DE10321901A1

DE10321901A1 - Affinitätsanreicherung von phosphorylierten Peptiden und/oder Proteinen

Info

Publication number: DE10321901A1
Application number: DE10321901A
Authority: DE
Inventors: Vukic Soskic; André SCHRATTENHOLZ
Original assignee: ProteoSys AG
Current assignee: ProteoSys AG
Priority date: 2003-05-06
Filing date: 2003-05-06
Publication date: 2004-12-02
Also published as: CA2524522A1; WO2004099233A3; EP1622717A2; US20070134648A1; JP2008500943A; AU2004235906A1; WO2004099233A2

Abstract

Es wird eine Substanz bereitgestellt, die einen festen Träger umfaßt, der über einen Linker mit einem Spacer verbunden ist, der mindestens zwei bestimmte Gruppen trägt. Diese Substanz ist als Affinitätsmaterial zur Anreicherung und/oder Isolierung von phosphorylierten Peptiden und/oder Proteinen geeignet. Insbesondere können hiermit tyrosinphosphorylierte Peptide und/oder Proteine angereichert und/oder isoliert werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Material, welches zur Anreicherung und/oder Isolierung von phosphorylierten Peptiden und/oder Proteinen geeignet ist. Neben dem Material bzw. der Substanz betrifft die Erfindung ein Anreicherungs- und/oder Isolierungsverfahren von phosphorylierten Peptiden und/oder Proteinen und ein Verfahren zur Herstellung der Substanz.
Die Phosphorylierung und Dephosphorylierung von Proteinen in der Zelle ist entscheidend für die Funktion von vielen biologischen Systemen. Durch die Phosphorylierung und Dephosphorylierung von Proteinen werden oftmals Signale im Organismus weitergegeben und insbesondere zahlreiche enzymatische Aktivitäten gesteuert. Phosphorylierungen sind daher ein entscheidender Faktor für die Signaltransduktionsketten in lebenden Zellen.
Die Erforschung von phosphorylierten Proteinen ist somit von besonderem Interesse. Im Rahmen der Proteomforschung wurde in diesem Zusammenhang der Ausdruck „Phosphoproteom" geprägt, mit welchem die Untersuchung von im wesentlichen allen phosphorylierten Proteinen einer Zelle umschrieben wird. In den letzten Jahren hat sich gerade die Phosphoproteom-Forschung weiterentwickelt, da verschiedene Anreicherungsprotokolle für Phosphoproteine oder Phosphopeptide optimiert wurden, Fraktionierungsmethoden verbessert wurden und insbesondere die multidimensionale Chromatographie weiterentwickelt wurde, um so die Phosphoproteine, welche im allgemeinen nur in sehr geringer Konzentration vorhanden sind, einer Analyse überhaupt erst einmal zugänglich machen zu können.
Bisher eingesetzte Methoden zur Anreicherung und Identifizierung von phosphorylierten Proteinen beinhalten meist ein radioaktives Markieren mit ³²P-markiertem ATP und nachfolgender SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese oder Dünnschichtchromatographie. Auch eine Edman-Sequenzierung kann zur Identifizierung der phosphorylierten Proteine durchgeführt werden.
Ein allgemeines Problem bei der Untersuchung von Proteinen, die an Signalübertragungskaskaden beteiligt sind, wie insbesondere die phosphorylieren Proteine, ist, daß diese Proteine im allgemeinen nur in sehr geringer Menge exprimiert werden und die Stöchiometrie der Phosphorylierung im allgemeinen relativ niedrig ist. Traditionelle Methoden zur Untersuchung und insbesondere zur Identifizierung dieser Proteine sind daher oftmals nicht geeignet, da die hierfür erforderlichen Proteinmengen nur mit sehr großen Schwierigkeiten bereitgestellt werden können.
Wegen ihrer besonderen Empfindlichkeit, Vielseitigkeit und Geschwindigkeit hat sich die Massenspektrometrie als sehr geeignete Methode zur Untersuchung von Phosphorylierungen erwiesen. In verschiedenen Studien hat sich jedoch gezeigt, daß das Ionensignal, welches durch phosphorylierte Peptide verursacht ist, in signifikanter Weise durch die Gegenwart von nicht-phosphorylierten Peptiden unterdrückt wird. Daher ist es erforderlich, die phosphorylierten Proteine oder Peptide gegenüber den nicht-phosphorylierten Proteinen oder Peptiden weiter anzureichern, um so eine bessere Detektierbarkeit der phosphorylierten Stellen zu ermöglichen.
Eine herkömmliche Methode zur Anreicherung von Phosphoproteinen verwendet phosphospezifische Antikörper für eine Affinitätsreinigung der phosphorylierten Proteine oder Peptide. Insbesondere die Verwendung von Antiphosphotyrosin-Antikörpern hat sich hier als erfolgreich erwiesen, wohingegen der Einsatz von Antikörpern gegen Phosphoserin- oder Phosphothreonin-enthaltende Proteine noch nicht so oft beschrieben wurde. Eine Alternative zur Anreicherung durch Antikörper ist die Verwendung von immobilisierter Metallaffinitäts-Chromatographie (IMAC). Dieses Verfahren basiert auf der Affinität der negativ geladenen Phosphatgruppen der anzureichernden Proteine für positiv geladene Metallionen, wie beispielsweise Fe³⁺ oder Ga³⁺, welche auf einem chromatographischen Träger immobilisiert sind. IMAC wurde bereits in Kombination mit „electro spray ionization" (ESI)-Tandem-Massenspektrometrie (Stensballe et al., Proteomics 1 (2001), 207–222) oder „matrix-assisted laser desorption/ionization" (MALDI)-Massenspektrometrie (MS) und alkalischer Phosphatase-Behandlung für die Bestimmung der Phosphorylierungsstellen eingesetzt (Raska et al., Anal. Chem. 74 (2002), 3429–3433).
Der Vorteil dieser herkömmlichen Methoden ist, daß hierdurch das gesamte Phosphoproteom einer Zelle isoliert werden kann. Allerdings stellen sich insbesondere bei der Untersuchung von Phosphotyrosin-enthaltenden Proteinen oder Peptiden besondere Probleme, da der Gehalt von Phosphotyrosin in Proteinen in beispielsweise Vertebraten-Zellen nur etwa 0,05% im Vergleich mit dem Gehalt von Phosphoserin (etwa 90%) und Phosphothreonin (etwa 10%) ausmacht.

Ojida et al. (J. Am. Chem. Soc. 124 (2002), 6256–6258) beschreiben zur Untersuchung von tyrosinphosphorylierten Proteinen einen fluoreszierenden Chemosensor, der mit einer phosphorylierten Peptidoberfläche interagiert. Die Autoren konnten zeigen, daß Anthrazin-Derivate mit zwei Zink(II)-Dipicolylaminresten selektiv phosphorylierte Peptide binden und so eine Änderung des Fluoreszenzspektrums bewirken. Mit einem solchen fluoreszierenden Chemosensor können phosphorylierte Peptide in wäßriger Lösung nachgewiesen werden. Eine besondere Spezifität zeigen die hier beschriebenen Anthrazinderivate für Phosphotyrosin-enthaltende Peptide.

Da Tyrosinphosphorylierungen in der lebenden Zelle insbesondere bei der Signaltransduktion und bei anderen Regulationsmechanismen eine besondere Rolle spielen, stellt sich die Erfindung die Aufgabe, ein gegenüber herkömmlichen Methoden verbessertes Verfahren bereitzustellen, mit welchem an Tyrosin phosphorylierte Peptide und/oder Proteine angereichert und/oder isoliert werden können.

Diese Aufgabe wird durch eine Substanz, wie sich im Anspruch 1 be- schrieben ist, gelöst. Anspruch 8 beschreibt ein Anreicherungs- bzw. Isolierungsverfahren, welches eine entsprechende Substanz einsetzt. Die Ansprüche 11, 13 und 15 befassen sich mit der Verwendung dieser Substanz bzw. mit einem entsprechenden Affinitätsmaterial. Mit dem Anspruch 16 wird ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Substanz beansprucht. Die abhängigen Ansprüche betreffen verschiedene bevorzugte Ausführungsformen dieser Aspekte der Erfindung. Durch Bezugnahme wird hiermit der Wortlaut sämtlicher Ansprüche zum Inhalt der Beschreibung gemacht.

Erfindungsgemäß wird eine Substanz bereitgestellt, die als Affinitätsmaterial zur Anreicherung und/oder Isolierung von phosphorylierten Peptiden und/oder Proteinen geeignet ist. Diese Substanz umfaßt einen festen Träger, der über einen Linker mit einem Spacer verbunden ist. Dieser Spacer trägt mindestens zwei Gruppen, welche durch die folgende allgemeine Formel beschrieben sind:

In dieser Formel bedeuten
X, Y: CR', N, S und/oder O;
Z: CR''₂ und/oder (CR'')₂;
R', R'': H, Alkyl, Halogenyl und/oder O-Alkyl; und
M: Mn²⁺, Fe³⁺, Co²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Al³⁺ und/oder Ga³+.

Zur Veranschaulichung ist die erfindungsgemäße Substanz in 1 graphisch dargestellt. Hierbei stehen die verschiedenen Buchstaben für die bereits beschriebenen Bedeutungen.

Diese Substanz und hierbei insbesondere der Spacer mit diesen mindestens zwei Gruppen weist eine hohe Affinität zu phosphorylierten Peptiden und/oder Proteinen auf. Diese Substanz bindet entsprechende Peptide und/oder Proteine mit großer Affinität und ermöglicht daher eine An reicherung und/oder Isolierung dieser Peptide und/oder Proteine aus einer Probe. Durch die Immobilisierung dieser hochaffinen Komponente kann die Substanz als Affinitätsmaterial eingesetzt werden, welches beispielsweise wie ein übliches säulenchromatographisches Material verwendet wird. Daher kann diese Substanz mit Protokollen, wie sie sich dem Fachmann ohne weiteres erschließen, für die Anreicherung und/oder Isolierung von phosphorylierten Peptiden und/oder Proteinen aus einer Probe verwendet werden.

Die erfindungsgemäße Substanz ist insbesondere dazu geeignet, phosphorylierte Peptide und/oder Proteine anzureichern bzw. zu isolieren, die an einem oder mehreren Tyrosinresten phosphoryliert sind. In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Substanz handelt es sich bei der Gruppe um ein Derivat von 2,2'-Dipicolylamin. Eine entsprechende erfindungsgemäße Substanz weist eine besonders hohe Affinität zu tyrosinphosphorylierten Peptiden und/oder Proteinen auf.

In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Substanz umfaßt der Spacer einen oder mehrere aromatische Ringe. Hierbei handelt es sich insbesondere um mono-, bi- und/oder tricyclische aromatische Ringe. Vorteilhafterweise handelt es sich bei dem Spacer um einen Dimethylbenzolsäuremethylester, der noch weitere Reste aufweisen kann. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Ausgangsverbindung für den Spacer durch folgende Formel gekennzeichnet:

Hierbei bedeuten
R₁, R₂: H, Alkyl, Halogenyl, O-Alkyl und/oder mono- oder bicyclische aromatische Ringe.

In ganz besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der Spacer 2,5-, 3,4- und/oder 3,5-Dimethylbenzolsäuremethylester bzw. ein entsprechendes Derivat.

Bevorzugterweise ist der Linker zwischen dem Spacer und dem festen Träger mindestens eine Amid-, Ester-, Carbamoyl-, Ether- und/oder Thioetherbindung. Die konkrete Ausgestaltung des Linkers bzw. der Linker-Verbindung hängt selbstverständlich von der Wahl des Trägermaterials und der Zusammensetzung des Spacers ab.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Substanz ist der Spacer inklusiv der mindestens zwei Gruppen 2,5-, 3,4- und/oder 3,5-Bis[(2,2'-Dipicolylamino)methyl]benzolsäure bzw. der entsprechende Benzolsäuremethylester.

Bevorzugterweise handelt es sich bei dem festen Träger um Glas, Silicat, Gold und/oder mindestens ein organisches Polymer. Allgemein sind hierfür im Prinzip alle üblichen Trägermaterialien einsetzbar, die für chromatographische Anwendungen geeignet sind. Vorteilhaft sind bei spielsweise Chromatographiematerialien in Kügelchenform, wie sie üblicherweise für die Säulenchromatographie eingesetzt werden. Bevorzugte Beispiele hierfür sind Fraktogel oder Sepharose, insbesondere Sepharose 4B. Die Wahl des Trägermaterials ist jedoch nicht auf solche Materialien beschränkt, die für Säulenchromatographie einsetzbar sind. Vielmehr umfaßt die Erfindung auch Materialien, wie sie für andere Affinitätsanreicherungsmethoden geeignet sind. Beispielsweise kann es sich bei dem Träger um ein solches Material handeln, welches für eine Dünnschichtchromatographie geeignet ist.

Weiterhin umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Anreicherung und/oder Isolierung von phosphorylierten Peptiden und/oder Proteinen aus einer Probe. Unter Probe ist hier im allgemeinen eine Probe aus biologischem Material zu verstehen. Beispielsweise kann es sich hierbei um ein Zellextrakt, ein Gewebeextrakt oder ähnliches handeln. Insbesondere können hierfür sämtliche Proteine von Zellen aus einer Zellkultur aufgearbeitet werden. Eine entsprechende Probe kann andererseits auch beispielsweise aus der Aufarbeitung von Biopsiematerial und/oder aus bestimmtem Organgewebe stammen. Andererseits können auch Proben pflanzlichen Ursprungs, bakterielle Proben oder Proben aus Pilzen in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Die Proben können hierbei entweder ohne weitergehende Aufreinigung eingesetzt werden, so daß beispielsweise nur der von Zelltrümmern befreite Zellextrakt verwendet wird. Andererseits kann die Probe auch weiter aufgereinigt sein. Besonders bevorzugt ist jedoch die Verwendung von Proben ohne weitere Aufreinigung, da in diesen Proben auf diese Weise sämtliche phosphorylierten Peptide und/oder Proteine von Interesse angereichert und/oder näher untersucht werden können, wie es insbesondere im Bereich der Proteomforschung von Interesse ist.

Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird zunächst die Probe mit einer Substanz, wie sie bereits beschrieben wurde, in Kontakt gebracht, so daß sich Wechselwirkungen zwischen der Substanz und den phosphorylierten Peptiden und/oder Proteinen aus der Probe ausbilden können. In einem weiteren Schritt wird nicht-gebundenes Material, also insbesondere nicht-phosphorylierte Peptide und/oder Proteine, von der Substanz entfernt. Dies kann insbesondere durch Waschen mit geeigneten Pufferlösungen erfolgen. Im weiteren werden die phosphorylierten Peptide und/oder Proteine, also die mit der Substanz wechselwirkenden Peptide und/oder Proteine, eluiert, d. h. also von der Substanz getrennt. Auch dies erfolgt vorteilhafterweise wieder durch Wahl von geeigneten Pufferbedingungen und/oder durch Änderung der Temperatur oder ähnliches. Dieser Elutionsschritt muß nicht zwingend durchgeführt werden. Insbesondere in Abhängigkeit von der gewählten Analysemethode oder allgemein der Zielsetzung, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren angestrebt wird, kann es vorteilhaft sein, daß die phosphorylierten Peptide und/oder Proteine nicht von dem Affinitätsmaterial abgetrennt werden. Ein geeignetes Protokoll zur Durchführung des Verfahrens und insbesondere die Wahl geeigneter Pufferbedingungen wird sich dem Fachmann auf diesem Gebiet ohne weiteres erschließen.

In der oder den eluierten Fraktionen nach Durchführung dieses Verfahrens befinden sich die nun angereicherten bzw. isolierten phosphorylierten Peptide und/oder Proteine aus der Probe. Diese Peptide und/oder Proteine können im weiteren noch weiter je nach Bedarf bearbeitet oder noch weiter gereinigt werden. Dies kann beispielsweise durch eine wiederholte Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens oder auch durch andere Reinigungsmethoden erreicht werden.

Besonders bevorzugt ist es, die phosphorylierten und vorzugsweise eluierten Peptide und/oder Proteine im weiteren zu analysieren und gegebenenfalls zu identifizieren. Dies kann mit herkömmlichen Methoden, insbesondere mit ein- und/oder zweidimensionaler Polyacrylamidgelelektrophorese und/oder massenspektrometrischen Methoden erfolgen.

Mit besonderem Vorteil erfolgt eine Analyse der angereicherten bzw. isolierten phosphorylierten Peptide und/oder Proteine mit massenspektrometrischen Methoden. Hierbei ist insbesondere eine „electro spray ionization" (ESI)-Tandem-Massenspektrometrie oder die sogenannte „matrix-assisted laser desorption/ionization" (MALDI)-Massenspektrometrie bevorzugt. Insbesondere diese Methoden haben sich bereits für die Untersuchung von phosphorylierten Peptiden und/oder Proteinen als besonders geeignet herausgestellt. Selbstverständlich werden auch andere Analysenmethoden von der Erfindung umfaßt, wie sie sich dem Fachmann erschließen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist bevorzugterweise dadurch gekennzeichnet, daß die anzureichernden phosphorylierten Peptide und/oder Proteine an einem oder mehreren Tyrosinresten ein- oder mehrfach phosphoryliert sind. Die Spezifität der erfindungsgemäßen Substanz für tyrosinphosphorylierte Peptide und/oder Proteine bzw. für an anderer Stelle phosphorylierte Peptide und/oder Proteine wird vor allem durch die Wahl der mindestens zwei Gruppen geprägt, die sich am Spacer gemäß 1 befinden. Im Gegensatz zu threonin- und/oder serinphosphorylierten Peptiden und/oder Proteinen sind vor allem tyrosinphosphorylierte Peptide und/oder Proteine an Signaltransduktions- und Regulationsvorgängen in der Zelle beteiligt. Sie sind daher von besonderem biologischem Interesse. Das Problem herkömmlicher Untersuchungsmethoden für tyrosinphosphorylierte Peptide und/oder Proteine liegt vor allem darin, daß die tyrosinphosphorylierten Peptide und/oder Proteine im Vergleich mit an anderer Stelle phosphorylierten Peptiden und/oder Proteinen in nur ausgesprochen geringer Konzentration in der Zelle vorliegen. Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist es nun möglich, insbesondere diese besonders seltenen phosphorylierten Peptide und/oder Proteine spezifisch anzureichern bzw. zu isolieren und somit einer Untersuchung zugänglich zu machen. Außerdem ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren, durch die spezifische Anreicherung bzw.

Isolierung von allen tyrosinphosphorylierten Peptiden und/oder Proteinen einer Zelle, einen Gesamtüberblick über diese sehr wichtigen Schaltstellen der Zelle zu liefern, wie es insbesondere das Ziel der Phosphoproteomforschung ist.

Weiterhin umfaßt die Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Substanz, wie sie bereits beschrieben wurde, als Affinitätsmaterial zur Anreicherung und/oder Isolierung von phosphorylierten Peptiden und/oder Proteinen. Insbesondere handelt es sich bei dem anzureichernden bzw. zu isolierenden Peptiden und/oder Proteinen um tyrosinphosphorylierte Peptide und/oder Proteine. Bezüglich weiterer Merkmale dieser erfindungsgemäßen Verwendung wird auch die obige Beschreibung verwiesen.

Weiterhin umfaßt die Erfindung ein Affinitätsmaterial zur Anreicherung und/oder Isolierung von phosphorylierten Peptiden und/oder Proteinen. Auch diesbezüglich wird auf die obige Beschreibung verwiesen. Insbesondere ist dieses Affinitätsmaterial dadurch gekennzeichnet, daß das Affinitätsmaterial ein säulenchromatographisches Material ist. Dies hat den Vorteil, daß hiermit das Verfahren zur Anreicherung und/oder Isolierung von phosphorylierten Peptiden und/oder Proteinen mit allgemein üblichen Protokollen aus der Proteinreinigung durchgeführt werden kann, wobei die Anpassung herkömmlicher Protokolle an dieses bestimmte Affinitätsmaterial für einen Fachmann ohne weiteres zu bewältigen ist. Neben säulenchromatographischen Materialien kann das Affinitätsmaterial selbstverständlich auch so ausgestaltet sein, daß es für andere Affinitätsreinigungen geeignet ist. So kann das Affinitätsmaterial beispielsweise so ausgestaltet sein, daß es für eine Dünnschichtchromatographie oder ähnliches geeignet ist.

Darüber hinaus umfaßt die Erfindung eine Chromatographiesäule, die ein entsprechendes Affinitätsmaterial aufweist. Hierbei kann die Chro matographiesäule derart ausgestaltet sein, daß sie bereits mit dem erfindungsgemäßen Affinitätsmaterial beladen ist. Andererseits kann es auch vorteilhaft sein, daß die Chromatographiesäule und das Affinitätsmaterial zunächst getrennt vorliegen und daß die Säule bei Bedarf in der entsprechenden Dimension gepackt wird. Auch bezüglich dieser Chromatographiesäule wird auf die obige Beschreibung verwiesen.

Schließlich umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Substanz, die als Affinitätsmaterial zur Anreicherung und/oder Isolierung von phosphorylierten Peptiden und/oder Proteinen geeignet ist. Diese Substanz wurde oben bereits eingehend beschrieben. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung dieser Substanz umfaßt die folgenden Verfahrensschritten, wobei diese Schritte zur Veranschaulichung in den 2 und 3 schematisiert sind:

a) Zunächst wird mindestens eine Verbindung, die mindestens zwei Methylreste und mindestens einen Methylesterrest enthält, mit N-Bromosuccinimid (NBS), N-Bromoacetamid (NBA) und/oder SO₂Cl₂ zu der entsprechenden Bromomethyl- und/oder Chloromethylverbindung umgesetzt. Die Verbindung ist vorzugsweise die Verbindung V₁, die durch folgende Formel gekennzeichnet ist:
wobei R₁, R₂: H, Alkyl, Halogenyl, O-Alkyl und/oder mono- oder bicyclische aromatische Ringe bedeuten. Ein besonders bevorzugter Vertreter dieser Verbindung V₁ ist Dimethylbenzolsäuremethylester. In diesem Fall ist das Reaktionsprodukt Bis(bromomethyl)benzolsäuremethylester und/oder Bis(chloromethyl)benzolsäuremethylester. Durch diese Verbindung bzw. gemäß der Formel entsprechende Verbindungen wird der Spacer der erfindungsgemäßen Substanz gebildet.
b) Das Reaktionsprodukt aus Verfahrensschritt a) wird mit Alkalicarbonaten, Bicarbonaten und/oder tertiären organischen Aminen sowie mindestens einer Verbindung V₂ gemäß folgender Formel:
wobei X, Y: CR', N, S und/oder O; Z: CR''₂ und/oder (CR'')₂; R', R'': H, Alkyl, Halogenyl und/oder O-Alkyl; M: Mn²⁺, Fe³⁺, Co²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Al³⁺ und/oder Ga³⁺ bedeuten, umgesetzt. Wenn im Verfahrensschritt a) beispielsweise Dimethylbenzolsäuremethylester eingesetzt wurde, ist das Reaktionsprodukt dieses Verfahrensschrittes Bis[(V₂)methyl]benzol säuremethylester. Ein besonders bevorzugter Vertreter von V₂ ist beispielsweise 2,2'-Dipicolylamin.
c) Das Reaktionsprodukt aus Schritt b) wird nun mit Alkalihydroxiden, Carbonaten, Bicarbonaten und/oder quartiären Ammoniumhydroxiden zu der entsprechenden Säure umgesetzt. Wenn anfangs beispielsweise Dimethylbenzolsäuremethylester eingesetzt wurde, entsteht hierbei Bis[(V₂)methyl]benzolsäure. Bei einer anderen Verbindung V₁ entsteht selbstverständlich ein anderes Reaktionsprodukt.
d) Als ein weiterer Schritt wird gegebenenfalls ein festes Trägermaterial aktiviert, an welchem im folgenden das Reaktionsprodukt aus Verfahrensschritt c) immobilisiert werden soll. Ob eine Aktivierung des Trägers erforderlich ist, hängt von dem jeweils gewählten Material ab. Zu welchem Zeitpunkt die Aktivierung des Trägers bzw. eine Bereitstellung des Trägers erfolgt, ist selbstverständlich nicht an die hier aufgeführte Reihenfolge gebunden.
e) Das Reaktionsprodukt aus Verfahrensschritt c) wird mit mindestens einem Carbodiimid, Uranium und/oder Phosphoniumsalz mit dem Träger, der gegebenenfalls aktiviert ist, umgesetzt, so daß das Reaktionsprodukt aus Verfahrensschritt c), also beispielsweise Bis[(V₂)methyl]benzolsäure auf dem Träger immobilisiert wird. Diese Verbindung von Träger und Reaktionsprodukt erfolgt über einen Linker, der beispielsweise eine Amid-, Ester-, Carbomoyl-, Ether- und/oder Thioetherbindung sein kann.
f) Abschließend wird das immobilisierte Produkt aus Verfahrensschritt e) mit Metall beladen, indem der Ansatz mit einer wäßrigen Lösung aus Mn²⁺, Fe³⁺, Co²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Al³⁺ und/oder Ga³⁺ bzw. den entsprechenden Salzen behandelt wird. Besonders be vorzugt sind hierbei Zn²⁺ oder Co²⁺. Die Beladung mit dem Metall gemäß Verfahrensschritt f) kann gegebenenfalls auch zu einem anderen Zeitpunkt der Reaktionsabfolge durchgeführt werden.

Weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen in Kombination mit den Figuren und Beispielen. Die verschiedenen Merkmale können dabei jeweils für sich oder in Kombination miteinander verwirklicht sein.

In den Figuren zeigt

1 schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Substanz;

2 schematische Darstellung der Reaktionsfolge a) bis c);

3 schematische Reaktionsfolge der Verfahrensschritte e) bis f);

4 Dotblot der Proteine, die von Zn²⁺-BiPy- und Co²⁺-BiPy-Kügelchen eluiert wurden. Dot 1: Probe 1; Dot 2: Probe 2; Dot 3: Probe 3; Dot 4: Probe 4; Dot 5: Probe 5; Dot 6: Probe 6; Dot 7: Probe 7; Dot 8: Probe 8; Dot 9: Probe 9; Dot 10: Probe 10;

5 Westernblot der Proteine, die von Zn²⁺-BiPy- und Co²⁺-BiPy-Kügelchen eluiert wurden. Spur 1: Gesamtzellextrakt; Spur 2: Probe 1 (Elution 1); Spur 3: Probe 3 (Elution 1); Spur 4: Probe 5 (Elution 1).

Beispiele

A. Herstellung des Affinitätsmaterials

1. Synthese von 2,5-, 3,4- und 3,5-Di(bromomethyl)benzolsäuremethylester

19,6 g 2,5-, 3,4- oder 3,5-Dimethylbenzolsäuremethylester, 47 g NBS und 0,5 g Benzoyl-Peroxid wurden in 120 ml Carbon-Tetrachlorid gelöst und die Reaktion für 12 h im Rückfluß durchgeführt. Nach dem Abkühlen wurde das Reaktionsgemisch filtriert, und das Lösungsmittel wurde durch Evaporation im Vakuum entfernt. Die erhaltenen Dibromo-Derivate wurden durch Rekristallisierung aus n-Hexan gereinigt, so daß sich für 2,5-Bis(bromomethyl)benzolsäuremethylester eine Ausbeute von 21,2 g bei einem Schmelzpunkt von 71°C, für 3,4-Bis(bromomethyl)benzolsäuremethylester eine Ausbeute von 22,2 g bei einem Schmelzpunkt von 74°C und für 3,5-Bis(bromomethyl)benzolsäuremethylester eine Ausbeute von 25,3 g bei einem Schmelzpunkt von 78°C ergab.

2. Synthese von 2,5-, 3,4- und 3,5-Bis[(2,2'-dipicolylamino)methyllbenzolsäuremethylester

Zu einer Lösung von 2,5-, 3,4- oder 3,5-Bis(bromomethyl)benzolsäuremethylester (2,24 g, 8 mmol), 2,2'-Dipicolylamin (3,5 g, 17,2 mmol) und K₂CO₃ (4,42 g, 3,2 mmol) in 20 ml wasserfreiem DMF (Dimethylfluorid) wurde tropfenweise eine Lösung von KI (1,3 g, 8 mmol) in DMF (8 ml) über 1 h bei 80 °C tropfenweise zugegeben. Nach dem Rühren für 60 min. bei 60 °C wurde das Reaktionsgemisch mit 1 N HCl verdünnt und zweimal mit Ethylacetat gewaschen. Die wäßrige Schicht wurde mit 4 N NaOH alkalisiert und mit Diethylether zweimal extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit Wasser und Lauge gewaschen, gefolgt von einer Trocknung über Na₂SO₄. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum wurde der Rest aus Ethanol rekristallisiert und ergab für 2,5-Bis[(2,2'-dipicolylamino)methyl]benzolsäuremethylester eine Ausbeute von 3,3 g bei einem Schmelzpunkt von 98°C, für 3,4- Bis[(2,2'-dipicolylamino)methyl]benzolsäuremethylester eine Ausbeute von 3,5 g bei einem Schmelzpunkt von 102°C und für 3,5-Bis[(2,2'-dipicolylamino)methyl]benzolsäuremethylester eine Ausbeute von 4,2 g bei einem Schmelzpunkt von 111°C.

3. Synthese von 2,5-, 3,4- und 3,5-Bis[(2,2'-dipicolylamino)methyl]benzolsäure

3,0 g von 2,5-, 3,4- oder 3,5-Bis[(2,2'-dipicolylamino)methyl]benzol säuremethylester in 50 ml 80% MeOH wurden mit 1,10 g Ba(OH)₂ gemischt und im Rückfluß unter Nitrogen für 2 h behandelt. Weitere 0,6 g Ba(OH)₂ wurden zugegeben und der Rückfluß für weitere 2 h durchgeführt. Nach dem Abkühlen des Reaktionsgemisches wurden bezüglich Ba(OH)₂ äquimolare Mengen von 50% H₂SO₄ zugegeben. Das erhalte ne Präzipitat wurde durch Zentrifugation abgetrennt, und die verbleibende Lösung wurde bis zur Trockenheit evaporiert. Bis[(2,2'-dipicolylamino)methyl]-benzolsäuren wurden als öliger Rest erhalten, der ohne weitere Reinigung weiterverwendet wurde.

4. Aktivierung des Trägermaterials

4.1 Aktivierung von Sepharose 4B mit 1,4-Butandioldiglycidylether

50 ml sauggetrocknetes Sepharose 4B-Material wurde in eine 250 ml konische Flasche überführt, die 50 ml 0,6 M NaOH und 50 ml 1,4-Butandioldiglycidylether enthielt. Die Suspension wurde für 12 h bei Raum temperatur geschüttelt. Das Sepharose 4B-Material wurde mit 2 l deionisiertem Wasser gewaschen und sofort für den nächsten Reaktionsschritt eingesetzt.

4.2 Synthese von Amino-1,4-Butandiolether-Sepharose 4B

10 ml der sauggetrockneten, mit 1,4-Butandioldiglycidylether aktivierten Sepharose 4B wurde in eine 250 ml konische Flasche überführt, die 50 ml 2,0 M NH₄OH-Lösung enthielt. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur für 12 h geschüttelt. Die Sepharose 4B wurde mit 1 l deionisiertem Wasser gewaschen und sofort für den nächsten Reaktionsschritt verwendet.

4.3 Synthese von Amino-Fraktogel

10 g Epoxy-Fraktogel-Material wurde in eine 250 ml konische Flasche überführt, die 50 ml 2,0 M NH₄OH-Lösung enthielt. Die Suspension wur de bei Raumtemperatur für 12 h geschüttelt. Das Fraktogel-Material wurde mit 1 l deionisiertem Wasser gewaschen und sofort für den nächsten Reaktionsschritt verwendet.

5. Immobilisierung

5.1 Synthese von 2,5-, 3,4- und 3,5-Bis[(2,2'-dipicolylamino)methyl]benzolsäure-Sepharose 4B

10 ml Amino-1,4-Butandiolether-Sepharose wurde schrittweise in einem Buchnertrichter mit 50 ml 20%, 40%, 60%, 80% und 100% DMF gewaschen. Die Amino-1,4-Butandiolether-Sepharosekügelchen wurden in 15 ml DMF resuspendiert, wobei das DMF jeweils 250 mg von 2,5-, 3,4- bzw. 3,5-Bis[(2,2'-dipicolylamino)methyl]benzolsäure enthielt. Zu dieser Suspension wurden 20 mg Imidazol, 100 μl Pyridin und 500 μl Di-Isopropylcarbodiimid zugegeben. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur für 24 h geschüttelt und weitere 200 μl Di-Isopropylcarbodiimid zugegeben. Nach 12 h wurden die Kügelchen durch Filtration gewonnen und in der folgenden Reihenfolge mit jeweils 50 ml gewaschen: 100%, 80%, 60%, 40%, 20% DMF und 500 ml Wasser. Die Kügelchen wurden dann in 20 ml 5% NaHCO₃ resuspendiert und 100 μl Essigsäureanhydrid hinzugegeben. Die Suspension wurde bei 37°C für 60 min geschüttelt und anschließend mit 50 ml Wasser, 50 ml 10% Essigsäure und 500 ml Wasser gewaschen. Schließlich wurden die Kügelchen in 30% EtOH gewaschen und im Kühlschrank aufbewahrt.

5.2 Synthese von 2,5-, 3,4- und 3,5-Bis[(2,2'-dipicolylamino)methyl]benzolsäure-Fraktogel

Die Synthese erfolgte entsprechend wie unter 5.1, bis auf das Amino-Fraktogel anstatt Sepharose 4B benutzt wurde.

6. Beladen von 2,5- 3,4- und 3,5-Bis[(2,2'-dipicolylamino)methyl]benzolsäure-Sepharose 4B bzw. -Fraktogel mit Zn²⁺ oder Co²⁺

Mit 2,5-, 3,4- und 3,5-Bis[(2,2'-dipicolylamino)methyl]benzolsäure-Sepharose 4B bzw. -Fraktogel gepackte Säulen wurden mit 5 Volumen Wasser gewaschen. Dann erfolgte eine Behandlung mit 3 Volumen 0,2 M-Lösung von ZnSO₄ oder CoCl₂ in Wasser und anschließend wieder 5 Volumen Wasser. Eine folgende Äquilibrierung erfolgte mit entsprechendem Puffer, der für die entsprechende Proteinproben-Vorbereitung benutzt wurde.

B. Anreicherung von tyrosinphosphorylierten Proteinen aus Rattenleber

1. Isolierung von Proteinen mit Tyrosinphosphorylierungen aus Rattenleber

In diesem Beispiel wurden die folgenden Affinitätsmaterialien benutzt:

Material Typ 1: 2,5-Bis[(2,2'-dipicolylamino)methyl]benzolsäure-Sepharose 4B (25BiPy-Sepharose 4B)
Material Typ 2: 3,4-Bis[(2,2'-dipicolylamino)methyl]benzolsäure-Sepharose 4B (34BiPy-Sepharose 4B)
Material Typ 3: 3,5-Bis[(2,2'-dipicolylamino)methyl]benzolsäure-Sepharose 4B (35BiPy-Sepharose 4B)
Material Typ 4: 3,5-Bis[(2,2'-dipicolylamino)methyl]benzolsäure-Fraktogel (35BiPy-Fraktogel)

Tabelle 1: Probenbezeichnung in diesem Beispiel

2. Probenvorbereitung und Isolierung der pTyr-Proteine

2.1 Puffer:

1. Lysis-Puffer: 50 mM NaMOPS, 25 mM NaCl, pH 7,2, 0,5% Zwittergent 3–10, 0,5% CHAPS, 5 mM NaF, 1 mM Natrium-Orthovanadat, 0,2 mM Natrium-Pervanadat, kompletter Mini Protease Inhibitor-Cocktail (ohne EDTA) 1 tabl./10 ml Puffer.
2. Wasch-Puffer: 50 mM NaMOPS, 25 mM NaCl, pH 7,2, 0,1% Zwittergent 3–10, 0,1% CHAPS, 5 mM NaF, 1 mM Natrium-Orthovanadat, 0,2 mM Natrium-Pervanadat.
3. Elutions-Puffer 1: 50 mM NaMOPS, 100 mM NaCl, 50 mM Phenylphosphat (127 mg Phenylphosphat, Dinatriumsalz-Dihydrat pro 10 ml Puffer), pH 7,2, 0,1% Zwittergent 3–10, 0,1% CHAPS, 5 mM NaF, 1 mM Natrium-Orthovanadat, 0,2 mM Natrium-Pervanadat.
4. Elutions-Puffer 2: 50 mM NaMOPS, 100 mM NaCl, pH 7,2, 0,1% Zwittergent 3–10, 0,1% CHAPS, 5 mM NaF, 1 mM Natrium-Orthovanadat, 0,2 mM Natrium-Pervanadat, 50 mM, Na₄EDTA.

2.2 Durchführung

1. 1 g Rattenlebergewebe wurde mit 15 ml Lyse-Puffer homogenisiert. Die Suspension wurde in einem Sorvall SS34 Rotor für 30 min. bei 18.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verwendet und das Pellet verworfen. Der Überstand wurde in 1,5 ml-Proben geteilt.
2. Die Proben (1,5 ml) wurden durch aktivierte und äquilibrierte Säulen laufengelassen, die mit 0,5 ml Zn²⁺-BiPy- und Co²⁺-BiPy-Kügelchen gepackt waren.
3. Die Säulen wurden mit 3,0 ml Wasch-Puffer gewaschen und die erste Elution mit Elutions-Puffer 1 (600 μl) und danach mit Elutions-Puffer 2 (600 μl) eluiert.

3. Dotblot-Analyse der Proteine, die von den Zn²⁺-BiPy- und Co²⁺-BiPy-Kügelchen eluiert worden waren

3.1 Puffer:

1. TBS (Tris-gepufferte Saline): 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 170 mM NaCl, 3,4 mM KCl.
2. TBS/Tween: 0,1% Tween 20 in TBS
3. BCIP/NBT (Bromochloroindolylphosphate/Nitroblau Tetrazolium): NBT- und BCIP-Stammlösungen wurden über mehrere Wochen im Kühlschrank aufbewahrt. Die Stammlösungen wurden durch Auflösung von 0,5 g NBT in 10 ml 70%iger Dimethylformamid präpariert. Die BCIP-Stammlösung wurde durch Auflösung von 0,33 g BCIP-Dinatriumsalz in 10 ml DMF in einem Glasgefäß präpariert.
4. APB (alkalischer Phosphatase-Puffer): 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 100 mM Tris-HCl pH 9,5
5. APB/Tween: 0,1% Tween 20 in APB

3.2 Durchführung

1. Die Positionen der Spots auf der Nitrozellulosemembran wurden mit einem weichen wasserfesten Stift markiert. Die Nitrozellulose membran wurde in Wasser befeuchtet und auf einem sauberen Papier fast vollständig getrocknet.
2. Die Proben wurden auf die markierten Stellen aufgegeben, wobei 1 μg Protein pro Spot aufgegeben wurde.
3. In einer zu bedeckenden Plastikschale wurde ausreichend Quenching-Puffer (5% BSA (bovines Serumalbumin) in TBS/Tween) gegeben, so daß der Boden der Schale vollständig bedeckt war. Der Nitrozellulose-Blot wurde vorsichtig auf die Oberfläche des Quenching-Puffers gegeben, so daß der Filter einheitlich befeuchtet wurde. Dann wurde der Filter in den Quenching-Puffer untergetaucht. Die Inkubation erfolgte unter Bewegung oder Schütteln für wenigstens 2 h. Die Lösung wurde entfernt und eine Lösung mit dem ersten Antikörper (1 : 1.000 Verdünnung pTyr102-Antikörper, Cell Signaling Technology, # 9416) in 4% BSA in TBS/Tween-Puffer zugegeben. Die Inkubation erfolgte für 16 h bei 4°C unter kontinuierlicher Bewegung auf einem Schüttler.
4. Die Antikörperlösung wurde weggegossen. Ohne den Blot trocknen zu lassen, wurde der Blot viermal mit 50 ml TBS/Tween jeweils für 5 min. gewaschen. Diese Waschlösung wurde wiederum abgegossen und die Lösung mit dem zweiten Antikörper auf den Blot gegeben.
5. Die Inkubation mit dem zweiten Antikörper (1 : 5.000-Verdünnung AP-konjugierter Antimaus-IgG-gesamtes Molekül, Sigma 93160 im Quenching-Puffer) wurde für 3 h bei 4°C mit Bewegung durchgeführt.
6. Diese Antikörperlösung wurde abgegossen und der Blot viermal mit jeweils 50 ml TBS/Tween jeweils für 5 min. gewaschen.
7. Der Nitrozelluloseblot wurde in BCIP/NBT-Arbeitslösung plaziert, wobei diese Lösung durch Zugabe von 66 ml NBT-Stammlösung zu 10 ml APB/Tween mit gründlichem Mischen und Zugabe von 33 ml BCIP-Stammlösung hergestellt wurde.
8. Nach der Entwicklung der Farbe wurde die Reaktion durch Waschen mit Wasser und 1% Essigsäure gestoppt.

4 zeigt die Ergebnisse des Dotblot-Screenings. Hierbei zeigt Dot 1 Probe 1, Dot 2 Probe 2, Dot 3 Probe 3 usw.

4. Westernblot-Analyse der Proteine, die von Zn²⁺-BiPy- und Co²⁺-BiPy-Material eluiert wurden

4.1 Die Polyacrylamidgelelektophorese (PAGE) wurde gemäß Laemmli durchgeführt. Es wurden jeweils 20 μg Protein pro Spur des 11% PAGE aufgetragen.

4.2 Puffer

Es wurden die gleichen Puffer wie beim Dotblot-Screening verwendet.

4.3 Durchführung

1. Das Elektroblotting wurde mit einer Nitrozellulosenmebran gemäß den Angaben des Herstellers mit einem Halbtrocken-Elektroblot-Apparat der Firma BioRad durchgeführt.
2. In einer zu bedeckenden Plastikschale wurde ausreichend Quenching-Puffer (5% BSA in TBS/Tween) gegeben, so daß der Boden der Schale vollständig bedeckt war. Der Nitrozelluloseblot wurde vorsichtig auf die Oberfläche des Quenching-Puffers gegeben, so daß der Filter einheitlich befeuchtet wurde. Dann wurde der Filter in den Quenching-Puffer untergetaucht. Die Inkubation erfolgte unter Bewegung oder Schütteln für wenigstens 2 h. Die Lösung wurde entfernt und eine Lösung mit dem ersten Antikörper (1 : 1.000 Verdünnung pTyr102-Antikörper, Cell Signaling Technology, # 9416) in 4% BSA in TBS/Tween-Puffer zugegeben. Die Inkubation erfolgte für 16 h bei 4% unter kontinuierlicher Bewegung auf einem Schüttler.
3. Die Antikörperlösung wurde weggegossen. Ohne den Blot trocknen zu lassen, wurde der Blot viermal mit 50 ml TBS/Tween jeweils für 5 min. gewaschen. Diese Waschlösung wurde wiederum abgegossen und die Lösung mit dem zweiten Antikörper auf den Blot gegeben.
4. Die Inkubation mit dem zweiten Antikörper (1 : 5.000-Verdünnung AP-konjugierter Antimaus-IgG-gesamtes Molekül, Sigma 93160 im Quenching-Puffer) wurde für 3 h bei 4°C mit Bewegung durchgeführt.
5. Diese Antikörperlösung wurde abgegossen und der Blot viermal mit jeweils 50 ml TBS/Tween jeweils für 5 min. gewaschen.
6. Der Nitrozelluloseblot wurde in BCIP/NBT-Arbeitslösung plaziert, wobei diese Lösung durch Zugabe von 66 ml NBT-Stammlösung zu 10 ml APB/Tween mit gründlichem Mischen und Zugabe von 33 ml BCIP-Stammlösung hergestellt wurde.

Die Ergebnisse der Westernblotanalyse sind in 5 dargestellt. Hierbei zeigt die Spur 1 den gesamten Zellextrakt, die Spur 2 die Probe 1 (Elution 1), die Spur 3 Probe 3 (Elution 1) und die Spur 4 Probe 5 (Elution 1).

Claims

Substanz, umfassend einen festen Träger, der über einen Linker mit einem Spacer verbunden ist, welcher mindestens zwei Gruppen gemäß der folgenden Formel trägt
wobei X, Y: CR', N, S und/oder O; Z: CR''₂ und/oder (CR'')₂; R', R'': H, Alkyl, Halogenyl und/oder O-Alkyl; M: Mn²⁺, Fe³⁺, Co²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Al³⁺ und/oder Ga³⁺ bedeuten.
Substanz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gruppe ausgehend von 2,2'-Dipicolylamino gebildet ist.
Substanz nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Spacer ein oder mehrere aromatische Ringe, insbesondere mono-, bi- und/oder tricyclische aromatische Ringe umfaßt.
Substanz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Spacer ausgehend von 2,5-, 3,4- und/oder 3,5-Dimethylbenzolsäuremethylester gebildet ist.
Substanz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Linker mindestens eine Amid-, Ester-Carbamoyl-, Ether- und/oder Thioether-Bindung umfaßt.
Substanz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Spacer mit den mindestens zwei Gruppen ausgehend von 2,5-, 3,4- und/oder 3,5-Bis[(2,2'-dipicolyamino)methyl]benzolsäure gebildet ist.
Substanz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der feste Träger Glas, Silicat, Gold und/oder mindestens ein organisches Polymer, insbesondere Sepharose und/oder Fraktogel, ist.
Verfahren zur Anreicherung und/oder Isolierung von phosphorylierten Peptiden und/oder Proteinen aus einer Probe, umfassend die Verfahrensschritte: – Inkontaktbringen der Probe mit einer Substanz gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche zur Ausbildung von Wechselwirkungen zwischen der Substanz und phosphorylierten Peptiden und/oder Proteinen in der Probe, – Entfernen von nicht wechselwirkendem Material, – Gegebenenfalls Eluieren der phosphorylierten Peptide und/oder Proteine, – Gegebenenfalls Analysieren der phosphorylierten Peptide und/oder Proteine.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Analyse mit massenspektrometrischen Methoden erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die phosphorylierten Peptide und/oder Proteine tyrosinphosphorylierte Peptide und/oder Proteine sind.
Verwendung einer Substanz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 als Affinitätsmaterial zur Anreicherung und/oder Isolierung von phosphorylierten Peptiden und/oder Proteinen.
Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die phosphorylierten Peptide und/oder Proteine tyrosinphosphorylierte Peptide und/oder Proteine sind.
Affinitätsmaterial zur Anreicherung und/oder Isolierung von phosphorylierten Peptiden und/oder Proteinen, insbesondere von tyrosinphosphorylierten Peptiden und/oder Proteinen, umfassend mindestens eine Substanz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7.
Affinitätsmaterial nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Affinitätsmaterial ein säulenchromatographisches Material ist.
Chromatographiesäule, umfassend ein Affinitätsmaterial gemäß Anspruch 13 oder Anspruch 14.
Verfahren zur Herstellung einer Substanz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend die Verfahrensschritte: a) Umsetzen mindestens einer Verbindung V₁ der folgenden Formel
wobei R₁, R₂: H, Alkyl, Halogenyl, O-Alkyl, mono- oder bicyclische aromatische Ringe bedeuten, mit N-Bromosuccinimid (NBS), N-Bromoacetamid (NBA) und/oder SO₂Cl₂; b) Umsetzen des Reaktionsproduktes aus Schritt a) mit mindestens einem Alkalicarbonat, Bicarbonat und/oder tertiärem organischen Amin mit mindestens einer Verbindung V₂ gemäß der folgenden Formel
wobei X, Y: CR', N, S und/oder O; Z: CR''₂ und/oder (CR'')₂; R', R'': H, Alkyl, Halogenyl und/oder O-Alkyl bedeuten; c) Umsetzen des Reaktionsproduktes aus Schritt b) mit mindestens einem Alkalihydroxyd, Carbonat, Bicarbonat und/oder quartiärem Ammoniumhydroxid; d) gegebenenfalls Aktivierung eines festen Trägers; e) Umsetzen des Reaktionsprodukts aus Schritt c) mit mindesens einem Carbodiimid, Uranium und/oder Phosphoniumsalz mit dem festen Träger, der gegebenenfalls aktiviert ist, zu einem auf dem Träger über Amid-, Ester-, Carbomoyl-, Ether- und/oder Thioetherbindungen immobilisierten Reaktionsprodukt; f) Beladen des Reaktionsproduktes aus Schritt e) mit mindestens einem Metall durch Behandeln mit einer wäßrigen Lösung aus Mn²⁺, Fe³⁺, Co²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Al³⁺ und/oder Ga³.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung V₁ Dimethylbenzolsäuremethylester ist.
Verfahren nach Anspruch 16 oder Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung V₂ 2,2'-Dipicolylamin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß der feste Träger Glas, Silicat, Gold und/oder mindestens ein organisches Polymer, insbesondere Sepharose und/oder Fraktogel ist.