DE1945471A1 - Verfahren zur Bestimmung von Catecholamin- und Serotoninmetaboliten - Google Patents
Verfahren zur Bestimmung von Catecholamin- und SerotoninmetabolitenInfo
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Description
Aktiengesellschaft 1. September 1969
Darmstadt
Verfahren zur Bestimmung von Catecholamin- und Serotoninmetaboliten
Unter Catecholaminen versteht man in der klinischen Chemie
Horadrenalin (MA), Adrenalin (A) und Dopamin. Die mengenmäßig und zur Zeit diagnostisch wichtigsten M.eta"boliten sind Metadrenalin,
Eormetadrenalin sowie die Phenolcarbonsäuren 4-Hydroxy-3-methoxymandelsäure
(HMMS oder TMS = Vanillinmandelsäure),
Vanillinsäure (VS) und Homovanillinsäure (HVS). Die Ausscheidung dieser Metaboliten ist bei verschiedenen Krankheiten erhöht,
z. B. beim Phäochromocytom, Neuroblastom und Ganglioneurom.
In diagnostischer Hinsicht wichtigster Serotoninmetabolit ist die 5-Hydroxyindolessigsäure (HIES). Die Ausscheidung an
HIES ist z. B. beim Bronchuscarcinom und beim Dünndarmkarzinoid
stark erhöht.
Es existieren zahlreiche Methoden zur Erfassung dieser Metaboliten.
Die gegenwärtig am häufigsten angewendeten fluorimetrischen und spektralphotometrischen Methoden haben gewisse
Hachteile. Sie sind entweder relativ einfach, aber unspezifisch
und deshalb von geringer Aussagekraft oder spezifisch, dann aber sehr kompliziert und mit großem Arbeitsaufwand verbunden.
Ferner ist ein Verfahren bekannt, in dem mit Hilfe von Kationenaustauschern und anschließender alkalischer Behandlung die noch
die Aminogruppe tragenden Metaboliten Metadrenälin (=Metanephrin) sowie Uormetadrenalin (=Normetanephrin) nachgewiesen werden
können.
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Diese Metaboliten werden jedoch, nur im.Anfall vermehrt ausgeschieden.
BEMS dagegen wird auch im anfallsfreien Intervall im erhöhten Maße ausgeschieden. Die gleichzeitige Erfassung von
HMMS ist schwierig, weil im Urin noch'zahlreiche andere Phenole auftreten, die mit den in Frage kommenden Reagenzien Farbstoffe
bilden und weil die basischen Ionenaustauscher die Phenolcarbonsäuren in Gegenwart der Harnsalze nicht sonderlich fest
binden.
Rein chromatographische Verfahren haben gegenüber diesen, mit Hilfe von Kationenaustauschern arbeitenden Verfahren den Vorteil,
daß mehrere Metaboliten gleichzeitig nebeneinander spezifisch erfaßt werden können. Aus der Literatur sind mehrere
papier- und dünnschichtchromatographische Methoden für die Bestimmung dieser Metaboliten bekannt. Bei diesen bekannten Ver-.
fahren folgt im allgemeinen der Extraktion des Harns eine
Trocknungj Filterung und Einengung des erhaltenen Extrakts,
anschließend wird eine papier- oder dünnschichtchromatographische Auftrennung auf Kieselgel oder Cellulose durchgeführt. Der Nachweis
der Metaboliten erfolgt in allen Fällen in an sich üblicher Weise mit einem Farbreagenz, wobei die Färbung mit einem Standard
verglichen wird.
Es ist auch schon vorgeschlagen worden, die Vorbehandlung des Harns vor dem Auftragen auf eine Celluloseschicht fortzulassen.
Das ist zwar eine wesentliche Vereinfachung, läßt aber nur unbefriedigende Trennungen zu, da andere Harnbestandteile (z. B.
Salze und Harnstoff) die aufgetrennten Zonen verzerren. Außerdem kann hierbei nur die HMMS erfaßt werden, wobei ihre Identifizierung noch relativ unsicher bleibt. Auch die Mengenabschätzung
ist mit einem großen Unsicherheitsfaktor "behaftet und
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man kann nur eine wirklich stark überhöhte Ausscheidung von
IZWiS nachweisen. Die untere iiachweisgrenze .liegt bei etwa
10 mg io / Tag; der Normal wert liegt jedoch "bei 3 - 4 Dag f°,
so daß auch schon Werte um oder unter Ί0 mg fo pro Tag erfaßt
werden sollten.
Es wurde nun gefunden, daß überraschenderweise durch die Verwendung
eines speziellen Sorptionsmittel störungsfreie Chromatogramme
mit hoher Zonenschärfe und sehr guter Auftrennung erhalten werden können. Erstaunlicherweise kann dabei der Harn
direkt ohne jede Vorbehandlung auf das Sorptionsmittel aufgetragen werden. Außerdem liegen die Kachweisgrenzen der Meta—
boliten sehr niedrig. Damit steht ein besonders vorteilhaftes Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung der Catecholamin- und
Serotoninmetaboliten zur Verfugung. Das neue Verfahren ist extrem einfach in der Durchführung und erfaßt alle in diesem
Zusammenhang diagnostisch wichtigen Metaboliten. Die Identifizierung und Mengenabschätzung der chromatographisch getrennten
Substanzen kann mit großer Sicherheit erfolgen.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Bestimmung von Catecholamin- und Serotoninmetaboliten in Körperflüssigkeiten
durch dünnschichtchromatographische Auftrennung und Anfärbung des Chromatogramms durch ITarbreagenzien in an sich üblicher Weise,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Sorptionsmittel mit Polyäthylenimin imprägnierte Cellulose verwendet. Zur Entwicklung
des Chromatogramns wird nach dem neuen Verfahren mindestens in der ersten Auftrennung ein vorzugsweise aus mindestens
3 Komponenten bestehendes, saures Gemisch verwendet. Zweckmäßig soll das Pließmittel neben mindestens 5 $>
V/asser mindestens ein weiteres Lösungsmittel aus mindestens jeweils
einer der folgenden Gruppen enthalten:
10 98 12/U U-
A) mit Wasser nicht oder nur unwesentlich mischbare Lösungsmittel
B) sowohl mit Wasser als auch mit organischen Lösungsmitteln
mischbare Lösungsmittel
C) Säuren, vorzugsweise niedere Allrancar"bonsäuren.
Als zu untersuchende Körperflüssigkeit kommt vor allem Harn in Betracht. Grundsätzlich können die Untersuchungen jedoch auch
mit anderen geeigneten Körperflüssigkeiten durchgeführt werden, z. B. Cerebrospinalflüssigkeit.
Als Sorptionsmittel wird die übliche, im Handel für chromatographische
Zwecke erhältliche, mit Polyäthylenimin imprägnierte Cellulose (ΡΞΙ-Cellulose) verwendet. Es kann jedoch auch jede
für chromatographische Zwecke geeignete Cellulose, vorzugsweise mikrokristalline Cellulose, in bekannter Weise (vgl. z. B. Biochimica
Biophysica Acta, Band 61, Seiten 852 - 854 (1962) ) mit Polyäthylenimin imprägniert werden. Am einfachsten gelingt das
mit der im Handel erhältlichen, etwa 50 feigen wäßrigen Lösung
von Polyäthylenimin. Eine solche Lösung wird, gegebenenfalls nach Verdünnung mit entsalztem Wasser, intensiv mit der Cellulose
vermischt. Die so erhaltene Suspension kann direkt zur Beschichtung der Platten eingesetzt werden. Der Anteil des PoIyäthylenimins
am Sorptionsmittel beträgt etwa 0,15 bis 10 G-ew. fo,
vorzugsweise etwa 0,5 bis 3»5 i°>
Es ist wichtig, daß hier nicht, wie sonst in der Chromatographie üblich, eine mit Salzsäure neutralisierte PEI-Oellulose eingesetzt
wird. Es ist vielmehr wesentlich, daß nach der vorliegenden Erfindung eine PEI-Cellulose verwendet wird, die kein zu fest
gebundenes G-egenion enthält. Deshalb sollte die PEI-Cellulose
zweckmäßig entweder in freier Form oder in der' 0H-Eorm vorliegen.
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oder nur solche Anionen enthalten, die einen geringeren Selektivitätskoeffizienten
als das Chloridanion besitzen. Der Selektivitätskoeffizient ist bekanntlich ein Maß für die relative Affinität
der Ionen gegenüber dem Austauscher. In diesem Zusammenhang geeignete Anionen sind z. B. Formiat, Acetat, Propionat, Butyrat.
Die Zusammensetzung des verwendeten Fließmittels ist ebenfalls
von Einfluß auf die Trennung der Chromatogramme. Es hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen, mindestens für die erste Auftrennung
des Harns ein aus mehreren Komponenten, vorzugsweise aus mindestens 3 Bestandteilen, bestehendes saures Gemisch
einzusetzen. Ein Zusatz von Wasser von mindestens 5 YoI. fo,
vorzugsweise zwischen 5 und 20 %, hat sich als besonders günstig
erwiesen. Die gewünschten Auftrennungen lassen sich besonders gut erreichen, wenn man Eließmittel verwendet, die neben Wasser
mindestens ein mit Wasser nicht oder nur unwesentlich mischbares Lösungsmittel, mindestens ein sowohl mit Wasser als auch mit
organischen Lösungsmitteln mischbares Lösungsmittel und mindestens eine Säure, vorzugsweise eine niedere Alkancarbonsäure-, enthalten.
Der Anteil der Säure am Gesamtgemisch bewegt sich in der Regel zwischen 1 und 40 YoI. fo, vorzugsweise um etwa 5-20 YoI. $.
Mit Wasser nicht oder nur unwesentlich mischbare Lösungsmittel (Gruppe A) sind z. B.- chlorierte Kohlenwasserstoffe wie Chloroform
und Methylenchlorid; aliphatische Alkohole mit mehr als 3 C-Atomen, z. B. Butanole oder Amylalkohole; Ester wie etwa
Essigester oder andere Ester der niederen aliphatischen Carbonsäuren, insbesondere der Essigsäure, z. B. Essigsäurebutyl-
oder -isoamylester; Äther, Benzol und Derivate wie Toluol und Xylol.
Als mit Wasser und organischen Lösungsmitteln mischbare Lösungsmittel
(Gruppe B) können für den vorliegenden Zweck z. B. niedere aliphatische Alkohole, insbesondere Methanol, Äthanol, n- und
Iso-Propanol, Ketone, insbesondere Aceton oder Methyläthylketon,
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Dioxan, Tetrahydrofuran, Acetonitril, Pyridin, Dimethylformamid
und Dimethylsulfoxid verwendet werden. Als Säuren kommen vorzugsweise
Ameisensäure, Essigsäure oder Propionsäure oder substituierte Carbonsäuren wie Methoxyessigsäure in Betracht.
Mit Mineralsäuren gelingen die Trennungen in der Eegel weniger gut.. ■ "
Sofern man auf die gleichzeitige Abtrennung der weniger polaren Metaboliten, z. B. der Homovanillinsäure, verzichtet, so lcann
auch jeweils eine der oben genannten Gruppen von Lösungsmitteln (A oder B) aus dem Fließmittelgeniisch fortgelassen werden»
Nach einer besonders bevor-zugten Ausführungsform wird als PlieS-mittel
ein Gemisch aus Chloroform/n-Butanol/Äthanol/Eisessig/
Wasser im Volumenverhältnis 10/55/5/15/15 verwendet. Weitere
geeignete Gemische sind z. B. : n-Butanol/iso-Propanol/Eisessig/
Wasser im Volumen-Verhältnis 60/10/15/15 oder auch 40/30/1-5/151
n-Butanol/Essigester/Eisessig/Wasser im Volumenverhältnis 60/10/15/15;. n-Butanol/Eisessig/Wasser im Volumenverhältnis
70/15/15; n-Butanol/Ä'thanol/Eisessig/Wasser im Volumenverhältnis
SO/5/10/25'
Die Viskosität des Fließmittelgemisehes soll bei 200C zwischen
0,2 und 5 centipoise liegen; der Siedebereich soll sich zwischen 30 und 15O0C bewegen.
Da nach dem erfindungsgemäßen Verfahren die Auftrennung durch
die Fließmittel in der Regel zweifach erfolgt, kann Jeweils für die zweite Trennung· auch ein basisches Fließmittelgemisch
eingesetzt werden. Wichtig ist jedenfalls, daß zunächst der Harn, da er ja ohne Vorbehandlung aufgetragen wird, auf der
PEI-Cellulose mit einem sauren Fließmittelgemisch. aufgetrennt
wird. Die weitere Behandlung des Chromatogramms, insbesondere
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auch "bei der zweidimensionalen Chromatographie, kann dagegen
auch alt anderen, neutralen oder "basischen Fließmitteln erfolgen.
Besonders gute Trennungen lassen sich z. B. erzielen, wenn man als "basische Eließmittelgemische solche verwendet, die
die oben für die sauren Pließmittel genannten Bestandteile enthalten,
wobei lediglich der Säureanteil durch eine Base, vorsugsweise Ammoniak, ersetzt ist. So sollte also auch das basische
Plleßmittel neben der Base zweckmäßig etwa zwischen 5 und 20 fo
'fässer, mindestens ein mit Wasser nicht oder nur wenig mischbares
Lösungsmittel (Gruppe A) und mindestens ein Lösungsmittel aus der Gruppe 3 (mit Yfesser und mit organischen Lösungsmitteln
mischbare Lösungsmittel) enthalten. 3ewährt hat sich z. B. ein
Gemisch aus Essigester/n-Butanol/Isopropanol/25 $£iges wässeriges
Ammoniumhydroxid im Volumenverhältnis 30/20/25/25· Auch hier
kann jedoch jeweils eine der Lösungsmittelgruppen A oder B fortgelassen werden, da für viele Probleme auch dann noch eine ausreichende
Auftrennung erfolgt. Als weitere basische Pließmittelgemische
seien beispielsweise die folgenden genannt: Chloroform/n-Butanol/Äthanol/25 $iges wässeriges Ammoniumhydroxic/Wasser
im Volumenverhältnis 20/30/30/15/10; Essigester/n-Butanol/lso-Propanol/25
folges Aamoniumhydroxid im Volumenverhältnis
30/20/25/25; n-Butanol/Aceton/25 $iges Ammoniumhydroxid/
Wasser im Volumenverhältnis 70/10/10/10; n-Butanol/l-iethyläthylj>:e"Don/25
S^iges Ammoniumhydroxid/¥asser im Volumenverhältnis
30/40/15/15; 3ssigsäure-isoamylester/iso-Propanol/25 ^iges
Arnoniurahydroxid im Volumenverhältnis 30/45/25; iso-Propanol/
23 $iges Ammoniumhydroxid im Voluiaenverhältnis 80/20.
JDie Herstellung der zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
zu verwendenden Dünnschichtchromatographieplatten erfclgt
in an sich üblicher Weise. Die Sorptionsmittelsuspension v.rird mit einem üblichen Streichgerät auf die Unterlagen aus
Glas, Kunststoffolien, Metallfolien oder anderen geeigneten Materialien
aufgebracht. Die Dicke der Sorptionsmittelschicht liegt in der Regel zwischen 50 und 20Ou. Die Platten werden
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"" O ™"
anschließend mehrere Stunden bei Zimmertemperatur oder kürzere Zeit bei erhöhter Temperatur, z. B.. einige Minuten bei 80 - 120(
getrocknet. Da die Schicht lichtempfindlich ist, ist es zweckmäßig,' die Platten vor licht geschützt aufzubewahren.
Die Durchführung des neuen Verfahrens erfolgt in an sich üblicher Weise. Der Harn wird ohne Vorbehandlung auf die Sorptionsmittelschicht
aufgetragen. Bei quantitativer Bestimmung wird die Harnprobe' unter Umständen mit vorzugsweise entsalztem
Wasser verdünnt, um vergleichbare Volumina zur Verfügung zu haben und die Umrechnung zu erleichtern. Zweckmäßig wird z. B.
die 24-Stundenausscheidung auf jeweils volle Liter aufgefüllt.
Von jeder Harnprobe werden etwa 1 bis 5 Ul aufgetragen; es
empfiehlt sich, zwischendurch, zu trocknen, falls mehr als 2 auf einen Punkt aufgetragen werden. Es ist zweckmäßig, neben
2-3 Harnproben jeweils eine Standardlösung aufzutragen. Zur Entwicklung werden die Platten (eine oder mehrere) in übliche
Kammern, die das Fließmittelgemisch enthalten, eingestellt. Zweckmäßig wird die Kammer während der Entwicklung mit einer
Deckplatte verschlossen. Im allgemeinen hat die Fließmittelfront den oberen Rand der Platte (8,5 cm Steighöhe bei einer
Plattengröße von 10 χ 10 oder 20 χ 10 cm) nach etwa 1-2 Stunden
erreicht. Am vorteilhaftesten wird nach dem Trocknen eine zweite Entwicklung in gleicher Weise angeschlossen,gegebenenfalls
auch unter Verwendung eines anderen oder eines basischen Fließmittels.
Zur Kenntlichmachung der Inhaltsstoffe der getesteten Flüssigkeit und des Standards wird anschließend in an sich üblicher
Weise ein Farbreagenz aufgesprüht. Normalerweise werden diese
Farbreagenzien in Konzentrationen von etwa 0^1 - 1 °/o verwendet,
meist in stabilisierter Form. Am häufigsten werden diazotierte p-Uitrοaniline eingesetzt, ζ. B. p-Mtrophenyldiazoniumfluorborat,
p-Diazosulfanilsäure, 4-Diazo-n-monoäthyl-ortho-toluidinfluorborat,
4-Diazo-N,lSi-diäthyl-anilinfluorborat, 4-Oiazo-N-äthyl-N-(ß-hydroxyäthyl)-anilin;
auch 2,6-Dichlorchinonchlorid
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ist schon für diesen Zweclc verwendet worden. Beim Besprühen
soll darauf geachtet werden, daß die Sorptionsmittelschicht nur gerade "befeuchtet wird, da andernfalls die Zonen verlaufen
können. Fach dem Trocknen, z. B. wenige Hinuten bei 90° oder
entsprechend langer bei niedrigeren Temperaturen, wird das
Chromatogramm im Auflicht und im Durchlicht ausgewertet. Die
Höhe und die Farbe der Flecken der Harn-Chromatogre .ze wird
mit denen der Standardlösungen verglichen. Vanillinsäure, Metadrenalin , ITormetadrenalin und Methoxyhydroxymandelsäure
zeigen blaue und Homovanillinsäure hellblaue Färbungen, sofern
p-Xitrophenyldiazoniumfluorborat als Farbreagenz verwendet
wurde. Hydroxyindolessigsäure dagegen wird in diesem Falle rot angefärbt. Pathologische Ausscheidungsmengen der Catecholamin-
und Serotoninmetaboliten werden auf diese Weise sicher erkannt.
Häufig ist es zweckmäßig, die erhaltenen Chromatogramme, besonders
bei positiven Befunden, durch zweidimensionale Chromatographie zu überprüfen. Hierdurch wird die Spezifität in erheblichem
Maße erhöht, da die in der eindimensionalen Chromatographie erhaltenen Flecken nochmals aufgetrennt werden. Durch
Medikamente oder auch alimentär bedingt kann es zu Störungen in der Bestimmung der Metaboliten kommen, weil auch andere
Metaboliten auftreten können, die in dem gewählten Elutionsmittel
unter Umständen den gleichen Rf-¥ert besitzen. Es empfiehlt sich deshalb häufig, einen positiven Befund durch
zweidimensionale Chromatographie zu überprüfen. Dann läßt sich mit Sicherheit entscheiden, ob vielleicht der erhöhte Befund
nur durch Überdeckung durch einen anderen Inhaltsstoff der untersuchten Körperflüssigkeit vorgetäuscht war.
Auch die zweidimensionale Chromatographie wird zweckmäßig in jeder Dimension zweifach durchgeführt. Auch hier kann gegebenenfalls
in der zweiten Dimension und/oder bei der zweiten Entwicklung jeweils ein basisches Elutionsmittel eingesetzt
werden.
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- ίο -
Vorteilhaft teilt nan bei der zweidimensionalen Chromatographie
die Dünnschichtplatte- in zwei Teile und entwickelt zunächst, zwei
räumlich getrennte Harnproben und eine Standardlösung in. an sich
üblicher Weise. Anschließend wird ein v/eiterer Standard aufgetragen
und die Chromatographie in der zweiten Dimension sehließt
sich in bekannter Weise an. Die auf diese Weise erhaltenen blecken der Harnproben können nun mit Leichtigkeit durch die
beiden entsprechenden Flecken der Standardlösungen, also durch
zwei Koordinaten, identifiziert v/erden. Auch die Mengenabschätzung der getrennten Substanzen läßt sich auf diese Weise
mit großer Sicherheit durchführen.
Durch die "vorliegende Erfindung ist es somit erstmalig möglich
geworden, eine Erkennung und Mengenabschätzung sowohl der Catecholamin- als auch der Serotoninmetaboliten nebeneinander
durchzuführen, ohne daß vorher eine Behandlung des Harns erfolgen muß, wodurch eine v/eitere Fehlerquelle ausgeschaltet
wird. Das neue Verfahren eignet sich wegen seiner Einfachheit und Schnelligkeit der Durchführung sowohl für Reihenuntersuchungen
als auch für EinzelbeStimmungen "bei pathologischen
Befunden. Die niedrigen !Tachweisgrenzen machen das neue Verfahren
für die verschiedensten Probleme und Differentialdiagnosen
anwendbar.
3 1 entsalztes Wasser werden zu 150 g einer 50 $Sigen wäßrigen :
Lösung von Polyäthylenimin gegeben. Die Lösung wird in ein
größeres Gefäß überführt und dort mit entsalztem Wasser auf
insgesamt 17,5 kg aufgefüllt. Zu dieser Polyäthyleniiain-Lösung
gibt man 4,8 kg mikrokristalline Cellulose. Die Misclaung wird
in einem Mixgerät mit hoher Geschwindigkeit 20 Sekunden lang suspendiert. Mit der so erhaltenen Suspension werden Glasplatten
im Format 20 χ 20 cm beschichtet. Das Streiengerät
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wird auf eine Schichtdicke von 250 ^. eingestellt. Die Platten
werden bei etwa 90° im Trockenschrank getrocknet. Die Schichtdicke
"beträgt etwa 80-120 .u.
Statt der nikrokristallinen Cellulose kann auch jede andere
für dünnschiciitige chromatographische Zwecke geeignete Cellulose
verwendet werden.
Der Anteil des Polyäthylenimins am Gesaatsdrptionsaittel beträgt
etwa 1,5 Gew. $.
Durchführung des Verfahrens
Beispiel 1
Beispiel 1
Anwendung als Kliniktest zur Erkennung erhöhter renaler Ausscheidung
von Catecholainin- und Serotoninmetaboliten.
Der gesammelte 24-h-Earn eines Patienten wird axt destilliertem
Wasser auf einen, zwei oder drei volle Liter aufgefüllt. Es werden punktförmig 2 ul Harn pro 1 1 dieser Mischung auf
die Längsseite einer 10 χ 20 cm großen PEI-Cellulose Glasplatte
in 1,5 cm Abstand vom unteren Rand aufgetragen. Zwisehen den
einzelnen Auftragspunkten wird ein Abstand von 1,5 ca eingehalten.
Neben jede zweite Harnprobe wird eine Standardlösung (Zusammensetzung s. nachfolg. Tabelle) aufgetragen. Auf diese
Weise ist jede Harnprobe einer Standardlösung benachbart und
es lassen sich auf eine Platte 8 Earnproben auftragen. Die Platte wird nun zweimal mit dem Elutionsmittelgemisch Chloroform/Butanol/Äthanol/Eisessig/Wasser
(5/55/10/15/15) bis zua oberen Rand der Platte entwickelt. Die Platte wird dann getrocknet
und mit einer 0,05 molaren Lösung von p-ITitrobenzoldiazonium-tetrafluoroborat
in 0,3 m wäßriger ITa2CO, Lösung
besprüht, liach kurzem Erwärmen erscheinen die einzelnen lietaboliten
getrennt als verschiedenfarbige Flecken. Man stellt
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jt
aufgrund der Intensität der Färbungen und der Größe der Fleklcen
fest, ob eine der Harnpro"ben einen Metaboliten in höherer
Konzentration enthält als der Standard.
Der Standard wird durch Auflösen der fraglichen Metaboliten in Wasser hergestellt. Der Standard entspricht dem oberen Normalbereich
(κit Ausnahme von Metadrenalin und Vormetadrenalin, die
zur besseren Erkennung in überhöhter Menge zugesetzt wurden). Die Zusammensetzung des Standards sowie die Steighöhen der
einzelnen Standardsubstanzen in dem verwendeten Fließmittel
ergeben sich aus folgender Tabelle:
'Tabelle 1
(Substanz | I Farbreaktion | Steighöhe | Konzentration im .. |
i | (cm) i |
Standard (mg/1) | |
i IVanillinsäure |
blau | ( 8,1 |
10 |
Eomovanillin- | hellblau | 7,8 | 15 |
säure | |||
I-Ietadrenalin | blau | 7,4 | 5 |
i\onaetadrenalin | blau | 6,7 | 5 |
5-Hydroxyindol- | rot | 6,1 | 10 |
essigsäure | |||
IZe thoxy-hydroxy- | blau | 3,2 | 10 |
,mandelsäure |
Im vorliegenden Fall zeigten alle Harnproben innerhalb des iTormbereichs liegende Werte.
Semiquantitative Abschätzung der renalen Ausscheidung an Catecholamin- und Serotoninmetaboliten
1 0 9 8 1 2 / U U
Zunächst stellt man sich Standardlösungen folgender Zusammensetzung und Konzentration her:
Konzentration der Standardlösung (St) in mg/1
! | i ST 1 |
l | ST 2 | ST 3 | Ϊ ST 4 |
i - 1 ST 5 |
I |
t Vani Hins äur e |
10 | 15 | 20 | 30 | 50 | ||
VIo ε ο vanillinsäure | 15 | 22,5 | 30 | 45 | 75 | ||
Iletadrenalin | VJl | • 7,5 | 10 | 15 | 25 | ||
Formetadrenalin | 5 | 7,5 | 10 | 15 | 25 | ||
p-Hydroxyindolessigsäure | 10 | 15 | 20 | 30 | 50 | ||
4-Hy dr oxy- 3-n e thoxy- | 10 | 15 | 20 | 30 | 50 | ||
nandelsäure |
Han trägt abwechselnd je 2 ul Harn pro 1 1 Tagesausscheidung
und je eine der verschiedenen Standardlösungen in steigender Konzentration in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise auf.
I-Ian entwickelt die Platte und führt die Farbreaktion aus,
wie im Beispiel 1 beschrieben. Anhand der Standards unterschiedlicher Konzentration läßt sich die Ausscheidungsmenge
der verschiedenen Metaboliten ohne Schwierigkeiten mit großer Sicherheit abschätzen.
4 der verwendeten Harnproben zeigten für die. 6 angegebenen Metaboliten Werte im Normalbereich, während bei einer Probe,
die einen Zusatz an Homovanillinsäure erhalten hatte, eine erhöhte
Konzentration gefunden wurde, die zwischen Standard 2 und Standard 3 einzuordnen war (hellblauer Fleck). Das entsprach
dem Zusatz von 25 mg/1 Homovanillinsäure zu dieser rlarnprobe.
109812/UU
-H-
LSOial 3-.
Zweidinensionale Chromatographie .
Zweidinensionale Chromatographie .
Sine wie oben beschrieben nit ΡΞΙ-Cellulose beschichtete Glasplatte
it . Format 10 χ 20 cn wird pit einem Bleistiftstrich in
zv/ei Hälften vom Format 10 χ 10 cm geteilt. Auf den so erhaltenen
linken Teil der Platte trägt man in je 1,5 era Entfernung
vom linken und vom unteren Rand mindestens 4 %L eines
unbehandelten Harns auf. Auf der rechten Hälfte der Platte wird entsprechend verfahren, jedoch v/erden hier in einem Abstand
von 15 mm neben dem Auftragspunkt des Harns 2 ul einer, Standardlösung (St 3 aus Beispiel 2) aufgetragen. Die Platte
wird mit der Längsseite nach unten in üblicher ¥eise mit dem Elutionsmittel Chloroform/Butanol/Äthanol/Eisessig/V/asser
(5/55/10/15/15) zweifach bis zum oberen Rand der Platte entwickelt. ITach erneuter Zwischentrocknung werden auf die Auftragsstelle
des Harns im linken Teil der Platte oder auch dicht daneben ebenfalls 2 ul der Standardlösung 3 aufgetragen..
Dann wird die linke Hälfte der Platte senkrecht zur ersten . .
Entwicklungsrichtung bis zum oberen Ende, also bis zum Blei-.
stiftstrich, zweifach (mit Zwischentrocknung) mit dem Fließ-; :
mlttelgemisch Essigester/n-Butanol/Isopropanol/25 J^iges , wässeriges
Ammoniumhydroxid (30/20/25/25) entwickelt. . . .:
Die erhaltenen Flecken werden durch Besprühen mit' einer 0,05.
molaren Lösung von p-Mtrophenyldiazoniumfluorborat sichtbar ■-..·■
gemacht. Jeder Fleck kann durch die zweidimensional niitge- ■ ,·
laufenen Standardlösungen durch 2 Koordinaten eindeutig charakterisiert
werden. . .- . '
Im vorliegenden Fall wurde deutlich, daß die in.einem voran-^
gehenden, eindimensionalen Chromatogramm erfaßte, erhöhte Ausscheidung von Hydroxymethoxymandelsäure (blauer Fleck) durch
einen anderen Metaboliten gleicher Steighöhe vorgetäuscht war. Der Fleck von Hydroxymethoxymandelsäure im zweidimensionalen
Chromatogramm lag nach Farbe und Größe im Uoraalbereich.
■OJ
1 0 9 8 1 2 / U U
19A5A71
Auf die int Beispiel 1 "beschriebene vieise wurden 100 24-Stunden-Harne
untersucht. Dabei wurde in Abweichung von Beispiel 1 die Standardlösung durch einen Standard folgender Zusammensetzung
ersetzt:
IH-LkS, HISS, HVS und VS in Konzentrationen von je 5 mg/1.
IH-LkS, HISS, HVS und VS in Konzentrationen von je 5 mg/1.
ITach der Entwicklung und Anfärbung der Chromatogramae analog
Beispiel 1 ergab sich folgendes Bild:
Von den 100 Harnen enthielten 22 Harne etwa 5 mg/1 HISS, 2 liarne
enthielten etwa 7 mg/1 HlES, der Rest der Harne enthielt weniger
als 5 rag/l HIES. Sämtliche Harne, die 5 mg/1 HISS oder mehr
enthielten, wurden nun in der in Beispiel 3 beschriebenen V/eise zweidimensional chromatography, er t. Dabei zeigte sich, daß nur
in einem !Falle im eindimensionalen GhroHatogramm eine Erhöhung
an HISS über 5 Hg/1 vorgetäuscht worden war.
21 der untersuchten Harne enthielten nach der Auswertung des eindimensionalen Chronatograams 5 mg/1 oder mehr HwKS. Eine
liachprüfung durch zweidimensional Chromatographie ergab, daß
in 5 Fällen bei der eindimensionalen Chromatographie in Höhe der HMKS eine störende Substanz lag, öle durch zv/eidiraensionale
Chromatographie abgetrennt wurde. Daraus ergab sich, daß die Ausscheidung innerhalb des SforiBbereichs lag. Somit zeigten nur
16 der untersuchten 100 Harne tatsächlich eine leicht erhöhte Ausscheidung
an HrEiS, die durch andere Tests bestätigt werden konnte.
PIVS wurde nur in 10 der 100 Harne durch die Größe und Intensität
der hellblauen Plecken entdeckt. Bei vielen Harnen fand man bei der eindimensionalen Chromatographie kurz unterhalb
der HVS-Elecken eine sich rot anfärbende Substanz. Um ganz sicher
zu sein, daß diese sich rot färbende Substanz keinen -auf HVS zurückgehenden. Fleck verdeckt, wurden den in Präge kommenden
Harnproben je 5, 10, 15 und 20 mg HVS/1 zugesetzt. Es ergab
1 0 9 8 1 2 / U 1 4 BAD ORIGINAL
sich, nach der Entwicklung des Chromatogrammes-, daß der Nachweis
von HVS bei dem erfindungsgemäßen Verfahren durch diese sich rot färbende Substanz nicht beeinträchtigt wird, denn die
Konzentrationsunterschiede v/aren gut zu sehen. In einem Pail lag eine Substanz, die sich rot anfärbte, genau in Höhe der
HVS. Das zweidimensionale Chromatogramm ergab jedoch, daß der
betreffende Harn keine wesentlichen Mengen an HVS enthielt.
In keinem der 100 untersuchten Harne ergab somit das erfindungsgemäße
Verfahren einen Hinweis auf eine pathologische Ausscheidung. Das "beweist, daß keine falsch positiven Ergebnisse
zu erwarten sind. Das ist um so "bemerkenswerter, als die
Harne von Patienten stammten, die hinsichtlich der Diät oder der Medikamenteneinnahme nicht auf den Versuch vorbereitet
v/aren. Palsch negative Resultate sind wegen der hohen 2Tachweisempfindlichkeit
des erfindungsgemäßen Verfahrens ebenfalls nicht möglich.
1 0 9 8 1 2 / U U SAD ORlQlNAt
Claims (11)
- Patentansprüche/ 1 J Verfahren zur Bestimmung von Catecholaain- und Serotoninmetaboliten in Körperflüssigkeiten durch dünnschichtchromatographische Auftrennung und Anfärbung des Chromatograiniiis mit üblichen Farbreagenzien, dadurch gekennzeichnet, daß man als Sorptionsmittel eine für chromatographische Zwecke geeignete, mit Polyäthylenimin imprägnierte Cellulose verwendet.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1,.dadurch gekennzeichnet, daß mit Polyäthylenimin imprägnierte mikrokristalline Cellulose verwendet wird.
- 3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Fließmittel ein aus mindestens 3 Lösungsmitteln bestehendes Gemisch verwendet wird.
- 4. Verfahren nach den Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Chromatographie jeweils zweifach durchgeführt wird.
- 5. Verfahren nach den Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens die erste Auftrennung mit Hilfe eines sauren Fließmittelgemisches vorgenommen wird.
- 6. Verfahren nach den Ansprüchen 1—5» dadurch gekennzeichnet, daß die zweite chromatographischei Auftrennung, insbesondere bei der zweidimensionalen Chromatographie, mit Hilfe eines basischen Fließmittelgemisches vorgenommen wird.109812/UU
- 7. Verfahren nach, den Ansprüchen 1 -5, dadurch gekennzeichnet, daß ,als saures ITließmittel ein Gemisch verwendet wird, "das neben mindestens 5 i> Wasser jeweils mindestens ein weiteres Lösungsmittel aus den folgenden Gruppen enthält:a) ait Wasser nicht oder nur unwesentlich mischbare Lösungsmittelb) sowohl mit Wasser als auch mit organischen Lösungsmitteln mischbare Lösungsmittelc) Säuren, vorzugsweise niedere Alkancarbonsäuren
- 8. Verfahren nach den Ansprüchen 1-5 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß als saures Pließmittel ein Gemisch aus Chloroform/n-Butanol/Äthanol/Eisessig/Wasser ia Verhältnis 10/55/ 5/15/15 verwendet wird.
- 9. Verfahren nach den Ansprüchen 1-4 und 6, dadurch gekennzeichnet,., daß als basisches Pließmittel ein Gemisch verwendet wird, daß neben mindestens 5 i» Wasser jeweils mindestens ein weiteres Lösungsmittel aus den folgenden Gruppen enthält:a) mit Wasser nicht oder nur unwesentlich mischbare Lösungsmittelb) sowohl mit Wasser als auch mit organischen Lösungsmitteln mischbare Lösungsmittelc) eine Base, vorzugsweise eine flüchtige Base wie Ammoniak.
- 10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 - 4, 6 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß als basisches Pließmittel ein Gemisch aus Essigester/n-Butanol/Isopropanol/25 $iges wässriges Anraaoniumhydroxid im Verhältnis 30/20/25/25 verwendet wird.
- 11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 - 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Körperflüssigkeit nicht vorbehandelter Harn verwendet wird.109812/UU
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