EP1556487A2 - Transplantierbare zelle - Google Patents

Transplantierbare zelle

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Publication number
EP1556487A2
EP1556487A2 EP03747785A EP03747785A EP1556487A2 EP 1556487 A2 EP1556487 A2 EP 1556487A2 EP 03747785 A EP03747785 A EP 03747785A EP 03747785 A EP03747785 A EP 03747785A EP 1556487 A2 EP1556487 A2 EP 1556487A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cell
cells
human
animal
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03747785A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Mark Burcin
Sybille Esser
Manfred Ruediger
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Priority to EP03747785A priority Critical patent/EP1556487A2/de
Publication of EP1556487A2 publication Critical patent/EP1556487A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
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    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian

Definitions

  • the invention relates to a human or animal non-totipotent cell which contains at least one nucleic acid which codes for at least one immunomodulator under the control of a gene switch molecule which can be regulated by adding an active substance, and to its production and use for transplantation, for inhibiting a
  • a large number of human diseases are based on the death or malfunction of specific cells, tissues or organs and often cannot be adequately treated with medication.
  • Conventional therapy has been to repair the damaged tissue or organ by transplanting healthy cells, tissues or organs, e.g. To replace the heart, lungs, kidneys, pancreas or cells or tissues obtained from healthy human donors.
  • the need for donor tissue can only be insufficiently met. This deficiency could be remedied by transplanting tissues or cells from specially bred non-human donor mammals.
  • replacement cells can also be obtained from cell lines. These cells can also be of human or non-human origin.
  • B cells, T cells, antigen presenting cells of the immune system and can ultimately lead to rejection of the transferred cells, tissue or organ .
  • immunomodulators which suppress the immune system or bring about a tolerance of the recipient to the transplant and thus prevent such a rejection reaction.
  • immunomodulators e.g. Steroids (prednisolone and derivatives), calcineurin inhibitors (cyclosporin A, tacrolimus), rapamycin (sirolimus), mycophenolate mofetil (MMF), azathioprine (imuran), lymphocyte antisera (ALG - anti-leukocyte globulin, ATG - anti thym monoMonal antibodies (anti-CD25: Zenapax, Simulect) were used.
  • Steroids prednisolone and derivatives
  • calcineurin inhibitors cyclosporin A, tacrolimus
  • rapamycin rapamycin
  • mycophenolate mofetil MMF
  • azathioprine imuran
  • lymphocyte antisera AG - anti-leukocyte globulin, ATG - anti thym monoMonal antibodies (anti-CD25: Zenapax, Simulect) were used.
  • the most significant side effects of conventional immunomodulator therapy include high blood pressure, kidney and liver damage, the increased incidence of opportunistic infections and an increased rate of various malignancies, e.g. Cancer and lymphoproliferative disorders.
  • various malignancies e.g. Cancer and lymphoproliferative disorders.
  • the infection with the cytomegalovirus which usually has only minor symptoms, leads to the formation of hepatitis, pneumonia and meningitis in immunosuppressed patients and is therefore a main cause of the increased mortality rate of transplant recipients (Transplantation Clinical Management, Vol. 5, 2000 Medscape, Inc., Web MD Health Network, NY, USA).
  • immunomodulators in particular immunosuppressants, can generally have toxic properties regardless of their effect on the immune system.
  • calcineurin inhibitors often cause renal insufficiency, high blood pressure, hyperlipidemia and the development of diabetes mellitus.
  • regular medication treatment severely impairs the quality of life and is therefore often not carried out by the patient to the extent that is medically necessary.
  • a clinically proven approach to reducing the side effects of immunomodulation is e.g. in combining newly developed immunoreactive drugs in low concentrations and thus replacing standard therapeutic agents (e.g. steroids, cyclosporin A).
  • the side effects of the individual immunomodulators of this combination such as however, the drop in the level of leukocytes, the appearance of oral abscesses and indigestion could not be avoided even with this treatment.
  • Another therapeutic approach could be to achieve immunological tolerance to the foreign tissue in the patient by administering novel immunomodulatory substances.
  • tolerance is characterized as the lack of an immune response or rejection reaction against the graft without continuous immunosuppression.
  • immunomodulatory substances are administered by the customary methods known to those skilled in the art (see, for example, WO 00/12138; WO 97/41232; WO 96/26274; WO 01/87330; Ferrari-Lacraz et al, The Journal of Immunology, 2001 , Vol. 167 pp.
  • a disadvantage of the conventional therapy approach is that tolerance-inducing immunomodulators are usually administered systemically (for example intravenously).
  • Another disadvantage is that the immunomodulators have to be isolated as therapeutic products from natural sources or biotechnologically produced as recombinant molecules in order to then administer them externally to the patient.
  • production-related aspects can mean that an immunomodulator in native form or as a recombinant molecule cannot be isolated or produced in sufficient quantity or activity.
  • the ex vivo production of the immunomodulator may require the addition of substances that may pose a further health risk to the patient (eg substances that have been isolated from animal organisms and can therefore potentially transmit zoonoses).
  • substances that may pose a further health risk to the patient eg substances that have been isolated from animal organisms and can therefore potentially transmit zoonoses.
  • the object was to develop an immunotherapy which avoids or reduces the disadvantages described above, in particular which has its immunomodulatory, in particular immunosuppressive, effect in the organism exactly where the immune response has been activated or can be activated, ie at the location of the transplanted cells or organs, and at the same time enables an immunomodulatory effect which can be regulated in terms of time and quantity
  • controllable expression of the immunomodulator in cells was achieved with the help of an adjustable gene expression system.
  • This regulatable expression system makes it possible that immunomodulators no longer have to be administered systemically or only at low concentrations continuously.
  • Another significant advantage of the invention is that even at the location of the transplant, there is no need for sustained suppression of the immune response if this is not necessary from a medical point of view, but is only activated when necessary. This reduces side effects and stress on the body, especially the transplant region. This also means a physical and psychological relief for the patient, since he is not continuously dependent on the administration of immunomodulators, in particular immunosuppressive agents.
  • Immunosuppressants in this sense are understood to mean substances which inhibit in whole or in part an immune response caused by the transplant, in particular cell (s), tissue and / or organ (s) in the organism.
  • this invention provides the advantage that the immunomodulator no longer has to be isolated from a native source or produced and purified recombinantly.
  • the immunomodulator is formed in therapeutically active amount and form in the recipient organism and / or at the site of action in vivo and thus retains its full native activity.
  • An object of the present invention therefore relates to a transplantable human or animal non-totipotent cell which contains at least one nucleic acid which codes for at least one immunomodulator under the control of a gene expression system which can be regulated by adding an active substance.
  • a nucleic acid in the sense of the present invention means an RNA or DNA, in particular genomic DNA, recombinantly produced DNA, cDNA or synthetic DNA, which was synthesized, for example, at the phosphoramidation level. Combinations and / or modifications of nucleotides of these nucleic acids are also included. This term also includes single and double-stranded nucleic acids.
  • nucleic acids which contain functionally linked components, for example one or more genes or active parts thereof coding for one or more immunomodulators and at least one regulatable gene expression system, the activation state of which is regulated by the addition of an active substance, and regulatable elements, for example promoters and regulators Nucleotide sequences and a polyadenylation signal, for example an SV40 polyadenylation signal.
  • the components are functionally linked if they are linked in such a way that under the influence of the transcription regulation the sequence (s) of the genes contained or the gene are or will be transcribed.
  • immunomodulator of the present invention essentially encompasses any type of molecule which has immunomodulatory, in particular immunosuppressive, activity, for example proteins, fusion proteins and soluble ligands, wherein a fusion protein is understood to mean an expression product of a fused gene which results from the linkage of two or more Genes or gene fragments are created.
  • An immunomodulating effect is present when the immune response of an organism, a cell and / or a tissue is essentially inhibited, for example by an altered or suppressed receptor binding.
  • An immunomodulating effect is also present when an immunological tolerance to a transplanted cell, tissue or organ is brought about.
  • the effect of the immunomodulator comprises, for example, one or more of the following activities: the inhibition of an antigen recognition mediated by T cells, • the inhibition of a signal mediated by a receptor on a T cell, the activation of a mediated by a receptor on a T cell Signal, the inhibition of the growth of T cells, • the inhibition of molecules which support the survival of T cells, the inhibition of effector molecules of T cells (such as TNF-alpha, IFN-gamma), the inhibition of the adhesion of T- Cells, the inhibition of a T-cell costimulatory interaction (the activation of a lymphocyte takes place via two signals: one is done
  • Stimulation via the antigen receptor there is a further signal for clonal expansion and differentiation of an unembossed lymphocyte; these costimulatory interaction can be inhibited by an immunomodulator), • the JmhibiKING the activation, proliferation, survival, antigen presentation of signaling and / or effector functions of other cells involved in an immune response, such as general and specific antigen Cells, in particular, for example, dendritic cells and monocytes / macrophages B cells, neutrophils and NK cells inhibit the cellular interaction of different cells
  • Cells either via surface receptors or via secreted molecules, such as cytokines, chemokines or growth factors, which are involved in an immune response, such as general and specific ones antigen-presenting cells, in particular, for example, dendritic cells and monocytes / macrophages, T-cells, B-cells, neutrophilic granulocytes and NK cells, the inhibition of the migration of cells which are involved in an immune response, such as, for example, special antigen-presenting cells, in particular, for example, dendritic cells and monocytes / macrophages, T cells, B cells, neutrophilic granulocytes and NK cells, the inhibition of components of the complement system, the inhibition of phagocytotic activities in connection with the presentation of foreign or autoimmune antigens, or by the binding of antibodies to antigens, and / or the inhibition of inflammatory reactions.
  • antigen-presenting cells in particular, for example, dendritic cells and monocytes / macrophages, T-cells, B-cell
  • Antibodies are suitable as immunomodulators. It is particularly preferably an antibody against IL-15, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-12, IL-17, IL-18, IL-21, interferon gamma, TNF- alpha, CD2, CD3, CD4, CD8, CD28, CD40, CD80, CD86 or CD 154 or against their receptors.
  • Immunomodulators are also preferably FasL, PD-Ll or PD-L2.
  • immunomodulators are IL-15, IL-10, IL-4, IL-2, interferon gamma or TGF-beta, in particular as a fusion protein.
  • the fusion protein particularly preferably comprises on the one hand wild-type IL-15, wild-type IL-10, wild-type IL-4, wild-type interferon gamma or wild-type TGF-beta and on the other hand an Fc fragment.
  • the fusion protein furthermore particularly preferably comprises mutated IL-15 on the one hand, preferably those in which “Q” has been replaced by “D” at positions 101 and 108 or mutated IL-2 and on the other hand an Fc fragment (see, for example, WO 97/41232 ; Kim et al, J Immunol. ( ⁇ 998), 160 (12): 5742-5748; WO 01/87330), which is fused, for example, to the C-terminus of the mutated IL-15 molel il via the hinge region.
  • immunomodulators are fusion proteins from TNF-alpha receptor (type 1 or 2), ICOS, CTLA-4, PSGL-1, ICAM-1 or VCAM-1 on the one hand and an Fc fragment on the other hand, as in the case of TNF- Receptor fusion proteins, those which are disclosed in EP 417,563 A.
  • immunomodulators are secreted variants of cytokine or growth factor receptors, such as e.g. IL-15Ralpha, IL-6, IL-7, IL-12, IL-17, IL-18 receptors, for example as variants without a transmembrane domain and cytoplasmic tail, preferably as a fusion protein with an Fc fragment.
  • cytokine or growth factor receptors such as e.g. IL-15Ralpha, IL-6, IL-7, IL-12, IL-17, IL-18 receptors, for example as variants without a transmembrane domain and cytoplasmic tail, preferably as a fusion protein with an Fc fragment.
  • the fusion protein is a chimeric fusion protein.
  • Suitable fusion proteins are, for example, IL-15 derivatives, comprising IL-15 or imitated IL-15 and a heterologous Fc fragment.
  • Fc (fragment crystallizable) fragment is to be understood as the fragment of an antibody which does not bind any antigens, for example one which comprises all constant domains or all constant domains except the first constant (partially or completely) domain, such as, for example, a one that includes the hinge region, the second (CH2) and third constant (CH3) heavy chain domains.
  • the Fc fragment can come from a natural source, can be produced recombinantly and / or can be synthesized. Appropriate
  • the Fc fragment can also have one or more mutations with respect to the natural sequence, for example those which have a suitable interface for the construction of a
  • the Fc fragment is one of an immunoglobulin (Ig) G, in particular a human IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 and / or an analogous mammal IgG and / or an IgGM, in particular a human IgM or a analog mammal IgM and / or a murine IgG2a.
  • Ig immunoglobulin
  • the immunomodulators can have wild-type sequences or else mutated sequences.
  • the immunomodulators are preferably already in a functionally active form, for example in a functionally active soluble form or a functionally active viral form.
  • a soluble form is understood to mean a molecule that is not bound to a cell membrane, e.g. a soluble receptor molecule.
  • a viral form is to be understood as a protein isoform which is endogenously encoded by a virus genome, e.g. viral IL-10.
  • a mutated sequence according to the present invention is to be understood as a nucleotide or amino acid sequence which contains deviations from the wild-type sequence by, for example, deletion, addition, insertion or substitution of one or more nucleotides or amino acids, but without completely losing the immunomodulatory effect ,
  • Mutated immunomodulators for the purposes of the present invention are therefore molecules which preferably have a sequence homology of at least approximately 80%, preferably at least approximately 90%, particularly preferably at least approximately 95%, most preferably at least approximately 99% of the sequence to the wild-type sequence.
  • Sequence homology in the sense of the present invention is understood to mean the degree of similarity (% positive) of two sequences, which is determined for polynucleotides using BLASTN 2.0.14, for example, the filter being set ⁇ off and BLOSUM 62 being (Altschul et al 1997, Nucl. Acids Res, 25: 3389-3402). Sequence homology can be used with common sequence homology Programs z. B. can be checked online at http://www.hgsc.bcm.tmc.edu / SearchLauncher /.
  • regulatable gene expression system in the sense of the present invention means the combination of a sequence coding for a gene switch molecule and a gene switch binding sequence, the binding of the gene switch molecule to the gene switch binding sequence being regulated by the addition of an active substance, thereby controlling the expression of a target gene, here a target gene coding for an immunomodulator is carried out (see also Burcin et al. 1998, Frontiers in Bioscience 3: cl-7).
  • a gene switch molecule can activate or inhibit the transcription of the target gene by binding to a suitable gene switch binding sequence.
  • the activation can be based on the fact that the gene switch molecule e.g. Provides contact points for the RNA polymerase and / or involved transcription factors.
  • the inhibition can be brought about in that the gene switch molecule blocks the DNA binding sites required for the transcription complex by its binding to the DNA and thereby makes it inaccessible to, for example, the RNA polymerase and / or involved transcription factors.
  • an active substance can influence the transcription of the target gene positively (activation) or negatively (inhibition).
  • the target gene is not expressed in the absence of the active substance.
  • it binds to the gene switch molecule and thereby causes the activation and binding of the gene switch molecule to the gene switch binding sequence, which subsequently initiates the transcription of the target gene.
  • the gene switch molecule binds to the DNA in the absence of the active substance and activates the transcription. After addition and binding of the active substance, the gene switch molecule is inactivated and the transcription of the target gene is ended.
  • gene switch molecule means a molecule, preferably a protein, in particular a fusion protein, containing a binding site for an active substance and a transcription activation domain, which changes its activation state after binding of the active substance.
  • gene switch binding sequence in the sense of the present invention is preferably understood to mean a nucleic acid sequence located 5 'upstream from the translation start (+1) of the gene, or active part thereof, which codes for an immunomodulator, which sequence determines the transcription of the target gene, in particular with regard to the transcription rate and / or the tissue specificity, controlled or the translation controlled.
  • a regulatory nucleic acid sequence with promoter activity, preferably also with enhancer activity, is bound directly or indirectly to this gene switch binding sequence.
  • the functioning of the regulatable gene expression system according to the invention can be described, for example, as follows: If no gene switch molecule is bound to the gene switch binding sequence, the coupled target gene is not expressed and in this case no immunomodulator is produced.
  • an active substance When an active substance is added, it binds, for example, to the dimerization domain of the gene switch molecule. This binding results in a conformational change in the dimensioning domain, which causes two gene switch molecules to dimerize and subsequently bind to the gene switch binding sequence. This binding brings the activation domain of the gene switch molecule close to the minimal TATA promoter and thus initiates the transcription of the coupled target gene coding for an immunomodulator. After the addition of the active substance has ended, the binding of the gene switch molecule to the gene switch binding sequence is released and thus the target gene expression is ended.
  • the gene switch molecule of the present invention can accordingly be regulated, for example inhibited or activated, preferably activated by adding an active substance and then binds to the gene switch binding site.
  • Preferred active substance is to be understood as a pharmacologically acceptable substance which directly or indirectly effects the regulated expression of a gene or several genes via its gene switch (s), for example mifepristone, tetracycline, doxycycline or rapamycin.
  • s gene switch
  • the regulated gene expression system of the present invention is in particular a progesterone gene expression system which comprises a gene switch which represents an artificially composed transcription factor consisting of a GAL4 DNA binding domain (Gal4-DBD), a dimerization domain derived from a mutated progesterone receptor with a shortened ligand binding site (hPR-LBD), and an activation domain of the p65 subunit of the human NF- ⁇ B protein (p65-AD).
  • the gene switch binding sequence is a nucleotide sequence consisting, for example, of a 17-nucleotide GAL4 binding sequence with subsequent minimal TATA promoter to which the corresponding target gene is coupled.
  • Such a regulatable gene expression system with the gene switch components Gal4-DBD / hPR-LBD / p65-AD mentioned is described, for example, in Wang et al. 1994, PNAS 91: 8180-8184 or Wang et al. 1997, Gene Therapy 4: 432-441.
  • the active substance which is suitable in this system is, for example, mifepristone, an artificial hormone-like molecule which does not occur in the mammal and which specifically binds to the dimerization domain of the gene switch molecule and activates it through the dimerization which is thereby brought about.
  • Another controllable gene expression system of the present invention is a tetracycline gene expression system, which is one by tetracycline (Tet) or that Derivative doxycycline (dox) inducible system, in which the gene switch molecule consists of a Tet transactivator protein.
  • This transactivator (tTA) is a fusion protein from a VP16 activation domain and the Tet Repressor (TetR) from Escherichia coli. In the absence of tetracycline, the tTA has a high affinity for its gene switch binding site, the Tet-responsive element (TRE), and activates the expression of the target gene.
  • rtTA reverse transactivator
  • the wild-type TetR is replaced by a mutated TetR (rTetR), as a result of which the fusion protein binds the gene switch binding site of the DNA only in the presence of doxycycline and thus induces coupled target genes, as described, for example, in Gossen 1995, Science 268: 1766-1769; Gossen et al. 1992, PNAS 89: 5547-5551; Linstedt et al. 1997, Mol. Biol. Cell 8: 1073-1087; Mehlen et al. 1998, Nature 395: 801-804 or Joosse et al. 2000, Hum. Mol. Genet. 9: 3075-3082.
  • Another controllable gene expression system of the present invention is a rapamycin gene expression system. This is an inducible dimerization of the proteins FKBP12 and FRAP mediated by the active substance rapamycin. Dimerization of these two proteins causes a DNA binding of the activation domain bound to FRAP and thus the activation of a coupled target gene.
  • a regulatable gene expression system is described, for example, in Rivera et al. 1996, Nature Med 2: 1028-1032.
  • This active substance can be administered by methods familiar to the person skilled in the art, for example intravenously, intraperitoneally, intramuscularly, subcutaneously, intracranially, intraorbitally, intracapsularly, intraspinally, transmuscularly, topically, orally or via the mucous membrane, for example the nose or the oral cavity. Further methods of administration are, for example, systemic or local injection, perfusion or catheter-based administration. Tablets or capsules are suitable as oral dosage forms. Administration via the lungs takes place, for example, with the aid of sprays and via the skin in the form of disposers which are implanted under the skin. Transdermal therapeutic systems (TTS) are known, for example, from EP 0 944 398-A1, EP 0 916 336-A1, EP 0 889 723-A1 or EP 0 852 493-A1.
  • TTS Transdermal therapeutic systems
  • the cells are preferably transplantable.
  • Transplantable in the sense of the present invention means that the living cell can be transferred to another location of the same organism or to another (recipient) organism, which is preferably a non-tumorigenic cell, or if it is one of is a cell derived from a tumor cell, it is treated accordingly before the transplantation (for example by mitotic inactivation) in order to inhibit its proliferation (see, for example, WO 00/64459 and US 5,175,103; Pleasure et al. (1992), The Journal of Neuroscience, 12 (5): 1802-1815 ".
  • the transplantable human or animal non-totipotent cell according to the invention is in particular a mammalian cell, including a human cell, and originates, for example, from a human, a mouse, a rat, a guinea pig, a rabbit, a cow, a sheep, a goat, a horse , a pig, a dog, a cat or a monkey, preferably from a human.
  • Cells according to the invention are, for example, epithelial cells, endothelial cells, liver cells, heart cells, skin cells, muscle cells, nerve cells, bone marrow cells, bone cells, cartilage cells, blood cells,
  • a non-totipotent cell is a cell that cannot develop into a complete organism on its own.
  • the cell is a stem cell, a precursor cell and / or an immortalized cell. It is preferably a pluripotent or multipotent embryonic, fetal, neonatal or adult stem cell.
  • Particularly preferred stem cells derived from, but not limited to, adult tissue include neuronal stem cells, bone marrow stem cells, mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, epithelial stem cells, and stem cells from the digestive tract, skin, adipose tissue, intestine, the placenta and duct of the pancreas.
  • a cell of the present invention also includes a cell which contains the above-described invention and which is introduced into a tissue or an organ of a human or animal organism before and / or after that tissue or organ in the same or another human or animal Organism is transplanted.
  • a preferred embodiment relates to a cell according to the invention in the form of a cell line.
  • a cell line according to the invention can be produced, for example, by transforming or infecting a cell line with the one described above Nucleic acid according to the invention with the aid of methods which are known to the person skilled in the art, for example transfection, transformation or infection.
  • the nucleic acid additionally codes a selection cassette, in particular a suitable transfection marker gene and / or differentiation marker gene.
  • a selection cassette in the sense of the present invention is a nucleic acid sequence which codes for at least one gene which effects a targeted selection of certain cells, for example transfected or differentiated cells.
  • Differentiation marker genes, transfection marker genes and reporter genes can be used for such a selection.
  • genes are predominantly used which impart resistance to certain toxic substances, for example antibiotics.
  • the most common antibiotics used in this context are neomycin, hygromycin (hph), zeocin (Sh ble) and puromycin (pacA).
  • Further examples of such genes, in particular for the selection of stem cells are, for example, genes which regulate the expression of fluorescent markers, for example GFP, with the aid of which the cells to be selected can be purified via fluorescence-mediated cell sorting (FACS).
  • FACS fluorescence-mediated cell sorting
  • selection markers are surface molecules, for example growth factor receptors, with the aid of which cells can be enriched via magnetic immunobeads (Bonini C, Science Vol 276, 1719-1724, 1997).
  • Further examples are genes which code for an enzyme activity (for example thymidine kinase) which convert a precursor of a toxic substance, so-called "prodrug” (for example ganciclovir) into a toxic substance. In this case, a negative selection can take place, ie only those cells that do not express the promoter upstream of the gene survive.
  • genes of the selection cassette according to the invention can be lacZ (coding for ⁇ -lactamase), ⁇ -lactamase, chloramphenicol acetyl transferase (CAT), adenosine deaminase (ADA), dihydrofolate reductase (DHFR), and xanthinguanine phosphoribosyl transferase (XG.
  • CAT chloramphenicol acetyl transferase
  • ADA adenosine deaminase
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • XG xanthinguanine phosphoribosyl transferase
  • the nucleic acid additionally encodes an NK cell-inhibiting and / or a killer cell-inhibiting molecule, preferably a human MHC class I molecule, a chimeric MHC class I molecule or a viral MHC class I homolog.
  • an NK cell-inhibiting and / or a killer cell-inhibiting molecule preferably a human MHC class I molecule, a chimeric MHC class I molecule or a viral MHC class I homolog.
  • killer cells as a heterogeneous population of mononuclear cells with spontaneous or acquired cytotoxic potential.
  • NK cells naturally killer cells
  • NK cells are to be understood as killer cells which are naturally present, i.e. which are not the result of an immune response and are therefore not induced by specific antigens.
  • the present invention further relates to a nucleic acid which codes for at least one immunomodulator and at least one gene expression system which can be regulated by adding an active substance, as has already been described in more detail above.
  • the nucleic acid preferably also codes for at least one element which controls gene expression.
  • elements are understood to mean, for example, promoters or regulatory nucleic acid sequences.
  • Suitable expression conditions for the expression of a nucleic acid can be created by these and by expression vectors (explained in more detail below).
  • expression vectors contain the promoters suitable for the respective cell or the gene to be transcribed in each case.
  • regulatable elements which enable consumer expression in eukaryotes are promoters which are recognized by RNA polymerase III.
  • Such promoters for constitutive expression in all cell and tissue types are, for example, the pGK (phosphoglycerate kinase) promoter, the CMV (cytomegalovirus) promoter, the TK (thymidine kinase) promoter, the EFl ⁇ (elongation factor-1-alpha) promoter, the SV40 (Simian Virus) promoter, the RSV (Rous Sarcoma Virus) promoter and the pUB (Ubiquitin) promoter.
  • pGK phosphoglycerate kinase
  • CMV cytomegalovirus
  • TK thymidine kinase
  • EFl ⁇ elongation factor-1-alpha
  • SV40 Seimian Virus
  • RSV Ra Sarcoma Virus
  • pUB Ubiquitin
  • regulatable elements which enable cell-specific or tissue-specific expression in eukaryotes are promoters or activator sequences from promoters or enhancers of those genes which code for proteins which are only expressed in certain cell types.
  • promoters are for example the insulin promoter for beta cells of the pancreas, the Sox-2 promoter for nerve cells, the myosin heavy chain promoter for muscle cells, the VE-cadherin promoter for endothelial cells and the keratin promoter for epithelial cells.
  • regulatable elements which enable regulatable expression in eukaryotes are the tetracycline operator in combination with a corresponding repressor (Gossen M. et al. (1994) Curr. Opin. Biotechnol. 5, 516-20).
  • Expression can also be controlled via regulatory nucleotide sequences which influence expression in terms of quantity and / or as a function of time. These include, for example, enhancer sequences, leader sequences, polyadenylation sequences, IRES sequences, introns, insulator sequences and repressor sequences.
  • the nucleic acid according to the invention can be localized on one or more nucleic acid molecules. According to the invention, however, in the case of several nucleic acid molecules, these must functionally interact.
  • the sequence for the gene switch molecule, (ii) the sequence for the immunomodulator under regulation of the gene switch binding site and (iii) the sequences for the selection markers can be on three different nucleic acid molecules.
  • Another object of the present invention is therefore also a vector which contains at least one nucleic acid according to the invention.
  • Vectors in the sense of the present invention can be plasmids, shuttle vectors, phagemids, cosmids, adenoviral vectors, retroviral vectors, expression vectors and vectors which are active in gene therapy.
  • Expression vectors in the sense of the present invention include at least one nucleic acid according to the invention, at least one translation initiation signal, a translation termination signal and / or a polyadenylation signal for expression in eukaryotes.
  • Gene-therapeutic vectors are, for example, plasmid vectors, virus vectors, for example adenovirus vectors, retroviral vectors or vectors which are based on replicons of RNA viruses (see, for example, Lindemann et al., 1997, Mol. Med. 3: 466-76; Springer et al , 1998, Mol. Cell. 2: 549-58; Khromykh, 2000, Curr. Opin. Mol. Ther .; 2: 555-69).
  • Vectors with gene therapy effects can also be obtained by complexing the nucleic acid fragments according to the invention with liposomes.
  • lipofection small unilamellar vesicles are made from cationic lipids by ultrasound treatment of the liposome suspension.
  • the DNA is bound ionically on the surface of the liposomes in such a ratio that a positive net charge remains and the plasmid DNA is 100% complexed by the liposomes.
  • DOTMA 1, 2-dioleyloxypropyl-3-trimethylammonium bromide
  • DPOE dioleoxylphosphatidylethanolamine
  • lipid formulations are DOTAP N- [l- (2,3-dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethyl-ammoniumethyl-sulfate or DOGS (TRANSFECTAM; dioetadecylamidoglycylspermin).
  • Auxiliaries that increase the transport of nucleic acids into the cells can be, for example, proteins or peptides that are bound to DNA or synthetic peptide-DNA molecules that enable the transport of the nucleic acid into the nucleus of the cell (Schwartz et al, 1999 , Gene Therapy 6: 282; Branden et al. 1999, Nature Biotechs. 17: 784).
  • Auxiliaries also include molecules that enable the release of nucleic acids into the cytoplasm of the cell (Planck et al, 1994, J. Biol. Chem. 269, 12918; Kichler et al, 1997, Bioconj. Chem. 8, 213) or, for example, liposomes (Uhlmann and Peimann, 1990, Chem. Rev. 90, 544).
  • the Cells according to the invention can also be used to express a heterologous gene.
  • Gene therapy vectors can be introduced into cells by transfection (e.g. electroporation, lipofection, calcium phosphate precipitation) or infection.
  • the present invention furthermore relates to a medicament which contains at least one cell according to the invention and suitable auxiliaries and / or additives.
  • the medicament according to the invention can be used for the prophylaxis and / or therapy of diseases, for example of
  • rheumatic diseases for example rheumatic arthritis, Sjogren's syndrome, scleroderma, dermatomyositis, polymyositis, Reiter's syndrome or
  • autoimmune diseases of the thyroid gland for example Graves' I rankheit
  • autoimmune diseases of the central nervous system for example multiple sclerosis
  • auxiliaries and additives which serve, for example, to stabilize and / or preserve the medicament, are generally familiar to the person skilled in the art. These include, for example, physiological saline solutions, Ringer's dextrose, Ringer's lactate, University of Wisconsin solution / NiaSpan® (Beizer UW), EuroCollins solution, DMSO, ethylene glycol, sucrose, trehalose, Ficoll, perfluorocarbons, demineralized water, stabilizers, antioxidants, complexing agents , antimicrobial compounds, proteinase inhibitors and / or inert gases.
  • physiological saline solutions include, for example, physiological saline solutions, Ringer's dextrose, Ringer's lactate, University of Wisconsin solution / NiaSpan® (Beizer UW), EuroCollins solution, DMSO, ethylene glycol, sucrose, trehalose, Ficoll, perfluorocarbons, demineralized water, stabilizers, antioxidants, complexing agents
  • the medicament according to the invention is administered by methods which are suitable for the particular cell, tissue or organ type to which it is to be administered. Such methods are familiar to the person skilled in the art.
  • the drug can then be administered intravenously, for example, for liver cells, intramuscularly for heart muscle cells or also by catheter-based
  • the drug can be introduced into the organism either using an ex vivo approach in which the cells are removed from the patient, genetically modified, for example by D ⁇ A transfection, and then reintroduced into the patient or using an in vivo approach, in which gene therapy-effective vectors according to the invention are introduced into the patient's body as naked DNA or using viral or non-viral vectors according to the invention or cells according to the invention.
  • the dosage of drugs depends on several factors, for example on the body weight, the general state of health, the extent of the body surface, the age of the patient and the interaction with other drugs. Dosage also depends on the type of administration. The dosage must therefore be determined by the specialist in each individual case for each patient. The drug can be administered once or several times a day and for several days; this can also be determined by a person skilled in the art.
  • the present invention further provides a human or animal organ-specific tissue and / or a human or animal mammalian organ which contains at least one cell according to the invention.
  • organ-specific tissue and mammalian organ in the sense of the present invention include, for example, the mammalian organs heart, skin, pancreas, kidneys, liver, muscles, nerves, eyes, lungs, bone marrow, cartilage, bones, vessels, connective tissue or tissues of these organs.
  • the present invention furthermore relates to a transgenic non-human mammal which contains at least one cell according to the invention.
  • Transgenic animals generally show a tissue-specific increased expression of nucleic acids and are therefore very suitable for the analysis of, for example, immune reactions.
  • Transgenic mice are preferably used.
  • a non-human mammal according to the invention is, for example, a mouse, a rat, a guinea pig, a rabbit, a cow, a sheep, a goat, a horse, a pig, a dog, a cat or a monkey.
  • Another object of the present invention is the use of a cell according to the invention, a human or animal organ-specific tissue according to the invention and / or a human or animal mammalian organ according to the invention for transplantation into a human or animal Mammal.
  • the transplantation according to the invention is preferably an auto, allo- or xenotransplantation.
  • transplantation to mean the transmission or transplantation of living material, for example cells, tissue and
  • Another object of the present invention is the use of a cell according to the invention, a human or animal organ-specific tissue according to the invention and / or a human or animal mammalian organ according to the invention for inhibiting a graft rejection reaction in an animal mammal or in humans.
  • An animal mammal within the meaning of the present invention is understood to mean, for example, a mouse, a rat, a guinea pig, a rabbit, a cow, a sheep, a goat, a horse, a pig, a dog, a cat or a monkey.
  • a graft rejection reaction as a process by which transplanted material, for example cells, tissue or an organ, are rejected by the recipient organism.
  • This rejection reaction is caused by cellular and humoral immunity.
  • the cause of this rejection reaction is a difference in Protein structure between transplanted material and recipient.
  • the protein structure of the transferred tissue is recognized as immunogenic by the recipient's immune system, which triggers an immune response.
  • Another object of the present invention is the use of a cell according to the invention, a human or animal organ-specific tissue according to the invention and / or a human or animal mammalian organ according to the invention for the prophylaxis and / or therapy of secondary transplant diseases and / or autoimmune diseases. Examples of such diseases have already been described above in the areas of application of the medicament according to the invention.
  • the uses according to the invention for inhibiting a graft rejection reaction and for the prophylaxis and / or therapy of secondary transplant diseases and / or autoimmune diseases can take place, for example, by introducing the cells, tissues and / or organs according to the invention into a human or animal mammal.
  • the expression of the immunomodulator according to the invention is controlled via the regulatable gene expression system according to the invention. This control takes place through the administration or withdrawal of an active substance according to the invention, whereby the gene switch molecule is activated or deactivated. When activated, the gene switch activates the transcription of the target gene which codes for the immunomodulator.
  • the immunomodulator expressed thereby essentially inhibits a defense reaction of the immune system to the transplanted cell, tissue or organ, and in particular in the transplant region of the organism of the human or animal mammal.
  • cells according to the invention consist of epithelial cells, endothelial cells,
  • Liver cells, derivatives of non-totipotent embryonic stem cells or non-totipotent embryonic germ cells, or stem cells derived from adult tissue include neuronal stem cells, bone marrow stem cells, mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, epithelial stem cells, stem cells from the digestive tract, skin, adipose tissue, intestine, placenta and duct of the pancreas all in one human or animal mammal are introduced.
  • the present invention furthermore relates to a method for producing a cell according to the invention, the method comprising the following steps: a. Introducing at least one nucleic acid according to the invention and / or at least one vector according to the invention into a transplantable human or animal non-totipotent cell, and b. Expression of the nucleic acid with the addition of at least one suitable active substance for regulating the gene switch molecule.
  • Suitable conditions which cause or enhance expression of the nucleic acid have already been described above. These include, for example, expression vectors, promoters and regulatable nucleic acid sequences, e.g. Enhancers, polyadenylation sequences.
  • the present invention furthermore relates to an in vitro method for producing a human or animal organ-specific one according to the invention Tissue and / or a human or animal mammalian organ according to the invention, the method comprising the following steps: a. Introduction of at least one nucleic acid according to the invention and / or at least one vector according to the invention as well as at least one differentiation gene into at least one non-totipotent
  • Stem cell, a non-totipotent progenitor cell and / or a non-totipotent immortalized cell b. Differentiation of the cell from step a, c. Selection of the differentiated cell from step b. and d. Introducing the selected cell from step c. in a human or animal organ-specific tissue and / or in a human or animal mammalian organ.
  • step a preference is given to the in vitro method according to the invention mentioned after, before or simultaneously with step a.
  • at least one suitable transfection marker gene is introduced into a non-totipotent stem cell, a non-totipotent progenitor cell and / or a non-totipotent immortalized cell and after step a. preferably the transfected cell from step a. selected.
  • the differentiation of the cells containing the nucleic acid according to the invention can e.g. by "embroid body formation", preferably by culturing the cells in solutions, by culturing the cells in high density, by cell aggregation, by withdrawing the cultivation on feeder cells, withdrawing substances which inhibit differentiation (for example LIF or medium conditioned by feeder cells), by adding Cytokines, growth factors, hormones, vitamins (e.g. nicotinamide), retinoic acid, sodium butyrate or DMSO to the cultured cells or by adding other substances known to initiate differentiation. .
  • the selection cassette according to the invention contains a marker gene, specifically an antibiotic resistance gene.
  • the cells are selected or isolated by enriching the differentiated cells after adding a suitable antibiotic during or after the differentiation step. Only the differentiated cells that express the marker gene are resistant to the antibiotic. Undifferentiated cells die.
  • the transfected cells can also be selected using the same method.
  • An antibiotic according to the invention means an antibiotic against which the antibiotic resistance gene (s) used as the selection cassette according to the invention produces resistance (s). After the antibiotic has been added to the cultured stem cells, only those stem cells which contain the reporter gene expression vector essentially survive and differentiate.
  • a selection method can also be used, the gene or genes of the selection cassette according to the invention coding for luciferase, green fluorescent protein, red fluorescent protein and / or yellow fluorescent protein.
  • the cells to be selected are isolated by means of fluorescence-activated cell sorting (FACS) or selected by affinity purification. Furthermore, cells can be concentrated with the help of surface molecules, for example growth factor receptors, using magnetic immunobeads (Bonini C, Science Vol 276, 1719-1724, 1997).
  • a second marker gene can preferably be introduced into the cells, as a result of which a selection of the cells in which the introduction of the nucleic acid and / or the vector according to step a. of the in vitro method according to the invention was successful. This double selection makes it possible to obtain an approximately 90%, preferably approximately 95-100% pure cell population of the desired cells.
  • the present invention further provides a method for producing a transgenic non-human mammal according to the invention, the method comprising the following steps: a. Introducing at least one nucleic acid according to the invention and / or at least one vector according to the invention as well as at least one suitable transfection marker gene into at least one oocyte, stem cell, a precursor cell and / or an immortalized cell of a non-human mammal, b. Selection of the transfected cell from step a, c. Introduce the after step b. selected cell into at least one non-human mammalian blastocyst, d. Introduce the blastocyst from step c. or the embryo from step d. into a non-human mammal foster mother and e. Identification of the transgenic non-human mammal developed from said blastocyte.
  • it is a pluripotent or multipotent embryonic, fetal, neonatal or adult stem cell.
  • Another object of the present invention is a method for
  • transgenic non-human mammal the method comprising the following steps: a. Introducing both at least one nucleic acid according to the invention and / or at least one vector according to the invention and at least one suitable transfection marker gene into one of the two precursors of a fertilized non-human mammalian oocyte, b. Introduce the mammalian oocyte from step a. into a non-human mammal foster mother and c. Identification of the transgenic non-human mammal developed from said mammalian oocyte.
  • non-human mammalian foster mother be mock pregnant by mating with a male with a severed spermatic duct.
  • blastocytes and / or oocytes into the foster mother are known to the person skilled in the art. It can be done, for example, by injection into the fallopian tube or uterus (see e.g. Hogan, B, Beddington, R, Constantini, F. and Lacy, E, A laboratory Manual (1994), Cold Spring Harbor Laboratory Press, page 173-181).
  • a transgenic non-human mammal can be identified, for example, by extracting genomic DNA from the transgenic non-human mammal, for example from the tail of a mouse.
  • genomic DNA is transferred to a membrane and detected by means of DNA probes, for example radioactively labeled DNA probes, which are specific for the transgene sought.
  • transgenic non-human mammal by regenerating a non-human stem cell, oocyte, precursor cell or immortalized cell to form a transgenic non-human animal, in particular transgenic mice, are known to the person skilled in the art, for example, from DE 196 25 049 and US Pat. No.
  • transgenic animals which can be generated, for example, by direct injection of expression vectors according to the invention into embryos or spermatocytes or via the transfection of expression vectors into embryonic stem cells (see, for example, Polites and Pihkert: DNA micromjection and transgenic animal production, Page 15-68 in Pinkert, 1994: Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press, London, UK; Houdebine 1997, Harwood Academic Publishers, Amsterdam, The Netherlands; Doetschman: Gene Transfer in Embryonic Stern Cells, page 115-146 in Pinkert, 1994, supra; Wood: Retrovirus-Mediated Gene Transfer, pages 147-176 in Pinkert, 1994, supra; Monastersky: Gene Transfer Technology: Alternative Techniques and Applications, pages 177-220 in Pinkert, 1994, supra).
  • transgenic animals in particular transgenic mice
  • processes for the production of transgenic animals are also known to the person skilled in the art, inter alia, from WO 98/36052, WO 01/32855, DE 196 25 049, US 4,736,866, US 5,625,122, US 5,698,765, US 5,583,278 and US 5,750,825 and include transgenic animals that can be generated, for example, by direct injection of vectors according to the invention into embryos or spermatocytes or via the transfection of vectors or nucleic acids into embryonic stem cells (see also Polites and Pinkert, in Pinkert, (1994) Transgenic animal technology, A Laboratory Handbook, Academic Press, London, UK, pages 15 to 68; Doetschman, in Pinkert, 1994, supra, pages 115 to 146).
  • the stem cell is used in the in vitro methods according to the invention for producing a human or animal organ-specific tissue according to the invention and / or a human or animal mammalian organ according to the invention and in the methods for producing a transgenic non-human mammal according to the invention is used to generate a pluripotent or multipotent embryonic, fetal, neonatal or adult stem cell.
  • the present invention also relates to a transgenic non-human mammal, which was produced by the method according to the invention described above, and the descendant (s) of this mammal.
  • Another object of the present invention is the use of a transgenic non-human mammal according to the invention for obtaining a human or animal cell, a human or animal organ-specific tissue and / or a human or animal mammalian organ for allo- and / or xenotransplantation.
  • this can take place, for example, by means of an implantation method or by means of a catheter injection method through the blood vessel wall.
  • extraction means the removal of the cell, tissue and / or organ mentioned from the organism of a transgenic non-human mammal according to the invention. Methods for such removal are common.
  • Another object of the present invention is the use of a transgenic non-human mammal according to the invention, a cell according to the invention, a human or animal organ-specific tissue according to the invention and / or a human or animal mammalian organ according to the invention for finding pharmacologically active substances and / or for identifying toxic substances substances.
  • one such method could be to target cells of the present invention to e.g. sow a 96-well microtiter plate, then add a pharmacologically active or toxic substance to be investigated and then use cell counting to analyze whether the substance has caused the death of an increased number of cells.
  • pharmacologically active substance and toxic substance in the sense of the invention include all those molecules, compounds and or
  • Exercise cells individual tissues, individual organs or the entire organism of an animal or human mammal.
  • Possible pharmacologically active substances and toxic substances can be simple chemical (organic or inorganic) molecules or compounds, nucleic acids or analogues of
  • nucleic acids nucleic acids, anti-sense sequences of nucleic acids, peptides, proteins or
  • Substance libraries originate and are examined for their pharmacological or toxic activity.
  • Pharmacologically active substances are, for example, active substances which have an influence on: the ability of cells to divide and / or survive, the secretion of proteins, eg insulin from beta cells of the pancreas,
  • Toxic substances are, for example, active substances that • stimulate cells to apoptosis after certain signals, for example stress, influence the cardiovascular system, influence the nervous system and / or influence metabolic activities.
  • the identified pharmacologically active substances and toxic substances can optionally be combined or together with suitable additives and / or auxiliary substances for the production of a diagnostic agent or a medicament for the prophylaxis and / or therapy of Transplantation complications and / or autoimmune diseases, as exemplified above, can be used.
  • the present invention also relates to:
  • the regulatable gene expression system is a progesterone gene expression system, a tetracycline expression system and / or a rapamycin gene expression system.
  • cell according to at least one of (i) - (v), characterized in that the immunomodulator has at least one of the following functional properties: a. inhibiting antigen recognition mediated by T cells b. inhibiting a signal mediated via a receptor on a T cell, c. the activation of a signal mediated via a receptor on a T cell, d. inhibiting the growth of T cells, e. inhibiting molecules that support the survival of T cells f. inhibition of T cell effector molecules (such as TNF-alpha, IFN-gamma), g. inhibition of T cell adhesion, h.
  • T cell effector molecules such as TNF-alpha, IFN-gamma
  • T-cell costimulatory interaction the activation of a lymphocyte takes place via two signals: on the one hand there is stimulation via the antigen receptor, on the other hand there is another signal for the clonal expansion and differentiation of an unimpressed lymphocyte; this costimulatory interaction can be done by one Immunomodulator are inhibited) i. inhibition of activation, proliferation, survival,
  • Antigen presentation, signaling, and / or the effector functions of other cells that are involved in an immune response such as, for example, general and special antigen-presenting cells, in particular, for example, dendritic cells and monocytes / macrophages B cells, neutrophilic granulocytes and NK cells inhibiting the cellular Interaction of different cells, either via surface receptors or via secreted molecules such as cytokines, chemokines or growth factors that are involved in an immune response, such as general and special antigen-presenting cells, in particular, for example, dendritic cells and monocytes / macrophages, T cells, B cells, neutrophilic granulocytes and JNK cells, j.
  • general and special antigen-presenting cells in particular, for example, dendritic cells and monocytes / macrophages, T cells, B cells, neutrophilic granulocytes and JNK cells, j.
  • a receptor is b.
  • a soluble secreted receptor is c. is a secreted protein or peptide
  • the Fc fragment of the antibody is one of an IgG, in particular a human IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 or an analog mammal IgG or an IgM, in particular a human IgM or an analog mammal IgM.
  • (xi) cell according to at least one of (i) l to (x), characterized in that the nucleic acid additionally codes a selection cassette, in particular a suitable transfection marker gene and or differentiation marker gene.
  • (xii) cell according to at least one of (i) to (xi), characterized in that the nucleic acid additionally encodes a molecule which inhibits NK cells and / or killer cells.
  • (xiii) cell according to at least one of the (i) - (xi), characterized in that the nucleic acid additionally encodes a molecule that a. Inhibits dendritic cells b. Monocytes and or macrophages inhibited c. B cells inhibit d. Polymer nuclear cells, e.g. Neutrophil granulocytes inhibited
  • (xxiv) Method for producing a cell according to one of (i) to (xiv), comprising the following steps: c. Introducing at least one nucleic acid according to (xv) and / or at least one vector according to (xvi) into a transplantable human or animal non-totipotent cell, and d. Expression of the nucleic acid with the addition of at least one suitable active substance to regulate the gene switch.
  • v / tro process for producing a human or animal organ-specific tissue and / or human or animal mammalian organ according to (xviii), comprising the following steps: e. Introducing at least one nucleic acid according to (xv) and / or at least one Velrtor according to (xvi) and also at least one differentiation marker gene into at least one non-totipotent stem cell, a non-totipotent precursor cell and / or a non-totipotent immortalized cell, f. Differentiation of the cell from step a, g. Selection of the differentiated cell from step b. and h. Introducing the selected cell from step c. in a human or animal organ-specific tissue and / or in a human or animal mammalian organ.
  • (xxvi) Method according to (xxv), characterized in that after, before or simultaneously with step a. at least one suitable transfection marker gene is introduced into at least one non-totipotent stem cell, a non-totipotent precursor cell and / or a non-totipotent immortalized cell and after step a. preferably the transfected cell from step a. is selected.
  • (xxvii) Method according to one of (xxv) or (xxvi), characterized in that it is a pluripotent or multipotent embryonic, fetal, neonatal or adult stem cell.
  • Progenitor cell and / or an immortalized cell of a non-human mammal g. Selection of the transfected cell from step a, h. Introduce the after step b. selected cell in at least one non-human mammalian blastocyst, i. Introduce the blastocyst from step c. into a non-human mammal foster mother and j. Identification of the transgenic non-human mammal developed from the blastocyst.
  • (xxx) A method for producing a transgenic non-human mammal according to (xix), comprising the following steps: d. Introducing both at least one nucleic acid according to (xv) and / or at least one vector according to (xvi) and at least one suitable transfection marker gene into one of the two pre-nuclei of a fertilized non-human mammalian oocyte, e. Introduce the mammalian oocyte from step a. into a non-human
  • Mammalian organ according to (xviii) for the detection of pharmacologically active substances and / or for the identification of toxic substances are provided.
  • Fig. 1 shows an immunoblot analysis of media supernatants of the 17x4 / IL15 / Oligo + pcDNA3switch +/- mifepristone (Example 3);
  • Fig. 2 shows a schematic illustration of the mechanism of action of the gene expression system according to the invention which can be regulated by adding an active substance.
  • the gene switch of the present invention is a chimeric protein consisting of three functional units: i) a Gal4 DNA binding domain (Gal-DBD), which
  • the UAS sequence of the invention contains four copies of a sequence motif of 17 nucleotides, each motif of which can serve as a binding site for two Gal4-DBD molecules.
  • a truncated ligand-binding domain of the human progesterone receptor (PR-LBD) which mediates the binding of the active substance mifepristone to the gene switch and the conversion of the
  • a p65 activation domain (P65-AD) which activates the transcription of the target gene by the gene switch.
  • P65-AD A p65 activation domain which activates the transcription of the target gene by the gene switch.
  • pTK ubiquitous weak basal minimal thymidine kinase promoter
  • these gene switch molecules are present as monomers and cannot yet bind any DNA regions or initiate transcription. After adding the active substance mifepristone Activation of the gene switch system.
  • the ligand-bound Genschalter homodimer binds to all regions of the DNA which contain UAS sequences (such as, for example, the regulatory region in front of the gene for MutIL15-mFc regulated by the TATA promoter) and thus activates the transcription of the immunomodulatory protein. Since the TK promoter of the gene switch red gene is additionally preceded by DNA regions with UAS sequences, the transcription of the gene switch protein itself is activated in an autoregulatory feedback mechanism and thus the amount of the active gene switch is increased. Furthermore, the transplantable cells of the invention produced from cell lines can contain marker genes, for example for resistance to the antibiotics neomycin (Neo-R) or hygromycin (Hygro-R).
  • the marker genes which are regulated by a ubiquitous promoter such as, for example, the phosphoglycerate inase promoter (pGK), are used to select the cell for the uptake of the DNA construct.
  • the cells must contain at least elements 1 and 2.
  • the cells can additionally contain element 3.
  • stem cells were transfected with vector constructs which, in addition to the elements for the regulatable expression of the immunomodulator MutIL-15 / mFc, contained a selection cassette which made it possible to produce a specific cell type (eg insulin-producing cell) (see US Pat. No. 5,733,727) , In this way, differentiated cells of a specific cell type can be produced and isolated from undifferentiated transgenic stem cells.
  • These transgenic differentiated cells can be transplanted into a suitable recipient mouse (e.g. diabetic mouse). If the transplanted animals are treated with mifepristone, the transplanted cells themselves form MutIL-15 / mFc and thus prevent their own rejection.
  • Transgenic mice were generated which contain a construct in the genome which effects the regulated expression of MutIL-15 / mFc by adding mifepristone. Since the expression of MutIL-15 / mFc is regulated by a ubiquitous promoter, the mice produced MutIL-15 / mFc when stimulated by adding mifepristone. Can be removed organs (eg heart and kidney) cells (islet cells, neural cells) from the transgenic animals and transplanted into an ⁇ other non-transgenic mouse. If the transplanted animals are treated with mifepristone, the transplanted organ / cells themselves form MutlL-15 / mFc and thus prevent their own rejection.
  • organs eg heart and kidney
  • transplanted organ / cells themselves form MutlL-15 / mFc and thus prevent their own rejection.
  • Example 1 Vector cloning for a transgenic mouse model
  • the luciferase gene was identified by the gene for a fusion protein from mutated IL-15 protein and mouse Fc part (hereinafter referred to as as MutIL-15 / mFc: Kim et al, The Journal of Immunology, 1998, 160: 5742-5748), which additionally contains a CD5 Leader sequence contains (Jones H, Nature 323 (6086), 346-349, 1986).
  • GS Gal4-DBD / hPR-LBD / p65-AD
  • Gal4UAS-PTK-IVS8 the upstream regulatory region
  • a vector was alternatively produced in which the intron IVS8 (also from pswitch) was inserted between the TATA box and the start codon of the CD5-MutIL-15 / mFc gene (vector name 17x4 / IL15 / Oligo / IVS8 / GS). The transitions between the segments of all cloning products were checked by sequencing.
  • Example 2 Vector cloning for transgenic in vitro transplants from insulin-producing cells
  • these vectors were produced analogously to the vectors for the transgenic mouse model.
  • these plasmids also contain a fragment which contains a neomycin resistance gene (neo) regulated by the rat insulin promoter (RIP) and a hygromycin resistance gene (hygro) regulated by the mouse phosphoglycerate kinase promoter (pGK).
  • neo neomycin resistance gene
  • hygro hygromycin resistance gene
  • pGK mouse phosphoglycerate kinase promoter
  • vectors were alternatively produced in which the intron IVS8 (also from pswitch) was used between the TATA box and the start codon of the CD5-mutIL15-mFc gene (vector names 17x4 / IL15 / Oligo / RIPhn / IVS8 / GS and 17x4 / IL15 / Oligo / RIPnh / IVS8 / GS). The transitions between the segments of all cloning products were checked by sequencing.
  • Example 3 Examination of the regulated expression and secretion of CD5-mutIL15-mFc in the vectors mentioned in Examples 1 and 2
  • CD5-mutIL15-mFc The secretion of CD5-mutIL15-mFc was analyzed using an ELISA that recognizes the mouse Fc part of the fusion protein. For this were 96 holes Plates (Nunc, Wiesbaden # 439454) were coated with 100 ⁇ l each of an anti-mouse IgG2a antibody (clone R1-89, BD PharMingen, Heidelberg # 02251D-553446) for one hour at 37 ° C. The plates were then washed three times with PBS and incubated for one hour at 37 ° C. with DMEM + 10% FCS in order to saturate non-specific bindings.
  • an anti-mouse IgG2a antibody clone R1-89, BD PharMingen, Heidelberg # 02251D-553446
  • the bound amount of the fusion protein was determined by a color reaction after adding an OPD-containing substrate solution (25 ml 0.1 M citric acid, 25 ml 0.1 M dipotassium hydrogen phosphate, ad 100 ml with H2O + 1 tablet OPD (Sigma Deisenhofen # P8412) + 40 ⁇ l H2O2 30%) made visible, stopped by adding 3 M HC1 and then measured in an ELISA reader ( ⁇ Quant, BIO-TEK Instruments Inc.) at 490 nm.
  • OPD-containing substrate solution 25 ml 0.1 M citric acid, 25 ml 0.1 M dipotassium hydrogen phosphate, ad 100 ml with H2O + 1 tablet OPD (Sigma Deisenhofen # P8412) + 40 ⁇ l H2O2 30%
  • media supernatants were analyzed in the immunoblot.
  • media supernatants were mixed with Lämmli sample buffer, heated at 92 ° C. for 5 minutes, then applied to a 12.5% polyacrylamide gel and separated electrophoretically at 150 V.
  • the proteins were then transferred to a nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Dassel CD0564-1).
  • the membrane was treated with 5% milk powder / PBS / 0.1% Tween20 to saturate non-specific bonds. Then it was incubated for 16 hours at 4 ° C.
  • mCD5.6 positive control for MutIL-15 / mFc secretion, vector with CD5-MutIL-15 / mFc under the control of a CMV promoter
  • the media supernatant contained cells that were both gene-free (3rd) and containing Constructs (5th + 7th) had been transfected after mifepristone treatment with an increased amount of MutIL-15 / mFc, which was detected by ELISA.
  • Immunoblot analyzes of media supernatants from transfection 3 (Fig. 1) also confirm that an increased amount of MutIL-15 / mFc (50 kDa band) is produced after mifepristone stimulation (lane 1) compared to unstimulated cells (lane 2).
  • the number of active gene switch molecules was that in transiently transfected cells that only produced autoregulated gene switches (transfection with 17x4 / IL15 / Oligo / GS and 17x4 / IL15 / Oligo / IVS8 / GS).
  • pCMVß positive control for lacZ, vector with lacZ gene under the control of a CMV promoter
  • the cells were fixed for 10 min at -20 ° C. with ice-cold methanol, washed 3 ⁇ with PBS and then for 2.5 h at 37 ° C. with lacZ staining solution (60 ⁇ l of 400 mM potassium ferricyanide, 60 ⁇ l of 400 mM potassium ferrocyanide, 60 ⁇ l of 200 mM MgC12, 300 ⁇ l 20 mg / ml X-Gal, 5.52 ml PBS).
  • lacZ staining solution 60 ⁇ l of 400 mM potassium ferricyanide, 60 ⁇ l of 400 mM potassium ferrocyanide, 60 ⁇ l of 200 mM MgC12, 300 ⁇ l 20 mg / ml X-Gal, 5.52 ml PBS.
  • Example 5 Production and characterization of transgenic mice 50 ⁇ g DNA of the constructs 17x4 / IL15 / Oligo / GS and 17x4 / IL15 / Oligo / IVS8 / GS were cut with the restriction enzymes Eco47III and Notl and the desired fragments of 4800 bp and 4924 bp in length purified.
  • the fragments were then injected into the pronuclei of C3HeB / FeJ mice and the embryos then implanted in sham pregnant women.
  • the genomic DNA was extracted from the mice obtained and examined for the integration of the transgene with the aid of PCR analysis.
  • the following primers were used for the PCR analysis: GS-IL15FW.2 (5'-TAT
  • the PCR products obtained accordingly have a length of 211 bp (without intron) or 335 bp (with intron IVS8).
  • mice Of 44 mice obtained from the oocyte injection of the construct 17x4 / ILl 5 / oligo / GS, 16 animals were transgenic (36%). The founder animals (F0 generation) were tested with wild-type DBA 2 mice and the FI offspring obtained were in turn examined for the genomic presence of the transgene. The transgenic FI animals were then examined for regulated expression of MutIL-15 / mFc. At the age of approx. 8-16 weeks, the animals were injected with 250 ⁇ g / kg mifepristone (Sigma, Deisenhofen M 8046) dissolved in sesame oil a total of three times intraperitoneally every other day. The animals were sacrificed one day after the last injection and RNA or protein was extracted from the tissues.
  • mifepristone Sigma, Deisenhofen M 8046
  • RNA The expression of gene switching protein or immunomodulator in the tissues was then analyzed using ELISA and Western blot.
  • the amount of RNA is determined by means of a quantitative reverse transcription PCR (RT-PCR) in order to determine the amount of transcribed gene switch or immunomodulator.
  • RT-PCR quantitative reverse transcription PCR
  • 1 ⁇ g RNA each are transcribed into cDNA using the Expand Reverse Transcriptase (Röche, Mannheim) according to the manufacturer's instructions.
  • the expression of the gene switch or the mutILl 5 / mFc immunomodulator is then examined quantitatively using the Light Cycler Fast Start DNA Master SYBR Green Kit (Röche, Mannheim).
  • the PCR conditions for the detection of the immunomodulator are as follows: Denaturation: 95 ° C, 600 sec cycles: 95 ° C 15 sec, 60 ° C 5 sec, 72 ° C 10 sec.
  • the PCR conditions for the detection of the gene switch are as follows: Denaturation: 95 ° C, 600 sec
  • mice of the same age are used in the same transgenic line, who had not previously been treated with mifepristone.
  • the transgenic mice are produced in a two-step process.
  • two different lines of transgenic mice are generated, which either express only the gene switch molecule (lines “A") or only the immunomodulator regulated by the gene switch binding site (lines “B”).
  • lines "A" express only the gene switch molecule
  • lines "B” only the immunomodulator regulated by the gene switch binding site
  • From the transgenic mouse strains of the A lines obtained those animals are selected which express suitable amounts of the gene switch molecule and, in a second step, variate with transgenic animals of the B lines.
  • the progeny obtained are then examined for simultaneous expression of the two transgenes. In this way, double transgenic lines "A / B" are obtained which express immune modulators regulated by gene switch molecules.
  • DNA of the constructs pswitch (for lines “A") or 17x4 / IL15 / Oligo and 17x4 / IL15 / Oligo / IVS8 (for lines “B") are cut with suitable restriction enzymes and the desired fragments are purified. Then the fragments are injected into the precuclear nucleus of C3HeB / FeJ mice and the embryos are then implanted in apparently pregnant females. The genomic DNA is extracted from the mice obtained and included Using PCR analysis to examine the integration of the transgene.
  • Example 6 Transplantation of Isles from Donor Organs of Transgenic Mice
  • islets isolated from mouse pancreata are injected under the kidney capsule of diabetic mice (Ferrari-Lacraz et al, The Journal of Immunology, 2001, Vol.167 p. 3478-3485).
  • Donor Islands are isolated from transgenic mice of the strain DBA / 2J, which express MutIL-15 / mFc under the control of the gene switch.
  • the donor mice are pretreated with mifepristone (250 ⁇ g / kg) so that they demonstrably produce MutIL-15 / mFc on the day the organ is removed.
  • donor pancreata are perfused in situ with type IV collagenase (2 mg / ml; Worthington Biochemical Co ⁇ .). After 30 minutes of digestion at 37 ° C., the islands are purified using a discontinuous Ficoll gradient and then cultured in RPMI1640 medium (Gibco, Düsseldorf) with 5.6 mM glucose. Then 300-400 islets are transplanted under the recipient's kidney capsule.
  • the recipient is a 6-10 week old, non-transgenic B6AF1 mouse, in which diabetes was induced by intraperitoneal injection of the beta cell toxin streptozotocin (225 mg / kg; Sigma, Deisenhofen).
  • syngeneic islands i.e., islands from B6AF1 mice
  • Pancreatic islets are grafted aseptically under the left kidney capsule.
  • the mouse is anesthetized and an incision is made under the left costal arch.
  • the left kidney is mobilized out of the abdomen and the lower pole of the kidney capsule is cut briefly.
  • a pocket is formed under the kidney capsule with a blunt sterile cannula.
  • the function of the allograft is monitored via regular blood glucose measurements (Accu-Check III; Boehringer Mannheim, Mannheim). Before and after the diabetes induction and after the island transplant, blood is regularly taken from the tail vein or the retrobulbar venous plexus from the animals and the blood sugar level is determined. Additional controls urine test strips are used between blood tests.
  • Primary graft function is defined as blood sugar levels below 11mmol / l (200 mg / dl) on day 3-5 after the transplant. The graft is considered rejected if the blood sugar level has risen to over 500 mg / dl for at least two consecutive days after observing primary graft function.
  • island transplantations are carried out in which the animals either do not receive mifepristone and thus do not express gene switch-regulated MutIL-15 / mFc or in which the animals are treated with external addition of MutIL-15 / mFc.
  • the animals treated in the manner described can better regulate their blood sugar levels after the transplantation of islet cells which are obtained from transgenic donor mice and show a reduced rejection of the cell transplants when treated with mifepristone.
  • Donor hearts are isolated from transgenic DBA / 2J strain mice that express MutIL-15 / mFc under the control of the gene switch.
  • the donor mice are pretreated with mifepristone (250 ⁇ g / kg) so that they demonstrably produce MutlL-15 / mFc on the day the organ is removed.
  • mifepristone 250 ⁇ g / kg
  • the vena cava is isolated and heparin (400 U / kg) is injected for distribution over the entire circulation.
  • the animals are then bled by dividing the abdominal vessels and the heart exposed using a median sternotomy.
  • the aorta and pulmonary vessels are isolated and divided and the pulmonary veins and the vena cava en masse are ligated with 4-10 Tevdek (Deknatal, Queens Village).
  • the heart is stored at 4 ° C in physiological saline (Physiolosol, Abbot Laboratories, Illinois, USA) immediately after its removal.
  • physiological saline Physiolosol, Abbot Laboratories, Illinois, USA
  • the inferior vena cava and abdominal aorta of the recipient (6-8 Week-old, non-transgenic B6AF1 mouse) are dissected and the vessels are provided with loosely located vascular clamps.
  • the end of the donor aorta is connected to the side of the recipient abdominal aorta with an 8-0 prole thread.
  • the donor's pulmonary artery is fused to the recipient's vena cava in the same way.
  • the vascular clamps are removed and the donor heart is warmed with 37 ° C warm Ringer's lactate solution, so that the heart contraction starts again spontaneously.
  • the recipient animals are treated with mifepristone 250 ⁇ g / kg every other day from the day of transplantation, so that they continuously produce MutIL-15 / mFc. Survival of the graft is checked every other day by palpating the beating heart through the abdominal wall and assessed on a scale of 1+ to 4+ based on the strength and rate of the impulses.
  • the heart is said to be rejected when there are no more heart muscle contractions. Rejection is prevented if the donor hearts beat for a longer period than hearts in untreated control animals.
  • heart transplantations are carried out, in which the animals either do not receive mifepristone and thus do not express a gene switch-regulated MutIL-15 / mFc or in which the animals are treated with external addition of MutIL-15 / mFc.
  • This example shows that the heterotopic heart transplants in the animals treated with mifepristone remain functional longer than in the untreated animals.
  • Example 8 Preparation of transgenic ES cell lines 100 ⁇ g DNA of constructs 17x4 / IL15 / Oligo / RIPnh / GS,
  • 17x4 / IL15 / Oligo / RIPnh / IVS8 / GS were cut with the restriction enzymes Eco47III and Notl, the fragments were purified and resuspended in at least 100 ⁇ l sterile PBS.
  • the constructs 17x4 / IL15 / Oligo / RIPhn / GS and 17x4 / IL15 / Oligo / RIPhn / IVS8 / GS were then introduced by electroporation into mouse ES cells of the SVJ129 or RI line. To Exponentially growing mouse ES cells were trypsinized, separated and counted.
  • ES cell medium DMEM with 20 mM Hepes, 15% heat-inactivated FCS, 50 U / ml penicillin, 50 ⁇ g / ml streptomycin, 0.1 mM non-essential amino acids, 0.1 mM mercaptoethanol, 10 3 U / ml Leukemia Inhibitory Factor
  • the cells were selected for up to 5-9 days for uptake of the construct and individual transgenic clones were isolated by hand under the sterile bench and transferred to 96-well plates. The cells were passaged before reaching confluence and successively transferred to 48-well plates, 24-well plates, 6-well plates and 10 cm dishes.
  • the cell clones were checked for controllable expression of the gene switch and MutIL-15 / mFc using quantitative RT-PCR or MutIL-15 / mFc using ELISA and Western blot assays (as described above in Examples 3 and 4) ) examined.
  • the transgenic ES cells are produced in a 2-step process. First, transgenic ES cells are generated, which only express the gene switch molecule in a regulated manner. From the transgenic cell lines obtained, those clones are selected which express suitable amounts of the gene switch molecule. In a second step, these clones are supertransfected with DNA constructs that encode the immune modulator regulated by a gene binding site.
  • double-transgenic ES cells which express the immune modulator regulated by gene switch molecules.
  • 100 ⁇ g DNA of the gene switch construct are cut with suitable restriction enzymes, the desired fragment is purified, resuspended in sterile PBS and introduced into ES cells by electroporation as described above. Since the construct confers resistance to the antibiotic Zeocin, the cells can be selected for successful transfection by treatment with this antibiotic.
  • Transgenic clones are isolated from the cells obtained and the expression of the gene switch molecule as a function of mifepristone addition is examined by quantitative RT-PCR.
  • Those clones which express suitable amounts of the gene switch molecule are super-transfected in a second step by renewed electroporation with purified Eco47III / NotI fragments of the constructs 17x4 / IL15 / Oligo / RIPhn and 17x4 / IL15 / Oligo / RIPhn IVS8 and by hygromycin. Treatment selected for uptake of the second transgene. The simultaneous integration of both transgenes is checked by means of PCR analysis of the genomic DNA.
  • the double transgenic cell clones obtained are after addition of 10 nM mifepristone for controllable expression of the gene switch and MutIL-15 / mFc by means of quantitative RT-PCR or MutIL-15 / mFc protein with the aid of ELISA and Western blot assays as above examined in Example 5 examined. Subsequently, those clones are selected from the cell lines obtained which produce and secrete the immune modulator MutlL-15 / mFc in sufficient quantities only after adding mifepristone.
  • Example 9 Transplantation of insulin-producing cells which are produced from transgenic ES cells. Before the transplantation, undifferentiated hygromycin-resistant ES cell clones are used to produce insulin-producing cells which are under the control of the Gene switch MutIL-15 / mFc express Soria et al. (Diabetes. 2000 Feb .; 49 (2):
  • the insulin-producing cells are treated with mifepristone before the transplant so that they produce sufficient MutIL-15 / mFc. Then 1 million insulin-producing cells in streptozotocin-treated diabetic C57BL / 6 mice either under the kidney capsule (as described in Example 7) or in the spleen (Soria et al. (Diabetes. 2000 Feb .; 49 (2): 157-62) The recipient animals are treated with mifepristone (250 ⁇ g / kg) every other day from the day of transplantation so that they continuously produce MutIL-15 / mFc.
  • the function of the allograft is monitored via regular blood glucose measurements (Accu-Check III; Boehringer Mannheim, Mannheim).
  • Primary graft function is defined as blood sugar levels below 11mmol / l (200 mg / dl) on day 3-5 after the transplant. The graft is considered rejected if the blood sugar level rises to over 500 mg / dl for at least two consecutive days if primary graft function is previously observed.
  • insulin-producing cells are transplanted into recipient animals which have been produced from the same cell clone but are not pretreated with mifepristone and therefore do not express any gene switch-regulated MutIL-15 / mFc.
  • insulin-producing cells can also be used which contain the MutIL-15 / mFc construct but not the gene switch
  • Animals also serve as controls, which are treated with external addition of MutlL-15 / mFc after the receipt of insulin-producing cells derived from stem cells.

Abstract

Die Erfindung betrifft eine humane oder tierische nicht-totipotente Zelle, die mindestens eine Nukleinsäure enthält, welche für mindestens einen Immunmodulator unter der Kontrolle eines durch Zugabe einer Wirksubstanz regulierbaren Genschaltermoleküls kodiert sowie ihre Herstellung und Verwendung zur Transplantation, zur Inhibierung einer Transplantationsabstobetaungsreaktion sowie zur Prophylaxe und/oder Therapie von Transplantationsfolge- und/oder Autoimmunkranheiten.

Description

Transplantierbare Zelle
Die Erfindung betrifft eine humane oder tierische nicht-totipotente Zelle, die mindestens eine Nukleinsäure enthält, welche für mindestens einen Immunmodulator unter der Kontrolle eines durch Zugabe einer Wirksubstanz regulierbaren Genschaltermoleküls kodiert sowie ihre Herstellung und Verwendung zur Transplantation, zur Inhibierung einer
Transplantationsabstoßungsreaktion sowie zur Prophylaxe und/oder Therapie von Transplantationsfolge- und/oder Autoimmunkrankheiten.
Eine Vielzahl von menschlichen Erkrankungen beruhen auf dem Absterben oder der Fehlfunktion von spezifischen Zellen, Geweben oder Organen und kann medikamentös oft nur unzureichend behandelt werden. Die konventionelle Therapie bestand bisher darin, das geschädigte Gewebe oder Organ durch Transplantation von gesunden Zellen, Geweben oder Organen, wie z.B. Herz, Lunge, Niere, Pankreas oder Zellen bzw. Gewebe hieraus zu ersetzen, die von gesunden menschlichen Spendern erhalten wurden. Aufgrund der bestehenden Knappheit an Organspendern kann der Bedarf an Spendergewebe jedoch nur unzureichend gedeckt werden. Dieser Mangel könnte durch die Transplantation von Geweben bzw. Zellen aus speziell gezüchteten nicht-humanen Spender- Säugetieren behoben werden. Alternativ können Ersatzzellen auch aus Zelllinien gewonnen werden. Diese Zellen können ebenfalls humanen oder nicht-humanen Ursprunges sein.
Bei jeder Transplantation von nicht-humanen Zellen, Geweben oder Organen in einen humanen Organismus (Xenotransplantation) bzw. von humanen Spenderzellen, Spendergewebe oder Spenderorganen eines genetisch nicht- identischen Menschen in einen humanen Empfänger (Allotransplantation) besteht jedoch das Problem der immunvermittelten Transplantatabstoßung. Die Abstoßung basiert auf der Erkennung der auf den Spenderzellen vorhandenen Histokompatibilitätsantigene als Fremdproteine, wodurch eine gegen das Transplantat gerichtete Immunantwort ausgelöst wird. Die Immunantwort gegen allogene und xenogene Zellen, Gewebe und Organe beruht auf zahlreichen komplexen Wechselwirkungen zwischen unterschiedlichen Zellen (z.B. B-Zellen, T- Zellen, Antigen präsentierenden Zellen) des Immunsystems und kann letztlich zur Abstoßung der/des übertragenen Zellen, Gewebes oder Organs führen. Zur Unterdrückung der Immunrea tionen muss der Empfänger daher mit Medikamenten, sogenannten Immunmodulatoren, behandelt werden, die das Immunsystem unterdrücken oder eine Toleranz des Empfängers gegenüber dem Transplantat bewirken und somit eine solche Abstoßungsreaktion verhindern.
Als Immunmodulatoren werden z.B. Steroide (Prednisolon und Derivate), Calcineurininhibitoren (Cyclosporin A, Tacrolimus), Rapamycin (Sirolimus), Mycophenolat Mofetil (MMF), Azathioprin (Imuran), Lymphocyten-Antiseren (ALG - anti-Leukocyte-Globulin, ATG - anti Thymocyte Globulin) oder monoMonale Antikörper (anti-CD25: Zenapax, Simulect) verwendet.
Während Antikörpertherapien als unterstützende Therapien während der ersten Wochen und Monate nach der Transplantation verabreicht werden (Induktionstherapie), werden die Calcineurininhibitoren, Steroide und oft MMF oder Imuran in der Regel vom Zeitpunkt der Transplantation an über den gesamten Zeitraum, in dem der Patient das Transplantat trägt, d.h. teilweise lebenslang, administriert. Unabhängig von der Art, Wirkungsweise und Kombination der derzeit verwendeten immunmodulatorischen Substanzen werden die Medikamente jedoch zumeist intravenös oder oral verabreicht und damit über den gesamten Körper des Patienten verteilt. Damit gelangen sie nicht nur an ihren Wirkungsort, d.h., in das transplantierte Organ oder Gewebe, oder den Ort an dem die transplantierten Zellen anwachsen, sondern auch in alle anderen Gewebe und Organe des Organismus. Dies führt zu einer generellen Unterdrückung der Immunabwehr, die nicht auf das Transplantat begrenzt ist. In den zielfremden Geweben und Organen beeinträchtigen sie die Funktion des Immunsystems und verhindern damit die physiologische Funktionsweise vieler Organe, was zu zahlreichen Nebenwirkungen fuhren kann.
Zu den bedeutendsten Nebenwirkungen konventioneller Immunmodulatortherapie zählen dabei Bluthochdruck, Nieren- und Leberschäden, das vermehrte Auftreten von opportunitischen Infektionen und eine erhöhte Rate von verschiedenen malignen Entartungen wie z.B. JKrebs und lymphoproliferative Erkrankungen. So kann z.B. die Infektion mit dem Cytomegalievirus, die normalerweise nur mit geringen Symptomen verläuft, in immunsupprimierten Patienten zur Ausbildungen von Hepatitis, Lungen- und Hirnhautentzündungen führen und ist damit eine Hauptursache für die erhöhte Sterblichkeitsrate von Transplantatempfängern (Transplantation Clinical Management, Vol. 5, 2000 Medscape, Inc., Web MD Health Network, NY, USA). Andere Studien belegen, dass immunsupprimierte Allograft-Empfanger nach konventioneller Behandlung ein drei- bis vierfach erhöhtes Krebsrisko haben, welches bei bestimmten JKrebsarten sogar um den Faktor 20-500 ansteigen kann (Penn L, Clin. Transpl. 147-158, 1998). Zusätzlich können Immunmodulatoren, insbesondere Immunsuppressiva, unabhängig von ihrer Wirlcung auf das Immunsystem generell toxische Eigenschaften aufweisen. So verursachen Calcineurininhibitoren oftmals Niereninsuf izienz, Bluthochdruck, Hyperlipidämie und die Entwicklung eines Diabetes mellitus. Weiterhin führt die regelmäßige Medikamentenbehandlung zu einer starken Beeinträchtigung der Lebensqualität und wird daher oftmals von den Patienten nicht in dem medizinisch notwendigen Ausmaß durchgeführt.
Weiterer Nachteil ist, dass die Medikamente in relativ hoher Dosierung verabreicht werden müssen, damit sie nach Verteilung über den gesamten Blutkreislauf noch die therapeutische Wirkkonzentration am Transplantationsort erreichen. Hierdurch wird das Auftreten der genannten Nebenwirkungen noch begünstigt bzw. verstärkt. Um diesen Tatsachen entgegenzuwirken, wurden in den letzten Jahren zahlreiche neuartige immuntherapeutische und begleitende diagnostische Ansätze entwickelt.
Ein klinisch erprobter Ansatz zur Reduktion der Nebenwirkungen der Immunmodulation besteht z.B. darin, neuentwickelte immunreaktive Medikamente in niedrigen Konzentrationen zu kombinieren und damit Standardtherapeutika (z.B. Steroide, Cyclosporin A) zu ersetzen. Dies wurde z.B. erfolgreich bei der Transplantation von allogenen Inselzellen zur Behandlung des Diabetes mellitus durchgeführt, bei der die diabetogene Wirkung von Glucokortikoiden durch die Verwendung einer Kombination aus Daclizumab, Sirolimus und niedrigdosiertem Tacrolimus umgangen wurde (Shapiro J., The New England Journal of Medicine, Vol 343, N. 4, 230-238, 2000). Die Nebenwirkungen der einzelnen Immunmodulatoren dieser Kombination wie z.B. das Absinken des Leukozytenspiegels, das Auftreten von Mundabszessen und Verdauungsstörungen, konnten jedoch auch bei dieser Behandlung nicht vermieden werden.
Ein weiterer Therapieansatz könnte darin bestehen, im Patienten durch Verabreichung neuartiger immunmodulatorischer Substanzen eine immunologische Toleranz gegenüber dem Fremdgewebe zu erreichen. Toleranz ist in diesem Zusammenhang als die fehlende Immunantwort bzw. Abstoßungsreaktion gegen das Transplantat ohne fortwährende Immunsuppression charakterisiert. Die Verabreichung solcher immunmodulatorischen Substanzen erfolgt nach den üblichen, dem Fachmann bekannten, Methoden (siehe z.B. WO 00/12138; WO 97/41232; WO 96/26274; WO 01/87330; Ferrari-Lacraz et al, The Journal of Immunology, 2001, Vol.167 S. 3478-3485; Kim et al, The Journal of Immunology, 1998, 160: 5742-5748; Penn, Transplant Proc, 1991, 23:1101; Beveridge et al, Lancet, 1984, 1:788). Ein Nachteil des herkömmlichen Therapieansatzes ist, dass auch Toleranz induzierende Immunomodulatoren im Normalfall systemisch (z.B. intravenös) administriert werden. Ein weiterer Nachteil ist, dass die Immunmodulatoren als therapeutische Produkte aus natürlichen Quellen isoliert oder als rekombinante Moleküle biotechnologisch hergestellt werden müssen, um sie dann dem Patienten von extern zu verabreichen. Produktionsbedingte Aspekte können jedoch dazu führen, dass ein Immunmodulator in nativer Form oder als rekombinantes Molekül nicht in ausreichender Menge bzw. Aktivität isoliert oder hergestellt werden kann. Zusätzlich kann die ex vivo Produktion des Immunmodulators die Zugabe von Substanzen erforderlich machen, die ein weiteres gesundheitliches Risiko für den Patienten bedeuten können (z.B. Substanzen, die aus tierischen Organismen isoliert wurden und daher potientiell Zoonosen übertragen können). Dies kann zur Folge haben, dass nicht alle Patienten in ausreichender Weise mit dem Immunmodulator behandelt werden können oder dass die Behandlung mit zusätzlichen gesundheitlichen Risiken verbunden ist.
Im Rahmen der Erfindung wurde die Aufgabe gestellt, eine Immuntherapie zu entwickeln, die die oben beschriebenen Nachteile vermeidet bzw. verringert, insbesondere, die ihre immunmodulatorische, insbesondere immunsuppressive, Wirkung im Organismus genau dort entfaltet, wo die Immmunantwort aktiviert wurde bzw. aktivierbar ist, d.h. am Lokalisationsort der transplantierten Zellen oder Organe, und gleichzeitig eine zeitlich und mengenmäßig regulierbare immunmodulatorische Wirkung ermöglicht.
Erfmdungsgemäß wurde eine kontrollierbare Expression des Immunmodulators in Zellen mit Hilfe eines regulierbaren Genexpressionssystems erreicht.
Mit Hilfe dieses regulierbaren Genexpressionsystems ist es möglich, einen Immunmodulator lokal (z.B. in Zelltransplantaten) und dosiert zu produzieren. Eine solche regulierbare Produktion von Immunmodulatoren konnte bisher nicht gezeigt werden. Umso überraschender war der Befund, in transienten Zellkulturversuchen eine regulierbare Produktion des Immunmodulators MutlL- 15/mFc zu erhalten (siehe Beispiel 1 und Kim et al, I. Immunology 1998, 160, 5742-5748).
Dieses regulierbare Expressionssystem ermöglicht es, dass Immunmodulatoren gar nicht mehr oder nur noch in geringen Konzentrationen kontinuierlich systemisch verabreicht werden müssen.
Ein weiterer erheblicher Vorteil der Erfindung liegt darin, dass auch an dem Lokalisationsort des Transplantats keine anhaltende Suppression der Immunantwort erfolgen muss, wenn dies aus medizinischer Sicht nicht erforderlich ist, sondern diese nur bei Bedarf aktiviert wird. Dadurch werden Nebenwirkungen sowie eine Belastung des Körpers, insbesondere der Transplantatregion, reduziert. Auch für den Patienten bedeutet dies eine physische und psychische Entlastung, da er nicht kontinuierlich auf die Verabreichung von Immunmodulatoren, insbesondere Immunsuppressiva, angewiesen ist. Unter Immunsuppressiva in diesem Sinne sind Substanzen zu verstehen, die eine Immunantwort, hervorgerufen durch das Transplantat, insbesondere Zelle(n), Gewebe und/oder Organ(e), in dem Organismus ganz oder teilweise inhibieren. Zusätzlich liefert diese Erfindung den Vorteil, dass der Imunmodulator nicht mehr aus einer nativen Quelle isoliert oder rekombinant hergestellt und aufgereinigt werden muss. Der Immunmodulator wird in therapeutisch aktiver Menge und Form im Empfangerorganismus und/oder am Wirkort in vivo gebildet und behält somit seine volle native Aktivität. Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft daher eine transplantierbare humane oder tierische nicht-totipotente Zelle, die mindestens eine Nukleinsäure enthält, die für mindestens einen Immunmodulator unter der Kontrolle eines durch Zugabe einer Wirksubstanz regulierbaren Genexpressionssystems kodiert. - Unter einer Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man eine RNA oder DNA, insbesondere genomische DNA, rekombinant hergestellte DNA, cDNA oder synthetische DNA, die beispielsweise auf Phosphoramidierungsebene synthetisiert wurde. Ebenfalls sind Kombinationen und/oder Modifikationen von Nukleotiden dieser Nukleinsäuren umfasst. Weiterhin umfasst dieser Begriff einzel- und doppelsträngige Nukleinsäuren.
Ebenso umfasst sind Nukleinsäuren, die funktioneil verknüpfte Komponenten beinhalten, beispielsweise ein oder mehrere Gene oder aktive Teile davon kodierend für einen oder mehrere Immunmodulatoren sowie mindestens ein regulierbares Genexpressionssystem, dessen A tivierungszustand durch Zugabe einer Wirksubstanz reguliert wird, sowie regulierbare Elemente, beispielsweise Promotoren und regulative Nukleotidsequenzen sowie ein Polyadenylierungssignal, beispielsweise ein SV40-Polyadenylierungssignal. Die Komponenten sind funktioneil verknüpft, wenn sie derart verbunden sind, dass unter dem Einfluss der Transkriptionsregulation die Sequenz(en) der enthaltenen Gene bzw. des Gens transkribiert werden bzw. wird.
Der Begriff Immunmodulator der vorliegenden Erfindung umfasst im wesentlichen jede Art von Molekül, das immunmodulatorische, insbesondere immunsupprimierende, Wirkung aufweist, beispielsweise Proteine, Fusionsproteine und lösliche Liganden, wobei unter einem Fusionsprotein ein Expressionsprodukt eines fusionierten Gens zu verstehen, das aus der Verknüpfung zweier oder mehrerer Gene oder Genfragmente entsteht.
Eine immunmodulierende Wirkung liegt vor, wenn die Immunantwort eines Organismus, einer Zelle und/oder eines Gewebes im Wesentlichen inhibiert wird, beispielsweise durch eine veränderte oder unterdrückte Rezeptorbindung. Eine immunmodulierende Wirkung liegt ebenfalls vor, wenn eine immunologische Toleranz gegenüber einer/s transplantierten Zelle, Gewebe oder Organs bewirkt wird. Die Wirkung des Immunmodulators umfasst beispielsweise eine oder mehrere der folgenden Aktivitäten: die Inhibierung einer durch T-Zellen vermittelten Antigenerkennung, • die Inhibierung eines über einen Rezeptor auf einer T-Zelle vermittelten Signals, die Aktivierung eines über einen Rezeptor auf einer T-Zelle vermittelten Signals, die Inhibierung des Wachstums von T-Zellen, • die Inhibierung von Molekülen die das Überleben von T-Zellen unterstützen die Inhibierung von Effektormolekülen von T-Zellen(wie TNF-alpha, IFN- gamma), die Inhibierung der Adhäsion von T-Zellen, die Inhibierung einer T-Zell-kostimulatorischen Interaktion (die Aktivierung eines Lymphozyten erfolgt über zwei Signale: zum einen erfolgt eine
Stimulierung über den Antigenrezeptor, zum anderen erfolgt ein weiteres Signal zur klonalen Expansion und Differenzierung eines ungeprägten Lymphozyten; diese kostimulatorische Interaktion kann durch einen Immunmodulator inhibiert werden) • die Jmhibierung der Aktivierung, der Proliferation, des Überlebens, der Antigenpräsentation, des Signalisierens, und/oder der Effektorfunktionen von weiteren Zellen, die an einer Immunantwort beteiligt sind, wie z.B. allgemeine und spezielle antigenpräsentierende Zellen, insbesondere z.B. dendritische Zellen und Monozyten/Makrophagen B-Zellen, neutrophile Granulozyten und NK Zellen die Inhibierung der zellulären Interaktion von unterschiedlichen
Zellen, entweder über Oberflächenrezeptoren oder über sekretierte Moleküle, wie z.B. Zytokine, Chemokine oder Wachstumsfaktoren, die an 'einer Immunantwort beteiligt sind, wie z.B. allgemeine und spezielle antigenpräsentierende Zellen, insbesondere z.B. dendritische Zellen und Monozyten/Makrophagen, T-Zellen, B-Zellen, neutrophile Granulozyten und NK Zellen, die Inhibierung der Migration von Zellen, die an einer Immunantwort beteiligt sind, wie z.B. spezielle antigenpräsentierende Zellen, insbesondere z.B. dendritische Zellen und Monozyten/Makrophagen, T-Zellen, B-Zellen, neutrophile Granulozyten und NK Zellen, die Inhibierung von Komponenten des Komplementsystems die Inhibierung von phagozytotischen Aktivitaeten im Zusammenhang mit der Präsentation von Fremd- oder Autoimmunantigenen, oder durch die Bindung von Antikörpern an Antigene, und/oder die Inhibierung von Entzündungsreaktionen.
Als Immunmodulatoren eignen sich beispielsweise Antikörper. Besonders bevorzugt handelt es sich um einen Antikörper gegen IL-15, IL-1, IL-2, IL-6, IL- 7, IL-12, IL-17, IL-18, IL-21, Interferon gamma, TNF-alpha, CD2, CD3, CD4, CD8, CD28, CD40, CD80, CD86 oder CD 154 oder gegen deren Rezeptoren.
Ebenfalls bevorzugt Immunmodulatoren sind FasL, PD-Ll oder PD-L2.
Weitere bevorzugte Immunmodulatoren sind IL-15, IL-10, IL-4, IL-2, Interferon gamma oder TGF-beta, insbesondere als Fusionspotein. Besonders bevorzugt umfasst das Fusionsprotein einerseits Wildtyp-IL-15, Wildtyp-IL-10, Wildtyp-IL- 4, Wildtyp-Interferon gamma oder Wildtyp-TGF-beta und andererseits einem Fc- Fragment. Weiterhin besonders bevorzugt umfasst das Fusionsprotein einerseits mutierte IL-15, bevorzugt solche, bei denen an Position 101 und 108 „Q" durch „D" ersetzt worden ist oder mutiertes IL-2 und andererseits ein Fc-Fragment (siehe beispielsweise WO 97/41232; Kim et al, J Immunol. (Ϊ998), 160(12):5742-5748; WO 01/87330), das beispielsweise an den C-terminus des mutierten IL-15 Molel il über die Hinge-Region fusioniert ist.
Weitere bevorzugte Immunmodulatoren sind Fusionsproteine aus einerseits TNF- alpha-Rezeptor (Typ 1 oder 2), ICOS, CTLA-4, PSGL-1, ICAM-1 oder VCAM-1 und andererseits einem Fc-Fragment, wie beispielsweise im Fall der TNF- Rezeptor Fusionsproteine, solche die in EP 417,563 A offenbart sind.
Weitere bevorzugte Immunomodulatoren sind sekretierte Varianten von Zytokin- oder Wachstumsfaktorrezeptoren, wie z.B. IL-15Ralpha, IL-6, IL-7, IL-12, IL-17, IL-18 Rezeptoren, beispielsweise als Varianten ohne Transmembrandomäne und zytoplasmatischem Schwanz, vorzugsweise als Fusionsprotein mit einem Fc- Fragment.
Vorzugsweise ist das Fusionsprotein ein chimäres Fusionsprotein. Geeignete Fusionsproteine sind beispielsweise IL-15 Derivate, umfassend IL-15 oder imitiertes IL-15 und ein heterologes Fc-Fragment.
Unter einem • Fc(Fragment crystallizable)-Fragment ist das Fragment eines Antikörpers zu verstehen, das keine Antigene bindet, beispielsweise ein solches, das alle konstanten Domänen oder alle konstanten Domänen ausser der ersten konstanten (teilweise oder vollständig) Domäne umfasst, wie z.B. ein solches, das die Hinge-Region, die zweite (CH2) und dritte konstante (CH3) Domäne der schweren Kette umfasst. Das Fc-Fragment kann aus natürlicher Quelle stammen, rekombinant hergestellt werden und/oder synthetisiert werden. Entsprechende
Methoden sind dem Fachmann bekannt. Dabei kann das Fc-Fragment auch eine oder mehrere Mutatationen gegenüber der natürlichen Sequenz aufweisen, beispielsweise solche, die eine geeignete Schnittstelle für die Konstruktion eines
Fusionsproteins beinhalten (siehe Kim et al. supra). In einer weiteren Ausfuhrungsform der Erfindung ist das Fc-Fragment ein solches von einem Immunglobulin (Ig)G, insbesondere ein humanes IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 und/oder ein analoges Säugetier IgG und/oder ein IgGM, insbesondere ein humanes IgM oder ein analoges Säugetier IgM und/oder ein murines IgG2a.
Die Immunmodulatoren können Wildtyp-Sequenzen oder auch mutierte Sequenzen aufweisen. Vorzugsweise liegen die Immunmodulatoren bereits in einer funktionell aktiven Form vor, beispielsweise in einer fimktionell aktiven löslichen Form oder einer funktioneil aktiven viralen Form. Unter einer löslichen Form ist ein Molekül zu verstehen, das nicht an eine Zellmembran gebunden ist, wie z.B. ein lösliches Rezeptormolekül. Unter einer viralen Form ist eine Proteinisoform zu verstehen, die endogen von einem Virusgenom kodiert wird, wie z.B. virales IL-10.
Unter einer mutierten Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleotid- bzw. Aminosäuresequenz zu verstehen, die Abweichungen zur Wildtyp-Sequenz durch beispielsweise Deletion, Addition, Insertion oder Substitution einer oder mehrerer Nukleotide bzw. Aminosäuren enthält, ohne jedoch die immunmodulatorische Wirkung vollständig zu verlieren.
Mutierte Immunmodulatoren im Sinne der vorliegenden Erfindung sind daher Moleküle, die vorzugsweise eine Sequenzhomologie von mindestens ungefähr 80%, vorzugsweise mindestens ungefäJhr 90%, besonders bevorzugt mindestens ungefähr 95%, am meisten bevorzugt mindestens ungefähr 99% der Sequenz zu der Wildtyp-Sequenz aufweisen.
Unter Sequenzhomologie im Sinne der vorliegenden Erfindung wird der Grad der Ähnlichkeit (% Positive) von zwei Sequenzen verstanden, die bei Polynukleotiden beispielsweise mit Hilfe von BLASTN 2.0.14 bestimmt wird, wobei der Filter^off gesetzt ist und BLOSUM 62 ist (Altschul et al. 1997, Nucl. Acids Res, 25: 3389- 3402). Die Sequenzhomologie kann mit gängigen Sequenzhomologie- Programmen z. B. im Internet unter http://www.hgsc.bcm.tmc.edu /SearchLauncher/ überprüft werden.
Unter dem Begriff regulierbares Genexpressionssystem im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man die Kombination aus einer Sequenz kodierend für ein Genschaltermolekül und eine Genschalterbindesequenz, wobei die Bindung des Genschaltermoleküls an die Genschalterbindesequenz durch die Zugabe einer Wirksubstanz reguliert wird, wodurch eine Kontrolle der Expression eines Zielgens, hier ein Zielgen kodierend für einen Immunmodulator, erfolgt (siehe auch Burcin et al. 1998, Frontiers in Bioscience 3: cl-7). Generell ist es möglich, dass ein Genschaltermolekül durch Bindung an eine geeignete Genschalterbindesequenz die Transkription des Zielgens aktivieren oder inhibieren kann. Die Aktivierung kann darauf beruhen, dass das Genschaltermolekül z.B. Kontaktstellen für die RNA-Polymerase und/oder beteiligte Transkriptionsfaktoren zur Verfügung stellt. Die Inhibierung kann dadurch bewirkt werden, dass das Genschaltermolekül die für den Transkriptionskomplex erforderlichen DNA-Bindungsstellen durch seine Bindung an die DNA blockiert und dadurch unzugänglich für beispielsweise die RNA- Polymerase und/oder beteiligte Transkriptionsfaktoren macht.
Die Zugabe einer Wirksubstanz kann die Transkription des Zielgens positiv (Aktivierung) oder negativ (Inhibierung) beeinflussen. Beispielsweise wird das Zielgen in Abwesenheit der Wirksubstanz nicht exprimiert. Nach Zugabe der Wirksubstanz bindet diese an das Genschaltermolekül und verursacht dadurch die Aktivierung und Bindung des Genschaltermoleküls an die Genschalterbindesequenz, wodurch nachfolgend die Transkription des Zielgens initiiert wird. Ein weiteres Beispiel ist, dass das Genschaltermolekül in Abwesenheit der Wirksubstanz an die DNA bindet und die Transkription aktiviert. Nach Zugabe und Bindung der Wirksubstanz wird das Genschaltermolekül inaktiviert und die Transkription des Zielgens wird beendet. Unter dem Begriff Genschaltermolekül versteht man ein Molekül, vorzugsweise ein Protein, insbesondere ein Fusionsprotein, enthaltend eine Bindungsstelle für eine Wirksubstanz und eine Transkriptionsaktivierungsdomäne, das nach Bindung der Wirksubstanz seinen Aktivierungszustand verändert. Unter dem Begriff Genschalterbindesequenz im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man vorzugsweise eine 5 '-stromaufwärts vom Translationsstart (+1) des Gens, oder aktiven Teiles hiervon, welches für einen Immunmodulator kodiert, gelegene Nukleinsäuresequenz, welche die Transkription des Zielgens, insbesondere bezüglich der Transkriptionsrate und/oder der Gewebespezifϊtät, kontrolliert oder die Translation kontrolliert. An diese Genschalterbindesequenz ist mittelbar oder unmittelbar eine regulatorische Nukleinsäuresequenz mit Promotoraktivität, vorzugsweise ebenfalls mit Enhanceraktivität gebunden.
Die Funktionsweise des erfindungsgemäßen regulierbaren Genexpressionssystems kann beispielsweise wie folgt beschrieben werden: Wenn kein Genschaltermolekül an die Genschalterbindesequenz gebunden ist, erfolgt keine Expression des gekoppelten Zielgens und in diesem Fall wird kein Immunmodulator produziert.
Bei Zugabe einer Wirksubstanz bindet diese beispielsweise an die Dimerisierungsdomäne des Genschaltermoleküls. Durch diese Bindung entsteht eine Konformationsänderung der Dimensierungdomäne, die eine Dimerisierung zweier Genschaltermoleküle und die nachfolgende Bindung an die Genschalterbindesequenz bewirkt. Durch diese Bindung wird die Aktivierungsdomäne des Genschaltermoleküls in die Nähe des minimalen TATA Promotors gebracht und somit die Transkription des gekoppelten Zielgenes kodierend für einen Immunmodulator initiiert. Nach beendeter Zugabe der Wirksubstanz wird die Bindung des Genschaltermoleküls an die Genschalterbindesequenz gelöst und somit die Zielgenexpression beendet. Das Genschaltermolekül der vorliegenden Erfindung ist demnach durch Zugabe einer Wirksubstanz regulierbar, z.B. inhibierbar oder aktivierbar, bevorzugt aktivierbar und bindet dann an die Genschalterbindungsstelle.
Unter bevorzugter Wirksubstanz ist eine pharmakologisch verträgliche Substanz zu verstehen, die unmittelbar oder mittelbar die regulierte Expression eines Gens oder mehrerer Gene über dessen/deren Genschalter(s) bewirkt, beispielsweise Mifepriston, Tetracyclin, Doxycyclin oder Rapamycin.
Das regulierte Genexpressionssystem der vorliegenden Erfindung ist insbesondere ein Progesteron-Genexpressionssystem, welches einen Genschalter umfasst, der einen artifiziell zusammengesetzten Transkriptionsfaktor darstellt, bestehend aus einer GAL4-DNA-Bindedomäne (Gal4-DBD), einer Dimerisierungsdomäne, abgeleitet von einem mutierten Progesteronrezeptor mit verkürzter Ligandenbindungsstelle (hPR-LBD), und einer Aktivierungsdomäne der p65- Untereinheit des humanen NF-κB Proteins (p65-AD). Die Genschalterbindesequenz ist eine Nukleotidsequenz bestehend beispielsweise aus einer 17-Nukleotid langen GAL4-Bindungssequenz mit anschließenden minimalen TATA Promotor, an den das entsprechende Zielgen gekoppelt wird. Ein solches regulierbares Genexpressionssystem mit den genannten Genschalterkomponenten Gal4-DBD/hPR-LBD/p65-AD ist beispielsweise in Wang et al. 1994, PNAS 91:8180-8184 oder Wang et al. 1997, Gene Therapy 4: 432-441 beschrieben. Die in diesem System geeignete Wirksubstanz ist beispielsweise Mifepriston, ein artifizielles, nicht im Säugetier vorkommendes hormonähnliches Molekül, das spezifisch an die Dimerisierungdomäne des Genschaltermoleküls bindet und diesen durch die dadurch bewirkte Dimerisierung aktiviert.
Ein weiteres regulierbares Genexpressionssystem der vorliegenden Erfindung ist ein Tetracyclin-Genexpressionssystem, das ein durch Tetracyclin (Tet) oder das Derivat Doxycyclin (Dox) induzierbares Sytem darstellt, bei dem das Genschaltermolekül aus einem Tet Transaktivatorprotein besteht. Dieser Transaktivator (tTA) ist ein Fusionsprotein aus einer VP16 Aktivierungsdomäne und dem Tet Repressor (TetR) von Escherichia coli. In Abwesenheit von Tetracyclin hat der tTA eine hohe Affinität zu seiner Genschalterbindestelle, dem Tet-responsiven Element (TRE), und aktiviert die Expression des Zielgens. Bei Zugabe der Wirksubstanz Tetracyclin wird die DNA-Bindung und somit die Zielgenaktivierung inhibiert. Dieses regulierbeare Genexpressionssystem wird beispielsweise in Gossen 1995, Science 268: 1766-1769; Früh 1995, Nature 375:415-418; Chao et al. 1998, Mol. Cell. Biol. 18 (8): 4883-4898; Halappnavar et al. 1999, J. Biol. Chem. 274 (52): 37097-37104 oder van der Viag et al. 2000, J. Biol. Chem. 275 (1): 697-704 beschrieben.
Eine Modifikation dieses regulatorischen Tet Systems ist der reverse Transaktivator (rtTA). In diesem System ist der Wildtyp TetR durch einen mutierten TetR (rTetR) ersetzt, wodurch das Fusionsprotein die Genschalterbindestelle der DNA nur in Anwesenheit von Doxycyclin bindet und somit gekoppelte Zielgene induziert, wie beispielsweise in Gossen 1995, Science 268: 1766-1769; Gossen et al. 1992, PNAS 89: 5547-5551; Linstedt et al. 1997, Mol. Biol. Cell 8: 1073-1087; Mehlen et al. 1998, Nature 395: 801-804 oder Joosse et al. 2000, Hum. Mol. Genet. 9: 3075-3082 beschrieben.
Ein weiteres regulierbares Genexpressionssystem der vorliegenden Erfindung ist ein Rapamycin-Genexpressionssystem. Hierbei handelt es sich um eine durch die Wirksubstanz Rapamycin vermittelte induzierbare Dimerisierung der Proteine FKBP12 und FRAP. Eine Dimerisierung dieser beiden Proteine bewirkt eine DNA-Bindung der an FRAP gebundenen AJktivierungsdomäne und somit das Anschalten eines gekoppelten Zielgenes. Ein solches regulierbeares Genexpressionssystem wird beispielsweise in Rivera et al. 1996, Nature Med 2: 1028-1032 beschrieben. Die Verabreichung dieser Wirksubstanz kann nach dem Fachmann geläufigen Methoden erfolgen, beispielsweise intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, intrakranial, intraorbital, intrakapsulär, intraspinal, transmuskulär, topikal, oral oder über die Schleimhaut-Membran, z.B. die Nase oder die Mundhöhle. Weitere Methoden der Verabreichung sind beispielsweise die systemische oder lokale Injektion, die Perfusion oder die Katheter-basierte Verabreichung. Als orale Darreichungsform eignen sich z.B. Tabletten oder Kapseln. Eine Verabreichung über die Lunge erfolgt beispielsweise mit Hilfe von Sprays und über die Haut in Form von Dispositorien, die unter die Haut implantiert werden. Transdermal-therapeutische Systeme (TTS) sind z.B. aus EP 0 944 398-A1, EP 0 916 336-A1, EP 0 889 723-A1 oder EP 0 852 493-A1 bekannt.
Vorzugsweise sind die Zellen transplantierbar. Transplantierbar im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet, dass die lebende Zelle an eine andere Stelle desselben Organismus oder in einen anderen (Empfänger-)Organismus übertragbar ist, wobei es sich vorzugsweise um eine nicht-tumorigene Zelle handelt, bzw. sofern es sich um eine von einer Tumorzelle abstammende Zelle handelt, diese vor der Transplantation entsprechend behandelt wird (z.B. durch mito tische Inaktivierung), um ihre Proliferation zu inhibieren (siehe z.B. WO 00/64459 und US 5,175,103; Pleasure et al. (1992), The Journal of Neuroscience, 12(5): 1802-1815".
Die erfindungsgemäße transplantierbare humane oder tierische nicht-totipotente Zelle ist insbesondere eine Säugetierzelle, inklusive einer humanen Zelle, und stammt beispielsweise aus einem Menschen, einer Maus, einer Ratte, einem Meerschweinchen, einem Kaninchen, einer Kuh, einem Schaf, einer Ziege, einem Pferd, einem Schwein, einem Hund, einer Katze oder einem Affen, vorzugsweise aus einem Menschen. > Erfindungsgemäße Zellen sind beispielsweise Epithelzellen, Endothelzellen, Leberzellen, Herzzellen, Hautzellen, Muskelzellen, Nervenzellen, Knochenmarkszellen, Knochenzellen, Knorpelzellen, Blutzellen,
Bindegewebszellen und Zellen aus der Bauchspeicheldrüse, der Niere, dem Auge oder der Lunge.
Unter einer nicht-totipotenten Zelle versteht man eine Zelle, die sich nicht selbständig zu seinem vollständigen Organismus zu entwickeln vermag.
In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Zelle um eine Stammzelle, eine Vorläuferzelle und/oder eine immortalisierte Zelle. Vorzugsweise handelt es sich um eine pluripotente oder multipotente embryonale, fötale, neonatale oder adulte Stammzelle. Besonders bevorzugte Stammzellen, die aus adultem Gewebe stammen, aber nicht auf diese beschränkt sind, umfassen neuronale Stammzellen, Stammzellen aus dem Knochenmark, mesenchymale Stammzellen, hämatopoetische Stammzellen, epitheliale Stammzellen, sowie Stammzellen aus dem Verdauungstrakt, der Haut, dem Fettgewebe, dem Darm, der Plazenta und dem Duktus des Pankreas.
Eine Zelle der vorliegenden Erfindung umfasst auch eine Zelle, welche die oben beschriebene erfindungsgemäße enthält, und die in ein Gewebe oder ein Organ eines humanen oder tierischen Organismus eingebracht wird, bevor und/oder nachdem dieses Gewebe oder Organ in denselben oder einen anderen humanen oder tierischen Organismus transplantiert wird.
Eine bevorzugte Ausführungsform betrifft eine erfmdungs gemäße Zelle in Form einer Zelllinie.
Eine erfindungsgemäße Zelllinie kann beispielsweise hergestellt werden durch Transformation oder Infektion einer Zelllinie mit der oben beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäure mit Hilfe von Methoden, die dem Fachmann geläufig sind, beispielsweise Transfektion, Transformation oder Infektion.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kodiert die Nukleinsäure zusätzlich eine Selektionskassette, insbesondere ein geeignetes Transfektions- Markergen und/oder Differenzierungs-Markergen.
Eine Selektionskassette im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäuresequenz, die für mindestens ein Gen kodiert, das eine gezielte Selektion von bestimmten Zellen, beispielsweise transfizierter oder differenzierter Zellen, bewirkt.
Für eine solche Selektion können beispielsweise Differenzierungs-Markergene, Transfektions-Markergene und Reportergene verwendet werden. Als solche werden überwiegend Gene verwendet, die eine Resistenz gegen bestimmte toxische Substanzen, beispielsweise Antibiotika, vermitteln. Die häufigsten in diesem Zusammenhang verwendeten Antibiotika sind Neomycin, Hygromycin (hph), Zeocin (Sh ble) und Puromycin (pacA). Weitere Beispiele für derartige Gene, insbesondere zur Selektion von Stammzellen, sind beispielsweise Gene, die die Expression von Fluoreszenzmarkem, z.B. GFP, regulieren, mit deren Hilfe die zu selektierenden Zellen über fluoreszenzvermittelte Zeil-Sortierung (FACS) aufgereinigt werden können. Weitere Beispiele von Selektionsmarkern sind Oberflächenmoleküle, z.B. Wachstumsfaktor-Rezeptoren, mit deren Hilfe Zellen über magnetische Immunobeads angereichert werden können (Bonini C, Science Vol 276, 1719-1724, 1997). Weitere Beispiele sind Gene, die für eine Enzymaktivität (z.B. Thymidinkinase) kodieren, die einen Vorläufer einer toxischen Substanz, sog. "Prodrug" (z.B. Ganciclovir) in eine toxische Substanz umwandeln. In diesem Fall kann eine Negativ- Selektion erfolgen, d.h., es überleben nur die Zellen, die den dem Gen vorgeschalteten Promotor icht exprimieren. Weitere Gene der erfϊndungsgemäßen Selektionskassette können lacZ (kodierend für ß-Lactamase), ß-Lactamase, Chloramphenicolacetyltransferase (CAT), Adenosin Deaminase (ADA), Dihydrofolatreduktase (DHFR), und Xanthinguaninphosphoribosyltransferase (XGPRT) sein. Dem Fachmann sind Reagenzien bekannt, die gegebenenfalls hinzugezogen werden können, um die Funktion dieser Gene zu sichern oder zu steigern, beispielsweise zusätzliche Nukleinsäuresequenzen.
In einer bevorzugten Ausführungsform kodiert die Nukleinsäure zusätzlich ein NK-Zellen- inhibierendes und/oder ein Killerzellen-inhibierendes Molekül, vorzugsweise ein humanes MHC-Klasse-I-Molekül, ein chimeres MHC-Klasse-I- Molekül oder ein virales MHC-Klasse-I- Homolog.
Unter Killerzellen ("killer cells") versteht der Fachmann eine heterogene Population mononukleärer Zellen mit spontanem oder erworbenem zytotoxischen Potential. Unter NK-Zellen (natürliche Killerzellen) sind Killerzellen zu verstehen, die natürlich vorhanden sind, d.h, nicht das Resultat einer Immunantwort sind und somit nicht Antigen-spezifisch induziert sind.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, welche für mindestens einen Immunmodulator und mindestens ein durch Zugabe einer Wirksubstanz regulierbares Genexpressionssystems kodiert, wie oben bereits näher beschrieben wurde.
Bevorzugt kodiert die Nukleinsäure ebenfalls für mindestens ein die Genexpression kontrollierendes Element. Unter diesen Elementen sind beispielsweise Promotoren oder regulative Nukleinsäuresequenzen zu verstehen. Durch diese sowie durch (nachfolgend näher erläuterte) Expressionsvektoren können geeignete Bedingungen für die Expression einer Nukleinsäure geschaffen werden. Im allgemeinen enthalten Expressionsvektoren die für die jeweilige Zelle bzw. das jeweils zu transkribierende Gen geeignete Promotoren. Beispiele für regulierbare Elemente, die konsumtive Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind Promotoren, die von der RNA-Polymerase III erkannt werden. Solche Promotoren für die konstitutive Expression in allen Zeil- und Gewebetypen sind z.B. der pGK (Phosphoglyceratkinase)-Promotor, der CMV (Cytomegalievirus)-Promotor, der TK (Thymidinkinase)-Promotor, der EFlα (Elongationsfaktor-l-alpha)-Promotor, der SV40 (Simian Virus)-Promotor, der RSV (Rous Sarcoma Virus)-Promotor und der pUB (Ubiquitin)-Promotor.
Beispiele für regulierbare Elemente, die zell- bzw. gewebespezifische Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind Promotoren oder Aktivatorsequenzen aus Promotoren oder Enhancern von solchen Genen, die für Proteine kodieren, die nur in bestimmten Zelltypen exprimiert werden. Derartige Promotoren sind beispielsweise der Insulin-Promotor für Beta-Zellen des Pankreas, der Sox-2- Promotor für Nervenzellen, der Myosin-Schwere-Kette-Promotor für Muskelzellen, der VE-Cadherin-Promotor für Endothelzellen und der Keratinpromotor für Epithelzellen.
Weitere Beispiele für regulierbare Elemente, die eine regulierbare Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind der Tetracyclinoperator in Kombination mit einem entsprechenden Repressor (Gossen M. et al, (1994) Curr. Opin. Biotechnol. 5, 516-20).
Ebenfalls kann die Expression über regulative Nukleotidsequenzen, welche die Expression mengenmäßig und/oder zeitabhängig beeinflussen, gesteuert werden. Hierzu zählen beispielsweise Enhancersequenzen, Leadersequenzen, Polyadenylierungssequenzen, IRES-Sequenzen, Introns, Insulatorsequenzen und Repressorsequenzen. Die erfmdungsgemäße Nukleinsäure kann auf einem oder mehreren Nukleinsäure- Molekülen lokalisiert sein. Erfindungsgemäß müssen im Falle mehrerer Nukleinsäure-Moleküle diese jedoch funktionell zusammenwirken. Im Sinne der vorliegenden Erfindung können z.B. (i) die Sequenz für das Genschaltermolekül, (ii) die Sequenz für den Immunmodulator unter Regulation der Genschalterbindestelle und (iii) die Sequenzen für die Selektionsmarker auf drei verschiedenen Nukleinsäuremolekülen liegen. Durch Transkription des Genschaltermoleküls im Zellkern kann das nach erfolgter Translation im Cytoplasma gebildete Genschalterprotein wiederum im Zellkern an die Genschalterbindestelle der Immunmodulatorsequenz binden und dessen Expression regulieren.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Vektor, der mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält.
Vektoren im Sinne der vorliegenden Erfindung können Plasmide, Shuttle- Vektoren, Phagemide, Cosmide, adenovirale Vektoren, retrovirale Vektoren, Expressionsvektoren und gentherapeutisch wirksame Vektoren sein.
Expressionsvektoren im Sinne der vorliegenden Erfindung umfassen mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, mindestens ein Translations-Initiations- Signal, ein Translations-Terminations-Signal und/oder ein Polyadenylisierungs- Signal zur Expression in Eukaryoten.
Derartige Expressionsvektoren, insbesondere zur Expression in Säugetierzellen, sind u.a. kommerziell erhältlich, beispielsweise pIRES (Fa. Clontech, Heidelberg, DE), pCI-neo Vektor (Fa. Promega, Mannheim, DE), pCMV-Script (Fa. Stratagene, La Jolla, USA) und pcDNA3 Vektor (Fa. Invitrogen, Karlsruhe, DE) oder können aus einzelnen Elementen individuell zusammengestellt werden. Erfindungsgemäße gentherapeutisch wirksame Vektoren sind zum Beispiel Plasmidvektoren, Virusvektoren, beispielsweise Adenovirus-Vektoren, retrovirale Vektoren oder Vektoren, die auf Replikons von RNA Viren beruhen (siehe z.B. Lindemann et al, 1997, Mol. Med. 3: 466-76; Springer et al, 1998, Mol. Cell. 2: 549-58; Khromykh, 2000, Curr. Opin. Mol. Ther.; 2: 555-69).
Gentherapeutisch wirksame Vektoren lassen sich auch dadurch erhalten, dass man die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Fragmente mit Liposomen komplexiert. Bei der Lipofektion werden kleine unilamellare Vesikel aus kationischen Lipiden durch Ultraschallbehandlung der Liposomensuspension hergestellt. Die DNA wird ionisch auf der Oberfläche der Liposomen gebunden, und zwar in einem solchen Verhältnis, dass eine positive Nettoladung verbleibt und die Plasmid- DNA zu 100% von den Liposomen komplexiert wird. Neben den Lipidmischungen DOTMA (1 ,2-dioleyloxypropyl-3-trimethylammoniumbromid) und DPOE (dioleoxylphosphatidylethanolamin) wurden inzwischen zahlreiche neue Lipidformulierungen synthetisiert und auf ihre Transfektionseffizienz bei verschiedenen Zelllinien getestet. (Behr et al. 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 6982-6986; Gao und Huang, 1991, Biochem. Biophys. Acta 1189, 195-203; Feigner et al. 1994, J. Biol. Chem. 269, 2550-2561). Beispiele der neuen Lipidformulierungen sind DOTAP N-[l-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N- trimethyl-ammoniumethyl-sulfat oder DOGS (TRANSFECTAM; dioeta- decylamidoglycylspermin). Hilfsstoffe, die den Transport von Nukleinsäuren in die Zellen erhöhen, können beispielsweise Proteine oder Peptide, die an DNA gebunden sind oder synthetische Peptid-DNA-Moleküle, die den Transport der Nukleinsäure in den Kern der Zell ermöglichen, sein (Schwartz et al, 1999, Gene Therapy 6: 282; Branden et al. 1999, Nature Biotechs. 17: 784). Hilfsstoffe umfassen auch Moleküle, die die Freisetzung von Nukleinsäuren in das Zytoplasma der Zelle ermöglichen (Planck et al, 1994, J. Biol. Chem. 269, 12918; Kichler et al, 1997, Bioconj. Chem. 8, 213) oder beispielsweise Liposomen (Uhlmann und Peimann, 1990, Chem. Rev. 90, 544). Die erfindungsgemäßen Zellen können auch zur Expression eines heterologen Gens verwendet werden.
Gentherapeutische Vektoren können durch Transfektion (z.B. Elektroporation, Lipofektion, Calciumphosphatpräziptation) oder Infektion in Zellen eingebracht werden.
Femer ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Arzneimittel, welches mindestens eine erfindungsgemäße Zelle und geeignete Hilfs- und/oder Zusatzstoffe enthält.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann zur Prophylaxe und/oder Therapie von Erkrankungen dienen, beispielsweise von
(a) rheumatischen Erkrankungen, beispielsweise rheumatische Arthritis, Sjögren's Syndrom, Skleroderma, Dermatomyositis, Polymyositis, Reiter' s Syndrom oder
Behcef s Krankheit,
(b) Diabetes Typ I oder LADA
(c ) Autoimmunerkrankungen der Schilddrüse, beispielsweise Graves" I rankheit, (d) Autoimmunerkrankungen des zentralen Nervensystems, beispielsweise Multiple Sklerose,
(f) Hauterkrankungen, beispielsweise Psoriasis oder Neurodermitis,
(g) entzündliche Darmerkrankungen, beispielsweise Ulcerative Colitis oder Morbus Crohn
(h) ImmunstörungserkranJkungen (i) Gefäßerkranlαmgen und
(j) Transplantationsfolgeerkranl ungen, beispielsweise Transplantatabstoßungsreaktionen.
Geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe, die z.B. der Stabilisierung und/oder Konservierung des Arzneimittels dienen, sind dem Fachmann allgemein geläufig. Hierzu zählen beispielsweise physiologische Kochsalzlösungen, Ringer-Dextrose, Ringer-Laktat, University of Wisconsin-Lösung/NiaSpan® (Beizer UW), EuroCollins Lösung, DMSO, Ethylenglykol, Sukrose, Trehalose, Ficoll, Perfluorokarbone, entmineralisiertes Wasser, Stabilisatoren, Antioxidantien, Komplexbildner, antimikrobielle Verbindungen, Proteinaseinhibitoren und/oder inerte Gase.
Die Verabreichung des erfindungsgemäßen Arzneimittels erfolgt nach Methoden, die für den jeweiligen Zell-, Gewebs- bzw. Organtyp, dem sie verabreicht werden sollen, geeignet sind. Derartige Methoden sind dem Fachmann geläufig. Die Verabreichung des Arzneimittels kann danach beispielsweise für Leberzellen intravenös, für Herzmuskelzellen intramuskulär oder auch durch eine Katheter-basierte
Verabreichung und - für ß-Zellen subkutan, intravenös, intraperitoneal, enkapsuliert oder intramuskulär erfolgen.
Das Arzneimittel kann in den Organismus eingebracht werden entweder mit Hilfe eines ex vivo Ansatzes, bei dem die Zellen aus dem Patienten entfernt, genetisch modifiziert, beispielsweise durch DΝA-Transfektion, und danach erneut in den Patienten eingeführt werden oder mit Hilfe eines in vivo Ansatzes, bei welchem erfindungsgemäße gentherapeutisch wirksame Vektoren in den Körper des Patienten als nackte DNA oder unter Verwendung von viralen oder nicht-viralen erfindungsgemäßen Vektoren oder erfindungsgemäßen Zellen eingebracht werden.
Es ist bekannt, dass die Dosierung von Arzneimitteln von mehreren Faktoren abhängt, beispielsweise von dem Körpergewicht, dem generellen Gesundheitszustand, dem Ausmaß der Körperoberfläche, dem Alter des Patienten sowie der Wechselwirkung mit anderen Medikamenten. Eine Dosierung hängt ebenfalls von der Art der Verabreichung ab. Die Dosierung ist daher im Einzelfall für jeden Patienten vom Fachmann zu bestimmen. Die Verabreichung des Arzneimittels kann einmal oder mehrmals am Tag und über mehrere Tage hinweg erfolgen; auch dies ist vom Fachmann bestimmbar.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein humanes oder tierisches organspezifisches Gewebe und/oder ein humanes oder tierisches Säugetierorgan, das mindestens eine erfindungsgemäße Zelle enthält.
Die Begriffe organspezifisches Gewebe und Säugetierorgan im Sinne der vorliegenden Erfindung umfassen beispielsweise die Säugetierorgane Herz, Haut, Bauchspeicheldrüse, Nieren, Leber, Muskeln, Nerven, Auge, Lunge, Knochenmark, Knorpel, Knochen, Gefäße, Bindegwebe, bzw. Gewebe dieser Organe.
Femer ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein transgenes nichthumanes Säugetier, das mindestens eine erfindungsgemäße Zelle enthält.
Transgene Tiere zeigen im Allgemeinen eine gewebespezifisch erhöhte Expression von Nukleinsäuren und sind daher für die Analyse beispielsweise von Immunreaktionen sehr geeignet. Bevorzugt werden transgene Mäuse verwendet.
Ein erfindungsgemäßes nicht-humanes Säugetier ist beispielsweise eine Maus, eine Ratte, ein Meerschweinchen, ein Kaninchen, eine Kuh, ein Schaf, eine Ziege, ein Pferd, ein Schwein, ein Hund, eine Katze oder ein Affe.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer erfindungsgemäßen Zelle, eines erfindungsgemäßen humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder eines erfindungsgemäßen humanen oder tierischen Säugetierorgans zur Transplantation in ein humanes oder tierisches Säugetier. Vorzugsweise handelt es sich bei der erfindungsgemäßen Transplantation um eine Auto-, Allo- oder Xenotransplantation.
Unter Transplantation versteht der Fachmann die Übertragung oder auch Veφflanzung von lebendem Material, beispielsweise Zellen, Gewebe und
Organe, an eine andere Stelle desselben Organismus (Autotransplantation) oder von einem Organismus (Spender) in einen anderen Organismus (Empfänger). Bei der Transplantation in einen anderen Organismus wird unterschieden zwischen
Synotransplantation, bei der Spender und Empfänger derselben Spezies angehören und genetisch völlig oder weitgehend identisch sind,
Allotransplantation, bei der Spender und Empfänger derselben Spezies angehören, aber immungenetisch different sind und
Xenotransplantation, bei der Spender und Empfänger nicht derselben Spezies angehören und demzufolge immungenetisch völlig different sind.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer erfindungsgemäßen Zelle, eines erfindungsgemäßen humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder eines erfindungsgemäßen humanen oder tierischen Säugetierorgans zur Inhibierung einer Transplantatabstoßungsreaktion in einem tierischen Säugetier oder im Menschen.
Unter einem tierischen Säugetier im Sinne der vorliegenden Erfindung ist beispielsweise eine Maus, eine Ratte, ein Meerschweinchen, ein Kaninchen, eine Kuh, ein Schaf, eine Ziege, ein Pferd, ein Schwein, ein Hund, eine Katze oder ein Affe zu verstehen.
Unter einer Transplantatabstoßungsreaktion versteht der Fachmann einen Vorgang, durch den transplantiertes Material, beispielsweise Zellen, Gewebe oder ein Organ, vom Empfängerorganismus abgestoßen werden. Diese Abstoßungsreaktion wird durch eine zelluläre und eine humorale Immunität hervorgerufen. Ursache dieser Abstoßungsreaktion ist eine Differenz der Eiweißstruktur zwischen transplantiertem Material und Empfänger. Die Eiweißstruktur des übertragenen Gewebes wird vom Immunsystem des Empfängers als immunogen erkannt, wodurch eine Immunantwort ausgelöst wird.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer erfindungsgemäßen Zelle, eines erfindungsgemäßen humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder eines erfindungsgemäßen humanen oder tierischen Säugetierorgans zur Prophylaxe und/oder Therapie von TransplantationsfolgeerkranJkungen und/oder Autoimmunerkrankungen. Beispiele für derartige Erkrankungen wurden bereits vorangehend im Rahmen der Anwendungsgebiete des erfindungsgemäßen Arzneimittels beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Verwendungen zur Inhibierung einer Transplantatabstoßungsreaktion sowie zur Prophylaxe und/oder Therapie von Transplantationsfolgeerkrankungen und/oder Autoimmunerkrankungen können beispielsweise erfolgen, indem die erfindungsgemäßen Zellen, Gewebe und/oder Organe in ein humanes oder tierisches Säugetier eingebracht werden. Die Expression des erfindungsgemäßen Immunmodulators wird über das erfindungsgemäße regulierbare Genexpressionssystem gesteuert. Diese Steuerung erfolgt durch die Verabreichung bzw. das Absetzen einer erfindungsgemäßen Wirksubstanz, wodurch das Genschaltermolekül aktiviert bzw. deaktiviert wird. Im Fall der Aktivierung aktiviert der Genschalter die Transkription des Zielgens, welches für den Immunmodulator kodiert. Der dadurch exprimierte Immunmodulator inhibiert im wesentlichen eine Abwehrreaktion des Immunsystems auf die/das transplantierte Zelle, Gewebe bzw. Organ und zwar vor allem in der Transplantatregion des Organismus des humanen oder tierischen Säugetiers.
Eine Behandlung basierend auf der Verwendung von Zellen kann dadurch erreicht werden, dass erfindungsgemäße Zellen aus Epithelzellen, Endothelzellen,
Leberzellen, Derivaten von nicht-totipotenten embryonalen Stammzellen bzw. nicht-totipotenten embryonalen Keimzellen, oder aus adultem Gewebe stammenden Stammzellen ausgewählt werden. Bevorzugte, aus adultem Gewebe stammende Stammzellen umfassen neuronale Stammzellen, Stammzellen aus dem Knochenmark, mesenchymale Stammzellen, hämatopoetische Stammzellen, epitheliale Stammzellen, Stammzellen aus dem Verdauungstrakt, der Haut, dem Fettgewebe, dem Darm, der Plazenta und dem Duktus des Pankreas, die in ein humanes oder tierisches Säugetier eingebracht werden.
Femer ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Zelle, wobei das Verfahren die folgenden Schritte enthält: a. Einbringen mindestens einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure und/oder mindestens eines erfindungsgemäßen Vektors in eine transplantierbare humane oder tierische nicht-totipotente Zelle, und b. Expression der Nukleinsäure unter Zugabe mindestens einer geeigneten Wirksubstanz zur Regulierung des Genschaltermoleküls.
Zum Einbringen einer Nukleinsäure, eines Vektors, eines Differenzierungs- Markergens oder eines Transfektions-Markergens oder einer Zelle gemäß vorliegender Erfindung in eine Zelle werden die dem Fachmann geläufigen Standardmethoden der Transfektion, Transformation, Elektroporation oder Injektion verwendet.
Geeignete Bedingungen, die eine Expression der Nukleinsäure bewirken bzw. verstärken, wurden bereits vorangehend beschrieben. Hierzu zählen beispielsweise Expressionsvektoren, Promotoren und regulierbare Nukleinsäuresequenzen, z.B. Enhancer, Polyadenylierungssequenzen.
Femer ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein in vitro- Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder eines erfindungsgemäßen humanen oder tierischen Säugetierorgans, wobei das Verfahren die folgenden Schritte enthält: a. Einbringen sowohl mindestens einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure und/oder mindestens eines erfindungsgemäßen Vektors als auch mindestens eines Differenzierangs-Markergens in mindestens eine nicht-totipotente
Stammzelle, eine nicht-totipotente Vorläuferzelle und/oder eine nicht- totipotente immortalisierte Zelle, b. Differenzierung der Zelle aus Schritt a, c. Selektionieren der differenzierten Zelle aus Schritt b. und d. Einbringen der selektierten Zelle aus Schritt c. in ein humanes oder tierisches organspezifischen Gewebes und/oder in ein humanes oder tierisches Säugetierorgan.
Bevorzugt wird in einer weiteren Ausführungsform in das genannte erfindungsgemäße in vitro- Verfahren nach, vor oder gleichzeitig mit Schritt a. mindestens ein geeignetes Transfektions-Markergen in eine nicht-totipotente Stammzelle, eine nicht-totipotente Vorläuferzelle und/oder eine nicht-totipotente immortalisierte Zelle eingebracht und nach Schritt a. vorzugsweise die transfizierte Zelle aus Schritt a. selektioniert.
Die Differenzierung der Zellen, die die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten, kann z.B. durch "Embroid Body Formation", vorzugsweise durch Kultivieren der Zellen in Lösungen, durch Kultivieren der Zellen in hoher Dichte, durch Zellaggregation, durch Entzug der Kultivierung auf Feederzellen, Entzug von differenzierungshemmenden Substanzen (z.B. LIF oder von Feederzellen konditioniertes Medium), durch Hinzufügen von Cytokinen, Wachstumsfaktoren, Hormonen, Vitaminen (z.B. Nicotinamid), Retinsäure, Natriumbutyrat oder DMSO zu den kultivierten Zellen oder durch Hinzufügen anderer Substanzen von denen bekannt ist, dass sie die Differenzierung initiieren, eingeleitet werden. ,
Es sind zahlreiche Verfahren zur Selektionierung von Zellen bekannt. Verfahren zur Selektionierung von Zellen aus differenzierten embryonalen Stammzellen sind beispielsweise beschrieben in Klug et al. (J. Clin. Invest. 1996 Jul 1; 98 (l):216-24) und Soria et al. (Diabetes. 2000 Feb.; 49 (2): 157-62).
Bei einer bevorzugten Methode der Selektion enthält die erfindungsgemäße Selektionskassette ein Markergen, und zwar ein Antibiotikum-Resistenzgen. Die Zellen werden selektiert bzw. isoliert, indem die differenzierten Zellen nach Hinzufügen eines geeigneten Antibiotikums während oder nach dem Differenzierungsschritt angereichert werden. Nur die differenzierten Zellen, welche das Markergen exprimieren, sind resistent gegen das Antibiotikum. Nicht differenzierte Zellen sterben ab. Nach der gleichen Methode kann auch die Selektion der transfizierten Zellen erfolgen.
Unter einem erfindungs gemäßen Antibiotikum wird ein Antibiotikum verstanden, gegen welches das bzw. die als erfindungsgemäße Selektionskassette verwendete(n) Antibiotikum-Resistenzgen(e) eine Resistenz erzeugt/en. Nach Hinzufügen des Antibiotikums zu den kultivierten Stammzellen überleben und differenzieren im wesentlichen nur solche Stammzellen, die den Reporter-Gen- Expressionsvektor enthalten.
Ebenfalls kann ein Selektionsverfahren angewendet werden, wobei das bzw. die Gene der erfindungsgemäßen Selektionskassette kodieren für Luciferase, grünes fluoreszierendes Protein, rotes fluoreszierendes Protein und/oder gelbes fluoreszierendes Protein. Die zu selektierenden Zellen werden mittels Fluoreszenz-aktivierter Zeil-Sortierung (FACS) isoliert oder durch eine Affinitätsreinigung selektiert. Weiterhin können Zellen mit Hilfe von Oberflächenmolekülen, z.B. Wachstumsfaktor-Rezeptoren, mittels magnetischen Immunobeads ankonzentriert werden (Bonini C, Science Vol 276, 1719-1724, 1997).
Vorzugsweise kann ein zweites Markergen in die Zellen eingebracht werden, wodurch eine Selektion der Zellen, in denen das Einbringen der Nukleinsäure und/oder des Vektors gemäß Schritt a. des erfindungsgemäßen in vitro- Verfahrens erfolgreich verlief, vorgenommen werden kann. Durch diese doppelte Selektion ist es möglich, eine ca. 90%ig, vorzugsweise ca. 95-100%ig reine Zellpopulation der gewünschten Zellen zu erhalten.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Erzeugung eines erfindungsgemäßen transgenen nicht-humanen Säugetiers, wobei das VerfaJhren die folgenden Schritte enthält: a. Einbringen sowohl mindestens einer erfindungs gemäßen Nukleinsäure und/oder mindestens eines erfindungsgemäßen Vektors als auch mindestens eines geeigneten Transfektions-Markergens in mindestens eine Oocyte, Stammzelle, eine Vorläuferzelle und/oder eine immortalisierte Zelle eines nicht-humanen Säugetieres, b. Selektionieren der transfizierten Zelle aus Schritt a, c. Einbringen der nach Schritt b. selektierten Zelle in mindestens eine nichthumane Säugetier-Blastozyste, d. Einbringen der Blastozyste aus Schritt c. oder des Embryos aus Schritt d. in eine nicht-humane Säugetier-Pflegemutter und e. Identifizierung des sich aus genannter Blastozyte entwickelten transgenen nicht-humanen Säugetiers.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um eine pluripotente oder multipotente embryonale, fötale, neonatale oder adulte Stammzelle. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur
Erzeugung eines erfmdungsgemäßen transgenen nicht-humanen Säugetiers, wobei das Verfahren die folgenden Schritte enthält: a. Einbringen sowohl mindestens einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure und/oder mindestens eines erfindungsgemäßen Vektors als auch mindestens eines geeigneten Transfektions-Markergens in einen der beiden Vorkeme einer befruchteten nicht-humanen Säugetier-Oocyte, b. Einbringen der Säugetier-Oocyte aus Schritt a. in eine nicht-humane Säugetier-Pflegemutter und c. Identifizierung des sich aus genannter Säugetier-Oocyte entwickelten transgenen nicht-humanen Säugetiers.
Es ist bevorzugt, dass die nicht-humane Säugetier-Pflegemutter durch Paarung mit einem Männchen mit durchtrenntem Samenleiter scheinschwanger gemacht wurde.
Verfahren zum Einbringen von Blastozyten und/oder Oozyten in die Pflegemutter sind dem Fachmann bekannt. Es kann beispielsweise durch Injektion in den Eileiter oder Uterus erfolgen (siehe z.B. Hogan, B, Beddington, R, Constantini, F. und Lacy, E, A laboratory Manual (1994), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Seite 173-181).
Die Identifizierung eines transgenen nicht-humanen Säugetiers kann beispielsweise dadurch erfolgen, dass genomische DNA aus dem transgenen nicht-humanen Säugetier, z.B. aus dem Schwanz einer Maus extrahiert wird. In einer nachfolgenden PCR (Polymerase Ketten Reaktion) Analyse werden Primer verwendet, die spezifisch das Transgen für die erfindungsgemäße Nukleinsäure erkennen. Eine Integration des Transgens in das Genom kann auf diese eise nachgewiesen werden. Eine weitere Möglichkeit der Identifizierung kann mittels Southern Blot erfolgen. Hierbei wird genomische DNA auf eine Membran übertragen und mittels DNA- Sonden, beispielsweise radioaktiv markierte DNA-Sonden, die spezifisch für das gesuchte Transgen sind, detektiert.
Verfahren zur Erzeugung eines erfindungsgemäßen transgenen nicht-humanen Säugetiers durch Regenerieren einer nicht-humanen Stammzelle, Oocyte, Vorläuferzelle oder immortalisierten Zelle zu einem transgenen nicht-humanen Tier, insbesondere von transgenen Mäusen sind dem Fachmann beispielsweise aus DE 196 25 049 und US 4,736,866; US 5,625,122; US 5,698,765; US 5,583,278 und US 5,750,825 bekannt und umfassen transgene Tiere, die beispielsweise durch direkte Injektion von erfindungs gemäßen Expressionsvektoren in Embryonen oder Spermatozyten oder über die Transfektion von Expressionsvektoren in embryonale Stammzellen erzeugt werden können (siehe z.B. Polites und Pihkert: DNA Mikromjection and Transgenic Animal Production, Seite 15-68 in Pinkert, 1994: Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press, London, UK; Houdebine 1997, Harwood Academic Publishers, Amsterdam, The Netherlands; Doetschman: Gene Transfer in Embryonic Stern Cells, Seite 115-146 in Pinkert, 1994, supra; Wood: Retrovirus- Mediated Gene Transfer, Seite 147-176 in Pinkert, 1994, supra; Monastersky: Gene Transfer Technology: Alternative Techniques and Applications, Seite 177- 220 in Pinkert, 1994, supra).
Zahlreiche Verfahren zur Herstellung von transgenen Tieren, insbesondere von transgenen Mäusen, sind dem Fachmann ebenfalls u.a. aus der WO 98/36052, WO 01/32855, DE 196 25 049, US 4,736,866, US 5,625,122, US 5,698,765, US 5,583,278 und US 5,750,825 bekannt und umfassen transgene Tiere, die beispielsweise über direkte Injektion von erfindungsgemäßen Vektoreμ in Embryonen oder Spermatozyten oder über die Transfektion von Vektoren oder Nukleinsäuren in embryonale Stammzellen erzeugt werden können (siehe auch Polites und Pinkert, in Pinkert, (1994) Transgenic animal technology, A Laboratory Handbook, Academic Press, London, UK, Seite 15 bis 68; Doetschman, in Pinkert, 1994, supra, Seite 115 bis 146).
In weiteren Ausführungsformen handelt es sich bei der Stammzelle, welche in den genannten erfindungsgemäßen in vitro- Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder eines erfindungsgemäßen humanen oder tierischen Säugetierorgans und in den Verfahren zur Erzeugung eines erfindungsgemäßen transgenen nicht- humanen Säugetiers verwendet wird, um eine pluripotente oder multipotente embryonale, fötale, neonatale oder adulte Stammzelle.
Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein transgenes nichthumanes Säugetier, welches durch das oben beschriebene erfindungsgemäße Verfahren erzeugt wurde, sowie der/die Nachkomme(n) dieses Säugetiers.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen transgenen nicht-humanen Säugetiers zur Gewinnung einer humanen oder tierischen Zelle, eines humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder eines humanen oder tierischen Säugetierorgans für die Allo- und/oder Xenotransplantation.
Im Fall der Zelltransplantation kann diese beispielsweise mittels eines Implantations- Verfahrens oder mittels einer Katheter-Injektionsmethode durch die Blutgefäßwand erfolgen.
Unter Gewinnung im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die Entnahme der/des genannten Zelle, Gewebes und/oder Organs aus dem Organismus eines erfindungsgemäßen transgenen nicht-humanen Säugetiers zu verstehen. Methoden für eine solche Entnahme sind geläufig. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen transgenen nicht-humanen Säugetiers, einer erfindungsgemäßen Zelle, eines erfindungsgemäßen humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder eines erfindungsgemäßen humanen oder tierischen Säugetierorgans zum Auffinden von pharmakologisch aktiven Wirkstoffen und/oder zur Identifizierung von toxischen Substanzen.
Eine solche Methode könnte zum Beispiel darin bestehen, Zellen der vorliegenden Erfindung auf z.B. eine 96-well Mikrotiter-Platte auszusäen, dann eine zu untersuchende pharmakologisch aktive oder toxische Substanz zuzugeben und anschließend mittels Zellzahlbestimmung zu analysieren, ob die Substanz den Tod einer vermehrten Anzahl von Zellen bewirkt hat.
Unter den Begriffen pharmakologisch aktiver Wirkstoff und toxische Substanz im Sinne der Erfindung sind all jene Moleküle, Verbindungen und oder
Zusammensetzungen und Substanzgemische zu verstehen, die unter geeigneten
Bedingungen einen pharmakologischen bzw. toxischen Einfluss auf einzelne
Zellen, einzelne Gewebe, einzelne Organe oder den gesamten Organismus eines tierischen oder humanen Säugetiers ausüben. Mögliche pharmakologisch aktive Wirkstoffe und toxische Substanzen können einfache chemische (organische oder anorganische) Moleküle oder Verbindungen, Nukleinsäuren oder Analoga von
Nukleinsäuren, anti-sense Sequenzen von Nukleinsäuren, Peptide, Proteine oder
Komplexe und Antiköφer sein. Beispiele sind organische Moleküle, die aus
Substanz-Bibliotheken stammen und die auf ihre pharmakologische bzw. toxische Aktivität hin untersucht werden.
Pharmakologisch aktive Wirkstoffe sind beispielsweise Wirkstoffe, die Einfluss ausüben auf: die Teilungs- und/oder Überlebensfähigkeit von Zellen, die Sekretion von Proteinen, z.B. Insulin von Beta-Zellen des Pankreas,
Dopamin von Nervenzellen, die Muskelzellen-Kontraktion und/oder das Wanderungsverhalten von Zellen, die Stoffwechselaktivtät von Zellen die elektrophysiologische Aktivität von Zellen die enzymatische Aktivität von Zellprodukten die Zelldifferenzierung die Zellorganisation zu Geweben bzw Organen In Anwendung auf den gesamten Organismus eines tierischen oder humanen Säugetiers ist hierunter ein Einfluss auf beispielsweise das Herz-Kreislaufsystem, das endokrine System, das Magen-Darm-System, • das Nervensystem sowie die Stoffwechselaktivitäten zu verstehen.
Toxische Substanzen sind beispielsweise Wirkstoffe, die • Zellen nach bestimmten Signalen, beispielsweise Stress, zur Apoptose anregen, das Herz-Kreislaufsystem beeinflussen, das Nervensystem beeinflussen und/oder die Stoffwechselaktivitäten beeinflussen.
Die identifizierten pharmakologisch aktiven Wirkstoffe und toxischen Substanzen können gegebenenfalls kombiniert oder zusammen mit geeigneten Zusatz- und/oder Hilfsstoffen zur Herstellung eines Diagnostikums oder eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Therapie von TransplantationsfolgeerkranJkungen und/oder Autoimmunerkrankungen, wie vorangehend beispielhaft aufgeführt, verwendet werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindungen sind auch:
(i) Humane oder tierische nicht-totipotente Zelle enthaltend mindestens eine Nukleinsäure kodierend für mindestens einen Immunmodulator unter der Kontrolle eines durch Zugabe einer Wirksubstanz regulierbaren Genexpressionssystems.
(ii) Zelle nach (i), dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Zelle um eine Stammzelle, eine Vorläuferzelle und/oder eine immortalisierte Zelle handelt.
(iii) Zelle nach (i) oder (ii), dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine pluripotente oder multipotente embryonale, fötale, neonatale oder adulte Stammzelle handelt.
(iv) Zelle nach mindestens einem der (i) bis (iii) in Form einer Zelllinie.
(v) Zelle nach mindestens einem der (i)-(iv), dadurch gekennzeichnet, dass das regulierbare Genexpressionssystem ein Progesteron- Genexpressionssystem, ein Tetracyclin-Expressionssystem und/oder ein Rapamycin-Genexpressionssystem ist.
(vi) Zelle nach mindestens einem der (i)-(v), dadurch gekennzeichnet, dass der Immunmodulator mindestens eine der folgenden funktionellen Eigenschaften aufweist: a. die Inhibierung einer Antigenerkennung, die durch T-Zellen vermittelt wird b. die Inhibierung eines über einen Rezeptor auf einer T-Zelle vermittelten Signals, c. die Aktivierung eines über einen Rezeptor auf einer T-Zelle vermittelten Signals, d. die Inhibierung des Wachstums von T-Zellen, e. die Inhibierung von Molekülen die das Überleben von T-Zellen unterstützen f. die Inhibierung von Effektormolekülen von T-Zellen(wie TNF-alpha, IFN- gamma), g. die Inhibierung der Adhäsion von T-Zellen, h. die Inhibierung einer T-Zell-kostimulatorischen Interaktion (die Aktivierung eines Lymphozyten erfolgt über zwei Signale: zum einen erfolgt eine Stimulierung über den Antigenrezeptor, zum anderen erfolgt ein weiteres Signal zur klonalen Expansion und Differenzierung eines ungeprägten Lymphozyten; diese kostimulatorische Interaktion kann durch, einen Immunmodulator inhibiert werden) i. die Inhibierung der Aktivierung, der Proliferation, des Überlebens, der
Antigenpräsentation, des Signalisierens, und/oder der Effektorfunktionen von weiteren Zellen, die an einer Immunantwort beteiligt sind, wie z.B. allgemeine und spezielle antigenpräsentierende Zellen, insbesondere z.B. dendritische Zellen und Monozyten/Makrophagen B-Zellen, neutrophile Granulozyten und NK Zellen die Inhibierung der zellulären Interaktion von unterschiedlichen Zellen, entweder über Oberflächenrezeptoren oder über sekretierte Moleküle, wie z.B. Zytokine, Chemokine oder Wachstumsfaktoren, die an einer Immunantwort beteiligt sind, wie z.B. allgemeine und spezielle antigenpräsentierende Zellen, insbesondere z.B. dendritische Zellen und Monozyten/Makrophagen, T-Zellen, B-Zellen, neutrophile Granulozyten und JNK Zellen, j. die Inhibierung der Migration von Zellen, die an einer Immunantwort beteiligt sind, wie z.B. spezielle antigenpräsentierende Zellen, insbesondere z.B. dendritische Zellen und Monozyten/Makrophagen, T- Zellen, B-Zellen, neutrophile Granulozyten und NK Zellen, k. die Inhibierung von Komponenten des Komplementsystems
1. die Inhibierung von phagozytotischen Aktivitäten im Zusammenhang mit der Präsentation von Fremd- oder Autoi munantigenen, oder durch die
Bindung von Antiköφern an Antigene, und/oder m. die Inhibierung von Entzündungsreaktionen.
(vii) Zelle nach mindestens einem der (i) bis (vi), dadurch gekennzeichnet, dass der Immunmodulator ein Antiköφer ist.
(viii) Zelle nach mindestens einem der (i) bis (vi), dadurch gekennzeichnet, dass der Immunmodulator a. ein Rezeptor ist b. ein löslicher sekretierter Rezeptor ist c. ein sekretiertes Protein oder Peptid ist
(ix) Zelle nach (viii), wobei der Immunmodulator ein Fusionsprotein ist aus einem mutierten IL 15 und einem Fc-Fragment, wobei das Fc- Fragment an den C-Terminus des mutierten IL 15 Moleküls, bevorzugt über die Hinge-Region, fusioniert ist.
(x) Zelle nach (ix), dadurch gekennzeichnet, dass das Fc-Fragment des Antiköφers ein solches von einem IgG, insbesondere ein humanes IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 oder ein analoges Säugetier IgG oder ein IgM, insbesondere ein humanes IgM oder ein analoges Säugetier IgM ist.
(xi) Zelle nach mindestens einem der (i)l bis (x), dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure zusätzlich eine Selektionskassette, insbesondere ein geeignetes Transfektions-Markergen und oder Differenzierungs- Markergen, kodiert.
(xii) Zelle nach mindestens einem der (i) bis (xi), dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure zusätzlich ein Molekül kodiert, das NK-Zellen- und/oder Killerzellen inhibiert.
(xiii) Zelle nach mindestens einem der (i)-(xi), dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure zusätzlich ein Molekül kodiert, dass a. Dendritische Zellen inhibiert b. Monocyten und oder Makrophagen inhibiert c. B-Zellen inhibiert d. Polmoφhnukleäre Zellen, z.B. Neutrophile Granulyozyten inhibiert
(xiv) Zelle nach (xiii), dadurch gekennzeichnet, dass das genannte inhibierende Molekül ein humanes MHC-Klasse-I-Molekül, ein chimeres MHC-Klasse-I-Molekül oder ein virales MHC-Klasse-I- Homolog ist.
(xv) Nukleinsäure kodierend für mindestens einen Immunmodulator und mindestens ein durch Zugabe einer Wirksubstanz regulierbares Genexpressionssystem.
(xvi) Vektor enthaltender mindestens einen Nukleinsäure nach (xv). (xvii) Arzneimittel, enthaltend mindestens eine Zelle nach einem der (i) bis (xiv) und geeignete Hilfs- und/oder Zusatzstoffe.
(xviii) Humanes oder tierisches organspezifisches Gewebe und/oder humanes oder tierisches Säugetierorgan, enthaltend mindestens eine Zelle nach einem der (i) bis (xiv).
(xix) Transgenes nicht-humanes Säugetier, enthaltend mindestens eine Zelle nach einem der (i) bis (xiv).
(xx) Verwendung einer Zelle nach einem der (i) bis (xiv) und/oder eines humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder eines humanen oder tierischen Säugetierorgans nach (xviii) zur Transplantation in ein humanes oder tierisches Säugetier.
(xxi) Verwendung nach (xx), dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Allo-, Auto- oder Xenotransplantation handelt.
(xxii) Verwendung einer Zelle nach einem der (i) bis (xiv), einer Nukleinsäure nach (xv), eines humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder eines humanen oder tierischen Säugetierorgans nach (xviii) zur Herstellung eines Medikamentes zur Inhibierung einer Transplantatabstoßungsreaktion in einem humanen oder tierischen Säugetier, gegebenenfalls in Anwesenheit mindestens eines Immunmodulators.
(xxiii) Verwendung einer Zelle nach einem der (i) bis (xiv), einer
Nukleinsäure nach (xv), eines humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder eines humanen oder tierisphen Säugetierorgans nach (xviii) zur Herstellung eines Medikamentes zur Prophylaxe und/oder Therapie von Transplantationsfolgeerkrankungen und/oder Autoimmunerkrankungen.
(xxiv) Verfahren zur Herstellung einer Zelle nach einem der (i) bis (xiv) enthaltend folgende Schritte: c. Einbringen mindestens einer Nukleinsäure nach (xv) und/oder mindestens eines Vektors nach (xvi) in eine transplantierbare humane oder tierische nicht-totipotente Zelle, und d. Expression der Nukleinsäure unter Zugabe mindestens einer geeigneten Wirksubstanz zur Regulierung des Genschalters.
(xxv) In v/tro-Verfahren zur Herstellung eines humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder humanen oder tierischen Säugetierorgans nach (xviii), enthaltend die folgenden Schritte: e. Einbringen sowohl mindestens einer Nukleinsäure nach (xv) und/oder mindestens eines Velrtors nach (xvi) und als auch mindestens eines Differenzierungs-Markergens in mindestens eine nicht-totipotente Stammzelle, eine nicht-totipotente Vorläuferzelle und/oder eine nicht- totipotente immortalisierte Zelle, f. Differenzierung der Zelle aus Schritt a, g. Selektionieren der differenzierten Zelle aus Schritt b. und h. Einbringen der selektierten Zelle aus Schritt c. in ein humanes oder tierisches organspezifischen Gewebes und/oder in ein humanes oder tierisches Säugetierorgan.
(xxvi) Verfahren nach (xxv), dadurch gekennzeichnet, dass nach, vor oder gleichzeitig mit Schritt a. mindestens ein geeignetes Transfektions- Markergen in mindestens eine nicht-totipotente Stammzelle, eine nicht-totipotente Vorläuferzelle und/oder eine nicht-totipotente immortalisierte Zelle eingebracht wird und nach Schritt a. vorzugsweise die transfektierte Zelle aus Schritt a. selektioniert wird. (xxvii) Verfahren nach einem der (xxv) oder (xxvi), dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine pluripotente oder multipotente embryonale, fötale, neonatale oder adulte Stammzelle handelt.
(xxviii)VerfaJhren zur Erzeugung eines transgenen nicht-humanen Säugetiers nach (xviii), enthaltend folgende Schritte: f. Einbringen sowohl mindestens einer Nukleinsäure nach (xv) und/oder mindestens eines Vektors nach (xvi) als auch mindestens eines geeigneten Transfektions-Markergens in mindestens eine Oocyte, Stammzelle, eine
Vorläuferzelle und/oder eine immortalisierte Zelle eines nicht-humanen Säugetieres, g. Selektionieren der transfizierten Zelle aus Schritt a, h. Einbringen der nach Schritt b. selektierten Zelle in mindestens eine nicht- humane Säugetier-Blastozyste, i. Einbringen der Blastozyste aus Schritt c. in eine nicht-humane Säugetier- Pflegemutter und j. Identifizierung des sich aus genannter Blastozyste entwickelten transgenen nicht-humanen Säugetiers.
(xxix) Verfahren nach (xxviii), dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine pluripotente oder multipotente embryonale, fötale, neonatale oder adulte Stammzelle handelt.
(xxx) Verfahren zur Erzeugung eines transgenen nicht-humanen Säugetiers nach (xix), enthaltend folgende Schritte: d. Einbringen sowohl mindestens einer Nukleinsäure nach (xv) und/oder mindestens eines Vektors nach (xvi) als auch mindestens eines geeigneten Transfektions-Markergens in einen der beiden Vorkerne einer befruchteten nicht-humanen Säugetier-Oocyte, e. Einbringen der Säugetier-Oocyte aus Schritt a. in eine nicht-humane
Säugetier-Pflegemutter und f. Identifizierung des sich aus genannter Säugetier-Oocyte entwickelten transgenen nicht-humanen Säugetiers.
(xxxi) Transgenes nicht-humanes Säugetier, dadurch gekennzeichnet, dass es nach dem Verfahren nach einem der (xxviii) oder (xxix) erzeugt wurde.
(xxxii) Transgenes nicht-humanes Säugetier, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Nachkomme des Säugetieres nach (xxx) ist.
(xxxiii)Verwendung eines transgenen nicht-humanen Säugetiers nach einem der (xix), (xxx) oder (xxxi) zur Gewinnung einer nicht-humanen Zelle, eines nicht-humanen organspezifischen Gewebes und oder eines nichthumanen Säugetierorgans für die Allo- und/oder Xenotransplantation.
(xxxiv) Verwendung eines transgenen nicht-humanen Säugetiers nach einem der (xix), (xxx) oder (xxxi), eines humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder eines humanen oder tierischen
Säugetierorgans nach (xviii) zum Auffinden von pharmakologisch aktiven Wirkstoffen und/oder zur Identifizierung von toxischen Substanzen.
Die folgenden Figuren und Beispiele sollen die vorliegende Erfindung verdeutlichen ohne sie jedoch zu beschränken:
Abb. 1 zeigt eine Immunoblotanalyse von Medienüberständen der TransfeJktion 17x4/IL15/Oligo + pcDNA3switch +/- Mifepriston (Beispiel 3);
Abb. 2 zeigt eine schematische Abbildung des Wirkmechanismus des erfindungsgemäßen durch Zugabe einer WirJksubstanz regulierbaren Genexpressionssystems.
Der Genschalter der vorliegenden Erfindung ist ein chimäres Protein, das aus drei fünJktionellen Einheiten besteht: i) eine Gal4-DNA-Bindungsdomäne (Gal-DBD), welche die
Genschalterbindungsdomäne UAS erkennt. Die UAS-Sequenz der Erfindung enthält vier Kopien eines Sequenzmotivs aus 17 Nukleotiden, von denen jedes Motiv als Bindungsstelle für zwei Gal4-DBD Moleküle dienen kann. ii) Eine verkürzte Ligandenbindungsdomäne des menschlichen Progesteron- Rezeptors (PR-LBD), welche die Bindung der Wirksubstanz Mifepriston an den Genschalter vermittelt und die Konversion des
Genschalteφroteins in eine aktive Konformation durch Dimerisierung bewirkt. iii) Eine p65 Aktivierungsdomäne (P65-AD), welche die Transkription des Zielgens durch den Genschalter aktiviert. Bei Abwesenheit von Mifepriston wird der Genschalter durch den vorgeschalteten ubiquitären schwachen basalen minimalen Thymidinkinase Promoter (pTK) in geringem Mengen transkribiert. Diese Genschaltermoleküle liegen aber, als Monomere vor und können damit noch keine DNA-Bereiche binden oder die Transkription initiieren. Nach Zugabe der Wirksubstanz Mifepriston erfolgt die Aktivierung des Genschaltersystems. Das Liganden-gebundene Genschälter- Homodimer bindet an alle Bereiche der DNA, die UAS-Sequenzen enthalten (wie z.B. die regulatorische Region vor dem durch den TATA-Promoter regulierten Gen für MutIL15-mFc) und aktiviert somit die Transkription des immunomodulatorischen Proteins. Da dem TK-Promoter des Genschalteφroteingens zusätzlich DNA-Bereiche mit UAS-Sequenzen vorgeschaltet sind, wird gleichzeitig in einem autoregulatorischen Rückkopplungsmechanimus die Transkription des Genschalteφroteins selbst aktiviert und somit die Menge des aktiven Genschalters erhöht. Weiterhin können die die aus Zelllinien hergestellten transplantierbaren Zellen der Erfindung Markergene wie z.B. für Resistenzen gegen die Antibiotika Neomycin (Neo-R) bzw. Hygromycin (Hygro-R) enthalten. Die Markergene, welche von einem ubiquitären Promoter wie z.B. dem Phosphoglycerat inase-Promoter (pGK) reguliert werden, dienen der Selektion der Zelle auf Aufnahme des DNA- Konstruktes. Die durch einen zelltypspezifischen Promoter, wie z.B. den Ratten- Insulinpromoter RIP) kontrollierten Markergene dienen der Selektion von transgenen Zellen eines spezifischen Zelltyps.
Zur Generierung der transgenen Tiere der Erfindung müssen die Zellen mindestens die Elemente 1 und 2 enthalten. Zur Herstellung der transgenen Zellen aus Zelllinien können die Zellen noch zusätzlich Element 3 enthalten.
Beispiele
Zur Untersuchung und Demonstration der Wirkungsweise der regulierten Expression des immunmodulierenden Proteins MutIL-15/mFc wurden zwei experimentelle Modelle entwickelt: a) Transgene Zelllinie zur Transplantation
Bei diesem Modell wurden Stammzellen mit Vektor-Konstrukten transfiziert, die zusätzlich zu den Elementen für die regulierbare Expression des Immunmodulators MutIL-15/mFc eine SeleJktionskassette enthielten, die die Herstellung eines spezifischen Zelltyps (z.B. Insulin-produzierende Zelle) ermöglichte (siehe US 5,733,727). Auf diese Weise können aus undifferenzierten transgenen Stammzellen differenzierte Zellen eines spezifischen Zelltyps hergestellt und isoliert werden. Diese transgenen differenzierten Zellen können in eine geeignete Empfängermaus (z.B. diabetische Maus) transplantiert werden. Werden die transplantierten Tiere mit Mifepriston behandelt, bilden die transplantierten Zellen selbst MutIL-15/mFc und verhindern damit ihre eigene Abstoßung.
b Transgenes Mausmodell Es wurden transgene Mäuse generiert, die im Genom ein Konstrukt enthalten, das die regulierte Expression von MutIL-15/mFc durch Zugabe von Mifepriston bewirkt. Da die Expression von MutIL-15/mFc durch einen ubiquitären Promoter reguliert wird, produzierten die Mäuse MutIL-15/mFc, wenn sie durch Zugabe von Mifepriston stimuliert werden. Aus den transgenen Tieren können Organe (z.B. Herz, Niere) oder Zellen (Inselzellen, neuronale Zellen) entnommen und in eine¬ andere nicht-transgene Maus transplantiert werden. Werden die transplantierten Tiere mit Mifepriston behandelt, bildet das transplantierte Organ/Zellen selbst MutlL- 15/mFc und verhindert damit seine eigene Abstoßung.
Beispiel 1: Vektorklonierung für ein transgenes Mausmodell
In dem Vektor 17x4/pGL3 Basic (modifizierter pGL3Basic Vektor von Promega mit TATA Box und 4 Kopien des 17-Oligomers als Genschalterbindungsstelle) wurde das Luciferase-Gen durch das Gen für ein Fusionsprotein aus mutiertem IL-15 Protein und Maus FcTeil ( im weiteren bezeichnet alsMutIL-15/mFc: Kim et al, The Journal of Immunology, 1998, 160: 5742-5748), das zusätzlich eine CD5 Leadersequenz enthält (Jones H, Nature 323 (6086), 346-349, 1986), ersetzt. Dadurch wird das CD5-MutIL-l 5/mFc Gen durch eine SV40polyA Sequenz abgeschlossen (Vektomame 17x4/IL15). Anschliessend wurde vor den 17- Oligomeren ein Oligonukleotid mit den Schnittstellen Sbfl und Pmel eingeführt (Vektomame 17x4/ILl 5/Oligo). Diese Schnittstellen dienten zum Einfügen des Gens für das Genschaltermolekül (GS = Gal4-DBD/hPR-LBD/p65-AD) inklusive vorgeschalteter regulatorischer Region (Gal4UAS-PTK-IVS8), welche aus dem Vektor pswitch (Jfnvitrogen, Karlsruhe) isoliert wurden (Vektomame 17x4/IL15/Oligo/GS). Zusätzlich wurde alternativ ein Vektor hergestellt, in den zwischen TATA Box und Startcodon des CD5- MutIL-15/mFc Gens das Intron IVS8 (ebenfalls aus pswitch) eingesetzt wurde (Vektomame 17x4/IL15/Oligo/IVS8/GS). Die Übergänge zwischen den Segmenten aller Klonierungsprodukte wurden durch Sequenzierungen übeφrüft.
Beispiel 2: Vektorklonierung für transgene in vitro Transplantate aus Insulinproduzierenden Zellen
Diese Vektoren wurden analog zu den Vektoren für das transgene Mausmodell hergestellt. Zusätzlich enthalten diese Plasmide jedoch noch ein Fragment, welches ein vom Ratten-Insulinpromoter (RIP) reguliertes Neomycin- Resistenzgen (neo) sowie ein vom Maus-Phosphoglyceratkinase-Promoter (pGK) reguliertes Hygromycin-Resistenzgen (hygro) enthält. Diese Elemente wurden 5' unterhalb des CD5- MutIL-15/mFc Gens eingefugt und alternativ in zwei Transkriptionsrichtungen kloniert. (Vektornamen 17x4/IL15/Oligo/RIPhn/GS und 17x4/IL15/Oligo/RIPnh/GS). Zusätzlich wurden alternativ Vektoren hergestellt, in denen zwischen TATA Box und Startcodon des CD5-mutIL15-mFc Gens das Intron IVS8 (ebenfalls aus pswitch) eingesetzt wurde (Vektornamen 17x4/IL15/Oligo/RIPhn/IVS8/GS sowie 17x4/IL15/Oligo/RIPnh/IVS8/GS). Die Übergänge zwischen den Segmenten aller Klonierungsprodukte wurden durch Sequenzierungen übeφrüft. Beispiel 3: Übeφriifung der regulierten Expression und Sekretion von CD5- mutIL15-mFc in den in Beispiel 1 und 2 genannten Vektoren
Es wurden transiente Transfektionen von cos-7 Zellen (DSMZ, Braunschweig) und A293 Zellen (Quantum, Montreal, Canada) durchgeführt. Dazu wurden am Tag vor der Transfektion 5-7,5xl05 Zellen/Loch auf 6-Loch Platten ausgesät. Für die Transfektion, die mit 1-2 μg DNA Loch durchgeführt wurde, wurden je 10-20 μl DNA der Konzentration 10 ng/ml mit je 250 μl OptiMEM-I Medium (Life Technologies, Karlsruhe) gemischt. Parallel dazu wurden je 2μl Lipofectamin 2000 (Life Technologies, Karlsruhe # 11668-019) /μg DNA mit 250 μl OptiMEM-I Medium (Life Technologies, Karlsruhe # 31985-062) gemischt. Gleiche Volumina beider Ansätze wurden gemischt und für 20 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. In der Zwischenzeit wurden die 6-Loch Platten mit den 50-70 % konfluenten Zellen einmal mit PBS gewaschen und anschließend je 1,5 ml Wachstumsmedium/Loch (DMEM + 10 % FCS) zugegeben. Zu diesen Zellen wurden pro Loch je 500 μl des DNA/Lipofectamingemisches tropfenweise hinzugefügt. Zellen, die mit Mifepriston stimuliert wurden, erhielten zusätzlich je 2 μl einer 10" M Lösung von Mifepriston (Sigma, Deisenhofen; Endkonzentraion 10" M) in 80 % Ethanol (Invitrogen, Karlsruhe). Am nächsten Tag wurde das Medium abgenommen und 2 ml frisches Medium (DMEM + 10 % FCS) zugegeben. Die mit Mifepriston stimulierten Zellen erhielten dabei erneut zusätzlich je 2 μl Mifepriston. 3 Tage nach der Transfektion wurde das Medium von den Zellen abgenommen, zur Entfernung von Zellresten zentrifiigiert und anschließend bei -80 °C weggefroren. Die Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen, in PBS abgeschabt, in ein 1,5 ml Eppendorf-Gefäß überführt und für 30-60 min bei 4°C mit je 50 μl RffA-Puffer (PBS mit 1 % IGEPAL/Sigma, Deisenhofen 1-3021, 0.5% Natriumdesoxycholat, 0,1 % SDS, 4mM EDTA und Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Röche, Mannheim #1873580) lysiert. Die zentrifugierten Lysate wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C gelagert.
Die Sekretion von CD5-mutIL15-mFc wurde mit Hilfe eines ELISA, der den Maus-Fc Teil des Fusionsproteins erkennt, analysiert. Dafür wurden 96-Loch Platten (Nunc, Wiesbaden# 439454) mit je 100 μl eines anti-Maus IgG2a Antiköφers (Klon Rl l-89, BD PharMingen, Heidelberg # 02251D-553446) für eine Stunde bei 37 °C beschichtet. Anschließend wurden die Platten dreimal mit PBS gewaschen und für eine Stunde bei 37 °C mit DMEM+10%FCS inkubiert, um unspezifische Bindungen abzusättigen. Auf die beschichteten Platten wurden je 100 μl unverdünnte Mediumüberstände gegeben, diese für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert und danach 5x mit je 200 μl PBS/0,1% Tween20 und lx mit je 200 μl PBS gewaschen. Der enzymgekoppelte Antiköφer HRP antiMaus IgG 2a Klon R19-15 (BD PharMingen, Heidelberg # 02017E-553391) wurde zur Detektion des Maus-Fc Teils ebenfalls wieder für 1 h bei Raumtemperatur mit den Platten inkubiert und die Platten anschließend erneut wie oben beschrieben gewaschen. Die gebundene Menge des Fusionsproteines wurde durch eine Farbreaktion nach Zugabe einer OPD-haltigen Substratlösung (25 ml 0,1 M Zitronensäure, 25 ml 0,1 M Dikaliumhydrogenphosphat, ad 100 ml mit H2O+ 1 Tablette OPD (Sigma Deisenhofen #P8412) + 40 μl H2O2 30%) sichtbar gemacht, durch Zugabe von 3 M HC1 abgestoppt und anschließend in einem ELISA-Reader (μ Quant, BIO-TEK Instruments Inc.) bei 490 nm gemessen.
Des weiteren wurden unverdünnte Medienüberstände im Immunoblot analysiert. Dazu wurden Medienüberstände mit Lämmli-Probenpuffer gemischt, für 5 Minuten bei 92 °C erhitzt, anschließend auf ein 12,5 %iges Polyacrylamidgel aufgetragen und bei 150 V elektrophoretisch aufgetrennt. Die Proteine wurden anschließend auf eine Nitrocellulosemembran (Schleicher u. Schuell, Dassel CD0564-1) übertragen. Die Membran wurde zur Absättigung unspezifischer Bindungen mit 5 % Milchpulver/PBS/0,1% Tween20 behandelt. Danach wurde sie für 16 Stunden bei 4°C mit einer 1:500 Verdünnung von Maus-anti-humanem IL15 Antiköφer (Becton- Dickinson, Heidelberg #554712) inkubiert, ausgiebig mit PBS/0,1% Tween20 gewaschen und danach für eine Stunde bei Raumtemperatur mit einer 1:3000 Verdünnung eines Peroxidase-gekoppelten Schaf-anti-Maus Antiköφers (Amersham, Freiburg #NA9310) behandelt. Die Membran wurde nach ausgiebigem Waschen für 5 Minuten bei Raumtemperatur mit Detektionsreagenz (NEN; Bad Homburg #NE103E) behandelt und die Farbreaktion durch Auflegen eines Röntgenfilmes detektiert.
Die Analysen von Medienüberständen von transfizierten Zellen mit bzw. ohne Mifepriston-Zugabe zeigten folgendes Ergebnis: Folgende Transfektionen wurden durchgeführt :
1. mCD5.6 (Positivkontrolle für MutIL-15/mFcsekretion, Vektor mit CD5- MutIL-15/mFc unter der Kontrolle eines CMV-Promoters)
2. 17x4/ILl 5/Oligo +/- Mifepriston (Negativkontrolle ohne Genschalter)
3. 17x4/IL15/Oligo + pcDNA3switch +/- Mifepriston 4. 17x4/IL15/Oligo/GS +/- Mifepriston
5. 17x4/IL15/Oligo/GS + pcDNA3switch +/- Mifepriston
6. 17x4/ILl 5/Oligo/IVS8/GS +/- Mifepriston
7. 17x4/ILl 5/Oligo/IVS8/GS + pcDNA3switch +/- Mifepriston
Keine signifikante Expression von MutIL-15/mFc wurde in Zellen beobachtet, die mit dem Kontrollvektor ohne Genschaltermolekül (2.) transfiziert worden waren sowie in Zellen, die nicht mit Mifepriston stimuliert worden waren. Nach Transfektion mit Konstrukten, die lediglich das autoregulierten Genschaltermolekül enthielten (4.+6.), konnte mit Hilfe des ELISA nur eine geringe Erhöhung der Sekretion von MutIL-15/mFc nach Mifepriston-Stimulation nachgewiesen werden. Dies beruhte vermutlich auf einer unzureichenden Bildung von aktiven Genschaltermolekülen durch autoregulatorische Genaktivierung im Verlauf der transienten Transfektion. Daher wurde die Genschaltermenge extern durch Kotransfektion mit dem Vektor pcDNA3 switch (Genschalter unter Kontrolle des CMV-Promoters) erhöht, der eine konstant hohe Produktion an Genschalter bewirkt. In diesen Kotransfektionen enthielt der Medienüberstand von Zellen, die sowohl mit Genschalter-freien (3.) als auch enthaltenden Konstrukten (5.+7.) transfiziert worden waren, nach Mifepriston-Behandlung eine erhöhte Menge an MutIL-15/mFc, die durch ELISA nachgewiesen wurde.
Tabelle 1: Messung von MutIL-15/mFc in Medienüberständen von transient transfizierten A293 Zellen (Mittel von Doppelwerten)
Immunoblotanalysen von Medienüberständen der Transfektion 3. (Abb. 1) bestätigen ebenfalls, dass eine erhöhte Menge an MutIL-15/mFc (50 kDa Bande) nach Mifepriston-Stimulierung (Spur 1) im Vergleich zu unstimulierten Zellen (Spur 2) produziert wird.
Diese Ergebnisse beweisen, dass die Transkription und Sekretion von MutIL-15/mFc Fusionsprotein durch Mifepriston-Zugabe in Zellen induziert werden kann, die mit den oben vorgestellten Vektoren (z.B. 17x4/IL15/Oligo/IVS8/GS) transfiziert worden waren. Damit wurde die Funktionalität der regulierten Expression von MutIL-15/mFc bewiesen. Beispiel 4: Übeφriifung der regulierten Expression und Funktionalität des Genschalterproteins fGal4UAS-PTK-IVS8-Gal4-DBD/hPR-LBD/p65-AD') in den in Beispiel 1 und 2 genannten Vektoren Wie zuvor erwähnt war die Anzahl an aktiven Genschaltermolekülen, die in transient transfizierten Zellen, die nur autoregulierten Genschalter produzierten (Transfektion mit 17x4/IL15/Oligo/GS und 17x4/IL15/Oligo/IVS8/GS), gering.
Da der ELISA nicht sensitiv genug ist, um eine Expression von MutIL-15/mFc auf Einzelzellebene zu detektieren, wurden Kotransfektionen mit dem Plasmid pGene/N5-His/lacZ (Invitrogen, Karlsruhe) durchgeführt. Dieser Vektor enthält ein lacZ Gen, dessen Transkription ebenfalls durch Genschalterbindungsstellen reguliert wird. Dies bedeutet, dass nur in solchen Zellen ß-Galaktosidase produziert wird, in denen gleichzeitig durch Mifepriston-Stimulierung aktiver Genschalter enthalten ist. Der Genschalter wurde durch einen zweiten Vektor (in diesem Fall die Konstrukte mit autoreguliertem Genschalter) zur Verfügung gestellt. ß-Galaktosidase konnte durch eine Substratreaktion als blauer Niederschlag in einzelnen Zellen detektiert werden. Dadurch konnte eine Funktion der Vektorkonstrukte mit wesentlich höherer Sensitivität nachgewiesen werden. A293 Zellen wurden wie im Beispiel 3 beschrieben mit folgenden Konstrukten transfiziert und anschließend teilweise mit Mifepriston stimuliert:
1. pCMVß (Positivkontrolle für lacZ, Vektor mit lacZ-Gen unter der Kontrolle eines CMV-Promoters)
2. 17x4/ILl 5/Oligo + pGene/V5-His/lacZ +/- Mifepriston (Negativkontrolle ohne Genschalter)
3. 17x4/ILl 5/Oligo/GS + pGene/V5-His/lacZ +/- Mifepriston
4. 17x4/ILl 5/Oligo/IVS8/GS + pGene/V5-His/lacZ +/- Mifepriston 5. pcDNA3switch + pGene/V5-His/lacZ +/- Mifepriston (Positivkontrolle mit konstitutiv hohem Genschalter)
6. pGene/N5-His/lacZ -Mifepriston (Νegativkontrolle ohne Genschalter)
Die Zellen wurden am dritten Tag nach der Transfektion für 10 min bei -20°C mit eiskaltem Methanol fixiert, 3x mit PBS gewaschen und anschließend für 2,5 h bei 37°C mit lacZ Färbelösung (60 μl von 400 mM Kaliumferricyanid, 60 μl von 400 mM Kaliumferrocyanid, 60 μl von 200 mM MgC12, 300 μl 20mg/ml X-Gal, 5,52 ml PBS) behandelt.
Die lichtmikroskopische Auswertung der transfizierten Zellen lieferte folgendes Ergebnis (Tab. 2):
Tabelle 2: Intensität der ß-Galaktosidasefärbung von transient transfizierten A293 Zellen
Ohne Genschalter (2.) war keine signifikante Blaufärbung von Zellen zu beobachten. In Zellen, die mit autoreguliertem Genschalter transfiziert worden waren (3.+4.), bewirkte Mifepriston-Stimulierung eine deutliche Blaufärbung von 3-5 % der Zellen. Da diese niedrige Zellanzahl eine MutIL-15/mFc-Menge produziert, die nur sehr gering ist, liegt sie unter der Nachweisgrenze des ELISA. Die lacZ Färbung jedoch kann die Genschalteraktivität auch in einzelnen Zellen erfassen und nachweisen.
Diese Experimente beweisen, dass der aktivierte Genschalter, der durch die Konstrukte 17x4/IL15/Oligo/GS und 17x4/IL15/Oligo/IVS8/GS nach Stimulierung mit Mifepriston bereitgestellt wird, die Transkription von lacZ bewirken kann. Damit beweisen diese Daten die Funktionalität des autoregulierten Genschalters der oben genannten Konstrukte.
Beispiel 5: Herstellung und Charakterisierung transgener Mäuse 50 μg DNA der Konstrukte 17x4/IL15/Oligo/GS und 17x4/IL15/Oligo/IVS8/GS wurden mit den Restriktionsenzymen Eco47III und Notl geschnitten und die gewünschten Fragmente der Länge 4800 bp bzw. 4924 bp aufgereinigt.
Anschließend wurden die Fragmente in die Vorkerne von C3HeB/FeJ Mäusen injiziert und die Embryonen anschließend in scheinschwangere Weibchen implantiert. Von den erhaltenen Mäusen wurde die genomische DNA extrahiert und mit Hilfe von PCR- Analyse auf die Integration des Transgens untersucht. Für die PCR- Analyse wurden folgende Primer verwendet: GS-IL15FW.2 (5'- TAT
GGC TTC TGA GGC GGA AAG AAC CAG C - 3') und GS-L15 RV.3 (5'- G
CAG AGA CCC CAT GGG CAT GGT GGC TAG -3'). Die erhaltenen PCR- Produkte haben dementsprechend eine Länge von 211 bp (ohne Intron) bzw. 335 bp (mit Intron IVS8).
Von 44 erhaltenen Mäusen der Oocyteninjektion des Konstruktes 17x4/ILl 5/Oligo/GS waren 16 Tiere transgen (36%). Die Founder-Tiere (F0 Generation) wurden mit Wildtyp-DBA 2 Mäusen veφaart und die erhaltene FI -Nachkommen wiederum auf genomische Präsenz des Trans gens untersucht. Die transgenen FI Tiere wurden anschließend auf regulierte Expression von MutIL-15/mFc untersucht. Im Alter von ca. 8-16 Wochen wurde den Tieren 250 μg/kg in Sesamöl gelöstes Mifepriston (Sigma, Deisenhofen M 8046) jeden zweiten Tag insgesamt dreimal intraperitoneal injiziert. Einen Tag nach der letzten Injektion wurden die Tiere getötet und aus den Geweben RNA bzw. Protein extrahiert. Anschließend wurde die Expression von Genschalteφrotein bzw. Immunmodulator in den Geweben mit Hilfe von ELISA und Western Blot analysiert. Die RNA-Menge wird mittels einer quantitativen Reverse-Transkription PCR (RT-PCR) bestimmt, um die Menge an transkribiertem Genschalter bzw. Immunmodulator zu ermitteln. Je 1 μg RNA werden mit Hilfe der Expand Reverse Transcriptase (Röche, Mannheim) nach Anleitung des Herstellers in cDNA transkribiert. Anschließend wird die Expression des Genschalters bzw. des Immunmodulators MutILl 5/mFc mit Hilfe des Light Cycler Fast Start DNA Master SYBR Green Kits (Röche, Mannheim) quantitativ untersucht. Die PCR Bedingungen für die Detektion des Immunmodulators sind wie folgt: Denaturierung: 95°C, 600 sec Zyklen: 95°C 15 sec, 60°C 5 sec, 72 °C 10 sec.
Primer CD5.6-FW: 5'-CCTGCTGGGGATGCTGGTC
Primer CD5.6-RV: 5'-TTTTCCTCCAGTTCCTCACATTC
MgCl2: 3 mM
Die PCR Bedingungen für die Detektion des Genschalters sind wie folgt: Denaturierung: 95 °C, 600 sec
Zyklen: 95°C 15 sec, 53°C 5 sec, 72 °C 10 sec. Primer GS-FW: 5'-GACTTAAAAAGCTCAAGTGCTCCAAAG Primer GS-RV: 5'-TATATCCTGTAAAGAATCCAT MgCl2: 3 mM Außerdem wird den Tieren in regelmäßigen Abständen vor bzw. während der Mifepriston-Behandlung Blut entnommen und die darin enthaltenen MutlL- 15/mFc Menge über ELISA bestimmt.
Zum Vergleich dienen gleichaltrige Mäuse derselben transgenen Linie, die zuvor nicht mit Mifepriston behandelt worden waren.
Alternativ werden die transgenen Mäuse in einem Zwei-Schritt-Verfahren hergestellt. Zuerst werden zwei verschiedene Linien transgener Mäuse generiert, die entweder lediglich das Genschaltermolekül (Linien „A") oder nur den durch die Genschalterbindungsstelle regulierten Immunmodulator (Linien „B") exprimieren. Von den erhaltenen transgenen Mäusestämmen der A-Linien werden diejenigen Tiere ausgewählt, die geeignete Mengen Genschaltermolekül exprimieren und in einem zweiten Schritt mit transgenen Tieren der B-Linien veφaart. Die erhaltenen Nachkommen werden danach auf simultane Expression der beiden Transgene untersucht. Auf diese Weise werden doppelt transgenen Linien „A/B" erhalten, die durch Genschaltermoleüle regulierten Immunmodulator exprimieren. 50 μg DNA der Konstrukte pswitch (für Linien „A") bzw. 17x4/IL15/Oligo und 17x4/IL15/Oligo/IVS8 (für Linien „B") werden mit geeigneten Restriktionsenzymen geschnitten und die gewünschten Fragmente aufgereinigt. Anschließend werden die Fragmente in die Vorkerne von C3HeB/FeJ Mäusen injiziert und die Embryonen anschließend in scheinschwangere Weibchen implantiert. Von den erhaltenen Mäusen wird die genomische DNA extrahiert und mit Hilfe von PCR- Analyse auf die Integration des Transgens untersucht.
Beispiel 6: Transplantation von Inseln aus Spenderorganen transgener Mäuse Bei der Inseltransplantation werden Inseln, die aus Pankreata von Mäusen isoliert werden, unter die Nierenkapsel von diabetischen Mäusen injiziert (Ferrari-Lacraz et al, The Journal of Immunology, 2001, Vol.167 S. 3478-3485). Spender-Inseln werden aus transgenen Mäusen des Stammes DBA/2J isoliert, die MutIL-15/mFc unter Kontrolle des Genschalters exprimieren. Die Spender-Mäuse werden mit Mifepriston (250 μg/kg) vorbehandelt, so dass sie am Tag der Organentnahme nachweisbar MutIL-15/mFc produzieren. Zur Präparation der Inseln werden Donor Pankreata in situ mit Typ IV Collagenase (2 mg/ml; Worthington Biochemical Coφ.) perfundiert. Nach 30 Minuten Verdau bei 37 °C werden die Inseln über einen diskontinuierlichen Ficoll-Gradienten aufgereinigt und anschließend in RPMI1640 Medium (Gibco, Karlsruhe) mit 5,6 mM Glucose kultiviert. Anschließend werden 300-400 Inseln unter die Nierenkapsel des Empfängers transplantiert.
Der Empfänger ist eine 6-10 Wochen alte nicht transgene B6AF1 Maus, bei der durch intraperitoneale Injektion des Betazelltoxins Streptozotocin (225 mg/kg; Sigma, Deisenhofen) Diabetes induziert wurde. Als Kontrolle werden syngene Inseln (d.h., Inseln von B6AF1 -Mäusen) in die diabetischen Mäuse transplantiert. Pankreatische Inseln werden aseptisch unter die linke Nierenkapsel transplantiert. Dazu wird die Maus narkotisiert und ein Einschnitt unter dem linken Rippenbogen durchgeführt. Die linke Niere wird aus dem Bauchraum herausmobilisiert und der untere Pol der Nierenkapsel kurz eingeschnitten. Mit einer stumpfen sterilen Kanüle wird eine Tasche unter der Nierenkapsel geformt. Die Inseln werden anschließend mit einer sterilen Pipettenspitze in diesen Hohlraum injiziert. Danach wird die Niere in den Bauchraum zurückgelegt und das Abdomen geschlossen. Die Empfängertiere werden ab dem Transplantationstag jeden zweiten Tag mit Mifepriston 250 μg/kg behandelt, so dass sie kontinuierlich MutIL-15/mFc produzieren.
Die Funktion des Allotransplantats wird über regelmäßige Blutglukosemessungen (Accu-Check III; Boehringer Mannheim, Mannheim) verfolgt. Vor und nach der Diabetesinduktion sowie nach der Inseltransplantation wird den Tieren regelmäßig Blut aus der Schwanzvene bzw. dem retrobulbären Venenplexus entnommen und der Blutzuckerspiegel bestimmt. Zusätzliche Kontrollen zwischen den Blutabnahmen finden mit Urinteststreifen statt. Die primäre Transplantatfunktion wird als Blutzuckergehalt unter l l,lmmol/l (200 mg/dl) an Tag 3-5 nach der Transplantation definiert. Das Transplantat gilt als abgestoßen, wenn der Blutzuckerspiegel an mindestens zwei aufeinanderfolgenden Tagen auf über 500 mg/dl angestiegen ist, nachdem man eine primäre Transplantatfunktion beobachtet.
Als Kontrolle werden Inseltransplantationen durchgeführt, bei denen die Tiere entweder kein Mifepriston erhalten und somit auch kein Genschalter-reguliertes MutIL-15/mFc exprimieren oder bei denen die Tiere die mit externer Zugabe von MutIL- 15/mFc behandelt werden.
Die Tiere, die auf die beschriebene Weise behandelt werden, können nach der Transplantation von Inselzellen, die aus transgenen Spendermäusen gewonnen werden, ihren Blutzuckerspiegel besser regulieren und zeigen bei Behandlung mit Mifepriston eine verminderte Abstoßung der Zelltransplantate.
Beispiel 7: Heterotope Herztransplantation
Bei der heterotopen Herztransplantation wird das Spenderherz mit den großen Gefäßen im Abdomen des Empfängers verbunden (Ono et al, J. Cardiovasc. Surg. 1969, Corry et al, Transplantation 1973). Spenderherzen werden aus transgenen Mäusen des Stammes DBA/2J isoliert, die MutIL- 15/mFc unter Kontrolle des Genschalters exprimieren. Die Spender-Mäuse werden mit Mifepriston (250 μg/kg) vorbehandelt, so dass sie am Tag der Organentnahme nachweisbar MutlL- 15/mFc produzieren. Bei den anästhesierten Mäusen wird die Vena cava isoliert und Heparin (400 U/kg) zur Verteilung über den gesamten Kreislauf injiziert. Anschließend werden die Tiere durch Teilung der abdominalen Gefäße ausgeblutet und das Herz mit Hilfe einer medianen Sternotomie freigelegt. Die Aorta und die pulmonaren Gefäße werden isoliert und geteilt und die pulmonären Venen und die Vena cava en masse mit 4-10 Tevdek (Deknatal, Queens Village) ligiert. Das Herz wird unmittelbar nach seiner Entnahme bei 4 °C in physiologischer Kochsalzlösung (Physiolosol, Abbot Laboratories, Illinois, USA) aufbewahrt. Die Vena cava inferior und Aorta abdominalis des Empfängers (6-8 Wochen alte nicht transgene B6AF1 Maus) werden freipräpariert und die Gefäße mit locker liegenden Gefäßklammem versehen. Das Ende der Spender-Aorta wird mit der Seite der Empfänger-Aorta abdominalis mit einem 8-0 Prolen-Faden verbunden. Die A. pulmonalis des Spenders wird mit der Vena cava des Empfängers auf die gleiche Weise fusioniert. Die Gefäßklammem werden entfernt und das Spender-Herz mit 37 °C warmer Ringer's Laktatlösung erwärmt, so dass spontan die Herzkontraktion wieder einsetzt. Die Empfängertiere werden ab dem Transplantationstag jeden zweiten Tag mit Mifepriston 250 μg/kg behandelt, so dass sie kontinuierlich MutIL- 15/mFc produzieren. Das Überleben des Transplantats wird jeden zweiten Tag durch Abtasten des schlagenden Herzens durch die Bauchwand übeφrüft und auf einer Skala von 1+ bis 4+ anhand der Impuls-Stärke und -Rate bewertet. Das Herz gilt als abgestoßen, wenn keine Herzmuskelkontraktionen mehr fühlbar sind. Eine Verhinderung der Abstoßung wird erzielt, wenn die Spender-Herzen über einen längeren Zeitraum schlagen als Herzen in unbehandelten Kontrolltieren. Als Kontrolle werden Herztransplantationen durchgeführt, bei denen die Tiere entweder kein Mifepriston erhalten und somit auch kein Genschalter-reguliertes MutIL- 15/mFc exprimieren oder bei denen die Tiere die mit externer Zugabe von MutIL- 15/mFc behandelt werden. Dieses Beispiel zeigt, dass die heterotopen Herztransplantate in denjenigen Tieren, die mit Mifepriston behandelt werden, im Vergleich zu den unbehandelten Tieren länger funktionsfähig bleiben.
Beispiel 8: Herstellung transgener ES-Zelllinien 100 μg DNA der Konstrukte 17x4/IL15/Oligo/RIPnh/GS,
17x4/IL15/Oligo/RIPhn/GS, 17x4/IL15/Oligo/RIPhn/IVS8/GS und
17x4/IL15/Oligo/RIPnh/IVS8/GS wurden mit den Restriktionsenzymen Eco47III und Notl geschnitten, die Fragmente aufgereinigt und in mindestens 100 μl sterilem PBS resuspendiert. Anschließend wurden die Konstrukte 17x4/IL15/Oligo/RIPhn/GS und 17x4/IL15/Oligo/RIPhn/IVS8/GS durch Elektroporation in Maus-ES-Zellen der Linie SVJ129 oder Rl eingebracht. Dazu wurden exponentiell wachsende Maus-ES Zellen trypsiniert, vereinzelt und gezählt. Ca. 3xl07 Zellen wurden zweimal mit 5-10 ml kaltem PBS gewaschen und danach das Zellpellet in kaltem PBS aufgenommen, so dass das Endvolumen inklusive DNA 800 μl beträgt. Anschließend wurde die verdaute DNA zu den Zellen gegeben, die Lösung gemischt und mindestens 10 Minuten auf Eis inkubiert. Unter der Sterilbank wurde das Zeil/DNA-Gemisch in vorgekühlte Elektroporationsküvetten mit einem Elektrodenspalt von 0,4 cm (BioRad, München) eingefüllt. Die Elektroporation wurde mit einem Genepulser-2 Gerät (BioRad, München) bei 0,8 kV und 3 μF durchgeführt. Anschließend wurden die Zellen mit ES-Zellmedium (DMEM mit 20 mM Hepes, 15 % hitzeinaktiviertes FCS, 50 U/ml Penicillin, 50 μg/ml Streptomycin, 0,1 mM nichtessentielle Aminosäuren, 0,1 mM Mercaptoethanol, 103 U/ml Leukemia Inhibitory Factor) gemischt und gleichmäßig auf zehn mit 0,1 % Gelatine beschichtete 10 cm Zellkulturschalen verteilt. Am nächsten Tag wurde die Selektion durch Zugabe von 200 μg/ ml Hygromycin (Sigma, Deisenhofen H 3274) in ES-Zellmedium begonnen. Die Zellen wurden für ca. 5-9 Tage auf Aufnahme des Konstruktes selektioniert und einzelne transgene Klone unter der Sterilbank von Hand isoliert und auf 96-Lochplatten überführt. Die Zellen wurden vor Erreichen der Konfluenz passagiert und sukzessive auf 48-Lochplatten, 24-Lochplatten, 6 Loch-Platten und 10 cm-Schalen umgesetzt.
Die Zeilklone wurden nach Zugabe von 10 nM Mifepriston auf regulierbare Expression des Genschalters und MutIL- 15/mFc mittels quantitativer RT-PCR bzw. von MutIL- 15/mFc mit Hilfe von ELISA und Western Blot Assays (wie oben in Beispiel 3 und 4 beschrieben) untersucht. Alternativ werden die transgenen ES-Zellen in einem 2-Schritt-Verfahren hergestellt. Zuerst werden transgene ES-Zellen generiert, die lediglich das Genschaltermolekül reguliert exprimieren. Von den erhaltenen transgenen Zelllinien werden diejenigen Klone ausgewählt, die geeignete Mengen Genschaltermolekül exprimieren. In einem zweiten Schritt werden diese Klone mit DNA-Konstrukten, die den durch eine Genschalterbindungsstelle regulierten Immunmodulator kodieren, supertransfiziert. Die erhaltenen doppelt-transgenen Linien werden wie in Beispiel 5 beschrieben durch RT-PCR auf simultane Expression der beiden Transgene untersucht. Auf diese Weise werden doppelt transgenen ES-Zellen erhalten, die durch Genschaltermoleküle regulierten Immunmodulator exprimieren. 100 μg DNA des Genschalter-Konstruktes werden mit geeigneten Restriktionsenzymen geschnitten, das gewünschte Fragment aufgereinigt, in sterilem PBS resuspendiert und wie oben beschrieben durch Elektroporation in ES-Zellen eingebracht. Da das Konstrukt eine Resistenz gegen das Antibiotikum Zeocin vermittelt, können die Zellen durch Behandlung mit diesem Antibiotikum auf erfolgreiche Transfektion selektioniert werden. Von den erhaltenen Zellen werden transgene Klone isoliert und die Expression des Genschaltermoleküls in Abhängigkeit von Mifepriston-Zugabe durch quantitative RT-PCR untersucht. Diejenigen Klone, die geeignete Mengen des Genschaltermoleküls exprimieren, werden in einem zweiten Schritt durch erneute Elektroporation mit aufgereinigten Eco47III/NotI-Fragmenten der Konstrukte 17x4/IL15/Oligo/RIPhn und 17x4/IL15/Oligo/RIPhn IVS8 super-transfiziert und durch Hygromycin- Behandlung auf Aufnahme des zweiten Transgens selektioniert. Die simultane Integration beider Transgene wird mittels PCR-Analyse der genomischen DNA übeφiüft. Die erhaltenen doppelt-transgenen Zellklone werden nach Zugabe von 10 nM Mifepriston auf regulierbare Expression des Genschalters und MutIL- 15/mFc mittels quantitativer RT-PCR bzw. von MutIL- 15/mFc-Protein mit Hilfe von ELISA und Western Blot Assays wie bereits oben in Beispiel 5 beschrieben untersucht. Anschließend werden von den erhaltenen Zelllinien diejenigen Klone ausgewählt, die nur nach Zugabe von Mifepriston den Immunmodulator MutlL- 15/mFc in ausreichenden Mengen herstellen und sezemieren.
Beispiel 9: Transplantation von Insulin-produzierenden Zellen, die aus transgenen ES-Zellen hergestellt werden , Vor der Transplantation werden aus undifferenzierten Hygromycin-resistenten ES- Zellklonen Insulin-produzierende Zellen hergestellt, die unter der Kontrolle des Genschalters MutIL-15/mFc exprimieren Soria et al. (Diabetes. 2000 Feb.; 49 (2):
157-62.
Die Insulin-produzierenden Zellen werden vor der Transplantation mit Mifepriston behandelt, so dass sie ausreichende Mengen MutIL- 15/mFc produzieren. Anschließend werden 1 Mio Insulin-produzierende Zellen in durch Streptozotocin- Behandlung diabetische C57BL/6 Mäuse entweder unter die Nierenkapsel (wie in Beispiel 7 beschrieben) oder in die Milz (Soria et al. (Diabetes. 2000 Feb.; 49 (2): 157-62) injiziert. Die Empfängertiere werden ab dem Transplantationstag jeden zweiten Tag mit Mifepriston (250 μg/kg) behandelt, so dass sie kontinuierlich MutIL- 15/mFc produzieren.
Die Funktion des Allotransplantats wird über regelmäßige Blutglukosemessungen (Accu-Check III; Boehringer Mannheim, Mannheim) verfolgt. Die primäre Transplantatfunktion wird als Blutzuckergehalt unter ll,lmmol/l (200 mg/dl) an Tag 3-5 nach der Transplantation definiert. Das Transplantat gilt als abgestoßen, wenn der Blutzuckerspiegel an mindestens zwei aufeinanderfolgenden Tagen auf über 500 mg/dl ansteigt, wenn zuvor eine primäre Transplantatfunktion beobachtet wird.
Als Kontrolle werden Insulin-produzierende Zellen in Empfänger-Tiere transplantiert, die aus dem gleichen Zellklon hergestellt wurden, aber nicht mit Mifepriston vorbehandelt sind und somit auch kein Genschalter-reguliertes MutIL- 15/mFc exprimieren. Alternativ können auch Insulin-produzierende Zellen verwendet werden, die zwar das MutIL- 15/mFc-Konstrukt, nicht aber den Genschalter enthalten
Weiterhin dienen Tiere als Kontrolle, die nach Erhalt von aus Stammzellen abgeleiteten Insulin-produzierenden Zellen mit externer Zugabe von MutlL- 15/mFc behandelt werden.
Untersuchungen des Blutzuckerspiegels von Tieren, die aus Stammzellen hergestellte Insulin-produzierende Zellen erhalten haben, zeigen, dass Zelltransplantate in mit Mifepriston behandelten Tieren längere Zeit funktionell aktiv sind.

Claims

Patentansprüche
1. Humane oder tierische nicht-totipotente Zelle enthaltend mindestens eine Nukleinsäure kodierend für mindestens einen Immunmodulator unter der
Kontrolle eines durch Zugabe einer Wirksubstanz regulierbaren Genexpressionssystems.
2. Zelle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Zelle um eine Stammzelle, eine Vorläuferzelle und/oder eine immortalisierte
Zelle handelt.
3. Zelle nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine pluripotente oder multipotente embryonale, fötale, neonatale oder adulte Stammzelle handelt.
4. Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 in Form einer Zelllinie.
5. Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass das regulierbare Genexpressionssystem ein Progesteron- Genexpressionssystem, ein Tetracyclin-Expressionssystem und/oder ein Rapamycin-Genexpressionssystem ist.
6. Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass der Immunmodulator mindestens eine der folgenden funktionellen Eigenschaften aufweist:
a. die Inhibierung einer Antigenerkennung, die durch T-Zellen vermittelt wird b. die Inhibierung eines über einen Rezeptor auf einer T-Zelle vermittelten Signals, c. die Aktivierung eines über einen Rezeptor auf einer T-Zelle vermittelten Signals, d. die Inhibierung des Wachstums von T-Zellen, e. die Inhibierung von Molekülen die das Überleben von T-Zellen unterstützen f. die Inhibierung von EffeJktormolekülen von T-Zellen(wie TNF- alpha, IFN-gamma), g. die Inhibierung der Adhäsion von T-Zellen, h. die Inhibierung einer T-Zell-kostimulatorischen Interaktion (die Aktivierung eines Lymphozyten erfolgt über zwei Signale: zum einen erfolgt eine Stimulierung über den Antigenrezeptor, zum anderen erfolgt ein weiteres Signal zur klonalen Expansion und Differenzierung eines ungeprägten Lymphozyten; diese kostimulatorische Interaktion kann durch einen Immunmodulator inhibiert werden) i. die Inhibierung der Aktivierung, der Proliferation, des Überlebens, der Antigenpräsentation, des Signalisierens, und/oder der Effektorfunktionen von weiteren Zellen, die an einer Immunantwort beteiligt sind, wie z.B. allgemeine und spezielle antigenpräsentierende
Zellen, insbesondere z.B. dendritische Zellen und Monozyten/Makrophagen B-Zellen, neutrophile Granulozyten und NK Zellen die Inhibierung der zellulären Interaktion von unterschiedlichen Zellen, entweder über Oberflächenrezeptoren oder über sekretierte Moleküle, wie z.B. Zytokine, Chemokine oder Wachstumsfaktoren, die an einer Immunantwort beteiligt sind, wie z.B. allgemeine und spezielle antigenpräsentierende Zellen, insbesondere z.B. dendritische Zellen und Monozyten/Makrophagen, T-Zellen, B-Zellen, neutrophile Granulozyten und NK Zellen, j. die Inhibierung der Migration von Zellen, die an einer Immunantwort beteiligt sind, wie z.B. spezielle antigenpräsentierende Zellen, insbesondere z.B. dendritische Zellen und Monozyten/Makrophagen, T-Zellen, B-Zellen, neutrophile Granulozyten und NK Zellen, k. die Inhibierung von Komponenten des Komplementsystems
1. die Inhibierung von phagozytotischen Aktivitäten im Zusammenhang mit der Präsentation von Fremd- oder Autoimmunantigenen, oder durch die Bindung von Antiköφern an Antigene, und/oder m. die Inhibierung von Entzündungsreaktionen.
7. Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Immunmodulator ein Antiköφer ist.
8. Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Immunmodulator d. ein Rezeptor ist e. ein löslicher sekretierter Rezeptor ist • f. ein sekretiertes Protein oder Peptid ist
9. Zelle nach Anspruch 8, wobei der Immunmodulator ein Fusionsprotein ist aus einem mutierten IL 15 und einem Fc-Fragment, wobei das Fc- Fragment an den C-Terminus des mutierten IL 15 Moleküls, bevorzugt über die Hinge-Region, fusioniert ist.
10. Zelle nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Fc-Fragment des
Antiköφers ein solches von einem IgG, insbesondere ein humanes IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 oder ein analoges Säugetier IgG oder ein IgM, insbesondere ein humanes IgM oder ein analoges Säugetier IgM ist.
11. Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure zusätzlich eine Selektionskassette, insbesondere ein geeignetes Transfektions-Markergen und/oder Differenzierungs-Markergen, kodiert.
12. Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure zusätzlich ein Molekül kodiert, das NK-Zellen- und/oder Killerzellen inhibiert.
13. Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure zusätzlich ein Molekül kodiert, dass a. Dendritische Zellen inhibiert b. Monocyten und oder Makrophagen inhibiert c. B-Zellen inhibiert d. Polmoφhnukleäre Zellen, z.B. Neutrophile Granulyozyten inhibiert
14. Zelle nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte inhibierende Molekül ein humanes MHC-Klasse-I-Molekül, ein chimeres MHC-Klasse-I-Molekül oder ein virales MHC-Klasse-I-Homolog ist.
15. Nukleinsäure kodierend für mindestens einen Immunmodulator und mindestens ein durch Zugabe einer Wirksubstanz regulierbares Genexpressionssystem.
16. Vektor enthaltender mindestens einen Nukleinsäure nach Anspruch 15.
17. Arzneimittel, enthaltend mindestens eine Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und geeignete Hilfs- und/oder Zusatzstoffe.
18. Humanes oder tierisches organspezifisches Gewebe und/oder humanes oder tierisches Säugetierorgan, enthaltend mindestens eine Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 14.
19. Transgenes nicht-humanes Säugetier, enthaltend mindestens eine Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 14.
20. Verwendung einer Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und/oder eines humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder eines humanen oder tierischen Säugetierorgans nach Anspruch 18 zur Transplantation in ein humanes oder tierisches Säugetier.
21. Verwendung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Allo-, Auto- oder Xenotransplantation handelt.
22. Verwendung einer Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 14, einer Nukleinsäure nach Anspruch 15, eines humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder eines humanen oder tierischen Säugetierorgans nach Anspruch 18 zur Herstellung eines Medikamentes zur Inhibierung einer Transplantatabstoßungsreaktion in einem humanen oder tierischen Säugetier, gegebenenfalls in Anwesenheit mindestens eines Immunmodulators.
23. Verwendung einer Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 14, einer Nukleinsäure nach Anspruch 15, eines humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder eines humanen oder tierischen Säugetierorgans nach Anspruch 18 zur Herstellung eines Medikamentes zur Prophylaxe und/oder Therapie von
Transplantationsfolgeerkrankungen und/oder Autoimmunerkrankungen.
24. Verfahren zur Herstellung einer Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 14 enthaltend folgende Schritte: c. Einbringen mindestens einer Nukleinsäure nach Anspruch 15 und/oder mindestens eines Vektors nach Anspruch 16 in eine transplantierbare humane oder tierische nicht-totipotente Zelle, und d. Expression der Nukleinsäure unter Zugabe mindestens einer geeigneten Wirksubstanz zur Regulierung des Genschalters.
25. In v/tro-Verfahren zur Herstellung eines humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes - und/oder humanen oder tierischen Säugetierorgans nach Anspruch 18, enthaltend die folgenden Schritte: e. Einbringen sowohl mindestens einer Nukleinsäure nach Anspruch
15 und/oder mindestens eines Velrtors nach Anspruch 16 und als auch mindestens eines Differenzierungs-Markergens in mindestens eine nicht- totipotente Stammzelle, eine nicht-totipotente Vorläuferzelle und/oder eine nicht-totipotente immortalisierte Zelle, f. Differenzierung der Zelle aus Schritt a, g. Selektionieren der differenzierten Zelle aus Schritt b. und h. Einbringen der selektierten Zelle aus Schritt c. in ein humanes oder tierisches organspezifischen Gewebes und/oder in ein humanes oder tierisches Säugetierorgan.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass nach, vor oder gleichzeitig mit Schritt a. mindestens ein geeignetes Transfektions- Markergen in mindestens eine nicht-totipotente Stammzelle, eine nicht- totipotente Vorläuferzelle und/oder eine nicht-totipotente immortalisierte Zelle eingebracht wird und nach Schritt a. vorzugsweise die transferierte
Zelle aus Schritt a. selektioniert wird.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine pluripotente oder multipotente embryonale, fötale, neonatale oder adulte Stammzelle handelt.
28. Verfahren zur Erzeugung eines transgenen nicht-humanen Säugetiers nach Anspruch 18, enthaltend folgende Schritte: f. Einbringen sowohl mindestens einer Nukleinsäure nach Anspruch 15 und/oder mindestens eines Vektors nach Anspruch 16 als auch mindestens eines geeigneten Transfektions-Markergens in mindestens eine
Oocyte, Stammzelle, eine Vorläuferzelle und/oder eine immortalisierte Zelle eines nicht-humanen Säugetieres, g. Selektionieren der transfizierten Zelle aus Schritt a, h. Einbringen der nach Schritt b. selektierten Zelle in mindestens eine nicht-humane Säugetier-Blastozyste, i. Einbringen der Blastozyste aus Schritt c. in eine nicht-humane
Säugetier-Pflegemutter und j. Identifizierung des sich aus genannter Blastozyste entwickelten transgenen nicht-humanen Säugetiers.
29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine pluripotente oder multipotente embryonale, fötale, neonatale oder adulte Stammzelle handelt.
30. Verfahren zur Erzeugung eines transgenen nicht-humanen Säugetiers nach
Ansprach 19, enthaltend folgende Schritte: d. Einbringen sowohl mindestens einer Nukleinsäure nach Anspruch
15 und/oder mindestens eines Vektors nach Anspruch 16 als auch mindestens eines geeigneten Transfektions-Markergens in einen der beiden Vorkeme einer befruchteten nicht-humanen Säugetier-Oocyte, e. Einbringen der Säugetier-Oocyte aus Schritt a. in eine nichthumane Säugetier-Pflegemutter und f. Identifizierung des sich aus genannter Säugetier-Oocyte entwickelten transgenen nicht-humanen Säugetiers.
31. Transgenes nicht-humanes Säugetier, dadurch gekennzeichnet, dass es nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 28 oder 29 erzeugt wurde.
32. Transgenes nicht-humanes Säugetier, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Nachkomme des Säugetieres nach Anspruch 30 ist.
33. Verwendung eines transgenen nicht-humanen Säugetiers nach einem der Ansprüche 19, 30 oder 31 zur Gewinnung einer nicht-humanen Zelle, eines nicht-humanen organspezifischen Gewebes und/oder eines nicht- humanen Säugetierorgans für die Allo- und/oder Xenotransplantation.
34. Verwendung eines transgenen nicht-humanen Säugetiers nach einem der Ansprüche 19, 30 oder 31, eines humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder eines humanen oder tierischen Säugetierorgans nach Anspmch 18 zum Auffinden von pharmakologisch aktiven Wirkstoffen und/oder zur Identifizierung von toxischen Substanzen.
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