JPH08510551A - 標識炭水化物およびアッセイにおけるそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 炭水化物または糖抱合体の混合物中の炭水化物または糖抱合体を識別する方法であって、特定のまたはそれぞれの炭水化物もしくは糖抱合体が疎水性の蛍光標識された糖分子であり、標識が、ＲがＨおよび置換基から選択されＰｈがフェニレンである−ＮＲ−Ｐｈ−ＣＯ−基である方法。

Description

【発明の詳細な説明】 標識炭水化物およびアッセイにおけるそれらの使用 発明の分野 本発明は、炭水化物に関し、特に同定および分析を容易ならしめる標識に抱合 した（オリゴ）糖に関する。発明の背景 オリゴ糖の分析は、ゲル濾過、イオン交換、疎水的相互作用および浸水的相互 作用クロマトグラフィー、質量スペクトル法、ゲル電気泳動ならびにキャピラリ ー電気泳動をはじめとする種々の標準的方法により行われるが、これらの方法に 限定されない。トリチウム標識がしばしば用いられる。さらに、例えば、ＵＶ吸 収、蛍光、または電気化学的に活性のある標識でオリゴ糖の還元末端を標識する ための方法、特に、還元的アミノ化による方法について詳述したいくつかの報告 がある。 多くの研究室は放射性同位元素の使用を避けたいであろう。例えば、ＷＯ−Ａ −９１０５２５６には、炭水化物の分離および分析のための、電荷を有する置換 基を有する蛍光ナフタレン環構造で炭水化物を標識することが開示されている。 好ましい標識試薬はアミノナフタレンスルホン酸である。 一般的には、かかるオリゴ糖に対する標識は、比較的大型で、荷電分子であり 、例えば、バイオラッド（Bio-Rad）Ｐ−４ゲルを用いる、例えば非荷電（オリ ゴ）糖のゲル濾過クロマトグラフィーに対してオリゴ糖を不適なものにしている 。 より小型の標識、例えば、ｐ−アミノベンゾアート類が質量スペクトル法に使 用されている。しかしながら、それらはｐＨを上昇させた場合に分解されやすい 。 より小型の蛍光標識も知られている。例えば、ヘイス（Hase）ら，ジャーナル ・オブ・バイオケミストリー（J.Biochem.）第８５巻：９８９〜９９４頁（１９ ７９年）には、オリゴ糖に対する蛍光標識の使用および濾紙電気泳動によるオリ ゴ糖の分離が開示されている。ヤルパニ（Yalpani）ら，カナディアン・ジャー ナ ル・オブ・ケミストリー（Can.J.Chem.）第５９巻：２９３４〜２９３９頁（１ ９８１年）には、二環式、例えば、ナフタレン標識、さらにはｐ−フルオロアニ リンを出発物質としてｐ−フルオロクロロアセトアミドアニリン（すなわち、Ｃ １−ＣＨ₂−ＣＯ−ＮＨ−Ｐｈ−Ｆ、ここに、Ｐｈは１，４−フェニレン）を経 由して得られる１,２：３,４−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｄ−ガラクトピ ラノースに対する蛍光標識が開示されている。 ビスワグナー（Bisswagner）ら，バイオケミストリー（Biochemistry）第１８ 巻（２６）：５９４６〜５９５３頁（１９７９年）には、トリプトファン生合成 、特に、多機能酵素（ホスホリボシル）アントラニラートイソメラーゼ−インド −ルグリセロールホスファートシンターゼに関する研究が報告されている。Ｎ− （５−ホスホリボシル）アントラニレートは、天然基質よりはるかに安定で純水 な基質として調製され同定された。この合成基質は、酵素の２個の結合部位それ ぞれに結合すると、異なる吸収および蛍光スペクトルを有することが報告された 。 オーブライエン（O'Brien）ら，ジャーナル・ヘテ・ケミ（J.Het.Chem.）第７ 巻：９９〜１０５頁（１９７０年）には、出発物質としてジメチルアントラニル 酸およびアントラニル酸を用いるアンチリボフラビン化合物の合成が開示されて いる。しかしながら、ここではアントラニル酸化合物は合成前駆体として使用さ れただけであり、蛍光標識としては使用されなかった。発明の概要 本発明によれば、式 −ＮＲ−Ｐｈ−ＣＯ−、例えば、−ＮＲ−Ｐｈ−ＣＯＯ− または−ＮＲ−Ｐｈ−ＣＯＮＲ'− で示される蛍光基で糖が標識される。 標識された化合物は安定で、水に可溶性で、さらにＤＭＳＯのごとき有機溶媒 にも可溶性である。例えば、基が−ＮＲ−Ｐｈ−ＣＯＮＲ'−である場合、それ らは電荷を有しないが、ゲルにおいて満足に移動する。ＲおよびＲ'は独立して Ｈ、Ｃ₁〜₆アルキル、例えばメチルであるか、または蛍光特性および十分な親水 性が保持されているならばいかなる置換基であってもよい。Ｐｈはフェニレンで ある。発明の説明 種々の条件下、シアノ水素化ホウ素ナトリウムのごとき還元剤（後で添加して もよい）、またはボラン−ジメチルアミン錯体のごときボラン−アミン錯体の存 在下で、還元糖との反応により標識を結合させることができる。反応後、誘導体 化された糖を、種々の方法により生成することもでき、あるいは、例えば、Ｐ４ ゲル濾過クロマトグラフィーにより直接分析してもよい。 糖の還元末端の還元的アミノ化により、容易に入手できる出発物質から、新規 化合物を容易に製造することができる。例えば、チャートＡに示すように、糖（ オリゴ−ＣＨＯで表す）をアントラニルアミド、例えば、２−アミノベンズアミ ドと反応させる。Ｎ原子のいずれかまたはそれぞれを、上記定義のＲ／Ｒ'によ り置換してもよく；基Ｒ'は同じであっても異なっていてもよい。さらにかかる 基によりベンゼン環を置換してもよい。ｍ−またはｐ−アミノベンズアミドを用 いてもよい。 別法として、糖を誘導体化し、次いで、チャートＢ（この場合、Ｐｈはｏ−フ ェニレン）に示すように、イサト酸無水物と反応させることもできる。いずれの 場合にも、いずれかまたは両方の試薬は反応性のある誘導体の形態であってよい 。例えば、糖を既知方法により処理して、例えばアセチル化により末端基が保護 されていてもよいヒドラゾンを得てもよく、次いで、例えばボラン−ジメチルア ミン錯体またはシアノ水素化ホウ素ナトリウムのごとき還元剤でヒドラゾンをヒ ドラジンに還元して部分式−Ｎ＊Ｈ−ＮＨＡｃを得てもよく；次いで、この生成 物をイサト酸無水物（またはそのアナログ）で処理してもよい。示された部分式 において、アステリスクは、炭水化物に結合したＮ原子であって、親電子試薬の 攻撃を受けやすいＮ原子を示す。 チャートにおいて、蛍光基は−ＮＲ−Ｐｈ−ＣＯＮＲ'−である。もう１つの 基は、アントラニル酸から誘導される−ＮＲ−Ｐｈ−ＣＯＯ−である。特に典型 的な蛍光基は−ＮＨ−（ｏ−ｐｈ）−ＣＯＮＨ₂および −ＮＨ−（ｏ−ｐｈ）−ＣＯＯＨである。 本発明化合物は、標識が存在するという理由で、糖抱合体である。糖、すなわ ち単糖またはオリゴ糖は、糖抱合体から誘導された炭水化物であってもよく、例 えば、糖脂質、糖ホルモン、または糖ペプチドであってもよい。好ましくは、糖 残基の末端の還元末端（あるいは単糖の場合には還元末端）に結合した何らかの 適当なリンカーにおいて、あるいは該リンカーを介して標識されている。 本発明の標識糖は、広範囲の分離系、アッセイ目的に非常に適する。特別には 、ＣＺＥまたはゲル電気泳動を用いてもよい。 ２−アミノベンズアミド（２ＡＢ）は、実質的に化学量論的な糖のプールの標 識を、選択性なく提供するが、既知の２−アミノピリジンは化学量論的であるこ とを示さないということが見いだされた。よって、標識として、２ＡＢは有効性 および選択性においてトリチウムと同等である。それは使用が簡単で、例えば、 糖の脱シアル化のない、あるいは実質的に糖の脱シアル化のない最小限の分解し か引き起こさない。さらに、２ＡＢ標識グリカンを、最も慣用的なクロマトグラ フィー法、質量スペクトル法および分光学的方法により分析することができる。 ２ＡＢ標識は極度に酸性およびアルカリ性下においてさえも安定であり、エキソ グリコシダーゼの作用を妨害しない。２ＡＢ標識されたグリカンをクロマトグラ フィーにより分析する場合、そのクロマトグラフィーでの挙動は、通常、誘導体 化されていないグリカンとは異なることに注意すべきである。 以下の実施例は本発明を説明する。実施例１はプロトコールの性質を帯びてい る。実施例２および３においては、特に、２−アミノベンズアミド（２ＡＢ）お よびアントラニル酸（２ＡＡ）を標識として使用する。実施例１ 材料： バイアルＡ：染料、例えば２ＡＢ バイアルＢ：ＤＭＳＯ（３５０μｌ）ＧｌｙｃｏＰｕｒｅ バイアルＣ：酢酸（２００μｌ）ＧｌｙｃｏＰｕｒｅ バイアルＤ：還元剤、例えばシアノ水素化ホウ素ナトリウム試料の調製 標識されるグリカン試料は、純粋であってもグリカン混合物であっても、遊離 の還元末端を有しており、塩を含まないものであるべきである。カチオンおよび ／またはアニオン交換（ただし、後者は酸性グリカンを吸着しない）を用いるか またはゲル濾過により、グリカンは容易に脱塩される。標識される脱塩されたグ リカンの一定量（１０ピコモル〜５０ナノモルの範囲）を、標識する直前に、清 潔な０．５ｍｌ容エッペンドルフチューブに移すべきである。還元されていない グリカンを取り扱う場合に、周囲の炭水化物に汚染されないように注意すべきで ある。手順： １．塩を含まないグリカンを清潔なエッペンドルフチューブに移し、蒸発乾固さ せる（グリカンがシアル化されている場合には２７℃未満の温度で）。 ２．バイアルＣの内容物１５０μｌをバイアルＢに添加し、混合する。この混合 物２００μｌをバイアルＡに添加し、染料が溶解するまで混合する。バイアルＡ 中の染料溶液１００μｌをバイアルＤに添加し、還元剤が溶解するまで混合する （ボルテックスを必要とするかもしれない）。この最後の添加をヒューム・フー ド（fume hood）内で行うべきである。 ３．バイアルＤ中の最終的な標識試薬５μｌを、乾燥した各グリカン試料に添加 し、エッペンドルフチューブのキャップを閉め、完全に混合し、６５℃で１２０ ±１５分インキュベーションする。 ４．インキュベーションの終わりに、反応物全体を濾紙片のマークした領域に一 度にスポットする（標準的なピペッターを用いる）。試料同定のために、濾紙片 の始点から最も遠い先端に鉛筆でマークする。スポットを室温で乾燥させ、濾紙 片をラックに移し、前以て平衡化しておいたクロマトグラフィータンク内にラッ クを置く。 ５．溶媒の先端が濾紙の終端から１０ｍｍ以内に来たとき、ラックを静かに取り 出し、ヒューム棚（fume cupboard）内に直立させて乾燥する（２０〜３０分） 。タンクから溶媒を捨てる。 ６．始点の各サイド上の濾紙片を５ｍｍ幅に切断し、始点を含む切断された濾紙 片を丸め（必要ならば）、清潔な試験管（ガラスまたはプラスチック）に挿入さ れたフィルターを装備したリュアーロックトシリンジ（luer-locked syringe） に移す。濾紙に１.０ｍｌの水を直接添加し、濾紙を完全に湿潤させ、浸す。５ 分間置き、次いで、１０分間遠心分離する（３５００ｒｐｍ）。 ７．標識グリカンの入った試験管を取り、蒸発乾固させ、さらなる分析のために 、所望体積の水または溶媒に再懸濁する。 ８．（脱シアル化）３５μｌの水中の各グリカンプールの一部を０．７ｍｌ容の エッペンドルフバイアルに移す。シアリダーゼ溶液１０μｌを５００ｍＭ酢酸ナ トリウム緩衝液に溶解し、試料１個の消化につき０.１ユニットとして各グリカ ンプールに添加する。キャッブをしたバイアルを３７℃で１４〜１６時間インキ ュベーションする。インキュベーションの終わりに、ＲＡＡＭ２０００GlycoSeq uencer（オックスフォード・グリコシステムズ・リミテッド（OxfordGlycoSyste ms Ltd.））を用いる分画のために標識グリカン標品を処理する。この装置は、 電荷を有しないグリカン混合物を分画するように設計された一体化されたクロマ トグラフィー装置である。グリカンの標識されたプールが酸性物質を含有してい る場合、酵素的または化学的手段によりこれらを除去すべきである。実施例２ 異なる条件下でのグリカンへの２ＡＢの結合を行うために、２種のモデルＮ− グリカン、すなわち、アシアロバイアンテナリ−Ｎ−グリカン（ＮＡ２）および コアフコースを伴うアシアロバイアンテナリ−Ｎ−グリカン（ＮＡ２Ｆ）を基質 として用いた。Ｇｌｙｃｏｍａｐ１０００（オックスフォード・グリコシステム ズ・リミテッド）を用いるゲル浸透クロマトグラフィーにおいて、各グリカンの ２ＡＢ−抱合形態の各グリカンは、非抱合形態とは異なる位置に溶出した。それ ゆえ、以下のアッセイ手順を用いて、異なる反応条件での抱合の程度を調べた。 放射標識（ガラクトースのＣ−６において³Ｈで）した還元されていないＮＡ ２およびＮＡ２Ｆを、対応するアシアロアガラクトバイアンテナリーグリカンの ガラクトシレーションにより調製し（β−ガラクトシルトランスフェラーゼおよ びＵＤＰ−（³Ｈ）を用いて）、Ｇｌｙｃｏｍａｐ１０００を用いて精製した。 痕跡量の放射標識されたグリカンを対応する既知量の未標識グリカンと混合し、 選択された条件下で２ＡＢと抱合させ、次いで、Ｇｌｙｃｏｍａｐ１０００を用 いて生成物を分離した（未反応２ＡＢおよび塩を濾紙クロマトグラフィーにより 除去後）。抱合および未抱合グリカン中の放射標識の相対量は、２ＡＢに対する グリカンのモル％抱合量の直接的な測定値であり、８５％と見積もられた。実施例３ マイクログラム量の加水分解されたデキストラン、オリゴ糖ＮＡ２、ＮＡ２Ｂ およびウシ・フェツインから遊離されたオリゴ糖ライブラリー、ヒト・α１−酸 性糖蛋白、ウシ・膵臓リボヌクレアーゼＢならびにニワトリ・オボアルブミンを 、ポリプロピレン製マイクロ遠心チューブ中で乾燥させた。３０％酢酸／ジメチ ルスルホキシド中１Ｍシアノ水素化ホウ素ナトリウムおよび３５０ｍＭの２−ア ミノ安息香酸を含有する溶液５μｌを添加した。試料を６５℃で２時間インキュ ベーションし、次いで、再度乾燥し、その後、１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐ Ｈ６．８、０．０１％ブロモフェノールブルーおよび２０％グリセロールからな るサンプルバッファーに再溶解した。次いで、各試料４μｌを、１０％アクリル アミド、３％ビスアクリルアミドおよび１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファ ー（ｐＨ６．８）からなるスタッキングゲルならびに２５％アクリルアミド、５ ％ビスアクリルアミドおよび３７５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）から なる分離ゲルよりなるポリアクリルアミドミニゲルに負荷した。４０ｍＭＴｒｉ ｓ／ホウ酸バッファー（ｐＨ８．８）からなるリザーバーバッファーを用い、定 電流１６ｍＡで９０分、試料を電気泳動した。ゲルを装置からはずし、最大エミ ッション波長３１２ｎｍのＵＶトランスイルミネーターを用いて可視化した。慣 用的なゲル乾燥装置で乾燥する前後において、ゲルを調べ、そして／または写真 に取るることができる。 乾燥ゲルの写真（上記のごとく取ったもの）は、 レーン１ 加水分解されたデキストラン レーン２ オボアルブミン レーン３ リボヌクレアーゼＢ レーン４ ウシ・フェツイン レーン５ ＮＡ２ レーン６ ＮＡ２Ｂ レーン７ α１−酸性糖蛋白 レーン８ 加水分解されたデキストラン を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 パレック，ラジェシュ・ビーク イギリス国オックスフォード・オーエック ス１・４ビーエイチ、ユニバーシティ・カ レッジ、シニアー・コモン・ルーム（番地 の表示なし) (72)発明者 ゴールディング，ポール イギリス国オックスフォードシャー・オー エックス14・２エイエヌ、アビンドン、ヘ ンドレッド・ウェイ９番 (72)発明者 チャールズ，スティーブン・アレクサンダ ー イギリス国オックスフォードシャー・オー エックス６・０ワイキュー、バイセスタ ー、ラベンクロフト54番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．炭水化物または糖抱合体の混合物中の炭水化物または糖抱合体を識別する 方法であって、特定のまたはそれぞれの炭水化物もしくは糖抱合体が疎水性の蛍 光標識された糖分子であり、標識が、ＲがＨおよび置換基から選択されＰｈがフ ェニレンである−ＮＲ−Ｐｈ−ＣＯ−基である方法。 ２．ＲがＨである請求項１記載の方法。 ３．Ｐｈがｏ−フェニレンである請求項１または請求項２記載の方法。 ４．ゲルにおける泳動である上記請求項のいずれかに記載の方法。 ５．標識が−ＮＲ−Ｐｈ−ＣＯＮＲ'−基であり、ＲおよびＲ'が独立してＨおよ び置換基より選択される、請求項１において定義される標識糖。 ６．一方のＲ'が他方のＲ'と同じであっても異なっていてもよい オリゴ−ＣＨ₂−ＮＲ−Ｐｈ−ＣＯＮ（Ｒ'）₂なる式を有し、オリゴ−ＣＨＯと して表されるオリゴ糖から得られる請求項５記載の糖。 ７．オリゴ−ＣＨ₂−ＮＲ'−ＣＯ−Ｐｈ−ＮＨＲなる式を有し、オリゴ−ＣＨＯ として表されるオリゴ糖から得られる請求項５記載の糖。 ８．特定のまたはそれぞれのＲ'がＨである請求項５〜７のいずれかに記載の糖 。 ９．ＲがＨである請求項５〜８のいずれかに記載の糖。 １０．Ｐｈがｏ−フェニレンである請求項５〜９のいずれかに記載の糖。 １１．糖が請求項５〜１０のいずれかにおいて定義されている請求項１記載の方 法。