KR102122267B1 - 당뇨병 치료를 위한 복수 형질전환 돼지 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 기능성 알파 1,3 갈락토실트랜스퍼라제 (αGT)의 발현을 결실하고 하나 이상의 추가 전이유전자를 발현하는, 임의의 동물, 특히 돼지류 동물, 이들로부터 유도된 조직 및 세포를 제공하며, 본 발명은 이들을 췌장섬 이종장기이식(xenotransplantation)에 적합한 공여체가 되게 할 수 있다. 또한, 이러한 동물에서 유도된 세포를 사용하여 당뇨병을 치료 및 예방하는 방법을 제공한다.

Description

당뇨병 치료를 위한 복수 형질전환 돼지{MULTI-TRANSGENIC PIGS FOR DIABETES TREATMENT}
관련 출원
본 원은 2009년 8월 14일자, "당뇨병 치료를 위한 복수 형질전환 돼지"라는 제하의 미국 가특허출원 제61/234,150호에 대하여 35 U.S.C. §119 하에서 우선권을 주장하며, 그 전체 내용은 여기에 참조로 포함되어 있다.
발명의 분야
본 발명은 이종장기이식(xenotransplantation) 치료요법에 특히 유용한 공여체 동물(donor animal), 조직 및 세포를 제공한다. 특히, 본 발명은 기능성 알파 1,3 갈락토실트랜스퍼라제 (αGT)의 발현을 결실하고 하나 이상의 추가 전이유전자를 발현하는, 동물을 췌장섬 이종장기이식에 적합한 공여체로 만드는 돼지류 동물, 이들로부터 유도된 조직 및 세포를 포함한다. 또한, 이러한 동물에서 유도된 조직 및 세포를 사용하여 당뇨병을 치료 및 예방하는 방법을 제공한다.
당뇨병
인슐린은 췌장에 의해 생산되는 호르몬으로 당을 혈액에서 몸의 세포로 이동시키며, 이것은 필수 에너지 공급원이 된다. 포유동물에서 인슐린은 췌장에서 랑게르한스 섬(췌장섬)의 베타 세포(β-세포) 내에서 합성된다. 건강한 성인 췌장 내에는 약 1백만 개의 섬(췌장 전체 중량의 약 1-2%)이 있으며, 이 기관의 전체에 분포한다.
당뇨병은 신체가 충분한 인슐린을 생산하지 않거나(제1형 당뇨병), 신체가 생산된 인슐린에 반응할 수 없기(제2형 당뇨병) 때문에 혈액에서 당이 비정상적으로 상승되는 것(고혈당증, hyperglycemia)을 특징으로 하는 질환 상태이다. 조절되지 않으면, 고혈당증은, 예를 들면 실명, 심장병, 신장질환 및 심지어 사망 등의 심각한 합병증을 유발할 수 있다.
미국에만 2000만 명 이상이 당뇨병을 앓고 있다. 제2형 당뇨병(T2D)이 가장 흔한 형태이며, 신체활동의 부족 및 비만과 연관되어 있다. 세계보건기구(WHO)의 통계에 따르면, 2007년에 세계적으로 1억 8천만 명을 넘는 사람들이 당뇨병을 앓고 있어서, 그 결과 290만 명의 사망자(전세계 사망율의 6%)가 발생하였고 총 2300억 달러 이상의 경제적 부담과 연관되어 있다.
제1형 당뇨병(T1D)은 T2D 보다는 훨씬 덜 일반적이다. T2D는 환자의 자가 면역계가 신체의 인슐린을 생산하는 췌장 베타 세포를 파괴하는 자가면역 질환이다. 전형적으로 어린 나이에 진단되면, 생애 내내 치료를 필요로 하는 만성질환이다. 치료는 일반적으로 인슐린 보충요법의 형태이며, 이것은 전형적으로 주사 또는 펌프에 의해 전달된다. 성공적인 인슐린 관리는 제공되는 식이요법이 얼마나 밀접하게 정상적인 생리적 인슐린 방출 패턴을 모방할 수 있는지에 달려있다. 입수할 수 있는 인슐린에는 몇 가지 상이한 형태가 있으며, 특정한 형태/양생법의 선택은 환자의 기호와 특정한 치료 양생법에 부착하는 능력을 반영할 수 있다. 인슐린의 약리학과 전달의 발전에도 불구하고, 인슐린 보충요법을 사용하는 엄격한 혈당조절을 달성하는 것은 큰 부담이 될 수 있다. 따라서, 많은 T1D 환자들이 여전히 고혈당증과 저혈당증을 경험하고 그 결과로서 장기간의 합병증으로 고통받는다.
인슐린 보충요법의 부담을 고려할 때, 치료대체제가 강력히 요구되고 있다. 이식된 사람의 췌장(동종이식)은 T1D 환자에게 가능한 치료를 제공한다. 공급원은 최근에 사망한 사람 공여자이거나 살아있는 공여체(부분적 췌장 이식) 등이다. 수용자의 원래 췌장은 일반적으로 제자리에 남기고, 공여된 췌장을 다른 위치에 부착한다. 검사는 수술과정에 내재하는 위험뿐만 아니라 대부분의 이식된 기관에 공통적인 거부반응의 가능성도 포함된다. 동종이식 췌장에 대한 거부반응은 이식 후 수 초(급성) 내지 수 년(만성) 내 언제든지 발생할 수 있다. 거부반응을 피하기 위해, 면역억제 약물을 무기한 복용해야 한다. 이러한 약물은 이겨내기 어렵고, 환자의 감염성 질환에 대한 위험을 증가시킬 수 있으며, 고혈압, 신장과 간의 장애와 연관되어 있다. 이식의 위험과 면역억제 약물 요법의 확대된 사용은 당뇨병 환자에게 특히 문제가 되는데(즉, 다른 기관 이식 수용자와 비교하여), 약물 요법은 일반적으로 선택이지만 바람직하지 않기 때문이다. 2003년의 연구에서는 기능성 신장을 가지는 환자에 있어서, 췌장만을 이식한 환자의 생존율이 일반적 요법으로 당뇨병을 관리하는 환자들의 생존율보다 훨씬 낮다는 사실을 발견하였다(Venstrom 등. 2003;290:2817-2823). 그 결과, 췌장 이식은 단지 일반적으로 말기 신장병이 있는 제1형 당뇨환자에게 수행된다.
섬 세포만(전체 췌장에 대해)의 이식은 침습성이 훨씬 적은 이식에 기초한 대체물을 제공한다. 여기에서 섬은 공여체의 췌장에서 단리되어 환자에게 카테터에 의해 문맥으로 주입된다(즉, 복부 대절개 불필요). 섬은 이들이 고정되는 간으로 이동하여 인슐린 생산을 이어받고 본질적으로 간이 대용 췌장이 되게 한다. 하지만, 초기에 섬 이식의 성공률은 매우 저조하였고 환자는 단기간 동안만 인슐린 독립적이었다. 에드몬톤(Edmonton) 방법과 이러한 초기 섬 이식술 간의 중요한 차이점은 면역억제 약물과 하나 이상의 췌장으로부터의 섬 이식물의 특별한 조합을 사용하는 것이다. 구체적으로, 에드몬톤 방법은 다클리주맵(daclizumab), 시롤리무스 (sirolimus) 및 타크롤리무스(tacrolimus)를 포함하는 면역역제 약물의 조합물을 사용한다. 다클리주맵은 이식 후 즉시 정맥 내로 제공된 다음, 중단시킨다. 이후, 환자에게 시롤리무스와 타크롤리무스가 무기한 제공된다.
췌장 전체와 섬 이식 방법은 모두 현재 존재하지 않는 사람 췌장 공여체의 안정적인 공급에 의존한다. 현재, 매년 3000개 사체 췌장만이 입수가능한데, 200만 명 이상의 T1D 환자에게 필요한 숫자에는 턱없이 부족하다.
유전자 요법은 또다른 대체요법이다. 면역 거부반응을 방지하고 섬 이식의 증식과 생존을 개선하기 위한 사람의 췌장섬 내 전이유전자의 삽입 및 발현이 수많은 연구에서 초점이 되어왔다(McCabe et　al., Diabetes Metab Res Rev. 2006 May-Jun;22(3):241-52; Chuang et　al., 2008; Martin et　al., Endocr Dev. 2007;12:24-32; Faideau et　al., Diabetes. 2005 Dec;54 Suppl 2:S87-96 참조). 사람 췌장섬의 생체외 형질도입에 의한 전이유전자 전달이 연구되었다(Garcia-Ocana et　al., Journal of Biol Chem., 2003, 278:343-351; Li et　al., Transplantation Proceedings, 39:3436-3437). 그러나, 이러한 시스템에서의 면역조절 유전자 발현은 아데노바이러스로 감염된 췌장섬 이식이 약 한달 내에 거부되기 때문에 장기간의 당뇨 조절에는 불충분하다(Sakata et　al., Diabetes Research and Clinical Practice, 2008, 80:352-359 참조). 또한, 사람에게서 유전자 요법에 사용된 아데노바이러스 벡터는 임의의 유전자를 전달하는 이들의 능력에 한계가 있으며 면역반응을 촉발하여 심지어 죽음에 이르게도 한다(Flotte, J. of Cellular Physiology, 2007, 213:301-305). 대체용 비바이러스 유전자 전달 시스템의 효능은 낮으며, 따라서 사람 췌장세포의 일시적인 유전적 변성은 T1D 환자의 요구를 효과적으로 해결하는데 실패하였다.
이종장기이식(Xenotransplantation)
이종장기이식(상이한 종의 공여체로부터 기관, 조직 및 세포의 이식)은 사람 공여체 췌장의 부족을 효과적으로 해결할 수 있다. 이종장기이식은 또한 (i) 예측가능한, 비응급성 기반 하에 유리하게 공급되고; (ii) 제어된 환경 하에서 생산되며; (iii) 이식 전에 특성화 및 시험이 가능하다.
공여체와 수용체 종 간의 관계에 따라, 이종이식은 일치(concordant) 또는 불일치(discordant)로 기술할 수 있다. 일치종은 계통발생적으로 밀접하게 연관된 종(예를 들면, 마우스 내지 래트)이다. 불일치종은 밀접하게 연관되지 않는다(예를 들면, 돼지 내지 사람). 돼지는 이종장기이식 영역에서 많은 연구의 중심이 되고 있는데, 돼지가 사람과 해부학적 및 생리학적 특성을 많이 공유하기 때문이다. 돼지는 또한 비교적 짧은 임신기간을 가지며, 병원균이 없는 환경에서 사육될 수 있고 식품원과 같은 일반적으로 사용되지 않는 동물(예를 들면, 영장류)과 연관된 윤리적 문제를 일으키지 않을 수 있다.
돼지 대 영장류의 이종장기이식 분야의 과학적 지식과 전문지식은 지난 10년 동안 급격히 성장하여 생명구제 돼지 이종이식의 영장류 수용체의 생존률이 상당히 연장되었다(Cozzi et al., Xenotransplantation, 16:203-214. 2009). 최근에, 췌장섬 이종장기이식 분야에서 비중있는 성과가 보고되었으며((Hering BJ, et al., Nat Med, 12:301-303. 2006; Cardona K, et al., Nat Med, 12:304-306. 2006.; Gianello P and Dufrane D., Xenotransplantation, 14: 441. 2007), 이러한 진전이 고체 장기가 아니라 췌장섬이 앞으로의 임상 이종장기이식 시도에서 제1형 이식이 될 수 있다는 암시를 유도하고 있다.
유전적 변성
여러가지 면에서 유리하지만, 이종장기이식은 또한 동종이식보다 훨씬 복잡한 면역학적 시나리오를 생성한다. 이처럼 유전적 변성에 의해 면역 장벽을 해결하는데 많은 노력이 집중되었다((van der Windt et　al., Xenotransplantation. 2007 Jul;14(4):288-97, Cowan and D'Apice, Curr Opin Organ Transplant. 2008 Apr;13(2):178-83).
이종이식 거부반응은 다음 3가지 상태로 분류할 수 있다: 초급성 거부반응, 급성 체액성 이종이식편 거부반응 및 T-세포 매개 세포성 거부반응. 초급성 거부반응(HAR)은 비가역적 이식 손상과 이식 재관류 후 수 분 내지 몇 시간 이내에 손실을 일으키는 매우 긴급한 상태이다. 이는 이식 시 수용체 내에 존재하는 이종반응성 천연 항체의 존재에 의해 촉발된다. 사람은 돼지 세포에서 발견된 알파 1,3-갈락토스 (Gal) 에피토프에 대해 자연적으로 발생한 항체를 가진다. 이 항체는 다량 생산되며, 최근에는 HAR의 주요 매개체인 것으로 생각되고 있다(Sandrin et　al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Dec 1;90(23):11391-5, 1993; review by Sandrin and McKenzie, Immunol Rev. 1994 Oct;141:169-90). 유전적으로 돼지를 변성하는 초기 노력은 돼지 세포에서 알파 1,3-갈락토스 (Gal) 에피토프를 제거하는데 집중되었다. 2003년에, Phelps 등 (Science, 2003, 299:411-414)은 αGT (GTKO)의 기능적 발현이 결핍된 살아있는 돼지의 생산을 최초로 보고하였으며, 이것은 이종장기이식에서 중요한 진전이었다(Revivicor, Inc.의 PCT 공개 제 WO 04/028243호 및 Immerge Biotherapeutics, Inc.의 PCT 공개 제 WO 04/016742호 참조). 후속 연구들에서 GTKO 돼지로부터의 기관 이식이 HAR을 일으키지 않는 것이 입증되었다(Kuwaki et　al., Nat Med. 2005 Jan;11(1):29-31, Yamada et　al., Nat Med. 2005 Jan;11(1):32-4). 하지만 Gal-매개 HAR은 현재 전체 기관의 이종장기이식에서 중요한 인자인 것으로 알려져 있다.
다자란 돼지에서는 순수한 집단의 췌장 베타 세포가 의미있는 수준의 면역원성 Gal 에피토프를 발현하지 않기 때문에 HAR이 성인 췌장섬 이종장기이식의 중요인자인지는 명확하지 않다. 실제로, 한 연구에서 GTKO 돼지 췌장섬이 야생형 췌장섬 만큼 파괴에 대한 감수성이 있는 것으로 밝혀졌다 (Rood, et　al. (2007) Transplantation 83:202-210). 그러나, 성체 췌장섬과는 달리, 태아와 신생아 췌장섬은 Gal을 발현한다.
이종이식 조직에서 보상(complement) 조절인자의 발현은 HAR과 대항하기 위한 상이한 전략으로 제안되고 있다(Squinto, Curr Opin Biotechnol. 1996 Dec;7(6):641-5). Imutran의 유럽 특허 제0495852호는 이종이식 조직을 수용체 보상 제한인자와 결합하여 수용체에서의 보상 활성화를 감소시키는 것을 제안하고 있다(Diamond, et　al., Transpl Immunol. 1995 Dec;3(4):305-12 참조). 사람의 DAF (hDAF) 및/또는 사람의 CD59 (hCD59)를 발현하는 형질전환 돼지가 보고되었다(Byrne et　al., Transplant Proc., 1996 Apr;28(2):758). CD46은 높은 유비쿼터스 발현에 최적화되고 마우스 이종이식 모델에서 돼지 세포를 보호하는 것으로 보이는 미니유전자를 사용하여 돼지 세포에서 발현된다(Loveland et　al., Xenotrans-plantation, 2004, 11:171:183; McKenzie et　al., Xenotransplantation. 2003 Nov;10(6):615-21). 그러나, 이러한 인자들의 발현은 가변적이며 일반적으로 췌장세포에서 매우 낮다(Bennet et　al., Transplantation, 2001, 72:312-319 참조).
HAR을 회피한 경우에도 이종이식은 거부반응의 지연된 형태인, 급성 체액성 이종이식 거부반응(AHXR)을 일으키며, 이것은 또한 지연 이종이식 거부반응(DXR)으로 지칭되기도 한다. 이것은 일반적으로 비(non)-Gal 항체 및 그래프트 내피의 후속 활성화를 포함하는 이종반응성 항체, 보상 시스템 및 응집 시스템에 의해 개시되는 것으로 생각된다(Miyagawa et al. Xenotransplantation, 2010, 1: 11-25).
체액성 반응에 의한 위협이 혈관성 그래프트의 생존과 작용과 관련하여 치명적이지만, 세포 메카니즘에 의한 그래프트 손상의 위험 또한 중요하다. 췌장섬 세포의 이종이식에서 이들의 역할이 충분히 규명되지는 않았지만, T-세포 매개 급성 반응은 이종이식 거부반응에서 중요한 역할을 한다. 이제까지 밝혀진 몇 종의 T 세포 공동촉진(costimulatory) 경로 중에서 가장 명확한 것은 CD28 경로 및 관련된 세포독성 T-림프구 결합 단백질(CTLA4) 경로이다.
면역억제제로서의 CTLA4-Ig에 대한 수많은 연구들은 이제까지 환자에게 CTLA4-Ig의 가용성 형태를 투여하는 것에 집중되었다(미국 특허 제7,304,033호; PCT 공개 제 WO 99/57266호; 및 Lui et　al. J Immunol Methods 2003 277:171-183 참조). 환자에서의 전체 면역억제 부담을 줄이기 위해 이러한 단백질의 형질전환 발현이 제안되었다. CTLA4-Ig를 발현하는 형질전환 마우스를 개발하였다(Ronchese et　al. J Exp Med (1994) 179:809; Lane et　al. J Exp Med. (1994) Mar 1;179(3):819; Sutherland et　al. Transplantation. 2000 69(9):1806-12). 또한, Alexion Pharmaceuticals, Inc.의 PCT 공개 제WO 01/30966호 및 Revivicor의 PCT 공개 제WO 07/035213호는 CTLA4-Ig 전이유전자만을 발현하는 형질전환 돼지를 기술하고 있다. 또한, Phelps 등의 Xenotransplantation, 16(6):477-485. 2009 참조. 뇌 조직에서 CTLA4-Ig를 발현하는 돼지가 만들어졌지만, 높은 혈장 발현이 부정적 효과를 일으키는 것으로 나타났다(Martin, et　al. (2005) Transg. Rsch. 14:373-84). 유제류에서 면역억제 전이 유전자의 장기간 발현이 유제류 또는 이러한 동물 조직의 수용체에 대하여 안전성 문제를 유발하는지에 대해서는 의심의 여지가 있다.
세포 및 체액 면역반응 이외에, 췌장섬 이식과 연관된 중대한 문제는 이식된 췌장섬의 주입(infusion) 및 수용체 혈액과의 접촉 직후 췌장섬의 심각한 조기 중량 손실로, 즉각적인 혈액 매개 염증 반응(IBMIR)으로 알려진 현상이다 (Bennet et　al., Ups J Med Sci 2000, 105:125-133) 이종이식에 대한 응고반응을 억제하기 위하여 항응고 전이유전자의 첨가가 제안되었다(Cowan, Xenotransplantation, 2007; 14:7-12에 의한 리뷰). 그러나, 이러한 보고는 기관 이식과 연관된 응고의 감소에 집중되어 있다. 또한, 이종장기이식에 적합한 항응고-발현 동물의 생산이 마우스처럼 작은 포유동물에서도 나타나는 출혈성 표현형으로 인하여 어렵다는 것이 입증되었다(Dwyer et　al. (2004) J Clin Invest 113: 1440-46 참조).
또한, 항응고요법이 IBMIR을 억제하는데 유용한지에 대해 의심의 여지가 있다. 이종이식 모델에서 보상 고갈(depletion) 또는 항응집의 사용은 IBMIR을 억제하는데 충분하지 않은 것으로 밝혀졌다(Rood et　al. 2007 Transplantation 83:202-210). Cabric, 등( (2006) Cell Transpl 15:759-67 and (2007) Diabetes 56:2008-15) 은 유전자 치료방법이 새로운 DNA를 췌장섬에 삽입하여 염증 또는 적응성 면역반응을 유발하는 위험과 연관되며, 형질도입된 췌장섬이 손상된 글루코스로 자극된 인슐린 방출을 나타내므로 유전자 치료요법이 췌장섬에서 IBMIR을 회피하는데 적절하지 않음을 시사하였다. 대신, 이들은 췌장섬 세포를 헤파린과 같은 약물로 사전처리하는 것을 제안하였다.
췌장섬의 이종장기이식, 특히 돼지를 공여체로 하는 이식이 사람 췌장섬의 제한된 공급과 품질로 인하여 동종이식을 사용하는 것에 대한 매력적인 대안이긴 하지만 커다란 장애가 남아 있다. 즉각적인 면역반응 및 지연된 면역반응과 췌장섬 파괴는 모두 면역억제제 요법의 잠재적으로 유독성인 칵테일을 필요로 한다. 임의의 면역반응을 해결하기 위한 유전적으로 변성된 동물의 생산이 제안되고 있지만, 이러한 생산방법은 제자리에서의 면역억제제 발현과 연관된 독성으로 인하여 제한된 성공에 그쳤다. 이종장기이식 요법에 적합한 개선된 동물과 조직에 대한 필요성은 여전히 남아 있다. 특히, 상당기간 또는 장기간의 면역억제 요법이 필요 없이 환자의 당뇨병을 경감하는 인슐린을 생산하는 이종이식물을 제조하기 위한 개선된 동물과 조직이 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 이종장기이식 요법에 특히 유용한 유전적으로 변성된 공여체 동물, 조직 및 세포를 제공한다. 더욱 구체적으로, 유전적으로 변성된 공여체 동물은 급성 혈액매개성 염증반응(IBMIR)을 제한할 뿐만 아니라 심각한 체액성(HAR 및 AHXR/DXR) 및 세포성 면역반응(ACXR)을 극복한 조직과 세포의 공급원으로 작용하여, 이들을 당뇨병, 특히 제1형 당뇨병을 위한 이종장기이식 요법에 특히 유용하게 하고, 임상적으로 관련 있는 면역억제 요법을 사용하여 장기간의 면역억제제 또는 항응고 요법의 필요성이 저감된다.
본 발명의 살아있는, 유전적으로 변성된 돼지류는 항응고제, 면역조절제 및 점막보호제를 포함하는 군에서 선택된, 이식 거부반응을 극복하는데 중요한 전이유전자의 발현뿐만 아니라 (즉, 기능성 알파 1,3 갈락토실 트랜스퍼라제(αGT)의 결실(lack)로 인한)글로벌하게 감소된 면역 반응성을 특징으로 한다. 본 발명 이전에, 동물의 생존가능성이 심각하게 단축될 것으로 예상되기 때문에 동물이 면역손상 및 호혈성이 되게 할 수 있는 이러한 종류의 유전자가 적합한 이식 공여체가 될 수 있는 단일 동물에서 발현될 수 있는지 알려져 있지 않았다. 본 발명자들은 이러한 공여체 동물, 조직 및 세포를, 특히 기능성 알파 1,3 갈락토실트랜스퍼라제(GTKO)의 발현 결실로 인한 면역 반응성의 글로벌 감소가 임의의 전이유전자의 조직 특이적 발현과 결합될 때 얻어질 수 있음을 발견하였다.
본 발명의 일 구체예에서는 기능성 알파 1,3 갈락토실트랜스퍼라제(GTKO)의 발현을 결실하고 췌장 조직에서 적어도 하나의 전이유전자를 특이적으로 발현하는 돼지류, 그의 조직 및 세포를 제공한다.
특정한 일 구체예에서, 췌장 조직에서 특이적으로 발현된 전이유전자는 적어도 하나의 항응고제이다. 또다른 특정한 구체예에서, 췌장 조직에서 특이적으로 발현된 전이유전자는 적어도 하나의 면역조절제이다. 특이적 구체예에서, 췌장 조직에서 특이적으로 발현된 전이유전자는 적어도 하나의 면역억제제이다. 특정한 다른 구체예에서, 췌장 조직에서 특이적으로 발현된 전이유전자는 적어도 하나의 세포보호 전이유전자이다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 췌장 조직에서 복수 전이유전자를 특이적으로 발현하는 GTKO 동물, 조직 및 세포가 제공된다. 특정 구체예에서, 복수 전이 유전자는 항응고제, 면역조절제 및 세포보호 전이유전자를 포함하는 군에서 선택된다.
특정 구체예에서, 췌장 조직에서 적어도 2개의 전이유전자를 특이적으로 발현하는 GTKO 동물, 조직 및 세포가 제공된다. 특이적 구체예에서, 적어도 2개의 전이유전자는 모두 항응고제이다.
특정 구체예에서, 췌장 조직에서 적어도 3개의 전이유전자를 특이적으로 발현하는 GTKO 동물, 조직 및 세포가 제공된다. 특이적 구체예에서, 적어도 3개의 전이유전자는 2개의 항응고제 전이유전자와 1개의 면역억제제 전이유전자를 포함한다.
다른 특이적 구체예에서, 기능성 알파 1,3 갈락토실트랜스퍼라제(GTKO)의 발현을 결실하고 췌장 조직에서 TFPI, CD39 및 CTLA4를 특이적으로 발현하는 GTKO 동물, 조직 및 세포가 제공된다.
본 발명의 다른 구체예에서, 기능성 알파 1,3 갈락토실트랜스퍼라제(GTKO)의 발현을 결실하고 적어도 하나의 제1 전이유전자와 적어도 하나의 제2 전이유전자를 발현하고, 여기에서 제2 전이유전자가 췌장 조직에서 특이적으로 발현되는 돼지류, 조직 및 세포가 제공된다.
일 구체예에서, 적어도 하나의 제1 전이유전자는 면역조절제이다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 제1 전이 유전자는 보체(compliment) 저해제이다.
다른 구체예에서, 적어도 하나의 제1 전이 유전자는 보체 저해제이고, 췌장 조직에서 특이적으로 발현된 적어도 하나의 제2 전이유전자는 (i) 항응고제; (ii) 면역억제제; 및 (iii) 점막보호제를 포함하는 군에서 선택된다.
일 구체예에서, 기능성 알파 1,3 갈락토실트랜스퍼라제(GTKO)의 발현을 결실하고 적어도 하나의 보체 저해제와 항응고제, 면역억제제 및 점막보호제로 구성되는 군에서 선택된 하나 이상의 추가 전이유전자를 발현하는 돼지류, 조직 및 세포가 제공된다.
특이적 구체예에서, 기능성 알파 1,3 갈락토실트랜스퍼라제(GTKO)의 발현을 결실하고 적어도 하나의 보체 저해제와 적어도 하나의 항응고제를 발현하는 돼지류, 조직 및 세포가 제공된다. 특정한 구체예에서, 보체 저해제는 CD46이고, 적어도 하나의 항응고제는 TFPI, CD39, 히루딘(hirudin), 트롬보모듈린(thrombomodulin) 및 EPCR로 구성되는 군에서 선택된다. 다른 특정한 구체예에서, 적어도 하나의 보체 저해제는 CD46이고 적어도 하나의 추가 전이유전자는 면역억제제, 예를 들면 CTLA4이다.
특이적 구체예에서, 기능성 알파 1,3 갈락토실트랜스퍼라제(GTKO)의 발현을 결실하고 또한 적어도 하나의 보체 저해제, 적어도 하나의 항응고제 및 적어도 하나의 면역억제제를 발현하는 돼지류, 조직 및 세포가 제공된다. 임의로, 돼지류, 조직 및 세포는 또한 적어도 하나의 세포보호 전이유전자를 발현한다.
일 구체예에서, 전이유전자는 췌장 세포에서 특이적으로 발현된다. 특정 구체예에서, 전이유전자는 췌장섬 세포에서 특이적으로 발현된다. 특이적 구체예에서, 전이유전자는 베타 세포에서 특이적으로 발현된다. 발현은 어떤 농도로도 가능하지만, 특이적 구체예에서, 고농도로 발현된다. 특정 구체예에서 세포는 캡슐화된다.
본 발명에 따른 항응고제는 조직인자 경로 저해제(TFPI), 히루딘, 트롬보모듈린, 내피 단백질 C 리셉터 (EPCR), 및 CD39를 포함하는 군에서 선택할 수 있다. 특정 구체예에서, 항응고제는 TFPI이다. 다른 구체예에서, 항응고제는 CD39이다.
본 발명에 따른 면역조절제는 보체 저해제이거나 면역억제제일 수 있다. 특이적 구체예에서, 면역조절제는 보체 저해제이다. 보체 저해제는 CD46 (또는 MCP), CD55, CD59 또는 CR1일 수 있다. 다른 특이적 구체예에서, 면역조절제는 면역억제제이다. 면역억제제는 CTLA4-Ig일 수 있다. 다른 면역조절제는 클래스 II 트랜스활성제(CIITA) 및 그의 돌연변이, PDL1, PDL2, 또는 종양괴사인자-α와 연관된 세포사멸 유발 리간드(TRAIL), Fas 리간드 (FasL, CD95L) CD47, 인티그린(integrin) 결합 단백질로 알려진 것(CD47), HLA-E, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR일 수 있다.
본 발명에 따른 세포보호 전이유전자는 항세포사멸, 항산화 또는 항염증 전이유전자일 수 있다. 임의의 구체예에서, 세포보호 전이유전자는 A20, HO-1, FAT-1, 및 가용성 TNF-알파 리셉터 (sTNFR1)를 포함하는 군에서 선택된다.
특이적 구체예에서, 본 발명은 적어도 다음과 같은 유전적 변성이 주어진 돼지류, 조직 및 세포를 제공한다: GT 발현의 결실, CD46의 발현 및 TFPI의 췌장 특이적 발현.
또다른 특이적 구체예에서, 본 발명은 적어도 다음과 같은 유전적 변성이 주어진 돼지류, 조직 및 세포를 제공한다: GT 발현의 결실, CD46의 발현, TFPI의 췌장 특이적 발현 및 CD39의 췌장 특이적 발현. 특정 구체예에서, CD46은 어디서든지 발현된다.
또다른 특이적 구체예에서, 본 발명은 적어도 다음과 같은 유전적 변성이 주어진 돼지류, 조직 및 세포를 제공한다: GT 발현의 결실, CD46의 발현, TFPI의 췌장 특이적 발현 및 CTLA4-Ig의 췌장 특이적 발현. 특정 구체예에서, CD46은 어디서든지 발현된다.
또다른 특이적 구체예에서, 본 발명은 적어도 다음과 같은 유전적 변성이 주어진 돼지류, 조직 및 세포를 제공한다: GT 발현의 결실, CD46의 발현, TFPI의 췌장 특이적 발현, CD39의 췌장 특이적 발현 및 CTLA4-Ig의 췌장 특이적 발현. 특정 구체예에서, CD46은 어디서든지 발현된다.
또다른 특이적 구체예에서, 본 발명은 적어도 다음과 같은 유전적 변성이 주어진 돼지류, 조직 및 세포를 제공한다: GT 발현의 결실, CD46의 발현, 세포보호 전이유전자의 발현, TFPI의 췌장 특이적 발현, CD39의 췌장 특이적 발현 및 CTLA4-Ig의 췌장 특이적 발현. 특정 구체예에서, CD46은 어디서든지 발현된다.
또다른 특이적 구체예에서, 본 발명은 적어도 다음과 같은 유전적 변성이 주어진 돼지류, 조직 및 세포를 제공한다: GT 발현의 결실, CD46의 발현, 세포보호 전이유전자의 발현, TFPI의 췌장 특이적 발현, 및 CD39의 췌장 특이적 발현. 특정 구체예에서, CD46은 어디서든지 발현된다.
일 구체예에서는 본 발명의 조직 또는 세포를 이를 필요로 하는 숙주에게 투여하는 것을 포함하는 당뇨병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 숙주는 당뇨병 숙주이다.
일 구체예에서, 당뇨병 숙주는 당뇨병 영장류이다. 특정 구체예에서, 숙주는 당뇨병이 있는 사람이다. 특이적 구체예에서, 숙주는 제1형 당뇨병(T1D)을 앓고 있는 사람이다.
일 구체예에서, 조직은 돼지 췌장 조직이다. 다른 구체예에서, 세포는 췌장 유도 세포, 전체 췌장섬 또는 췌장섬 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 췌장섬이다. 또다른 특정 구체예에서, 췌장 세포는 베타 세포이다. 일 구체예에서, 췌장 세포는 성체 세포이다. 또다른 구체예에서, 췌장 세포는 태아 또는 신생아 세포이다.
일 구체예에서는 본 발명의 돼지류에서 단리된 섬세포를 투여하는 것을 포함하는 당뇨병을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.
선택적 구체예에서는 당뇨병 숙주에게 본 발명의 조직 또는 세포를 투여하여 당뇨병 숙주가 필요로 하는 인슐린 양을 저감하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 숙주는 치료 후에 외인성 인슐린이 필요하지 않거나 감소가 필요하다. 일 구체예에서, 숙주는 치료 후에 약 5% 내지 약 25% 더 적은 인슐린을 필요로 한다. 또다른 구체예에서, 숙주는 치료 후에 약 25% 내지 약 50% 더 적은 인슐린을 필요로 한다. 또 또다른 구체예에서, 숙주는 치료 후에 약 50% 내지 약 75% 더 적은 인슐린을 필요로 한다. 추가적인 다른 구체예에서, 숙주는 치료 후에 약 75% 내지 약 100% 더 적은 인슐린을 필요로 한다.
특정 구체예에서, 치료 후, 숙주는 1일 당 4 단위 미만, 3 단위 미만, 2 미만, 2 단위 미만, 또는 1 단위 미만의 인슐린을 필요로 한다. 일 구체예에서, 치료 후, 숙주는 외인성 인슐린을 필요로 하지 않는다.
다른 구체예에서, 여기서 제공된 조직 또는 세포는 재이식 시술에 사용될 수 있으며, 이러한 시술은, 예를 들면 임의의 구체예에서 혈당증을 장기간 조절하기 위해 충분한 수준의 췌장섬을 유지하는데 필요할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서는 본 발명의 조직 또는 세포를 당뇨병을 앓고 있는 숙주에게 투여하는 것을 포함하는 당뇨병을 치료하거나 예방하는 방법이 제공되며, 여기에서 숙주는 치료 후에 면역억제 요법이 필요하지 않거나 감소된다.
일 구체예에서, 면역억제 약물/제제의 투여량은 다른 방법과 비교하여 감소된다. 특이적 구체예에서, 하나 이상의 다클리주맵, 타크롤리무스, 및/또는 시롤리무스(sirolimus)의 투여량은 다른 이식 방법에서 사용되는 투여량과 비교하여 감소된다.
다른 구체예에서, 면역억제 약물/제제의 수는 다른 방법과 비교하여 감소된다.
일 구체예에서, 면역억제의 지속기간은 다른 방법과 비교하여 줄어든다.
다른 구체예에서, 다른 방법과 비교하여 유지 면역억제가 낮아지거나 사용되지 않는다.
일 구체예에서는, IEQ/kg(kg 당 췌장섬 당량) 필요량이 다른 방법과 비교하여 감소된, 본 발명의 조직 또는 세포를 당뇨병을 앓고 있는 숙주에게 투여하는 것을 포함하는 당뇨병의 치료 또는 예방방법이 제공된다. 다른 구체예에서, IEQ/kg는 100,000 이하이다. 다른 구체예에서, IEQ/kg는 50,000 이하이다. 일 구체예에서, IEQ/kg는 25,000 이하이다. 또다른 구체예에서, IEQ/kg는 10,000 이하이다.
다른 구체예에서, 조직 또는 세포가 문맥내 주입으로 투여되는, 본 발명의 췌장 세포 또는 섬을 당뇨병을 앓고 있는 숙주에게 투여하는 것을 포함하는 당뇨병의 치료 또는 예방방법이 제공된다. 특정 구체예에서, 췌장섬은 문맥내 주입으로 투여된다. 일 구체예에서, 췌장섬은 복막내 공간, 신장 서브캡슐, 신장 캡슐, 장막 도는 췌장 베드 주입에 의해 투여된다.
다른 구체예에서, 본 발명의 췌장 세포 또는 섬을 당뇨병을 앓고 있는 숙주에게 투여하는 것을 포함하고, 조직 또는 세포가 캡슐화되는 당뇨병의 치료 또는 예방방법이 제공 된다. 일 구체예에서, 세포는 마이크로캡슐화된다. 선택적 구체예에서, 세포는 마크로캡슐화된다. 다른 구체예에서, 세포는 캡슐화되지 않는다. 특정 구체예에서, 세포는 정제된 알기네이트와 세포를 포함하는 박판 시이트의 형태로 제공된다. 특이적 구체예에서, 췌장섬은 마이크로캡슐화되거나, 마크로캡슐화되거나, 또는 정제된 알기네이트와 췌장섬을 함유하는 박판 시이트로 제공된다.
다른 구체예에서, 본 발명의 조직 또는 세포를 당뇨병 숙주에게 투여하는 것을 포함하고, 이식 후에 숙주가 일부 또는 전체 기능성 이식 세포를 가지는 당뇨병의 치료 또는 예방방법이 제공된다. 일 구체예에서, 숙주는 다른 방법을 수행한 후에 존재하는 기능성 이식 췌장섬의 수와 비교하여 더 많은 기능성 이식 췌장섬을 가진다. 일 구체예에서, 췌장섬의 기능성은 0.3ng/dl를 초과하는 기본 또는 자극된 돼지 C-펩티드로 정의된다. 일 구체예에서 췌장섬의 기능성은 50%를 초과하는 외인성 인슐린 필요량 감소와 결합하여 검출가능한 돼지 C-펩티드로 정의되며, 여기에서 C-펩티드는 이식된 물질로부터 생산된다. 특정 구체예에서, 기능성이 있는 췌장섬은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100%이다.
다른 구체예에서, 본 발명의 조직 또는 세포를 당뇨병 환자에 투여하는 것을 포함하고, 이식 후 숙주가 정상혈당을 유지할 수 있는 당뇨병의 치료 또는 예방방법이 제공된다. 일 구체예에서, 정상혈당이 적어도 3개월 동안 유지된다. 다른 구체예에서, 정상혈당은 적어도 6개월 또는 적어도 12개월 유지된다.
다른 구체예에서, 본 발명의 조직 또는 세포를 당뇨병 환자에게 투여하는 것을 포함하고, 이식 후 숙주의 금식 및 비금식 혈당 수준(각각 FBG 및 NFBG)을 정상수준으로 유지할 수 있는 당뇨병의 치료 또는 예방방법이 제공된다. 일 구체예에서, 정상수준은 적어도 3개월 동안 유지되어야 한다. 다른 구체예에서, 정상수준은 적어도 6개월 동안 유지되어야 한다. 또다른 구체예에서, 정상수준은 적어도 12개월 동안 유지되어야 한다. 특정 구체예에서, FBG는 약 70 내지 약 100 mg/dL (3.9 내지 5.5 mmol/L)로 유지될 수 있다. 다른 구체예에서, FBG는 약 70 내지 약 130 mg/DL로 유지될 수 있다. 다른 특정 구체예에서, NFBG는 약 200mg/dL 미만으로 유지될 수 있다.
일 구체예에서, 치료 후, 숙주는 약 8.0 % 미만의 글리케이트(glycat)화된 헤모글로빈을 가진다. 다른 구체예에서, 치료 후, 숙주는 약 6.5 % 미만의 글리케이트(glycate)화된 헤모글로빈을 가진다.
일 구체예에서, 본 발명의 조직 또는 세포를 당뇨병 숙주에게 투여하는 것을 포함하고, 숙주가 이식 후 정맥 내 글루코스 내성 시험을 성공적으로 통과하는 당뇨병의 치료 또는 예방방법이 제공된다. 일 구체예에서, 시험은 이식 후 1, 3, 6 및/또는 12개월에 수행할 수 있다. 다른 구체예에서, 글루코스에 대한 유의한 반응이 돼지 C-펩티드 형태로 사람이 아닌 영장류 C-펩티드의 유의한 반응 부재 하에서 입증되면 시험 결과는 성공적이다.
다른 구체예에서, 본 발명의 조직 또는 세포를 당뇨병을 앓고 있는 당뇨병 숙주에게 투여하는 것을 포함하고, 숙주가 이식 후 아르기닌 자극 시험을 성공적으로 통과하는 당뇨병의 치료 또는 예방방법이 제공된다. 일 구체예에서, 시험은 이식 후 이식 후 1, 3, 6 및/또는 12개월에 수행할 수 있다. 다른 구체예에서, 글루코스에 대한 유의한 반응이 돼지 C-펩티드 형태로 사람이 아닌 영장류 C-펩티드의 유의한 반응 부재 하에서 입증되면 시험 결과는 성공적이다.
일 구체예에서, 본 발명의 조직 또는 세포를 당뇨병 숙주에게 투여하는 것을 포함하고, 이식 후 공여체 C-펩티드 농도가 검출될 수 있는 당뇨병의 치료 또는 예방방법이 제공된다. 다른 구체예에서, 돼지 C-펩티드 농도는 약 0.3 내지 0.96이다. 특이적 일 구체예에서, 돼지 C-펩티드 농도는 약 0.21 내지 0.63(ng/ml)이다.
다른 구체예에서, 본 발명의 조직 또는 세포를 당뇨병 숙주에게 투여하는 것을 포함하고, 이식 후 숙주의 조직학적 분석이 실시되는 당뇨병의 치료 또는 예방방법이 제공된다. 일 구체예에서, 검시 후 원래 췌장의 조직학적 분석은 감소된 인슐린 양성 베타 세포를 나타내고, 하나의 비제한적 실시예에서, 인슐린 양성 베타 세포가 없는 것을 나타낸다. 다른 구체예에서, 간 또는 췌장섬 이식물의 조직학적 시험은 다수의 살아있는 인슐린 양성 세포를 나타낸다.
다른 구체예에서, 본 발명의 조직 또는 세포를 당뇨병 숙주에게 투여하는 것을 포함하고, 이식 후 하나 이상의 이식과정, 면역억제 요법, 내성을 유발하는 요법 또는 췌장섬의 캡슐화와 결합된 다수의 또는 심각한 생명을 위협하는 합병증이 없는 당뇨병의 치료 또는 예방방법이 제공된다.
본 발명의 다른 구체예는 이하의 본 발명의 상세한 설명, 특허청구의 범위 및 당업계에서 공지된 것들에 의해 당업자에게 명백해질 것이다.
본 특허 또는 출원은 컬러로 작성된 하나 이상의 도면을 포함한다. 컬러 도면이 첨부된 본 특허 또는 특허출원 공개 사본은 요금 신청 및 납부에 의해 관할 관청에서 제공된다.
도 1은 본 발명에서 사용된 벡터의 대표적 도면이다."pREV788"은 베이스 벡터이고; pREV790는 TFPI-CD4 전이유전자를 가지는 베이스 벡터이며; pREV792는 pCTLA4-Ig 전이유전자를 가지는 베이스 벡터이며; pREV835는 CD39 전이유전자를 가지는 베이스 벡터이다.
도 2는 환원 및 분해 조건 하에서의 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출된 형질전환 돼지 기관 용해물 중의 pCTLA4-Ig 단백질 발현 이미지를 나타낸 것이다. 융합 단백질의 Ig 부위에 대해 특이적인 항체로 밴드가 검출되었다. 347-3 및 342-1은 태아 548/A3의 리클론(reclone)이고 340-2는 (음성 대조용으로 사용된) 형질전환되지 않은 동물이다.
도 3은 췌장섬 내 발현을 국소화시킨, 다자란 형질전환 마우스 췌장에서 관찰된 고농도 hTFPI를 나타내는 FITC로 표지된 안티-사람 TFPI 항체로 염색된 세포의 이미지이다. H&E 염색은 대표적인 췌장섬 형태학을 나타내고 있다.
도 4는 FITC 표지된 안티-사람 TFPI Ab 및 FITC-표지된 안티-사람 IgG1 (pCTLA4-Ig의 사람 Ig 부분에 결합)으로 염색된 548/A3의 태아 췌장 이미지로, TFPI and pCTLA4-Ig의 발현을 나타낸다.
도 5는 FITC 표지된 안티-사람 TFPI Ab 및 FITC-표지된 안티-사람 IgG1 (pCTLA4-Ig의 사람 Ig 부분에 결합)으로 염색된, 2.5 월령 새끼돼지 347-3 (548/A3의 리클론)의 췌장 이미지로, TFPI 및 pCTLA4-Ig 전이유전자의 발현을 나타낸다. 인슐린에 대한 염색은 전이유전자의 염색과 비슷한 패턴을 나타내고 있다. 야생형 돼지 및 아이소타입 대조군도 나타내었다.
도 6은 CD39의 고발현을 나타내고 있는, FITC 표지된 안티-사람 CD39로 염색된, 새끼돼지 320-2의 췌장 이미지이다. 인슐린의 염색도 나타내었다.
도 7은 CD46의 고발현을 나타내고 있는, FITC 표지된 안티-사람 CD46으로 염색된, 새끼돼지 342-3, 548/A3의 리클론의 췌장 이미지이다.
도 8은 야생형 췌장섬과 비교하여 돼지 390-1의 췌장섬의 포스페이트 방출농도를 나타낸 것이다.
도 9는 돼지 390-1에서 CD46, TFPI, CTLA4-Ig, CD39 및 인슐린의 염색 결과이다.
췌장섬 그래프트에 존재하는 공여체 혈관내피세포는 이식 후의 수용체에서 췌장섬 조직의 혈관재생과 연관된 새로운 혈관의 형성에서 중요한 역할을 한다는 증거가 늘어나고 있다(Linn et　al., FASEB, (2003)17:881-883; Brissova et　al., Diabetes (2004) 53:1318-1325; Johansson U, et　al., Am J. Transplant. (2005) 5:2632-2639; Nyqvist, et　al., Diabetes, (2005) 54:2287-2293). 일부 새로운 혈관들은 공여체의 내피세포와 배열되지만, 다른 혈관들은 공여체와 수용체 세포의 키메라로서 재구성될 수 있다(Brissova et　al., Diabetes (2004) 53:1318-1325). 살아있는 공여체 내피세포의 존재가 없다면 혈관재생이 지연되고 불완전하여 허혈성 손상 및 많은 췌장섬의 사멸이 발생한다. 따라서, 본 발명은 GTKO 유전적 배경을 가지는 돼지 및 췌장섬 이식에서 개선된 결과를 위한 다른 전이유전자를 포함한다. 췌장에서 특이적으로 다른 전이유전자를 발현하는 GTKO 돼지의 췌장섬은 공여체 내피세포, 따라서 췌장섬에 대해 상당한 보호를 제공한다.
"전이유전자"는 하나의 개체에서 다른 개체로 전이된 유전자 또는 유전 물질이다. 전형적으로 이 용어는 하나의 개체에서 단리되어 다른 개체에 도입된 유전자 서열을 포함하는 DNA 세그먼트를 나타낸다. 이러한 DNA의 비고유 세그먼트는 형질전환 개체에서 RNA 또는 단백질을 생산하는 능력을 보유하거나, 형질전환 개체의 유전코의 정상 기능을 변성시킬 수 있다. 일반적으로, DNA는 유기체 생식선에 결합된다. 예를 들면, 고등 척추동물에서 이것은 외래 DNA를 수정란의 핵에 주입하여 이루어질 수 있다. 세포에 도입될 때, 전이유전자는 mRNA(메신저 RNA)의 카피인 cDNA(상보성 DNA) 또는 게놈 DNA의 그 원래 영역에 존재하는 유전자 자체일 수 있다. 전이유전자는, 특히 BAC(박테리아성 합성 염색체) 또는 코스미드(cosmid)에 거대 클론으로 도입될 경우 게놈 서열일 수 있다. 본 명세서의 내용 중에서 전이유전자의 "발현"은, 달리 특정되지 않는 한, 비고유 핵산의 펩티드 서열이 숙주의 하나 이상의 세포에서 발현되는 것을 의미한다. 펩티드는 숙주 게놈에 결합된 전이유전자로부터 발현될 수 있다.
"공여체(donor)"란 이종장기이식을 위한 공여 조직 또는 세포 공급원이 될 수 있는 사람 이외의 개체를 포함하는 것을 의미하며, 제한적인 것은 아니나, 예를 들면 포유동물, 새, 닭, 파충류, 어류 및 곤충이다. 공여체는 성장의 어떤 단계도 가능하며, 제한적인 것은 아니나 태아기, 신생아기, 소아기 및 성년기 등이다. "동물"은 전형적으로 포유동물이다. "포유동물"이란 임의의 사람 이외의 포유동물, 예를 들면 돼지, 양, 염소, 축우(소), 사슴, 노새, 말, 원숭이, 개, 고양이, 래트, 마우스를 포함하는 것을 의미하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 일 구체예에서, 유전적으로 변성된 돼지 및 그의 제조방법이 제공된다. 본 발명의 동물은 "유전적으로 변성되거나" 또는 "형질전환"되며, 이것은 이들이 적어도 하나의 동물 세포, 및 전형적으로 적어도 하나의 동물 생식선 세포에 유전자형 또는 표현형 효과를 매개하기 위해 전이유전자 또는 첨가되거나 결합된 다른 외래 DNA, 또는 표적화, 재조합, 차단, 결실, 파괴, 대체, 억제, 증강, 이외에 변경 등으로 변성된 내인성 유전자를 가지는 것을 의미한다. 일부 구체예에서, 동물은 그의 게놈의 1 대립형질 (allele) 상에 통합된 전이유전자(이종접합성 형질전환)를 가질 수 있다. 다른 구체예에서, 동물은 2 대립형질 상에 전이유전자(동종접합성 형질전환)를 가질 수 있다.
"유제동물"(ungulate)는 발굽을 가진 동물을 일컫는다. 우제류는 영양, 낙타, 젖소, 사슴, 염소, 돼지, 및 양을 포함하는 균일한 발톱 (갈라진 발굽) 유제동물이다. 기제류는 한짝 발가락 유제동물이며, 말, 얼룩말, 무소, 및 맥을 포함한다. 여기서 사용되는 용어 "유제동물"은 성년, 배아 또는 태아 유제동물을 일컫는다.
여기서 사용되는 용어 "돼지류", "돼지 같은 동물", "새끼 돼지" 및 "돼지"는 성, 크기 또는 잡종에 상관없이 동일 유형의 동물을 언급하는 일반적 용어이다.
본 발명의 "세포"는 동물에서 우도된다. 세포는 성체 동물에서 유도될 수 있지만, 일부 구체예에서 세포는 태아 또는 신생아 조직에서 유도된다. 본 발명의 특정한 구체예에서, 세포, 특히 췌장섬 세포는 형질전환 돼지류 동물, 특히 성인 췌장섬 공여체로 유용한 충분한 크기로 사육된 형질전환 돼지류에서 유도된다. 임의의 구체예에서, 동물은 최근 이유기를 벗어난 동물일 수 있다. 특이적 구체예에서, 동물은 적어도 6개월령이다. 임의의 구체예에서, 동물은 번식기에 이를 때까지 생존한다. 임의의 구체예에서, 동물은 적어도 300 파운드의 돼지류 동물이다. 특이적 구체예에서, 동물은 모돈이며 적어도 1회 새끼를 낳은 적이 있다.
"높은" 수준의 발현이란 표현형을 제공하는데 충분한 것(검출가능한 발현 또는 치료 이익)으로 간주된다. 전형적으로 '높은' 수준의 발현은 이식 거부반응, 예를 들면 초급성 거부반응, 급성 체액성 이종이식편 거부반응(AHXR), T-세포 매개 세포성 거부반응 및 즉각적인 혈액 매개 염증 반응(IBMIR)을 줄일 수 있을 정도로 충분하다. 항응고성 및 면역억제 전이유전자가 췌장섬 세포에서 이러한 종류의 거부반응을 감소시킬 수 있는 수준으로 발현될 수 있는지에 대해서 이전에는 알려지지 않았다.
형질전환 동물
일 구체예에서, 적어도 4개의 유전적 변성을 가지는 돼지류 동물, 조직 및 세포가 제공된다. 이러한 유전적 변성은, 제한이 없으며, 유전자의 첨가 및/또는 결실, 예를 들면 재배열뿐만 아니라 넉-아웃 및 넉-인(knock-in)을 포함한다. 특정한 구체예에서, 적어도 4개의 유전적 변성을 가지는 돼지류 동물, 조직 및 세포가 제공되며, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 4개의 유전적 변성이 전이유전자이고 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 4개의 전이유전자가 어디서나 발현된다. 특정 구체예에서, 적어도 4개의 유전적 변성을 가지는 돼지류 동물, 조직 및 세포가 제공되며, 적어도 하나의 유전적 변성이 넉-아웃이다.
특정 구체예에서, 적어도 하나의 넉-아웃된 유전자를 가지며 적어도 3개의 전이유전자를 발현하는 돼지류 동물, 조직 및 세포가 제공된다. 특이적 구체예에서, 적어도 하나의 유전자가 상동성 재조합으로 넉-아웃된다.
일 구체예에서, 적어도 5개의 유전적 변성을 가지는 돼지류 동물, 조직 및 세포가 제공된다. 이러한 유전적 변성은 다른 유전자의 첨가 및/또는 결실, 예를 들면 재배열뿐만 아니라 넉-아웃 및 넉-인을 포함한다. 특정한 구체예에서, 적어도 5개의 유전적 변성을 가지는 돼지류 동물, 조직 및 세포가 제공되며, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 5개의 유전적 변성이 전이유전자이고 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 5개의 전이유전자가 어디서나 발현된다. 특정 구체예에서, 적어도 5개의 유전적 변성을 가지는 돼지류 동물, 조직 및 세포가 제공되며, 적어도 하나의 유전적 변성이 넉-아웃이다.
특정 구체예에서, 적어도 하나의 넉-아웃된 유전자를 가지며 적어도 4개의 전이유전자를 발현하는 돼지류 동물, 조직 및 세포가 제공된다. 특이적 구체예에서, 적어도 하나의 유전자가 상동성 재조합으로 넉-아웃된다.
일 구체예에서, 기능성 알파 1,3 갈락토실트랜스퍼라제(GTKO)의 발현을 결실하고 적어도 하나의 전이유전자를 췌장 조직에서 발현하는 돼지류 동물, 조직 및 세포가 제공된다. 다른 구체예에서, 췌장 조직에서 복수 전이유전자를 발현하는 GTKO 동물, 조직 및 세포가 제공된다. 특정 구체예에서, 동물, 조직 및 세포는 적어도 하나의 면역조절제를 발현한다. 임의의 구체예에서, 동물, 조직 및 세포는 하나 이상의 면역조절제를 발현한다. 특정한 구체예에서, 적어도 하나의 면역조절제 및 적어도 하나의 항응고제 전이유전자를 발현하는 GTKO 동물, 조직 및 세포가 제공된다. 일 구체예에서, 면역조절제는 면역억제제이다. 대체 구체예에서, 면역조절제는 보체 저해제이다. 특정한 구체예에서, 면역조절제의 발현은 췌장에 대해 특이적이다. 다른 특정한 구체예에서, 면역억제제의 발현은 췌장에 대해 특이적이다. 또다른 특이적 구체예에서, 보체 저해제의 발현은 췌장에 대해 특이적이다. 다른 하부구체예에서, 동물, 조직 및 세포는 적어도 하나의 항응고제를 발현한다. 임의의 구체예에서, 동물, 조직 및 세포는 하나 이상의 항응고제를 발현한다. 특정한 구체예에서, 항응고제의 발현은 췌장에 대해 특이적이다. 일 하부구체예에서, 동물, 조직 및 세포는 적어도 하나의 세포보호성 전이유전자를 발현한다. 다른 구체예에서, 동물, 조직 및 세포는 하나 이상의 세포보호성 전이유전자를 발현한다. 일 구체예에서, 전이유전자는 특이적으로 췌장섬에서 발현되며, 특정한 구체예에서, 베타 세포의 특이적 발현이 제공된다.
일 구체예에서, 본 발명은 기능성 알파 1,3 갈락토실트랜스퍼라제(GTKO)의 발현을 결실하고 적어도 하나의 보체 저해제 및, 항응고제, 면역억제제 및 점막보호제로 구성되는 군에서 선택된 적어도 하나의 추가 전이유전자를 발현하는 GTKO 동물, 조직 및 세포를 포함한다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 추가 전이유전자의 발현은 췌장에 대해 특이적이다.
특이적 구체예에서, 적어도 하나의 보체 저해제(예를 들면, CD46) 및 적어도 하나의 항응고제(예를 들면, TFPI)를 발현하는 GTKO 동물, 조직 및 세포가 제공된다.
다른 특이적 구체예에서, 적어도 하나의 보체 저해제(예를 들면, CD46) 및 적어도 2개의 항응고제(예를 들면, TFPI 및 CD39)를 발현하는 GTKO 동물, 조직 및 세포가 제공된다.
다른 특이적 구체예에서, 적어도 하나의 보체 저해제(예를 들면, CD46) 및 적어도 하나의 면역억제제(예를 들면, CTLA4)를 발현하는 GTKO 동물, 조직 및 세포가 제공된다.
또다른 특이적 구체예에서, 적어도 하나의 보체 저해제(예를 들면, CD46) 및 세포보호 전이유전자(예를 들면, A20)를 발현하는 GTKO 동물, 조직 및 세포가 제공된다.
임의의 구체예에서, 적어도 하나의 면역억제제, 적어도 하나의 보체 저해제 및 적어도 하나의 항응고제 전이유전자를 발현하는 GTKO 동물, 조직 및 세포가 제공된다. 다른 특정한 구체예에서, 적어도 하나의 면역억제제, 적어도 하나의 보체 저해제 및 적어도 2개의 항응고제 전이유전자를 발현하는 GTKO 동물, 조직 및 세포가 제공된다. 특이적 구체예에서, 적어도 하나의 면역억제제, 적어도 하나의 보체 저해제 및 적어도 하나의 항응고제 전이유전자를 발현하고, 적어도 하나의 면역억제제 및 적어도 하나의 항응고제 전이유전자의 발현이 췌장에 대해 특이적인 GTKO 동물, 조직 및 세포가 제공된다. 또다른 특이적 구체예에서, 적어도 하나의 면역억제제, 적어도 하나의 보체 저해제 및 적어도 2개의 항응고제 전이유전자를 발현하고, 적어도 하나의 면역억제제 및 적어도 2개의 항응고제 전이유전자의 발현이 췌장에 대해 특이적인 GTKO 동물, 조직 및 세포가 제공된다. 일 구체예에서, 전이유전자는 췌장섬에서 특이적으로 발현되고, 특정한 구체예에서 베타 세포에서의 특이적 발현이 제공된다.
일 구체예에서, 적어도 하나의 면역조절제, 적어도 하나의 항응고제 및 적어도 하나의 세포보호 전이유전자를 발현하는 GTKO 동물, 조직 및 세포가 제공된다. 다른 특정한 구체예에서, 적어도 하나의 면역억제제, 적어도 하나의 보체 저해제, 적어도 하나의 항응고제 전이유전자 및 적어도 하나의 세포보호 전이유전자를 발현하는 GTKO 동물, 조직 및 세포가 제공된다. 다른 특정한 구체예에서, 적어도 하나의 면역억제제, 적어도 하나의 보체 저해제, 적어도 2개의 항응고제 전이유전자 및 적어도 하나의 항세포보호 전이유전자를 발현하는 GTKO 동물, 조직 및 세포가 제공된다. 특정한 구체예에서, 적어도 하나의 면역억제제, 적어도 하나의 보체 저해제, 적어도 하나의 항응고 전이 유전자 및 적어도 하나의 세포보호 전이유전자를 발현하고, 적어도 하나의 면역억제제와 적어도 하나의 항응고제 전이유전자의 발현이 췌장에 대해 특이적인 GTKO 동물, 조직 및 세포가 제공된다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 면역억제제, 적어도 하나의 보체 저해제, 적어도 2개의 항응고제 전이 유전자 및 적어도 하나의 세포보호 전이유전자를 발현하고, 적어도 하나의 면역억제제와 적어도 2개의 항응고제 전이유전자의 발현이 췌장에 대해 특이적인 GTKO 동물, 조직 및 세포가 제공된다. 특이적 구체예에서, 항세포자멸 전이유전자의 발현이 췌장에 대해 특이적이다. 일 구체예에서, 전이유전자는 췌장섬에서 특이적으로 발현되고, 특정한 구체예에서 베타 세포에서의 특이적 발현이 제공된다.
일 구체예에서, 여기에 기술된 형질전환 돼지류 동물은 생존할 수 있다. 다른 구체예에서, 여기에 기술된 동물은 생식력이 있다. 다른 구체예에서, 여기에 기술된 동물은 그의 유전적 변성 일부를 그의 후대에 안정하게 전달할 수 있다. 또다른 구체예에서, 여기에 기술된 동물은 그의 유전적 변성 전부를 그의 후대에 안정하게 전달할 수 있다. 임의의 구체예에서, 동물은 그의 유전적 변성 전부를 그의 후대에게 이 동물이 자연적으로 번식될 때 안정하게 절달할 수 있다. 다른 구체예에서, 복수의 전이유전자는 후대에게 코세그리게이션(co-segregation)을 나타낸다. 특정 구체예에서, 세포는 살아있는 동물의 췌장에서 유도된다. 특정 구체예에서, 세포는 췌장섬이다. 보다 특정한 구체예에서, 세포는 췌장의 베타 세포이다. 임의의 구체예에서, 세포는 인슐린을 생산한다. 다른 일부 구체예에서, 세포는 췌장섬 세포 클러스터를 포함한다. 또다른 구체예에서, 세포는 췌장섬과 같은 세포이다.
특정 구체예에서, 돼지류 동물, 조직 및 세포는 적어도 다음 유전적 변성이 제공된다: GT의 발현 결실, 보체 저해제의 발현, 항응고제 전이유전자의 췌장 특이적 발현 및 면역억제제 전이유전자의 발현. 특정한 구체예에서, 돼지류 동물, 조직 및 세포는 적어도 다음 유전적 변성이 제공된다: GT의 발현 결실, 보체 저해제의 발현, 2개 항응고제 전이유전자의 췌장 특이적 발현 및 면역억제제 전이유전자의 발현. 일 구체예에서, 전이유전자는 췌장섬에서 특이적으로 발현되고, 특정한 구체예에서 베타 세포에서의 특이적 발현이 제공된다.
다른 구체예에서, 돼지류 동물, 조직 및 세포는 적어도 다음 유전적 변성이 제공된다: GT의 발현 결실, 보체 저해제의 발현, 세포보호 전이유전자의 발현, 항응고제 전이유전자의 췌장 특이적 발현 및 면역억제제 전이유전자의 발현. 특정한 구체예에서, 돼지류 동물, 조직 및 세포는 적어도 다음 유전적 변성이 제공된다: GT의 발현 결실, 보체 저해제의 발현, 세포보호 전이유전자의 발현, 2개 항응고제 전이유전자의 췌장 특이적 발현 및 면역억제제 전이유전자의 발현결실. 특이적 구체예에서, 세포보호 전이유전자의 발현은 또한 췌장 특이적이다. 일 구체예에서, 세포보호 전이유전자의 발현 또한 췌장 특이적이다. 일 구체예에서, 전이유전자는 췌장섬에서 특이적으로 발현되고, 특정한 구체예에서 베타 세포에서의 특이적 발현이 제공된다.
면역조절제는 보체 저해제 또는 면역억제제일 수 있다. 특이적 구체예에서, 면역조절제는 보체 저해제이다. 보체 저해제는 CD46 (또는 MCP)일 수 있다. 다른 구체예에서, 보체 저해제는 CD55, CD59 또는 CR1일 수 있다. 임의의 구체예에서, 전이유전자는 유비쿼터스 프로모터로부터 발현된다. 임의의 다른 구체예에서, 전이유전자는 주로 췌장 세포에서 활성인 프로모터로부터 발현된다. 발현은 어떤 수준으로도 가능하지만, 특이적 구체예에서, 발현은 높은 수준이다.
면역조절제는 또한 면역억제제일 수 있다. 면역억제제는 T-세포 매개 반응을 하향조절할 수 있다. 특히, 면역억제제는 CTLA4-Ig 또는 그의 돌연변이일 수 있다. 다른 구체예에서, 면역억제제 전이유전자는 B7 리셉터 펩티드 또는 그의 돌연변이와 같은, CD28 활성을 방해하는 리간드이다. 임의의 구체예에서, 전이유전자는 주로 췌장 세포에서 활성인 프로모터에서 발현된다. 발현은 어떤 수준으로도 가능하지만, 특이적 구체예에서, 발현은 높은 수준이다.
다른 구체예에서, 면역조절제는 클래스 II 트랜스활성자(CIITA)와 그의 돌연변이, PDL1, PDL2, 종양괴사인자-α관련 세포자멸 유도 리간드(TRAIL), Fas 리간드 (FasL, CD95L), 인티그린(integrin) 결합 단백질, (CD47), HLA-E, HLA-DP, HLA-DQ, 또는 HLA-DR을 포함하는 군에서 선택될 수 있다. 임의의 다른 구체예에서, 전이유전자는 주로 췌장 세포에서 활성인 프로모터에서 발현된다. 발현은 어떤 수준으로도 가능하지만, 특이적 구체예에서, 발현은 높은 수준이다.
일 구체예에서, 항응고제는 조직인자 경로 저해제 (TFPI), 히루딘, 트롤보모듈린, 내피 단백질 C 리셉터 (EPCR), 및 CD39를 포함하는 군에서 선택된다. 특정 구체예에서, 항응고제는 TFP1이다. 다른 특정 구체예에서, 항응고제는 CD39이다. 임의의 다른 구체예에서, 전이유전자는 주로 췌장 세포에서 활성인 프로모터에서 발현된다. 발현은 어떤 수준으로도 가능하지만, 특이적 구체예에서, 발현은 높은 수준이다.
세포보호 전이유전자는 항세포자멸, 항산화 또는 항염증 전이유전자일 수 있다. 임의의 구체예에서, 세포보호 전이유전자는 A20, HO-1, FAT-1, 및 가용성 TNF-알파 리셉터(sTNFR1)를 포함하는 군에서 선택된다. 임의의 다른 구체예에서, 전이유전자는 주로 췌장 세포에서 활성인 프로모터에서 발현된다. 발현은 어떤 수준으로도 가능하지만, 특이적 구체예에서, 발현은 높은 수준이다.
임의의 구체예에서, 하나 이상의 면역억제제 또는 항응고제 전이유전자는 높은 수준의 CD46을 발현하는 GTKO 돼지류 동물의 췌장 조직에서 발현된다. 특정 구체예에서, 돼지류 동물, 조직 및 세포는 췌장 조직, 특히 췌장섬 세포에서 높은 수준의 CD46을 발현하고 TFPI 및 CTLA4-Ig을 발현하는 GTKO 동물에서 유도되어 제공된다. 별도의 구체예에서, 췌장 조직, 특히 췌장섬 세포에서 높은 수준의 CD46을 발현하고 CD39 및 CTLA4-Ig을 발현하는 GTKO 동물에서 유도된 돼지류 동물, 조직 및 세포가 제공된다.
일부 구체예에서, 면역조절제는 사람 단백질의 서열을 가진다. 다른 구체예에서, 면역조절제는 돼지류 단백질의 서열을 가진다. 일부 구체예에서, 항응고제는 사람 단백질의 서열을 가진다. 다른 구체예에서, 항응고제는 돼지류 단백질의 서열을 가진다. 일부 구체예에서, 세포보호 전이유전자는 돼지류 단백질의 서열을 가진다. 다른 구체예에서, 세포보호 전이유전자는 사람 단백질의 서열을 가진다. 특정한 구체예에서, 돼지류 동물, 조직 또는 세포는 사람 CD46 전이유전자를 발현한다. 특정한 구체예에서, 돼지류 동물, 조직 또는 세포는 사람 CTLA4-Ig 전이유전자를 발현한다. 임의의 구체예에서, 돼지류 동물, 조직 또는 세포는 사람 TFPI를 발현한다. 임의의 구체예에서, 돼지류 동물, 조직 또는 세포는 사람 CD39를 발현한다. 특정한 구체예에서, 돼지류 동물, 조직 또는 세포는 돼지류 CD46 전이유전자를 발현한다. 특정한 구체예에서, 돼지류 동물, 조직 또는 세포는 돼지류 CTLA4 전이유전자를 발현한다. 임의의 구체예에서, 돼지류 동물, 조직 또는 세포는 돼지류 TFPI를 발현한다. 임의의 구체예에서, 돼지류 동물, 조직 또는 세포는 돼지류 CD39를 발현한다.
특정한 구체예에서, 돼지류 동물, 조직 및 세포는 적어도 다음 유전적 변성이 제공된다: GT의 발현 결실, CD46의 발현, TFPI의 췌장 특이적 발현 및 CTLA4-Ig의 췌장 특이적 발현. 다른 특정한 구체예에서, 돼지류 동물, 조직 및 세포는 적어도 다음 유전적 변성이 제공된다: GT의 발현 결실, CD46의 발현, TFPI의 췌장 특이적 발현, CD39의 췌장 특이적 발현 및 CTLA4-Ig의 췌장 특이적 발현. 일 구체예에서, 전이유전자는 췌장섬에서 특이적으로 발현되고, 특정한 구체예에서 베타 세포에서의 특이적 발현이 제공된다. 특정한 구체예에서, CD46은 사람 CD46일 수 있다. 다른 특정 구체예에서, 사람 CD46은 높은 수준으로 발현될 수 있다.
다른 특정한 구체예에서, 돼지류 동물, 조직 및 세포는 적어도 다음 유전적 변성이 제공된다: GT의 발현 결실, CD46의 발현, 세포보호 전이유전자의 발현, TFPI의 췌장 특이적 발현 및 CTLA4-Ig의 췌장 특이적 발현. 다른 특정한 구체예에서, 돼지류 동물, 조직 및 세포는 적어도 다음 유전적 변성이 제공된다: GT의 발현 결실, CD46의 발현, 세포보호 전이유전자의 발현, TFPI의 췌장 특이적 발현, CD39의 췌장 특이적 발현 및 CTLA4-Ig의 췌장 특이적 발현.
임의의 구체예에서, 전이유전자는 주로 췌장 세포에서 활성인 프로모터로부터 발현된다. 임의의 구체예에서, 프로모터는 췌장 또는 췌장섬 특이적 프로모터로, 예를 들면 척추동물, 예를 들면 제한적인 것은 아니나 틸라피아, 사람, 돼지, 래트 또는 마우스 등의 어류 또는 포유동물의 인슐린 프로모터가 있다. 특이적 구체예에서, 프로모터는 래트-인슐린 프로모터(RIP)이다. 임의의 구체예에서, 추가의 조절요소는 인핸서 요소 등의 전이유전자 발현 시스템에 결합할 수 있다. 인핸서는, 예를 들면, pdx-1 인핸서 또는 치킨 액틴 인핸서이거나, 예를 들면 전이유전자의 발현을 강화하기 위한 치킨 베타-글로빈 인슐레이터(insulator) 등의 인슐레이터 요소일 수 있다(Chung JH, Bell AC, Felsenfeld G., Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Jan 21;94(2):575-80).
임의의 구체예에서, 발현은 췌장 조직에서만 있으며, 돼지류의 다른 조직에서는 발현되지 않는다. 또한, 태아, 신생아, 및 성체 조직에서 발현될 수 있고, 각각은 공급체 췌장섬의 공급원일 수 있다. 본 발명의 특정한 구체예에서, 세포, 특히 췌장섬 세포는 형질전환 돼지류 동물, 특히 성체 췌장섬 공급체로서 유용한 충분한 크기로 성장한 형질전환 돼지류에서 유도된다. 임의의 구체예에서, 동물은 최근 이유기를 벗어난 동물일 수 있다. 특이적 구체예에서, 동물은 적어도 6개월령이다. 임의의 구체예에서, 동물은 번식기에 이를 때까지 생존한다. 임의의 구체예에서, 동물은 적어도 300 파운드의 돼지류 동물이다. 특정한 구체예에서, 캡슐화된 췌장섬을 이식시킬 수 있다.
일 구체예에서, 당뇨병을 앓고 있는 숙주(당뇨병 숙주 또는 당뇨병 환자)에게 돼지류 췌장 조직, 췌장에서 유도된 세포, 전체 췌장섬 또는 단리된 췌장섬 세포를 투여하는 것을 포함하는 당뇨병의 치료 또는 예방방법을 제공하며, 여기에서 세포는 적어도 하나의 면역억제제와 적어도 하나의 항응고제 전이유전자 발현을 나타낸다. 다른 구체예에서, 여기에서 제공된 돼지류 동물에서 단리된 췌장섬 세포는 당뇨병을 치료하거나 역전시키는데 사용된다.
일 구체예에서, 여기에서 제공된 췌장섬을 사용하여 당뇨병 숙주에게 필요한 인슐린의 양을 감소시킬 수 있다. 이식 후, 환자는 이식 전에 필요로 한 것 보다 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 미만의 인슐린을 필요로 할 수 있다. 이식 후, 숙주는 이식 전에 필요로 한 것 보다 약 5% 내지 약 25% 미만의 인슐린을 필요로 할 수 있다. 이식 후, 숙주는 이식 전에 필요로 한 것 보다 약 25% 내지 약 50% 미만의 인슐린을 필요로 할 수 있다. 이식 후, 숙주는 이식 전에 필요로 한 것 보다 약 50% 내지 약 75% 미만의 인슐린을 필요로 할 수 있다. 이식 후, 숙주는 이식 전에 필요로 한 것 보다 약 75% 내지 약 100% 미만의 인슐린을 필요로 할 수 있다.
특정 구체예에서, 이식 후에 숙주는 1일 킬로그램(kg) 당 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.05, 또는 0.01 외인성 단위 미만으로 인슐린을 필요로 할 수 있다. 일 구체예에서, 숙주는 이식 후 1일 킬로그램(kg) 당 약 0.01 내지 약 0.1 외인성 단위 미만의 임의의 숫자로 인슐린을 필요로 할 수 있다. 일 구체예에서, 환자는 이식 후 1일 킬로그램(kg) 당 약 0.1 내지 약 0.25 외인성 단위 미만의 임의의 숫자로 인슐린을 필요로 할 수 있다. 일 구체예에서, 환자는 이식 후 1일 킬로그램(kg) 당 약 0.25 내지 약 0.5 외인성 단위 미만의 임의의 숫자로 인슐린을 필요로 할 수 있다. 일 구체예에서, 환자는 이식 후 1일 킬로그램(kg) 당 약 0.5 내지 약 0.6 외인성 단위 미만의 임의의 숫자로 인슐린을 필요로 할 수 있다.
특정한 일 구체예에서, 이식 후, 환자는 1일 4 단위 미만의 인슐린을 필요로 한다. 일 구체예에서, 이식 후, 환자는 1일 2 단위 미만의 인슐린을 필요로 한다. 일 구체예에서, 이식 후, 환자는 1일 2 단위 미만의 인슐린을 필요로 한다. 다른 구체예에서, 이식 후, 환자는 1일 1 단위 미만의 인슐린을 필요로 한다. 일 구체예에서, 이식 후, 환자는 외인성 인슐린을 필요로 하지 않는다.
다른 구체예에서, 여기에서 제공된 췌장섬은 재이식 시술에서 사용될 수 있으며, 이러한 시술은, 예를 들면 임의의 구체예에서 충분한 수준의 췌장섬을 유지하여 혈당증을 장기간 조절하기 위해 필요할 수 있다.
본 발명의 임의의 구체예에서, 본 발명의 조직 또는 세포를 당뇨병의 치료 또는 예방이 필요한 영장류에게 투여하는 것을 포함하는 영장류의 당뇨병을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다. 일 구체예에서, 영장류는 사람을 제외한 영장류이며, 비제한적 일 예에서는 원숭이이다. 다른 구체예에서, 영장류는 사람이다. 일 구체예에서, 췌장 세포는 성체 세포이다. 다른 구체예에서, 췌장 세포는 태아 또는 신생아 세포이다.
추가의 구체예에서, 동물은 또한 면역조절제를 발현하는 유전적 변성을 포함할 수 있다. 면역조절제는 보체 경로 저해제 유전자이고, 특정한 구체예에서 CD55, CD59, CR1 및 CD46 (MCP)로부터 선택된다. 보체 저해제는 사람 일 수 있으며, 여기서 미니유전자 구조물에 의해 발현된다(Loveland et al., Xenotransplantation, 11(2):171-183. 2004 참조). 면역조절제는 또한 CTLA4-Ig와 같은 T-세포 조절효과를 가지는 면역억제제 유전자, 또는 클래스 II MHC (CIITA)의 우성 네가티브 저해제, 또는 B-세포 또는 T-세포 매개 면역작용의 발현을 조절하는 다른 유전자일 수 있다. 추가의 구체예에서, 이러한 동물은 추가로 변성되어 면역작용에 영향을 주는 유전자의 발현을 제거할 수 있다.
또다른 구체예에서, 동물은 또한 항응고제를 발현하는 유전적 변성을 포함할 수 있다. 항응고제는, 제한적인 것은 아니나 TFPI, 히루딘, 트롬보모듈린, EPCR 및 CD39를 포함할 수 있다. 또한, 동물은 유전적으로 변성되어 CMP-Neu5Ac 하이드록실라제 유전자 (예를 들면, 미국 특허공개 2005-0223418 참조), iGb3 신타제(synthase) 유전자 (예를 들면, 미국 특허공개 2005-0155095 참조), 및/또는 Forssman 신타제 유전자 (예를 들면, 미국 특허공개 2006-0068479)의 발현을 저해할 수 있다. 또한, 동물은 유전적으로 변성되어 프로(pro)응고제의 발현을 감소시킬 수 있다. 특히, 일 구체예에서, 동물은 유전적으로 변성되어 FGL2 (피브리노겐 유사 단백질 2) (예를 들면, Marsden, et　al. (2003) J din Invest. 112:58-66; Ghanekar, et　al. (2004) J Immunol. 172:5693-701; Mendicino, et　al. (2005) Circulation.112:248-56; Mu, et　al. (2007) Physiol Genomics. 31(1):53-62 참조)와 같은 프로응고제의 발현을 감소시키거나 제거시킬 수 있다.
전이유전자가 발현되는 구체예에서, 발현은 유비쿼터스 또는 조직 특이적 프로모터를 경유하며, 인핸서, 인슐레이터, 매트릭스 결착 영역(MAR)과 같은 추가 조절 요소를 포함할 수 있다.
이러한 추가의 유전적 변성을 달성하기 위해, 일 구체예에서, 유전적으로 변성된 돼지에서 단리된 세포를 추가로 변성시켜 복수의 유전적 변성을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 이들 세포는 공급체로서 사용되어 핵 전이를 통해 복수의 유전적 변성을 가지는 돼지를 생산한다. 다른 구체예에서, 유전적으로 변성된 동물을 함께 사육하여 복수의 유전적 변성을 달성한다.
급성 체액성 거부반응을 대상으로 하는 전이유전자
이종그래프팅은 현재 거부반응에 대한 심각하고 문서에 의해 충분히 입증된 문제로 방해받고 있다. 이 방법은 별개의 단계로 나뉘어질 수 있으며, 제1 단계는 이식 후 수분 내에 일어나며 "초급성 거부반응"(HAR)이라 한다. HAR은 외래 조직에 결합하는, 고역가의 미리 형성된 자연 항체의 유비쿼터스 존재로 정의된다. 공여체 조직 내피 상의 표적 에피토프에 이러한 천연 항체가 결합하는 것은 HAR에서 초기사건인 것으로 판단된다. 이러한 결합은, 공여체 조직이 수용체 혈액과 몇 분 이내에 관류하여 보체 활성화, 혈소판 및 피브린 침착, 그리고 궁극적으로 간질성 부종 및 공여체 기관 내에서의 출혈로 이어져서, 이 모든 것이 수용체 내에서 조직의 거부반응을 야기한다(Strahan et　al. (1996) Frontiers in Bioscience 1, e34-41). 사람에서 HAR의 주요 코스는 천연 항-Gal 항체이고, 이것은 사람과 원숭이에서 대략 1%의 항체를 포함한다.
다음으로, 초기의 초급성 거부반응은 지연된 혈관반응(급성 체액성 이종이식편 거부반응(AHXR), 급성 혈관 거부반응(AVR) 또는 지연된 이종이식편 거부반응(DXR)으로 알려짐)에 의해 보강된다. 초급성 반응 동안 내피세포의 용해 및 사멸은 부종과 외막세포의 노출에 의해 일어나고, 이것은 본질적으로 그의 표면에서 조직인자(TF)를 발현한다. 조직 인자는 생체내 응고 캐스캐이드의 개시에 중심이 되는 것으로 보이며 혈장에 대한 그의 노출이 응고 반응을 촉발한다. 트롬빈과 TNF-알파는 손상된 조직 주위에 위치하게 되고 이로 인하여 추가 합성과 내피세포에 의한 TF의 발현이 유발된다.
정지하고 있는 내피세포 주위의 환경은 응고를 따르지 않는다. 몇몇의 자연 응고 저해제는, 예를 들면 조직인자 경로 저해제, 안티트롬빈 III, 및 트롬보모듈린 등의 내피세포의 세포외 프로티오글리칸(proteoglycan)과 결합한다. 그러나, 이종간반응 자연 항체(XNA)에 의한 외래 조직의 인지는 이러한 분자들의 손실을 유발한다.
노출과 조직인자의 유발과 함께, 내피세포 주위의 항응고 환경은 친응고가 된다. 따라서 이종이식편의 혈관화된 영역은 손상된 조직의 특징인 혈액 엉김 부위가 된다. 혈류가 손상되고 이식된 기관은 허혈성이 된다. 지연된 혈관 거부반응에 대한 충분한 설명은 문헌[Bach et　al. (1996) Immunol Today. 1996 Aug;17(8):379-84]에서 확인할 수 있다.
본 발명은 HAR, AHXR/DXR 및/또는 ACXR 중 하나 이상을 생산하지 않거나 낮은 수준으로 생산하는 이종이식에 사용할 수 있는 동물, 조직 또는 세포를 제공한다. 일 구체예에서, 동물, 조직 또는 세포를 이종이식에서 사용하여 HAR 및 AHXR을 생산하지 않거나 낮은 수준으로 생산할 수 있다. 다른 구체예에서, 동물, 조직 또는 세포를 이종이식에서 사용하여 HAR, AHXR 및 ACXR을 생산하지 않거나 낮은 수준으로 생산할 수 있다. 이하의 부분에서 상세하게 설명한 바와 같이, 본 발명의 구체예는 보체 조절제 발현, 면역억제제 발현, 항응고제 발현 및/또는 공여체 조직에서 부분적으로 또는 전체적으로 감손된 기능성 αGT 발현의 다양한 조합을 포함한다.
일 구체예에서, 여기에서 제공된 돼지류 동물에서 단리된 췌장섬 세포는 하나 이상의 전이유전자를 발현하는 것으로 나타났다. 추가의 구체예에서, 여기에서 제공된 돼지류 동물의 췌장섬 세포는 상기한 돼지류 세포에 대한 사람 림프구에 의한 면역반응 감소(MLR 에세이)를 유발할 수 있다. 다른 구체예에서, 전이유전자를 발현하는 췌장섬 세포는 이종이식편 환경에서 일어나는 응고와 혈전증을 저해하는 것으로 입증되었다.
알파 1,3 갈락토실트랜스퍼라제(αGT)
앞서 언급된 바와 같이, 사람에서 HAR의 주요 코스는 사람과 원숭이에서 대략 1%의 IgG 항체를 포함하는, 자연 항갈락토스 알파 1,3 갈락토스 (Gal) 항체이다. 구대륙 원숭이, 유인원 및 사람을 제외하고, 대부분의 포유동물은 Gal 에피토프를 함유하는 그의 세포표면 상에 당단백질을 담지한다(Galili et　al., J. Biol. Chem. 263: 17755-17762, 1988). 사람, 유인원 및 구대륙 원숭이는 Gal을 발현하지 않지만, 오히려 Gal을 가지는 동물 조직을 사람에게 이종이식할 때 즉시형 초급성 반응을 유발하는 자연발생 항-Gal 항체를 다량 생산한다(Sandrin et　al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Dec 1;90(23):11391-5, 1993; review by Sandrin and McKenzie, Immunol Rev. 1994 Oct; 141:169-90). 이종장기이식으로 유발된 항-Gal 체액성 반응을 제거 또는 조절하기 위해 다양한 전략들이 시행되고 있으며, 예를 들면 알파-갈락토시다제를 사용한 에피토프의 효소적 제거(Stone et　al., Transplantation 63: 640-645, 1997), 특이적 항-gal 항체 제거 (Ye et　al., Transplantation 58: 330-337,1994), αGT 발현을 제거하는데 실패한, 다른 탄수화물 잔기를 이용한 에피토프의 캡핑 (Tanemura et　al., J. Biol. Chem. 27321: 16421-16425, 1998 and Koike et　al., Xenotransplantation 4: 147-153, 1997) 및, 형질전환 돼지에서 αGT의 경쟁적 저해가 에피토프 수를 부분적으로만 감소시킨 것을 보고한 보체 저해성 단백질의 도입(Dalmasso et　al., Clin.Exp.Immunol. 86:31-35, 1991, Dalmasso et　al. Transplantation 52:530-533 (1991)). C. Costa et　al. (FASEB J 13, 1762 (1999)) 등이다. 마찬가지로, S. Miyagawa 등(J. Biol. Chem 276, 39310 (2000))은 N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 III 형질전환 돼지에서 gal 에피토프의 발현을 차단하는 시도가 또한 gal 에피토프 수를 부분적으로만 감소하여 영장류 수용체에서 이식 생존율을 상당히 확장하는데 실패하였음을 보고하였다.
돼지류 세포와 살아있는 동물의 αGT 부위의 싱글 대립유전자 넉아웃이 보고되었다. Denning 등(Nature Biotechnology 19: 559-562, 2001)은 양에서 αGT 유전자의 하나의 대립유전자에 대한 표적화된 유전자 결실을 보고하였다. Harrison 등(Transgenics Research 11: 143-150, 2002)은 이형접합성 αGT 넉아웃 체성(somatic) 돼지 태아 섬유아세포의 생산을 보고하였다. 2002년에 Lai 등(Science 295: 1089-1092, 2002)과 Dai 등(Nature Biotechnology 20: 251-255, 2002)은 αGT 유전자의 대립유전자 하나를 성공적으로 불활성화시킨 돼지의 생산을 보고하였다. Ramsoondar 등(Biol of Reproduc 69, 437-445 (2003))은 사람 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제(HT)를 발현하는 이형접합성 αGT 넉아웃 돼지의 생성을 보고하였고, 이것은 HT와 αGT 에피토프를 모두 발현하였다. The Curators of the University of Missouri의 PCT 공개 WO 03/055302에서는 넉아웃 돼지에서 기능성 αGT의 발현이 야생형과 비교하여 감소된 이종장기이식에서 사용하기 위한 이형접합성 αGT 넉아웃 미니어쳐 돼지의 생산을 확인하고 있다. Austin Research Institute의 PCT 공개 WO 94/21799 및 미국 특허 제5,821,117호; Bresatec의 PCT 공개 WO 95/20661; 및 BioTransplant, Inc. and The General Hospital Corporation의 PCT 공개 WO 95/28412, 미국 특허 제6,153,428호, 미국 특허 제 6,413,769호 및 미국 특허공개 제2003/0014770호는 αGT 유전자의 cDNA에 기초한 αGT 네가티브 돼지류 세포의 생산에 대한 논의를 제공하고 있다.
이종장기이식 분야에서 최근의 중요한 돌파구는 αGT의 기능성 발현을 결실한 최초의 살아있는 돼지의 생산이었다(Phelps et　al. Science 299:411-414 (2003); Revivicor, Inc.의 PCT 공개 WO 04/028243 및 Immerge Biotherapeutics, Inc.의 PCT 공개 WO 04/016742).
일 구체예에서, 기능성 αGT (GTKO)의 발현을 결실하고 췌장 조직에서 적어도 하나의 추가 전이유전자를 발현하는 동물, 조직 및 세포가 제공된다. 추가의 전이유전자는 전형적으로 다음에서 선택된다: 1) 보체 저해제(즉, CD46 (MCP), CD55, CD59, CR1 등)를 포함하는 면역조절제 또는 면역억제제, 또는 2) 항응고제(즉, TFPI, 히루딘, 트롬보모듈린, EPCR, CD39 등). 다른 구체예에서, 기능성 αGT의 발현을 결실하고 하나 이상의 면역조절제와 하나 이상의 항응고제를 췌장 조직에서 발현하는 동물, 조직 및 세포가 제공된다. 일부 구체예에서, 췌장 조직은 돼지류이다. 추가 구체예에서, 췌장 조직은 췌장섬 세포, 또는 췌장섬, 또는 췌장섬 세포 클러스터를 포함한다. 특정한 구체예에서, 세포는 췌장섬이다. 보다 특정한 구체예에서, 세포는 췌장 베타 세포이다. 임의의 구체예에서, 세포는 인슐린을 생산한다. 다른 추가 구체예에서, 세포는 췌장섬과 같은 세포이다. 췌장섬 세포 클러스터는 하나 이상의 알파, 베타, 델타, PP또는 입실론 세포를 포함한다. 일반적으로 글루카곤을 생산하는 알파 세포는 원래 췌장 내 전체 췌장섬 세포의 약 15-20%를 구성하며, 인슐린과 아밀린(amylin)을 생산하는 베타 세포는 원래 췌장 내 췌장섬 세포의 약 65-80%를 구성하고, 소마토스타틴을 생산하는 델타 세포는 원래 췌장 내 전체 췌장섬 세포의 약 3-10%를 구성하며, 췌장 폴리펩티드를 생산하는 PP 세포는 원래 췌장 내 전체 췌장섬 세포의 약 3-5%를 구성하며, 그렐린(ghrelin)을 생산하는 입실론 세포는 원래 췌장 내 전체 췌장섬 세포의 <1%를 구성한다(Elayat et　al. (1995). J. Anat. 186: 629-37 참조).
또한, 본 발명에는 췌장 조직에서 다음 중 적어도 하나를 동시 발현하는 기능성 αGT를 감소된 수준으로 발현하는 동물, 조직 및 세포가 포함된다: 1) 보체 저해제(즉, CD46, CD55, CD59, CR1 등)를 포함하는 면역조절제 또는 면역억제제(즉,. CTLA-4, B7 등), 또는 2) 항응고제(즉, TFPI, 히루딘, 트롬보모듈린, EPCR, CD39 등). 일부 구체예에서, 기능성 αGT의 발현 수준이 감소되고 췌장 조직에서 적어도 하나의 면역조절제와 적어도 하나의 항응고제를 발현하는 동물, 조직 및 세포가 제공된다. 일부 구체예에서, 췌장 조직은 돼지류이다. 추가 구체예에서, 췌장 조직은 췌장섬 세포를 포함한다. 기능성 αGT의 발현은, 예를 들면 적어도 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 95%까지 감소될 수 있다.
기능성 αGT의 완전한 또는 감소된 수준의 발현은 당업자들에게 공지된 방법으로 얻을 수 있다. 본 발면의 일 측면에서, 돼지류 동물은 αGT 유전자의 대립유전자 하나를 유전적 표적화에 의해 불활성화하여 제공된다. 본 발명의 다른 측면에서, 돼지류 동물은 αGT 유전자의 대립유전자 둘 다를 유전적 표적화에 의해 불활성화하여 제공된다. 일 구체예에서, 유전자는 상동 재조합에 의해 표적화시킬 수 있다. 다른 구체예에서, 유전자를 분해할 수 있으며, 즉 유전 코드의 일부를 변성하여 유전자 세그먼트의 전사 및/또는 번역에 영향을 줄 수 있다. 예를 들면, 유전자의 분해는 치환, 결실("넉아웃") 또는 삽입("넉인") 방법에 의해 일어날 수 있다. 목적하는 단백질 또는 현존 서열의 전사를 조절하는 조절 서열에 대한 추가 유전자를 삽입할 수 있다.
본 발명의 구체예에서, αGT 유전자의 대립유전자가 불활성화되어 생성된 αGT 효소는 세포 표면에서 더이상 Gal을 생성할 수 없다. 일 구체예에서, αGT 유전자는 RNA로 전사될 수 있으나 단백질로 번역될 수 없다. 다른 구체예에서, αGT 유전자는 트렁케이트(truncate) 형태로 전사시킬 수 있다. 이러한 트렁케이트된 RNA는 비기능성 단백질로 전사되거나 전사되지 않을 수 있다. 선택적 구체예에서, αGT 유전자는 유전자의 전사가 일어나지 않는 방법으로 불활성화될 수 있다. 다른 구체예에서, αGT 유전자는 전사된 다음, 비기능성 단백질로 번역될 수 있다. 일부 구체예에서, 활성 αGT의 발현은 임의의 방법, 예를 들면 유전자의 전사 또는 번역을 표적화하는 방법 등을 사용하여 감소시킬 수 있다. 예를 들면, 원래 αGT 유전자 또는 그의 mRNA를 표적화하는 안티센스 RNA 또는 siRNA를 사용하여 발현을 감소시킬 수 있다. 다른 구체예에서, 부위 특이적 재조합효소를 사용하여 재조합을 위한 게놈 영역을 표적화한다. 이러한 시스템의 예로는 CRE-lox 시스템 및 Flp-Frt 시스템이 있다.
αGT 유전자의 2개 불활성 대립유전자를 가지는 돼지는 자연적으로 발생하지 않는다. 유전적 표적화에 의해 αGT 유전자의 제2 대립유전자 넉아웃을 시도하면 포인트 돌연변이가 동정되어 제2 대립유전자가 기능성 αGT 효소를 생산하는 것을 억제하는 것을 이전에 발견하였다.
따라서, 본 발명의 다른 측면에서, αGT 유전자는 적어도 하나의 포인트 돌연변이에 의해 불활성화시킬 수 있다. 일 구체예에서, αGT 유전자의 하나의 대립유전자를 적어도 하나의 포인트 돌연변이에 의해 불활성화시킬 수 있다. 다른 구체예에서, αGT 유전자의 2개 대립유전자를 적어도 하나의 포인트 돌연변이에 의해 불활성화시킬 수 있다. 일 구체예에서, 이러한 포인트 돌연변이는 유전적 표적화에 의해 발생할 수 있다. 다른 구체예에서, 이러한 포인트 돌연변이는 자연적으로 일어나는 것일 수 있다. 추가 구체예에서, 돌연변이는 돌연변이제에 의해 αGT 유전자에서 유도될 수 있다.
하나의 특이적 구체예에서, 포인트 돌연변이는 αGT 유전자 엑손 9의 제2 염기에서의 T 내지 G 돌연변이일 수 있다. αGT 유전자에서 자연적으로 발생한 포인트 돌연변이를 가지는 돼지는 항생제 내성 유전자가 없는 αGT 결핍 돼지를 생산할 수 있으므로 사람에게 사용하기 위한 안전한 생성물의 제조가 가능하다. 다른 구체예에서, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10 또는 적어도 20 포인트 돌연변이가 존재하여 αGT 유전자를 불활성화할 수 있다. 다른 구체예에서, αGT 유전자의 2개 대립유전자 모두 기능성 αGT 효소의 발현을 억제하는 포인트 돌연변이를 포함하는 돼지가 제공된다. 특이적 구체예에서, αGT 유전자의 2개 대립유전자 모두의 엑손 9의 제2 염기에 T 내지 G 돌연변이를 포함하는 돼지가 제공된다.
본 발명의 다른 측면은 αGT 유전자의 대립유전자 2개가 모두 불활성화되어, 하나의 대립유전자가 유전적 표적화에 의해 불활성화되고 다른 대립유전자가 돌연변이에 의해 불활성화된, 돼지류 동물을 제공한다. 일 구체예에서, αGT 유전자의 대립유전자 2개가 모두 불활성화되어, 하나의 대립유전자가 유전적 표적화에 의해 불활성화되고 다른 대립유전자가 엑손 9의 제2 염기에서의 T 내지 G 포인트 돌연변이 존재로 인하여 불활성화된, 돼지류 동물이 제공된다. 특정한 구체예에서, αGT 유전자의 대립유전자 2개가 모두 불활성화되어, 하나의 대립유전자가 엑손 9에 대한 표적 구조물에 의해 불활성화되고 다른 대립유전자가 엑손 9의 제2 염기에서의 T 내지 G 포인트 돌연변이 존재로 인하여 불활성화된, 돼지류 동물이 제공된다.
면역조절제
면역조절제는 보체 조절제(와 면역억제제를 포함한다.
(i) 보체 조절제
보체는 일련의 혈액 단백질에 대한 집합적 용어이며, 면역 시스템의 중요한 이펙터 메카니즘이다. 보체 활성화와 표적 구조에 대한 그의 침착은 직접적인 보체 매개 세포 용해를 유발하거나, 염증의 강력한 조절제의 생성과 면역 이펙터 세포의 보충 및 활성화로 인하여 세포 또는 조직 파괴를 간접적으로 유발할 수 있다. 조직 손살을 매개하는 보체 활성화 생성물은 보체 경로의 다양한 포인트에서 생성된다. 숙주 조직상의 적절하지 않은 보체 활성화는 많은 자가면역 및 염증 질환의 병리학에서 중요한 역할을 하며, 또한 생체부적합성(bioincompatibility), 예를 들면 심폐 염증 후와 이식 거부반응과 연관된 다수의 질환상태를 담당한다. 숙주 세포막에서의 보체 침착은 세포 표면에서 발현된 보체 저해 단백질에 의해 억제된다.
보체 시스템은 약 30개 단백질의 집합을 포함하며, 면역 시스템의 중요 이펙터 메카니즘의 하나이다. 보체 캐스캐이드는 기본적으로 전통적 경로(일반적으로 항체 의존성) 또는 선택적 경로(일반적으로 항체 비의존성)에 의해 활성화된다. 둘 중 어느 하나의 경로에 의한 활성화는 캐스캐이드의 중심 효소 복합체인 C3 컨버타제의 생성을 유발한다. C3 컨버타제는 혈청 C3를 C3a와 C3b로 분해하며, C3b는 활성부위에 공유결합하여 C3 컨버타제의 추가 생성(증폭 루프)을 유발한다. 활성 생성물 C3b(및 또한 전통적 경로에 의해서만 생성되는 C4b)와 그의 분해산물은 중요한 옵소닌(opsonin)이며, 면역 복합체 수송과 가용화뿐만 아니라 (식세포 및 NK 세포에 의한)표적 세포의 세포매개 용해를 촉진하는 것과 연관된다. 면역 시스템의 다양한 세포에서 C3/C4 활성화 산물과 이들의 리셉터는 또한 세포 면역반응을 조절하는데 중요하다. C3 컨버타제는 C5를 분해하여 C5a와 C5b를 얻는 복합체인 C5 컨버타제 형성에 관여한다. C5a는 강력한 염증전 특성과 화학주성을 가지며 면역 이펙터 세포를 보충하고 활성화할 수 있다. C5b의 형성은 터미널 보체 경로를 개시하여 막 공격 복합체(MAC 또는 C5b-9)를 형성하는 보체 단백질 C6, C7, C8 및 (C9)n의 순차적 어셈블리가 얻어진다. 표적 세포막에서 MAC의 형성은 직접적인 세포 용해를 얻을 수 있지만, 또한 세포 활성화와 다양한 염증 조절제의 발현/유리를 유발할 수 있다.
막 보체 저해제에는 2개의 광범위한 종류가 있으며, 보체 활성 경로의 저해제(C3 컨버타제 형성을 저해한다)와 터미널 보체 경로의 저해제(MAC 형성을 저해한다)이다. 보체 활성화의 막 저해제로는 보체 리셉터 1(CR1), 디케이 촉진인자(DAF 또는 CD55) 및 막 코팩터 단백질(MCP 또는 CD46)이 있다. 이들은 모두 C3/C3 결합 단백질의 공통 특징인 숏 컨센서스 반복체라 하는 약 60-70 아미노산으로 된 변화하는 수의 반복단위로 구성되는 단백질 구조를 가진다.
사람 보체 활성화 저해제의 설치류 상동체가 확인되었다. 설치류 단백질 Cr1은 DAF 및 MCP와 비슷한 작용을 하는 널리 분포하는 보체 활성화 저해제이다. Cr1이 기능적으로 설치류에서 보체 활성화의 제일 중요한 조절제인 것으로 보이지만 설치류는 또한 DAF와 MCP를 발현한다. 사람에서 발견되는 Cr1의 상동체는 없지만, Cr1에 대한 연구와 동물 모델에서 그의 용도는 임상적으로 연관되어 있다.
터미널 보체 경로와 숙주 세포막에서 MAC 형성의 조절은 기본적으로 CD59의 활성에 의해 일어나며, CD59는 글루코실포스파티딜이노시톨(GPI) 앵커에 의해 혈장막에 부착된, 널리 분포하는 20 kD 당단백질이다. CD59는 어셈블링 MAC에서 C8 및 C9과 결합하여 막의 삽입을 억제한다.
숙주 세포는 DAF, MCP 및 CD59와 같은 막 결합 보체 조절 단백질에 의해 그 자체의 보체로부터 보호된다. 기관이 다른 종으로 이식되면, 수용체의 자연 항체가 공여체 기관의 내피와 결합하여 보체를 활성화하여 신속한 거부반응을 개시한다. 사람 세포와 대비하여 돼지의 이것이 사람 보체에 매우 민감하다는 것이 이미 제시되었으며, 이는 돼지 세포-표면 보체 조절 단백질이 사람 보체에 대해 비효과적이기 때문인 것으로 판단되었다. 기관이 다른 종에 이식되면, 수용체의 자연 항체는 공여체 기관의 내피와 결합하여 보체를 활성화하여서 신속한 거부반응을 개시한다. 몇가지 방법은 거부반응을 억제하거나 지연하는 것으로 나타났으며, 예를 들면 IgM 자연 항체의 제거 및 전신성 보체제거 또는 sCR1, 헤파린 또는 C1 억제제를 사용한 보체의 저해 등이다.
거부반응 문제에 대한 대안적 방법은 형질전환 돼지에서 사람의 막결합 보체-조절 분자를 발현하는 것이다. 디케이 촉진인자 DAF(CD55), 막 코팩터 단백질 MCP(CD46) 및 반응성 용해의 막 저해제인 MIRL (CD59)을 발현하는 형질전환 돼지를 생산하였다(Klymium et al. Mol Reprod Dev (2010)77:209-221 참조). 이러한 사람 저해제는 돼지류 혈관 내피에서 다량 발현되는 것으로 나타났다. 대조 동물의 심장에 대한 사람 혈액으로의 생체외 관류가 몇 분 내에 기관의 보체 매개성 파괴를 유발하는 반면, 형질전환 동물에서 얻어진 심장은 보체에 대해 내성이 있고 몇 시간 동안 생존하였다.
위에 요약된 이들을 "인간화"하기 위한 돼지 기관 내 사람 보체 조절단백질의 발현 이유는 내인성 돼지 조절 단백질이 사람 보체를 억제하는데 불충분하고 이종장기이식의 상황에서 기관 생존률에 거의 기여하지 않을 것이라는 가정에 기초한다. 사람을 제외한 영장류에서 돼지 췌장섬 이종장기이식과 관련한 연구는 보체 성분(C3, C5, C9, SC5b-9)의 침착, 및 이식 후 12-24시간 이내의 췌장섬 그래프트에서 관찰된 IgM의 상당한 결합을 포함하여, 보체 활성화의 중요성을 나타냈다. 보체 활성화는 주입된 췌장섬의 그래프팅을 방지하는 IBMIR과 결합된 염증반응에서 중요한 역할을 할 수 있다 (Cantarovich et　al., Xenotransplantation 9:25, 2002; Kirchhof et　al., Xenotransplantation 11(5), 396, 2004; Tjernberg, et　al., Transplantation. 2008 Apr 27;85(8): 1193-9). 또한, 가용성 보체 저해제는 시험관내 췌장섬의 보체 매개 용해를 억제할 수 있다(Bennet, et　al., Transplantation 69(5):711, 2000).
모건 등의 미국 특허 제7,462,466호는 몇 가지 사람 보체 조절 단백질(CRP)에 대한 돼지류 상동체의 단리 및 특성화를 기술하고 있다. 이 연구에서는 사람 보체 조절 단백질 분자를 발현하는 돼지 기관은 이들이 사람 CRP 분자를 발현하기 때문이 아니라, 이들이 기능성 CRP 분자의 대량 증가된 양을 발현했기 때문에 보체 손상에 대해 내성이 있었음을 설명하였다. Morgan 등은 돼지 CRP의 증가된 발현이 공여체 기관이 사람 보체 조절 단백질을 발현하는 것과 같이 초급성 거부반응을 유발하는 보체 손상으로부터 공여체 기관을 보호하는데 동등하게 효과적인 것을 확인하였다.
CD46은 전통적 경로와 선택적 경로 모두에 의해 활성화된 보체 매개 공격에 대해 숙주세포를 보호할 수 있는 조절 특성을 가진 단백질로 특성화된다(Barilla-LaBarca, M. L. et al., J. Immunol. 168, 6298-6304 (2002)). hCD46은 낮은 수준의 자연 또는 유도된 항-Gal 또는 항-nonGal 항체에 의해 매개되는 염증과 체액성 거부반응에서 보체 용해에 대한 보호를 제공할 수 있다. 그 결과, 더많은 췌장섬이 그래프트하고, 이어서 거부반응에 대해 더 양호하게 보호될 수 있으므로 면역억제제 요구를 줄인다.
본 발명의 일 구체예에서, 적어도 하나의 보체 조절제를 발현하고 기능적 αGT의 발현을 결실하거나 다음 중 적어도 하나를 췌장 조직에서 발현하는 동물, 조직 및 세포가 제공된다: 1) 면역억제제(즉, CTLA-4, B7 등) 또는 항응고제(즉, TFPI, 히루딘, 트롬보모듈린, EPCR, CD39 등).
일 구체예에서, 보체 저해제(예를 들면, CD46, DAF)는 이것이 정상적으로 발현되는 모든 세포에서 발현된다. 다른 구체예에서, 보체 저해제는 어디서든지 발현된다.
다른 추가 구체예에서, 적어도 하나의 보체 조절제를 발현하고, 기능적 αGT의 발현을 결실하고, 췌장 조직에서 적어도 하나의 면역억제제(즉, CTLA-4, B7 등)를 발현하고, 적어도 하나의 항응고제(즉, TFPI, 히루딘, 트롬보모듈린, EPCR, CD39 등)를 발현하는 동물, 조직 및 세포가 제공된다. 일부 구체예에서, 췌장 조직은 돼지류이다. 추가 구체예에서, 췌장 조직은 췌장섬 세포를 포함한다.
일부 구체예에서, 보체 조절제는 보체 저해제일 수 있다. 추가 구체예에서, 보체 저해제는 막 보체 저해제일 수 있다. 막 보체 저해제는 보체 활성화 경로의 저해제(C3 컨버타제 형성을 저해) 또는 터미널 보체 경로의 저해제(MAC 형성 저해)일 수 있다. 보체 활성화의 막 저해제는 보체 리셉터 1(CR1), 디케이 촉진인자(DAF 또는 CD55), 막 코팩터 단백질(MCP 또는 CD46) 등을 포함한다. 터미널 보체 경로의 막 저해제는 CD59 등을 포함할 수 있다. 보체 조절제가 발현되는 예에서, 2 이상의 상이한 보체 조절제가 발현될 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, 보체 조절제는 사람의 보체 조절제이다. 다른 구체예에서, 보체 조절제는 돼지류 보체 조절제이다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 동물, 조직 또는 세포는 변성되어 하나 이상의 보체 조절제를 형질전환적으로 발현할 수 있다. 동물, 조직 또는 세포는 병성되어보체 조절제 펩티드, 그의 생물학적으로 활성인 절편 또는 유도체를 발현할 수 있다. 일 구체예에서, 보체 조절제 펩티드는 전체 길이 보체 조절제이다. 추가의 구체예에서, 보체 조절제 펩티드는 전체 길이 보체 조절제 단백질 미만을 함유할 수 있다.
당업자에게 공지된 임의의 사람 또는 돼지류 보체 조절제 서열 또는 그의생물학적으로 활성인 부분 또는 절편은 본 발명의 조성물 및 방법에 따를 수 있다. 또다른 구체예에서, 임의의 컨센서스 보체 조절제 펩티드를 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 다른 구체예에서, 핵산 및/또는 펩티드 서열은 여기에 기술된 보체 조절제 펩티드 및 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 상동이다. 추가 구체예에서, 보체 조절제로서 유사한 활성을 나타내는 임의의 절편 또는 상동성 서열을 사용할 수 있다.
(ii) 면역억제제
"면역억제제" 전이유전자는 면역반응을 하향조절할 수 있다. 어떤 종류의 이식 시술에 있어서, 효능과 독성 간의 균형은 그의 임상적 수용에 대한 주요인자이다. 췌장섬 이식과 관련하여, 추가적인 문제는 최근의 수많은 면역억제제, 특히 글루코코르테코이드 또는 칼시누린(calcineurin) 저해제, 예를 들면 Tarcolimus가 베타 세포를 손상시키거나 말초 인슐린 내성을 유발한다는 것이다.(Zeng et al. Surgery (1993) 113: 98-102). 시롤리무스(sirolimus), 저용량 Tarcolimus 및 IL-2 리셉터에 대한 모노클로날 항체(mAb)를 포함하는 스테로이드가 없는 면역억제 전략("에드몬톤(Edmonton) 전략")을 제1형 당뇨병 환자에게 췌장섬 이식만의 시도에서 사용하였다(Shapiro, A. M. J. et al, (2000), N. Eng. J. Med., 343: 230-238). "에드몬톤 전략"을 사용한 최근의 성공은 당뇨병을 치료하기 위해 췌장섬 이식을 사용하는데 대한 의욕을 갱신하였다. 그러나, Tacrolimus의 독성과 관련한 문제는 이러한 요법을 사람에 적용하는 것을 제한할 수 있다.
주요 T 세포 공동자극 시그널, 특히 CD28 경로를 차단하는 생물작용제는 췌장섬을 보호하는 강력한 대안이다. CD28 경로를 차단하는 약물의 예로는 제한적인 것은 아니나 돌연변이 CTLA4 분자를 포함하는 가용성 CTLA4이다.
T-세포 활성화는 이식 거부반응의 발병과 연관되어 있다. T-세포의 활성화는 적어도 2 세트의 시그널을 필요로 한다. 첫 번째는 항원이 존재하는 세포(APC5) 상의 주조직적합성(major histocampatibility) 복합체(MHC)와 결합된 항원성 펩티드의 T-세포 리셉터를 통한 특이적 인지에 의해 개시된다. 시그널의 두 번째 세트는 항원 비특이적이며 APC 상의 그들의 리간드와 상호작용하는 T-세포 공동자극 리셉터에 의해 전달된다. 공동자극이 없을 때, T-세포 활성화는 손상되거나 중지되어 클로날 아네르기(anergy)의 항원 특이적 무반응 상태 또는 세포자멸사에 의한 결실을 유발할 수 있다. 그러므로, T-세포 공동자극의 차단은 항원 특이적 방법으로 원하지 않는 면역반응을 억제하는 방법을 제공할 수 있는 반면, 정상적인 면역기능을 보존한다(Dumont, F. J. 2004 Therapy 1, 289-304).
이제까지 확인된 몇 가지의 T 세포 공동자극 경로 중에서 가장 두드러진 것은 CD28 경로이다. CD28은 수지상 세포, 대식세포 및 B-세포에 존재하는, T-세포 및 그의 카운터 리셉터인 B7.1 (CD8O) 및 B7.2 (CD86) 분자 상에서 발현되는 세포 표면 분자로 T-세포 공동자극 시그널을 차단하는 관심있는 표적물로 특성화되고 동정되었다. CD28에 대한 제2 T-세포 표면 분자 상동체는 세포독성 T-림프구 결합 단백질(CTLA4)로 알려져 있다. CTLA4는 세포 표면 시그널링 분자이지만, CD28의 작용에 대비하여 CTLA4는 부정적으로 T 세포 작용을 조절한다. CTLA4는 B7 리간드에 대한 친화성이 CD28 보다 20배 더 높다. 사람 CTLA4의 유전자는 1988년에 클론되어 1990년 염색체 지도가 작성되었다(Dariavach et al., Eur. J. Immunol. 18:1901-1905 (1988); Lafage-Pochitaloff et al., Immunogenetics 31:198-201 (1990); 미국 특허 제5,977,318호).
CD28/B7 경로는 T 세포 공동자극 시그널을 차단하는 흥미있는 표적물이 되었다. CD28/B7 저해제의 설계는 이 시스템의 내인성 네가티브 조절제, CTLA4를 활용하였다. CTLA4-면역글로불린(CTLA4-Ig) 융합 단백질은 T 세포 공동자극을 저해하는 수단으로 광범위하게 연구되었다. 면역억제요법으로 어려운 균형을 이루어내야 하는데; 질환 또는 거부반응을 극복하는 충분한 억제를 제공해야 하지만 과도한 면역억제는 전체 면역계를 저해하게 된다. CTLA4-Ig의 면역억제 활성은 기관 이식과 자가면역 질환에 대한 동물 모델의 사전임상연구에서 입증되었다. 가용성 CTLA4는 최근 신부전, 건선 및 류마티스 관절염이 있는 사람 환자에서 시험되었으며, 류마티스 관절염 치료가 승인되어 Bristol-Myers Squibb (Abatacept, 가용성 CTLA4-Ig)사가 개발한 약물로 제제화되었다. 이 약물은 최초의 새로운 종류의 선택성 T 세포 공동자극 조절제이다. Bristol-Myers Squibb는 또한 동종이식편 신장 이식에 대해 Belatacept (LEA29Y)로 II기 임상 시험을 실시하고 있다. LEA29Y은 CTLA4의 돌연변이 형태로, 면역글로불린에 융합된, 야생형 CTLA4보다 B7 리셉터에 대해 더 높은 친화성을 가지도록 가공되었다. Repligen Corporation은 또한 그의 CTLA4-Ig로 특발성 혈소판 감소성 자발증에 대하여 임상 시험을 실시하고 있다. "가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 사용한 동종이계 췌장섬 이식의 보호방법"에 대한 미국 특허 U5730403에서는 동종이계 췌장섬 이식을 보호하기 위한 가용성 CTLA4-Ig와 가용성 CTLA4 돌연변이 분자의 용도를 기술하고 있다.
하나의 개체로부터의 CTLA4가 다른 개체의 B7과 결합할 수 있지만 동종이계 B7에 대한 매우 높은 결합활성이 발견되었다. 따라서, 공여체 개체의 가용성 CTLA4가 (정상세포 상의)수용체 B7과 (이종장기이식된 세포 상의)공여체 B7 모두에 결합할 수 있지만, 우선적으로 이종이식편 상의 B7과 결합한다. 따라서, 이종장기이식에 대한 돼지류 동물 또는 세포를 포함하는 본 발명의 구체예에서, 돼지류 CTLA4가 전형적이다. Imperial College의 PCT 공개 WO 99/57266은 이종장기이식 요법에 대한 돼지류 CTLA4 서열과 가용성 CTLA4-Ig의 투여를 기술하고 있다. Vaughn A. et al., J Immunol (2000) 3175-3181에서는 가용성 돼지류 CTLA4-Ig의 결합과 기능을 기술하고 있다. 돼지류 CTLA4-Ig는 (사람이 아닌)돼지류 B7과 결합하여 수용체 T 세포 상의 CD28을 차단하고 글로벌 T 세포 면역억제를 일으키지 않고 이러한 국소 T 세포를 무력화한다(Mirenda et.al., Diabetes 54:1048-1055, 2005 참조).
이제까지 면역억제제로서 CTLA4-Ig에 대한 수많은 연구들은 CTLA4-Ig의 가용성 형태를 환자에게 투여하는 것에 집중되었다. CTLA4-Ig를 발현하도록 조작된 형질전환 마우스가 생산되어 여러 계열의 실험이 수행되었다. Ronchese 등은 마우스에서 CTLA4의 발현 후에 면역시스템 작용을 일반적으로 시험하였다(Ronchese et al. J Exp Med (1994) 179: 809; Lane et al. J Exp Med. (1994) Mar 1; 179(3):819). Sutherland 등(Transplantation. 2000 69(9):1806-12)은 동종 췌장섬 이식에 대한 형질전환 발현된 CTLA4-Ig의 효과를 시험하기 위해 마우스에서 형질전환 태아 췌장 이종이식편으로 분비된 CTLA4-Ig의 보호 효과를 기술하였다. Lui 등(J Immunol Methods 2003 277: 171-183)은 바이오리액터로서 사용하기 위한 형질전환 동물의 유즙 중에서 가용성 CTLA4-Ig의 발현을 유도하기 위해서 유방 특이적 프로모터의 조절 하에 CTLA4-Ig를 발현한 형질전환 마우스의 생산을 보고하였다.
Alexion Phamaceuticals Inc.의 PCT 공개 WO01/30966에서는 보체 단백질 CD59에 부착된 T 세포 저해제 CTLA-4를 함유하는 키메라 DNA 구조물뿐만 아니라 이를 함유하는 형질전환 돼지류 세포, 조직 및 기관을 기술하고 있다. PCT 공개 WO2007035213 (Revivicor)은 CTLA4-Ig를 발현하기 위해 유전적으로 변성시킨 형질전환 돼지류 동물을 기술하였다.
CTLA4-Ig를 발현하는 동물의 개발이 제안되었지만, 이러한 동물은 심각하게 면역저하된다. 최근 Revivicor, Inc.가 제조한, CAG 인핸서/프로모터를 유비쿼터스로 사용하여 CTLA4-Ig를 발현하는 돼지가 면역약화 표현형을 가지는 것을 발견하였으며 전형적인 사육 환경에서 생존하지 못하였다(실시예 11 참조).
본 발명에서는, 태아 췌장섬과 성체 췌장섬 모두에서의 직접 유전자 발현에 대해 알려진, Pdx-1 유전자에서 유래한 췌장섬 계통 특이적 인핸서(Lomedico et al., 1979)를 래트 Ins2 유전자에서 유래한 프로모터(Gerrish et al., 2004)와 결합하여 생산된 형질전환 동물의 췌장섬에서 국소 및 특이적으로 면역억제 전이유전자의 발현을 작동하는 벡터를 제조하기 위해 사용하였다.
추가적인 면역조절제와, 특히 면역억제제는 동물, 조직 또는 세포에서 발현될 수 있다. 예를 들면, 면역약화된 표현형을 생산하기 위해 마우스에서 비활성화되는 유전자를 클론하여 돼지에서 유전자 표적화에 의해 파괴할 수 있다. 마우스에서 표적화되고 면역약화된 돼지를 제조하기 위해 표적화시킬 수 있는 일부 유전자는 베타 2-마이크로글로불린 (MHC 클래스 I 결핍, Koller et al., Science, 248:1227-1230), TCR 알파, TCR 베타 (Mombaerts et al., Nature, 360:225-231), RAG-1 및 RAG-2 (Mombaerts et al., (1992) Cell 68, 869-877, Shinkai, et al., (1992) Cell 68, 855-867, US 5859307) 등이다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 동물 또는 세포는 변성되어 세포독성 T-림프구 결합 단백질 4-면역글로빈(CTLA4)을 형질전환적으로 발현할 수 있다. 동물 또는 세포를 변성시켜서 CTLA4 펩티드 또는 그의 생물학적으로 활성인 절편(예를 들면, 세포외 도메인, 적어도 트랜스멤브레인 도메인이 제거된 펩티드의 트렁케이트 형태) 또는 그의 유도체를 발현할 수 있다. 펩티드는, 예를 들면 사람 또는 돼지류일 수 있다. CTLA4 펩티드를 돌연변이시킬 수 있다. 돌연변이된 펩티드는 돼지류 및/도는 사람 B7 분자의 야생형 보다 더 높은 친화성을 가질 수 있다. 특이적 일 구체예에서, 돌연변이된 CTLA4는 CTLA4(Glu104, Tyr29)일 수 있다. CTLA4 펩티드는 세포내 발현된 정도로 변성시킬 수 있다. CTLA4의 다른 변성은 N 또는 C 터미널에 대한 소포체잔류신호의 첨가를 포함한다. 소포체잔류신호는, 예를 들면 KDEL 서열일 수 있다. CTLA4 펩티드는 펩티드 다이머화 도메인 또는 면역글로불린(Ig) 분자에 융합될 수 있다. CTLA4 융합 펩티드는 2개 펩티드를 결합할 수 있는 링커 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명에 따라 제조된, 기능성 면역글로불린의 발현을 결실한 동물에게 이들의 T-세포 반응을 억제하는 약물로서 CTLA4 펩티드 또는 그의 변이체(pCTLA4-Ig, 또는 hCTLA4-Ig (Abatacept/Orencia, 또는 Belatacept)를 투여할 수 있다.
일 구체예에서, CTLA4 펩티드는 전체 길이 CTLA4이다. 추가 구체예에서, CTLA4 펩티드는 전체 길이 CTLA4 단백질 미만을 함유할 수 있다. 일 구체예에서, CTLA4 펩티드는 CTLA-4 펩티드의 세포외 도메인을 함유할 수 있다. 특정한 구체예에서, CTLA4 펩티드는 CTLA4 펩티드의 세포외 도메인이다. 다른 추가 구체예에서, 본 발명은 CTLA4의 돌연변이 형태를 제공한다. 일 구체예에서, CTLA4의 돌연변이된 형태는 돼지류 및/또는 사람 B7에 대해 야생형보다 더 높은 친화성을 가질 수 있다. 특이적 일 구체예에서, 돌연변이된 CTLA4는 사람 CTLA4 (Glu104, Tyr29)일 수 있다.
일 구체예에서, CTLA4는 적어도 단백질의 트랜스멤브레인 도메인이 제거된, CTLA4의 트렁케이트 형태일 수 있다. 다른 구체예에서, CTLA4 펩티드는 세포내 발현될 정도로 변성될 수 있다. 일 구체예에서, 골지체잔류시그널은 CTLA4 펩티드의 N 또는 C 터미널에 첨가될 수 있다. 일 구체예에서, 골지체잔류시그널은 KDEL 서열일 수 있으며, 이것은 CTLA4 펩티드의 C 또는 N 터미널에 첨가될 수 있다. 추가 구체예에서, CTLA4 펩티드는 펩티드 다이머화 도메인에 융합시킬 수 있다. 일 구체예에서, CTLA4 펩티드는 면역글로불린 (Ig)에 융합시킬 수 있다. 다른 구체예에서, CTLA4 융합 펩티드는 2개 펩티드를 결합할 수 있는 링커 서열을 포함할 수 있다.
당업자들에게 알려진 임의의 사람 CTLA4 서열 또는 그의 생물학적으로 활성인 부분 또는 절편도 본 발명의 조성물 및 방법에 사용할 수 있다. 비제한적인 예로 사람 CTLA4 서열을 기술하는 다음과 같은 Genbank 기탁번호가 있으며, 이에 한정되지는 않는다: NM005214.2; BC074893.2; BC074842.2; AF414120.1; AF414120; AY402333; AY209009.1; BC070162.1; BC069566.1; L15006.1; AF486806.1; AC010138.6; AJ535718.1; AF225900.1; AF225900; AF411058.l; M37243.1; U90273.1; 및/또는 AF316875.l. CTLA4 펩티드를 코딩하는 추가 뉴클레오티드 서열을, 제한적인 것은 아니나 EST 데이터베이스로부터의 다음과 같은 Genbank 기탁번호를 포함하는 것에서 선택할 수 있다: CD639535.1; A1733018.1; BM997840.1; BG536887.1; BG236211.1; BG058720.l; A1860i99.l; AW207094.l; AA210929.1; A1791416.1; BX113243.1; AW515943.1; BE837454.1; AA210902.1; BF329809.1; A1819438.1; BE837501.1; BE837537.1; 및/또는 AA873138.1.
추가 구체예에서, 임의의 컨센서스 CTLA4 펩티드도 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 다른 구체예에서, 핵산 및/또는 펩티드 서열은 자연 CTLA4 펩티드 및 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 상동이다. 추가의 구체예에서, CTLA4와 유사한 활성을 나타내는 임의의 절편 또는 상동성 서열이 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, T 세포 저해활성을 나타내는 아미노산 서열은 돼지류 CTLA4 서열의 38 내지 162 아미노산 또는 사람 CTLA4 서열의 38 내지 161 아미노산일 수 있다(예를 들면, PCT 공개 WO 01/30966 참조). 일 구체예에서, 사용된 부분은 모(母)분자의 활성의 적어도 약 25%, 바람직하게 적어도 약 50%를 가져야 한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 CTLA4 핵산 및 펩티드는 면역글로불린 유전자 및 그의 분자 또는 절편 또는 영역에 융합시킬 수 있다. 본 발명의 CTLA4 서열에 대한 참조는 면역글로불린에 융합된 이들 서열을 포함한다.
일 구체예에서, Ig는 사람 Ig일 수 있다. 다른 구체예에서, Ig는 IgG, 특히 IgG1일 수 있다. 다른 구체예에서, Ig는 IgG의 정상영역일 수 있다. 특정한 구체예에서, 정상영역은 IgG1의 Cγ1 사슬일 수 있다. 본 발명의 특정한 일 구체예에서, 돼지 CTLA4의 세포외 도메인은 사람 Cγ1 Ig에 융합시킬 수 있다. 다른 특정한 구체예에서, 사람 CTLA4의 세포외 도메인은 IgG1 또는 IgG4에 융합시킬 수 있다. 추가의 특정 구체예에서, 돌연변이된 CTLA4(Glu 104, Tyr 29)의 세포외 도메인을 IgG1에 융합시킬 수 있다.
(iii) 기타 면역조절제
사용가능한 기타 면역조절제는 클래스 II 트랜스활성제(CIITA) 및 그의 돌연변이, PDL1, PDL2, 종양괴사인자-α와 연관된 세포자멸 유발 리간드(TRAIL), Fas 리간드 (FasL, CD95L) 인티그린 결합 단백질(CD47), HLA-E, HLA-DP, HLA-DQ, 또는 HLA-DR이다.
(a) CIITA: 클래스 II 트랜스활성제(CIITA)는 전사 활성제로서 작용하고 MHC 클래스 II 유전자의 발현에서 중요한 역할을 하는 비- 또는 멀티기능성 도메인 단백질이다. 아미노 터미널 151개 아미노산을 결실한 단백질을 코딩하는 사람 CIITA 유전자의 돌연변이된 형태는 HLA 클래스 II 발현의 강력한 우성-네가티브 억제제로서 작용하는 것이 이미 입증되었다(Yun et al., Int Immunol. 1997 Oct;9(10):1545-53). 돼지 MHC 클래스 II 항원은 사람 CD4+ T 세포에 의한 직접 T-세포 인지의 강력한 자극제이고, 따라서 임상 이종장기이식에서 형질전환 돼지 공여체에 대한 거부반응에서 중요한 역할을 할 것으로 보인다. 돌연변이된 사람 CIITA 구조물은 돼지 세포에서 효과적이며, IFN[감마]-유도된 것과 구성성 돼지 MHC 클래스 II 발현을 현저하게 억제하는 것으로 보고되었다. 또한, 돌연변이된 사람 CIITA 구조물을 가지는 안정하게 형질감염된 돼지류 혈관 내피세포주는 정제된 사람 CD4+ T 세포에 의한 직접 T-세포 이종장기이식을 자극하는데 실패하였다(Yun et al., Transplantation. 2000 Mar 15;69(5):940-4). CIITA-DN 형질전환 동물에서 유래한 기관, 조직 및 세포는 사람 수용체에서 대량 감소된 T-세포 거부반응을 유발할 수 있다. 다른 전이유전자와 결합하여, 돌연변이된 CIITA의 형질전환 발현은 임상적으로 허용가능한 수준의 면역억제를 가지는 장기간의 이종이식편 생존을 이룰 수 있다.
(b) PDL1 , PDL2: T-세포 활성화를 위한 전형적인 공동자극 분자는 CD80/86 또는 CD40이다. 지난 수년 동안의 이러한 포지티브 공동자극 경로 이외에, 네가티브 시그널을 매개하고 T-세포 활성화 조절에 중요한 새로운 공동자극 경로를 발견하였다. 이러한 보다 새로운 경로 중 하나가 프로그램된 사멸 1(PD-1) 리셉터 및 그의 리간드, PD-L1 및 PD-L2로 구성되는 경로이다. PD-1 리셉터는 휴면 세포에서 발현되지 않지만 T 및 B 세포 활성화 후에 상향조절된다. PD-1은 세포질 면역리셉터 티로신 포함 스위치 모티브를 함유하며 PD-L1 또는 PD-L2와 PD-1의 결합은 T-세포에서 억제 시그널을 유도한다. 최근의 데이터는 PD1/PDLigand 경로가 조절 활성을 나타내는 T-세포 서브세트의 조절에서 작용할 수 있다는 것을 시사한다. 마우스에서, PD-1 시그널은 조절 T-세포(Treg)의 억제활성과 적응성 Treg의 생성에 필요한 것으로 나타났다. 이러한 관찰은 PD-1/PDLig와 상호작용이 T-세포 반응을 저해할 뿐만 아니라 면역조절을 유발할 수 있음을 나타낸다. PD-1/PDLigand 경로가 인그래프트먼트와 동종이식편의 거부반응을 조절할 수 있어서 이들 분자들이 기관의 이식 후 면역조절에 대한 흥미있는 표적물임을 시사하는 것을 몇 가지 증거들이 증명하고 있다. 실제로, 동종이식편 생존의 연장은 래트 이식 모델에서 공여체 심장으로의 PDL1Ig 유전자 전이에 의해 얻어질 수 있다. 또한, PD-L1Ig 주사에 의한 PD-1 시그널링 강화도 마우스에서 그래프트를 거부반응으로부터 보호하는 것으로 보고되었다. 최근의 자료 역시 마우스에서 췌장섬 그래프트 상에서의 PD-L1IG의 과발현이 췌장섬 그래프트 생존을 부분적으로 연장할 수 있는 것을 나타내고 있다. 돼지 세포와 조직에서 사람 PD-L1 또는 PD-L2의 형질전환 발현은 감작화의 직접 경로에 의해 개시되는 사람 항돼지 T-세포 반응을 조기에 감소시켜야 한다(Plege et al., Transplantation. 2009 Apr 15;87(7):975-82). Treg의 유도에 의해 이종이식편에 대해 감작된 T-세포를 지속적 내성을 얻는데 필요한 간접 경로를 통해 조절할 수 있다.
(c) TRAIL / Fas L: Fas 리간드(FasL, CD95L) 또는 종양괴사인자-α와 연관된 세포자멸을 유발하는 리간드(TRAIL, Apo-2L) 등의 세포자멸 유도 리간드의 발현은 이종이식편을 공격하는 T-세포를 제거할 수 있다. TRAIL은 FasL에 대하여 고도의 아미노산 동일성(28%)을 나타내는 다른 종양괴사인자 종류의 세포외 도메인에 대해 상동인 세포외 도메인을 가지는 타입 II 막단백질이다. TRAIL은 종양 세포에 대해 우선적으로 그의 세포자명 유도 활성을 나타낸다. 정상 세포에서, TRAIL 리셉터의 결합은 세포 사멸을 유발하지 않는다. 최근의 연구에서는, 예를 들면 T-세포, 자연킬러세포, 대식세포 및 수지상 세포와 같은 면역 세포의 세포독성 효과가 적어도 부분적으로 TRAIL에 의해 매개되는 것으로 나타났다. 형질전환 돼지에서의 사람 TRAIL의 발현은 영장류의 이종장기이식 후에 세포 매개 거부반응에 대해 돼지 조직을 보호하는 적절한 전략을 제공할 수 있다. 형질전환 돼지에서 사람 TRAIL의 안정한 발현이 얻어졌으며, 발현된 TRAIL은 시험관 내에서 생물학적으로 기능성이 있는 것으로 입증되었다(Klose et al., Transplantation. 2005 Jul 27;80(2):222-30).
(d) CD47: 인티그린 결합 단백질로 알려진 CD47은 유비쿼터스 발현된 50-kDa 세포 표면 당단백질이며, 대식세포 상의 면역저해 리셉터인 시그널 조절 단백질(SIRP)α(또한 CD172a, SHPS-1로 알려짐)에 대한 리간드로 작용한다. CD47과 SIRPα는 세포 이동, B 세포의 부착 및 T-세포 활성화를 포함하는 다양한 세포 과정에서 중요한 역할을 하는 세포-세포 커뮤니케이션 시스템(CD47-SIRPα 시스템)을 구성한다. 또한, CD47-SIRPα 시스템은 대식세포에 의한 식균작용의 네거티브 조절에 연관된다. 몇몇 세포 종류(즉, 적혈구, 혈소판 또는 백혈구)의 표면상의 CD47은 저해성 대식세포 리셉터 SIRPα에 결합하여 대식세포에 의한 식균작용을 막을 수 있다. 자체 인지 및 식균작용의 저해에서 CD47-SIRPα 상호작용의 역할은 초기, 야생형 마우스 대식세포가 야생형 마우스가 아니라 CD47 결핍성 마우스에서 얻어진 비옵소닌화 RBC를 신속하게 식균하는 것에 의해 설명된다. 또한, 그의 SIRPα 리셉터에 의해 CD47이 Fcγ와 보체 리셉터 매개 식균작용을 저해하는 것이 보고되었다. 돼지 CD47은 사람 대식세포 유사 세포주에서 SIRPα 티로신 포스포릴레이션을 유발하지 않으며 가용성 사람 CD47-Fc 융합 단백질은 돼지 세포에 대한 사람 대식세포의 식균 활성을 저해하는 것이 증명되었다. 또한, 사람 CD47의 발현을 위한 돼지 세포의 조작이 사람 대식세포에 의해 식균작용에 대한 세포의 감작성을 감소시키는 것으로 나타났다(Ide et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Mar 20;104(12):5062-6). 돼지 세포에서 사람 CD47의 발현은 사람 대식세포 상의 SIRPα 에 대한 저해 시그널링을 제공하여 대식세포 매개 이종이식편 거부반응을 억제하는 방법을 제공한다.
(e) NK 세포 반응. HLA -E / 베타 2 마이크로글로불린 및 HLA -DP, HLA - DQ , HLA-DR:
사람의 자연킬러(NK)세포는 생체 외에서 사람 혈액으로 관류된 돼지 기관을 잠식하고 직접 및, 사람 혈청 존재 하에 항체 의존성 세포 매개 세포독성에 의해 시험관 내에서 돼지 세포를 용해하므로 이들은 성공적인 돼지 대 사람 이종장기이식에 대한 잠재적인 장애이다. NK 세포 자가반응성은 정상 자가유래 세포 상의 저해성 NK 리셉터의 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 리간드의 발현에 의해 억제된다. 활성화된 사람 NK 세포 대부분에서 발현된 저해성 리셉터 CD94/NKG2A는 사람 백혈구 항원(HLA)-E와 특이적으로 결합한다. 비고전적 사람 MHC 분자 HLA-E는 CD94/NKG2A를 담지하는 NK 세포에 대한 강력한 저해 리간드이며, 고전적 MHC 분자와는 달리 동종이계의 T-세포 반응을 유발하지 않는다. HLA-E는 소포체에서 조합되어 세포 표면에 HLA-E 중쇄, β2-마이크로글로불린(β 2m), 및 일부 MHC 클래스 I 분자의 리더 서열로부터 유도된 펩티드로 구성되는 안정한 트라이머 복합체로서 이송된다. HLA-E의 발현은 이종발생성 사람 NK 세포 세포독성에 대한 부분적 보호를 제공하는 것으로 나타났다(Weiss et al., Transplantation. 2009 Jan 15;87(1):35-43). 돼지 기관에서 HLA-E의 형질전환 발현은 동종반응의 위험 없이 돼지 이종이식편의 사람 NK 세포 매개 거부반응을 실질적으로 경감하는 가능성을 가진다. 또한, 다른 HLA 유전자를 가지는 형질전환 돼지가 돼지 기관, 조직 및 세포의 "사람화" 를 목표로 하여 성공적으로 생성되었다(Huang et al., Proteomics. 2006 Nov;6(21):5815-25, 미국 특허 제6639122호 참조).
항응고제
췌장섬-혈액 반응은 가속화된 응고와 혈소판 소모로, 처음 48 시간 이내에 췌장섬 중량의 80-90%를 손실하는 것을 특징으로 하며, 보체 용해시스템의 활성화 및 췌장섬에서의 조직인자의 상향조절과 결합되어 있는 것으로 나타났다(Johansson et al. Diabetes, 2005, 54:1755; Moberg et al, Lancet, 2002,360:1999-2000; Berman et al., Transplantion 2007, 84:308-313). 이전에 이러한 항응고제 전이유전자들은 이들을 기관 이종장기이식을 위한 돼지 내피에서의 발현을 목적으로 동물에게 삽입되었다. 본 발명에 있어서, 태아 췌장섬과 성체 췌장섬 모두에서의 직접 유전자 발현으로 알려진, Pdx-1 유전자에서 유래한 췌장섬 계통 특이적 인핸서(Lomedico P et al., Cell, 1979, 18:545)를 래트 Ins2 유전자(Gerrish K et al., Mol. Endocrinol., 2004, 18(3): 533)와 함께 사용하여 생산되는 형질전환 동물의 췌장섬에서 국소 및 특이적으로 항응고제의 발현을 작동하는 벡터를 제조하였다.
조직인자 경로 저해제(TFPI)는 단일 사슬 폴리펩타이드이며, Factor Xa (Xa)와 트롬빈(Factor IIa)을 가열적으로 저해할 수 있고, 따라서 TF 의존성 응고를 저해한다. TFPI에 대하여는 Crawley와 Lane의 문헌(Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2008, 28(2):233-42)을 참조 바람. Dorling과 그의 동료들은 Weibel-Palade 세포내 저장 그래뉼을 목표로 하는 P-셀렉틴 테일(P-selectin tail)을 가지는, 사람의 CD4의 트랜스멤브레인/세포질 도메인에 결합된 사람 TFPI의 3개 Kunitz 도메인으로 구성되는 융합 단백질을 발현하는 형질전환 마우스를 생성하였다(Chen D, et al. Am J Transplant 2004; 4: 1958-1963.). 내피에서 TFPI의 생성된 활성화 의존성 표현은 사이클로스포린으로 처리된 래트에 의한 마우스 심장 이종이식편의 혈전증 매개 급성 체액성 거부반응을 완전히 저해하는데 충분하다. 또한, 응고의 효과적 조절이 만성 거부반응을 억제할 수 있다는 제안도 있다. 히루딘/CD4/P-셀렉틴 융합 단백질을 발현하는 형질전환 마우스 심장으로 유사한 결과를 얻었으며, 이는 트롬빈 생성 또는 활성의 억제가 이 모델에서의 보호에 열쇠임을 나타낸다.
히루딘은 약용 거머리(예를 들면, Hirudo medicinalis)의 침샘에 있는 자연적으로 발생한 펩티드이며 강력한 트롬빈 저해제이다. Dorling과 동료들(Chen et al., J Transplant. 2004 Dec;4(12):1958-63)은 또한 막-연결(tethered) 히루딘 융합 단백질을 발현하는 형질전환 마우스를 생성하여 그의 심장을 래트에 이식(마우스-래트 Xeno-Tx)하였다. 3일 이내에 모두 거부된 대조용 비형질전환 마우스 심장과 대조하여, 형질전환 마우스의 양 스트레인으로부터 유래한 기관의 100%가 체액성 거부반응에 완전하게 내성이 있었으며, T-세포 매개 거부반응이 시클로스포린 A 투여로 저해될 때 100일 이상 생존하였다.
Riesbeck 등(Circulation. 1998 Dec 15;98(24):2744-52)은 또한 혈관내 혈전증의 억제 전략으로서 포유동물 세포에서 히루딘 융합 단백질의 발현을 연구하였다. 세포 내 발현은 국소적 트롬빈 농도를 감소시키고 피브린 형성을 저해하였다. 그러므로, 히루딘은 이종장기이식에 존재하는 혈전증 효과를 억제하기 위해 주목되는 또다른 항응고제 전이유전자이다.
트롬보모듈린(TM)은 트롬빈과 1:1 화학양론적 복합체를 형성하여 항응고제 경로에서 단백질 C의 트롬빈 유도 활성화에서 코팩터로 작용한다. 내피세포 단백질 C 리셉터(EPCR)는 단백질 C의 활성화를 증강하는 N-글리코실레이트된 타입 I 막단백질이다. 단백질 C 항응고제 시스템에서 이러한 단백질의 역할은 Van de Wouwer et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004 Aug;24(8):1374-83에서 리뷰되었다. 이들 및 다른 항응고제 전이유전자의 발현이 다양한 그룹들에 의해 연구되어 이종장기이식에 대한 응고 장벽을 가능성 있게 설명하였다(리뷰: Cowan and D'Apice, Cur Opin Organ Transplant. 2008 Apr;13(2):178-83). Esmon과 동료들(Li et al., J Thromb Haemost. 2005 Jul;3(7):1351-9)은 형질전환 마우스의 내피에서 EPCR을 과발현시켜서 이러한 발현이 마우스를 혈전증 시험에서 보호하는 것임을 보여주었다. Iino 등(J Thromb Haemost. 2004 May;2(5):833-4)은, 췌장섬 이식에서 혈전 합병증을 방지하는 수단으로 유전자 요법에 의해 공여체 췌장섬에서 TM의 생체외 과발현을 제안하였다.
CD39는 주요 혈관 뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포하이드롤라제 (NTPDase)이며, ATP, 및 ADP를 AMP로, 궁극적으로 아데노신으로 전환시킨다. 세포외 아데노신은 혈전증과 면역에서 중요한 역할을 하며, 따라서 이식에서 그의 유익한 작용에 대해 연구되었다(Robson et al. Semin Thromb Hemost. 2005 Apr;31(2):217-33에 의해 리뷰). 최근의 연구에서는 CD39가 염증 반응 감소에 큰 효과를 나타내는 것으로 나타났다(Beldi et al., Front Biosci, 2008, 13:2588-2603). hCD39를 발현하는 형질전환 마우스는 심장 이식 모델에서 손상된 혈소판 응집, 연장된 출혈시간 및 전신 혈전색전증에 대한 내성을 나타냈다(Dwyer et al., J Clin Invest. 2004 May;113(10):1440-6). 이들은 또한 췌장섬에서 CD39를 발현하는 것이 확인되었으며, 사람 혈액과 인큐베이션하였을 때 야생형 췌장섬과 비교하여 이 췌장섬들은 응고시간을 상당히 지연하였다(Dwyer et al., Transplantation. 2006 Aug 15;82(3):428-32). 형질전환 돼지에서 구성성 프로모터 시스템으로부터 고수준으로 hCD39를 발현하려는 초기 노력은 출산 후의 높은 치사율을 보였다(Revivicor, Inc., 미공개 자료). 그러므로, 동물의 안녕을 위태롭게 하지 않는 방법으로 돼지에서 항응고제 전이유전자를 발현하는 것이 필요하지만, 여전히 임상적 이종장기이식에서 사용하기 위한 적절한 수준의 발현은 제공되지 않고 있다.
세포보호성 전이유전자
본 발명은 세포보호성 전이유전자("세포보호제(cytoprotectants)")를 포함한다. 세포보호성 전이유전자는 항세포자멸제, 항산화제 및 항염증제를 포함하는 것으로 간주된다. 예를 들면, 다음과 같다:
(a) A20: A20은 항염증 활성과 항세포자멸 활성을 제공한다. 혈관성 이식된 기관은 항염증성, 항응고성 및/또는 항세포자멸성 분자에 의해 내피세포 활성화와 세포 손상에 대해 보호될 수 있다. 급성 혈관성 거부반응(AVR) 조절에 대해 커다란 잠재성을 가지는 유전자 가운데 사람 A20 유전자(hA20)가 처음으로 사람 탯줄정맥 내피세포에서 종양괴사인자(TNF)-α 유도인자로서 동정되었다. 사람 A20은 몇 종의 카스파제의 차단과 전사인자 핵 팩터-κB 각각으로 TNF 매개 세포자멸과 염증으로부터 내피세포를 보호하는 이중 세포보호 작용을 가진다. 살아있는 A20 형질유전자 새끼돼지가 생산되었으며, 이러한 동물에서 hA20의 발현은 골격근, 심장 및, hA20 발현에 의한 TNF 매개 세포자멸 및 적어도 부분적으로 CD95(Fas)L 매개 세포사멸에 대하여 보호되는 PAEC로 한정되었다. 또한, hA20-형질전환 클론된 돼지에서 유래한 심장근육은 부분적으로 심장발작에 대해 보호되었다(Oropeza et al., Xenotransplantation. 2009 Nov;16(6):522-34).
(b) HO-1: HO는 항염증 활성, 항세포자멸 활성 및 항사화제 활성을 제공한다. 헴 옥시게나제(Heme oxygenases, HO)는 헴 이화작용의 속도제한효소로서 HSP32라고도 하며, 열 쇼크 단백질에 속하는 것으로, 헴 고리는 제1철, 일산화탄소(CO) 및, 빌리버딘(biliverdin) 환원효소에 의해 빌리루빈으로 전환되는 빌리버딘으로 분해된다. HO-1, HO-2 및 HO-3 등의 HO의 이소폼(isoform)이 클론되었다. HO-1의 발현은 잘 유도되는 반면, HO-2와 HO-3는 본질적으로 발현된다(Maines M D et al., Annual Review of Pharmacology & Toxicology 1997; 37:517-554, and Choi A M et al., American Journal of Respiratory Cell & Molecular Biology 1996; 15:9-19). HO-1-/- 마우스의 분석에서는 HO-1을 코딩하는 유전자가 철 항상성을 유지하고 강력한 항산화, 항염증 및 항세포자멸 효과를 가지는 세포보호 유전자로서 작용하는 것으로 나타났다(Poss K D et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1997; 94:10925-10930, Poss K D et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1997; 94:10919-10924, and Soares M P et al., Nature Medicine 1998; 4:1073-1077). 최근에 유사한 결과가 사람에서의 HO-1 결핍에 대한 케이스 보고에서 기술되었다(Yachie A et al., Journal of Clinical Investigation 1999; 103:129-135). 항염증, 항산화 및 항세포자멸 등의, HO-1의 세포보호 효과를 담당하는 분자 메카니즘은 그의 반응 생성물에 의해 매개된다. HO-1 발현은 상이한 금속을 가지는 프로토포피린(protoporphyrin)에 의해 시험관 내와 생체 내에서 조절될 수 있다. 코발트 프로토포피린 (CoPP)과 철 프로토포피린 (FePP)은 HO-1의 발현을 상향조절할 수 있다. 반면, 주석 프로토포피린(SnPP)과 아연 프로토포피린 (ZnPP)은 단백질 수준에서 HO-1의 활성을 억제한다. 최근에, HO-1의 발현이 마우스 대 래트 심장 이식물의 거부반응을 억제하며(Sato K et al., J. Immunol. 2001; 166:4185-4194), 췌장섬 세포의 세포자멸을 보호하며 이식 후 췌장섬의 생체내 기능을 개선(Pileggi A et al., Diabetes 2001; 50: 1983-1991)하는 것이 입증되었다. 또한, 유전자 전이에 의한 HO-1의 투여가 고산소증 유발 폐 손상에 대한 보호를 제공하고(Otterbein L E et al., J Clin Invest 1999; 103: 1047-1054), HO-1의 상향조절은 fat Zucker 래트 간을 허혈/재관류 손상에서 유전적으로 보호하며 (Amersi F et al., J Clin Invest 1999; 104: 1631-1639), HO-1 유전자의 융삭 또는 발현이 시스플라틴 유도 신장 관상(tubular) 세포자멸을 조절(Shiraishi F et al., Am J Physiol Renal Physiol 2000; 278:F726-F736)하는 것이 증명되었다. 형질전환 동물 모델에서는, HO-1의 과발현이 폐 염증과 저산소증에 대한 혈관반응을 억제하고(Minamino T et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001; 98:8798-8803), 허혈 및 재관류 손상에 대해 심장을 보호(Yet S F, et al., Cir Res 2001; 89:168-173)하는 것으로 나타났다. HO-1 전이유전자를 보유한 돼지가 생산되었지만, 이종장기이식에서 이들의 용도와 관련된 임상효과는 보고되지 않았다(US7378569).
(c) FAT-1: FAT-1은 항염증활성을 제공한다. 다불포화지방산(PUFA)은 염증을 억제(n-3 클래스)하는 역할을 한다. 포유동물은 n-6 PUFA를 n-3 PUFA로 전환하는 불포화효소(desaturase)가 없다. 따라서, 필수 n-3 지방산은 식이요법으로 공급해야 한다. 하지만, 포유동물과 달리 자유생활 선충 Caenorhabditis elegans는 n-6-지방산에 탄화수소 사슬의 n-3 위치로 이중결합을 삽입하여 n-3 PUFA를 형성하는 n-3 지방산 불포화효소를 발현한다. C. elegans fat-1 유전자를 발현하여, 결과적으로 6-시리즈의 식이성 PUFA를 3-시리즈의 PUFA, 예를 들면 EPA (20:5 n-3) 및 DHA (22-6 n-3)로 효과적으로 전환할 수 있는 형질전환 마우스가 생산되었다(Kang et al., Nature. 2004 Feb 5;427(6974):504). 다른 그룹에서는 fat-1 cDNA의 코돈을 포유동물계에서의 효과적 번역을 위해 더 최적화하여; C. elegans n-3 지방산 불포화효소 유전자, mfat-1을 과발현하여 n-3 PUFA를 내인성 생산하는 형질전환 마우스를 생산하였다. 이 그룹은 mfat-1의 형질전환적 발현에 의한 n-3 PUFA의 세포적 증가와 n-6 PUFA의 감소가 마우스의 단리된 췌장섬에서 글루코스-, 아미노산- 및 GLP-1-자극된 인슐린 분비를 증가시키고, 췌장섬이 사이토카인으로 유발된 세포 사멸에 강력하게 내성이 되는 것을 나타내었다(Wei et al., Diabetes. 2010 Feb;59(2):471-8).
(d) 가용성 TNF-알파 수용체(sTNFR1): 종양괴사인자(TNF, 카켁신(cachexin) 또는 카켁틴(cachectin) 및 이전에 종양괴사인자-알파로 알려짐)는 전신성 염증과 연관된 사이토카인이며 급성 상 반응(acute phase reaction)을 자극하는 사이토카인 중 하나이다. TNF의 중요한 역할은 면역 세포의 조절에 있다. TNF는 자연적 세포 사멸을 유도할 수 있으며, 염증을 유발한다. 가용성 TNF-알파 리셉터 1(sTNFR1)은 TNFR1의 세포외 도메인이며 TNF-알파에 대한 길항제이다(Su et al., 1998. Arthritis Rheum. 41, 139-149). 이종이식편 내 sTNFR1의 형질전환 발현은 유익한 항염증 효과를 가진다.
적절한 항산화 특성을 가지는 다른 세포보호제로는 SOD와 Catalyse가 있으며, 이에 제한되지는 않는다. 산소는 모든 호기성생물에 필수적인 분자이며, ATP 생성, 즉 산화성 포스포릴레이션에서 탁월한 역할을 한다. 이 과정에서, 수퍼옥사이드 음이온(O(2)(-))과 과산화수소 (H(2)O(2)) 등의 반응성 산소종(ROS)이 부산물로 생산된다. 사람에 있어서, 항산화 방어 시스템은 ROS 생성의 균형을 유지한다. 수퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)와 카탈라제는 항산화특성을 가지는 2개의 효소이다. SOD는 수퍼옥사이드 래디칼의 과산화수소로의 디스뮤테이션(dismutation)을 촉매하며, 과산화수소는 카탈라제와 글루타티온 퍼옥시다제에 의해 물로 전환된다. ROS의 생성으로 인한 세포손상이 이식 고정에서 발생할 수 있다. 감소된 항산화 방어로 인하여 췌장 베타 세포는 특히 자유 래디칼과 염증성 손상에 취약하다. 일반적으로 사용되는 항거부반응 약물은 후천성 면역반응을 저해하는데 있어서는 우수하지만; 대부분이 췌장섬에 유해하고 반응성 산소종과 췌장섬 단리 및 허혈-재관류 손상으로 인한 염증을 보호하지 못한다. 그러므로, 항산화제로 췌장을 생체외 처리하거나 유전자 요법 또는 공여체 조직에서의 형질전환 발현에 의해 항산화 유전자를 발현하는데 관심이 있다. EC-SOD와 카탈라제의 생체외 유전자 전이는 래트에서의 항원으로 유발된 관절염 모델에서 항염증성을 나타냈다(Dai et al., Gene Ther. 2003 Apr;10(7):550-8). 또한, 문맥을 통한 EC-SOD 및/또는 카탈라제 유전자의 전달은 마우스 모델에서 간 I/R 손상을 현저하게 약화시킨다(He et al., Liver Transpl. 2006 Dec;12(12):1869-79). 최근의 마우스 연구에서, 동질유전자 이식, 차선의 동질유전자 이식 또는 이종유전자 이식 전에 촉매성 항산화제로 처리된 췌장섬은 처리되지 않은 대조군과 비교하여 우수한 작용을 나타냈다. 같은 연구에서, 촉매성 항산화제 처리된 동종이계 췌장섬의 당뇨병성 쥐과 수용체는 이식 후 개선된 혈당조절을 나타내고 동종이식편 거부반응의 지연을 입증하였다(Sklavos et al., Diabetes. 2010 Jul;59(7):1731-8. Epub 2010 Apr 22). 마우스의 다른 연구에서, MnSOD를 과발현하는 췌장섬 이식편은 대조 이식편 보다 약 50% 더 오래 작용하였다(Bertera et al., Diabetes. 2003 Feb;52(2):387-93).
또한, 임의의 항응고제, 예를 들면 트롬보모듈린, EPCR 및 CD39 역시 항염증 활성을 제공한다.
유전적 변성 동물의 생산
유전적으로 변성된 동물을 당업자에게 공지된 어떠한 방법에 의해서도 생산할 수 있으며, 이러한 방법으로는 선택적 번식, 핵 전이, 난모세포, 정자, 접합체, 또는 난할구로의 DNA 도입, 또는 배아줄기세포의 사용에 의한 것 등이 포함되며, 이에 제한되지는 않는다.
일부 구체예에서, 유전적 변성은 목적하는 세트의 유전적 변성(또는 단일 유전적 변성)을 가지는 한 무리의 동물을 형성하기 위해 함께 사육된 동물에서 확인할 수 있다. 그의 후대에서 상이한 또는 동일한 세트의 유전적 변성(또는 단일 유전적 변성)을 생산하기 위해 후대를 더 사육할 수 있다. 목적하는 유전적 변성을 가진 동물에 대한 이러한 사육 주기는 원하는 동안 계속할 수 있다. 본 내용에서 "무리"란 시간이 지남에 따라 생산된, 동일하거나 상이한 유전적 변성을 가진 동물의 복수 세대를 포함할 수 있다. "무리"는 또한 동일하거나 상이한 유전적 변성을 가진 단일 세대의 동물을 지칭할 수 있다.
(예를 들면, 제한적인 것은 아니나 상동성 재조합에 의해)유전적 변성에 유용한 세포는, 예를 들면 상피 세포, 신경 세포, 표피 세포, 각질 세포, 조혈 세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 림프구(B 및 T 림프구), 적혈구, 대식 세포, 단핵구, 단핵 세포, 섬유아세포, 심근 세포, 및 기타 섬유 세포 등이다. 또한, (예를 들면, 제한적인 것은 아니나 핵 전이에 의해)유전적으로 변성된 동물을 생산하는데 사용되는 세포는 상이한 기관, 예를 들면 피부, 폐, 췌장, 간, 위, 장, 심장, 생식기관, 방광, 신장, 요도 및 기타 비뇨 기관 등에서 얻어질 수 있다. 세포는 체세포 또는 생식세포를 포함하여, 신체의 어떠한 세포 또는 기관에서도 얻을 수 있다.
또한, 유전적으로 변성될 수 있는 동물 세포는 다양한 다른 기관 및 조직으로부터 얻어질 수 있으며, 예를 들면 제한적인 것은 아니나 피부, 간충조직, 폐, 췌장, 심장, 장, 위, 방광, 혈관, 신장, 요도, 생식기관, 및 배아, 태아 또는 성체 동물의 전체 또는 일부의 분해물이다. 본 발명의 일 구체예에서, 세포는, 비제한적으로 상피 세포, 섬유아세포, 신경 세포, 각질 세포, 조혈 세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 림프구 (B 및 T), 대식세포, 단핵구, 단핵 세포, 심근 세포, 다른 근육 세포, 과립막 세포, 난구 세포, 표피 세포, 내피 세포, 랑게르한스섬 세포, 혈액 세포, 혈액 전구체 세포, 골 세포, 뼈전구체 세포, 신경줄기세포, 원시줄기세포, 성체줄기세포, 간엽줄기세포, 간세포, 각질 세포, 제정맥 내피 세포, 대동맥 내피 세포, 미세혈관 내피 세포, 섬유아세포, 간 별(liver stellate) 세포 세포, 대동맥 평활근 세포, 심근세포, 뉴런, 쿠퍼(Kupffer) 세포, 평활근 세포, 슈반(Schwann) 세포, 및 상피 세포, 적혈구, 혈소판, 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 호염구, 지방세포, 연골세포, 췌장섬 세포, 갑상선 세포, 부갑상샘 세포, 이하선 세포, 종양 세포, 신경교 세포, 성상교 세포, 적혈구 세포, 백혈구 세포, 대식세포, 상피 세포, 체세포, 뇌하수체 세포, 부신 세포, 털 세포, 방광 세포, 신장 세포, 망막 세포, 막대 세포, 원추 세포, 심장 세포, 페이스메이커(pacemaker) 세포, 비장 세포, 항원표출세포, 메모리 세포, T 세포, B-세포, 형질 세포, 근육 세포, 난소 세포, 자궁 세포, 전립선 세포, 질 상피 세포, 정자 세포, 고환 세포, 생식 세포, 알 세포, 라이디히(leydig) 세포, 세관주위(peritubular) 세포, 세프톨리(sertoli) 세포, 루테인 세포, 자궁경부세포, 자궁내막 세포, 유방 세포, 여포 세포, 점막 세포, 섬모 세포, 비케라틴화 상피 세포, 케라틴화 상피 세포, 폐 세포, 배상 세포, 원통 상피 세포, 편평 상피 세포, 뼈세포, 조골세포, 및 파골세포로 구성되는 군에서 선택될 수 있다. 선택적 일 구체예에서, 배아줄기세포가 사용될 수 있다. 배아줄기세포주를 사용하거나 또는 배아줄기세포를 돼지류 동물과 같은 숙주로부터 새롭게 얻을 수 있다. 세포는 적절한 섬유아세포 공급체 층에서 배양하거나 백혈병 억제인자(LIF)의 존재 하에 배양할 수 있다.
배아줄기세포는 바람직한 생식 세포 종류이며, 배아줄기세포주가 사용되거나 배아줄기세포가 돼지류 동물 등의 숙주로부터 새롭게 얻어질 수 있다. 세포는 적절한 섬유아세포 공급체 층에서 배양하거나 백혈병 억제인자(LIF)의 존재 하에 배양할 수 있다.
특히 관심있는 세포는, 다른 계통 중에서 줄기세포, 예를 들면, 조혈모세포, 배아줄기세포, 간엽 줄기 세포, 랑게르한스섬, 도파민을 분비할 수 있는 부신속질 세포, 조골세포, 파골세포, 상피 세포, 내피 세포, 백혈구, 예를 들면 B- 및 T-림프구, 골수단구 세포 등, 뉴런, 신경교 세포, 신경절 세포, 망막 세포, 간 세포, 예를 들면 간 세포, 골수 세포, 각질 세포, 모낭세포 및 근아세포(근육)이다.
특정한 구체예에서, 세포는 섬유아세포, 또는 섬유아세포와 구별할 수 없는 형태학 또는 표현형을 가지거나 세포노화전 수명이 적어도 10일, 또는 적어도 12일 또는 적어도 14일 또는 적어도 18일 또는 적어도 20일이거나 상동성 재조합 및 비세포노화 핵의 핵전이를 하는데 충분한 수명을 가지는 섬유아세포 유사 세포일 수 있으며; 특이적 일 구체예에서, 세포는 태아 섬유아세포일 수 있다. 섬유아세포는 발달 태아 및 성체 동물에서 대량으로 얻어질 수 있기 때문에 적합한 체세포 종류이다. 이러한 세포는 급속한 배가시간으로 시험관 내에서 용이하게 증식될 수 있고 유전자 표적화 방법에 사용하기 위해 클론증식할 수 있다. 사용될 세포는 동물 태아에서 입수하거나, 또는 신생아 또는 성체 동물에서 기원할 수 있다. 세포는 성숙 또는 미성숙, 분화 또는 미분화 모두 가능하다.
상동 재조합
상동 재조합은 내생 유전자의 부위특이적 변성을 가능하게 하여 신규한 변화가 게놈 내에 가공될 수 있다. 상동 재조합에서 제1 단계는 DNA 가닥 교환이며, 이것은 DNA 듀플렉스와 상보성 서열을 함유하는 적어도 하나의 DNA 가닥이 짝지음(pairing)하여 헤테로듀플렉스 DNA를 함유하는 중간체 재조합 구조를 형성하는 것과 연관된다.(예를 들면, Radding, C. M. (1982) Ann. Rev. Genet. 16: 405; U.S. Pat. No. 4,888,274 참조). 헤테로듀플렉스 DNA는, 예를 들면 단일 상보성 가닥이 DNA 듀플렉스에 침윤한, 3개 DNA 가닥을 함유하는 트리플렉스 형태를 포함하여 몇 가지 형태를 취할 수 있고(Hsieh et al. (1990) Genes and Development 4: 1951; Rao et al., (1991) PNAS 88:2984)), 2개의 상보성 DNA 가닥이 DNA 듀플렉스와 쌍을 이루면 전통적인 Holliday 재조합 결합 또는 카이 구조가 형성(Holliday, R. (1964) Genet. Res. 5: 282)되거나, 더블-D 루프가 형성될 수 있다("Diagnostic Applications of Double-D Loop Formation"미국 특허출원 제 07/755,462호, 1991년 9월 4일 출원). 일단 형성되면, 헤테로듀플렉스 구조는 가닥 분리와 교환에 의해 풀려서 침습 DNA 가닥의 전부 또는 일부가 수용체 DNA 듀플렉스에 이어져서 수용체 DNA 듀플렉스의 세그먼트를 첨가하거나 대체한다. 선택적으로, 헤테로듀플렉스 구조는 유전자 전환을 일으킬 수 있으며, 여기에서 침습 가닥의 서열은 잘못 짝지어진 염기의 복구에 의해 침습 가닥을 템플레이트로 사용하여 수용체 DNA 듀플렉스에 전달된다(Genes, 3rd Ed. (1987) Lewin, B., John Wiley, New York, N.Y.; Lopez et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 5643). 분리와 재결합의 메카니즘에 의해서든지 또는 유전자 전환의 메카니즘에 의해서든지 상동으로 짝지어진 결합에서 헤테로듀플렉스 DNA의 형성은 하나의 DNA 분자에서 다른 DNA qs자로의 유전적 서열 정보 전이를 제공할 수 있다.
DNA 분자들 간의 유전적 서열정보를 전달하는 상동 재조합(유전자 전환 및 고전적 가닥 분리/재결합)의 작용은 표적화된 상동 재조합이 유전공학 및 유전자 조작의 강력한 방법이 되게 한다.
상동 재조합에서, 유입 DNA는 실질적으로 상동인 DNA 서열을 함유하는 게놈의 부위와 상호작용하여 통합(integration)된다. 비상동성 ("랜덤" 또는 "불법 (illicit)") 통합에서 유입 DNA는 게놈 중의 상동성 서열에서 발견되지 않지만, 다수의 가능한 위치중 1개에 있어서 어디서나 통합된다. 일반적으로, 고등 진핵세포를 이용한 연구에 의해, 상동 재조합의 빈도는 랜덤 통합화의 빈도보다 훨씬 적은 것으로 판명되었다. 이들 빈도의 비율은 "유전자 표적화"에 대해서는 직접적 관계를 지니고, 이것은 상동 재조합 (즉, 외인성 "표적화 DNA"와 게놈 중의 상응하는 "표적 DNA" 사이의 재조합)에 의한 통합에 의존한다. 본 발명은 유전자를 불활성화하거나 상기한 세포들과 같은 세포 내에서 유전자를 도입 및 상향조절 또는 활성화하기 위해 상동 재조합을 사용할 수 있다. DNA는 적어도 유전자 일부를 특정 위치에 포함하여, 원래 유전자의 적어도 한 카피, 임의로 두 카피에 변경(alteration)을 도입하여 기능성 유전자 생성물의 발현을 억제할 수 있다. 이러한 변경은, 삽입, 결실, 대체, 돌연변이 또는 이들의 조합일 수 있다. 변경이 불황성화되는 유전자의 한 카피에만 도입될 경우, 표적 유전자의 돌연변이되지 않은 단일 카피를 가지는 세포가 증식되어 제2 표적화 단계를 수행할 수 있으며, 여기에서 변경은 제1 변경과 동일하거나 다를 수 있고, 일반적으로는 다르며, 결실 또는 치환을 포함하고 원래 도입된 변경의 적어도 일부와 오버랩할 수 있다. 이러한 제2 표적화 단계에서, 상동성의 동일한 가지를 가지지만 상이한 포유동물 선택성 마커를 포함하는 표적 벡터를 사용할 수 있다. 얻어진 형질전환체를 기능성 표적 항원 부재에 대하여 스크리닝하고 세포의 DNA를 추가로 스크리닝하여 야생형 표적 유전자의 부재를 보장할 수 있다. 선택적으로, 표현형에 대한 동형접합성을 돌연변이에 대해 이형접합성인 숙주를 사육하여 얻을 수 있다.
많은 문헌들에서 포유동물 세포에서의 상동 재조합 사용을 기술하고 있다. 이러한 문헌의 예로는 Kucherlapati et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3153-3157; Kucherlapati et al. (1985) Mol. Cell. Bio. 5:714-720; Smithies et al. (1985) Nature 317:230-234; Wake et al. (1985) Mol. Cell. Bio. 8:2080-2089; Ayares et al. (1985) Genetics 111:375-388; Ayares et al. (1986) Mol. Cell. Bio. 7:1656-1662; Song et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6820-6824; Thomas et al. (1986) Cell 44:419-428; Thomas and Capecchi, (1987) Cell 51: 503-512; Nandi et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3845-3849; and Mansour et al. (1988) Nature 336:348-352; Evans and Kaufman, (1981) Nature 294:146-154; Doetschman et al. (1987) Nature 330:576-578; Thoma and Capecchi, (1987) Cell 51:503-512; Thompson et al. (1989) Cell 56:316-321 등이 있다.
랜덤 삽입
일 구체예에서, 형질전환 서열을 코딩하는 DNA는 세포의 염색체에 무작위로 삽입될 수 있다. 무작위 통합은 당업자들에게 알려진 세포에 DNA를 도입하는 어떠한 방법에 의해서도 가능하다. 예를 들면, 제한적인 것은 아니나 전기천공법, 초음파천공법(sonoporation), 유전자 총의 사용, 리포(lipo)형질주입, 인산칼슘 형질주입, 덴드리머(dendrimer) 사용, 미세주사, 아데노바이러스를 포함하는 바이러스 벡터, AAV 및 레트로바이러스 벡터, 및 그룹 II 리보자임 등이다. 일 구체예에서, 전이유전자 서열을 코딩하는 DNA가 리포터 유전자를 포함하도록 설계하여 전이유전자 또는 그의 발현생성물의 존재를 리포터 유전자의 활성화에 검출할 수 있다. 리포터 유전자는 당업계에서 알려진 것을 사용할 수 있으며, 예를 들면 상기한 바와 같다. 리포터 유전자가 활성화된 이러한 세포를 세포 배양물에서 선택하여 전이유전자를 포함하는 세포를 선택할 수 있다. 일 구체예에서, 전이유전자를 코딩하는 DNA를 전기천공법으로 세포에 도입할 수 있다. 다른 구체예에서, DNA를 리포펙션, 감염 또는 형질변환에 의해 세포에 도입할 수 있다. 일 구체예에서, 전기천공법 및/또는 리포펙션을 사용하여 섬유아세포를 형질주입시킬 수 있다. 특정한 구체예에서, 형질주입된 섬유아세포를 핵 전이를 위한 핵 공여체로 사용하여 이하에 설명되고 당업계에서 알려진 바와 같이 형질전환 동물을 생산할 수 있다.
리포터 유전자가 존재하는 세포는 FACS로 분류하여 세포 개체군을 증가시켜서 목적하는 형질유전자를 코딩하는 DNA를 포함하는 세포를 높은 비율로 얻을 수 있다. 다른 구체예에서, FACS-분류된 세포는 이후에 일정 기간, 예를 들면 12, 24, 36, 48, 72, 96 시간 이상, 또는 DNA를 통합할 수 있는 기간 동안 배양하여 안정한 형질주입된 세포 개체군을 얻을 수 있다.
형질전환 동물을 생산하기 위한 벡터
핵산을 표적으로 하는 벡터 구조물을 세포에서 상동 재조합을 수행하기 위해 설계할 수 있다. 일 구체예에서, 표적화 벡터는 "폴리(A) 트랩"을 사용하여 설계된다. 프로모터 트랩과는 달리, 폴리(A) 트랩 벡터는 표적 세포(즉, 섬유아세포 또는 ES 세포)에서 발현되지 않는 것들을 포함하여 광범위한 유전자를 캡쳐한다. 폴리A 트랩 벡터는 폴리A 시그널을 결실한 선택가능한 마커 유전자의 발현을 작동하는 구성 프로모터를 포함한다. 폴리A 시그널을 대체하는 것은 하부 엑손에 연결(splice)하도록 설계된 스플라이스 공여체 부위이다. 이러한 전략에서, 선택가능한 마커 유전자의 mRNA는 표적 세포에서 그의 발현상태에 상관없이 내인성 유전자의 폴리A 시그널 트랩핑에 따라 안정화될 수 있다. 일 구체예에서, 표적 벡터는 폴리아네닐레이션의 시그널이 결핍된 선택가능한 마커를 포함하여 구성된다.
이러한 표적 벡터는 포유동물 세포에 적합한 방법, 예를 들면 제한적인 것은 아니나 형질주입, 형질전환, 바이러스 매개 형질도입 또는 바이러스 벡터를 사용한 감염 등에 의해 도입될 수 있다. 일 구체예에서, 표적 벡터는 3' 재조합 가지와 목적하는 게놈 서열과 상동인 5' 재조합 가지(즉, 플랭킹 서열)를 포함할 수 있다. 3'과 5' 재조합 가지는 이들이 게놈 서열 중 적어도 하나의 작용영역의 3' 말단과 5' 말단을 플랭킹하도록 설계할 수 있다. 작용영역의 표적화는 이것을 불활성화할 수 있으며, 그 결과 세포가 기능성 단백질을 생산할 수 없게 한다. 다른 구체예에서, 상동성 DNA 서열은 하나 이상의 인트론 및/또는 엑손 서열을 포함할 수 있다. 핵산 서열뿐만 아니라, 발현 벡터는 마커 서열, 예를 들면 증강된 Green Fluorescent Protein (eGFP) 유전자 서열, 개시 및/또는 인핸서 서열, 폴리 A-테일 서열, 및/또는 원핵 및/또는 진핵 숙주 세포에서 구조물의 발현에 제공하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 선택가능한 마커는 5'와 3' 재조합 가지 서열 사이에 위치할 수 있다.
세포의 표적화된 위치는 DNA를 세포에 삽입하여 변성할 수 있고, 여기에서 DNA는 표적 위치에 대해 상동성을 가지며 마커 유전자를 포함하여 통합된 구조를 포함하는 세포를 선택할 수 있다. 표적 벡터 내의 상동성 DNA는 염색체 DNA와 표적 위치에서 재조합할 것이다. 마커 유전자는 상동성 DNA 서열에 의해 양쪽, 즉 3' 재조합 가지와 5' 재조합 가지에 플랭크될 수 있다. 표적화 벡터를 제조하는 방법은 선행기술(예를 들면, Dai et al., Nature Biotechnology 20: 251-255, 2002; PCT 국제공개 WO 00/51424 참조)에 기술되어 있다.
다양한 효소들이 외래 DNA의 숙주 게놈 내로의 삽입을 촉매할 수 있다. 바이러스 인티그라제(integrase),트랜스포사제 및 부위특이적 리컴비나제가 바이러스 게놈, 트랜스포손(transposon) 또는 박테리오파지의 숙주 게놈 내로의 통합을 매개한다. 이러한 특성을 가지는 효소들의 대규모 집합물을 다양한 공급원으로부터 유도할 수 있다. 레트로바이러스는, 예를 들면 게놈의 상대적 단순성, 사용 및 숙주 세포 게놈으로 통합하는 능력의 용이성, 형질도입된 세포 또는 그의 후대에서 장기간의 전이유전자 발현 등과 같은 여러가지 유동한 특징을 갖추고 있다. 그러므로, 이들은 수많은 유전자 요법 전략에서 사용되고 있다. Lentivirus 벡터를 기초로 하는 벡터는 sdeno-결합 바이러스를 가지기 때문에 유전자 요법과 전이유전자 적용을 위한 주목되는 캔디데이트이며, 이것은 포유동물 세포에서 아데노바이러스, 단순헤르페스 바이러스 또는 사람 거대세포 바이러스와 같은 헬퍼 바이러스와 함께 동시 복제되는 작은 DNA 바이러스(파라보바이러스(parvovirus))이다. 바이러스 게놈은 원래 (적어도)7개의 상이한 폴리펩티드가 선택적 스플라이싱과 선택적 프로모터 사용으로 유도된 2개 ORF(비구조 단백질 rep와 구조 단백질 cap)만을 포함한다. 헬퍼 바이러스의 존재 하에서, rep 단백질은 AAV 게놈의 복제를 매개한다. 통합, 및 그에 따른 잠재 바이러스 감염은 헬퍼 바이러스가 없을 때 일어난다. 트랜스포손 또한 주목된다. 이것은 다양한 개체에서 발견할 수 있는 이동성 DNA 세그먼트이다. 활성 트랜스포손이 수많은 원핵 시스템과 곤충에서 발견되지만, 기능성 자연 트랜스포손은 척추동물에 존재하지 않는다. Drosophila P 성분 트랜스포손은 여러 해 동안 게놈 공학도구로 사용되고 있다. 슬리핑 뷰티 트랜스포손을 연어에서 발견되는 비기능성 트랜스포손 카피로부터 구축하였으며 원핵 또는 곤충 트랜스포손 보다 포유동물에서 훨씬 더 활성적이다. 부위특이적 재조합효소는 제한된 정도의 서열 상동성만을 가지는 DNA 세그먼트들 간 DNA 가닥 교환을 촉매하는 촉매이다. 이들은 20 내지 200 뉴클레오티드 길이인 인지 서열과 결합하고, DNA 골격을 분해하며, 관련된 2개 DNA 이중나선을 교환하여 DNA를 재결찰한다. 일부 부위특이적 재조합 시스템에서, 단일 폴리펩티드는 이러한 반응 모두를 수행하는데 충분한 반면, 다른 재조합효소는 이러한 작업을 수행하기 위해 다양한 수의 보조 단백질을 필요로 한다. 부위특이적 재조합효소는 현저한 생화학적 특성을 가지는 2개의 단백질군, 즉 티로신 재조합효소(DNA가 티로신 잔기에 공유결합)와 세린 재조합효소(세린 잔기에서 공유결합 발생)로 분류할 수 있다. 게놈 변성방법에 가장 많이 사용되는 효소는 Cre (E. coli 박테리오파지 P1에서 유도된 티로신 재조합효소)과 fC3l 인티그라제 (스트렙토마이세스(Streptomyces) 파지 fC31에서 유도된 세린 재조합효소)이다. 다른 몇가지 박테리오파지에서 유도된 부위특이적 재조합효소(예를 들면, Flp, 람다 인티그라제, 박테리오파지 HK022 재조합효소, 박테리오파지 R4 인티그라제 및 파지 TP901-1 인티그라제)를 포유동물 게놈에 안정한 유전자 삽입을 매개하는데 성공적으로 사용하였다. 최근, 부위특이적 재조합효소는 스트렙토마이세스 박테리오파지에서 정제되고 있다. fC31 재조합효소는 레솔바제(resolvase)류의 하나로, 파지 통합을 매개한다. 이 과정에서 박테리오파지 attP 부위는 박테리아 게놈 내의 상응하는 attB 부위와 재조합한다. 크로스오버가 2개의 부위, attL 및 attR을 생성하고, 이들은 보조 단백질이 없는 경우에 더 이상 재조합효소 작용의 표적물이 아니다. 이 반응은 또한 포유동물 세포에서 일어날 수 있으므로 치료 유전자의 부위특이적 통합을 매개하기 위해 사용할 수 있다. 티로신 재조합효소의 부위특이성은 촉매 도메인과 DNA 인지 도메인이 밀접하게 섞여 있기 때문에 직접적 단백질 조작에 의한 변성이 어렵다. 그러므로, 활성 손실에 의해 특이성의 변화가 자주 수반된다. 세린 재조합효소는 보다 용이하게 가공처리할 수 있고, Tn3 레솔바제의 과활성 유도체는 자연 DBD를 사람 아연-핑거 전사인자 Zif268의 아연-핑거 도메인으로 교환하여 변성된다. 얻어진 키메릭 단백질, Z-레솔바제의 DNA 부위특이성은 Zif268과 스위치되었다. 아연-핑거 단백질은 시험관내 단백질 진화에 의해 변성되어 임의의 DNA 서열을 인지할 수 있으므로, 이 방법은 게놈의 정교한 위치에 치료 유전자를 통합할 수 있는 키메릭 재조합효소의 개발을 가능하게 할 수 있다. 재조합을 증가시키거나 매개하는 방법으로는 부위특이적 재조합과 상동 재조합의 조합, AAV-벡터 매개 재조합 및 아연-핑거 매개 재조합이 있다(참조: Geurts et.al., Science, 325: 433, 2009).
여기에서 사용된 "벡터"라는 용어는 유용한 생물학적 또는 생화학적 특성을 삽입된 핵산에 제공하는 핵산 분자(바람직하게 DNA)를 지칭한다. 본 발명에 따른 "발현벡터"는 벡터를 세포 내에 형질전환할 때 벡터에 삽입 또는 클론된 하나 이상의 분자의 발현을 강화할 수 있는 벡터를 포함한다. 이러한 발현벡터의 예로는, 파지, 복제기점염기서열(ARS), 동원체, 및 시험관 내 또는 세포 내에서 복제하거나 복제될수 있는, 또는 동물 세포 내의 원하는 위치에 목적하는 핵산 세그먼트를 전달할 수 있는 기타 서열 등이다. 본 발명에 유용한 발현벡터는 염색체-, 에피솜- 및 바이러스 유도 벡터, 예를 들면 박테리아 플라스미드 또는 박테리오파지, 및 이들의 조합물로부터 유도된 벡터, 예를 들면 코스미드(cosmid)와 파지미드(phagemid) 또는 바이러스 포함 벡터, 예를 들면 아데노바이러스, AAV, 렌티바이러스 등이다. 벡터는 벡터의 필수적인 생물학적 기능을 상실하지 않는 확인가능한 방법으로 서열을 절단하고, 핵산 절편을 그의 복제 및 클로닝을 일으키기 위해 스플라이싱할 수 있는 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제 인식부위를 가질 수 있다. 벡터는 또한, 예를 들면 PCR을 위한 프라이머 부위, 전사 및/또는 번역 개시 및/또는 조절 부위, 재조합 시그널, 리플리콘, 선택가능한 마커 등을 제공할 수 있다. 분명히, 상동 재조합, 전위 또는 제한효소의 사용이 필요하지 않은 목적하는 핵산 절편을 삽입하는 방법(예를 들면, 제한적인 것은 아니나, PCR 절편의 UDG 클로닝(미국 특허 제5,334,575호), TA Cloning® 브랜드 PCR 클로닝(Invitrogen Corp., Carlsbad, Calif.))을 적용하여 핵산을 본 발명에 따라 사용되는 벡터에 클론할 수 있다.
표적화된 위치의 세포 동형성은 DNA를 세포에 삽입하여 만들 수 있으며, 여기에서 DNA는 표적 위치에 대해 상동성을 가지며 마커 유전자를 포함하여 통합된 구조물을 포함하는 세포를 선택할 수 있다. 표적 벡터 내의 상동성 DNA는 표적 위치의 염색체 DNA와 재조합할 것이다. 마커 유전자는 상동 DNA 서열에 의한 양쪽, 3' 재조합 가지와 5' 재조합 가지에 플랭킹될 수 있다. 표적 벡터를 구성하는 방법은 문헌[Dai et　al. (2002) Nature Biotechnology 20: 251-255; WO 00/51424, Figure 6; and Gene Targeting : A Practical Approach . Joyner, A. Oxford University Press, USA; 2nd ed. February 15, 2000]에 기술되어 있다.
다양한 구조물이 표적 위치에서 상동 재조합을 준비할 수 있다. 일반적으로 구조물은 적어도 25 bp, 50 bp, 100 bp, 500 bp, 1kbp, 2 kbp, 4 kbp, 5 kbp, 10 kbp, 15 kbp, 20 kbp, 또는 50 kbp의 표적 위치화의 서열 상동성을 포함할 수 있다.
표적 DNA 서열의 상동성 범위 결정에 있어서, 예를 들면 표적 위치의 크기, 서열의 입수가능성, 표적 위치에서의 이중 크로스오버의 상대적 효능 및 표적 서열과 다른 서열의 유사성 등 많은 것들이 고려될 수 있다. 표적화 DNA는 DNA가 목적하는 서열 변성이 변성될 게놈 내 상응하는 표적 서열과 실질적으로 동질유전자 플랭킹하고 있는 서열을 포함할 수 있다. 실질적 동질유전자형 서열은 상응하는 표적 서열(목적하는 서열 변성 제외)과 적어도 약 95%, 97-98%, 99.0-99.5%, 99.6-99.9%, 또는 100% 일치할 수 있다. 표적화 DNA와 표적 DNA는 바람직하게 100% 동일한 적어도 약 75, 150 또는 500 염기쌍 DNA의 스트레치를 공유할 수 있다. 따라서, 표적화 DNA는 표적화되는 세포와 밀접하게 연관된 세포에서 유도되거나; 표적화 DNA는 표적화되는 것과 같은 세포주 또는 동물의 세포에서 유도될 수 있다.
적합한 선택가능한 마커 유전자는, 제한적인 것은 아니나 임의의 배지 물질에서 성장하는 능력을 제공하는 유전자, 예를 들면 HAT 배지 (하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘)에서 성장하는 능력을 제공하는 tk 유전자(티미딘 키나제) 또는 hprt 유전자(하이포잔틴 포스포리보실트랜스퍼라제); MAX 배지(마이코페놀산, 아데닌 및 잔틴)에서 성장가능한 박테리아 gpt 유전자 (구아닌/잔틴 포스포리보실트랜스퍼라제)이다.[Song et　al. (1987) Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 84:6820-6824 참조] [Sambrook et　al. (1989) Molecular Cloning--A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., see chapter 16 참조] 선택가능한 마커의 다른 예는: 항생제와 같은 화합물에 대한 내성을 제공하는 유전자, 선택된 물질에서 성장하는 능력을 제공하는 유전자, 녹색형광단백질, 강화된 녹색형광단백질(eGFP) 등의 루미네센스와 같은 검출할 수 있는 시그널을 생산하는 단백질을 코딩하는 유전자이다. 이러한 다양한 마커들은 공지되어 있거나 입수할 수 있으며, 예를 들면 네오마이신 내성 유전자 (neo) (Southern, P., and P. Berg, (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:327-341); 및 하이그로마이신 내성 유전자(hyg) (Nucleic Acids Research 11:6895-6911 (1983), and Te Riele et al. (1990) Nature 348:649-651)와 같은 항생제 내성 유전자가 있다. 본 발명의 방법에 유용한 추가의 리포터 유전자로는, 예를 들면 아세토하이드록시애시드 신타제(AHAS), 알칼린 포스파타제(AP), 베타 갈락토시다제(LacZ), 베타 글루코니다제(GUS), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), 그린형광단백질 (GFP), 적색형광단백질(RFP), 황색형광단백질(YFP), 시안형광단백질(CFP), 호오스래디쉬 퍼옥시다제(HRP), 루시퍼라제(Luc), 노팔린 신타제(NOS), 옥토핀 신타제(OCS), 및 이들의 유도체가 있다. 암피실린, 블레오마이신(bleomycin), 클로람페니콜, 겐타마이신, 하이그로마이신, 카나마이신, 린코마이신, 블라스티시딘(blasticidin), 제오신(zeocin), 메토트렉세이트, 포스피노트리신(phosphinothricin), 퓨로마이신, 및 테트라사이들린에 대해 내성을 제공하는 복수의 선택가능한 마커를 입수할 수 있다. 리포터 유전자의 억제를 측정하는 방법이 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들면 형광측정법(예를 들면, 형광분광학, Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS), 형광현미경검사), 항생제 내성 측정 등이며 이에 제한되지는 않는다.
선택 마커의 조합을 사용할 수 있다. 마커의 조합을 위해, HSV-tk 유전자를 클론하여 표적화 DNA의 외부에 있게 할 수 있다(필요하다면, 또다른 선택가능한 마커를 반대 플랭크에 위치시킬 수 있다). DNA 구조물을 표적되는 세포에 도입한 후, 세포를 적절한 항생제에서 선택할 수 있다. 선택 마커를 또한 네가티브 선택을 위해 사용할 수 있다. 네가티브 선택 마커는 일반적으로 발현이 그자체로 독성이거나, 단순헤르페스 바이러스 타입 I 티미딘 키나제(HSV-tk) 또는 디프테리아 톡신 A와 같은 독성 대사물질을 유발하는 촉매를 생산하기 때문에 이들이 발현되는 사포를 사멸시킨다. 일반적으로, 네가티브 선택 마커는 표적화 벡터에 결합되어 정밀한 재조합 후에 떨어진다. 마찬가지로, GFP와 같은 일반적인 선택 마커가, 예를 들면 FACS 분류를 사용하여 네가티브 선택에 사용될 수 있다.
결실은 적어도 약 50 bp, 보다 일반적으로 적어도 약 100 bp, 일반적으로 약 20 kbp 이하이며, 결실은 일반적으로 엑손의 일부 또는 하나 이상의 엑손, 인트론의 일부 또는 하나 이상의 인트론을 포함하는 코딩 영역의 적어도 일부를 포함하고, 플랭킹 비코딩 영역, 특히 5 -비코딩 영역(전사조절영역)의 일부를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 그러므로, 상동영역은 코딩 영역을 지나 5'-비코딩 영역 또는 선택적으로 3-비코딩 영역으로 확장될 수 있다. 삽입은 일반적으로 10 kbp를 초과하지 않고, 일반적으로 5 kbp를 초과하지 않고, 일반적으로 적어도 50 bp이며, 보다 일반적으로 적어도 200 bp일 수 있다..
상동성 영역은 돌연변이를 포함할 수 있고, 여기에서 돌연변이는 프레임 이동 준비 또는 주요 아미노산 변경에서 표적 유전자를 추가로 활성화하거나, 이 돌연변이가 역기능 대립유전자 등을 정정할 수 있다. 일반적으로 돌연변이는 상동성 플랭킹 서열의 약 5%를 넘지않는 미세한 변화 또는 엑손의 활성부위의 포인트 돌연변이와 같은 단일 뉴클레오티드 변화일 수 있다. 유전자의 돌연변이가 필요한 경우, 마커 유전자는 전사 시에 표적 유전자를 절단하도록 인트론에 삽입할 수 있다.
표적 DNA 서열의 상동성 범위 결정에 있어서, 예를 들면 표적 위치의 크기, 서열의 입수가능성, 표적 위치에서의 이중 크로스오버의 상대적 효능 및 표적 서열과 다른 서열의 유사성 등 많은 것들이 고려될 수 있다. 표적화 DNA는 DNA가 목적하는 서열 변성이 변성될 게놈 내 상응하는 표적 서열과 실질적으로 동질유전자 플랭킹하고 있는 서열을 포함할 수 있다. 실질적 동질유전자형 서열은 상응하는 표적 서열(목적하는 서열 변성 제외)과 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%, 또는 95 내지 100%, 97-98%, 99.0-99.5%, 99.6-99.9%, 또는 100% 일치할 수 있다. 특정한 구체예에서, 표적화 DNA와 표적 DNA는 100% 동일한 적어도 약 75, 150 또는 500 염기쌍 DNA의 스트레치를 공유할 수 있다. 따라서, 표적화 DNA는 표적화되는 세포와 밀접하게 연관된 세포에서 유도되거나; 표적화 DNA는 표적화되는 것과 같은 세포주 또는 동물의 세포에서 유도될 수 있다.
구조물은 당업계에 알려진 방법에 따라 제조될 수 있으며, 다양한 절편을 함께 모아서, 적절한 벡터에 삽입하여 클론하고 분석한 다음, 목적하는 구조물이 얻어질 때까지 조작할 수 있다. 서열을 다양하게 변성시켜서 제한분석, 절단, 프로브의 확인 등을 할 수 있다. 필요하다면, 사일런트 돌연변이를 도입할 수 있다. 여러 단계에서, 제한분석(restriction analysis), 서열화, 폴리머라제 연쇄 반응으로의 증폭, 프라이머 복구, 시험관내 돌연변이 등을 적용할 수 있다.
구조물은 원핵복제시스템 등과 같은 박테리아 벡터, 예를 들면 E. coli가 인식할 수 있는 기원을 사용하여 구조물을 클론하고 분석할 수 있는 각 단계에서 제조할 수 있다. 삽입에 사용될 마커와 동일하거나 상이한 마커를 사용할 수 있고, 이것은 표적 세포에 도입하기 전에 제거할 수 있다. 일단 구조물을 함유하는 벡터가 완성되면, 박테리아 서열의 결실, 연장(linearization) 등에 의해 추가로 조작하여 상동 서열 내 짧은 결실을 도입할 수 있다. 최종 조작 후에 구조물을 세포에 도입할 수 있다.
DNA 또는 RNA 구조물이 숙주 세포에 유입되도록 하기 위해 사용할 수 있는 기술로는 칼슘 포스페이트/DNA 공침전, DNA의 핵내 미세주입, 전기천공법, 온전한 세포와의 박테리아 프로토플라스트 융합, 형질주입, 리포펙션, 감염, 입자충격, 정자 매개 유전자 전이 또는 당업자에게 알려진 다른 방법이 있다. DNA 또는 RNA는 단일가닥 또는 이중가닥이거나, 직선형 또는 고리형의, 이완 또는 초나선 DNA일 수 있다. 포유동물 세포를 형질주입하기 위한 다양한 방법들은 문헌[Keown et al., Methods in Enzymology Vol. 185, pp. 527-537 (1990)]을 참조할 수 있다.
이하의 벡터를 예로 들 수 있다: 박테리아: pBs, pQE-9 (Qiagen), phagescript, PsiXl74, pBluescript SK, pBsKS, pNH8a, pNHl6a, pNHl8a, pNH46a (Stratagene); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR54O, pRIT5 (Pharmacia). Eukaryotic: pWLneo, pSv2cat, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPv, pMSG, pSVL (Pharmiacia). 또한, 숙주에서 복제 및 생존할 수 있는 한, 다른 어떤 플라스미드와 벡터도 사용될 수 있다. 당업계에 알려진 벡터와 상업적으로 입수할 수 있는 벡터(및 변이체 또는 그의 유도체)는 본 발명에 따라 조작되어 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 하나 이상의 재조합부위를 포함할 수 있다. 이러한 벡터들은 다음 공급원으로부터 입수할 수 있다: 예를 들면, Vector Laboratories Inc., Invitrogen, Promega, Novagen, NEB, Clontech, Boehringer Mannheim, Pharmacia, EpiCenter, OriGenes Technologies Inc., Stratagene, PerkinElmer, Pharmingen, 및 Research Genetics. 주목할 만한 다른 벡터로는 진핵 발현벡터, 예를 들면 pFastBac, pFastBacHT, pFastBacDUAL, pSFV, 및 pTet-Splice (Invitrogen), pEUK-C1, pPUR, pMAM, pMAMneo, pBI101, pBI12l, pDR2, pCMVEBNA, 및 pYACneo (Clontech), pSVK3, pSVL, pMSG, pCH110, 및 pKK232-8 (Pharmacia, Inc.), p3'SS, pXT1, pSG5, pPbac, pMbac, pMC1neo, 및 pOG44 (Stratagene, Inc.), 및 pYES2, pAC360, pBlueBacHis A, B, 및 C, pVL1392, pBlueBacIII, pCDM8, pcDNA1, pZeoSV, pcDNA3 pREP4, pCEP4, 및 pEBVHis (Invitrogen, Corp.) 및 이들의 변이체 또는 유도체이다.
다른 벡터로는 pUC18, pUC19, pBlueScript, pSPORT, 코스미드, 파지미드, YAC's (효모 인공 염색체), BAC's (박테리아 인공 염색체), P1 (Escherichia coli phage), pQE70, pQE60, pQE9 (quagan), pBS 벡터, PhageScript 벡터, BlueScript 벡터, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene), pcDNA3 (Invitrogen), pGEX, pTrsfus, pTrc99A, pET-5, pET-9, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia), pSPORT1, pSPORT2, pCMVSPORT2.0 및 pSY-SPORT1 (Invitrogen) 및 이들의 변이체 또는 유도체가 있다. 또한, 바이러스 벡터로는, 예를 들면 렌티바이러스 벡터 (PCT 공개 WO03/ 059923; Tiscornia et al. PNAS 100:1844-1848 (2003) 참조)를 사용할 수 있다.
또다른 주목할 만한 벡터로는 pTrxFus, pThioHis, pLEX, pTrcHis, pTrcHis2, pRSET, pBlueBacHis2, pcDNA3.1/His, pcDNA3.1(-)/Myc-His, pSecTag, pEBVHis, pPIC9K, pPIC3.5K, pAO8lS, pPICZ, pPICZA, pPICZB, pPICZC, pGAPZA, pGAPZB, pGAPZC, pBlueBac4.5, pBlueBacHis2, pMelBac, pSinRep5, pSinHis, pIND, pIND(SP1), pVgRXR, pcDNA2.l, pYES2, pZErOl.l, pZErO-2.l, pCR-Blunt, pSE280, pSE380, pSE420, pVL1392, pVL1393, pCDM8, pcDNA1.1, pcDNA1.1/Amp, pcDNA3.1, pcDNA3.1/Zeo, pSe, SV2, pRc/CMV2, pRc/RSV, pREP4, pREP7, pREP8, pREP9, pREP 10, pCEP4, pEBVHis, pCR3.1, pCR2.1, pCR3.1 -Uni, 및pCRBac(Invitrogen); λExCell, λgt11, pTrc99A, pKK223-3, pGEX-1λT, pGEX-2T, pGEX-2TK, pGEX-4T-1, pGEX-4T-2, pGEX-4T-3, pGEX-3X, pGEX-5X-1, pGEX-5X-2, pGEX-5X-3, pEZZ18, pRIT2T, pMC1871, pSVK3, pSVL, pMSG, pCH110, pKK232-8, pSL1180, pNEO, 및 pUC4K (Pharmacia); pSCREEN-1b(+), pT7Blue(R), pT7Blue-2, pCITE-4abc(+), pOCUS-2, pTAg, pET-32L1C, pET-30LIC, pBAC-2cp LIC, pBACgus-2cp LIC, pT7Blue-2 LIC, pT7Blue-2, λSCREEN-1, λBlueSTAR, pET-3abcd, pET-7abc, pET9abcd, pET11abcd, pETl2abc, pET-14b, pET-15b, pET-16b, pET-17b-pET-l7xb, pET-19b, pET-20b(+), pET-21abcd(+), pET-22b(+), pET-23abcd(+), pET-24abcd(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-28abc(+), pET-29abc(+), pET-30abc(+), pET-31b(+), pET-32abc(+), pET-33b(+), pBAC-1, pBACgus-1, pBAC4x-1, pBACgus4x-1, pBAC-3cp, pBACgus-2cp, pBACsurf-1, plg, Signal plg, pYX, Selecta Vecta-Neo, Selecta Vecta-Hyg, 및 Selecta Vecta-Gpt (Novagen); pLexA, pB42AD, pGBT9, pAS2-1, pGAD424, pACT2, pGAD GL, pGAD GH, pGAD10, pGilda, pEZM3, pEGFP, pEGFP-1, pEGFP-N, pEGFP-C, pEBFP, pGFPuv, pGFP, p6xHis-GFP, pSEAP2-Basic, pSEAP2-Contral, pSEAP2-Promoter, pSEAP2-Enhancer, pβgal-Basic, pβgal-Control, pβgal-Promoter, pβgal-Enhancer, pCMV, pTet-Off, pTet-On, pTK-Hyg, pRetro-Off, pRetro-On, pIRES1neo, pIRES1hyg, pLXSN, pLNCX, pLAPSN, pMAMneo, pMAMneo-CAT, pMAMneo-LUC, pPUR, pSV2neo, pYEX4T-1/2/3, pYEX-S1, pBacPAK-His, pBacPAK8/9, pAcUW31, BacPAK6, pTriplEx, λgt10, λgt11, pWE15, 및 λTriplEx (Clontech); Lambda ZAP II, pBK-CMV, pBK-RSV, pBluescript II KS +/-, pBluescript II SK +/-, pAD-GAL4, pBD-GAL4 Cam, pSurfscript, Lambda FIX II, Lambda DASH, Lambda EMBL3, Lambda EMBL4, SuperCos, pCR-Scrigt Amp, pCR-Script Cam, pCR-Script Direct, pBS +/-, pBC KS +/-, pBC SK +/-, Phagescript, pCAL-n-EK, pCAL-n, pCAL-c, pCAL-kc, pET-3abcd, pET-11abcd, pSPUTK, pESP-l, pCMVLacI, pOPRSVI/MCS, pOPI3 CAT, pXT1, pSG5, pPbac, pMbac, pMC1neo, pMC1neo Poly A, pOG44, pOG45, pFRTβGAL, pNEOβGAL, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pRS413, pRS414, pRS4l5, 및 pRS4l6 (Stratagene)이 있다.
추가 벡터로는, 예를 들면 pPC86, pDBLeu, pDBTrp, pPC97, p2.5, pGAD1-3, pGAD10, pACt, pACT2, pGADGL, pGADGH, pAS2-1, pGAD424, pGBT8, pGBT9, pGAD-GAL4, pLexA, pBD-GAL4, pHISi, pHISi-1, placZi, pB42AD, pDG202, pJK202, pJG4-5, pNLexA, pYESTrp 및 이들의 변이체 또는 유도체가 있다.
프로모터
본 발명의 동물을 생산하기 위해 사용되는 벡터 구조물은 조절 서열, 예를 들면 서열에 작동적으로 연결되는 프로모터를 포함할 수 있다. 수많은 적합한 벡터와 프로모터가 당업자들에게 알려져 있으며 상업적으로 입수할 수 있다.
특이적 구체예에서, 본 발명은 전이유전자, 특히 면역조절제 또는 항응고제 전이유전자를 췌장 조직에서 발현하는 동물, 조직 및 세포를 제공한다. 발현을 특정한 조직에 대해 표적화하기 위해 동물을 췌장 유전자 발현에 특이적인 프로모터를 포함하는 벡터를 사용하여 개발한다.
일 구체예에서, 핵산 구조물은 발현될 전이유전자 서열에 작동적으로 연결된 조절 서열을 포함한다. 일 구체예에서, 조절 서열은 프로모터 서열일 수 있다. 일 구체예에서, 프로모터는 조절가능한 프로모터일 수 있다. 이러한 시스템에서, 약물은, 예를 들면 펩티드가 동물, 조직 또는 기관에서 발현되는지를 조절하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들면, 발현은 기관 또는 조직이 돼지의 일부라도 억제될 수 있지만, 돼지가 사람에게 세포 면역반응을 극복하는 기간 동안 이식되면 발현이 유발된다. 또한, 발현의 수준은 수용체 면역 시스템의 면역억제가 일어나지 않는 것을 보장하는 조절가능한 프로모터에 의해 제어될 수 있다. 조절가능한 프로모터 시스템은 다음 유전자 시스템에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다: 구리 등의 금속에 의해 유도할 수 있는 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터(Lichtlen and Schaffner, Swiss Med Wkly., 2001, 131 (45-46):647-52 참조); 테트라사이클린 조절 시스템(Imhof et　al., J Gene Med., 2000, 2(2):107-16 참조); 엑디손(ecdysone) 조절 시스템 (Saez et　al., Proc Natl Acad Sci U S A., 2000, 97(26):14512-7 참조); 사이토크롬 P450 유도성 프로모터, 예를 들면 CYP1A1 프로모터 (Fujii-Kuriyama et　al., FASEB J., 1992, 6(2):706-10 참조); 미페리스톤(mifepristone) 유도성 시스템 (Sirin and Park, Gene., 2003, 323:67-77 참조); 쿠마린 활성 시스템 (Zhao et　al., Hum Gene Ther., 2003, 14(17): 1619-29 참조); 마크롤리드(macrolide) 유도성 시스템 (라파마이신, 에리트로마이신, 클라리트로마이신(clarithromycin), 및 록시티로마이신(roxitiromycin)과 같은 마크롤리드 항생제에 반응) (Weber et　al., Nat Biotechnol., 2002, 20(9):901-7; Wang et　al., Mol Ther., 2003, 7(6):790-800 참조); 에탄올 유도 시스템 (Garoosi et　al., J Exp Bot., 2005, 56(416):163542; Roberts et　al., Plant Physiol., 2005, 138(3):1259-67 참조); 스트렙토그라민(streptogramin) 유도성 시스템 (Fussenegger et　al., Nat Biotechnol., 2000 18(11):1203-8 참조); 친전자체 유도성 시스템 (Zhu and Fahl, Biochem Biophys Res Commun., 2001, 289(1):212-9 참조); 및 니코틴 유도성 시스템 (Malphettes et　al., Nucleic Acids Res., 2005, 33(12):e107 참조).
특정한 구체예에서, 프로모터는 특히 항응고제 또는 면역억제제의 발현에서 조직 특이적 프로모터이다. 조직 특이적 프로모터는 가장 바람직하게 췌장 특이적 프로모터이다(Edlund et　al., Science, 1985, 230:912-916). 일 구체예에서, 조직 특이적 프로모터는 ins2 (Lomedico P et　al., Cell, 1979, 18:545; GenBank J00747 및 J00748이다.
다른 구체예에서, 인핸서 성분은 조직 특이적 방법으로 전이유전자의 발현 증가를 촉진하기 위해 핵산 구조물에서 사용된다. 인핸서는 유전자 전사의 효능을 대폭 변경하는 외부 성분이다(Molecular Biology of the Gene, Fourth Edition, pp. 708-710, Benjamin Cummings Publishing Company, Menlo Park, CA ⓒ1987). 특정한 구체예에서, pdx-1 인핸서 (IPF-1, STF-1, 및 IDX1로 알려짐(Gerrish K et　al., Mol. Endocrinol., 2004, 18(3): 533; Ohlsson et　al., EMBO J. 1993 Nov, 12(11):4251-9; Leonard et　al., Mol. Endocrinol., 1993, 7(10):1275-83; Miller et　al., EMBO J., 1994, 13(5):1145-56; Serup et　al., Proc Natl Acad Sci U S A., 1996, 93(17):9015-20; Melloul et　al., Diabetes., 2002, 51 Suppl 3:S320-5; Glick et　al., J Biol Chem., 2000, 275(3):2199-204; GenBank AF334615.))를 ins2 프로모터와 조합하여 전이유전자의 췌장 특이적 발현에 사용한다. 임의의 구체예에서, 동물은 전이유전자를 인핸서 성분과 조합하여 프로모터의 제어 하에 발현한다. 특정한 구체예에서, 동물은 췌장 특이적 프로모터 성분, 예를 들면 인슐린 프로모터를 포함하고, 추가로 인핸서 성분을 포함한다. 일부 구체예에서, 인핸서 성분은 PDX1이다. 특이적 구체예에서, 동물, 조직 또는 세포는 RIP 프로모터를 PDX1 인핸서와 조합하여 포함한다. 다른 구체예에서, 프로모터는 유비쿼터스 프로모터일 수 있다. 유비쿼터스 프로모터는 다음을 포함하며, 이에 한정되지는 않는다: CMV, SV40와 같은 바이러스 프로모터. 적합한 프로모터는 또한 베타-액틴 프로모터, 감마-액틴 프로모터, GAPDH 프로모터, H2K, 유비퀴틴 및 로사 프로모터.
형질전환 세포의 선택
일부 경우에, 형질전환 세포는 유전적 변성을 가지며, 이것은 세포 게놈 내로의 표적 전이유전자 삽입 또는 통합(즉, 상동 재조합에 의한)의 결과이다. 일부 경우에, 형질전환 세포는 유전적 변성을 가지며, 이것은 세포 게놈 내로의 비표적(랜덤) 통합의 결과이다. 세포는 적절하게 선택된 배지에서 세포를 동정하기 위해 성장시켜서 적절한 통합을 제공할 수 있다. 이 후, 목적하는 표현형을 나타내는 이러한 세포들을 제한분석, 전기영동, 써던(Southern) 분석, 폴리머라제 연쇄 반응 또는 당업계에 알려진 다른 기술을 사용하여 추가로 분석할 수 있다. 표적 유전자 부위에서 적절한 삽입을 나타내는 절편을 동정하여 (또는 랜덤 통합방법이 목적하는 결과를 생성하는, 비표적 적용에서) 상동 재조합(또는 목적하는 비표적 통합)이 발생하여 표적 유전자를 비활성화하거나 아니면 변성시킨 세포를 동정할 수 있다.
선택가능한 마커 유전자의 존재는 숙주 게놈에 표적 구조물의 통합을 구축한다. 목적하는 표현형을 나타내는 이러한 세포들은 다음으로 제한분석, 전기영동, 써던 분석, 폴리머라제 연쇄 반응 등에 의해 추가로 분석하여 상동 또는 비상동 재조합의 발생 여부를 확인하기 위해 DNA를 분석할 수 있다. 이것은 삽입물에 대한 프로브를 사용한 다음, 삽입물과 플랭킹하고 있는 5' 및 3' 영역을 구조물의 플랭킹 영역을 지나 연장되어 있는 유전자의 존재에 대해 서열화하거나, 결실이 도입된 경우 결실의 존재를 동정하여 측정할 수 있다. 구조물 내의 서열에 상보성이고 구조물과 표적 위치 외부의 서열에 대해 상동성인 프라이머를 또한 사용할 수 있다. 이 방법에서는 상동 재조합이 발생한 경우 상보성 사슬에 존재하는 프라이머 둘다를 가지는 DNA 듀플렉스만을 얻을 수 있다. 예를 들면, 프라이머 서열 또는 예상된 크기 서열의 존재를 입증하여 상동 재조합의 발생을 뒷받침한다.
상동 재조합 발생을 스크리닝하는데 사용되는 폴리머라제 연쇄 반응은 문헌[Kim and Smithies, (1988) Nucleic Acids Res. 16:8887-8903; and Joyner et　al. (1989) Nature 338:153-156]에 기술되어 있다.
표적화의 제1 라운드(또는 비표적화된(랜덤) 목적하는 위치로의 통합)에서 얻어진 세포주는 통합된 대립유전자에 대해 이형접합성일 가능성이 있다. 대립유전자가 둘다 변성된 동형접합성은 여러 방법으로 얻을 수 있다. 그 중 하나는 하나의 카피가 변성된 많은 세포를 생육한 다음, 이들 세포를 상이한 선택 마커를 사용하여 다른 라운드의 표적화(또는 비표적화된(랜덤) 통합)를 수행하는 것이다. 선택적으로, 동형접합체는 변성된 대립유전자에 이형접합성인 동물을 번식하여 얻을 수 있다. 일부의 경우에서, 2개의 상이한 변성 대립유전자를 가지는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 유전자 표적화(또는 랜덤 통합)의 연속 라운드에 의해서 또는 각각이 목적하는 변성 대립유전자 중 하나를 보유하는 이형접합체를 번식하여 얻을 수 있다. 임의의 구체예에서, 적어도 하나의 동물 요소는 특히 동형접합성 동물을 개발하기 위해 대립유전자에서 자발적으로 발생하는 돌연변이의 선택에 의해 유도된다. 임의의 구체예에서, 선택방법을 사용하여 매우 높은 농도의 선택제에 노출하여 이형접합성 세포로부터 상동성 넉아웃 세포를 얻는다. 이러한 선택은, 예를 들면 제네티신(G418)과 같은 항생제 사용에 의한 것일 수 있다.
형질주입되거나, 그렇지 않으면 적절한 벡터를 수용한 세포는 유전자형 또는 표현형 분석에 의해 선택되거나 동정될 수 있다. 일 구체예에서, 세포는 형질주입되고 적절하게 선택된 배지에서 생육하여 통합된 벡터를 함유하는 세포를 동정한다. 선택 마커 유전자의 존재는 형질주입된 세포 내의 전이유전자 구조물의 존재를 나타낸다. 목적하는 표현형을 나타내는 이러한 세포들은 제한분석, 전기영동, 써던 분석, 폴리머라제 연쇄 반응 등에 의해 추가로 분석하여 숙주 세포의 게놈 내로의 전이유전자의 통합을 확인하기 위해 DNA를 분석할 수 있다. 프라이머는 또한 전이유전자 서열에 상보하는 것을 사용할 수 있다. 상동 재조합 및 랜덤 통합을 스크리닝하는데 사용된 폴리머라제 사슬 반응은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들면 문헌[Kim and Smithies, Nucleic Acids Res. 16:8887-8903 1988; Joyner et　al. Nature 338:153-156, 1989]할 수 있다. 돌연변이 폴리오마 인핸서와 네오마이신 유전자를 구동하는 티미딘 키나제의 특이적 조합이 배아줄기세포와 EC 세포 모두에서 활성인 것으로 나타났다[Thomas and Capecchi, supra, 1987; Nicholas and Berg (1983) in Teratocarcinoma Stem Cell, eds. Siver, Martin and Strikland (Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, N.Y. (pp. 469-497); and Linney and Donerly, Cell 35:693-699, 1983].
상동 재조합이 수행된 세포는 여러가지 방법으로 동정할 수 있다. 일 구체예에서, 선택방법은 세포에 대한 면역반응의 결핍을, 예를 들면 사람 안티-gal 항체에 의해 검출할 수 있다. 다른 구체예에서, 선택방법은 세포 또는 조직에 노출되었을 때 사람 혈액에서의 응고 정도를 평가하는 것을 포함할 수 있다. 항생제 내성에 의한 선택은 스크리닝을 위해 가장 통상적으로 사용되고 있다. 이 방법은 표적 벡터에서 내성 유전자의 존재를 검출할 수 있지만, 통합이 표적화 재조합인지 랜덤 통합인지를 직접적으로 나타내지 않는다. 선택적으로, 마커는 GFP 또는 RFP와 같은 형광성 마커 유전자 또는, 세포 분류나 FACS 분석에 의해서 세포 표면에서 검출할 수 있는 유전자일 수 있다. 임의의 기술, 예를 들면 폴리 A 및 프로모터 트랩 기술 등은 표적화된 경우의 확률을 증가시키지만, 한편 목적하는 표현형이 얻어진 직접적 증거를 제공하지 않는다. 또한, 선택의 네가티브 형태는 표적화된 통합을 선택하기 위해 사용할 수 있으며; 이러한 경우에, 세포에 치명적인 인자(예를 들면, Tk 또는 디프테리아 A 톡신)에 대한 유전자는 표적화된 건들만이 세포가 사멸을 피할 수 있게 하는 방법으로 삽입된다. 이러한 방법에 의해 선택된 세포들은 이후에 유전자 분해, 벡터 통합 및, 최종적으로 유전자 감소를 에세이할 수 있다. 이 경우, 선택은 변경된 표현형에서가 아니라 표적 벡터 통합의 검출에 기초하기 때문에 포인트 돌연변이가 아닌 표적화된 넉아웃, 유전자 재배열 또는 트렁케이션 또는 이와 같은 다른 변성을 검출할 수 있다.
다음 방법들로 특성화를 추가로 수행할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다: PCR 분석, 써던블로팅분석, 노던블로팅분석, 특이적 렉틴 결합 에세이 및/또는 서열화 분석. 표현형 특성화는 또한, 예를 들면 면역형광법(immunofluroescence), 면역세포화학, ELISA 에세이, 유동세포계수법, 웨스턴 블로팅, RT-PCR에 의해서와 같은 세포에서 RNA의 전사 시험 등의 다양한 에세이로 항마우스 항체의 결합 등에 의해 수행할 수 있다.
다른 구체예에서, GTKO 동물 또는 세포는 추가의 유전적 변성을 포함한다. 유전적 변성은 단지 상동성 표적화 이상을 포함할 수 있지만, 또한 외인성 유전자의 랜덤 통합, 임의 유전자의 돌연변이, 결실 및 삽입을 포함할 수 있다. 여기에 기술된 형질전환 세포와 동물에서 얻어진 세포를 추가로 유전적으로 변성하거나 여기에 기술된 동물을 추가로 유전적으로 변성된 동물과 번식시켜서 추가적인 유전적 변성을 수행할 수 있다. 이러한 동물들은 αGT 유전자, CMP-Neu5Ac 하이드록실라제 유전자(예를 들면, 미국 특허 제7,368,284호 참조), iGb3 신타제 유전자(예를 들면, 미국 특허공개 제2005/0155095호 참조), 및/또는 Forssman 신타제 유전자(예를 들면, 미국 특허공개 제2006/0068479 참조)의 적어도 하나의 대립유전자의 발현을 제거하기 위해 변성시킬 수 있다. 추가의 구체예에서, 여기에 기술된 동물은 또한 유전적 변성을 포함하여 푸코실트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제 및/또는 글루코실트랜스퍼라제 중 하나를 발현할 수 있다. 이러한 추가의 유전적 변성을 얻기 위해, 일 구체예에서, 세포를 변성하여 복수의 유전적 변성을 포함시킬 수 있다. 다른 구체예에서, 동물을 함께 사육하여 복수의 유전적 변성을 얻을 수 있다. 일 특이적 구체예에서, 돼지와 같은, 기능성 면역글로불린의 발현을 결핍한, 여기에 기술된 방법, 서열 및/또는 구조물에 따라 제조된, 동물을 돼지와 같은, (예를 들면, PCT 공개 WO 04/028243에 기술된 바와 같이)αGT 의 발현을 결핍한 동물과 함께 사육할 수 있다.
다른 구체예에서, 이종이식 거부반응의 원인이 되는 추가 유전자의 발현은 제거되거나 감소될 수 있다. 이러한 유전자는, 예를 들면 CMP-NEUAc 하이드록실라제 유전자, isoGloboside 3 신타제 유전자, 및 Forssman 신타제 유전자이나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 보체 연관 단백질을 코딩하는 유전자 또는 cDNA는, 보체 매개 용균작용의 억제를 담당하고, 또한 본 발명의 동물과 조직에서 발현될 수 있다. 이러한 유전자들은, 예를 들면 다음과 같으며 이에 한정되지는 않는다: CD59, DAF (CD55), 및 CD46 (예를 들면, PCT 공개 WO 99/53042; Chen et　al. Xenotransplantation, Volume 6 Issue 3 Page 194-August 1999, CD59/DAF 전이유전자를 발현하는 돼지 기술; Costa C et al, Xenotransplantation. 2002 January; 9(1):45-57, 사람 CD59 및 H-트랜스퍼라제를 발현하는 형질전환 돼지 기술; Zhao L et　al.; Diamond L E et　al. Transplantation. 2001 Jan. 15; 71(1):132-42, 사람 CD46 형질전환 돼지 기술).
추가의 변성은, 예를 들면 "세포 부착 분자의 하향조절에 의한 이종이식편 거부반응의 억제"라는 제하의 PCT 공개 WO 00/31126에 기술되어 있는, 세포에 의한 세포 부착 분자의 발현을 하향조절하는 항체와 같은 화합물의 발현을 포함할 수 있고, 또한 기관 수용체에게 이종 공여체 개체에서 유래한 가용성 형태의 CTLA-4를 투여하는 등으로 시그널 2에 의한 공동자극을 억제하는 화합물의 발현을 포함할 수 있으며, 이 화합물들은, 예를 들면 "T 세포 공동자극 시그널 2 차단(B7/CD28 상호작용)에 의한 면역억제"라는 제하의 PCT 공개 99/57266에 기술되어 있다.
핵 전이
여기에 기술된 유제류 또는 돼지류와 같은 형질전환 조작된 동물은 당업계에 알려진 적합한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 이러한 기술은, 예를 들면, 제한적인 것은 아니나 미세주사(예를 들면, 전핵(pronuclei) 주사), 정자 매개 유전자 전이, 난자 또는 접합체의 전기천공법 및/또는 핵 이식을 포함한다.
임의의 구체예에서, 정자 매개 유전자 전이를 사용하여 여기에 기술된 유전적으로 변성된 유제류를 생산할 수 있다. 전이유전자를 삽입하기 위해 여기에 기술된 방법과 조성물은 당업계에 공지된 또는 여기에 기술된 방법에 의해 정자 세포를 유전적으로 변성하기 위해 사용될 수 있다. 유전적으로 변성된 정자를 사용하여 자성(female) 수용체를 인공수정, 세포질내 정자 주입 또는 다른 공지된 방법으로 수태시킬 수 있다. 일 구체예에서, 정자 및/또는 정자 헤드는 외인성 핵산과 함께 충분한 시간 동안 항온처리할 수 있다. 충분한 시간이란, 예를 들면 약 30초 내지 약 5분, 전형적으로 약 45초 내지 약 3분, 보다 전형적으로 약 1분 내지 약 2분이다.
유전자 전이를 위한 벡터로서 정자 세포의 사용 가능성은 Brackeff 등[Proc., Natl. Acad. Sci. USA 68:353-357 (1971)]에 의해 처음 제안되었다. 이 후, 난모세포를 네이키드 (naked) DNA로 항온처리된 정자로 시험관내 수정한 후의 형질전환 마우스와 돼지의 생산에 대한 보고(예를 들면, Lavitrano et　al., Cell 57:717-723 (1989) and Gandolfi et　al. Journal of Reproduction and Fertility Abstract Series 4, 10 (1989) 참조)를 제공하였으나 다른 실험실들은 이 실험을 재현할 수 없었다(예를 들면, Brinster et　al. Cell 59:239-241 (1989) and Gavora et　al., Canadian Journal of Animal Science 71:287-291 (1991) 참조). 그 이후에 치킨(예를 들면, Nakanishi and Iritani, Mol. Reprod. Dev. 36:258-261 (1993) 참조); 마우스(예를 들면, Maione, Mol. Reprod. Dev. 59:406 (1998) 참조); 및 돼지 ((예를 들면, Lavitrano et　al. Transplant. Proc. 29:3508-3509 (1997); Lavitrano et　al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:14230-5 (2002); Lavitrano et　al., Mol. Reprod. Dev. 64-284-91 (2003) 참조) 등에서 정자가 매개된 유전자 전이가 성공하였다. 유사한 방법이 미국 특허 제6,376,743호 (2002년 4월 23일 공고); 미국 특허공개 제 20010044937호(2001년 11월 22일 공개), 및 미국 특허공개 제20020108132호(2002년 8월 8일 공개)에 기술되어 있다.
일부 구체예에서, 세포질내 정자 주입은 여기에 기술된 유전적으로 변성된 유제류를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 외인성 핵산과 정자를 수정되지 않은 난모세포의 세포질에 동시삽입하여 수정된 형질전환 난모세포를 형성하고 수정된 형질전환 난모세포가 형질전환 배아, 및 필요하다면 살아있는 후대내에 발생되게 하여 수행될 수 있다. 정자는 멤브레인 분해 정자 헤드 또는 탈멤브레인(demembranated) 정자 헤드일 수 있다. 동시삽입 단계는 정자와 외인성 핵산을 충분한 시간, 예를 들면 약 30초 내지 약 5분, 전형적으로 약 45초 내지 약 3분, 보다 전형적으로 1분 내지 약 2분 동안 사전 인큐베이션하는 하부단계를 포함할 수 있다. 정자와 외인성 핵산은 난모세포에 미세주입에 의해 동시삽입될 수 있다. 정자와 혼합된 외인성 핵산은 하나 이상의 전이유전자를 포함하여 여기에 기술된 하나 이상의 전이유전자에 대해 형질전환인 배아를 생산한다. 세포질내 정자 주입은 당업계에 공지된 기술(예를 들면, 미국 특허 제6,376,743호 참조)에 의해 수행될 수 있다.
당업계에 알려진 다른 기술을 사용하여 전이유전자를 동물에 도입할 수 있다. 이러한 기술로는, 예를 들면 제한적인 것은 아니나 전핵 미세주사(예를 들면, Hoppe, P. C. and Wagner, T. E., 1989, 미국 특허 제4,873,191호 참조); 레트로바이러스를 매개로 한 생식계열로의 유전자 전이(예를 들면, Van der Putten et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:6148-6152 참조); 배아줄기세포에서의 유전자 표적화(예를 들면, Thompson et al., 1989, Cell 56:313-321; Wheeler, M. B., 1994, PCT 공개 WO 94/26884 참조); 배아의 전기천공(예를 들면, Lo, 1983, Mol Cell. Biol. 3:1803-1814 참조); 세포 총; 형질주입; 형질도입; 레트로바이러스 감염; 아데노바이러스 감염; 아데노바이러스 결합 감염; 리포좀 매개 유전자 전이; 네이키드 DNA 전이; 및 정자 매개 유전자 전이(예를 들면, Lavitrano et al., 1989, Cell 57:717-723 참조) 등이 있다. 이러한 기술들의 검토는, 예를 들면 Gordon, 1989, Transgenic Anithals, Intl. Rev. Cytol. 115:171-229을 참조할 수 있다. 특정한 구체예에서, CTLA4 및/또는 CTLA4-Ig 융합 유전자의 유제류내 발현은 상기한 기술들에 의해 수행될 수 있다.
일 구체예에서, 전이유전자를 코딩하는 구조물의 미세주입을 사용하여 형질전환 동물을 생산할 수 있다. 일 구체예에서, 핵산 구조물 또는 벡터는 접합체의 전핵에 미세주입할 수 있다. 일 구체예에서, 구조물 또는 벡터는 접합체의 웅성(male) 전핵에 주입할 수 있다. 다른 구체예에서, 구조물 또는 벡터는 접합체의 자성 전핵에 주입할 수 있다. 또다른 구체예에서, 구조물 또는 벡터는 정자 매개 유전자 전이에 의해 주입할 수 있다.
전이유전자 구조물 또는 벡터의 미세주입은 다음 단계들을 포함할 수 있다: 자성 공여체의 과배란; 난자의 외과적 제거; 난자의 수정; 전이유전자 전사 단위의 배아 전핵 내로의 주입; 및 형질전환 배아를, 일반적으로 동일 종의 가임신 숙주모의 생식관에 도입. 예를 들면, 미국 특허 제4,873,191호, Brinster, et　al. 1985. PNAS 82:4438; Hogan, et　al., in "Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual". Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986. Robertson, 1987, in Robertson, ed. "Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells a Practical Approach" IRL Press, Evnsham. Oxford, England. Pedersen, et　al., 1990. "Transgenic Techniques in Mice--A Video Guide" Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 참조. 형질전환 돼지는 일반적으로 전이유전자 구조물 또는 벡터를 돼지 배아에 미세주입하여 생산된다. 일 구체예에서, 전이유전자의 존재는 각 새끼돼지의 꼬리 조직에서 게놈 DNA를 단리하고, 약 5 마이크로그램의 게놈 DNA를 전이유전자 특이적 프로브와 핵산 하이브리드화 분석을 수행하여 검출할 수 있다. 특정 구체예에서, 형질전환 동물은 당업자들에게 알려진 방법[예를 들면, Bleck et　al., J. Anim. Sci., 76:3072 (1998); 미국 특허 제6,872,868호; 제6,066,725호; 제5,523,226호; 제5,453,457호; 제4,873,191호; 제4,736,866호; 및/또는 PCT 공개 WO/ 9907829 참조]에 따라 제조할 수 있다.
일 구체예에서, 전핵 미세주입 방법은 본 발명의 전이유전자 포함 구조물 또는 벡터 적어도 대략 50, 100, 200, 300, 400 또는 500 카피를, 예를 들면 여기에 기술된 바와 같은 선택된 프로모터와 연결하는 것을 포함할 수 있고, 다음으로 외래 DNA를 수정된 난자에 미세 유리바늘로 주입할 수 있다.
일 구체예에서, DNA는 접합체의 웅성 전핵에 주입될 수 있다. 돼지 접합체는 불투명이며 핵 구조의 시각화는 곤란할 수 있다. 일 구체예에서, 돼지 접합체의 전핵 또는 핵은 원심분리, 예를 들면 3 mm, 15000 g에서 원심분리한 후 가시화될 수 있다. 전핵의 주입은 확대 하에 표준 미세주입 장치를 사용하여 수행할 수 있다. 접합체는 블런트 홀딩 피펫으로 유지하고 투명대, 혈장 멤브레인 및 전핵 엔벨로프를 주입 피펫으로 투과할 수 있다. 블런트 홀딩 피펫은 작은 직경, 예를 들면 약 50 um의 직경을 가질 수 있다. 주입 피펫은 홀딩 피펫보다 작은 직경, 예를 들면 약 15 um의 직경을 가질 수 있다. DNA 통합은 복제하는 동안 숙주 DNA의 복구 작용으로 일어난다. 이러한 외래 DNA를 포함하는 난자들은 당업자들에게 알려진 기술에 따라 배아의 임신을 위해 대리모에게 이식될 수 있다.
일부 구체예에서, 전핵 미세주입은 수정 12시간 전에 접합체 상에서 수행할 수 있다. 이러한 유전자 흡수는 수 회의 세포 주기 동안 지연될 수 있다. 그 결과, 흡수의 세포주기에 따라 일부 세포 계통만이 전이유전자를 보유하여 모자이크 후대를 얻는다. 필요하다면 모자이크 동물을 사육하여 실제 생식계열 형질전환 동물을 형성할 수 있다.
다른 구체예에서, 전이유전자를 함유하는 돼지류 세포 등의 유제류 세포는 공여체 세포로 사용되어 핵 전이를 위한 핵을 제핵 난모세포에 제공하여 클론된, 형질전환 동물을 생산할 수 있다. 일 구체예에서, 유제류 세포는 핵 전이를 위한 공여체 세포로서 사용하기 위해 전이유전자 단백질을 발현할 필요가 없다. 일 구체예에서 돼지류 세포는 핵산 구조물 또는 프로모터를 포함하는 벡터에서 전이유전자를 발현하기 위해 조작될 수 있다. 선택적으로, 돼지류 세포는 상동 재조합에 의해 내인성 프로모터의 제어 하에 전이유전자를 발현하기 위해 조작될 수 있다. 일 구체예에서, 전이유전자 핵산 서열은 조직 특이적 프로모터, 조직 특이적 인핸서, 또는 이들 모두의 제어 하에 게놈에 삽입할 수 있다. 다른 구체예에서, 전이유전자 핵산 서열은 유비쿼터스 프로모터의 제어 하에 게놈에 삽입될 수 있다. 임의의 구체예에서, 표적화 벡터를 제공하여 체세포에서의 표적화 상동 재조합하도록 설계된다. 이러한 표적화 벡터는 포유동물 세포에 형질전환되어 상동 재조합에 의해 목적하는 내인성 유전자를 표적화한다. 일 구체예에서, 표적화 구조물은 전이유전자 뉴클레오티드 서열과 선택성 마커 유전자를 외인성 유전자에 삽입하여 상부 서열을 가지는 리딩 프레임 내에 존재하고 활성 융합 단백질을 생산하도록 한다. 세포는 본 발명의 방법을 사용하여 구조물로 형질전환될 수 있고, 선택 마커에 의해 선택된 다음, 재조합체 존재에 대해 스크린된다.
본 발명은 체세포 핵 전이에 의해 임의의 전이유전자를 함유하는 돼지와 같은 유제류를 클로닝하는 방법을 제공한다. 일반적으로 돼지는 다음 단계들을 포함하는 핵전이 방법에 의해 생산할 수 있다: 공여체 핵의 공급원으로 사용되는 목적하는 분화된 돼지 세포를 얻고; 돼지로부터 난모세포를 취한 다음; 난모세포에서 핵을 제거하고; 목적하는 분화된 세포 또는 세포 핵을 제핵된 난모세포에, 예를 들면 융합 또는 주입으로 전이하여 핵 전이(NT) 단위체를 형성하고; 얻어진 NT 단위체를 활성화하고; NT 단위체가 태아로 발달하도록 배양된 NT 단위체를 숙주 돼지에 전이:
핵 전이 기술 또는 핵 이식 기술은 당업계에 알려져 있다(예를 들면, Dai et　al. Nature Biotechnology 20:251-255; Polejaeva et al Nature 407:86-90 (2000); Campbell, et　al., Theriogenology 68 Suppl 1:S214-3 1 (2007); Vajta, et　al., Reprod Fertil Dev 19(2): 403-23 (2007); Campbell et　al. (1995) Theriogenology, 43:181; Collas et　al. (1994) Mol. Report Dev., 38:264-267; Keefer et　al. (1994) Biol. Reprod., 50:935-939; Sims et　al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:6143-6147; WO 94/26884; WO 94/24274, 및 WO 90/03432, U.S. Pat. Nos. 4,944,384, 5,057,420, WO 97/07669, WO 97/07668, WO 98/30683, WO 00/22098, WO 004217, WO 00/51424, WO 03/055302, WO 03/005810, 미국 특허 제6,147,276호, 제6,215,041호, 제6,235,969호, 제6,252,133호, 제6,258,998호, 제5,945,577호, 제6,525,243호, 제6,548,741호, 및 Phelps et　al. (Science 299:411-414 (2003)).
공여체 세포 핵은, 변성되어 본 발명의 전이유전자를 포함하며 수용체 돼지류 난모세포에 전이된다. 이러한 방법의 사용은 특정한 공여체 세포 종류에 한정되지 않는다. 공여체 세포는 Wilmut 등의 (1997) Nature 385:810; Campbell et　al. (1996) Nature 380:64-66; 또는 Cibelli 등의 (1998) Science 280:1256-1258에 기술되어 있는 것일 수 있다. 핵 전이에서 성공적으로 사용가능한 배아, 태아 및 성체 체세포를 포함하여 정상 핵형의 모든 세포를 기본적으로 사용할 수 있다. 태아 섬유아세포가 특히 유용한 공여체 세포 종류이다. 일반적으로 핵 전이의 적합한 방법이 다음 문헌에 기술되어 있다: Campbell et　al. (1995) Theriogenology 43:181, Collas et　al. (1994) Mol. Reprod. Dev. 38:264-267, Keefer et　al. (1994) Biol. Reprod. 50:935-939, Sims et　al. (1993) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:6143-6147, WO-A-9426884, WO-A-9424274, WO-A-9807841, WO-A-9003432, 미국 특허 제4,994,384호 및 미국 특허 제5,057,420호, Campbell et　al., (2007) Theriogenology 68 Suppl 1, S214-231, Vatja et　al., (2007) Reprod Fertil Dev 19, 403-423). 또한, 분화되거나 적어도 부분적으로 분화된 공여체 세포를 사용할 수 있다. 공여체 세포는 또한 배양 중에 있거나, 반드시 그러한 것은 아니나 휴지상태일 수 있다. 휴지상태인 핵 공여체 세포는 생체 내에서 휴지기에 들어가거나 휴지상태에 있도록 유도될 수 있는 세포이다. 종래기술의 방법에서는 또한 클로닝 과정에서 배아 세포 형태를 사용하였다(예를 들면, Campbell et　al. (1996) Nature, 380:64-68) and Stice et　al. (1996) Biol. Reprod., 20 54:100-110 참조). 특정한 구체예에서, 섬유아세포, 예를 들면 돼지류의 섬유아세포는 유전적으로 변성되어 목적하는 전이유전자를 포함할 수 있다.
난모세포의 단리방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 기본적으로, 이는 돼지의 난소 또는 생식관으로부터 난모세포를 단리하는 것을 포함한다. 용이하게 입수할 수 있는 돼지 난모세포 공급원은 도축장 물질이다. 유전자 조작, 핵 전이 및 클로닝 등의 기술의 조합을 위하여 난모세포는 일반적으로 이러한 세포들을 핵 전이를 위한 수용체 세포로 사용하기 전, 및 이들을 정자 세포에 의해 수정하여 배아로 발달시키기 전에 시험관 내에서 성숙시켜야 한다. 이 과정은 일반적으로 포유동물 난소, 예를 들면 도축장에서 입수한 소의 난소에서 미숙한(전기 I) 난모세포를 수집하고, 수정 또는 제핵 전에 난모세포가 중기 II 단계에 이를 때까지 성숙 배지에서 난모세포를 숙성하는데, 소의 난모세포의 경우 일반적으로 흡인 후 약 18-24시간에 일어나고, 돼지의 경우는 일반적으로 약 35-55 시간에 일어난다. 이 기간은 "숙성기간"이라고 알려져 있다.
중기 II 단계 난모세포가 수용체 난모세포일 수 있으며, 이 단계에서 난모세포는 "활성화"될 수 있거나 충분히 "활성화"되어 수정 정자처럼 도입된 핵을 처리하는 것으로 보인다. 중기 II 단계 난모세포는, 생체 내에서 성숙되어 핵 전이 방법에서 성공적으로 사용된다. 기본적으로, 성숙한 중기 II 난모세포는 과잉배란되지 않은 또는 과잉배란된 돼지에서 발정기 개시 또는 사람의 융모성 생식선 자극 호르몬(hCG) 또는 유사 호르몬의 주입 35 내지 48 시간, 또는 39-41 시간 후에 외과적으로 수집할 수 있다.
정해진 시간의 성숙기간 후에 난모세포를 제핵처리할 수 있다. 제핵 이전에 난모세포를 꺼내고, 예를 들면 난구세포의 제거 이전에 히알루로니다제를 밀리리터 당 1 밀리그람 함유하는 HECM 또는 TCM199과 같은 적절한 배지에 옮긴다. 스트리핑 난모세포를 극체(polar body)에 스크린하고, 극체의 존재로 측정된, 선택된 중기 II 난모세포를 핵전이에 사용한다. 제핵은 다음과 같다.
제핵은 공지된 방법으로 수행할 수 있으며, 예를 들면 미국 특허 제4,994,384.호에 기술되어 있다. 예를 들면 중기 II 난모세포는 즉시 제핵을 위해 임의로 사이토칼라신 B를 밀리리터당 7-10 밀리그람 함유하는 HECM에 넣거나, 또는 적합한 배지, 예를 들면 10%의 발정기 소 혈청을 포함하는 CR1aa와 같은 배아 배양배지에 넣은 다음, 추후, 예를 들면 24 시간 이하 또는 16-18 시간 후에 제핵할 수 있다.
제핵은 극체와 근접 세포질을 제거하기 위해 마이크로피펫을 사용하여 미세수술로 수행할 수 있다. 그런 다음, 난모세포를 스크린하여 이들 중 성공적으로 제핵된 것을 동정할 수 있다. 난모세포를 스크린하는 한가지 방법은 난모세포를 적합한 홀딩 배지 중에서 밀리리터당 3-10 마이크로그람의 33342 Hoechst 염료로 염색하고 이어서 난모세포를 자외선 조사 하에 10초 미만 동안 보는 것이다. 성공적으로 제핵된 난모세포를 적합한 배양 배지, 예를 들면 10% 혈청을 포함하는 CRlaa에 옮길 수 있다.
제핵된 난모세포와 같은 종의 단일 포유동물 세포를 NT 단위체를 생산하기 위해 사용된 제핵 난모세포의 위란강에 전이할 수 있다. 포유동물 세포와 제핵된 난모세포를 당분야에 알려진 방법에 따라 NT 단위체를 생산하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들면, 세포는 전기세포융합에 의해 융합할 수 있다. 전기세포융합은 세포막의 일시적 분해를 일으키는데 충분한 전기 펄스를 제공하여 수행된다. 이러한 세포막의 분해는 막이 바로 재결성되므로 매우 짧다. 그러므로, 2개 인접한 막이 분해가 유발되고 재결성시 리피드 이분자층이 섞이면 작은 통로가 2개 세포 사이에 열릴 수 있다. 이러한 작은 개구부의 열역학적 불안정성으로 인하여 2개 세포가 하나가 될 때까지 커진다. 예를 들면, Prather 등의 미국 특허 제4,997,384호 참조. 다양한 전기세포융합 매질이 사용될 수 있으며, 예를 들면 슈크로스, 만니톨, 소르비톨 및 인산염 완충액 등이다. 예를 들면 융합 매질은 0.05 mM MgCl2 및 0.001 mM CaCl2를 함유하는 280 밀리몰 (mM)의 만니톨 용액을 포함할 수 있다(Walker et al., Cloning and Stem Cells. 2002;4(2):105-12). 융합은 또한 융합유도성(fusogenic) 시약으로 Sendai 바이러스를 사용하여 수행할 수 있다(Graham, Wister Inot. Symp. Monogr., 9, 19, 1969). 또한, 핵은 전기천공 융합을 사용하기 보다 난모세포에 직접 주입될 수 있다. 예를 들면, Collas and Barnes, (1994) Mol. Reprod. Dev., 38:264-267 참조. 융합 후, 얻어진 융합 NT 단위체를 활성화까지 적합한 배지, 예를 들면 CRlaa 배지에 두었다. 전형적으로 활성화는 이후에 단기에 일어날 수 있으며, 예를 들면소의 NT에서는 24시간 미만 후 또는 약 4-9 시간 이후이고, 돼지 NT에서는 1-4시간 이후이다.
NT 단위체는 공지된 방법으로 활성화할 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들면 본질적으로 NT 단위체에 차가운, 또는 실질적으로 냉온 쇼크를 가하여 NT 단위체를 생리적온도 이하에서 배양하는 것을 포함한다. 이것은 NT 단위체를 배아가 정상적으로 노출되는 생리적 온도보다 상대적으로 낮은 실온에서 배양하여 아주 간편하게 수행될 수 있다. 선택적으로, 활성화는 기지의 활성화제를 적용하여 달성할 수 있다. 예를 들면, 수정하는 동안 정자에 의한 난모세포 투과는 선구(prelusion) 난포세포를 활성화하여 더많은 수의 살아있는 임신과 핵 전이 후의 복수의 유전적으로 동일한 새끼를 얻는 것으로 나타났다. 또한, 전기적 및 화학적 쇼크와 같은 처리는 융합후 NT 배아를 활성화하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들면 Susko-Parrish 등의 미국 특허 제5,496,720호 참조. 추가적으로 동시에 또는 순차적으로 난모세포에서 이가 양이온의 농도를 증가시키고, 난모세포에서 세포 단백질의 포스포릴레이션을 감소하여 활성화할 수 있다. 이는 일반적으로 난모세포 세포질에 이가 양이온, 예를 들면 마그네슘, 스트론튬, 바륨 또는 칼슘을, 예를 들면 이오노포어(ionophore) 형태로 첨가하여 일어날 수 있다. 이가 양이온의 농도를 증가시키는 다른 방법은 전기적 쇼크 사용, 에탄올 처리 및 케이지 킬레이터 처리를 포함한다. 포스포릴레이션은, 예를 들면 키나제 억제제, 예를 들면 6-디메틸-아미노퓨린, 스타우로스포린(staurosporine), 2-아미노퓨린 및 스핑고신과 같은 세린-트레오닌키나제 억제제를 첨가하는 공지된 방법으로 감소시킬 수 있다. 선택적으로, 세포 단백질의 포스포릴레이션은 난모세포에 포스파타제, 예를 들면 포스파타제 2A 및 포스파타제 2B를 첨가하여 저해할 수 있다.
활성화된 NT 단위체는 이들이 자성 수용체에 전이되는데 적합한 크기에 이를 때까지 또는 , 선택적으로 이들이 자성 수용체에 즉시 전이될 수 있을 때까지 배양할 수 있다. 배아의 배양 및 성숙에 적합한 배양 배지는 당업계에 알려져 있다. 배아의 배양 및 유지에 사용가능한 종래의 배지의 예로는, Ham F-10+10% 소 태아 혈청 (FCS), Tissue Culture Medium-199 (TCM-199)+10% 소 태아 혈청, Tyrodes-알부민-락테이트-피루베이트 (TALP), Dulbecco 인산염 완충 식염수 (PBS), Eagle/Whitten 배지, PZM, NCSU23 및 NCSU37이 있다. Yoshioka K, Suzuki C, Tanaka A, Anas I M, Iwamura S. Biol Reprod. (2002) January; 66(1):112-9 및 Petters R M, Wells K D. J Reprod Fertil Suppl. 1993;48:61-73 참조.
이 후, 배양된 NT 단위체 또는 단위체들을 세척한 다음, 임의로 적합한 융합 피더(feeder)층을 포함할 수 있는 웰 플레이트에 포함된 적합한 배지로 옮길 수 있다. 적합한 피더층은, 예를 들면 섬유아세포와 상피세포이다. NT 단위체가 자성 수용체에 전이하는데 또는 세포 콜로니를 생산하기 위해 사용할 수 있는 세포를 얻는데 적합한 크기에 이를 때까지 NT 단위체를 피더층에서 배양한다. NT 단위체는 적어도 약 2 내지 400 세포, 약 4 내지 128 세포, 또는 적어도 약 50 세포까지 배양할 수 있다. 선택적으로 NT 단위체는 자성 수용체에 즉시 전이할 수 있다.
본 발명에서 배아 전이와 수용체 동물 관리를 하는 방법은 배아 전이 산업에서 사용되는 표준 방법이다. 동시발생 전이는 본 발명의 성공에 중요하며, 즉 NT 배아의 단계는 자성 수용체의 발정기와 동시 발생한다. 예를 들면, Siedel, G. E., Jr. (1981) "Critical review of embryo transfer procedures with cattle in Fertilization and Embryonic Development in Vitro, L. Mastroianni, Jr. and J. D. Biggers, ed., Plenum Press, New York, N.Y., page 323 참조. 돼지 배아 전이는 당업계에 알려진 방법에 따라 수행할 수 있다. 예를 들면, Youngs et　al. "Factors Influencing the Success of Embryo Transfer in the Pig," Theriogenology (2002) 56: 1311-1320 참조.
췌장섬 연관 세포의 생산
췌장은 척추동물의 소화계 및 내분비계의 샘(gland) 기관이다. 이것은 인슐린, 글루카곤, 및 소마토스타틴 등의 중요한 호르몬을 생산하는 내분비 샘일 뿐만 아니라 소장을 통과하는 소화효소를 함유하는 췌장액을 분비하는 외분비 샘이다. 췌장은 췌장 외분비 세포와 그의 연관된 도관으로 구성된다. 랑게르한스섬이라고 불리는 대략 100만개 정도의 작은 세포 클러스터들이 이러한 내분비 조직 내에 내재하며, 이것이 췌장의 내분비 세포이고, 인슐린, 글루카곤 및 다른 몇 종의 호르몬을 분비한다.
사람 췌장은 약 100만개의 랑게르한스섬을 포함하고 있다. 이들은 기관 전체에 분포된, 세포의 작은 스피로이드(spheroid) 클러스터이다. 이들은 크기에서, 10개 세포 내지 수 천개 세포의 범위까지 상당히 다양하다. "섬 세포"는 랑게르한스섬에서 발견되는 세포 종류의 집합군을 포함한다. 이들은 A, B, C, D 및 PP 세포를 포함하고, 표준적인 염색방법을 사용하여 구별하는 것이 비교적 어렵다. α세포는 글루카곤(혈액 중 글루코스를 증가시킴)을 분비하고, β세포는 인슐린(혈액 중에서 글루코스를 감소시킴)을 분비하며, δ세포는 소마토스타틴(α 및 β세포를 조절/정지)을 분비하고 PP 세포는 췌장 폴리펩티드를 분비한다.
일 구체예에서, 유전적으로 변경된 돼지는 췌장섬 및/또는 췌장섬 세포 등의 췌장 조직 공여체로 사용된다. 이러한 조직에서 유도된 췌장 조직 또는 세포는 췌장섬 세포, 또는 췌장섬, 또는 췌장섬 세포 클러스터를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 세포는 췌장섬이다. 보다 특정한 구체예에서, 세포는 췌장 베타 세포이다. 임의의 구체예에서, 세포는 인슐린을 생산한다. 또다른 구체예에서, 세포는 췌장섬 유사 세포이다. 췌장섬 세포 클러스터는 하나 이상의 알파, 베타, 델타, PP 또는 입실런 세포를 포함할 수 있다. 일반적으로, 글루카곤을 생산하는 알파 세포는 원래 췌장에서 전체 췌장섬 세포의 약 15-20%를 구성하며, 인슐린과 아밀린을 생산하는 베타 세포는 원래 췌장에서 전체 췌장섬 세포의 약 65-80%를 구성하고, 소마토스타틴을 생산하는 델타 세포는 원래 췌장에서 전체 췌장섬 세포의 약 3-10%를 구성하고, 췌장 폴리펩티드를 생산하는 PP 세포는 원래 췌장에서 전체 췌장섬 세포의 약 3-5%를 구성하고 그렐린을 생산하는 입실런 세포는 원래 췌장에서 전체 췌장섬 세포의 약 <1%를 구성한다(Elayat et　al. (1995). J. Anat. 186: 629-37 참조). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/ PMC1167020/
공여체 돼지는 발달의 어떠한 단계에서도 가능하며, 예를 들면 태아, 신생아, 새끼 및 성체로 이에 한정되지는 않는다. 일부 구체예에서, 췌장섬 세포는 성체 돼지 형질전환 동물에서 단리된다. 선택적 구체예에서, 췌장섬 세포는 태아 또는 신생아 돼지 형질전환 동물에서 단리된다(예를 들면, Mandel (1999) J. Mol. Med. 77:155-60; Cardona, et　al. (2006) Nat. Med. 12:304-6 참조). 공여체 돼지는 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1년령 이하일 수 있다. 일 구체예에서, 췌장섬 세포는 6년령 이하의 형질전환 돼지에서 단리된다. 다른 구체예에서, 췌장섬 세포는 3년령 이하의 형질전환 돼지에서 단리된다. 공여체 돼지는 0 내지 2년령, 2 내지 4년령, 4 내지 6년령, 6 내지 8년령 또는 8 내지 10년령일 수 있다. 일부에서 공여체 돼지는 10년령 이상일 수 있다. 다른 구체예에서, 췌장섬 세포는 신생 내지 2년령 형질전환 돼지로부터 단리된다. 일 구체예에서, 췌장섬 세포는 태아 내지 2년령 형질전환 돼지로부터 단리된다. 특정 구체예에서, 췌장섬 세포는 6개월령 내지 2년령 형질전환 돼지로부터 단리되고, 보다 특정한 구체예에서는 7개월령 내지 1년령 형질전환 돼지에서 단리된다. 일구체예에서, 췌장섬 세포는 2-3년령 형질전환 돼지에서 단리된다. 일부 경우에, 공여체 돼지는 0연령 미만(즉, 태아 또는 배아)이다. 신생 췌장섬은 성체 췌장섬 보다 원기왕성하고 단리 후 일치성이 있으며, 산화성 스트레스에 보다 강하고 (발생기 췌장섬 줄기 세포 부분 모집단에서와 같이)상당한 성장 가능성이 있어서 이들이 이식 부위에서 이식 및 생착 후 증식하는 능력을 가진다. 이들은 상당한 농도의 인슐린을 생산하는 정도로 충분히 성숙하기 위해서 최대 4-6주를 소요할 수 있는 단점을 가지지만, 이것은 신생아 췌장섬이 성숙하는 충분한 기간 동안 외인성 인슐린으로 처리하여 극복된다. 신생아 췌장섬의생존 및 기능성 생착은 잠재적 내인성 C-펩티드와 용이하게 구분되는 돼지 특이적 C-펩티드 농도를 측정하여 결정할 수 있다.
성체 돼지류 췌장섬을 앞서 기술한 바(Bottino, 2002, 2004; Balamurugan, 2003, 2005)와 같이 사람 췌장섬에 대해 기술되고 돼지에 대해 추가로 최적화된 방법(Toso, 2000; Yonekawa, 2005)의 변성에 따라 단리할 수 있다. 순도를 췌장섬 샘플을 디티존(dithizone)으로 염색한 후 평가하여 췌장섬/전체 조직의 백분률로 표시하였다(Balamurugan, 2005). 췌장섬을 오염 외분비 조직 제조물을 대폭 감소시키기 위해 이식 전에 1-3일 동안 췌장섬을 배양할 수 있다. Tx 전에, 돼지 췌장섬을 계수하고 이중 형광 칼세인-AM 및 프로피듐(propidium) 요오드 염색으로 생존력을 평가하였다(Lorenzo, 1994). 전체 제조물에서 >75%의 췌장섬 세포 생존력과, >80% 췌장섬/전체 조직의 순도가 요구된다. 역동적 페리퓨젼(perifusion)과 생존성 등의 췌장섬의 기능성을 Tx 이전에 시험관내에서 측정할 수 있다(Balamurugan, 2006). 일부 구체예에서, 형질전환 돼지 췌장섬 세포를 시험관내에서 배양하여 이들이 이식에 적합하도록 이들을 확장, 성숙 및/또는 정제한다.
임의의 구체예에서, 공여체 형질전환 췌장 조직은 외과적으로 제거된다. 외과적 제거 후에 공여체 췌장을 크린룸 설비로 추가 공정을 위해 플라스틱 냉컨테이너 내 2% 사람 혈청 알부민(HSA)이 첨가된 Hank Balanced Salt Solution (HBSS)을 함유하는 50 ml 시험관 내에 옮겼다. 각 공여체의 혈액 샘플을 바이러스 시험 및 톡소플라스마 혈청학으로 보냈다. 각 기관의 샘플은 필요하다면 추후 시험 동안 -80 ℃의 냉동고에 보관하였다.
췌장섬 세포는 Ricordi 등(1990)에 기술된 방법을 일부 변성하여 분쇄된 췌장의 표준 콜라게나제 소화에 의해 단리할 수 있다. 무균성 기술을 사용하여 샘을 LiberaseTM(설치류 췌장의 급속 분리 및 건강하고, 온전한 기능성 랑게르한스섬의 최대 회수를 위해 제제화된 정제 효소 혼합물, 여기에서 이 효소들의 표적 물질은 충분히 확인되지 않았으나 콜라겐과 비콜라겐 단백질인 것으로 추정되며, 이것은 췌장 샘꽈리 조직의 세포내 매트릭스를 포함한다)(1.5 mg/ml)로 팽창시켜서, 과량의 지방, 혈관 및 결합조직을 정리하고, 분쇄하여 진탕 수조 중에서 15분 동안 120 rpm으로 37 ℃에서 분해시킨다. 분해하는 동안 세포 손상을 피하기 위해 LiberaseTM 용액과 혼합된 리그노카인을 사용하여 분해하였다. 분해과정에 이어서, 세포를 멸균 400 mm 메쉬를 통해 멸균 비이커로 보냈다. 제2 분해과정은 분해되지 않은 조직에 대해 수행한다.
선택적으로, Vitacyte 콜라게나제 MA (7.5 Wunsch Units/그람의 췌장조직) 및 Vitacyte BP 프로테아제 (0.13 mg/그람의 췌장조직)를 사용할 수 있다.
임의의 구체예에서, 콜라게나제 보다는 LiberaseTM(예를 들면, 뉴질랜드에서 Roche사로부터 공급)가 사용된다("Improved Pig Islet Yield and Post-Culture Recovery Using Liberase P1 Purified Enzyme Blend", T J Cavanagh et　al. Transplantation Proceedings 30, 367 (1998) and in "Significant Progress In Porcine Islets Mass Isolation Utilizing LiberaseTM HI For Enzymatic Low-Temperature Pancreas Digestion", H. Brandhorst et　al. Transplantation Vol 68, 355-361 No. 3, Aug. 15, 1999). 분해된 조직을 3회 세척하고, 2% 사람 혈청 알부민(HSA), 10mmol/L 니코틴아미드, 및 항생제 (Ciproxin)를 첨가한 세포 배양배지 RPMI 1640에 접종하였다.
조직의 오염을 제거하기 위해, 단리한 후와 캡슐화 전에 세포 배양 샘플에 대해 품질관리과정을 수행하였다. 단리한 3일 후에, 세포 배양물을 승인된 실험실에 의해 미생물 오염을 시험하였다. 돼지 내인성 레트로바이러스(PERV)에 대한 시험을, 예를 들면 미국 오클랜드 병원의 Virology Laboratory에서 실시하였다.
췌장섬 수율은 세포의 디티존(DTZ) 염색에 의해 측정된다. 디티존은 아연-킬레이트화제이며 랑게르한스섬에서 선택적으로 아연을 염색하여 독특한 적색을 띠는, 초생체 염색이다.
췌장섬 세포의 생존력을 아크리딘 오렌지와 프로피듐 요오드를 사용하여 측정할 수 있다. 아크리딘 오렌지는 모든 세포막을 용이하게 통과하는 형광착색제로 세포질과 핵을 염색한다. 온전한 살아있는 세포는 자외선(UV)에 노광시 핵과 세포질에 밝은 녹색 형광을 띤다. 이와 반대로, 프로피듐 요오드는 온전한 막을 통과할 수 없는 형광착색제이다. 이것은 LIV광에 노광되었을 때 밝은 적색 형광을 발산하며, 세포핵에 프로피듐 요오드가 존재할 경우 심각한 손상을 나타내거나 죽은 세포를 나타낸다.
정적 글루코스 자극(SGS)을 사용하여 돼지 췌장섬을 낮은 농도와 높은 농도의 글루코스와 테오필린(theophylline)에 노출하여 이들의 시험관내 기능을 평가한다. 시험관내 인슐린 분비능은 유리 췌장섬(배양 3일 후)과 이들을 후속 캡슐화한 후에 대하여 측정한다.
미숙한 돼지 췌장섬을 사용할 경우, 미숙한 세포를 그의 인슐린 생산 형태로 성숙시키기 위해 IgF-1(사람 인슐린 유사 성장인자 I)을 사용할 수 있다. IgF-1은 출생 후에 성장 호르몬의 성장 촉진 활성을 매개하는 강력한 미토겐 성장인자이다. IgF-1과 IgF-2는 모두 많은 세포 종류에서 발현되며 내분비, 자가분비 및 주변분리 기능을 가질 수 있다. IgF-1의 바람직한 형태는 IgF-1의 아미노-터미널 트리펩티드 글리신-프롤린-글루타메이트(GPE)이다.
췌장섬이 이식 전에 정제되는 과정은 이렇게 고도로 특수화된 조직에 외상을 초래한다. 이러한 외상은 괴사 또는 세포자멸을 유발할 수 있다. 최신 기술에서 알려진 췌장섬 제조 및 캡슐화 방법을 본 발명에 사용할 수 있다. 이러한 기술은 개별 췌장섬의 마이크로캡슐화, 또는 복수 췌장섬/췌장 조직의 마크로캡슐화를 포함한다. 예를 들면 다음과 같다: Scharp 등의 미국 특허 제7,427,415호는 다음 단계들을 포함하는 생물학적 물질의 캡슐화방법을 기술하고 있다: 제1 완충액을 포함하는 용액을 생물학적 물질에 첨가하고; 생물학적 물질을 원심분리하여 펠렛화된 생물학적 물질을 형성하고; 상징액을 제거하고; 세포흡수물질에 컨쥬게이트된 광개시제 염료를 포함하는 용액을 펠렛화된 생물학적 물질에 첨가하고; 펠렛화된 생물학적 물질을 세포흡수물질에 컨쥬게이트된 광개시제 염료를 포함하는 용액을 재현탁하여 유효한 시간 동안 인큐베이션하고; 혼합물을 원심분리하고; 세포흡수물질에 컨쥬게이트된 광개시제 염료를 포함하는 용액을 제거하고; 펠렛화된 생물학적 물질을 제2 완충액을 포함하는 제2 용액으로 재현탁하고; 제2 완충액을 원심분리하여 제거하고; 생물학적 물질을 광활성 폴리머 용액으로 재현탁하여 혼합하고; 재현탁된 생물학적 물질과 광활성 폴리머 용액을 에너지원으로 조사하여 캡슐화된 생물학적 물질을 형성하는 단계. 바람직하게 캡슐화된 생물학적 물질은 PEG 컨포멀 코팅 췌장섬 동종이식편이다.
다른 방법은 제로 허혈(warm ischemia)(많은 사람 췌장섬 제조물과 시간로 비교)을 보장하고, 성공적인 시험관내 체외이식을 증가시키기 위한 니코틴아미드의 사용과 연관되어 있고, 콜라게나제 또는 Liberase와의 최소 인큐베이션 시간과 연관되어 있으며, 신속한 비외상성 캡슐화 기술과 연관되고, IgF-1 (또는 그의 GPE 트리펩티드)의 사용, 리그노카인과 같은 마취제 사용 및 시프로프록신 등의 항생제 사용과 연관된다.
Elliott 등의 미국 특허 제7,122,177호는 췌장섬의 캡슐화방법을 기술하고 있다. 이 방법에 사용되는 소듐 알기네이트는 원료 공급원(해초)에서 추출하여 초순수 분말 형태로 제조된다. 멸균 소듐 알기네이트 용액(1.6%)을 Diatranz Islet Transplant Centre에서 사용하여 캡슐화된 췌장섬을 제조하였다. 통상적으로 각각의 캡슐화방법은 췌장섬과 적합한 알기네이트 용액(일반적으로 소듐 알기네이트)을 혼화가능한 양이온 공급원에 제공하여 췌장섬을 양이온-알기네이트 겔(일반적으로 칼슘-알기네이트 겔) 내에 포집하는 것을 포함한다.
캡슐화방법은 췌장섬과 소듐 알기네이트 용액(1.6% w/w)의 혼합물을 액적 생성 바늘을 통해 겔화 양이온(염화칼슘) 배쓰(bath)에 사출하는 것을 포함한다. 칼슘-알기네이트 겔 내에 포집된 췌장섬은 양전하를 띤 폴리-L-오르니틴으로 코팅된 후, 알기네이트(0.05%)의 외부 코팅으로 이어진다. 이 후, 알기네이트의 중심 핵을 시트르산나트륨을 첨가하여 액화시킨다. 대부분의 캡슐은 3 췌장섬을 포함하고 300 내지 400 um의 직경을 가진다.
췌장섬을 포집한 알기네이트의 액상화 후에 "캡슐"을 세척하고 다시 알기네이트로 코팅하여 폴리-L-오르니틴 코팅 상의 잔류물을 중화하고 전체 캡슐이 이식될 때 폴리-L-오르니틴과 조직의 직접 접촉을 방지한다. 캡슐화된 췌장섬을 계속 세포배양한 다음, 이식 전에 오염, 인슐린 방출 및 생존성을 확인한다. 모든 품질관리 시험이 음성이면 이들을 단지 이식용으로 방출한다.
Opara의 미국 특허 제6,303,355호에서는 산화방지제, 항사이토킨, 항내독소 또는 항생제 중 적어도 하나(또는 이들의 조합물)를 함유하는 배지에서 세포를 먼저 배양하여 단리된 살아있는 세포를 처리하는 방법을 기술하고 있다. 이 후, 세포는 하이드로겔 코어와 반투외막을 포함하는 생체적합성 마이크로캡슐로 캡슐화되어 살아있는 세포를 포함하는 마이크로캡슐을 제공한다.
Cochrum 등의 미국 특허 제5,578,314호는 균일한 최소 두께를 가지는 정제된 알기네이트 겔의 복수층 코팅으로 코팅된 기능성 세포와 조직 이식물의 제조방법을 기술하고 있다. 이 방법은 숙주 내에서의 기계적, 화학적 또는 면역 파괴를 견딜 수 있고, 이식물 작용을 손상하는 피브로겐 반응을 유발하지 않으며, 균일하고 제어가능한 코팅 두께를 제공하여 영양분의 자유로운 투과와 생성물의 분비 및 배출이 가능하다. 균일한 코팅은 약 20-200 um의 두께를 가지며, 이것은 이식물의 작용성에 파괴적인 피브로겐 및/또는 면역 반응을 제거하고 생물학적 조직 코어의 실질적으로 가능한 최대 범위를 제공하므로 세포 또는 조직의 성공적인 장기 이식이 가능하다. Cochrum 등은 폴리라이신 또는 다른 폴리아미노산 또는 폴리캐티온에 의한 제1 코팅 및 후속 코팅의 안정화가 필요하지 않다는 점에서 이들의 방법이 독특하다고 말한다. 이 방법은 임의로 할로층을 형성하며, 이 층은 생물학적 조직의 노출영역을 균일하게 커버하는 내부와 외부 코팅 간의 중간층을 제공한다.
췌장섬 세포 단리와 관련한 또다른 방향은 다음 참고문헌에서 확인할 수 있다: Qi, et　al., Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue and Part II: purification and culture of human islets, J Vis Exp, 27. May 2009.
또한, 면역적 단리 멤브레인 장치, 예를 들면 TheraCyte 마크로캡슐화 장치에서 세포 이식물을 캡슐화하는 방법을 사용할 수 있다(Rafael, et　al. (2000) Cell Transpl. 9:107-13 참조). 다른 방법으로는 "Valdes 캡슐"이 있으며, 이는 Valdes (1998) "Biological Encapsulation as a New Model for Preservation of Islets of Langerhans'Transplantation Proceed 30:481에 기술되어 있다. 알기네이트 시이트는 또한 베타 세포를 포집하는 캡슐화에도 사용할 수 있다. 알기네이트 시이트의 생산과 관련한 기술에 있어서, 췌장섬 시이트는 고도로 정제된 알기네이트와 랑게르한스섬의 겔화에 의해 제작된 박판 바이오인공 내분비 췌장으로 제공된다. 무세포 알기네이트 층은 캡슐화된 세포의 숙주 거부반응에 대한 균일한 면역보호 장벽을 형성하고 조직을 인접한 숙주 조직으로부터의 수동확산에 의해 영양분을 공급한다.(Stors, et　al. (2006) Ann. NY Ac. Sci. 944:252-266 참조).
형질전환 췌장섬은 또한 다른 종류 세포와 동시이식될 수 있으며,다른 종류 세포는, 예를 들면 세르톨리 세포 또는 줄기 세포, 특히 간엽줄기세포이다(Osiris Inc. http://www.osiristx.com/).
처리방법
여기에 기술된 발명은 당뇨병 또는 전 당뇨병의 치료 또는 예방방법을 포함한다. 이 방법은 여기에 기술된 공여체 동물에서 유래한 하나 이상의 췌장섬 세포를 이를 필요로 하는 숙주에게 투여하는 것을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 본 방법은 이식 또는, 일부 경우에서 이종장기이식일 수 있다. 공여체 동물은 돼지일 수 있다. 숙주는 영장류, 예를 들면 제한적인 것은 아니나 원숭이와 같은 비사람 영장류일 수 있다. 숙주는 사람일 수 있고, 일부 경우에 당뇨병 또는 전 당뇨병이 있는 사람일 수 있다.
본 발명의 일 방법은 이종장기이식 방법이며, 여기에서 제공된 형질전환 췌장 조직 또는 세포는 영장류에게 이식되고, 이식 후 영장류에게서는 외인성 인슐린 요구가 없거나 감소한다. 다른 구체예에서, 영장류는 이식 후 외인성 인슐린 요구량이 감소하거나 필요하지 않다. 일반적으로 이식 후(post-transplant)란 정상혈당 상태의 진전 후의 기간(예를 들면, 대략 4 또는 12주 소요)을 지칭한다. 이식 후, 영장류는 이식 전에 필요한 것보다 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 미만의 인슐린을 필요로 할 수 있다. 이식 후, 영장류는 이식 전에 필요한 것보다 약 5% 내지 약 25% 미만의 인슐린을 필요로 할 수 있다. 이식 후, 영장류는 이식 전에 필요한 것보다 약 25% 내지 약 50% 미만의 인슐린을 필요로 할 수 있다. 이식 후, 영장류는 이식 전에 필요한 것보다 약 50% 내지 약 75% 미만의 인슐린을 필요로 할 수 있다. 이식 후, 영장류는 이식 전에 필요한 것보다 약 75% 내지 약 100% 미만의 인슐린을 필요로 할 수 있다. 이식 후 영장류는 1일 킬로그램 (kg) 당 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.05, 또는 0.01 외인성 단위 미만의 인슐린을 필요로 한다. 일 구체예에서, 이식 후의 영장류는 1일 킬로그램 (kg) 당 약 0.01 내지 약 0.1 외인성 단위 미만의 인슐린을 필요로 한다. 일 구체예에서, 이식 후의 영장류는 1일 킬로그램 (kg) 당 약 0.1 내지 약 0.25 외인성 단위 미만의 인슐린을 필요로 한다. 일 구체예에서, 이식 후의 영장류는 1일 킬로그램 (kg) 당 약 0.25 내지 약 0.5 외인성 단위 미만의 인슐린을 필요로 한다. 일 구체예에서, 이식 후의 영장류는 1일 킬로그램 (kg) 당 약 0.5 내지 약 0.6 외인성 단위 미만의 인슐린을 필요로 한다. 일 구체예에서, 이식 후, 영장류는 1일 4 단위 미만의 인슐린을 필요로 한다. 일 구체예에서, 이식 후, 영장류는 1일 2 단위 미만의 인슐린을 필요로 한다. 일 구체예에서, 이식 후, 영장류는 외인성 인슐린을 필요로 하지 않는다. 일 구체예에서, 이식 후, 영장류는 1일 kg 당 1 IU 미만의 인슐린을 필요로 한다. 다른 특정한 구체예에서, 영장류는 1일 0.50 IU/kg 미만을 필요로 한다.
본 발명의 방법은 또한 이종장기이식 방법을 포함하며, 여기에서 제공된 형질전환 췌장 조직 또는 세포는 영장류에게 이식되고, 이식 후 영장류는 최소한의 면역억제요법이 필요하거나 필요하지 않다. 감소되거나 또는 필요하지 않은 면역억제 요법은, 예를 들면 다른 방법들에서 필요한 것과 비교하여 면역억제 약물/제제 용량의 감소(또는 완전한 제거); 다른 방법들에서 필요한 것과 비교하여 면역억제 약물/제제 종류의 수 감소(또는 완전한 제거); 다른 방법들에서 필요한 것과 비교하여 면역억제 치료의 지속기간 감소(또는 완전한 제거); 및/또는 다른 방법들에서 필요한 것과 비교하여 면역억제 유지의 감소(또는 완전한 제거)를 포함하며, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 방법은 또한 이종장기이식 방법을 포함하며, 여기에서 제공된 형질전환 췌장 조직 또는 세포는 영장류에게 이식되고, 여기에서 IEQ/kg (kg 당췌장섬 당량) 요구량은 다른 방법과 비교하여 감소된다. 여기에 기술된 신규한 발명에서 필요로 하는 IEQ/kg은, 제한적인 것은 아니나 약 100,000; 90,000; 80,000; 70,000; 60,000; 50,000; 40,000; 30,000; 20,000; 10,000 또는 5,000 미만이다. 여기에 기술된 신규한 발명에서 필요로 하는 IEQ/kg은 약 5,000 내지 약 10,000; 약 10,000 내지 약 15,000; 약 15,000 내지 약 20,000; 약 20,000 내지 약 25,000; 약 25,000 내지 약 30,000; 약 30,000 내지 약 35,000; 약 35,000 내지 약 40,000; 약 40,000 내지 약 45,000; 약 45,000 내지 약 50,000; 약 50,000 내지 약 55,000; 약 55,000 내지 약 60,000; 약 60,000 내지 약 65,000; 약 65,000 내지 약 70,000; 약 70,000 내지 약 75,000; 약 75,000 내지 약 80,000; 약 80,000 내지 약 85,000; 약 85,000 내지 약 90,000; 약 90,000 내지 약 95,000; 약 95,000 내지 약 100,000일 수 있다. 일 구체예에서, IEQ/kg는 100,000 미만이다. 일 구체예에서, IEQ/kg는 50,000 미만이다. 일 구체예에서, IEQ/kg는 25,000 미만이다. 일 구체예에서, IEQ/kg는 10,000 미만이다.
본 발명의 방법은 또한 당뇨병을 치료하거나 예방하는 방법을 포함하며, 여기에서 제공된 형질전환 췌장 조직 또는 세포는 영장류에게 이식되고, 이식 후 영장류는 전체 또는 일부의 이식된 기능성 췌장섬을 가진다. 이식된 영장류는 이식 전의 수준과 비교하거나 다른 방법을 사용하여 얻어진 수준과 비교하여 더 많은 이식된 기능성 췌장섬을 가질 수 있다. 췌장섬은 당업자들에게 알려진 정의를 사용하여 기능적으로 특성화할 수 있으며, 예를 들면 인슐린 생산능, 숙주의 외인성 인슐린 요구량 감소능, 및/또는 공여체 타입 C-펩티드 생산능으로 이에 한정되지는 않는다. 일 구체예에서, 췌장섬 기능성은 0.3ng/dl 초과의 기저 또는 자극 돼지 C-펩티드로 정의된다. 일 구체예에서, 췌장섬 기능성은 외인성 인슐린 필요량의 50% 이상 감소와 함께 검출가능한 C-펩티드로 정의되며, 여기에서 C-펩티드는 이식된 물질에서 생산된다.
본 발명의 방법은 또한 당뇨병을 치료하거나 예방하는 방법을 포함하며, 여기에서 제공된 형질전환 췌장 조직 또는 세포는 영장류에게 이식되고, 이식 후 영장류의 금식 및 비금식 혈당 농도를 정상으로 유지한다. 이러한 정상 농도는 일정 시간 동안 유지될 수 있으며, 예를 들면 제한적인 것은 아니나, 이식 후 적어도 약 3, 6, 12, 24, 또는 36 개월이다. 일 구체예에서, 정상 농도는 적어도 3개월 동안 유지되어야 한다. 다른 구체예에서, 정상 농도는 적어도 6개월 동안 유지되어야 한다. 다른 구체예에서, 정상 농도는 적어도 12개월 동안 유지되어야 한다. 영장류, 예를 들면 제한적인 것은 아니나 사람과 원숭이의 정상적 금식 및 비금식 혈당 농도는 당업자들에게 알려져 있다. 특정한 구체예에서, FBG는 약 70 내지 약 100 mg/dL (3.9 내지 5.5 mmol/L)까지 유지될 수 있다. 다른 특정 구체예에서, NFBG는 약 200 mg/dL 미만으로 유지될 수 있다.
일부 경우에서, 무작위(금식 또는 비금식 상태와 상관없이)로 시험하여 평균하였을 때, 글루코스의 정상 농도는 약 70-130 mg/dl 또는 3.9-7.2 mmol/l이다. 일부 경우에서, 금식 후, 글루코스의 정상 농도는 약 65-70 mg/dl의 범위이다. 임의의 구체예에서, 이식 후 글루코스 농도는 대략적으로 약 200 mg/dl, 175 mg/dl, 150 mg/dl, 125 mg/dl, 100 mg/dl, 75 mg/dl, 또는 50 mg/dl 미만으로 유지된다. 일 구체예에서, 이식 후와 밤새 금식 후 글루코스 농도는 140 mg/dl 미만이고, 이러한 금식후 농도는 적어도 1 개월 동안 주 당 적어도 1회 얻어진다.
일 구체예에서, 이식 후 평균 글루코스 농도(아침 농도와 저녁 농도의 평균)는 약 2-5 mmol/l 또는 약 3-4 mmol/l이다.
일 구체예에서, 이식 후 영장류는 적절하게 혈당 조절할 수 있다. 일 구체예에서, 이식 후 글라이케이트(glycate)화된 헤모글로빈 농도는 약 8%, 7%, 6%, 5%, 4% 또는 3% 미만이다. 특정 구체예에서, 이식 후의 글라이케이트화 헤모글로빈 농도는 6.5% 미만이다.
본 발명의 방법은 또한 당뇨병의 치료 또는 예방방법을 포함하며, 여기에서 제공된 형질전환 췌장 조직 또는 세포는 영장류에게 이식되고, 이식 후 영장류는 성공적으로 정맥내 글루코스 내성 시험을 통과한다. 이 시험은 이식 후 언제든지 수행할 수 있으며, 예를 들면 이식 후 1, 3, 6 및/또는 12개월에 수행되나 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에서, 공여체(예를 들면, 돼지류) C-펩티드 형태의 글루코스에 대한 유의한 반응이 숙주(예를 들면, 영장류) C-펩티드의 유의한 반응이 없을 때 나타나면 시험 결과는 성공적이다.
본 발명의 방법은 또한 당뇨병의 치료 또는 예방방법을 포함하며, 여기에서 제공된 형질전환 췌장 조직 또는 세포는 영장류에게 이식되고, 이식 후 영장류는 아르기닌 자극 시험을 성공적으로 통과한다. 이 시험은 이식 후 언제든지 수행할 수 있으며, 예를 들면 이식 후 1, 3, 6 및/또는 12개월에 수행되나 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에서, 공여체(예를 들면, 돼지류) C-펩티드 형태의 글루코스에 대한 유의한 반응이 숙주(예를 들면, 영장류) C-펩티드의 유의한 반응이 없을 때 나타나면 시험 결과는 성공적이다.
본 발명의 방법은 또한 이종장기이식 방법을 포함하고, 여기에서 제공된 형질전환 췌장 조직 또는 세포는 영장류에게 이식되고, 이식 후 공여체 C-펩티드 농도를 검출할 수 있다. 일부 경우에서, 공여체 C-펩티드 농도는 돼지류이고, 일부 경우에서 돼지류 C-펩티드 농도는 약 0.2 내지 약 1.0, 약 0.2 내지 약 0.75, 약 0.2 내지 약 0.65, 약 0.2 내지 약 0.55, 약 0.2 내지 약 0.45, 또는 약 0.2 내지 약 0.35 ng/ml이다. 이식 후 공여체 돼지류 농도는 약 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0 ng/ml일 수 있다. 일부 경우에서, 공여체 돼지류 농도는 1.0 ng/ml 초과이다. 일부 경우에서, 공여체 돼지류 농도는 0을 초과한다. 일 구체예에서, 공여체 돼지류 C-펩티드 농도는 약 0.5 ng/ml이다.
본 발명의 방법은 또한 당뇨병의 치료 또는 예방방법을 포함하며, 여기에서 형질전환 췌장 조직 또는 세포의 이식 후에 숙주 영장류의 해부학적 분석을 수행한다. 일부 경우에서, 부검 후 원래 췌장의 해부학적 분석에서 인슐린 양성 베타 세의 감소가 나타나거나, 또는 비제한적 일 실시예에서는 인슐린 양성 베타 세포가 나타나지 않았다. 이러한 경우, 또는 원래 췌장이 시험되지 않은 다른 경우에서, 간 또는 췌장섬 이식의 다른 부위의 해부학적 시험은 복수의 살아있는 인슐린 양성 세포를 나타낸다.
본 발명의 방법은 또한 당뇨병 치료 또는 예방방법을 포함하고, 여기에서 형질전환 췌장 조직 또는 세포의 이식 후, 이식 과정, 면역억제 요법, 내성 유발 요법 및/또는 췌장섬의 캡슐화와 결합된 심각한 생명을 위협하는 합병증은 많지 않다.
본 발명의 방법은 또한 당뇨병 치료 또는 예방방법을 포함하고, 여기에서 형질전환 췌장 조직 또는 세포의 이식 후, 이식을 반복한다. 이식은 임의의 일 영장류에서 2회, 3회 이상 수행될 수 있다. 이식은 적절한 인슐린 농도를 유지하기 위해 정기적 간격으로 수행될 수 있다. 이식은 1년에 1회 발생할 수 있다. 이식은 1년에 2회 발생할 수 있다. 이식은 1년에 3회 발생할 수 있다. 이식은 1년에 3회 이상 발생할 수 있다. 이식은 다년에 걸쳐서 여러 회 발생할 수 있다. 이식의 매개변수, 예를 들면 제한적인 것은 아니나 시술과정, 전달방법, 사용된 공여체 조직 및/또는 세포, 사용된 면역억제 요법이 동일한 영장류에서 수행된 다른 이식과 비교하여 동일하거나 다를 수 있다.
일부 구체예에서, 본 방법은 숙주에게 항염증제의 투여 필요를 감소시킨다. 다른 구체예에서, 본 방법은 숙주에게 항응고제의 투여 필요를 감소시킨다. 임의의 구체예에서, 본 방법은 숙주에게 면역억제제의 투여 필요를 감소시킨다. 일부 구체예에서, 숙주에게 췌장섬 세포의 투여 후 30일 미만, 또는 20일 미만, 또는 10일 미만, 또는 5일 미만, 또는 4일 미만, 또는 3일 미만, 또는 2일 미만, 또는 1일 미만 동안 항염증제를 투여한다. 일부 구체예에서, 숙주에게 췌장섬 세포의 투여 후 30일 미만, 또는 20일 미만, 또는 10일 미만, 또는 5일 미만, 또는 4일 미만, 또는 3일 미만, 또는 2일 미만, 또는 1일 미만 동안 항응고제를 투여한다. 일부 구체예에서, 숙주에게 췌장섬 세포의 투여 후 30일 미만, 또는 20일 미만, 또는 10일 미만, 또는 5일 미만, 또는 4일 미만, 또는 3일 미만, 또는 2일 미만, 또는 1일 미만 동안 면역억제제를 투여한다.
수용체(숙주)는 이식 시에 부분적으로 또는 완전히 면역억제되거나 전혀 면역억제되지 않을 수 있다. 이식 전, 이식 중 및/또는 이식 후 사용될 수 있는 면역억제 제제/약물은 당업자들에게 알려져 있으며, 예를 들면 MMF (마이코페놀레이트 모페틸 (Cellcept)), ATG (항티모사이트 글로불린), 항-CD154 (CD40L), 알렘투주맵(alemtuzumab) (Campath), CTLA4-Ig (Abatacept/Orencia), 벨라타셉트 (LEA29Y), 시롤리무스 (Rapimune), 타크롤리무스 (Prograf), 다클리주맵 (Zenapax), 바실릭시맵(basiliximab) (Simulect), 인플릭시맵(infliximab) (Remicade), 사이클로스포린, 데옥시스퍼구알린(deoxyspergualin), 가용성 보체 리셉터 1, 코브라 독, 메틸프레드니솔론, FTY720, 에버롤리무스, 항-CD154-Ab, 레플루노마이드(leflunomide), 항-IL-2R-Ab, 라파마이신, 및 사람 항-CD154 모노클로날 항체이나, 이에 한정되지는 않는다. 하나 이상의 면역억제 제제/약물을 함께 또는 순차적으로 사용할 수 있다. 하나 이상의 면역억제 제제/약물을 유도요법 또는 유지요법에 사용할 수 있다. 동일하거나 다른 약물을 유도 및 유지 단계에서 사용할 수 있다. 일 구체예에서, 다클리주맵(Zenapax)은 유도요법에 사용되고 타크롤리무스(Prograf)와 시롤리무스(Rapimune)는 유지요법에 사용된다. 다른 구체예에서, 다클리주맵(Zenapax)은 유도요법에 사용되고 저용량 타크롤리무스(Prograf)와 저용량 시롤리무스(Rapimune)는 유지요법에 사용된다. 일 구체예에서, 알렘투주맵 (Campath)은 유도요법에 사용된다. Teuteberg et al., Am J Transplantation, 10(2):382-388. 2010; van der Windt et　al., 2009, Am. J. Transplantation 9(12):2716-2726. 2009 ,; Shapiro, The Scientist, 20(5):43. 2006; Shapiro et al., N Engl J Med. 355:1318-1330. 2006 참조. 면역억제는 또한 비약물요법, 예를 들면 제한적인 것은 아니나 전신조사법, 흉선조사법, 및 전체 및/또는 부분 비장적출을 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 기술은 또한 하나 이상의 면역억제 약물/제제와 함께 사용할 수 있다.
형질전환 췌장섬 세포는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 이식될 수 있으며, 이 방법은 예를 들면, 제한적인 것은 아니나 수용체 기관의 문맥을 통해, 신피막 하, 흉쇄유돌근 내, 복강 내, 위 점막하층 내, 고환 내 또는 비장 내로 주입할 수 있고(Rood et　al., Cell Transplantation, 15:89-104. 2006; Dufrane and Gianello,Transplantation, 86:753-760. 2008; Hering et　al., Nature Medicine, published online 19 February 2006; van der Windt et　al., Cell Transplant. 2008;17(9):1005-14 참조), 이들은 또한 세르톨리 세포와 함께 이식될 수 있으며, 이것은 췌장섬 이종이식편 내에 면역억제 효과를 제공하는 것을 시사한다(Yin et　al., 2009 Transplantation. 2009 Aug 15;88(3):339-45). 일 구체예에서, 췌장섬을 문맥내 주입으로 투여하는, 여기에서 제공된 췌장 세포를 영장류에 이식하는 이종장기이식 방법이 제공된다. 일 구체예에서, 췌장섬을 복강내 공간, 신피막하, 신피막, 장막을 통해서 또는 췌장 베드 주입으로 투여하는, 여기에서 제공된 췌장 세포를 영장류에 이식하는 이종장기이식 방법이 제공된다.
본 발명의 방법은 또한 췌장섬을 캡슐화하는 이종장기이식 방법을 포함한다. 췌장섬은 마이크로캡슐화되거나 마크로캡슐화되거나 또는 이들을 조합할 수 있다. 췌장섬의 일부 또는 모두를 캡슐화하지 않을 수 있다. 캡슐을 생산하기 위해 사용되는 물질은 당업자들에게 알려진 것일 수 있으며, 예를 들면 니트로셀룰로스, 알기네이트, 아크릴로니트릴, 아가로스 및 폴리테트라플루오로에틸렌으로, 이에 한정되지 않는다. 캡슐은 투과성 또는 반투과성일 수 있다.
인그래프트먼트를 위한 충분한 시간(예를 들면, 1주일, 3주일 등)이 제공되며, 성공적인 인그래프트먼트는 당업자들에게 알려진 기술을 사용하여 측정된다. 이러한 기술은, 예를 들면 제한적인 것은 아니나 공여체 C-펩티드의 농도 평가, 조직학적 시험, 정맥내 글루코스 내성 시험, 외인성 인슐린 요구량 시험, 아르기닌 자극 시험, 글루카곤 자극 시험, IEQ/kg (췌장섬 당량/kg) 요구량 시험, 수용체의 정상혈당 지속성 시험, 면역억제 요구량 시험, 및 이식된 췌장섬의 기능성 시험이다(Rood et　al., Cell Transplantation, 15:89-104. 2006; Rood et　al., Transplantation, 83:202-210. 2007; Dufrane and Gianello,Transplantation, 86:753-760. 2008; van der Windt et　al., 2009, Am. J. Transplantation, 9(12):2716-2726. 2009 참조).
하나 이상의 방법을 사용하여 인그래프트먼트의 성공 여부를 측정할 수 있다. 성공적인 인그래프트먼트란 무처리에 관련한 것을 지칭할 수 있으며, 일부 구체예에서 이식에 대한 다른 접근방법과 관련한 것이다(즉, 인그래프트먼트는 이식을 위해 다른 방법/조직을 사용한 것보다 더 성공적이다). 일부 경우에서, 성공적인 인그래프트먼트는 공여체 C-펩티드 농도를 평가하여 측정된다. 돼지류 동물, 조직, 세포를 사용할 경우, 일 구체예에서, 인그래프트먼트는 돼지류 C-펩티드 농도가 약 0.2-1.0 (ng/ml) 또는, 더욱 특별하게 약 0.2-0.65 (ng/ml)일 때 성공적인 것으로 간주될 수 있다(Cooper and Casu, Xenotransplantation, 16:229-238. 2009; Rood et al, Cell Transplantation, 15:89-104. 2006). 다른 구체예에서는 IEQ/kg (췌장섬 당량/kg) 요구량 시험이 사용된다. 이 구체예에서, IEQ/kg는 이식을 위해 다른 방법/조직을 사용하여 필요한 것에 비하여 훨씬 적게 필요하다. 일부 경우에서, IEQ 요구량은 신생 돼지 중량 1 kg에 대하여 대략 50,000 IEQ 미만, 또는 성체 돼지 중량 1 kg에 대하여 대략 25,000 IEQ 미만일 수 있다(Dufrane and Gianello,Transplantation, 86:753-760. 2008). 일부 경우에서, IEQ 요구량은 성체 돼지 중량 1 kg에 대하여 대략 100,000 IEQ 미만일 수 있다. 혈당 조절로 더 낮은 IEQ/kg 농도를 얻는 것은 성공적인 인그래프트먼트의 일 표시일 수 있다. 일부 경우에서, 수용체(숙주)에서 정상혈당의 지속성은 성공적인 인그래프트먼트의 특징이다. 이식 후 일정 시간 동안 외인성 인슐린에 대한 장시간 감소된 의존성(또는 비의존성)은 성공적 인그래프트먼트의 표시이다. 이 기간은 3개월, 6개월, 1년 또는 1년 이상일 수 있다. 이것은 제1 이식 이후이거나 후속 이식에서 측정될 수 있다. 일부 경우에서, 성공적인 인그래프트먼트는 면역억제 필요의 감소로 나타내어진다. 이러한 감소된 면역억제 요구는 하나 이상의 면역억제 약물/제제의 용량 저감, 필요한 면역억제 약물/제제 종류의 수량 감소, 면역억제의 짧아진 지속기간 및/또는 면역억제 관리 감소 또는 불필요를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 성공적인 인그래프트먼트는 이식된 조직 (전체 또는 부분)의 기능성 시험에 의해 평가할 수 있다. 이것은 공여체 C-펩티드(예를 들면, 돼지 C-펩티드) 검출과 함께 외인성 인슐린 요구량의 50% 이상 감소를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 이식된 조직의 기능성은 0.3 ng/dl 초과의 기저 또는 자극된 C-펩티드로 정의될 수 있다.
췌장섬 세포 이식과 관련한 추가적인 방법은 다음 문헌들에서 찾을 수 있다: Bertuzzi et　al., Cur Mol Med, 6(4):369-74. June 2006; Ricordi et　al., Diabetes, 35:649. 1986; Korsgren et　al., Transplantation, 45:509. 1988; Dufrane et　al., Xenotransplantation, 13(3):204-14. May 2006; Toso et　al., Cell Transplantation, 9:297. 2000; Cozzi and Bosio, Curr Opin Organ Transplant, 13(2):155-8. April 2008; Bottino and Cooper, Xenotransplantation, 15(2):104-6. March 2008.
당뇨병의 치료 또는 예방이 필요한 숙주는 당뇨병, 전 당뇨병 또는 당뇨병과 관련된 질환을 가지는 것으로 확인된 숙주일 수 있다. 숙주는 다음 증상들을 겪을 수 있다: 증가된 갈증 또는 허기, 구갈, 빈뇨, 설명되지 않는 체중감소, 피로, 몽롱함, 두통, (드물게)의식소실, 궤양 또는 절단의 치유 지연, 피부 소양, 잦은 이스트균 감염, 최근의 체중증량, 흑색가시세포증이라 불리는 경부, 겨드랑이 및 서혜부의 벨벳성 흑색 피부 변화, 손과 발의 무감각 및 아린감, 시력저하, 임포텐시. "글루코스 내성 손상"이라고도 알려진 전(pre) 당뇨병은 증상이 거의 없는 건강한 상태지만 매우 심각한 2형 당뇨병으로 진전되기 전 거의 항상 나타난다. 미국에서 20세 이상에서 5천만 이상의 사람들이 정상보다 높은 혈당을 가진 전 당뇨병이지만 당뇨병으로 분류되기에는 충분하지 않다. 전 당뇨병을 측정하기 위해서, 2개의 혈액 시험 중 하나로 금식 혈장 글루코스(FPG) 시험과 경구 글루코스 내성 시험(OGTT)을 사용한다. FPG 혈액시험에서는 금식 8시간 후에 혈당 농도를 측정한다. FPG 시험에서, 측정치 100 mg/dL - 125 mg/dL은 전 당뇨병을 나타내며 2개 이상 시험에서 126 mg/dL을 초과하면 당뇨병을 나타낸다. OGTT 시험에서는 금식한 다음 다시 다량의 글루코스를 함유하는 음료를 마신 2시간 후 혈당을 측정한다. OGTT 시험에서, 측정치 140 mg/dL 내지 199 mg/dL은는 전 당뇨병을 나타내며 200 mg/dL을 초과하면 당뇨병을 나타낸다.
실시예
실시예 1: 췌장섬 특이적 발현벡터의 제조
포유동물 발현벡터 pCI-Neo (Promega)를 췌장섬 특이적 발현벡터용 백 드롭으로 제작하였다. 이 벡터는 파지 f1 영역, SV40 인핸서 및 조기 프로모터, 복제의 SV40 최소기원, 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 함유하는 1967 염기쌍(bp) 절편의 Cla1 절단으로 변성되었다. 또한, 인슐린-II 프로모터를 이 벡터에 제한효소 BglII과 Hind III를 사용하여 삽입할 때 CMV 즉시-초기 인핸서/프로모터를 절단하였다.
췌장 특이적 발현벡터의 프로모터 성분으로 작용하는 서열은 래트 인슐린 II 유전자 CDS의 근부(proximal) 서열 상부에서 증폭된 2개의 클론된 서열을 비교하여 선택하였다. 이렇게 증폭된 생성물은 길이가 497bp 내지 767bp로 다양하고; 증폭된 가장 짧은 생성물은 문헌에서 이전에 사용된 것과 거의 상응하였다. 어떤 프로모터 서열 앰플리머(amplimer)가 최선의 선택인지를 결정하기 위하여 GPF의 cDNA를 각 프로모터 서열의 하부에 삽입하고 이 시험벡터를 베타-TC-6 마우스 췌장 인슐린종 세포의 형질주입에 사용하였다. FACS 분석을 수행하여 형질주입된 세포에서 전이유전자(GFP) 발현에 대한 시험을 수행하였다. 이 분석에서는 가장 긴 앰플리머(767bp)가 GFP를 가장 잘 발현하는 것으로 나타났으므로; 췌장 특이적 발현을 생산하기 위해 사용된 모든 벡터는 가장 긴 프로모터 성분을 함유한다.
래트 인슐린 II 유전자 코딩 영역에 대해 5'쪽 767bp 영역을 템플레이트로서 정제된 고분자량 래트 DNA, PFx DNA 폴리머라제(Invitrogen), 및 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하였다;
Figure 112019056805299-pat00001
이 절편은 전이유전자의 췌장 특이적 발현을 가진 돼지와 마우스를 생산하기 위해 사용된 모든 벡터에서 프로모터로 작용한다.
BglII/HindIII 절편인 래트 II (rIns2) 프로모터 영역을, 동시에 pCIneo에서 CMV 인핸서 프로모터(765bp frag)를 제거하는 제한효소 BglII 및 Hind III의 분해에 의해 ClaI-결실 pCI neo 벡터에 삽입하였다.
마우스 PDX-1 유전자 말단 인핸서(483bp)를 템플레이트로서 정제된 고분자량 마우스 DNA, PFx DNA 폴리머라제, 및 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하였다;
Figure 112019056805299-pat00002
Figure 112019056805299-pat00003
마우스 PDX-1 인핸서를 BglII 제한부위 내에서 rInsII 프로모터의 Bgl II/BamHI 절편 5'로 삽입하여 중간체 pInsII 벡터를 제조하였다.
복수의 치킨 β-글로빈 인슐레이터 절편을 인핸서/프로모터/전이유전자 부위와 플랭킹하고 있는 위치에서 벡터에 삽입하였다. 치킨 β-글로빈 인슐레이터(227bp)를 인슐레이터 서열, PFx DNA 폴리머라제 및 프라이머를 함유하는 인하우스 벡터를 사용하여 PCR로 증폭하였다:
Figure 112019056805299-pat00004
Figure 112019056805299-pat00005
ClaI/XbaI 인슐레이터 절편과 SpeI/ClaI 인슐레이터 절편은 이 증폭방법으로 생성되어 3-절편 라이게이션에서 마우스 PDX-1 인핸서를 함유하는 pInsII 벡터의 3' 말단의 ClaI 부위에 삽입되었다.
(상기한)4개의 3' 인슐레이터 절편을 함유하는 벡터에서 인슐레이터 절편의 쌍을 ClaI 분해로 절단하고, DNA 폴리머라제 I, 거대 (Klenow) 절편으로 ClaI 절편을 블런트하여 이렇게 블런트 처리된 절편을 이미 프로모터, 인핸서, 및 3' 플랭킹 인슐레이터를 함유하는 rInsII 벡터의 블런트된 BglII 부위에 삽입하여 카세트의 5' 말단에 대한 인슐레이터를 제조하였다.
기본 벡터를 pREV788이라 지칭하고 췌장섬 특이적 발현을 위한 전이유전자의 이후 모든 삽입에 사용하였다. 삽입된 전이유전자를 함유하는 벡터를 도 1에 나타내었다. 실시예에서 사용된 벡터는 다음과 같다:
pREV788: 이 췌장섬 특이적 벡터 카세트는 치킨 β-글로빈 인슐레이터와 마우스 PDX-1 인핸서가 플랭킹하는 래트 인슐린 II 프로모터를 포함한다. 복수 클로닝 부위(MCS)는, 상부 키메릭 인트론과 하부 SV40 pA 시그널과 함께, 전이유전자 삽입 및 발현에 제공된다.
pREV790: 사람 CD4의 도메인 3과 4 및 C-터미널 서열을 코딩하는 cDNA에 융합된 사람 TFPI cDNA를 함유하는 1841bp Xhol/Notl 절편을 Xho1/Not1-분해된 벡터 카세트에 삽입하였다.
pREV792: 돼지 CTLA4 세포외 영역 cDNA를 함유하는 1637bp Sall/Not1 절편은 사람 IgG1의 힌지 CH2 및 CH3 영역에 가용성 링커에 의해 융합되고, Sa11/Not1-분해된 벡터 카세트에 삽입되었다.
pREV835: 사람 CD39 cDNA를 함유하는 1609bp Xhol/Xhol절편을 Xho1-분해된 벡터 카세트에 삽입하였다.
pCTLA4-Ig과 TFPI에 대한 서열은 부분적으로 미국 특허 제7,432,344호와 제6,423,316호에 기술된 서열에서 유도되었다.
이 벡터들은 2개의 상이한 프라이머리 돼지 태아 세포주에 형질주입되었다(실시예 3 참조) 세포주 183-6-6을 유전자형 동형접합성 GTKO와 CD46에 대한 이형접합성 전이유전자인 웅성 태아에서 단리하였다. 세포주 227-3을 동형접합성 GTKO와 CD46에 대한 동형접합성 전이유전자인 자성 태아(귀 생검)에서 단리하였다.
형질전환 마우스를 생산하여 삽입된 전이유전자인 TFPI으로 췌장 발현벡터를 시험하였다. 이어서, CD39의 췌장 발현이 확인된 돼지(예를 들면, pig 320-2)를 생산하고, 태아(548/A3)를 생산한 다음, 재클론하여 pCTLA4-Ig와 TFPI 전이유전자의 췌장 발현을 나타내는 돼지(예를 들면, pig 347-3)를 생산하였다. 다음 실시예의 돼지들은 모두 동형접합성 GTKO와 CD46 형질전환체인 유전적 배경 하에 생산되었다(사용된 세포주는 183-6-6 또는 227-3이다). 그러므로, 이렇게 생성된 돼지의 게놈은 이종장기이식과 관련하여 3 내지 4개의 유전적 변성을 가지며, 이러한 변성 중 적어도 하나는 췌장섬 이식에서 사용하기 위한 췌장에서 특이적으로 전이유전자를 발현한다.
실시예 2: 췌장 특이적 발현벡터 pREV790를 사용한 TFPI 형질전환 마우스의 생산
접합체 단계 마우스 배아를 암컷 B6C3 F1과 B6C3 F1 수컷(Harlan Sprague Dawley, Dublin, VA)을 짝지어서 얻었다. 암컷을 7.5 IU PMSG (복강내, Calbiochem, San Diego, CA)와 5.0 IU Hcg (복강내, Intervet, Millsboro, DE)로 44 내지 48시간 이후에 과잉배란시켰다. 접합체를 모아서 표준방법((Hogan et al., 1994)으로 FHM (Specialty Media, Lavallette, NJ)에서 조작하였다. 시험관내 배아 배양은 5.0% CO2를 포함하는, KSOM 배지 (Specialty Media) 중에서 37 ℃, 가습 공기 중에서 수행되었다. pREV790 구조물의 전핵 미세주사를 이전에 기술된 방법 (Page et al., 1995 Transgenic Res. 4:12-17)을 사용하여 수행하였다. 주입된 배아를 시험관 내에서 밤새 배양하고, 이들을 꺼내어 FHM으로 옮겼다. 살아있는 2개 세포 배아를 상상임신 ICR 마우스의 난관에 공지된 방법(Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, 2nd edition, 2004)을 사용하여 전이시켜서 이들이 자연적으로 새끼를 낳게 하였다. 21일령에 새끼들을 이유하고 암수를 감별하여 토 노칭(toe notching)으로 확인하였다. 유전자형 분석을 위해 꼬리 말단 생검을 수집하였다.
120개 접합체를 미세주사하여 87개를 밤새 배양하고 76개의 얻어진 2개 세포 배아를 상상임신 수용체에 이식하였다. 19마리의 새끼가 태어났으며, 이 중 4마리를 PCR과 써던 분석으로 스크린하여 pREV790 구조물에 대한 형질전환체가 있는 것 (21%의 형질전환율)을 확인하였다. 이러한 형질전환율은 미세주사법을 사용한 정상적 예상 범위내이다.
실시예 3: 핵 전이용 세포주의 제조
세포주의 단리:
2개 세포주(183-6-6 및 227-3)를 추가 전이유전자를 첨가하는 형질주입 및, 최종적으로 돼지를 생산하는 핵 전이를 위한 유전적 배경으로 사용하였다. 두 개 세포주는 GTKO 돼지(Dai et　al., (2002) Nature biotechnology 20, 251-255; Phelps et　al., Science, (2003) 299:411-414)를 유비쿼터스로 발현하는 hCD46 형질전환 돼지 계통(Loveland et　al., Xenotransplantation, 2004, 11:171:183)으로 사육하여 제조하였다. 2개 세포주를 유전자형과 표현형에 의해 동형접합 GTKO 및 hCD46 형질전환체로 확인하였다. 세포주를 다음과 같이 NT에 사용하기 위해 제조하였다: 태아 섬유아세포 세포주를 임신 36일째에 태아 183-6-6에서 단리하였다. 과도한 열이 발생하지 않도록 서서히 외과적 곡선겸자를 사용하여 태아를 60 메쉬 금속 스크린을 통과시켜 분쇄하였다. 세포 현탁액을 펠렛화하여 20% 소 태아 혈청과 Antibiotic-Antimycotic (Invitrogen)을 함유하는 DMEM에 재현탁하였다. 세포를 3일 동안 배양하고 저온보존하였다.
귀 섬유아세포 세포주를 48일령 돼지(227-3)의 귀 천공으로부터 단리하였다. 귀 천공을 200 프루프(proof)의 에탄올로 세척한 다음 PBS로 세척하였다. 조직을 외과가위로 분쇄하여 냉동보존 이전에 12일 동안 배양하였다. 태아 548/A3를 임신 73일째에 수집하여 발현을 분석(실시예 6-7)하기 위해 췌장 샘플을 단리하였다. 또한, 태아 세포를 (상기한 바와 같이)단리하고 나중의 재클로닝을 위해 보관하였다. (실시예 4).
형질주입을 위한 플라스미드 절편 제조
pREV790 플라스미드 절편을 형질주입을 위해 AatII와 AhdI (New England Biolabs)로 제한효소 분해하여 제조하였다. pREV792를 AseI와 AatII (New England Biolabs)로 분해하여 제조하였다. 분해로 생성된 플라스미드 절편을 1% 저용융 아가로스겔(Cambrex)에서 분리하여 플라스미드 골격을 제거하였다. 목적하는 전이유전자를 함유하는 카세트 절편을 절단하여 얼음 상에서 15분 동안 2배 부피의 1X Agarase 완충액 중에서 2회 인큐베이션하였다. 완충액을 제거하고, 겔을 65 ℃에서 10분 용융하였다. 42 ℃에서 10분 후에, 겔 100 uL 당 1 uL Agarase (New England Biolabs)를 용융하여 42 ℃에서 최소 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1/10 부피의 3 M 소듐 아세테이트를 겔 용융물에 첨가하여 얼음에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 15000 rpm에서 15분 동안 4 ℃로 원심분리하여 분해되지 않은 아가로스를 분리하였다. 2 부피의 100% 에탕올을 상징액에 첨가하고 원심분리하여 DNA 절편을 펠렛화하였다. 70% 에탄올을 사용하여 37 ℃에서 건조하기 전에 펠렛을 세척하였다. 펠렛을 TE에 다시 현탁하였다.
스크리닝을 위한 콜로니의 형질주입, 선택, 수확
돼지 227-3의 돼지류 귀 섬유아세포를 pREV790 (Pdx-rInsII-hTFPI), pREV792 (Pdx-rInsII-pCTLA4-Ig) 및 pREV828 (Puromycin 선택 마커 유전자 벡터)로 형질주입하였다. 약 500만개의 세포를 3 ㎍의 각각의 전이유전자 벡터 및 .5 ㎍의 선택 마커 벡터로 동시-전기천공하였다. 형질주입 48시간 후에, 형질주입 세포를 0.5 mg/ml의 항생제 Puromycin (InvivoGen, San Diego, CA)을 20 x 10cm 디쉬 중에 디쉬 당 약 25,000 세포의 밀도로 첨가하여 선택하였다. 푸로마이신 선택 개시 72시간 후에 배지를 교환하였다. 선택 개시 7일 후에 콜로니를 수확하였다. 70 푸로마이신 내성 콜로니를 수확하여 3일 동안 추가배양하였다. 70 콜로니 중 45를 생육하여 2개의 샘플, 하나는 PCR 분석용, 다른 하나는 팽창용으로 분리하였다. pREV790 및 pREV792에 대한 PCR 분석을 실시예 5에 기술된 바와 같이 수행하였다. 37 더블-PCR 양성 콜로니를 모으고 이후의 핵 전이에서 사용하기 위해 냉동보존하였다.
형질주입에 세포주 183-6-6을 사용한 것을 제외하고, pREV828 및 pREV792와 함께 pREV835 (Pdx-rInsII-CD39) 벡터를 사용하여 콜로니의 동시-형질주입, 선택 및 수확에 유사한 방법을 사용하였다.
실시예 4: 핵 전이(NT)에 의한 복수 형질전환 돼지의 생산
본 발명의 복수 형질전환 돼지를 제조하기 위해 다양한 방법을 사용할 수 있다. 다음은 사용된 공여체 세포(line 227-3 및 line 183-6-6)가 유전적 배경 동형접합성 GTKO (결핍된 작용성 αGT)이고 또한 CD46(및 췌장에서 발현된 CD46: 도 7)에 대한 형질전환체인 일 예이다. 공여체 세포는 NT에 사용하기 전에, 실시예 3에 기술된 바와 같이, 형질주입 및 선택하여 pREV790, pREV792, 및/또는 pREV835 벡터에 대해 양성인 것을 스크린하였다. 일부 경우에서, 형질주입 및 선택된 세포의 복수 콜로니를, 모두 전이유전자에 양성인 것을 스크리닝하여 NT에서 사용하기 전에 함께 모았다.
NT용 공여체 세포(태아 또는 성체 섬유아세포)를 10-20%의 소 태아 혈청과 0-4ng/ml 베이직 섬유아세포 성장인자로 보충된 Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, cat#11995-065)에서, 가습 인큐베이터 중에 질소로 밸런스된 5% O2, 5% CO2 하에 37 ℃에서 배양하였다. 배양에서 세포는 핵 전이 24-48시간 전에 컨플루언시(confluency)에 이르는 적절한 희석으로 세포를 핵 전이과정 3-7일전에 접종하였다. 핵 전이 당일에, 공여체 세포를 배아 재구성에서 사용하기 전에 Trypsin-EDTA (Gibco, cat#25300-054)를 사용하여 약 30-45분 수확하여 적합한 홀딩 배지(예를 들면, Hepes buffered M199, Gibco cat #12350-039) 중에 단일 세포 현탁액을 제조하였다.
NT 과정은 시험관 내 성숙된 난모세포(Desoto Biosciences, Christiansburg, VA)에 대하여 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행되었다(예를 들면, Polejaeva, et　al., (2000) Nature 407, 86-90, Dai et　al., (2002) Nature biotechnology 20, 251-255, Campbell et　al., (2007) Theriogenology 68 Suppl 1, S214-231, Vatja et　al., (2007) Reprod Fertil Dev 19, 403-423 참조). 재구성된 난모세포의 전기융합 및 활성화는 ECM2001 Electrocell Manipulator (BTX Inc., San Diego)를 사용하여 수행하였다. 융합 및 활성화된 핵 전이 배아를 인산염 완충 NCSU-23 배지(J Rprod Fertil Suppl. 1993;48:61-73)의 배양에서 1-4 시간 38.5 ℃로 유지한 다음, 발정 동기화된 수용체 어린 암퇘지(gilt)의 난관에 전이시켰다. 크로스베드 어린 암퇘지(large white/Duroc/Landrace) (280-400 lbs)는 이들의 사료에 혼합된 18-20 mg Matrix (Altrenogest, Hoechst, Warren, NJ)를 경구투여하여 수용체 동물로서 동기화되었다. Matrix를 14일 연속 공급하였다. 사람 Chorionic Gonadotropin (hCG, 1000 units; Intervet America, Millsboro, DE)을 최종 Regu-Mate 처리 105시간 후에 근육내 투여하였다. 배아 전이는 hCG 주사 22-26 시간 후에 중복부 개복술에 의해 수행하였다. Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG, 1000 IU) 및 hCG (500 IU)를 전이 후 10일과 13일에 임신을 유지하기 위해 사용하였다. 전이 후 28일에 초음파에 의해 임신을 확인하였다. 이 후, 주 마다 임신을 모니터하였다. 모든 새끼 돼지가 자연분만으로 출생하였다.
퓨로마이신 선택되고 pREV792 및 pREV835 전이유전자에 대해 양성 스크린된 183-6-6 세포를 사용한 핵 전이는 지금까지 3 배(litter)의 새끼 돼지를 생산하였고; 일부 새끼돼지가 pREV792 및 pREV835 전이유전자에 유전자형 양성이었다. 이 새끼돼지들 중 한 마리, #320-2을 표현형 분석에 사용하였다(실시예 7 참조). 새끼돼지 320-2에서 단리된 섬유아세포를 또한 이어서 핵 전이에 사용(재클로닝)하여 배(litter)와 살아있는 새끼를 생산하였다.
퓨로마이신 선택되고 pREV790 및 pREV792 전이유전자에 대해 양성 스크린된 227-3 세포를 사용한 핵 전이로 태아 548/A3를 생산하였고, 이들은 모 세포주에서 유래한 GTKO 및 CD46 유전적 변성뿐만 아니라 pREV790 및 pREV792 전이유전자에 대해 유전자형 양성이었다. 태아 548/A3에서 단리된 세포를 재클로닝에 사용하고 지금까지 일곱 배(litter)를 생산하였다(표 1 참조). 한 배에서의 새끼돼지 347-3을 실시예 6-7에서 표현형 분석에 사용하였다. 재클론된 새끼돼지 모두 태아 548/A3와 동일한 유전자형을 가지는 것을 확인하였으며, 즉 이들은 pREV790 (TFPI) 및 pREV792 (pCTLA4-Ig) 전이유전자(췌장 특이적 발현)에 대한 형질전환체이고, 또한 CD46 형질전환체 및 GTKO(형질주입에 사용된 세포주의 유전적 배경으로 기인: 227-3)였다. 우리가 아는 한, 이것은 3개 이상의 유전적 변성을 포함하여 생산된 최초의 돼지이다.
Figure 112019056805299-pat00006
*살아있는 새끼돼지는 살아서 태어나서 적어도 24시간 동안 살아있는 새끼돼지이다. 일부 새끼돼지는 전이유전자 발현분석 또는 다른 연구를 위해 다양한 기간에 안락사되었다. 이 중 2마리는 번식용으로 사육되고 있다.
실시예 5: PCR과 써던 블로팅 분석에 의한 세포와 형질전환 동물의 유전자형 분석
유전자형 분석
게놈 DNA를 형질주입된 세포, 및 시험될 각각의 마우스 또는 새끼돼지의 혈액 또는 샘플에서 추출하였다. 간단히 요약하면, 조직 샘플을 밤새 진탕 인큐베이터에서 조직 175mg 당 약 1 ml의 용균액(50 mM Tris pH8.0, 0.15 M NaC1, 0.01 M EDTA, 1% SDS, 25% 소듐 퍼클로레이트 및 1% β-머캡토에탄올 및 Proteinase K)으로 밤새 60 ℃에서 용해하였다. DNA를 이소프로필 알코올, 페놀/클로로포름 순으로 추출하여 침전시켰다. 재용해된 DNA를 RNase (1 mg/ml) + RNase T1 (1000 U/㎕)로 37 ℃에서 1시간 동안, 프로테이나제 K(20 mg/ml)로 55 ℃에서 1시간 동안 처리하고, 페놀/클로로포름으로 추출하고 트리스 에틸렌데아민테트라아세트산(EDTA)에 재현탁하였다. 포유동물 혈액용 DNA 단리 키트(Roche Diagnostics Indianapolis, IN)를 사용하여 전체 혈액샘플에서 DNA를 단리하였다.
써던 블로팅 분석에 있어서, 약 10 ㎍의 DNA를 적절한 제한효소(하기함)로 분해하고 1% 아가로스 겔에서 분리하였다. 전기영동한 다음, DNA를 나일론 멤브레인에 옮기고 3'-말단 digoxigenin 표지된 프로브(프로브 서열은 하기함)로 탐침하였다. 화학발광 물질 시스템(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)을 사용하여 밴드를 검출하였다.
pREV790 - TFPI
통합된 pREV790 구조물의 존재는 래트 인슐린 II 프로모터에서 TFPI 코딩 서열의 5' 영역으로 이어지는 l000 bp 절편을 표적하는 프라이머 790.5L와 790.5R을 사용하여 PCR에 의해 측정하였다.
Figure 112019056805299-pat00007
통합된 pREV790 구조물의 존재는 BamHI 분해를 사용하는 써던 블로팅 분석과 프로브 TFPI5'/3'으로의 탐침에 의해 확인하였다.
TFPI5'/3' 프로브 서열:
GGATTGTGTCGTGCCAATGAGAACAGATTCTACTACAATTCAGTCATTGG
GAAATGCCGCCCATTTAAGTACAGTGGATGTGGGGGAAATGAAAACAATT
TTACTTCCAAACAAGAATGTCTGAGGGCATGTAAAAAAGGTTTCATCCAA
AGAATATCAAAAGGAGGCCTAATTAAAACCAAAAGAAAAAGAAAGAAGCA
GAGAGTGAAAATAGCATATGAAGAAATTTTTGTTAAAAATATcTGcAgGA
ACCAGAAGAAGGTGGAaTTCAAAATAGACATCGTGGTGCTAGCTTTCCAG
AAGGCCTCCAGCATAGTCTATAAGAAAGAGGGGGAACAGGTGGAGTTCTC
CTTCCCACTCGCCTTTACAGTTGAAAAGCTGACGGGCAGTGGCGAGCTGT
GGTGGCAGGCGGAGAGGGCTTCCTCCTCCAAGTCTTGGATCACCTTTGAC
CTGAAGAACAAGGAAGTGTCTGTAAAACGGGTTACCCAGGACCCTAAGCT
CCAGATGGGCAAGAA
pREV792 - pCTLA4-Ig
통합된 pREV792 구조물의 존재는 래트 인슐린 II 프로모터에서 CTLA4 코딩 서열의 5' 영역으로 이어지는 473 bp 절편을 표적하는 프라이머 (792.s 및 792.a)를 사용하여 PCR에 의해 측정하였다. 이 프라이머의 서열은 다음과 같다:
Figure 112019056805299-pat00008
통합된 pREV792 구조물의 존재는 BamHI 분해를 사용하는 써던 블로팅 분석과 프로브 792.s1792/a2265로의 탐침에 의해 확인하였다.
Figure 112019056805299-pat00009
pRE'V835 - CD39
통합된 pREV835 구조물의 존재는 CD39 코딩 영역 내에서 584 bp 절편을 표적화하는 프라이머 CD39R3 및 CD39L3를 사용하여 PCR에 의해 측정하였다.
CD39R3: CATAGAGGCGAAATTGCAGAG
CD39L3: AGTATGGGATTGTGCTGGATG
통합된 pREV835 구조물의 존재는 Sad 분해를 사용하는 써던 블로팅 분석과 프로브 CD39L3/R3로의 탐침에 의해 확인하였다.
Figure 112019056805299-pat00010
실시예 6: 형질전환 돼지에서 유래한 조직의 표현형 분석(pCTLA4-Ig)
pCTLA4-Ig 발현에 대한 웨스턴 블로팅
조직과 세포 용해물을 프로테아제 저해제(Thermo Scientific, Rockford, IL)의 존재 하에서 균질화하여 준비하고 SDS (1% 최종 농도)를 첨가한 다음 원심분리하여 잔류 세포 찌꺼기를 제거하였다. 단백질 농도를 비신코닌산(bicinchoninic acid) (BCA) 단백질 에세이 키트로 측정하였다(Pierce, Rockford, IL). 열 분해되고 β머캡토에탄올 환원된 샘플(l0-20~g 단백질)을 4-12% BisTris SDS 그래디언트 겔 (Invitrogen, Carlsbad, CA)로 분획화하였다. 재조합 사람 CTLA4-Ig/Fc (R&D Systems, Minneapolis, MN)를 표준 대조용 단백질로 사용하였다. 전기영동한 후, 단백질을 니트로셀룰로스 멤브레인에 옮겨서 전체 단백질의 가시화를 위해 Memcode Protein Stain (Thermo Scientific)로 염색하고, 카제인 차단 완충액(Sigma-Aldrich., St. Louis, MO)으로 차단하였다. 차단된 멤브레인을 래빗 항사람 IgG1-호오스래디쉬 퍼옥시다제(HRP) (The Binding Site, San Diego, CA)에서 인큐베이션하였으며, 이것은 pCTLA4-Ig의 사람 IgG1 중쇄 영역을 인식한다. 면역반응성 밴드를 Super Signal West Pico 화학발광 물질 (Thermo Scientific)과 포토그래피 이미지화로 검출하였다.
태아 548/A3, 및 548/A3 세포에서 재클론된 새끼돼지(piglet 347-3)는, 특히 췌장에서 웨스턴에 의해 56 kDa pCTLA4-Ig 단백질의 발현을 나타냈다 (도 2).
실시예 7: 췌장에서 전이유전자를 발현하는 동물의 표현형 분석
조직학 및 면역형광법:
마우스 또는 돼지 췌장을 분리하여 10% 포르말린에 고정하거나 OCT 블럭(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)에서 동결하였다. 포르말린 고정된 조직은 파라핀으로 차단하여 Hematoxylin 및 Eosin (H + E)으로 염색하기 위해 5 ㎛로 절단하였다. H 및 E 염색은 표준 방법으로 수행하였다. 동결된 부분을 크라이오스탯에서 5 ㎛로 절단하여 래빗 항사람 TFPI (폴리클로날, American Diagnostica, Stamford, CT, #4901), 양 항사람 IgG1 (폴리클로날, The Binding Site, Birmingham, UK, #AUOO6), 마우스 항사람 CD46 (clone O.N. 137, mIgG2a, U.S. Biological, Swampscott, MA), 마우스 항사람 CD39 (clone BU6I, mIgG1, Ancell, Bayport, MN) 또는 마우스 항래트 인슐린/프로인슐린 (clone D3E7, mIgG1, Serotec, Oxford, UK)로 염색하였다. 아이소타입 대조군은 래빗 IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), 양 IgG (Jackson), 마우스 IgG2a (clone MRC OX-34, Serotec) 및 마우스 IgG1 (clone MOPC-31C, BD Pharmingen, San Jose, CA), 각각에 대해 수행하였다. 면역형광(IF) 염색은 3-스텝 과정을 사용하여 수행하였다. 동결된 부분을 건조하고 차가운 아세톤(Sigma, St. Louis, MO)에서 고정하여 아비딘-비오틴 블로킹(Invitrogen, Carlsbad, CA)하였다. 2차 Ab 숙주종 혈청 블로킹 스텝을 또한 포함하였다(10% 당나귀 혈청, Jackson). 1차 Ab를 PBS로 희석하고 실온에서 가습 챔버 내에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 사용된 2차 Ab는 45 mm용 비오틴레이트화된 당나귀 항-(래빗, 양 또는 마우스) IgG이고, 사용된 3차 Ab는 30 mm 용 플루오레세인 컨쥬게이트 스트렙 아비딘(Jackson)이다. 스텝 사이에 슬라이드를 PBS로 세척하고, 22x30mm 커버슬립(VWR, West Chester, PA)을 사용하여 커버슬립시켜서 DAPI를 포함하는 Slowfade (Invitrogen)로 보존하였다. 대표적인 조직학 및 IF 사진을 Provis 현미경에서 Olympus DP71 카메라로 찍어 200배 확대하여 DP 컨트롤러 소프트웨어 (Olympus, Center Valley, PA)로 분석하였다.
결과
pREV790 (TFPI) 형질전환 마우스:
대표적인 H+E 조직학에서 보이는 바와 같이, 1년령 마우스는 매우 잘 클러스터된 췌장섬을 가졌다. 이러한 마우스는 췌장섬 특이적 방법으로 hTFPI 을 발현하였고, 염색은 인슐린과 비슷한 방법으로 국소화되었다(도 3).hTFPI 염색은 인슐린 보다 더 강하여 여기에 기술된 시스템을 사용하는 효과적인 췌장섬 특이적 발현을 나타내었다.
pREV790/REV792 형질전환 돼지:
태아 548/A3를 임신 73일에 조직학에 의해 특성화하였다 (도 4). 새끼돼지 347-3 (548/A3의 재클론)을 약 2.5월령에 특성화하였다(도 5). 베타 세포를 분산시켜서 태아 췌장에 확산하였으며, 이것은 대표적인 사진에서 볼 수 있다. hTFPI 및 pCTLA4-Ig (hIgGI Ab)에 대한 염색 패턴은 인슐린과 유사하였다. 염색은 인슐린 보다 hTFPI 및 pCTLA4-Ig에 대해 더 강하였다. 2.5월령의 새끼돼지 347-3은 췌장섬 클러스터를 더 진전하였으며, 여기에서 강력한 염색을 나타냈다. 새끼돼지 347-3의 췌장 특이적 발현은 hTFPI에 대하여 가장 강하였고, pCTLA-4-Ig에 대하여는 다소 덜 강하였으며, 인슐린에 대하여는 훨씬 적었다.
pREV835 (CD39) 형질전환 돼지:
~3.5월령의 새끼돼지 320-2는 췌장섬 클러스터가 완전히 발육되어, 그의 CD39에 대한 강력한 염색을 나타내었다. 이전의 마우스와 돼지 실시예에서 보이는 바와 같이, hCD39에 대한 320-2에서의 췌장섬 특이적 발현은 인슐린에 대해서 보다 강하였다 (도 6).
실시예 8: 췌장섬 분리 및 형질전환 마우스와 새끼돼지 췌장섬의 시험관내 응고 에세이
돼지와 마우스 췌장섬을 단리하고, 배양하여 당업계에 알려진 실험방법을 사용하여 시험관내 응고(응고시간)를 시험할 수 있으며, 그 예를 여기에 기재하였다.
췌장섬 단리 및 배양 방법:
Figure 112019056805299-pat00011
마우스 췌장섬 단리방법:
췌장을 수확하기 직전에 마우스를 희생하였다. 수확하여 멸균 조건 하에 플로우 후드 내에서 단리과정을 수행하였다. 개복술을 시행하고 피부와 체벽을 머리쪽을 향해 당겼다. 간이 횡경막에 대해 되돌아가게 된다. 온쓸개의 정확한 위치를 찾고 장과의 접합부를 따라간다. 십이지장 주위와 담관 말단에 클램프를 설치하여 담관에서 장으로의 흐름을 막았다.
3 ml 또는 5 ml 시린지를 차가운 콜라게나제 용액으로 채우고 30G 바늘을 부착하였다. 바늘을 샤프트 아래로 약 절반 가량 구부려서 90도 각을 만들었다. 담관에 바늘을 삽입하고 간에 근접하여 바늘이 장을 향하게 하였다. 가능한 담관을 더이상 손상하지 않으면서(천공이 발생하지 않게) 바늘을 담관에 밀어넣었다. 콜라게나제를 췌장이 충분히 팽창될 때까지 췌장에 주입하였다. 장으로 누출되지 않도록 먼저 소량만 주입한다. 누출되면, 클램프를 재조정한다. 동물의 크기에 따라 팽창에 2-5 ml의 콜라게나제가 사용될 수 있다. 췌장 팽창 후에, 바늘과 클램프를 제거하였다. 부착조직과 담관을 절제하여 췌장을 분리하였다. 최대 수율을 위해 전체 췌장을 분리하였다. 분리된 췌장을 차가운 콜라게나제 용액으로 세척하고 25 cm2 플라스크에 담아서 다른 췌장 모두가 수집될 때까지 빙냉하였다. 4개 이상의 췌장을 한 플라스크에 두지 않는다. 인큐베이션 전에 플라스크에 1-2 ml를 추가하였다. 플라스크를 37℃에서 18-20분 동안 진탕없이 인큐베이션하였다.
인큐베이션한 후, 플라스크를 약 10초 동안 또는 조직이 균질화될 때까지 진탕하였다. 플라스크에 10 ml의 차가운 HBSS-BSA를 첨가하여 효소작용을 중지시켰다. 마개를 씌우고 플라스크를 다시 2-3초 이상 진탕하였다. 조직 슬러리를 50 ml 코니칼 튜브에 따르고 HBSS-BSA로 50 ml까지 채웠다. 혼합하고 5분 동안 중력침강시켰다. 이는 췌장섬이 아닌 조직의 미세 입자들을 제거하기 위한 것이다. 췌장섬은 크고 원심분리 없이 바닥에 가라앉는다. 느슨하게 침강된 펠렛을 교란하지 않고 상징액을 제거하였다. 펠렛을 피펫팅 또는 진탕에 의해 혼합하고 다시 세척하였다. 상징액이 비교적 투명해질 때까지 세척단계를 2-5회 반복하였다. 세척량은 사용된 조직의 크기에 따라 다르다. 분해되지 않은 조직의 덩어리는 2차 또는 3차 세척에서 조직을 와이어 20메쉬 스크린에 통과시켜서 제거할 수 있다. 최종 세척 후에, 펠렛을 췌장 당 5 ml HBSS-BSA의 비율로 재현탁하였다. 분해된 조직을 나누어 17 X 100 mm (14m1) 둥근바닥 폴리스티렌 튜브에 옮겼다. 하나의 튜브에 췌장 2개만을 넣는다. 튜브를 1000 RPM에서 1분 동안 서서히 원심분리하여 조직을 펠렛화하였다. Ficoll 그래디언트를 희석하지 않도록 펠렛에서 가능한 많은 상징액을 제거하였다. 4 ml의 25% Ficoll 용액을 튜브에 첨가하여 5-10초 동안 보텍싱하여 조직을 재현탁하였다. 23%로 출발하여, 20.5% 및 최종적으로 11%로 남아있는 Ficoll 그래디언트(각각 2 ml)를 오버레이하였다. 층 또는 경계면을 교란하거나 혼합하지 않는다. 튜브를 1800 RPM에서 10분 동안 원심분리하였다.
원심분리한 후, 췌장섬은 대부분 11 & 20.5% 층간 및 20.5 & 23% 사이 경계면에 있다. 층과 경계면 모두를 별도로 취하여 이들을 15 ml 코니칼 튜브에 넣었다. 버리기 전에 모든 층을 췌장섬에 대해 시험하였다. 이 층들을 HBSS-BSA로 1회 세척하였다. 1분 동안 1000 RPM에서 원심분리하였다. 피펫으로 상징액을 제거하였다. 전체 배지를 한번 더 세척하고 3-5분 동안 중력침강시켰다. 피펫으로 상징액을 제거하였다. 펠릿을 교란하지 않는다. 튜브에 남아있는 것을 모아서 60 mm의 조직이 없는 배양 멸균 페트리 디쉬에 옮겼다. 췌장섬을 정선하여 계수할 준비를 하였다.
콜라게나제를 사용한 돼지 췌장 분해
콜라게나제(Liberase PI or Collagenase P, Roche)를 준비하였다. 1mg/콜라게나제/ml를 포함하는 HBSS 용액을 제조하였다. 사용할 때까지 빙냉 하에 보관하였다. 사용 전에 24 ℃가 되게 한다. 성체 돼지의 전체 췌장에 대해 500 ml의 용액을 제조하였다.
1. 얼음 상의 멸균버킷에서, 췌장의 결합조직, 지방, 혈액을 제거한다.
2. 얼음에서 기관을 꺼낸다.
3. 췌장관의 정확한 위치를 찾은 다음, (전체 췌장을 사용하려면) 췌장관을 통해 콜라게나제를 주입한다. 선택적으로, 부분적 기관 샘플에 대해서이거나, 췌장관을 찾을 수 없다면 콜라게나제를 직접 유조직에 주입한다.
4. 주입을 최대 5분까지 계속할 수 있다.
5. 기관을 조각으로 잘라서(각각 1/2 인치) 비이커에 미리 가온한 (전체 조각을 커버하기에 충분한)콜라게나제와 함께 넣는다.
6. 37 ℃의 수조로 옮겨서 수동으로 진탕을 계속한다.
7. 몇 분 후에 조직이 분해하기 시작한다. 전체 조각이 분해되지는 않을 수 있다. 유리된 세포의 과분해를 피해야 하므로, 진탕 10분 후에 용액이 불투명해지면 피펫으로 자유 세포를 회수하기 시작하여 세포를 혈청(5%)을 함유하는 다량의 차가운 RPMI 용액이 있는 병 또는 비이커(빙냉 하)에 옮긴다.
8. 충분한 세포가 수집될 때까지 온난 분해를 계속하지만, 조직을 30분 이상 온난 콜라게나제에 노출되지 않게 한다.
9. 세포를 차가운 RPMI + 혈청으로 수회 세척하여 콜라게나제를 제거한다.
10. 1000 RPM에서 3분 동안 원심분리한다.
11. 단리된 췌장섬을 얻기 위해, ficoll 그랜디언트를 수행한다.
12. 소량의 조직 펠렛에 대하여 50 ml 코니칼 튜브를 사용한다.
13. 비중 그래디언트를 만든다: 스톡 1.132, 층 1.108, 1.096, 1.037.
14. 10 ml의 스톡 Ficoll에 분산된 2 ml의 펠렛을 바닥에 로딩한다. 상부에 8 ml의 1.108, 8 ml의 1.096. 8 ml의 1.037, 및 5 ml of HBSS.
15. 800 g 또는 2000 rpm에서 20분 동안 원심분리한다.
16. 췌장섬은 제2 및 제3 경계면에 있어야 하지만, 다른 층도 확인한다.
17. ficoll을 잘 세척(RPMI + 혈청으로, 1200 rpm에서 3분 동안 적어도 3회 세척)한 다음, 필요한 세포를 배양하거나 고정한다.
시험관내 응고(응고 시간) 에세이를 위한 방법:
재료
- CMRL-1066 배지(Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA), 37 ℃
- 인큐베이터 진탕기, 37 ℃
- 폴리스티렌 미처리 24웰 플레이트
- 피펫
- 1 mL 주사기
- 배큐테이너(Vacutainer) 세트: 바늘, 고무밴드
- 알코올 스와프
- 밴드에이드
- 쓰레기통
- 타이머
방법
- 100개의 정선된 췌장섬을 웰당 37 ℃의 200 uL CMRL 배지에 도말하였다.
- 혈액만을 대조용 웰의 37 ℃, 200 uL CMRL 배지에 도말하였다.
- 각 웰에 200 uL의 새로 추출한 사람 혈액을 첨가하였다.
- 플레이트를 진탕하여 부드럽게 혼합하고 플레이트를 인큐베이터 진탕기에 옮겼다.
- 응고 시간 동안 실험을 관찰하였다.
췌장섬을 상기한 방법들을 사용하여 단리하였다. 정상 야생형(WT) 마우스 또는 돼지 췌장섬을 대조용으로 사용하였다. 췌장섬은 또한 TFPI-형질전환 마우스 라인(pREV790; 실시예 2 참조)으로부터 제조되었다. TFPI 형질전환 돼지 췌장섬을 실시예 4에 기술된 548/A3 돼지라인으로부터 얻었다. 췌장섬을 새로 단리된사람 혈액과 혼합하고 응혈 형성에 대해 응고 시간을 측정하였다. 사람 혈액에 노출된 형질전환 마우스와 돼지 췌장섬(2개의 별도 시험)의 시험관내 응고 시간(분)을 표 2에 나타내었다.
Figure 112019056805299-pat00012
췌장섬에서 전이유전자의 발현은 마우스 췌장섬의 응고 시간 33% 증가, 및 돼지 췌장섬의 응고 시간 38% 증가를 유발하였다.
실시예 9: 비사람 영장류( NHP ) 이식에서 형질전환 돼지 췌장섬 이종이식편의 생체내 기능성 측정
NHP에서 당뇨병 및 면역억제 유발:
비사람 영장류 모델에서, 사이노몰구스(cynomolgous) 원숭이에 적용된 최근 개발된 스트렙토조톡신(streptozotocin) 방법을 사용하여 화학적으로 당뇨병을 유발할 수 있으며, 당뇨병 상태 및 공여체 췌장섬 생존/기능을 인슐린과 영장류-특이적 및 돼지-특이적 C-펩티드 에세이를 사용하여 관찰할 수 있다(Rood et al. 2006, Casu et al 2008, Bottino et al. 2009).
사람 항-CD 154mAB와 유사한 활성을 가지는, 공동자극 차단약물, 사람 CTLA4Ig를 ATG 유도요법 및 MMF를 사용한 유지요법과 병용하여 사용할 수 있다. CTLA4-Ig는 현재 CD 154mAB에 대한 강력한 대안이며, 이미 돼지 대 비사람 영장류 췌장섬 Tx를 위한 한 그룹에서 사용되고 있다(Cardona et al., 2006). CTLA4Ig (Orencia)는 STZ-유발 당뇨병 원숭이에게 12.5-25mg/kg i.v.로, 동시 간격에 항-CD 154mAb (-l, 0, 4, 7, 10, 14, 19일, 및 매주, 저점 농도 >300ng/ml 유지)로서 투여될 수 있다. 이러한 복용 요법은 ATG 및 MMF와 함께, 예비 연구에서 GTKO 돼지 동맥 이식을 받은 개코원숭이에서 민감화를 방지하는데 충분하다는 것이 입증되었다(Ezzelarab et al, manuscript in preparation).
요약하면, 췌장섬 이식에 대한 NHP의 면역억제는 다음과 같다:
유도:
- T 세포수를 0일에 <500 세포/mm3로 감소시키기 위해 항티모사이트(anti-thymocyte) 글로불린 (ATG) 1-10mg/kg i.v. x2 (-3 및 -1일)
유지:
- 3-6ug/ml에서 전체 혈액 저점농도를 12시간 유지하기 위해 마이코페놀레이트 모페틸(MMF) 50-100mg/kg/일 p.o.
- -1, 0, 4, 7, 10, 14일 및 이후 매주, CTLA4-Ig 25mg/kg i.v.
돼지 췌장섬 제조 및 이식:
돼지 췌장섬 단리를 마취시킨 돼지 공여체에서 췌장을 분리한 후 수행하였다. 돼지 췌장섬을 Ricordi가 기술한 반자동방법의 변성을 사용하여 얻었으며, 돼지용으로 설계된 특이적 콜라게나제 블렌드, 낮은 분해온도, 효소의 완만한 주입 및 사실상 무기계적교반을 사용하였다(Bottino et al., 2007). 췌장섬은 불연속 그래디언트(Bottino et al., 2007, 2009)에서 세포 가공기(COBE 29911)로 원심분리하여 정제되었다. 단리된 췌장섬의 기능특성과 생존성은 각각의 췌장섬 배치에 대해 평가하였다. 자가면역 1형 당뇨병의 비사람 영장류 모델이 없는 경우, 고혈당증은 스트렙토조톡신(STZ, Zanosar, 125-150mg/kg)의 정맥내 주사로 유발되었다. 혈관라인을 원숭이의 경동맥과 경정맥에 삽입하고 테터(tether) 시스템에 연결하여 약물 전달과 혈액 추출이 용이하고 당뇨병 유발 이후에 최적의 i.v. 인슐린 투약이 가능하다. 정맥내 글루코스 내성 시험(IVGTT) 및 아르기닌 자극 시험(AST)을 스트렙토조톡신 투여 전과 후에 수행하여 당뇨병 상태를 확인하고, 이식 후, 분비증강제에 대한 이식 반응을 평가하였다. 이식 당일에, 췌장섬을, 10% 열로 불활성화된 소 태아 혈청, 10mM 니코틴아미드, 2 mM 글루타민 및 Pen-Strepto가 공급된 CMRL-1066 배지에서 밤새 배양하고, 계수하여 응고를 방지하기 위한 4mg 덱스트란 설페이트를 함유하는 CMRL에 재현탁하고 5-10분의 기간에 걸쳐 중력에 의해 문맥 내 주입하였다. 췌장섬 세포 분해의 표시인 돼지 C-펩티드 방출을 췌장섬을 주입하고 1시간 및 2시간 후에 측정하였고, 피크값은 IBMIR로 인한 초기 췌장섬 세포 손실 정도를 나타낸다. 이전 실험에서 발생한 조직한 데이터를 전이유전자의 조기 췌장섬 손실을 방지하는 능력을 평가하는데 사용할 수 있다. 혈청 C-펩티드 농도를 서로 교차반응하지 않는 특이적 돼지 및 사람 항체를 사용해서 측정하였으며, 이것은 이종장기이식 후 내인성 및 이식 인슐린 생산을 구별할 수 있게 되었다(Casu et al. 2008).
IBMIR로부터의 췌장섬의 조기 상실은 다음과 같은 방법으로 관찰할 수 있다: (i) 처음 24시간 이내의 C-펩티드 농도 측정(췌장섬 분해의 마커), (ii) 혈당 농도, (iii) Tx후의 외인성 인슐린 요구량(정상혈당 상태의 유지에서 이식의 성공의 표시) (iv) 간에서 살아있는 많은 췌장섬의 존재(인슐린 양성), 및 (v) 검시후 조직학 실험에서 이식물의 세포내 침입 정도.
실시예 10: 당뇨병 원숭이에서 CD46 형질전환 돼지 췌장섬의 생체내 기능
영장류에서 당뇨병 치료를 위한 CD46 발현 세포의 유용성을 측정하기 위하여 실시예 9에 기술한 바와 같이 사이노몰구스 원숭이에서 당뇨병을 화학적으로 유도하였다.
hCD46+ 돼지 췌장섬 공여체는 그의 내인성 프로모터 조절하의 미니유전자인 hCD46 전이유전자를 수반하는 전구라인에서 아웃크로싱에 의해 유도하였다. 유비쿼터스 hCD46 발현은 분석된 모든 조직 및 단리된 췌장섬의 면역형광 현미경에 의해 관찰되었다(Loveland et al., Xenotransplantation, 2004, 11:171:183). 실시예 9에서와 같이 당뇨병을 유발하고 9마리의 원숭이 수용체에서 확인하였다. 그룹 A의 수용체(n=4)에게는 야생형 돼지 췌장섬(n=2) 또는 GTKO 돼지에서 단리된 췌장성(n=2)을 체중 kg 당 85,000 내지 100,000 IEQ로 이식하였다. 그룹 B 수용체(n=5)는 hCD46+ 돼지에서 유래한 췌장섬의 동일한 숫자가 제공되었다. 2마리의 그룹 B 동물에게는 49일과 91일 후에 각각 재이식되었다. 면역억제는 양 그룹에서 동일하였고 유도를 위한 항티모사이트 글로불린, 항-CD154 모노클로날 항체 및 마이코페놀라이트 모페틸(MMF)을 포함하였다. 원숭이는 이식 작용을 상실할 때까지 또는 이식 후 3개월까지 이어졌고, 1년 이상 추적되는 그룹 B의 동물 한 마리는 예외로 하였다.
외인성 인슐린 요구량의 50% 이상 감소와 함께 검출가능한 돼지 C-펩티드에 의해 측정된 기능성 돼지 췌장섬 생존율은 모든 원숭이에서 얻어졌다. 그룹 A에서, 췌장성 생존은 7, 20, 31, 및 46일 동안 지속됐다. 그룹 B에서, hCD46+ 췌장섬의 사용은 기능성 돼지 췌장섬 생존을 3개월을 채워서 또는 후속군에 대해서는 1년 이상까지 각각 지속됐다(log-rank test P=0.0042). 이식후 매주 금식한 돼지 C-펩티드 농도는 처음 45일 동안 그룹 A와 B가 필적할 만하였다(1.10±0.41 대 1.19±0.88 ng/mL, 학생 t-시험 P=0.860). 45일 후, C-펩티드 양성 (positivity )은 그룹 B 수용체에서만 0.87 ± 0.41 ng/mL로 유지되었다.
인슐린 독립성은 5, 17, 및 36일의 기간 동안 각각 그룹 A 원숭이 4마리 중 3마리에서 얻어졌다. 그룹 B 원숭이 5마리 중 4마리는 각각 87, 91 92, 및 >396일 동안 인슐린 독립적이 되었다. 인슐린 독립 기간 동안, 금식 혈당값은 잘 조절되었다(그룹 A: 91±18 mg/dL; 그룹 B: 112±22 mg/dL, 학생 t-시험 P=0.250). 어떤 원숭이에서도 내인성 베타 세포 기능이 복구되지는 않았다.
이식후 간의 조직학적 평가는 그룹 B 동물에서 살아있는 많은 돼지 췌장섬을 나타냈다. T 세포 침윤은 성공적으로 억제되었다. 항-Gal 및/또는 항-비Gal 항체의 혈청 농도는 그룹 A 또는 그룹 B 원숭이 어느 쪽에서도 증가하지 않았으며, 재이식 후에도 증가하지 않았다. 그럼에도 불구하고, IgM, IgG, 및 C4d는 그룹 A 간의 조직학 분석에 의해 그래프팅된 췌장섬에서 나타났으나 그룹 B 간에서는 적은 범위로만 나타났다.
단지 전이유전자로서 CD46으로는 여전히 다량의 췌장섬이 필요하며(75,000-100,000 IEQ/kg), hCD46 이종이식편과 결합된 상당한 조기 이식편 손실이 여전히 남아있다. 또한, 사용된 외인성 면역억제 요법은 사람 환자에게 사용하는 것이 받아들여지지 않는다(van der Windt et al., Am. J. Transplantation, 9(12):2716-2726. 2009 참조).
실시예 11: pCTLA4-Ig를 발현하는 돼지의 표현형
pCTLA4-Ig를 발현하는 동물의 개발이 제안되었지만, 이러한 동물은 심각하게 면역손상된다. CAG 인핸서/프로모터를 유비쿼터스로 사용하여 CTLA4-Ig를 발현하는 돼지는 면역손상 표현형을 가지는 것으로 확인되었으며 전형적인 사육 환경에서 생존하지 못하였다.
WT 또는 GTKO 돼지의 원발성 태아 섬유아세포(Landrace/Duroc/Large White crosses에서 유래)를 전기천공으로 pgkpuromycinr 또는 pgkncomycinr 벡터에 대한 10:1 비율의 선형 pCTLA4-Ig 구조물로 동시 형질주입하였다. 48시간에, 세포를 100-500 세포/cm2 농도의 48-웰 플레이트에 접종하고, 250 ㎍/ml G418 (Gibco BRL, Grand Island, NY) 또는 0.5 ㎍/ml 푸로마이신 (InvivoGen, San Diego, CA)으로 선별하였다. 선별된 클론을 pCTLA4-Ig 전이유전자에 대해 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)로 스크린하고, 양성 클론(WT 배경을 가지는 8, GTKO 배경을 가지는 70)을 합하여 핵 전이에 사용하였다. 이러한 세포에 대해 상기한 핵 전이를 수행하였다. 동물들은 분리된 축사에서 분만시켜서 병원균에 대한 노출을 최소화하고 출생시부터 안락사할 때까지 테트라사이클린(110g/kg 사료)을 함유하는 사료를 제공하였다. pCTLA4-Ig 발현은 웨스턴 블로팅과 면역형광을 나타내는 로부스트 발현으로 평가하였다. pCTLA4-Ig의 혈청 농도는 혈청 ml 당 약 380 내지 1,600 ㎍ 범위로 높았다.
pCTLA4-Ig 형질전환 돼지와 비형질전환 한배 새끼들은 약 2개월 동안 건강한 것으로 보였다. 이 지점에서 형질전환 새끼돼지들은 열, 일반적인 거북함, 비정상적 털 성장 및, 일부에서는 피부병소 등의 질환의 증상을 나타내기 시작했다. WT/pCTLA4-Ig 돼지에서, 이들은 모돈(새끼돼지들의 어미)에서 이유되어 전체 무리 사육장에 수용되었으며, 질환들이 급성이 되어 증상후 분명히 급속하게 죽었다. 대부분의 형질전환 돼지들은 질환을 견디지 못하거나 10-11주령에 안락사가 필요하였다. 이러한 배에서의 비형질전환 한배 새끼들은 건강하게 남아있었다. 혈액학적 분석에서는, 예방적 처치없이 형질전환 돼지는 이들의 비형질전환 한배 새끼들과 비교하여 백혈구 세포 (WBC) 수가 정상값의 53% 내지 71%의 범위로 낮은 것으로 나타났다. 전체 림프구 수 또한 이러한 동물에서 정상값의 14% 내지 61%의 범위로, 정상 이하였다.
동형접합 GTKO 배경에서 생산된 CAG-pCTLA4-Ig 형질전환 돼지는 더 많은 만성 질환을 나타냈고, 항생제 치료에도 불구하고 이 돼지들의 건강은 계속 악화되어 대략 10주령에 남은 돼지들을 안락사시켰다. 4마리의 비형질전환 한배 새끼들은 이들의 CTLA4-형질전환 형제들과 함께 사육되어 건강하고 활발하게 남아있었다(Phelps et al., Xenotransplantation, 16(6):477-485. 2009 참조).
실시예 12: 5개 유전적 변성을 함유하는 돼지의 생산 ( GTKO , CD46, 및 췌장섬 특이적 TFPI, CTLA4-Ig 및 CD39)
태아 548/A3 유래의 세포에 대한 형질주입(유전적 변성: 동형접합 GTKO/ CD46/TFPI/CTLA4-Ig)을 수행하여 pREV835 (CD39) 전이유전자를 첨가하였다. 태아 섬유아세포를 pREV835 전이유전자로 실시예 3에 기술된 것과 유사한 방법으로 형질 주입하였다. 99개의 콜로니를 수확하여 pREV835 전이유전자의 존재에 대해 실시예 5에 기술된 방법을 사용하여 스크린하였다. 10개 양성 콜로니를 합하여 핵 전이에서 사용하기 위해 준비하였다. 핵 전이는 모아진 pREV835 양성 세포를 핵 공여체로 사용하여 실시예 4에 기술된 방법에 따라 수행하였다. 배아를 4마리의 수용체 어린암퇘지에게 전이하고 2마리의 임신을 구축하였다. 10마리가 태어났고, 이들 중 4마리가 살아있었다. 유전자형 분석에서는 4마리의 갓태어난 살아있는 돼지가 548/A3 라인의 4개 유전적 변성(GTKO/CD46/ TFPI/CTLA4-Ig) 이외에 pREV835(CD39) 전이유전자를 함유하는 것으로 나타났다. 우리가 아는 한, 이것은 4개 이상의 유전적 변성을 포함하는 돼지를 생산한 최초이다.
실시예 13: 복수 형질전환 돼지의 생식력, 안정한 트랜스미션 및 복수 형질전환 돼지가 자연적으로 사육될 때 후대로의 복수 전이유전자의 코세그리게이션 (co-segregation)
자성 돼지 347-2 (548/A3 공여체 세포를 사용하는 NT에 의해 생산된 돼지)와 동형접합 GTKO 웅성 돼지와의 자연적 번식으로 정상적 임신이 발생하여 8마리의 한배 새끼돼지들이 태어났으며, 이로써 복수 형질전환 동물의 생식력이 입증되었다. 이들 중 5마리가 살아서 태어났다. 태어난 살아있는 돼지들 중 2마리는 모세포주에 고유한 GTKO 및 CD46 유전적 변성뿐만 아니라 이들의 어미(TFPI 및 CTLA4-Ig)로부터 트랜스미션된 2개의 추가 췌장섬 특이적 (548/A3 라인) 전이유전자를 담지하였다. 다른 3마리의 새끼는 GTKO 및 CD46에 대해서만 양성이었다. 이하의 표에는 347-2 새끼돼지의 유전자형을 요약하였다(써던 분석으로 측정).
Figure 112019056805299-pat00013
써던 분석에서는, TFPI로 형질전환한 모든 동물이 또한 CTLA4Ig에 대한 형질전환인 것으로 나타났으며; 이것은 TFPI 및 CTLA4-Ig 전이유전자가 돼지 게놈에서 동시통합되고, 감수분열 동안 코세그리게이션되며, 번식을 통해 트랜스미션된 것을 시사한다. 548A3 라인을 번식하여 생산된 후대에서는 2개 췌장섬 특이적 전이유전자중 하나를 함께 가지거나 어떤 췌장섬 특이적 전이유전자도 갖지 않는다. 후대 동물 417-4에 대한 형광물질 제자리 하이브리다이제이션(FISH) 분석은 진행중이며, 이러한 공동통합을 추가로 분석한다. 이 분석에서 CTLA4Ig 및 TFPI에 대한 프로브는 뚜렷한 형광 태그로 표지되고 염색체 DNA와 하이브리다이즈된다. 단일 위치에서 2개 프로브의 하이브리다이제이션은 이러한 전이유전자들이 동시통합되어 돼지들의 차후 세대에서 함께 유전된다는 것을 나타낸다. 동물 417-4는 추후 번식을 위해 자라고 있다.
실시예 14: CD39 양성 돼지 췌장섬 세포의 ATP아제(ATPase) 작용성 에세이
돼지 390-1로부터 돼지 췌장섬의 단리:
췌장 조직을 실시예 12에서 생산된 5개 유전적 변성을 가지는 돼지인, 동물 390-1로부터 얻었다. 췌장을 지방으로 트림하여 차가운 HBSS + 0.5mg/ml의 콜라게나제 P (Roche Applied Science, Indianapolis, IN)를 주입하였다. 췌장을 37 ℃로 30분 동안 가온하였다. 다음으로, 차가운 HBSS로 옮기고 기관을 겸자를 사용하여 분쇄하였다. 분산된 조직을 메쉬 스크린(30 메쉬)을 통과시켜서 조직의 큰 조각은 제거하였다. 췌장섬을 OptiprepTM(Axis-Shield, Oslo, Norway) 방법을 사용하여 정제하였다. 조직 펠렛을 20 ml의 RPMI와 10 ml의 Optiprep 작업용액 (최종농도 1.1 g/ml)에 재현탁하였다. 8 ml의 1.085 OptiprepTM을 오버레이한 다음, 10 ml의 RPMI를 사용하였다. 튜브를 500 x g에서 5분 동안 4 ℃에서 회전시켰다. 상부 경계면에 존재하는 췌장섬을 분리하고 샘플을 염색하여 췌장섬의 존재를 확인하였다. 췌장섬을 ATP아제 에세이 준비에서 96 웰 플레이트에 도말하였다.
390-1 췌장섬에 대한 ATP아제 에세이:
CD39는 ATP 및 ADP를 AMP(즉, 포스페이트를 유리)로 촉매하는 세포외 효소이다. 그러므로, ATP아제 색소생성(chromogenic) 에세이(QuantiChromTM ATPase/GTPase Assay Kit, BioAssay Systems (Hayward, CA))는 포스페이트의 유리량을 측정하며, 야생형 돼지에서 단리된 췌장섬과 비교하여 돼지 췌장섬 내의 CD39 전이유전자의 기능성을 측정하기 위해 사용되었다. CD39의 높은 수준의 유비쿼터스 발현을 가지는 돼지(동물 325.1)에서 유래한 태아 섬유아세포를 양성 대조용으로 사용하였다.
세포를 희석하여 96 웰 플레이트의 횡렬에 컨플루언시를 제공하고, 제2 횡렬의 웰에서 1:10 희석하였다. 수용된 모든 세포를 트리스 완충 식염수(TBS)로 세척하였다. 세포를 밤새 동결하고, 해동하여 6 컨플루언트 웰의 내용물을 모아서 100ul TBS의 최종 부피에 현탁하였다. 이 부피를 2개 2 1.5ml Eppendorf 튜브(50ul/ea)로 나누었다. 각 튜브에 첨가하였다:
90ul 2X 샘플 희석
1.8ul 100mM ATP (1mM 최종 농도) 또는 H2O
38.2ul H2O
반응 믹스를 진탕하면서 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 8000 rpm으로 원심분리하였다. 10 ul의 상징액을 190 ul의 H2O와 혼합(1:20 희석)하였다. 이 희석액 80 ul 부피를 96 웰 플레이트의 제1열의 웰에 첨가하였다. 웰의 컬럼을 따라 하부로 2배씩 연속 희석하여 1:20 내지 1:2560으로 희석하였다. 포스페이트 희석액(0-50uM)을 제조하고 플레이트에 첨가하여 표준곡선으로 하였다. ATP아제 키트의 Malachite 그린 시약(200ul)을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 실온에서 45분 동안 인큐베이션하였다. OD620에서 판독을 수행하고 유리된 포스페이트의 농도를 포스페이트 표준 곡선으로부터 내삽하여 결정하였다.
도 8에서 보이는 바와 같이, 돼지 390-1의 췌장섬은 야생형 췌장섬 보다 더 높은 농도의 포스페이트를 유리하였으며, 이것은 발현된 CD39 전이유전자의 기능을 나타낸다.
실시예 15: 복수 형질전환 돼지에서 유래한 췌장 조직의 면역형광법
췌장 조직의 샘플을 약 3개월령의 돼지 390-1 (유전자형: GTKO, CD46, TFPI, CTLA4-Ig 및 CD39 형질전환)에서 수집하여 실시예 7에 기술된 바와 같이 IF에 의해 표현형으로 특성화하였다. 강력한 염색이 췌장의 모든 형질전환 단백질에 대해 나타났으며; D46, TFPI, CTLA4-Ig, 및 CD39 (도 9); 특히 췌장섬 세포 성분에서 나타났다. 시험된 조직에서 췌장섬의 인슐린 염색 또한 나타났다. TFPI, CTLA4-Ig 및 CD39의 발현은 췌장섬 특이적이며 시험된 다른 조직/기관(표시하지 않음)에서는 나타나지 않았다. 모든 아이소타입 대조용은 염색에 대하여 음성이었다(나타내지 않음).

Claims (11)

  1. (ⅰ) 기능성 알파 1,3 갈락토실트랜스퍼라제의 발현 결실(GTKO);
    (ⅱ) 보체 저해제 전이유전자인 CD46의 도입, 및 췌장섬 세포 및 조직에서의 그의 발현;
    (ⅲ) 면역억제제 전이유전자인 CTLA4-Ig의 도입, 및 췌장섬 세포 및 조직에서의 그의 발현; 및
    (ⅳ) 조직 인자 경로 저해제(TFPI) 및 CD39로 구성된 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 항응고제 전이유전자의 도입, 및 췌장섬 세포 및 조직에서의 그의 발현의 유전자 변형을 갖는 돼지 동물로부터 유래된 돼지 췌장 조직 또는 세포를 포함하는, 당뇨병 숙주에서 당뇨병을 치료 또는 예방하기 위한 약제로서,
    상기 당뇨병 숙주에 상기 약제의 이식 후, 상기 숙주는 기능성 이식 돼지 췌장 조직 또는 세포를 가지고,
    상기 돼지 동물로부터 분리한 형질전환 돼지 췌장섬 세포는 숙주에 이식 후 비-형질전환 돼지 췌장섬 세포와 비교하여 인슐린을 생성하고, 즉각적인 혈액 매개 염증 반응(IBMIR)을 감소시키는, 약제.
  2. 제1항에 있어서, 췌장 조직 또는 세포가 췌장 조직인 것을 특징으로 하는 약제.
  3. 제1항에 있어서, 췌장 조직 또는 세포가 성체, 신생아 또는 태아 기원인 것을 특징으로 하는 약제.
  4. 제3항에 있어서, 췌장 세포가 췌장섬 또는 베타 세포인 것을 특징으로 하는 약제.
  5. 제3항에 있어서, 췌장 세포가 캡슐화된 것을 특징으로 하는 약제.
  6. 제1항에 있어서, 돼지 동물이 2개의 항응고제 전이유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 약제.
  7. 제6항에 있어서, 항응고제가 TFPI 및 CD39인 것을 특징으로 하는 약제.
  8. 제1항에 있어서, 돼지 동물이 TFPI, CD39 및 CTLA4를 발현하는 것을 특징으로 하는 약제.
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