DE1945471B2 - Verfahren zur bestimmung von catecholamin- und serotoninmetaboliten - Google Patents

Description

Unter Catecholaminen versteht man in der klinischen Chemie Noradrenalin (NA), Adrenalin (A) und Dopamin. Die mengenmäßig und zur Zeit diagnostisch wichtigsten Metaboliten sind Metadrenalin, Normetadrenalin sowie die Phenolcarbonsäuren 4-Hydroxy-3-methoxymandelsäure (HMMS oder VMS = Vanillinmandelsäure), Vanillinsäure (VS) und Homovanillinsäure (HVS). Die Ausscheidung dieser Metaboliten ist bei verschiedenen Krankheiten erhöht, z. B. beim Phäochromocytom, Neuroblastom und Ganglioneurom.

In diagnostischer Hinsicht wichtigster Serotoninmetabolit ist die 5-Hydroxyindolessigsäure (HIES). Die Ausscheidung an HIES ist z. B. beim Bronchuscarcinom und beim Dünndarmkarzinoid stark erhöht.

Es existieren zahlreiche Methoden zur Erfassung dieser Metaboliten. Die gegenwärtig am häufigsten angewendeten fluorimetrischen und spektralphotometrischen Methoden haben gewisse Nachteile. Sie sind do entweder relativ einfach, aber unspezifisch und deshalb von geringer Aussagekraft oder spezifisch, dann aber sehr kompliziert und mit großem Arbeitsaufwand verbunden.

Ferner ist ein Verfahren bekannt, in dem mit Hilfe von Kationenaustauschern und anschließender alkalischer Behandlung die noch die Aminogruppe tragenden Metaboliten, Metadrenalin (= Metaniphrin) sowie Normetadrenalin (= Normetanephrin), nachgewiesen werden können.

Diese Metaboliten werden jedoch nur im Anfall vermehrt ausgeschieden. HMMS dagegen wird auch im anfallsfreien Intervall im erhöhten Maße ausgeschieden. Die gleichzeitige Erfassung von HMMS ist schwierig, weiii im Urin noch zahlreiche andere Phenole auftreten, die mit den in Frage kommenden Reagenzien Farbstoffe bilden, und weil die basischen Ionenaustauscher die Phenolcarbonsäuren in Gegenwart der Harnsalze nicht sonderlich fest binden.

Rein chromatographische Verfahren haben gegenüber diesen, mit Hilfe von Kationenaustauschern arbeitenden Verfahren den Vorteil, daß mehrere Metaboliten gleichzeitig nebeneinander spezifisch erfaßt werden können. Aus der Literatur sind mehrere papier- und dünnschichtchromatographische Methoden für die Bestimmung dieser Metaboliten bekannt. Bei diesen bekannten Verfahren folgt im allgemeinen der Extraktion des Harns eine Trocknung, Filterung und Einengung des erhaltenen Extrakts, anschließend wird eine papier- oder dünnschichtchromatographische Auftrennung auf Kieselgel oder Cellulose durchgeführt. Der Nachweis der Metaboliten erfolgt in allen Fällen in an sich üblicher Weise mit einem Farbreagenz, wobei die Färbung mit einem Standard verglichen wird, vgl. E.

•Jtahl. Dünnschichtchromatografie, 2. Aufl., Berlin — Heidelberg-New York 1967. s. insbes. S.498 ff. _llnd S. 561 ff.

Es ist auch schon vorgeschlagen worden, die Vorbehandlung des Harns vor dem Auftragen auf eine Celluloseschicht fortzulassen. Das ist zwar eine wesentliche Vereinfachung, läßt aber nur unbefriedigende Trennungen zu, da andere Harnbesiandteile (z. B. Salze und Harnstoff) die aufgetrennten Zonen verzerren. Außerdem kann hierbei nur die HMMS erfaßt werden, wobei ihre Identifizierung noch relativ unsicher bleibt. Auch die Mengenabschätzung ist mit einem großen Unsicherheitsfaktor behaftet und man kann nur eine wirklich stark überhöhte Ausscheidung von HMMS nachweisen. Die untere Nachweisgrenze liegt bei etwa 10mg%/Tag; der Normalwert liegt jedoch bei 3—4 mg%, so daß auch schon Werte um oder unter 10 mg% pro Tag erfaßt werden sollten.

Es wurde nun gefunden, daß überraschenderweise durch die Verwendung eines speziellen Sorptionsmiitels störungsfreie Chromatogramme mit hoher Zonenschärfe und sehr guter Auftrennung erhalten werden können. Erstaunlicherweise kann dabei der Harn direkt ohne jede Vorbehandlung auf das Sorptionsmittel aufgetragen werden. Außerdem liegen die Nachweisgrenzen der Metaboliten sehr niedrig. Damit steht ein besonders vorteilhaftes Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung der Catecholamin- und Serotoninmetaboliten zur Verfugung. Das neue Verfahren ist extrem einfach in der Durchführung und erfaßt alle in diesem Zusammenhang diagnostisch wichtigen Metaboliten. Die Identifizierung und Mengenabschätzung der chromatographisch getrennten Substanzen kann mit großer Sicherheit erfolgen.

Die Erfindung bezieht sich somit auf ein Verfahren zur Bestimmung von Catecholamin- und Serotoninmetaboliten in Körperflüssigkeiten durch dünnschichtchromatographische Auftrennung und Anfärbung des Chromatogramms durch Farbreagenzien und ist dadurch gekennzeichnet, daß man als Sorptionsmittel eine für chromatographische Zwecke geeignete, mit PoIyäthylenimin imprägnierte Cellulose verwendet.

Vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens sind in den Unteransprüchen beschrieben.

Als zu untersuchende Körperflüssigkeit kommt vor allem Harn in Betracht. Grundsätzlich können die Untersuchungen jedoch auch mit anderen geeigneten Körperflüssigkeiten durchgeführt werden, z. B. Cerebrospinalflüssigkeit.

Durch die folgenden Ausführungen wird das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutert.

Als Sorptionsmittel eignet sich die übliche, im Handel für chromatographische Zwecke erhältliche, mit PoIyäthylenimin imprägnierte Cellulose (PEI-Cellulose). Es kann jedoch auch jede für chromatographische Zwecke geeignete Cellulose, vorzugsweise mikrokristalline Cellulose, in bekannter Weise (vgl. zum Beispiel Biochimica Biophysica Acta, Band 61, Seiten 852 — 854 [1962]) mit Polyäthylenimin imprägniert werden. Am einfachsten gelingt das mit der im Handel erhältlichen, etwa 50%igen wäßrigen Lösung von Polyäthylenimin. Eine solche Lösung wird, gegebenenfalls nach Verdünnung mit entsalztem Wasser, intensiv mit der Cellulose vermischt, Die so erhaltene Suspension kann direkt zur Beschichtung der Platten eingesetzt werden. Der Anteil des Polyäthyienimins am Sorptionsmittel beträgt etwa 0,15 bis 10 Gew.-%, vorzugsweise etwa 0,5 bis 3,5%.

Es ist wichtig, daß hier nicht, wie sonst in der

Chromatographie üblich, eine mit Salzsäure neutralisierte PEICellulose eingesetzt wird. Es ist vielmehr wesentlich, daß nach der vorliegenden Erfindung eine PEI-Cellulose verwendet wird, die kein zu fest gebundenes Gegenion enthält. Deshalb sollte die PEI-Cellulose zweckmäßig entweder in freier Form oder in der OH-Form vorliegen oder nur solche Anionen enthalten, die einen geringeren Selektivitätskoeffizienten als das Chloridanion besitzen. Der Selektivitätskoeffizient ist bekanntlich ein Maß für eine relative Affinität der Ionen gegenüber dem Austauscher. In diesem Zusammenhang geeignete Anionen sind z. B. Formiat, Acetat, Propionat, Butyrat.

Die Zusammensetzung des verwendeten Fließmittels ist ebenfalls von Einfluß auf die Trennung der Chromatogramme. Es hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen, mindestens für die erste Auftrennung des Harns ein aus mehreren Komponenten, vorzugsweise aus mindestens 3 Bestandteilen bestehendes saures Gemisch einzusetzen. Ein Zusatz von Wasser von mindestens 5 Vol.-%, vorzugsweise zwischen 5 und 20%, hai sich als besonders günstig erwiesen. Die gewünschten Auftrennungen lassen sich besonders gut erreichen, wenn man Fließmittel verwendet, die neben Wasser mindestens ein mit Wasser nich·. oder nur unwesent'ich mischbares Lösungsmittel, mindestens ein sowohl mit Wasser als auch mit organischen Lösungsmitteln mischbares Lösungsmittel und mindestens eine Säure, vorzugsweise eine niedere Alkancarbonsäure, enthalten. Der Anteil der Säure am Gesamtgemisch bewegt sich in der Regel zwischen 1 und 40 Vol.-%, vorzugsweise um etwa 5 — 20 Vol.-%.

Mit Wasser nicht oder nur unwesentlich mischbare Lösungsmittel sind z. B. chlorierte Kohlenwasserstoffe wie Chloroform und Methylenchlorid; aliphatische Alkohole mit mehr als 3 C-Atomen, z. B. Butanole oder Amylalkohole; Ester wie etwa Essigester oder andere Ester der niederen aliphatischen Carbonsäuren, insbesondere der Essigsäure, z. B. Essigsäurebutyl- oder -isoamylester; Äther, Benzol und Derivate wie Toluol und Xylol.

Als mit Wasser und organischen Lösungsmitteln mischbare Lösungsmittel können für den vorliegenden Zweck z. B. niedere aliphatische Alkohole, insbesondere Methanol, Äthanol, n- und iso-Propanol, Ketone, insbesondere Aceton oder Methyläthylketon, Dioxan, Tetrahydrofuran, Acetonitril, Pyridin, Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid, verwendet werden. Als Säuren kommen vorzugsweise Ameisensäure, Essigsäure oder Propionsäure oder substituierte Carbonsäuren wie Methoxyessigsäure in Betracht. Mit Mineralsäuren gelingen die Trennungen in der Regel weniger gut.

Sofern man auf die gleichzeitige Abtrennung der weniger polaren Metaboliten, z. B. der Homovanillinsäure, verzichtet, so kann auch jeweils eine der obengenannten Gruppen von Lösungsmitteln aus dem Fließmittelgemisch fortgelassen werden.

Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird als Fließmittel ein Gemisch aus Chloroform/n-Butanol/Äthanol/Eisessig/Wasser im Volumenverhältnis 10/55/5/15/15 verwendet. Weitere geeignete Gemische sind z. B.: n-Butanol/iso-Propanol/Eisessig/Wasser im Volumen-Verhältnis 60/10/15/15 oder auch 40/30/15/15 n-Butanol/Essigester/Eisessig/Wasser im Volumenverhältnis 60/10/15/15; n-Butanoi/'Eisessig/Wasser im Volumenverhältnis 70/15/15; n-Butanol/Äthanol/Eisessig/ Wasser im Volumenverhältnis 60/5/10/25.

Die Viskosität des Fließmittelgemisches soll bei 20⁰C

zwischen 0,2 und 5 Zentipuise liegen; der Siedcbereich soll sich /wischen 30 und 150° C be wegen.

Da nach dem erfindungsgemäßen Verfahren die Auftrennung durch die Fließmittel vorlcilhafterweise zweifach erfolgt, kann jeweils für die zweite Trennung auch ein basisches FlieBmittelgemisch eingesetzt werden. Wichtig ist jedenfalls, daß zunächst der Harn, da er ja ohne Vorbehandlung aufgetragen wird, auf der PEI-Cellulose mit einem sauren Fließmittelgemisch aufgetrennt wird. Die weitere Behandlung des Chromatogramrns, insbesondere auch bei der zweidimensionalen Chromatographie, kann dagegen auch mit anderen, neutralen oder basischen Fließmitteln erfolgen. Besonders gute Trennungen lassen sich z. B. erzielen, wenn man als basische Fließmittelgemische solche verwendet, die die oben für die sauren Fließmittel genannten Bestandteile enthalten, wobei lediglich der Säureanteil durch eine Base, vorzugsweise ammoniak, ersetzt ist. So sollte also auch das basische Fließmittel neben der Base zweckmäßig etwa zwischen 5 und 20% Wasser, mindestens ein mit Wasser nicht oder nur wenig mischbares Lösungsmittel und mindestens ein mit Wasser und mit organischen Lösungsmitteln mischbares Lösungsmittel enthalten. Bewährt hat sich z. B. ein Gemisch aus Essigester/n-Butanol/Isopropanol/ 25%iges wässeriges Ammoniumhydroxid im Volumenverhältnis 30/20/25/25. Auch hier kann jedoch jeweils eine der Lösungsmittelgruppen fortgelassen werden, da für viele Probleme auch dann noch eine ausreichende A.uftrennung erfolgt. Als weitere basische Fließmitteigemische seien beispielsweise die folgenden genannt:

Chloroform/n-Butanol/Äthanol/25%iges wässeriges Ammoniumhydroxid/Wasser im Volumeiiverhältnis 20/30/30/15/10;

Fssigester/n-Butanol/iso-Propanol/25%iges Ammoniumhydroxid im Volumenverhältnis 30/20/ 25/25;

n-Butanol/Aceton/25%iges Ammoniumhydroxid/ Wasser im Volumenverhältnis 70/10/10/10;
n-Butanol/Methyläthylketon/25%iges Ammoniumhydroxid/Wasser im Volumenverhältnis 30/40/ 15/15;

Essigsäure-isoamylesteriso-Propanol25%iges
Ammoniumhydroxid im Volumenverhältnis 30/45/25;

iso-Propanol/25%iges Ammoniumhydroxid im Volumenverhältnis 80/20.

Die Herstellung der zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zu verwendenden Dünnschichtchromatographieplatten erfolg*, in an sich QbIieher Weise. Die Sorptionsmittelsuspension wird mit einem üblichen Streichgerät auf die Unterlagen aus Glas, Kunststoffolien, Metallfolien oder anderen geeigneten Materialien aufgebracht. Die Dicke der Sorptionsmittelschicht liegt in der Regel zwischen 50 und 200 μ. Die Platten werden anschließend mehrere Stunden bei Zimmertemperatur oder kürzere Zeit bei erhöhter Temperatur, z. B. einige Minuten bei 80-120⁰C, getrocknet. Da die Schicht lichtempfindlich ist, ist es zweckmäßig, die Platten vor Licht geschützt aufzubewahren.

Die Durchführung des neuen Verfahrens erfolgt in an sich üblicher Weise. Der Harn wird ohne Vorbehandlung auf die Sorptionsmittelschicht aufgetragen. Bei quantitativer Bestimmung wird die Harnprobe unter Umständen mit vorzugsweise entsalztem Wasser verdünnt, um vergleichbare Volumina zur Verfügung zu haben und die Umrechnung zu erleichtern. Zweckmäßig

wird z. B. die24-Siunden-Ausscheidun_t; auf jeweils volle Liter aufgefüllt.

Von jeder Harnprobe werden etwa 1 bis 5_U| aufgetragen; es empfiehlt sich, zwischendurch _Zu trocknen, falls mehr als 2 μΐ auf einen Punkt aufgetragen werden. Fs ist zweckmäßig, neben 2-3 Harnproben jeweils eine Standardlösung aufzutragen. Zur Entwicklung werden die Platten (eine oder mehrere) in übliche Kammern, die das Fließmittelgemisch enthalten, eingestellt. Zweckmäßig wird die Kammer während der Entwicklung mit einer Deckplatte verschlossen. i_m allgemeinen hat die Fließmittelfronl den oberen Rand der Platte (8,5 cm Steighöhe bei einer Plaitengröße von 10x10 oder 2Ox 10cm) nach etwa 1-2 Stunden erreicht. Am vorteilhaftesten wird nach dem Trocknen eine zweite Entwicklung in gleicher Weise angeschlossen, gegebenenfalls auch unter Verwendung eines anderen oder eines basischen Fließmittels.

Zur Kenntlrchmachung der Inhaltsstoff'e der getesteten Flüssigkeit und des Standards wird anschließend in an sich üblicher Weise ein Farbreagenz aufgesprüht. Normalerweise werden diese Farbreagenzien in Konzentrationen von etwa 0,1 — 1% verwendet, meist in stabilisierter Form. Am häufigsten werden dia/.otierte p-Nitroaniline eingesetzt, z. B. p-Nitrophenyldiazoniumfluorborat, p-Diazosulfanilsäure, 4-Diazo-n-monoäthyl-ortho-toluidinfluorborat, 4-Diazo-N,N-diäthylanilinfluorborat, 4-Diazo-N-äthyl-N-(^-hydroxyäthyl)-anilin; auch 2,6-Dichlorchinonchlorid ist schon für diesen Zweck verwendet worden. Beim Besprühen soll darauf geachtet werden, daß die Sorptionsmittelschicht nur gerade befeuchtet wird, da andernfalls die Zonen verlaufen können. Nach dem Trocknen, z. B. wenige Minuten bei 90° oder entsprechend langer bei niedrigeren Temperaturen, wird das Chromatogramm im Auflicht und im Durchlicht ausgewertet. Die Höhe und die Farbe der Flecken der Harn-Chromatogramme wird mit denen der Standardlösungen verglichen. Vanillinsäure, Metradrenalin, Normetadrenalin und Methoxyhydroxymandelsäure zeigen blaue und Hornovanillinsäure hellblaue Färbungen, sofern p-Nitrophenyldiazoniumfluorborat als Farbreagenz verwendet wurde. Hydroxyindolessigsäure dagegen wird in diesem Falle rot angefärbt. Pathologische Ausscheidungsmengen der Catecholamin- und Serotoninmetaboliten werden auf diese Weise sicher erkannt.

Häufig ist es zweckmäßig, die erhaltenen Chromatogramme, besonders bei positiven Befunden, durch zweidimensionale Chromatographie zu überprüfen. Hierdurch wird die Spezifität in erheblichem Maße erhöht, da die in der eindimensionalen Chromatographie erhaltenen Flecken nochmals aufgetrennt werden. Durch Medikamente oder auch alimentär bedingt kann es zu Störungen in der Bestimmung der Metaboliten kommen, weil auch andere Metaboliten auftreten können, die in dem gewählten Elutionsmittel unter Umständen den gleichen Rf-Wert besitzen. Es empfiehlt sich deshalb häufig, einen psotiven Befund durch zweidimensionale Chromatographie zu überprüfen. Dann läßt sich mit Sicherheit entscheiden, ob vielleicht der erhöhte Befund nur durch Überdeckung durch einen anderen Inhaltsstoff der untersuchten Körperflüssigkeit vorgetäsucht war.

Auch die zweidimensionale Chromatographie wird zweckmäßig in jeder Dimension zweifach durchgeführt. Auch hier kann gegebenenfalls in der zweiten Dimension und/oder bei der zweiten Entwicklung jeweils ein basisches Elutionsmittel eingesetzt werden.

Orteilhaft teilt man bei der zweidimensionalen omatographie die Dünnschichtplatte in zwei Teile entwickelt zunächst zwei räumlich getrennte "nproben und eine Standardlösung in an sich üblicher ise. Anschließend wird ein weiterer Standard getragen und die Chromatographie in der zweiten nension schließt sich in bekannter Weise an. Die auf ;e Weise erhaltenen Flecken der Harnproben inen nun mit Leichtigkeit durch die beiden sprechenden Flecken der Standardlösungen, also ch zwei Koordinaten, identifiziert werden. Auch die ngenabschätzung der getrennten Substanzen läßt ι auf diese Weise mit großer Sicherheit durchführen. >urch die vorliegende Erfindung ist es somit malig möglich geworden, eine Erkennung und ngenabschätzung sowohl der Catecholamin- als auch Serotoninmetaboliten nebeneinander durchzufühohne daß vorher eine Behandlung des Harns )lgen muß, wodurch eine weitere Fehlerquelle geschaltet wird. Das neue Verfahren eignet sich ;en seiner Einfachheit und Schnelligkeit der Durch-■ung sowohl für Reihenuntersuchungen als auch für ielbestimmungen bei pathologischen Befunden. Die Irigen Nachweisgrenzen machen das neue Verfahfür die verschiedensten Probleme und Differentialmosen anwendbar.

•urch die folgenden speziellen Ausführungsbeispiele i die Erfindung noch näher erläutert:

I. Herstellung der Dünnschichtplatten

1 entsalztes Wasser werden zu 150 g einer 50%igen Irigen Lösung von Polyäthylenimin gegeben. Die ung wird in ein größeres Gefäß überführt und dort entsalztem Wasser auf insgesamt 17,5 kg aufgefüllt, dieser Polyäthylenimin-Lösung gibt man 4,8 kg rokristalline Cellulose. Die Mischung wird in einem gerät mit hoher Geschwindigkeit 20 Sekunden lang tendiert. Mit der so erhaltenen Suspension werden splatten im Format 20 χ 20 cm beschichtet. Das •ichgerät wird auf eine Schichtdicke von 250 μ :estellt. Die Platten werden bei etwa 90° im ckenschrank getrocknet. Die Schichtdicke beträgt a 80-120 μ.

tatt der mikrokristallinen Cellulose kann auch jede ere für dünnschichtige chromatographische Zwecke gnete Cellulose verwendet werden.

Tabelle 1

Der Anteil des Polyäthylenimins am Gesamtsorptionsmittel beträgt etwa 1,5 Gew.-%.

II. Durchführung des Verfahrens

Beispiel 1

Anwendung als Kliniktest zur Erkennung erhöhter

renaler Ausscheidung von Catecholamin- und

Serotoninmetaboliten

Der gesammelte 24-h-Harn eines Patienten wird mit

ι $ destilliertem Wasser auf einen, zwei oder drei volle Liter aufgefüllt. Es werden punktförmig 2 μΐ Harn pro 1 1 dieser Mischung auf die Längsseite einer 10x20 cm großen PEl-Cellulose-Glasplatte, in 1,5 cm Abstand vom unteren Rand, aufgetragen. Zwischen den einzelnen Auftragspunkten wird ein Abstand von 1,5 cm eingehalten. Kleben jede zweite Harnprobe wird eine Standardlösung (Zusammensetzung s. nachfolgende Tabelle) aufgetragen. Auf diese Weise ist jede Harnprobe einer Standardlösung benachbart, und es lassen sich auf eine Platte 8 Harnproben auftragen. Die Platte wird nun zweimal mit dem Elutionsmittelgemisch Chloroform/Butanol/Äthanol/Eisessig/Wasser (5/55/ 10/15/15) bis zum oberen Rand der Platte entwickelt. Die Platte wird dann getrocknet und mit einer 0,05molaren Lösung von p-Nitrobenzoldiazonium-tetrafluoroborat in 0,3 m wäßriger Na2CO3-Lösung besprüht. Nach kurzem Erwärmen erscheinen die einzelnen Metaboliten getrennt als verschiedenfarbige Flecken. Man stellt aufgrund der Intensität der Färbungen und der Größe der Flecken fest, ob eine der Harnproben einen Metaboliten in höherer Konzentration enthält als der Standard.

Der Standard wird durch Auflösen der fraglichen Metaboliten in Wasser hergestellt. Der Standard entspricht dem oberen Normalbereich (mit Ausnahme von Metadrenalin und Vormetadrenalin, die zur besseren Erkennung in überhöhter Menge zugesetzt wurden). Die Zusammensetzung des Standards sowie die Steighöhen der einzelnen Standardsubstanzen in

45. dem verwendeten Fließmittel ergeben sich aus folgender Tabelle:

Substanz	Farbreaktion	Steighöhe	Konzentration
			im Standard
		(cm)	(mg/1)
Vanillinsäurc	blau	8,1	10
Homovanillinsäurc	hellblau	7,8	15
Metadrenalin	blau	7,4	5
Normetadrenalin	blau	6,7	5
5-Hydroxyindolessigsäurc	rot	6,1	10
Methoxy-hydroxymandelsäurc	blau	3,2	10

η vorliegenden Fall zeigten alle Harnproben innerhalb des Normbcrcichs liegende Werte.

Beispiel 2

emiquantitative Abschätzung der rcnalen Ausscheidung an Calccholamin- und Serotoninmetaboliten unächst stellt man sich Standardlösungcn folgender Zusammensetzung und Konzentration her:

Tabelle 2

Konzentration der Standardlösung (St) in mg/1

Vanillinsäure

Homovanillinsäure

Metadrenalin

Normetadrenalin

5-Hydroxyindolessigsäure

4-Hydroxy-3-methoxymandelsäure

Man trägt abwechselnd je 2 μΙ Harn pro 1 1 Tagesausscheidung und je eine der verschiedenen Standardlösungen in steigender Konzentration in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise auf. Man entwickelt die Platte und führt die Farbreaktion aus, wie im Beispiel 1 beschrieben. Anhand der Standards unterschiedlicher Konzentration läßt sich die Ausscheidungsmenge der verschiedenen Metaboüten ohne Schwierigkeiten mit großer Sicherheit abschätzen.

4 der verwendeten Harnproben zeigten für die 6 angegebenen Metaboüten Werte im Normalbereich, während bei einer Probe, die einen Zusatz an Homovanillinsäure erhalten hatte, eine erhöhte Konzentration gefunden wurde, die zwischen Standard 2 und Standard 3 einzuordnen war (hellblauer Fleck). Das entsprach dem Zusatz von 25 mg/1 Homovanillinsäure zu dieser Harnprobe.

St I	St 2	St 3	St 4	St 5
10	15	20	30	50
15	22,5	30	45	75
5	7,5	10	15	25
5	7,5	10	15	25
10	15	20	30	50
ure IO	15	20	30	50

Beispiel 3 Zweidimensionale Chromatographie

Eine wie oben beschrieben mit PEI-Cellulose beschichtete Glasplatte im Format 1Ox 20 cm wird mit einem Bleistiftstrich in zwei Hälften vom Format 10 χ 10 cm geteilt. Auf den so erhaltenen linken Teil der Platte trägt man in je 1,5 cm Entfernung vom linken und vom unteren Rand mindestens 4 μΙ eines unbehandelten Harns auf. Auf der rechten Hälfte der Platte wird entsprechend verfahren, jedoch werden hier in einem Abstand von 15 mm neben dem Auftragspunkt des Harns 2 μΙ einer Standardlösung (St 3 aus Beispiel 2) aufgetragen. Die Platte wird mit der Längsseite nach unten in üblicher Weise mit dem Elutionsmittel Chloroform/Butanol/Äthanol/Eisessig/Wasser (5/55/ 10/15/15) zweifach bis zum oben:n Rand der Platte entwickelt. Nach erneuter Zwischentrocknung werden auf die Auftragsstelle des Harns im linken Teil der Platte oder auch dicht daneben ebenfalls 2 μΙ der Standardlösung 3 aufgetragen. Dann wird die linke Hälfte der Platte senkrecht zur ersten Entwicklungsrichtung bis zum oberen Ende, also bis zum Blcistiftstrich, zweifach (mit Zwischentrocknung) mit dem Flicßmittelgcmisch Essigcster/n-Butanol/lsopropanol/25%igcs wässeriges Ammoniumhydroxid (30/20/25/25) entwickelt.

Die erhaltenen Flecken werden durch Besprühen mit einer 0,05molarcn Lösung von p-Nitrophcnyldiazoniumfluorborat sichtbar gemacht. Jeder Fleck kann durch die zweidimensional mitgelaufenen Standardlösungen durch 2 Koordinaten eindeutig charakterisiert werden.

Im vorliegenden Fall wurde deutlich, daß die in einem vorangehenden, eindimensionalen Chromatogrnmm erfaßte, erhöhte Ausscheidung von Hydroxymethoxymandelsäure (blauer Fleck) durch einen anderen Metaboliten gleicher Steighöhe vorgetäuscht war. Der Fleck von Hydroxymethoxymandelsäure im zweidimensionalen Chromatogramm lag nach Farbe und Größe im Normalbereich.

Beispiel 4

Auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise wurden 100 24-Stunden-Harne untersucht. Dabei wurde in Abweichung von Beispiel 1 die Standardlösung durch einen Standard folgender Zusammensetzung ersetzt:

HMMS, HIES, HVS und VS in Konzentrationen von je 5 mg/1.

Nach der Entwicklung und Anfärbung der Chromatogramme analog Beispiel 1 ergab sich folgendes Bild:

Von den 100 Harnen enthielten 22 Harne etwa 5 mg/1 HlES, 2 Harne enthielten etwa 7 mg/1 HIES, der Rest ,5 der Harne enthielt weniger als 5 mg/1 HIES. Sämtliche Harne, die 5 mg/1 HIES oder mehr enthielten, wurden nun in der in Beispiel 3 beschriebenen Weise zweidimensional Chromatographien. Dabei zeigte sich, daß nur in einem Falle im eindimensionalen Chromatogramm eine Erhöhung an HlES über 5 mg/1 vorgetäuscht worden war.

21 der untersuchten Harne enthielten nach der Auswertung des eindimensionalen Chromatogramms 5 mg/1 oder mehr HMMS. Eine Nachprüfung durch zweidimensionale Chromatographie ergab, daß in 5 Fällen bei der eindimensionalen Chromatographie in Höhe der HMMS eine störende Substanz lag, die durch zweidimensionale Chromatographie abgetrennt wurde. Daraus ergab sich, daß die Ausscheidung innerhalb des Normbereichs lag. Somit zeigten nur 16 der untersuchten 100 Harne tatsächlich eine leicht erhöhte Ausscheidung an HMMS, die durch andere Tests bestätigt werden konnte.

HVS wurde nur in H) der 100 Harne durch die Größe und Intensität der hellblauen Flecken entdeckt. Bc vielen Harnen fand man bei der eindimensionaler Chromatographie kurz unterhalb der H VS-Flecken eine sich rot anfärbende Substanz. Um ganz sicher zn sein daß diese sich rot färbende Substanz keinen auf HV.. zurückgehenden Fleck verdeckt, wurden den in i ragt kommenden Harnproben je 5, 10, 15 und 20 mg HVS/ zugesetzt. Es ergab sich nach der Entwicklung de: Chromatogramms, daß der Nachweis von HVS bei den erfindungsgemäßen Verfahren durch diese sich ro färbende Substanz nicht beeinträchtigt wird, denn du Konzentrationsunterschiede waren gut zu sehen. Ii einem Fall lag eine Substanz, die sich rot anfärbte, geiiiH in Höhe der HVS. Das zweidimensionale Chromato

(H)

('S

11 12

gramm ergab jedoch, daü der betreffende Harn keine im um so bemerkenswerter, ah die Harne von Paiit

wesentlichen Mengen an HVS enthielt. stammten, die hinsichtlich der Diät oder der Me

In keinem der 100 untersuchten Harne ergab somii menteneinnahme nicht auf den Versuch vorbei

das erfindungsgemäße Verfahren einen Hinweis auf waren. Falsch negative Kesuhate sind wegen der h

eine pathologische Ausscheidung. Das beweist, daß '' Nachweisempfindlichkeit des erfindungsgemäüen

keine falsch positiven Ergebnisse /u erwarten sind. Das !ahrens ebenfalls nicht möglich.

Claims (10)

1. Patentansprüche:

   I. Verfahren zur bestimmung von Catecholamin- und Serotoninmetaboliten in Körperflüssigkeilen durch dünnschichtchromatographische Auftrennung und Anfärbung des Chromatogramms durch Farbreagenzien, dadurch gekennzeichnet, daß man als Sorptionsmittel eine für chromatographische Zwecke geeignete, mit Polyiithylenimin imprägnierte Cellulose verwendet.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mit Polyäthylenimin imprägnierte mikrokristalline Cellulose verwendet wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Fließmittel ein aus mindestens 3 Lösungsmitteln bestehendes Gemisch verwendet wird.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1—3, dadurch gekennzeichnet, daß die Chromatographie jeweils zweifach durchgeführt wird.
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1—4, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens die erste Auftrennung mit Hilfe eines sauren Fließmittelgemisches vorgenommen wird.
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1—5, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite chromatographische Auftrennung, insbesondere bei der zweidimensionalen Chromatographie, mit Hilfe eines basischen Fließmittelgemisches vorgenommen wird.
7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1—5, dadurch gekennzeichnet, daß als saures Fließmittel ein Gemisch verwendet wird, das neben mindestens 5% Wasser jeweils mindestens ein weiteres Lösungsmittel aus den folgenden Gruppen enthält:

   a) mit Wasser nicht oder nur unwesentlich mischbare Lösungsmittel,

   b) sowohl mit Wasser als auch mit organischen Lösungsmitteln mischbare Lösungsmittel,

   c) Säuren, vorzugsweise niedere Alkancarbonsauren.
8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 —5 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß als saures Fließmittel ein Gemisch aus Chloroform/n-Butanol/Äthanol/ Eisessig/Wasser, im Verhältnis 10/55/5/15/15, verwendet wird.
9. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 —4 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß als basisches Fließmittel ein Gemisch verwendet wird, das neben mindestens 5% Wasser jeweils mindestens ein weiteres Lösungsmittel aus den folgenden Gruppen enthält:

   a) mit Wasser nicht oder nur unwesentlich mischbare Lösungsmittel,

   b) sowohl mit Wasser als auch mit organischen Lösungsmitteln mischbare Lösungsmittel,

   c) eine Base, vorzugsweise eine flüchtige Base wie Ammoniak.
10. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1—4, 6 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß als basisches Fließmittel ein Gemisch aus Essigester/n-Butanol/ Isopropanol/25%iges wäßriges Ammoniumhydroxid im Verhältnis 30/20/25/25 verwendet wird.