DE69421398T2 - Markierte kohlenhydrate und ihre verwendung in assays - Google Patents
Markierte kohlenhydrate und ihre verwendung in assaysInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Karbohydrate und insbesondere auf (Oligo)Sacharide, die mit einer Markierung verbunden sind, welche ihre Identifikation und Analyse ermöglicht.
- Oligosacharid-Analyse kann mit Hilfe einer Vielzahl herkömmlicher Techniken durchgeführt werden und zwar - ohne darauf eingegrenzt zu sein - Gel- Filtration, Ionen-Austausch, Chromatographie von hydrophoben und hydrophilen. Wechselwirkungen, Massenspektrometrie, Gel-Elektrophorese und kapilare Elektrophorese. Häufig wird Tritium-Markierung verwendet. Es gibt außerdem einige Berichte, in denen Verfahren detailliert dargestellt sind, die, insbesondere durch reduktive Aminierung, zur Markierung des reduzierten Endes eines Oligosacharid mit, zum Beispiel, UV-absorbierenden, fluoreszenten oder elektrochemisch aktiven Markierungen dienen.
- Viele Labore würden es bevorzugen, die Verwendung von Radio-Isotopen zu vermeiden. Z. B. offenbart die WO-A-9105256 die Markierung von Karbohydraten mit einem fluoreszenten Naphtalen in Ringstruktur, die einen Substituten aufweist, der Ladung trägt, und zwar zu dem Zweck, die Karbohydrate zu trennen und zu analysieren. Die bevorzugten Reagenzien zur Markierung sind Aminonaphtalensulphonsäuren.
- Solche Markierungen für Oligosacharide sind allgemein verhältnismäßig große, geladene Moleküle, was sie ungeeignet macht zum Beispiel für die Gel-Filtrationschromatographie von nicht geladenen (Oligo)Sachariden, z. B. unter Verwendung von Bio-Rad P4 Gels.
- Kleinere Markierungen, z. B. p-Aminobenzoate, werden in der Massen- Spektrometrie eingesetzt. Sie sind aber anfällig für Hydrolyse bei angehobenem pH.
- Verhältnismäßig kleine fluoreszente Markierungen sind ebenfalls bekannt. Z. B. offenbaren Hase et. al., J. Biochem. 85 : 989-994 (1979), 2-Aminopyridin zur Verwendung als fluoreszente Markierung für Oligosacharide und ihre Trennung mittels Papier-Elektrophorese. Yalpani et. al., Can. J. Chem. 59: 2934-2939 (1981), offenbaren bizyklische, z. B. naphtalene, Markierungen und außerdem p-Fluoroanilin als Anfangsmaterial für fluoreszente Markierung über p-Fluorochlororoactamidoaminoanilin (das heißt Cl-CH&sub2;-CO-NH- Ph-F, wobei Ph 1,4-Phenylen ist) aus 1,2;2,4-di-O-Isopropyliden-α-D- Galactopyranose.
- Bisswanger et. al., Biochemistry 18(26): 5946-5953 (1979), berichten die Untersuchung von Tryptophan-Biosynthese, insbesondere der multifunktionalen Enzyme (Phosphoribosyl)Anthranilat Isomerase-Indoleglykerol Phosphat Synthase. N-(5-Phosphoribosyl)Anthranilat wird dabei als Substrat mit größerer Stabilität und Reinheit als die natürlichen Substrate präpariert und identifiziert. Dieses synthetische Substrat hat dem Bericht nach unterschiedliche Absorptions- und Fluoreszenz-Spektren bei den Bindungen an die jeweilige der zwei Verbindungsstellen des Enzyms.
- O'Brian et. al., J. Het. Chem. 7 : 99-105 (1970), offenbaren die Synthese von Verbindungen von Antiriboflavin, wobei sie als Anfangsmaterial Dimethylanthranilsäure und Anthranilsäure verwenden. Die Verbindungen von Anthranil werden dabei aber nur als synthetische Präkusoren verwendet und nicht als fluoreszente Markierungen.
- Entsprechend der vorliegenden Erfindung ist, wie in den beigefügten Ansprüchen definiert, ein Sacharid am reduzierten Ende mit einer fluoreszenten Gruppe mit der Formel -NR-Ph-CO-, z. B. -NR-Ph-COO- oder -NR-Ph-CONR'- markiert.
- Die markierten Verbindungen sind stabil, in Wasser löslich und ebenso in organischen Lösungsmitteln wie z. B. DMSO. Wenn zum Beispiel die Gruppe -NR-Ph-CONR'- ist, sind sie nicht geladen, arbeiten aber zufriedenstellend auf Gels. R und R' können unabhängig H, C&sub1;&submin;&sub6; sein, zum Beispiel Methyl oder jede beliebige Substituten unter der Voraussetzung, daß seine Eigenschaft, fluoreszent und entsprechend hydrophil zu sein, erhalten bleiben. Ph ist Phenylen. Die Markierung kann durch Reaktion mit reduziertem Zucker unter einer Vielzahl von Bedingungen in Anwesenheit eines Reduktionsmittels (kann nachfolgend beigefügt werden), zum Beispiel Natriumcyanoborohydrid, oder einem Boran-Amin-Komplex, zum Beispiel dem Boran-Dimethylamin-Komplex, angebracht werden. Nach der Reaktion kann das derivatisierte Sacharid mit Hilfe von einer Vielzahl von Verfahren gereinigt werden oder z. B. direkt z. B. mittels P4 Gel Filtrationschromatographie analysiert werden.
- Die neuen Verbindungen lassen sich aus leicht verfügbaren Ausgangsmaterialien präparieren, und zwar mit Hilfe von reduktiver Aminierung des reduzierten Endes eines Sacharids. Z. B. kann das Sacharid (repräsentiert als Oligo-CHO) mit einem Anthranilamid, z. B. 2-Aminobenzamid, wie in Schema A dargestellt, reagieren. Jedes einzelne N-Atom kann durch R/R' wie oben definiert ersetzt werden; die Gruppen R' können gleich oder ver schieden sein. Der Benzen-Ring kann ebenfalls durch solche Gruppen ersetzt sein. Ein m- oder p-Aminobenzamid kann ebenfalls verwendet werden.
- Alternativ kann das Sacharid deriviert und anschließend mit einem isatoischen Anhydrid reagiert werden, was in Schema B dargestellt ist (in diesem Fall ist Ph o-Phenylen). In beiden Fällen können eines oder beide Reagentien in der Form eines reaktiven Derivats vorliegen. Z. B. kann ein Sacharid auf bekannte Weise behandelt werden und so einen Hydrazon bilden, dessen Endgruppe, z. B. durch Azetylierung, geschützt sein kann. Das Hydrazon kann dann zu Hydrazin reduziert werden, und zwar zum Beispiel mit einem bekannten Reduktionsmittel wie z. B. Boran-Dimethylamin-Komplex oder Natrium Zyanoborohydrid, um die Teil-Formel -N*H-NHAc zu ergeben; das Produkt wird dann mit isatoischem Anhydrid (oder einem Analogon) reagiert. Bei der gegebenen Teil-Formel bezeichnet der Stern das N-Atom, daß an dem Karbohydrat angebunden und für elektrophile Reagentien empfänglich ist.
- In den Schemata ist die fluoreszente Gruppe -NR-Ph-CONR'-. Eine bestimmte, illustrative fluoreszente Gruppe ist -NR-(o-Ph)-CONH&sub2;.
- In dem Verfahren nach der vorliegenden Erfindung können Sacharid mit der fluoreszenten Gruppe -NR-Ph-COO alternativ verwendet werden. Eine bestimmte, illustrative fluoreszente Gruppe ist -NR-Ph-COOH-.
- Verbindungen nach dieser Erfindung sind Glyko-Verbindungen, weil die Markierung vorliegt. Das Sacharid, das heißt, ein Mono-Sacharid oder ein Oligo-Sacharid, kann ein Karbohydrat sein, daß aus einer Glyko-Verbindung deriviert wurde, und zwar z. B. aus einem Glykolipid, einem Glykohormon oder einem Glykopeptid. Es ist vorzugsweise an oder über ein beliebiges geeignetes Bindeglied am reduzierten Ende der (oder einer, im Falle eines Mono-Sacharides) Verbindungsstelle der Sacharid-Hälfte markiert.
- Markierte Sacharide nach der Erfindung sind zur Verwendung in einem weiteren Bereich von Trennungssystemen für Asseys geeignet. Insbesondere kann CZE oder Gel-Elektrophorese verwendet werden.
- Es hat sich herausgestellt, daß 2-Aminobenzamid (2AB) im wesentlichen stoichiometrische Maskierung eines Pools von Zucker ohne Selektivität bewirkt, während sich die bekannte Markierung 2-Aminopyridin als nicht stoichiometrisch herausgestellt hat. Als Markierung ist demzufolge 2AB in seiner Wirksamkeit und Selektivität äquivalent zu Tritium. Es ist einfach zu verwenden und bewirkt nur minimale Degradation, z. B. keine oder im wesentlichen keine Desialylation, von Zucker. Außerdem kann Glykan, welches mit 2AB markiert ist, durch die meisten herkömmlichen chromatographischen, massenspektrometrischen Techniken analysiert werden. Die AB-Markierung ist selbst unter extrem sauren und basischen Bedingungen stabil und steht der Wirksamkeit von Exoglykiadasen nicht entgegen. Wenn Glykan, welches mit 2AB markiert ist, mittels Chromatographie analysiert wird, sollte angemerkt werden, daß sein chromatographisches Verhalten im wesentlichen von dem von nicht deriviertem Glykan verschieden sein wird.
- Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung. Beispiel 1 ist seinem Wesen nach einem Protokoll. Die Beispiele 2 und 3 nutzen spezifisch 2- Aminobenzamid (2AB) und Anthranilsäure (2AA) als Markierungen.
- Glas A: Farbstoff, z. B. 2AB
- Glas B: DMSO (350 ul) GlycoPure
- Glas C: Essig-Säure (200 ul) GlycoPure
- Glas D: Reduktionsmittel, z. B. Natrium Zyanoborohydrid
- Die Probe von Glycan, die markiert werden soll, sei es reines Glycan oder eine Glycan-Mischung, sollte ein freies reduziertes Ende aufweisen und frei von Salz sein. Das Glycan kann auf einfache Weise von Salz befreit werden unter Verwendung entweder von Kationen- und/oder Anionen-Austausch (vorausgesetzt, daß diese keinerlei saures Glycan adsolvieren) oder mittels Gel-Filtration. Eine Menge (im Bereich von 10 Pikomol bis 50 Nanomol) des von Salz befreiten Glycan, daß markiert werden soll, sollte in ein sauberes, 0,5 ml fassendes Eppendorf-Rohr transferiert werden, und zwar unmittelbar vor Beginn der Markierung. Bei der Handhabung vom nicht reduziertem Glycan sollte Vorsicht walten gelassen werden, um Kontamination mit Karbohydrat aus der Umgebung zu vermeiden.
- 1. Transferieren von Glycan, welches von Salz befreit ist, in ein sauberes Eppendorf-Rohr und Evaporieren (Rotationsvakuum-Evaporierer) bis zur Trockenheit (bei einer Temperatur von < 27ºC, wenn das Glycan nicht sialyliert ist).
- 2. Hinzufügen von 150 ul von Farbstoff-Lösung in Glas A bis Glas D und Mischen, bis das Reduktionsmittel gelöst ist (dies könnte Umrühren erforderlich machen). Dieses letzte Hinzufügen sollte in einer Abzugshaube durchgeführt werden.
- 3. Hinzufügen von 5 ul von abschließendem Markierungsreaktionsmittel in Glas D zu jeder getrockneten Glycan-Probe, Verschließen des Eppendorf- Rohres, sorgfältiges Mischen und Inkubieren bei 65º für 120 +/- 15 Minuten.
- 4. Bei Abschluß der Inkubation Tupfen (unter Verwendung einer gewöhnlichen Pipette) mit einem einzigen Transfer der gesamten Reaktionsmischung auf den markierten Bereich eines Papier-Streifens. Der Streifen kann mit einem Bleistift an der Spitze markiert sein, die am weitesten von dem Ursprung zur Identifikation der Probe entfernt ist. Trocknen Lassen des Tupfers bei Raum-Temperatur, Transferieren des Streifens in ein Gestell und Plazieren des Gestells in einen zuvor equilibrierten Chromatographie-Tank.
- 5. Wenn die Front des Lösungsmittels sich innerhalb von 10 mm von dem Ende des Papiers entfernt befindet, vorsichtiges Entfernen des Gestells und aufrecht Stellen in ein Abzug-Regal zum Trocknen (20 bis 30 Minuten) Entsorgung des Lösungsmittels aus dem Tank.
- 6. Schneiden des Streifens auf eine Breite von 5 mm auf jeder Seite des Ursprungs und Rollen der geschnittenen Abschnitte des Papiers (wenn nötig), die den Ursprung enthalten, Transferieren von diesen in eine luer-verschlossene Spritze mit eingepaßtem Filter, die in ein sauberes Reagenzglas (aus Glas oder Kunststoff) eingesetzt ist. Hinzufügen von 1,0 ml Wasser direkt auf das Papier, Sicherstellen, daß es vollständig getränkt und untergetaucht ist. Für 5 Minuten in Ruhe Lassen und dann für 10 Minuten Zentrifugieren (3500 Umdrehungen pro Minute).
- 7. Entfernen des Reagenzglases, welches das markierte Glycan enthält, Evaporieren bis zur Trockenheit, Resuspendieren in einer gewünschten Menge von Wasser oder Lösungsmittel zur weiteren Analyse.
- 8. (Desialylation) Transferieren eines Aliquot in jedes der Glycan-Pools in 35 ul Wasser in ein 0,7 ml umfassendes Eppendorf-Glas. Hinzufügen von 10 ul von Sialidase-Lösung in 500 mM Natriumazetat-Puffer zu jedem Glycan- Pool. Inkubation des verschlossenen Glases bei 37ºC für 14 bis 16 Stunden. Am Ende der Inkubation Weitergehen mit der Präparation des markierten Glycan zur Fraktionierung unter Verwendung des RAAM 2000 GlycoSequenzers (Oxford GlycoSystems Ltd.). Dieses Instrument ist ein integriertes Chromatographie-Instrument, das dazu ausgestaltet ist, Mischungen aus nicht geladenem Glycan zu fraktionieren. Wenn das markierte Glycan-Pool sauere Substituenten enthält, sollten diese durch geeignete enzymatische oder chemische Mittel entfernt werden.
- Um die Verbindung von 2AB mit Glycan unter verschiedenen Reaktionsbedingungen zu verfolgen, wurden zwei Modell-N-Glycane als Substrate verwendet, nämlich das asialo biantennary n-Glycan (NA2) und das asialo biantennary n-Glycan mit Kern-Fukose (NA2F). Die mit 2AB verbundene Form des jeweiligen Glycan eluiert an einer anderen Position aus der nicht verbundenen Form während Gel-Permeationschromatographie unter Ver wendung des GlycoMap 1000 (Oxford GlycoSystems Ltd.). Die folgende Assey-Prozedur war daher im Einsatz, um das Ausmaß von Verbindungen unter verschiedenen Reaktionensbedingungen zu untersuchen.
- Radio-markiertes (³H bei C-6 of Galaktose) nicht reduziertes NA2 und Na&sub2;F wurde durch Galktosylation der zugehörigen asialo agalakto biantennary Glycan (unter Verwendung von β-Galaktosyl Transferase und UPD-(³H) Galaktose) vorbereitet und unter Verwendung des GlycoMap 1000 gereinigt. Spuren-Mengen von Radio-markiertem Glycan vor dem mit bekannten Mengen des zugehörigen nicht markierten Glycan gemischt, mit 2AB unter bekannten Bedingungen verbunden und die Produkte (nach Entfernung von nicht reagiertem 2AB und Salz durch Papier-Chromatographie) unter Verwendung des GlycoMap 1000 getrennt. Die relative Menge von Radioaktivität in dem verbundenen und nicht verbundenen Glycan ist ein direktes Maß der relativen Molprozent-Verbindung von Glycan mit 2AB und stellte sich als 85% aus.
- Mengen im Bereich von Mikrogramm von hydrolysiertem Dextran, den Oligosachariden NA2, NA2B und den Oligosacharid-Libraries, die aus bovinem Fetuin freigesetzt sind, menschlichem α1-saurem Glykoprotein, boviner Pankreas-Ribonuklease und Hühner-Ovalbumin wurden im Polypropylen Mikrozentrifugen-Röhren getrocknet. 5 ul einer Lösung mit 1 M Natrium Zyanoborohydrid und 350 mM 2-aminobenzoischer Säure (Anthranilsäure 2AA) in 30%igem Essigsaurem Säure/Dimethyl Sulfoxid wurde hinzugefügt. Die Proben wurden bei 65ºC für zwei Stunden inkubiert und dann erneut getrocknet, bevor sie wieder in dem Proben-Puffer aufgelöst wurden, der aus 125 mM Tris HCl pH 6,8, 0,01% Bromophenol-Blau und 20% Glyzerol besteht. 4 ul jeder Probe wurden dann auf ein Polyakrylamid Mini-Gel (75 · 85 · 0,75 mm) geladen, welches aus einem Gel-Stapel besteht, der aus 10% Akrylamid, 5% Bisakrylamid und 375 mM Tris HCl pH 8,8 besteht. Die Proben wurden auf dem Gel unter Verwendung von einem Reservoir-Puffer laufen gelassen, der aus 40 mM Tris/Borat pH 8,8 bei konstantem Strom von 1b mA für 90 Minuten zusammengesetzt war. Das Gel wurde aus der Vorrichtung entfernt und unter Verwendung von einem UV-Transilluminator mit einem Emissionsmaximum von 312 nm sichtbar gemacht. Das Gel läßt sich entweder vor oder nach dem Trocknen in einem herkömmlichen Gel-Trockenapparat untersuchen und/oder fotografieren.
- Eine Fotografie (aufgenommen wie beschrieben) eines trockenen Gels zeigte
- Reihe 1 hydrolysiertes Dextran
- Reihe 2 Ovalbumin
- Reihe 3 Ribonuklease B
- Reihe 4 Bovines Fetuin
- Reihe 5 NA2
- Reihe 6 NA2B
- Reihe 7 α1-saures Glykoprotein
- Reihe 8 hydrolysiertes Dextran TABELLE A TABELLE B
Claims (11)
1. Verfahren zur Unterscheidung zwischen Karbohydrat und
Glyko-Verbindungen in einer Mischung daraus, wobei das/die oder jede(s)
Karbonhydrat oder Glyko-Verbindung ein hydrophiles Sacharid-Molekül ist,
welches an dem reduzierten Ende fluoreszenzmarkiert ist, wobei R aus H
und Substituten ausgewählt ist, wobei die Markierung eine -NR-Ph-CO-
Gruppe ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei R H ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei Ph o-Phenylen ist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das auf einem Gel
durchgeführt wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die
Markierung eine -NR-Ph-CONR'- Gruppe ist und R und R' aus H und
Substituten unabhängig ausgewählt sind.
6. Markiertes Sacharid nach Anspruch 1, das die Formel aufweist Sacharid-
CH&sub2;-NR-Ph-CON(R')&sub2;, wobei R und R' aus H und Substituten
unabhängig ausgewählt sind, welche sich aus Monosacharid oder Oligosacharid
gewinnen lassen.
7. Markiertes Sacharid nach Anspruch 1, das die Formel aufweist Sacharid-
CH&sub2;-NR'-CO-Ph-NHR, wobei R und R' aus H und Substituten
unabhän
gig ausgewählt sind, welche sich aus Monosacharid oder Oligosacharid
gewinnen lassen.
8. Sacharid nach Anspruch 6 oder 7, wobei das oder jedes R' H ist.
9. Sacharid nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei R H ist.
10. Sacharid nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei Ph o-Phenylen ist.
11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Sacharid so ist, wie in einem der
Ansprüche 6 bis 10 beansprucht.
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| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| 8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
Owner name: PROZYME, INC., SAN LEANDRO, CALIF., US |
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Representative=s name: LEINWEBER & ZIMMERMANN, 80331 MUENCHEN |