EP1549958A2 - Maldi-matrix - Google Patents

Maldi-matrix

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Publication number
EP1549958A2
EP1549958A2 EP03793665A EP03793665A EP1549958A2 EP 1549958 A2 EP1549958 A2 EP 1549958A2 EP 03793665 A EP03793665 A EP 03793665A EP 03793665 A EP03793665 A EP 03793665A EP 1549958 A2 EP1549958 A2 EP 1549958A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
acid
amine
matrix
matrices
group
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03793665A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Bernd Stahl
Günther Boehm
Marko Mank
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nutricia NV
Original Assignee
Nutricia NV
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Filing date
Publication date
Application filed by Nutricia NV filed Critical Nutricia NV
Publication of EP1549958A2 publication Critical patent/EP1549958A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/02—Details
    • H01J49/10—Ion sources; Ion guns
    • H01J49/16—Ion sources; Ion guns using surface ionisation, e.g. field-, thermionic- or photo-emission
    • H01J49/161—Ion sources; Ion guns using surface ionisation, e.g. field-, thermionic- or photo-emission using photoionisation, e.g. by laser
    • H01J49/164—Laser desorption/ionisation, e.g. matrix-assisted laser desorption/ionisation [MALDI]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G01N33/6851—Methods of protein analysis involving laser desorption ionisation mass spectrometry
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing

Definitions

  • the invention relates to matrices for ultraviolet matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry comprising a salt of an amine reacting as a proton acceptor and an organic substance reacting as a proton donor, either the amine or the organic substance absorbing UV light, and the use of such matrices ,
  • UV-MALDI-MS The analysis principle of UV-MALDI-MS is based on matrix-assisted laser desorption and ionization of molecules, including biomolecules from a cocrystallization from an analyte and a UV light-absorbing matrix substance. Such UV light-absorbing substances are also simply called MALDI matrix.
  • Typical MALDI matrices are, for example, 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB), ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) and trans-3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid (sinapic acid).
  • DVB 2,5-dihydroxybenzoic acid
  • CHCA ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid
  • sinapic acid trans-3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid
  • the UV-MALDI-MS is mainly used for mass spectrometric analysis of molecules or biomolecules, e.g. carbohydrates, proteins, peptides, Nucleotides and lipids including their corresponding conjugates such as glycoproteins, lipoproteins etc. It is also possible to directly characterize whole cells and microorganisms using MALDI-MS analysis.
  • MALDI-MS analysis for example, to Alomirah HF, Alli I, Konishi Y..Applications of mass spectrometry to food proteins and peptides, J. Chromatogr. A. 2000 Sep 29; 893 (1): 1-21. Review; Kussmann M, Roepstorff P.
  • enzymes on the MALDI targets or the MALDI sample carriers in order to carry out modifications to the molecules to be examined and to demonstrate them by mass spectrometry.
  • a solution of enzyme, analyte / substrate and a neutral conventional MALDI matrix such as ATT is applied directly to the MALDI target.
  • the enzymatic reaction taking place is then stopped by drying and cocrystallization of the batch.
  • the analysis of the reaction products using MALDI can then be carried out as usual after the actual enzymatic reaction.
  • an acidic matrix such as DHB can also be added to the reaction mixture at the end of an enzymatic reaction.
  • Ionic liquids from an amine salt of an organic acid have also been proposed as matrices for MALDI-MS, see D. W. Armstrong et al, Anal. Chem. 2001, 73, 3679-3686 ,. These are amine salts of various cinnamic acid derivatives or from aminoquinoline and CHCA (Kolli VSK, Orlando R, Rapid Commun. Mass Spectrom. 1996, 10: 923-926).
  • the object of the present invention is to provide improved matrices for UV-MALDI-MS with which more error-free and reproducible analysis values can be obtained, in particular the combination of the pure mass spectrometric analysis with the additional knowledge from enzymatic reactions / modifications with the possibility of monitoring should be given.
  • This object is achieved by the matrices according to the teaching of claims 1 to 4 and by the use of these matrices in the form of an ionic liquid according to the teaching of the use claims.
  • the invention relates to new matrices, namely those which are ionic liquids and are therefore liquid at room temperature.
  • These matrices are composed of a salt of an amine reacting as a proton acceptor and an organic substance reacting as a proton donor, either the amine or the organic substance absorbing UV light.
  • the C 1 -C 8 -alkyl radicals mentioned can thus have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8 C atoms, the C 1 -C 3 -alkyl radicals in the primary amines 1, 2, 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10 or 1 1 carbon atoms.
  • the amines used according to the invention thus include the following:
  • the iso radicals listed above include all possible isomers.
  • the organic substance is 2,5-dihydroxybenzoic acid and the isomers (especially 2,6-dihydroxybenzoic acid) thereof, 2-hydroxy-5-methoxy-benzoic acid and the isomers thereof, picolinic acid, 3-hydroxypicolinic acid, nicotinic acid , 5-chloro-2-mercaptobenzothiazole, 6-aza-2-thiothymine,
  • the new matrices preferably include
  • the new matrices are obtainable by reacting a proton accepting amine described above with an organic reacting proton donor in a molar ratio of 0.5: 1 to 1: 0.5 and preferably in a molar ratio by for example, these two reactants are brought into contact with one another. If only one of the reactants is liquid, then the solid reactant can be added to the liquid reactant and vice versa. In the case of two liquid reactants, these can be combined. However, the two reactants are preferably brought into contact with one another in a solvent which is removed after the reaction, preferably by stripping off the solvent, in particular in vacuo. If liquid reaction products are obtained in this reaction or after removal of the solvent at room temperature, then they are ionic liquids or matrices according to the invention.
  • the invention further relates to the use of the new matrices and known matrices in the form of ionic liquids from one Salt from an amine reacting as a proton acceptor and from cinnamic acid. or a cinnamic acid derivative, the amine being one on whose N atom one, two or three methyl, ethyl, n-propyl, iso-propyl, n-butyl, iso-butyl radical (E), which may be substituted by an OH group and / or a phenyl radical is / are pyridine or 3-aminoquinoline, as a medium for carrying out reactions with (bio) polymers and for Monitoring of these reactions and for analysis of the resulting reaction products by means of the ultraviolet matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry.
  • E iso-butyl radical
  • the new matrices and the known matrices are referred to as matrices according to the invention in the context of the present documents.
  • Another advantage of using ionic liquids as a matrix is that the matrix / analyte mixture does not have to be dry. This leads to a time saving in the preparation of the preparation.
  • the matrices according to the invention can be used without problems in already existing UV-MALDI mass spectrometers which are equipped, for example, with N 2 lasers.
  • enzymatic cleavages of peptides / proteins by means of proteases eg trypsin, chymotrypsin, pepsin, aminopeptidase, carboxypeptidase
  • proteases eg trypsin, chymotrypsin, pepsin, aminopeptidase, carboxypeptidase
  • glycoconjugates eg: fucosidases, sialidases, galactosidases, hexosaminidases, and pectinases
  • lipids triglycerides, phospholipids, glycolipids
  • nucleic acids DNA, RNA
  • synthesis reactions in the MALDI matrix can also be monitored using transferases such as transglycosidases.
  • Analytes with a high concentration can be directly prepared and measured undiluted.
  • simultaneous detection of different analytes with little variance depending on the desorption site is possible. This also applies to analytes of different substance classes with possibly different physico-chemical properties.
  • pH of the matrices according to the invention is closer to the physiological values of non-covalent complexes and acid-labile molecules, such analytes can also be measured.
  • ultraviolet matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry can also be carried out using electrophoresis techniques (such as FFE, PAGE or CE techniques), if necessary using sample application robots, or using (micro) preparation
  • the matrices according to the invention can be produced by adding an amine reacting as a proton acceptor in an equimolar amount to an organic substance reacting as a proton donor, with either the amine or the organic substance absorbing UV light.
  • the reaction is carried out at room temperature.
  • An ionic liquid or a liquid salt is obtained which is generally highly vacuum stable and can be used as a UV-MALDI matrix.
  • the solvent was drawn off at about 40 ° C. and about 43 mbar until there was no further reduction in volume (about 30 minutes).
  • the final volume of the DHB-Bu obtained was approximately 200 ⁇ l.
  • MSA 5-methoxysalicylic acid
  • Bu butylamine
  • Working up was carried out in accordance with Example 1. Approx. 200 ⁇ l of MSA-butylamine (MSA-Bu) were obtained.
  • the solvent was drawn off at about 40 ° C. and about 43 mbar until there was no volume reduction (about 30 minutes).
  • the final volume of the ATT-Bu obtained was approximately 200 ⁇ l.
  • THAP 2 ', 4', 6'-trihydroxyacetophenone monohydra
  • the ionic matrices obtained can each be diluted with a solvent, for example pure ethanol in a ratio of 1: 1 V / V, and are then readily pipettable
  • a matrix analyte preparation can be prepared according to the following general procedure:
  • liquid ionic matrix A undiluted or 1: 1 (v / v) in EtOH or solvent B
  • analyte C in a suitable solvent D on a MALDl sample plate (stainless steel target).
  • the preparation can be carried out as under 1., but after prior desalting of the analyte by incubation in a 1: 1 (v / v)
  • the MALDI sample plate with the premixed sample is transferred directly to the MALDI high vacuum. Then the MALDI MS analysis is carried out.
  • ionic liquids described here and in particular the following can be used as matrix A: butylamine-CHCA, butylamine-DHB, butylamine-MA, butylamine-DHBS and triethylamine-sinapic acid.
  • solvent B acetone, acetonitrile, methanol (MetOH), ethanol (EtOH), butanol, isopropanol, chloroform and H 2 O.
  • the analyte C can be of the following substance classes:
  • carbohydrates e.g. mono-, di-, tri-, oligo- and polysaccharides, homopolymeric and heteropolymeric composition
  • Atoms that are not volatile in a high vacuum e.g. alkali, alkaline earth metals (such as Na, K, Ca, Mg), metals (such as Fe, Zn, Sn, Cu, Cr, etc.).
  • the solution can e.g. acidified with 0.1-5% TFA, acetic acid or formic acid.
  • the solvent was drawn off at about 40 ° C. and about 43 mbar until there was no further reduction in volume (about 30 minutes).
  • the final volume of the 2,6-DHB-Bu obtained was about 200 ⁇ l.
  • the solvent was drawn off at about 40 ° C. and about 43 mbar until there was no further reduction in volume (about 30 minutes).
  • the final volume of the DHB-HMIM obtained was approximately 200 ⁇ l.
  • the solvent was drawn off at about 40 ° C. and about 43 mbar until there was no further reduction in volume (about 30 minutes).
  • the final volume of the 3-aminoquinoline triflate obtained was approximately 200 ⁇ l.
  • the 3-aminoquinoline and thus the amine or the proton acceptor is the compound which is able to absorb UV light, while in the other examples the amine is not able to do this, but rather as a proton donor functioning organic substance that absorbs UV light.
  • reaction of (bio) polymers and in particular enzymatic reactions can be carried out.
  • the matrix also serves as a medium or as a “reaction container”. The course of the reaction can then be followed directly and continuously by mass spectroscopy.
  • the preparation can be carried out as follows (general procedure):
  • Example 7 Those listed in Example 7 can be used as matrix A.
  • enzyme B hydrolases, isomerases, lyases, transferases, oxidoreductases and ligases.
  • solvent / buffer C H 2 0, carbonate buffer, ammonium acetate buffer, Tris buffer or another suitable and MS compatible buffer system or solvent.
  • the enzyme / substrate ratio in the finished matrix-enzyme substrate solution is 1: 1 to 1: 300 (w / w) or more.
  • the MALDI-MS spectra are recorded e.g. after 0, 5, 10, 20, 30, 60 and 120 minutes. If necessary, the MS analysis can also be extended to a few days after the mixture has been prepared
  • the matrices described above can be used in combined LC-MALDI-MS or in electrophoresis-MALDI-MS methods (PAGE, CE, FFE).
  • a combination with (micro) preparation / separation techniques, in particular ⁇ TAS, GYROS ® and Lab-on-Chip ® is also possible

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Abstract

Bereitgestellt werden Matrizes für die Ultraviolett Matrix-unterstützte Laserdesorptions-lonisations-Massenspektrometrie aus einem Salz eines als Protonenakzeptor reagierenden Amins und einer als Protonendonator reagierenden organischen Substanz, wobei entweder das Amin oder die organischen Substanz UV-Licht absorbiert. Diese Matrizes zeichnen sich dadurch aus, dass die Matrizes bei Raumtemperatur eine ionische Flüssigkeit darstellen, dass das Amin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 3-Aminochinolin, Pyridin, einem primären Amin, an dessen N-Atom ein Phenylrest oder ein gerader oder verzweigter, gesättigter C1-C11-Alkylrest, der durch eine OH-Gruppe substituiert sein kann, gebunden ist, einem sekundären und tertiären Amin, an dessen N-Atom zwei oder drei Reste gebunden sind, die gleich oder verschieden sein können und bei denen es sich um einen geraden oder verzweigten, gesättigten C1-C8-Alkylrest, der durch eine OH-Gruppe substituiert sein kann, und einen Phenylrest handelt, Imidazol und den C- und/oder N-alkylierten Imidazolderivaten und dass die organische Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 2,5-Dihydroxybenzoesäure sowie den Isomeren Davon,2-Hydroxy-5-methoxy-benzoesäure sowie den Isomeren davon, Picolin-säure, 3-Hydroxypicolin-säure, Nikotinsäure, 5-Chloro-2-mercapto-benzo-thiazol, 6-Aza-2-thiothymin, 2',4',6'-Trihydroxyacetophenon-Monohydrat, 2',6'-Di-hydroxyaceto-phenon, 9H-Pyridol[3,4-b]indol, Dithranol, trans-3-Indolacrylsäure, Osazone, Ferulasäure, 2,5-Dihydroxyacetophenon, 1-Nitrocarbazol, 7-Amino-4-methylcumarin, 2-(p-Hdroxyphenylazo)-benzoesäure, 8-Aminopyrene-2,3,4-trissulfonsäure, 2-[2E-3-(4-tert-butylphenyl)-2-methylprop-2-enylidene]malonitril (DCTB), 4-Methoxy-3-hydroxyzimtsäure und 3,4-Dihydroxyzimtsäure. Mit diesen flüssigen Matrizes können fehlerfreiere und reproduzierbarere Analysenwerte erhalten werden, wobei insbesondere die Verknüpfung der reinen massenspektrometrischen Analyse mit den zusätzlichen Erkenntnissen aus enzymatischen Reaktionen/Modifikationen mit der Möglichkeit eines Monitoring gegeben ist.

Description

MALDI-Matrix
BESCHREIBUNG
Die Erfindung betrifft Matrizes für die Ultraviolett Matrix-unterstützte Laserdesorptions-/Ionisations-Massenspektrometrie aus einem Salz eines als Protonenakzeptor reagierenden Amins und einer als Protonendonator reagierenden organischen Substanz, wobei entweder das Amin oder die organische Substanz UV-Licht absorbiert, und die Verwendung derartiger Matrizes.
Die Ultraviolett-Matrix-unterstützte Laserdesorptions-/lonisations-Massen- spektrometrie wird im allgemeinen abgekürzt als UV-MALDI-MS.
Das Analysenprinzip der UV-MALDI-MS basiert auf einer Matrixunterstützten Laserdesorption und Ionisierung von Molekülen einschließlich Biomolekülen aus einer Kokristallisation aus einem Analyt und einer UV-Licht-absorbierenden Matrixsubstanz. Derartige UV-Licht- absorbierenden Substanzen werden vereinfacht auch MALDI-Matrix genannt.
Übliche MALDI-Matrizes sind beispielsweise 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB), α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure (CHCA) und trans-3,5-Dimethoxy-4- Hydroxyzimtsäure (Sinapinsäure).
Die Kokristallisation von Analyt und Matrix wird beispielsweise erreicht, indem man üblicherweise wässrige Lösungen der genannten UV-Licht- absorbierenden Matrixsubstanzen und des Analyten auf einem Metallprobenträger mischt und trocknet. Die aus der festen Phase der Kokristallisation erzeugten Ionen werden anschließend mit massenspektrometrischen Analysatoren, die beispielsweise auf dem TOF-, Quadrupol-, lonenfallen- oder FTICR-Prinzip oder auf einer Kombination dieser Techniken basieren, nachgewiesen.
Die UV-MALDI-MS wird vorwiegend eingesetzt zu massenspektrometrischen Analysen von Molekülen bzw. von Biomolekülen, beispielsweise Kohlenhydraten, Proteinen, Peptiden, Nukleotiden und Lipiden einschließlich deren entsprechender Konjugate wie Glycoproteine, Lipoproteine etc. Auch die direkte Charakterisierung ganzer Zellen und Mikroorganismen mittels MALDI-MS-Analyse ist möglich. Diesbezüglich wird beispielsweise verwiesen auf Alomirah HF, Alli I, Konishi Y..Applications of mass spectrometry to food proteins and peptides, J. Chromatogr. A. 2000 Sep 29;893(1 ):1-21. Review; Kussmann M, Roepstorff P. Sample preparation techniques for peptides and proteins analyzed by MALDI-MS, Methods Mol. Biol. 2000;146:405-24; Bonk T., Humney A., MALDI-TOF-MS analysis of Protein and DNA, Neuroscientist, 2001 , 27(5), 465-72.
Die MALDI-MS verfügt über viele Vorteile. Dazu zähit die hohe Empfindlichkeit der Analyse (Femto - bis Attomolbereich bei Isolaten), eine hohe Toleranz gegenüber Verunreinigungen und verschiedenen Puffersubstanzen, die einfache Probenpräparation („Dried Droplet- Verfahren") und die Einbindung des MALDI-MS-Prinzips in Hochdurchsatzanalysen.
Desweiteren ist es möglich, Enzyme auf den MALDI-Targets bzw. den MALDI-Probenträgern einzusetzen, um Modifikationen an den zu untersuchenden Molekülen durchzuführen und diese massenspektrometrisch nachzuweisen. Dazu wird eine Lösung aus Enzym, Analyt/Substrat und einer neutralen herkömmlichen MALDI-Matrix wie ATT direkt auf das MALDI-Target appliziert. Die ablaufende enzymatische Reaktion wird anschließend durch Trocknen und Kokristallisation des Ansatzes gestoppt. Die Analyse der Reaktionsprodukte mittels MALDI kann dann nach der eigentlichen enzymatischen Reaktion wie üblich durchgeführt werden Alternativ kann auch eine saure Matrix wie etwa DHB zur Beendigung einer enzymatischen Reaktion nachträglich zum Reaktionsansatz zugegeben werden.
Ein wesentlicher Nachteil der MALDI-MS-Analyse mit einer festen Matrix oder einer festen Analytpräparation ist allerdings die oft hohe Varianz der Signalintensitäten des Analyten bei der Desorption von unterschiedlichen Stellen der gleichen Präparation bzw. des gleichen Präparates. Diese Varianz beruht einerseits darauf, dass die Analytmoleküle über die Oberfläche der getrockneten Präparation unterschiedlich verteilt sind. Andererseits ist die Ursache dafür in dem unterschiedlichen Einbau verschiedener Substanzklassen in das Kristallgitter der getrockneten Kokristallisation von Analyt/Probe und Matrix zu sehen. Es sind nun bereits verschiedene Präparationsverfahren vorgeschlagen worden, um homogenere Kristallisationen zu erreichen. Dazu zählt beispielsweise die Dünnschichtpräparation (Vorm O., Roepstorf, P., Mann M., Anal, Chem., 64, 1992, 1879-1884), die Präparation auf dünnen Schichten von Matrixkristallen, die als Kristallisationskeime dienen, die Anwendung von Nitrozellulosezusätzen sowie Fucose und das Lösen üblicher MALDI- Matrizes wie DHB oder CHCA in Glycerin (Sze ET, Chan TW, Wang G. Formulation of matrix Solutions for use in matrix-assisted laser desorption/ionization of biomolecules. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 1998 Feb;9(2): 166-74). Diese optimierten Verfahren lösen jedoch immer nur Probleme aus Teilbereichen der MALDl-MS-Analytik.
Es sind auch schon ionische Flüssigkeiten aus einem Aminsalz einer organischen Säure als Matrizes für die MALDI-MS vorgeschlagen worden, man vergleiche D. W. Armstrong et al, Anal. Chem. 2001 , 73, 3679- 3686,. Dabei handelt es sich um Aminsalze verschiedener Zimtsäurederivate bzw. aus Aminochinolin und CHCA (Kolli VSK, Orlando R, Rapid Commun. Mass Spectrom. 1996, 10:923-926).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, verbesserte Matrizes für die UV-MALDI-MS bereitzustellen, mit denen fehlerfreiere und reproduzierbarere Analysenwerte erhalten werden können, wobei insbesondere die Verknüpfung der reinen massenspektrometrischen Analyse mit den zusätzlichen Erkenntnissen aus enzymatischen Reaktionen/Modifikationen mit der Möglichkeit eines Monitoring gegeben sein soll. Gelöst wird diese Aufgabe durch die Matrizes gemäß der Lehre der Ansprüche 1 bis 4 sowie durch die Verwendung dieser Matrizes in Form einer ionischen Flüssigkeit nach der Lehre der Verwendungsansprüche.
Gegenstand der Erfindung sind neue Matrizes, und zwar solche, die ionische Flüssigkeiten darstellen und somit bei Raumtemperatur flüssig sind. Diese Matrizes sind aufgebaut aus einem Salz eines als Protonenakzeptor reagierenden Amins und einer als Protonendonator reagierenden organischen Substanz, wobei entweder das Amin oder die organische- Substanz UV-Licht absorbiert. Bei dem Amin handelt es sich um 3-Aminochinolin, um Pyridin, um ein primäres Amin, an dessen N- Atom ein Phenylrest oder ein gerader oder verzweigter, gesättigter Ci-C-n-Alkylrest, der durch eine OH-Gruppe substituiert sein kann, gebunden ist, um ein tertiäres oder sekundäres Amin, an dessen N-Atom zwei oder drei Reste gebunden sind, die gleich oder verschieden sein können und bei denen es sich um einen geraden oder verzweigten, gesättigten Cι-C8-Alkylrest, der durch eine OH-Gruppe substituiert sein kann, und einen Phenylrest handelt, um Imidazol und um die C- und/oder N-alkylierten imidazolderivaten.
Die genannten Cι-C8-Alkylreste können somit 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 C- Atome besitzen, wobei die C-i-Cn-Alkytreste bei den primären Aminen 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder 1 1 C-Atome besitzen können.
Zu den erfindungsgemäß eingesetzten Aminen zählen somit folgende:
• ein primäres Amin, an dessen N-Atom ein Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, iso-Propyl-, n-Butyl-, iso-Butyl-, n-Pentyl-, iso-Pentyl-, n-Hexyl-, iso-Hexyl-, n-Heptyl-, iso-Heptyl-, n-Octyl-, iso-Octyl-, n-Nonyl-, iso-Nonyl-, n-Decyl, iso-Decyl-, n-Undedcyl- oder iso-Undecyl-Rest, der durch eine OH-Gruppe substituiert sein kann, oder ein Phenylrest gebunden ist.
• ein sekundäres oder tertiäres Amin, an dessen N-Atom zwei oder drei Reste gebunden sind, die gleich oder verschieden sein können und die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, iso-Propyl-, n-Butyl-, iso-Butyl-, n-Pentyl-, iso-Pentyl-, n-Hexyl-, iso-Hexyl-, n-Heptyl-, iso-Heptyl-, n-Octyl- und iso-Octyl-Resten, die durch eine OH-Gruppe substituiert sein können, und einem Phenylrest.
• 3-Amino-chinolin, Pyridin, Imidazol und die C- und/oder N-alkylierten Imidazolderivate, wobei die Alkylreste gleich oder verschieden sein können und insbesondere 1 , 2, 3, 4, 5 oder 6 C-Atom besitzen.
Die oben aufgeführten iso-Reste umfassen alle möglichen Isomere.
** I Bei der organischen Substanz handelt es sich um 2,5-Dihydroxybenzoesäure sowie den Isomeren (insbesondere 2,6-Dihydroxybenzesäure) davon, 2-Hydroxy-5-methoxy-benzoesäure sowie den Isomeren davon, Picolinsäure, 3-Hydroxypicolinsäure, Nikotinsäure, 5-Chloro-2-mercaptobenzothiazol, 6-Aza-2-thiothymin,
15 Trifluormethansolfonat, 2I,4',6'-Trihydroxyacetophenon-Monohydrat, 2', 6'- Dihydroxyacetophenon, 9H-Pyridol[3,4-b]indol, Dithranol, trans-3- Indolacrylsäure, Osazone, Ferulasäure, 2,5-Dihydroxyacetophenon, 1 -Nitrocarbazol, 7-Amino-4-methylcumarin, 2-(p-Hdroxyphenylazo)- benzoesäure, 8-Aminopyrene-2,3,4-trissulfonsäure, 2-[2E-3-(4-tert-
20 butylphenyl)-2-methylprop-2-enylidene]malonitril (DCTB), 4-Methoxy- 3-hydroxyzimtsäure und 3,4-Dihydroxyzimtsäure. Neben den bei den einzelnen organischen Substanzen aufgeführten Isomeren können auch Isomere und insbesondere Stellungsisomere der anderen organischen Substanzen eingesetzt werden, sofern sie in der Lage sind, mit einem
25 Amin eine ionische Flüssigkeit zu bilden, worauf nachstehend noch näher eingegangen wird. Es werden somit solche Matπzes beansprucht, die bei Raumtemperatur als ionische Flüssigkeit vorliegen. Diese ionische Flüssigkeit wird aufgrund einer Säure Base Reaktion erzeugt aus einem genannten Amin mit der Funktion eines Protonenakzeptors und einer
30 genannten organischen Substanz mit der Funktion eines Protonendonators. Bei dem Amin handelt es sich vorzugsweise um Anilin, Ethanolamin, Ethylamin. n-Butylamin, N,N-Diethylamin, N,N-Diethylanilin, N,N- Diethylmethylamin, N,N-Dimethylamin, Triethylamin, Tri-n-propylamin, Tri-n-butylamin, 3-Aminochinolin und Pyridin.
Zu den neuen Matrizes gehören vorzugsweise
2,5-Dihydroxybenzoesäure-Butylamin und 2-Hydroxy-5-methoxy-j benzoesäure-Butylamin.
Die neuen Matrizes sind dadurch erhältlich, dass ein als Protonenakzeptor reagierendes, oben beschriebenes Amin mit einer als Protonendonator reagierenden organischen, oben beschriebenen Substanz in einem Molverhältnis von 0,5 : 1 bis 1 : 0,5 und vorzugsweise im molaren Verhältnis umgesetzt wird, indem beispielsweise diese beiden Reaktanden miteinander in Kontakt gebracht werden. Ist nur einer der Reaktanden flüssig, dann kann der feste Reaktand zu dem flüssigen Reaktanden hinzugegeben werden und vice versa. Im Falle von zwei flüssigen Reaktanden können diese zusammengegeben werden. Vorzugsweise werden die beiden Reaktanden jedoch in einem Lösungsmittel miteinander in Kontakt gebracht, das nach der Umsetzung entfernt wird, vorzugsweise durch Abziehen des Lösungsmittels, insbesondere im Vakuum. Werden bei dieser Umsetzung bzw. nach dem Entfernen des Lösungsmittels bei Raumtemperatur flüssige Reaktionsprodukte erhalten, dann handelt es sich um erfindungsgemäße ionische Flüssigkeiten bzw. Matπzes.
Es ist somit ohne weiteres durch einen einfachen Versuch feststellbar, ob aus einem hier beschriebenen, als Protonenakzeptor dienenden Amin und einer hier beschriebenen organischen, als Protonendonator dienenden Substanz bei Raumtemperatur eine ionische Flüssigkeit herstellbar ist. Ist dies der Fall, handelt es sich um eine erfindungsgemäße Matrix.
Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung der neuen Matrizes sowie bekannter Matrizes in Form von ionischen Flüssigkeiten aus einem Salz aus einem als Protonenakzeptor reagierenden Amin und von Zimtsäure . oder einem Zimtsäurederivat, wobei es sich bei dem Amin um eine solches, an dessen N-Atom ein, zwei oder drei Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, iso-Propyl-, n-Butyl-, iso-Butyl- Rest(e), der/die durch eine OH- Gruppe substituiert sein kann/können, und/oder ein Phenylrest gebunden ist/sind, um Pyridin oder um 3-Aminochinolin handelt, als Medium zur Durchführung von Reaktionen mit (Bio)Polymeren und zur Überwachung dieser Reaktionen sowie zur Analyse der dabei entstehenden Reaktionsprodukte mittels der Ultraviolett Matrix-unterstützte Laserdesorptions-/lonisations-Massenspektrometrie.
Diese bekannten flüssigen Matrizes sind beschrieben an dem bereits oben genannten Ort, nämlich von D. W. Armstrong et al in Anal. Chem. 2001 , 73, 3679-3686.
Die neuen Matrizes und die bekannten Matπzes werden im Rahmen der vorliegenden Unterlagen als erfindungsgemäße Matrizes bezeichnet.
Da die erfindungsgemäße Matrix flüssig ist, liegt eine homogene Verteilung des Analyten in dieser Matrix vor. Daher treten die oben geschilderten Probleme mit den festen Matrizes nicht auf. So findet beispielsweise keine Segregation verschiedener Analytkomponenten an verschiedenen Punkten der Präparation statt. Daher kann eine UV- MALDI-MS mit einer flüssigen Matrix auch für Zwecke einer quantitativen Analyse eingesetzt werden, die bisher nur in wenigen Ausnahmefällen möglich war, beispielsweise durch den Einsatz isotopenmarkierter interner Standards.
Ein weiterer Vorteil des Einsatzes von ionischen Flüssigkeiten als Matrix besteht darin, dass das Matrix/Analytgemisch nicht trocken sein muss. Dies führt zu einer Zeitersparnis bei der Herstellung der Präparation.
Allerdings ist es auch möglich, die erfindungsgemäßen Matrizes bzw. die erfindungsgemäßen ionischen Flüssigkeiten zusammen mit einem Lösungsmittel wie beispielsweise Ethanol, Isopropanol sowie langkettigeren Alkoholen und Acetonitril, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Tetra hydrofu ran zum Einsatz zu bringen, um die Viskosität der ionischen Matrix zu verringern und besser handhabbar, beispielsweise pipettierbar zu machen. Weiterhin kann durch den Einsatz der genannten Lösungsmittel die Solubilisierung der Analyten in der Matrix verbessert werden.
Die erfindungsgemäßen Matrizes können problemlos in bereits existierenden UV-MALDI-Massenspektrometern eingesetzt werden, die beispielsweise mit N2-Lasem ausgerüstet sind.
Mit einer flüssigen Matrix ist zudem die Analyse eines breiten Spektrums von Molekülen möglich. Dazu zählen technische Polymere und Biopolymere wie Kohlenhydrate, z. B. Oligosaccharide, Proteine, Peptide, Lipide, Nukleinsäuren, Sekundärmetabolite, Pharmaka und deren Konjugate, beipielsweise Glyko- sowie Lipokonjugate und auch sekundäre Pflanzenmetabolite (z.B. Flavonoide inklusive Procyanidine etc.).
Mit den erfindungsgemäßen Matrizes ist es zudem möglich, Reaktionsabläufe und Reaktionsverläufe einschließlich Kinetiken zu untersuchen, ohne die Reaktion zu einem willkürlichen Zeitpunkt stoppen zu müssen. Dies gilt vorzugsweise für Reaktionen, die durch Enzyme, insbesondere Glycosidasen, Proteasen, Nukleasen, Lipasen oder Lyasen, katalysiert werden. So können insbesondere enzymatische Spaltungen von Peptiden/Proteinen mittels Proteasen (z.B. Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin, Aminopeptidase, Carboxypeptidase) sowie Spaltungen von Kohlenhydraten und Glycoconjugaten mittels Glycosidasen (z.B.: Fucosidasen, Sialidasen, Galactosidasen, Hexosaminidasen, Pectinasen, Lyasen) und darüber hinaus Spaltungen von Lipiden (Triglyceriden, Phospholipide, Glycolipide) und Nukleinsäuren (DNA, RNA) untersucht werden. Ferner können auch Synthesereaktionen in der MALDI-Matrix mittels Transferasen wie etwa Transglycosidasen verfolgt werden. Analyte mit hoher Konzentration können unverdünnt direkt präpariert und vermessen werden. Zudem ist eine simultane Detektion von unterschiedlichen Analyten mit geringer vom Desorptionsort abhängiger Varianz möglich. Dies gilt auch für Analyte unterschiedlicher Substanzklassen mit unter Umständen unterschiedlichen physiko- chemischen Eigenschaften.
Der Einsatz einer flüssigen Matrix ermöglicht auch die Analyse labiler Analyte. Es wird dabei davon ausgegangen, ohne an diese Erklärung gebunden zu sein, dass die Desorption von einer flüssigen Matrix schonender verläuft, da der Analyt nicht aus dem Kristallgitter sondern aus einer Flüssigkeit in die Gasphase übergeht.
Bedingt dadurch, dass der pH-Wert der erfindungsgemäßen Matrizes näher an physiologischen Werten von nicht-kovalenten Komplexen und säurelabilen Molekülen liegt, können auch derartige Analyten vermessen werden.
Darüberhinaus ermöglichen die flüssigen Matrices auch eine Kopplung von analytischen und präparativen chromatographischen Methoden wie der HPLC, GPC, HPAEC mit der MALDI-MS. So können etwa im Atmospheric Pressure MALDI-Modus die Matrix und das Säuleneluat in bzw. vor der Quelle gemischt werden. Bei offline MALDI-Analyse können geeignete Probenapplikationsroboter Säuleneluate parallel mit flüssiger Matrix auf Targets applizieren, um so kontinuierlich, unter „Abbildung" einer hohen chromatographischen Trennung, eine verbesserte Analyse zu gewährleisten.
Die Ultraviolett Matrix-unterstützte Laserdesorptions-/lonisations- Massenspektrometrie kann neben LC auch mit Elektrophoresetechniken (wie FFE-, PAGE- oder CE-Techniken ), ggf. unter Einsatz von Probenapplikationsrobotern, oder mit (mikro)Präparations-
/Separationstechniken, insbesondere μTAS, GYROS® und Lab-on-Chip® kombiniert/gekoppelt werden. Gegenstand der Erfindung ist zudem ein Verfahren gemäß der Lehre der Verfahrensansprüche.
Die Erfindung wird im folgenden anhand bevorzugte Ausführungsformen erläuternder Beispiele näher beschrieben. Prinzipiell sind die erfindungsgemäßen Matrizes dadurch herstellbar, das ein als Protonenakzeptor reagierendes Amin in äquimolarer Menge zu einer als Protonendonator reagierenden organischen Substanz, wobei entweder das Amin oder die organische Substanz UV-Licht absorbiert, hinzugegeben wird. Die Umsetzung wird bei Raumtemperatur durchgeführt. Es wird eine ionische Flüssigkeit bzw. ein flüssiges Salz erhalten, das im allgemeinen hochvakuumstabil ist und als UV-MALDI- Matrix eingesetzt werden kann.
Beispiel 1
Herstellung von 2,5-Dihydroxybenzoesäure-Butylamin (DHB-Bu):
308,4 mg 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) wurden in 10 ml Ethanol gelöst. Dann wurden 198,4 μl Butylamin (Bu) hinzugegeben.
Das Lösungsmittel wurde bei ca. 40 °C sowie ca. 43 mbar abgezogen, bis keine Volumenreduktion mehr erfolgte (ca. 30 min). Das Endvolumen des erhaltenen DHB-Bu betrug etwa 200 μl.
Beispiel 2
Herstellung von 5-Methoxysalicylsäure-Butylamin (MSA-Bu):
336,4 mg 5-Methoxysalicylsäure (MSA; wird auch als 2-Hydroxy-5- methoxybenzoesäure bezeichnet) wurden in 10 ml Ethanol gelöst. Dazu wurden 198,4 μl Butylamin (Bu) hinzugegeben. Die Aufarbeitung erfolgte entsprechend Beispiel 1. Es wurden ca. 200 μl MSA-Butylamin (MSA-Bu) erhalten.
Durch Vermischen von Butylamin-DHB mit Butylamin-MSA (10 : 1) (v/v) kann Butylamin-DHBS hergestellt werden. Beispiel 3
Herstellung α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure-Butylamin (CHCA-Bu):
378,4 mg α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA) wurden in 10 ml Methanol gelöst. Dann wurden 198,4 μl Butylamin (Bu) hinzugegeben. Die Aufarbeitung erfolgte entsprechend Beispiel 1. Es wurden 200 μl • α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure-ButyIamin (CHCA-Bu) erhalten.
Beispiel 4
Herstellung Sinapinsäure-Triethylamin:
378,4 mg Sinapinsäure (trans-3,5-Dimethoxy-4-hydroxy-zimtsäure) wurden in 10 ml Ethanol gelöst. Dann wurden 278,4 μl Triethylamin hinzugegeben. Die Aufarbeitung erfolgte entsprechend Beispiel 1. Es wurden 200 μl Sinapinsäure-Triethylamin erhalten.
Beispiel 5
Herstellung von 6-Aza-2-Thiothymin-Butylamin (ATT-Bu):
286,4 mg 6-Aza-2-Thiothymin (ATT) wurden in 10 ml Ethanol gelöst. Dann wurden 198,4 μl Butylamin (Bu) hinzugegeben.
Das Lösungsmittel wurde bei ca. 40 °C sowie ca. 43 mbar abgezogen, bis keine Volumenreduktion mehr erfolgte (ca. 30 min.). Das Endvolumen des erhaltenen ATT-Bu betrug etwa 200 μl.
Beispiel 6
Herstellung von 2',4',6,-Trihydroxyacetophenon-Monohydrat-Butylamin (THAP-Butylamin):
372,4 mg 2',4',6'-Trihydroxyacetophenon-Monohydra (THAP) wurden in 10 ml Ethanol gelöst. Dann wurden 198,4 μl Butylamin (Bu) hinzugegeben. Das Lösungsmittel wurde bei ca. 40 °C sowie ca. 43 mbar abgezogen, bis keine Volumenreduktion mehr erfolgte (ca. 30 min.). Das Endvolumen des erhaltenen THAP-Bu betrug etwa 200 μl.
Zur Verringerung der Viskosität der erhaltenen ionischen Matrizes können diese jeweils mit einem Lösungsmittel, beispielsweise reinem Ethanol im Verhältnis 1 : 1 V/V verdünnt werden und sind dann gut pipettierbar
Beispiel 7
Die Herstellung einer Matrix-Analytpräparation kann nach folgender allgemeinen Arbeitsweise erfolgen:
1 . 1 μl flüssige ionische Matrix A (unverdünnt oder 1 :1 (v/v) in EtOH oder Lösungsmittel B) werden mit 1 μl Analyt C in einem geeignetem Lösungsmittel D auf einer MALDl-Probenplatte (Stainless Steel Target) vermischt.
2. Alternativ kann die Präparation wie unter 1. erfolgen, jedoch nach vorheriger Entsalzung des Analyten durch Inkubation in einer 1 : 1 (v/v)
Verdünnung mit einem . Crown-Ether bzw. mit Ionenaustauschern.
3. Die MALDl-Probenplatte mit der vorgemischten Probe wird direkt in das MALDl-Hochvakuum transferiert. Dann erfolgt die Durchführung der MALDI MS Analyse.
Als Matrix A können alle hier beschriebenen ionischen Flüssigkeiten und insbesondere folgende eingesetzt werden: Butylamin-CHCA, Butylamin- DHB, Butylamin-MSA, Butylamin-DHBS und Triethylamin-Sinapinsäure.
Als Lösungsmittel B können folgende eingesetzt werden: Aceton, Acetonitril, Methanol (MetOH), Ethanol (EtOH), Butanol, Isopropanol, Chloroform und H2O.
Bei dem Analyt C kann es sich um folgende Substanzklassen handeln:
1. Technische Polymeren (z.B. PEG, Polyacrylamide, PE),
2. Kohlenhydraten (z.B. Mono-, Di-, Tri-, Oligo- und Polysaccharide, homopolymerer und heteropolymerer Zusammensetzung),
3. Proteine und Peptide,
4. Lipide,
5. Konjugate obiger Analyte, 6. Mono-, Di, -Tri-, Oligo- und Polynucleotide,
7. sekundäre Pflanzenmetabolite ( Phenolische Substanzen, Flavonoide etc.),
8. Atome die im Hochvakuum nicht flüchtig sind (z.B. Alkali-, Erdalkalimetalle (wie Na, K, Ca, Mg), Metalle (wie Fe, Zn, Sn, Cu, Cr, etc.).
Als Lösungsmitte! D können folgende dienen:
Wässrige oder angesäuerte Lösung von 10-80 % MetOH, EtOH, H2O, Aceton, Acetonitril, Isopropanol, Butanol, Chloroform, DMSO, DMF, Glycerin und THF.
Die Lösung kann z.B. mit 0,1-5% TFA, Essigsäure oder Ameisensäure angesäuert werden.
Beispiel 8
Herstellung von 2,6-Dihydroxybenzoesäure-Butylamin (2,6-DHB-Bu):
308,4 mg 2,6-Dihydroxybenzoesäure (DHB) wurden in 10 ml Ethanol gelöst. Dann wurden 198,4 μl Butylamin (Bu) hinzugegeben.
Das Lösungsmittel wurde bei ca. 40 °C sowie ca. 43 mbar abgezogen, bis keine Volumenreduktion mehr erfolgte (ca. 30 min). Das Endvolumen des erhaltenen 2,6-DHB-Bu betrug etwa 200 μl.
Beispiel 9
Herstellung von 2,5-Dihydroxybenzoesäure-1 -HexyI-3-MethyIimidazol (DHB-HMIM): 308,4 mg 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) wurden in 10 ml Ethanol gelöst. Dann wurden 371 ,4 mg 1-Hexyl-3-Methylimidazol (Bu) hinzugegeben.
Das Lösungsmittel wurde bei ca. 40 °C sowie ca. 43 mbar abgezogen, bis keine Volumenreduktion mehr erfolgte (ca. 30 min). Das Endvolumen des erhaltenen DHB-HMIM betrug etwa 200 μl.
Beispiel 10
Herstellung von 3-Aminochinolin-Triflat (AC-Triflat):
288,4 mg 3-Aminochinolin (AC) wurden in 10 ml Ethanol gelöst. Dann wurden 298,2 mg Trifluormethansulfonat hinzugegeben.
Das Lösungsmittel wurde bei ca. 40 °C sowie ca. 43 mbar abgezogen, bis keine Volumenreduktion mehr erfolgte (ca. 30 min). Das Endvolumen des erhaltenen 3-Aminochinolin-Triflat betrug etwa 200 μl.
Bei dieser Matrix stellt das 3-Aminochinolin und somit das Amin bzw. der Protonenakzeptor diejenige Verbindung dar, welche in der Lage ist, UV- Licht zu absorbieren, während bei den anderen Beispielen das Amin dazu nicht in der Lage ist, sondern die als Protonendonator fungierende organische Substanz das UV-Licht absorbiert.
Beispiel 1 1
In den oben beschriebenen Matrizes können Reaktionen von (Bio)Polymeren und insbesondere enzymatische Reaktionen durchgeführt werden. Die Matrix dient dabei zusätzlich als Medium bzw. als „Reaktions-Container". Die Reaktionsverläufe können dann unmittelbar und kontinuierlich massenspektroskopisch verfolgt werden.
Für die Herstellung der entsprechenden Präparationen kann man wie folgt vorgehen (allgemeine Arbeitsweise):
0,5μl flüssige ionische Matrix A (unverdünnt oder 1 :1 (v/v) werden in EtOH oder einem anderem geeigneten Lösungsmittel) mit 0,5 μl eines Enzyms B_(ca. 1 μg/μl) in einem geeigneten Lösungsmittel/Puffer C sowie mit 0,5 μl eines Substrats D (ca. 1 μg/μl ) in einem geeigneten Lösungsmittel/Puffer auf einer MALDl-Probenplatte homogen vermischt. Danach erfolgt ein direkter Transfer der MALDl-Probenplatte mit dem vorgemischten enzymatischen Ansatz in der ionischen flüssigen MALDI- Matrix in das MALDI-Hochvakuum.
Als Matrix A können diejenigen eingesetzt werden, die im Beispiel 7 aufgeführt sind.
Als Enzym B können folgende Enzymklassen Verwendung finden: Hydrolasen, Isomerasen, Lyasen, Transferasen, Oxidoreduktasen und Ligasen.
Als Lösungsmittel/Puffer C sind folgende einsetzbar.: H20, Carbonatpuffer, Ammoniumacetatpuffer, Tris-Puffer oder ein anderes geeignetes und MS kompatibles Puffersystem oder Lösungsmittel.
Das Enzym/Substratverhältnis in der fertigen Matrix-Enzym- Substratlösung beträgt dabei 1 :1 bis 1 :300 (w/w) oder mehr.
Anwendunqsbeispiele:
• Desialisierung eines Trisaccharides aus humaner Milch: 0,5μl Sialidase aus Clostridium Perfringens 1 μg/μl (ca. 0, 1 U/μl) in 25mM
NH4-Acetatpuffer bei pH 5.0) mit 0,5μl Sialyllactose 1 μg/μl in H2O und mit 0,5μl DHB-Bu (1 :1 in EtOH) auf MALDl-Probenplatte mischen und direkt ins MALDI-MS Hochvakuum transferieren.
• Defucosylierung eines Pentasaccharides aus humaner Milch: 0,5μl - Fucosidase aus Rinderniere 1 μg/μl (ca. 2mU/μl) in 25mM NH -
Acetatpuffer bei pH 5.0) mit 0,5μl LNFP 1 μg/μl in H2O und mit 0,5μl DHB-Bu (1 :1 in EtOH) auf MALDl-Probenplatte mischen und direkt ins MALDI-MS Hochvakuum transferieren. • Deglykosilierung eines Glykoproteins: 0,5μl PNGase F aus Flavobactenum Meningosepticum, rekombinant 1 μg/μl (ca. 0,5U/μl) in 20mM Tris-Puffer pH 7.5 mit 0,5μl RNAse B 1 μg/μl in H2O und mit 1 μl CHCA-Bu oder DHB-Bu (1 :1 in EtOH) auf MALDl-Probenplatte mischen und direkt ins MALDI-MS Hochvakuum transferrieren.
• Enzym. Hydrolyse von humanem Casein: 0,5μl Trypsin mit TPCK aus bovinem Pancreas 0,01-1 μg/μl (ca. 0,074 -7,4 U/μl) mit 0,5μl ß- casein 1 μg/μl in Imidazolpuffer 12,5mM pH 7.6 und mit 1 μl CHCA-Bu (1 : 1 in EtOH) auf MALDl-Probenplatte mischen und direkt ins MALDI- MS Hochvakuum transferieren.
• Carboxypeptidasenverdau zur Sequenzanalyse eines Peptides: 0,5μl Carboxypeptidase aus Saccharomyces Cerevisiae (CPY) 0,2μg/μl (ca. 20mU/μl) mit 0,5μl Peptid 0, 1-1 μg/μl in 60mM Diammoniumhydrogencitratpuffer pH 5 und mit 1 μl CHCA-Bu (1 :1 in EtOH) auf MALDl-Probenplatte mischen und direkt ins MALDI-MS
Hochvakuum transferieren.
• Aminopeptidasenverdau zur Sequenzanalyse eines Peptides: 0,5μl Aminopeptidase aus Aeromonas Protolytica 0,2μg/μl (ca. 20mU/μl) mit 0,5μl Peptid 0, 1-1 μg/μl in Tricinpuffer pH 8 +ZnCI2 und mit 1 μl CHCA-Bu (1 :1 in EtOH) auf MALDl-Probenplatte mischen und direkt ins MALDI-MS Hochvakuum transferieren.
• Dephosphorylierung eines Phosphoglykopeptides: 0,5μl saure Phosphatase aus Kartoffeln 0,01-1 μg/μl (ca. 0,02 -2 U/μl) mit 0,5μl ß- casein 1 μg/μl in 25mM NH4-Acetatpuffer bei pH 5 und mit 1 μl CHCA- Bu (1 :1 in EtOH) auf MALDl-Probenplatte mischen und direkt ins
MALDI-MS Hochvakuum transferieren.
• Dephosphorylierung eines Phospholipids: 0,5μl Phospholipase A2 aus Honigbienengift 0,01 μg/μl (ca. 10mU/μl) mit Phosphatidylcholin- diheptadecanoyl 1 μg/μl in MetOH/ CHCI3 (2:1 ) und mit 1 μl DHB-Bu (1 :1 in EtOH) auf MALDl-Probenplatte mischen und direkt ins MALDI- MS Hochvakuum transferieren.
• Deglykosilierung eines Glykolipids/Gangliosids: 0,5μl Ceramidglykanase aus Marobdella Decora 1 μg/μl (ca. 10 mU/μl) in 20mM Tris-Puffer pH 7.0 mit bovinem Gangliosid GM1 1 μg/μl in H2O und mit 1 μl CHCA-Bu oder DHB-Bu (1 :1 in EtOH) auf MALDl- Probenplatte mischen und direkt ins MALDI-MS Hochvakuum transferieren.
• Sequenzierung eines Oligonucleotides: 0,5μl Phosphodiesterase I aus Crotalus Adamanteus Gift ca. 1 mU/μl in 20mM Tris-Puffer pH
8.0 mit 0,5μl Oligonucleotid in H2O 1 μg/μl und mit 1 μl CHCA-Bu (1 :1 in EtOH) auf MALDl-Probenplatte mischen und direkt ins MALDI-MS Hochvakuum transferieren.
Die Aufnahme der MALDI-MS-Spektren erfolgt z.B. nach 0, 5, 10, 20, 30, 60 und 120 Minuten. Die MS-Analyse kann, wenn nötig, auch bis auf einige Tage nach Ansatz der Mischung ausgedehnt werden
Auf die oben beschriebene Weise ist z.B. auch ein einfaches Screening von Substraten oder Reaktionsprodukten möglich. So können beispielsweise mehrere hundert verschiedene Substrate mit einem Enzym auf nur einer Proben-Platte inkubiert werden. Dazu sind nur geringste Mengen Enzym und Substrat (0,5 μl bei beispielsweise 1 μg/μl) erforderlich. Über die massenspektrometrische Analyse können beispielsweise Kinetiken im Vakuum verfolgt werden. Diese Anwendung birgt . unter Ausnutzung bereits bestehender automatischer Messprogramme ein sehr hohes Potential bezüglich Automatisierung und Kostenersparnis.
Dies gilt beispielsweise im Falle des Einsatzes von Sialidase zur Desialisierung von Sialyllactose in DHB-Bu und im Falle des Einsatzes von PNGaseF zur Deglykosilierung von Glycopeptiden/-Proteinen in DHB- Bu. Weiterhin können die oben beschriebenen Matrizes in kombinierten LC- MALDI-MS oder in Elektrophorese-MALDl-MS Verfahren (PAGE, CE, FFE) eingesetzt werden. Auch eine Kombination mit (mikro)Präparations- /Separationstechniken, insbesondere μTAS, GYROS® und Lab-on-Chip®, ist möglich

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Matrizes für die Ultraviolett Matrix-unterstützte Laserdesorpti ns- /lonisations-Massenspektrometrie aus einem Salz eines als Protonenakzeptor reagierenden Amins und einer als Protonendonator reagierenden organischen Substanz, wobei entweder das Amin oder die organische Substanz UV-Licht absorbiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrizes bei Raumtemperatur eine ionische Flüssigkeit darstellen, dass das Amin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 3-Aminochinolin, Pyridin, einem primären Amin, an dessen N-Atom ein Phenylrest oder ein gerader oder verzweigter, gesättigter Ci-Cn-Alkyl- rest, der durch eine OH-Gruppe substituiert sein kann, gebunden ist, einem sekundären und tertiären Amin, an dessen N-Atom zwei oder drei Reste gebunden sind, die gleich oder verschieden sein können und bei denen es sich um einen geraden oder verzweigten, gesättigten Cι-C8-Alkylrest, der durch eine OH-Gruppe substituiert sein kann, und einen Phenylrest, handelt, Imidazol und den C- und/oder N-alkylierten
Imidazolderivaten und dass die organische Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 2,5-Dihydroxybenzoesäure sowie den Isomeren davon, 2-Hydroxy-5-methoxy-benzoesäure sowie den Isomeren davon, Picolinsäure, 3-Hydroxypicolin-säure, Nikotinsäure, 5-Chloro-
2-mercaptobenzo-thiazol, 6-Aza-2-thiothymin, 2',4',6,-Trihydroxyaceto- phenon-Monohydrat, 2',6'-Di-hydroxyaceto-phenon, 9H-Pyridol[3,4-b]- indol, Dithranol, trans-3-lndolacrylsäure, Osazone, Ferulasäure, 2,5-Dihyd.roxyacetophenon, 1-Nitrocarbazol, 7-Amino-4-methylcumarin, 2-(p-Hdroxyphenylazo)-benzoesäure, 8-Aminopyrene-2,3,4-trissulfon- säure, 2-[2E-3-(4-tert-butylphenyl)-2-methylprop-2-enylidene]malonitril (DCTB), 4-Methoxy-3-hydroxyzimtsäure, Trifluormethansulfonat und 3,4-Dihydroxy-zimtsäure.
2. Matrizes nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass . es sich bei dem Amin um Anilin, Ethanolamin, Ethylamin. n-Butylamin,
N,N-Diethylamin, N,N-Diethylanilin, N,N-Diethylmethylamin, N,N- Dimethylamin, Triethylamin, Tri-n-propylamin, Tri-n-butylamin, 3-Aminochinolin und Pyridin handelt.
3. Matrizes nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Matrizes um 2,5-Dihydroxybenzoesäure-Butylamin oder 2-Hydroxy-5-methoxybenzoesäure-Butylamin handelt.
4. Matrizes nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit einem Lösungsmittel versetzt sind.
5. Verwendung der ionische Flüssigkeiten darstellenden Matrizes nach einem der vorhergehenden Ansprüche bei der Ultraviolett Matrixunterstützten Laserdesorptions-/lonisations-Massenspektrometrie und insbesondere zur quantitativen oder qualitativen Ultraviolett Matrix- unterstützten Laserdesorptions-/lonisations-Massenspektrometrie.
6. Verwendung der ionische Flüssigkeiten darstellenden Matrizes nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 4 und von bei Raumtemperatur flüssigen, ionische Flüssigkeiten darstellenden Matrizes aus einem Salz aus einem als Protonenakzeptor reagierenden Amin und von Zimtsäure oder einem Zimtsäurederivat, wobei es sich bei dem Amin um eine solches, an dessen N-Atom ein, zwei oder drei Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, iso-Propyl-, n-Butyl-, iso-Butyl- Rest(e), der/die durch eine OH-Gruppe substituiert sein kann/können, und/oder ein Phenylrest gebunden ist/sind, um 3-Aminochinolin und um Pyridin handelt, als Medium zur Durchführung von Reaktionen mit (Bio)Polymeren und zur Überwachung dieser Reaktionen sowie zur Analyse der dabei entstehenden Reaktionsprodukte mittels der Ultraviolett Matrix-unterstützte Laserdesorptions-/lonisations-Mas- senspektrometrie.
7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionen durch Enzyme, insbesondere durch Glycosidasen, Proteasen, Nukleasen, Lipasen oder Lyasen, katalysiert werden, und es sich bei den (Bio)Polymeren um Peptide, Proteinen, Kohlenhydrate, Lipide, Nukleinsäuren, Sekundärmetabolite und/oder Pharmaka sowie deren Konjugate handelt.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Ultraviolett Matrix-unterstützte Laserdesorptions-/lonisations- Massenspektrometrie mit analytischer oder präparativer Flüssigchromatographie, insbesondere HPLC, GPC und HPAEC, Elektrophorese-Techniken, insbesondere CE, CEC, PAGE und FFE, oder (mikro) Präparations-/Separationstechniken, insbesondere μTAS, GYROS® und Lab-on-Chip®, kombiniert wird.
9. Verfahren zur Durchführung von Reaktionen mit (Bio)Polymeren und zur Überwachung dieser Reaktionen sowie zur Analyse der dabei entstehenden Reäktionsprodukte, wobei diese Reaktionen insbesondere durch Enzyme, vorzugsweise Glycosidasen, Proteasen, Nukleasen, Lipasen oder Lyasen, katalysiert werden, dadurch gekennzeichnet, dass diese Reaktionen in einer eine ionische Flüssigkeit darstellenden Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder in einer eine ionische Flüssigkeit darstellenden Matrix aus einem Salz aus einem als Protonenakzeptor reagierenden Amin und aus Zimtsäure oder einem Zimt- säurederivat, wobei es sich bei dem Amin um eine solches, an dessen
N-Atom ein, zwei oder drei Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, iso-Propyl-, n-Butyl-, iso-Butyl- Rest(e), der/die durch eine OH-Gruppe substituiert sein kann/können, und/oder ein Phenylrest gebunden ist/sind, um 3- Aminochinolin oder um Pyridin handelt, durchgeführt und mittels der Ultraviolett Matrix-unterstützte Laserdesorptions-/Ionisations-Mas- senspektrometrie überwacht werden.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Ultraviolett Matrix-unterstützte Laserdesorptions-/lonisations-Mas- senspektrometrie mit analytischer oder präparativer Flüssigchromatographie, insbesondere HPLC, GPC und HPAEC, Elektrophorese- Techniken, insbeswondere CE, CEC, PAGE und FFE, oder
(mikro)Präparations-/Separationstechniken, insbesondere μTAS, GYROS® und Lab-on-Chip®, kombiniert wird.
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