EP1537245A2 - Dna-chips zur bioprozesskontrolle - Google Patents

Dna-chips zur bioprozesskontrolle

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Publication number
EP1537245A2
EP1537245A2 EP03797287A EP03797287A EP1537245A2 EP 1537245 A2 EP1537245 A2 EP 1537245A2 EP 03797287 A EP03797287 A EP 03797287A EP 03797287 A EP03797287 A EP 03797287A EP 1537245 A2 EP1537245 A2 EP 1537245A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
corresponds
seq
amino acid
acid sequence
nucleotide sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03797287A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jörg FEESCHE
Karl-Heinz Maurer
Roland Breves
Thomas Schweder
Michael Hecker
Britta JÜRGEN
Birgit Voigt
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henkel AG and Co KGaA
Universitaet Greifswald
Original Assignee
Henkel AG and Co KGaA
Ernst Moritz Arndt Universitaet Greifswald
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henkel AG and Co KGaA, Ernst Moritz Arndt Universitaet Greifswald filed Critical Henkel AG and Co KGaA
Publication of EP1537245A2 publication Critical patent/EP1537245A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to chips doped with nucleic acid probes which are suitable for monitoring the course of bioprocesses, to the use of corresponding probes on such chips, or to methods and possible uses which are based on such chips, and to genes suitable therefor.
  • Bio processes are to be understood, for example, as the culture of microorganisms on an agar plate or in shaking culture, but in particular their fermentation, or the extraction of raw materials by fermentation of microorganisms.
  • eukaryotes such as yeasts or streptomycetes
  • gram-negative or gram-positive bacteria there is a rich state of the art for this, both with regard to unicellular eukaryotes such as yeasts or streptomycetes and with regard to gram-negative or gram-positive bacteria.
  • Such processes are monitored on the one hand by observing the changing properties and requirements of the organisms under consideration in the course of the process, which can be seen, for example, in the optical density and viscosity of the medium, in absorbed or released gases, in changes in the pH or in changing Imposes nutritional needs.
  • an electrochemical sensor for on-line analysis by E. co // - Accordingly, the / acZ gene can be brought under the control of the promoter of the RpoS-dependent gene osmY, which is expressed when a culture changes to the stationary growth phase, and the ⁇ -galactosidase activity derived therefrom which occurs in the culture medium can be over An electrochemical sensor can be determined and the signal obtained thereby indicates the end of the exponential growth phase of the culture in question.
  • the chip technology is based on the principle of attaching probes for proteins or for nucleic acids to physically readable carriers (chips) which are directly dependent on the presence of the proteins in question , or address nucleic acids. Compared to the two technologies mentioned first, such chips are expected to provide timely analysis of the process under consideration (at-line analysis). Another advantage is the need for comparatively small sample quantities.
  • Chips that recognize mRNA are usually doped with complementary DNA molecules.
  • DNA chip analyzes there are those with PCR amplification of the target sequence and those without amplification.
  • optical evaluation of the signals attributable to the detection there are also those with electrical evaluation.
  • the optical detection methods sometimes require an amplification mechanism for the signals.
  • fluorophores, acridinium esters or indirect detection via secondary binding processes for example via biotin, avidin / streptavidin or digoxigenin.
  • digoxigenin-specific antibodies are used for optical detection, which are labeled with an enzyme.
  • the enzyme activity is detected either colorimetrically or via luminescence.
  • the hybridization can be coupled with a PCR on the DNA chip in order to be able to carry out the entire detection reaction on a chip (“Lab-on-a-Chip - Concept").
  • electrical impulses can be used to amplify the hybridization reaction on optical DNA chips.Fritsche et al. (2002; Laborwelt II) proposed an electrical chip system that works with metallic nanoparticles that For example, are bound to oligonucleotides. In this system, a drop in the electrical resistance at the electrode, which can then be measured as a signal, is triggered by a so-called “metallic reinforcement” during the hybridization reaction.
  • DNA probes are used which, after labeling with a suitable enzyme (for example alkaline phosphatase), lead after hybridization to an electrically active substrate which is then subjected to a redox reaction on the Electrode is detectable (Hintsche et al. (1997), EXS, 80, pp. 267-283).
  • a suitable enzyme for example alkaline phosphatase
  • the detection of a broad spectrum of gene activities with one and the same chip is desirable, for example in order to recognize a multitude of possible scenarios, for example, but also if several organism strains are observed in parallel or the same host is to be used to form different products, so that not a new one every time Chip must be developed.
  • Biotechnological processes with gram-positive bacteria are of particular technical interest. Because these are used particularly because of their ability to secrete for the industrial production of valuable materials. Among these, those of the genus Bacillus and below them, in turn, the species B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. agaradherens, B. Hcheniformis, B. lentus and B. globigii are currently of the greatest economic importance.
  • Table 1 deals with the simultaneous observation of the activity of several genes in bacteria (multiparametric detection).
  • E. coli Another fermentation of E. coli is described in the work "Monitoring of genes that respond to overproduction of an insoluble recombinant protein in Eschenchia coli glucose-limited fed-batch fermentations" by Jürgen et al. (2000), Biotech. Bioeng., 70 , Pp. 217-224, which expresses the expression of the genes ion, dnaK, ibpB, htrA, ppiB, groEL, tig, s6, 19 and dps, partly at the mRNA level, partly at the protein level, partly at both levels.
  • subtilis describes how they can be determined using the DNA macro array technique or two-dimensional polyacrylic gel electrophoresis, after which the genes for purine and pyrimidine synthesis and certain ribosomal proteins are used in gram-positive bacteria used for overexpression expressed more than expected based on the knowledge of Gram-negative bacteria, another difference concerns the proteases Lon and Clp.
  • patent application WO 02/055655 A2 discloses more than 1,800 DNA sequences which have been determined by the complete sequencing of the genome of the microorganism Methylococcus capsulatus. This includes one from the lipid metabolism, namely eno, which is also of interest in the context of the present patent application, but would not have been considered on the basis of this application alone.
  • the task therefore was to identify genes, preferably to identify a representative cross-section of genes which are suitable for indicating via changes in metabolic activities how an observed bioprocess proceeds.
  • attention should be paid to fermentations, especially those that serve the production of biological materials. Accordingly, such physiological conditions should be recognizable, which indicate that the cells in question leave the path of the optimal growth course.
  • physiological conditions include, for example, states of hunger for various nutrients or stress situations such as heat or cold shock, shear stress, oxidative stress or oxygen limitation.
  • the aim was to develop probes for these genes so that they could be used to monitor the corresponding bioprocesses.
  • Another task was to develop a sensor doped with probes on a representative selection of marker genes, which is suitable for monitoring a bioprocess based on microorganisms, in particular gram-positive or gram-negative bacteria, changes in the metabolic activities characterizing this process faster than in conventional, in particular display methods based on gel electrophoresis. This should have the advantage of being able to intervene in the process in question with the shortest possible time delay. Because the possibility of timely regulation should make a bioprocess more efficient.
  • Such a sensor should be able to be used for several comparable processes and should be adaptable to specific applications with comparatively minor variations. It should preferably be aimed at bioprocesses based on ⁇ / // t / s species, in particular B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. lentus, B globigii, and very particularly on B. Hcheniformis. Bioprocesses focused on fermentations, especially the technical production of products, especially of overexpressed proteins. Furthermore, such a sensor should enable appropriate methods for measuring the physiological state of the cells under consideration and corresponding possible uses for monitoring the biological processes under consideration.
  • the first part of this task is solved by identifying the following genes: acoA, ahpC, ahpF, citB, clpC, clpP, codY, cspA, cspB, des, dnaK, eno, glnR, groEL, groL, gsiB, ibpA, ibpB, katA , katE, IctP, Idh, opuAB, phoA, phoD, pstS, purC, purN, pyrB, pyrP, sigB, tnrA, trxA and ydyF.
  • the further task is solved by a chip that is equipped with nucleic acid or nucleic acid analogue probes for at least four of the following genes: acoA, ahpC, ahpF, citB, clpC, clpP, codY, cspA, cspB, des, dnaK, eno, glnR, groEL, groL, gsiB, ibpA, ibpB, katA, katE, IctP, Idh, opuAB, phoA, phoD, pstS, purC, purN, pyrB, pyrP, sigB, tnrA, trxA and ydjF, or for the same in the organism under consideration regulated genes from the metabolic pathways characterized by these genes is doped.
  • probes for further genes or gene products can be contained.
  • genes which can be used according to the invention for bioprocess control are listed in Table 2 below, together with the functions of the derived proteins and the physiological signal for which they stand, unless the function clearly shows the latter.
  • these are genes whose gene products become active in the following metabolic contexts: cell wall synthesis, DNA replication, membrane transport mechanisms, C-metabolism (carbon), citrate cycle (tricarboxylic acid cycle; TCA), respiratory chain, N-metabolism (nitrogen), P-metabolism (Phophathaushalt)
  • the relevant DNA sequences include (in some cases odd), the regions coding for the respective protein and in each case approximately 200 bp upstream and downstream thereof, regardless of whether these regions detect the complete non-coding regions of the gene or protrude into regions, that already affect the neighboring genes.
  • SEQ ID NO. 93 clpP from ß Hcheniformis
  • SEQ ID OK. 11 Comparison with the corresponding sequence of ß. subtilis suggests that at the 5 'end about 48 bp and thus 16 amino acids are missing.
  • SEQ ID NO. 101 (dnaK from ß Hcheniformis) only the coding area is given.
  • the even-numbered sequence numbers each stand for the derived amino acid sequences. They are used, for example, to check the gene function via sequence database comparisons and can possibly be used to generate probes that recognize similar nucleic acids, for example by back-translating the genetic code. All of these genes are described individually in the prior art. They can be found for the different organisms from generally accessible databases. This applies in particular to the well-characterized species ß. subtilis and £. coli, which are generally regarded as model organisms of gram-positive or gram-negative bacteria.
  • sequences given, for example, in the sequence listing were taken from the databases of the Institut Pasteur, 25.28 rue du Do Budapest Roux, 75724 Paris CEDEX 15, France, which can be found at http://genolist.pasteur.fr/Colibri/ ( for E. coli) or http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/ (for ß. subtilis) (as of August 16, 2002).
  • GenBank National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA.
  • Bacteria form a coherent mRNA (polycistronic mRNA) from the genes which are located one behind the other in an operon and are regulated via the same promoter. This hybridizes with all probes against each of the genes mapped on this mRNA.
  • genes that are regulated equally can be identified in a different way: For this purpose, the promoters that regulate the expression of the genes in question must be identified using methods known per se. Identically regulated genes can be recognized here by the fact that they are preceded by the same promoters.
  • a probe is a chemical compound which is able to bind mRNA molecules via hydrogen bonds, as is also the case, for example, when the two strands of a DNA or the DNA-RNA interaction interact. From a chemical point of view, this is DNA, for example, which is more stable to hydrolysis than RNA.
  • DNA for example, which is more stable to hydrolysis than RNA.
  • other molecules are known in the prior art, in particular chemically synthesized ones, which enable the same interaction biomimetically, but are more stable than DNA.
  • nucleic acid analog probes characterize preferred embodiments of the present application.
  • chips according to the invention are doped with increasingly preferably at least 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 28, 30, 32 or 34 of the named probes in order to have the broadest possible range of metabolic situations capture.
  • the genes listed are known in both gram-positive and gram-negative bacteria. Some of these genes are currently only known from individual groups of organisms such as gram-negative or gram-positive bacteria. If homologous representatives, that is to say recognizable by hybridization, are found in other groups in the future, they will be included in the scope of the claim accordingly. Because according to the invention it is not important to determine the exact nucleotide sequence but via Hybridization to get an accurate signal.
  • the groEL gene can come from a gram-positive organism such as ß. subtilis can be identified by homologous hybridization with a probe for the E. coli groL gene.
  • the detection of this signal can be used to infer a stress situation for the organism under consideration, in which a large number of misfolded proteins occur.
  • the same probe can also be applied analogously to other species which form a large-like chaperone.
  • genes which are equally regulated in the organism under consideration and lie on the metabolic pathways characterized by these genes, can serve as equivalent indicators.
  • the selection of the genes purC or purN which are characteristic of the purine metabolism, can be considered to some extent as arbitrary.
  • one or more other genes are selected which are also required for the purine synthesis, provided that they stand for the same signal as purC and / or purN.
  • the same also applies to the genes of the other metabolic services under consideration: Cell wall synthesis, DNA replication, membrane transport mechanisms C metabolism (carbon balance), citrate cycle (tricarboxylic acid cycle; TCA), respiratory chain, N metabolism (nitrogen balance), P metabolism (phosphate balance),
  • Amino acid synthesis pyrimidine synthesis, translation, including ribosomal genes, secretion, anaerobiosis and possibly sporulation.
  • the chip is on gram-positive bacteria, in particular ⁇ . subtilis or ß. Hcheniformis aligned.
  • it is recommended to dope it with probes from the group of genes acoA, ahpC, ahpF, citB, clpC, clpP, codY, cspB, des, dnaK, eno, glnR, groEL, gsiB, katA, katE, IctP , Idh, opuAB, phoA, phoD, pstS, purC, purN, pyrB, pyrP, sigB, tnrA, trxA and ydjF, or for genes that are regulated equally in the organism under consideration, are selected from the metabolic pathways characterized by these genes.
  • the associated DNA sequences are in the sequence listing under the numbers SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 43, 45, 49, 51, 53, 55, 59, 61, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77 and 81 for ß. subtilis or SEQ ID NO. 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123 and 125 for ß. Hcheniformis specified. According to what has been said above, probes for other gram-positive bacteria can also be derived from these.
  • the chip is aimed at Gram-negative bacteria, in particular E. coli or Klebsieila.
  • Gram-negative bacteria in particular E. coli or Klebsieila.
  • probes from the group of genes clpP, cspA, cspB, dnaK, groL, ibpA, ibpB, katE, phoA, pstS, and trxA, or for genes regulated equally in the organism under consideration metabolic pathways characterized by these genes are selected.
  • the associated DNA sequences are in the sequence listing under the numbers SEQ ID NO. 13, 17, 21, 27, 35, 39, 41, 47, 57, 63 and 79 for E. coli. According to what has been said above, probes for Klebsiella and other gram-negative bacteria can also be derived from these.
  • Chips of preferred embodiments are therefore characterized in that only one or another gene of the following gene pairs, which is regulated equally in the organism under consideration, is present from the metabolic pathway each characterized by one of these genes: ahpC or ahpF; clpC or clpP; cspA or cspB; ibpA or ibpB; IctP or Idh; phoA or phoD; purC or purN; pyrB or pyrP.
  • the wild-type strains are generally not used, but rather those which are aimed at the process in question.
  • this includes the provision of selection markers or further adjustments of the metabolism, up to auxotrophies.
  • Such strains have a special requirement profile for the growth conditions and some have. Metabolic genes that are mutated to the wild type genes. Since chips according to the invention should advantageously be aimed at precisely these strains, especially the bioprocess under consideration, these strain-specific peculiarities must be taken into account and can be reflected in the choice of the probes concerned. This applies in particular if the complete gene sequences, rather only parts of them, are used as probes.
  • the chips are characterized in that they are probes which respond to the genes in question from the organism selected for the bioprocess, preferably those which are derived from genes of this organism.
  • the organism selected for the bioprocess is a representative of unicellular eukaryotes, gram-positive or gram-negative bacteria.
  • Different organisms are selected depending on the type of product desired. For the purposes of the invention, this does not only mean the production strains but also all organisms upstream of the production process, for example for cloning corresponding genes or for selecting suitable expression vectors.
  • the unicellular eukaryotes are protozoa or fungi, including in particular yeast, very particularly Sacharomyces or Schizosaccharomyces. This is because they are used as host cells, in particular for the gene products of eukaryotes, especially if they are to undergo special modifications which can only be carried out by these strains. These include, for example, glycosylations.
  • the gram-positive bacteria are Coryneform bacteria or those of the genus Bacillus, including in particular ⁇ . subtilis, B. amyloliquefaciens, B. Hcheniformis, B. agaradherens,
  • B. stearothermophilus B. lentus or ß. globigii. Because these are technically particularly important production strains. They are used in particular for the production of low molecular weight chemical compounds, such as vitamins or antibiotics, or for the production of proteins, in particular enzymes. Amylases, cellulases, lipases, oxidoreductases and proteases are particularly noteworthy.
  • Gram-negative bacteria in particular those of the genera Eschenchia coli or Klebsiella. These are used both on a laboratory scale, for example for cloning and expression analysis, and on an industrial scale to produce biological materials.
  • chips according to the invention are thus characterized in that at least one, and increasingly preferably several, probes are derived from the sequences which are listed in the sequence listing under the numbers SEQ ID NO.
  • the processes observed serve a technical interest that is linked to other specific genes.
  • a protein in the event that a protein is to be produced, it is the gene for this protein and in the event that a low-molecular compound is to be produced, one or more gene products which are on the synthetic route of the compound in question.
  • Other cell-specific genes can also be affected, such as metabolic genes that have to be increasingly formed in the course of product production, for example a cell-own oxidoreductase, if the product is to be obtained from an educt or an intermediate product via oxidation or reduction.
  • Examples 8 and 9 show which genes can also be monitored via a chip according to the invention if a specific enzyme is to be produced by fermentation.
  • these are chips which are additionally doped with at least one probe for an additional gene, in particular one which is in a metabolic relation to the gene (s) additionally expressed due to the process, very particularly for one of these or this itself.
  • chips which are characterized in that the gene additionally expressed due to the process is the protein for a commercially usable protein , in particular an amylase, cellulase, lipase, oxidoreductase or protease, or one that is on a synthetic route for a low-molecular chemical compound or at least partially regulates it.
  • the design of chips doped with nucleic acids is known from the prior art presented in the introduction. They are based on the principle of nucleic acid hybridization of the mRNA to be detected with the probe presented on the chip.
  • chips with an optical and with an electrical analysis system In principle, both systems can be used according to the invention.
  • Such chips are used as follows to monitor (monitor) the bioprocess in question: a sample with the biological material to be analyzed is taken from the process at a certain point in time; RNA, in particular mRNA, is isolated from this, using methods known per se, for example using cell disruption and using a denaturing buffer. This is advantageously passed over / through the chip in a buffer. Hybridization (sandwich marking) of a prepared RNA with the homologous probe provided on the chip (target nucleic acid, for example target DNA or target nucleic acid analog) results in a corresponding optically or electronically evaluable signal. This is based, for example, on hybridization with a second probe or on a secondary detection reaction, for example via RT-PCR.
  • the strength of the hybridization signal is proportional to the number of specific mRNA present in the sample over a certain range, which may have to be optimized in individual cases. In this way, the strength of the signal is a direct measure of the activity of the gene in question at the time of sampling.
  • the time span between sampling and measurement should be kept as short as possible, for example via a largely automated sampling, its processing and conduction via / through the sensor.
  • Limiting the usability of a probe is the degree of homology between the probe provided and the mRNA that is to be recognized by hybridization.
  • a hybridization must take place under the conditions given by the structure of the measuring apparatus and other influences, which can only be attributed specifically to the gene of interest, is sufficiently strong to give a positive signal and, on the other hand, is not too strong to be the mRNA diffuses again after the signal has been generated in order to free the binding site for the next molecule or to allow the signal to subside.
  • chips of preferred embodiments are characterized in that one, preferably several, single-stranded probes are provided in the form of the codogenic strand. Because this hybridizes with the coding strand of the DNA, or with the corresponding mRNA.
  • Chips according to the invention should advantageously be usable several times, in particular during a single observed process, in the course of which constant monitoring is desirable.
  • chips according to the invention are characterized in that one, preferably several probes are provided in the form of a DNA, preferably a nucleic acid analog.
  • a DNA itself is less sensitive to hydrolysis than an RNA.
  • Analogs which are difficult to hydrolyze, in which, for example, the phosphate of the sugar-phosphate backbone is replaced, are preferred, however. Such connections are known in the prior art.
  • the probes in question would be, for example to be synthesized according to the model of the sequence listing associated with this application.
  • Hybridization over the entire sequence length is often not required to detect an mRNA.
  • the specific probes therefore need to encompass less the region of the gene that is transcribed into mRNA than that which is actually to be detected as mRNA. It is advantageous for this purpose to select a region which is close to the 5 'end of the mRNA, since this is first transcribed into mRNA and can therefore be detected first after activation of the gene. This is conducive to timely proof.
  • chips according to the invention are thus characterized in that one, preferably a plurality of probes comprise gene regions which are rewritten into mRNA by the organism to be examined, in particular the gene regions which are close to the 5 'end of the mRNA.
  • mRNA molecules are often in a secondary structure that is based on hybridization of individual mRNA regions with their own, other regions. This leads to loop or stem-Ioop structures, for example. Such regions generally hybridize less easily with other nucleic acid molecules, even if they are homologous.
  • chips according to the invention are therefore characterized in that one, preferably several, probes respond to fragments of the nucleic acids in question, in particular to those which have a low degree of secondary folding in the mRNA in question, based on the respective total mRNA.
  • the probes used for the detection reaction need only comprise parts of the mRNA to be detected, provided that the signal obtainable via them is still specific enough. This specificity sets the lower limit for the length of the probes in question.
  • a chip according to the invention is therefore preferably characterized in that one, preferably a plurality of probes, have a length of less than 200 nucleotides, and increasingly preferably less than 150, 120, 100, 80, or from 20 to 60, 30 to 50 and particularly preferably of 45 to 55 nucleotides.
  • probes which were each only 20 bases long have already proven to be useful.
  • Chips according to the invention are preferably characterized in that an electrical signal is triggered by the binding of the mRNA to the probe in question.
  • the time from sampling to measurement of the signal for optically evaluable chips is approximately 24 hours. With the help of an electrical system, the time required is currently approximately 2 hours (see FIG. 4). In contrast, the number of samples which can be analyzed simultaneously in the case of chips which can be evaluated electrically is currently limited to a maximum of 12 probes, although rapid development suggests that more analysis places can be made available on one chip shortly. The limits for this are the electronic evaluation units for the various signals.
  • RT-PCT One of the methods for mRNA quantification established in the prior art is, for example, the RT-PCT.
  • This is described in the article “Quantification of Bacterial mRNA by One-Step RT-PCR Using the LightCycler System” (2003) by S.Tobisch, T .Koburger, B.Jürgen, S.Leja, M.Hecker and T.Schiser in BIOCHEMICA, Volume 3, pages 5 to 8.
  • detection via electrochips has another advantage, illustrated in Example 4 and Figure 5, namely the higher one Reliability of the data. Because, as shown there, these have significantly smaller fluctuation ranges compared to the RT-PCR.
  • the mode of operation of electrically readable chips of a particularly preferred embodiment can be described as follows:
  • the gene-specific probes are covalently bound in a manner known per se to magnetic beads which are located in chambers of the chips provided for this purpose.
  • the specific hybridization of the corresponding mRNA to the respective beads takes place in this hybridization chamber, which can be temperature-controlled and can be flushed through by the solutions in question.
  • the beads are held in this chamber by a magnet.
  • a washing step is carried out to remove the unbound RNA, so that only specific hybrids are still present in the incubation chamber, specifically bound to the magnetic beads.
  • a detection probe is introduced into the incubation chamber, which is labeled with an alkaline phosphatase bound to biotin-extravidin. This probe binds to a second free region of the hybridized mRNA. This hybrid is then washed again and incubated with the substrate of the alkaline phosphatase para-aminophenol phosphate (pAPP). The enzymatic reaction in the incubation chamber leads to the release of the redox-active product para-aminophenol (pAP). This is now passed over the Red / Ox electrode on the electrical chip and the signal is sent to a potentiostat.
  • System-specific software reads the data received and the results can be evaluated and displayed on a computer with the help of another program (for example Origin).
  • the detection reaction also by another, but preferably because of the electrical measuring principle, a redox reaction.
  • One achievement of the present invention is to have process-critical genes identified and made available for analysis by means of appropriately designed biochips.
  • the advantage of chips over conventional detection methods, in addition to the time saved and the higher accuracy, is that the activity of several different genes can be detected simultaneously by providing several probes on a carrier in the same sample.
  • the present invention provides the use of appropriate probes which are selected such that they give a representative picture for most fermentation processes about different physiological states of the gram-negative and gram-positive in question.
  • the probes described here which are specific for the genes ibpB, dnaK, acoA and sigB, can therefore be bound to appropriate chips in a manner known per se and used for the analysis of bioprocesses.
  • Example 4 and Example 7 the acoA mRNA of ⁇ which indicates glucose hunger. subtilis or ß.
  • Example 6 the phosphate deficient gene product of pstS of ß. Hcheniformis and in example 5 with aprE an mRNA for a gene product of interest. Electrically evaluable chips with eleven probes at the same time are described in Examples 8 and 9, seven probes reflecting the general metabolic situation, one directed towards the product of interest and three other genes each monitoring those aspects of the metabolism that are related to the one of interest Product stand (see tables 5 and 6).
  • the protease product is a probe for genes of nitrogen metabolism and the product amylase is a probe for genes of carbohydrate metabolism.
  • the gene activities required for the chemical conversion of the substrates in question could be observed in a biotransformation, for example.
  • a separate subject of the invention is thus the use of nucleic acid or nucleic acid analog probes for at least four of the following genes: acoA, ahpC, ahpF, citB, clpC, clpP, codY, cspA, cspB, des, dnaK, eno, glnR, groEL, groL, gsiB, ibpA, ibpB, katA, katE, IctP, Idh, opuAB, phoA, phoD, pstS, purC, purN, pyrB, pyrP, sigB, tnrA, trxA and ydjF, or for genes regulated equally in the organism under consideration from the metabolic pathways characterized by these genes, bound to a previously described chip for determining the physiological state of an organism undergoing a biological process.
  • preferred uses are those which are characterized in that at least one, and more preferably several, probes are derived from the sequences which are listed in the sequence listing under the numbers SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123 and 125 are listed.
  • Another separate subject of the invention is formed in accordance with the above-mentioned method for determining the physiological state of an organism undergoing a biological process by using a chip according to the invention described above.
  • a method according to the invention is preferably characterized in that the organism selected for the bioprocess is a representative of unicellular eukaryotes, gram-positive or gram-negative bacteria.
  • a method according to the invention is preferably characterized in that the unicellular eukaryotes are protozoa or fungi, including in particular yeast, very particularly Sacharomyces or Schizosaccharomyces.
  • a method according to the invention is preferably characterized in that the gram-positive bacteria are Coryneform bacteria or those of the genus Bacillus, including in particular ⁇ . subtilis, B. amyloliquefaciens, B. Hcheniformis, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. lentus or ß. globigii, among them particularly preferred with probes, of those in the sequence listing specified sequences from ß. subtilis or ß. Hcheniformis (SEQ ID NO.
  • probes are preferably used which are derived from the relevant genes of the most closely related species, particularly preferably from the respective organism itself.
  • Hcheniformis means such processes, which are characterized in that they are ß. subtilis or ß. Hcheniformis acts, whereby for ß. subtilis the probes from the sequences given in the sequence listing from ß. subtilis (SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 43, 45, 49, 51, 53, 55, 59, 61, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77 and / or 81) are derived, or for ß. Hcheniformis the probes from the sequences given in the sequence listing from ß. Hcheniformis (SEQ ID NO.
  • 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123 and / or 125) are derived.
  • a method according to the invention is preferably characterized in that the gram-negative bacteria are those of the genera Eschenchia coli or Klebsieila, preferably with probes which are derived from the sequences from E. coli (SEQ ID NO. 13, 17, 21 , 27, 35, 39, 41, 47, 57, 63 and / or 79) are derived.
  • a method according to the invention is preferably characterized in that the determination of the physiological state is carried out at different points in time of the same process, optionally using a number of identical chips.
  • a process according to the invention is preferably characterized in that the process is a fermentation, in particular the fermentative production of a commercially usable product, particularly preferably the Production of a protein or a low molecular weight chemical compound.
  • a separate subject of the invention is the use of a chip according to the invention for determining the physiological state of an organism undergoing a biological process.
  • a use according to the invention is preferably characterized in that the organism selected for the bioprocess is a representative of unicellular eukaryotes, gram-positive or gram-negative bacteria.
  • a use according to the invention is preferably characterized in that the unicellular eukaryotes are protozoa or fungi, including in particular yeast, very particularly Sacharomyces or Schizosaccharomyces.
  • a use according to the invention is preferably characterized in that the gram-positive bacteria are Coryneform bacteria or those of the genus Bacillus, including in particular ⁇ . subtilis, B. amyloliquefaciens, B. Hcheniformis, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. lentus or ß. globigii, among them particularly preferred with probes, which from the sequences given in the sequence listing from ß. subtilis or ß. Hcheniformis (SEQ ID NO.
  • ß. subtilis acts, among them those uses are preferred which are characterized in that for ß. subtilis the probes from the sequences given in the sequence listing from ß. subtilis (SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 43, 45, 49, 51, 53, 55, 59, 61, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77 and / or 81) are derived, or for ß.
  • Hcheniformis the probes from those in the sequence listing specified sequences from ß. Hcheniformis (SEQ ID NO.
  • 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123 and / or 125) are derived.
  • a use according to the invention is preferably characterized in that the gram-negative bacteria are those of the genera Eschenchia coli or Klebsieila, preferably with probes which are derived from the sequences from E. coli (SEQ ID NO. 13, 17, 21 , 27, 35, 39, 41, 47, 57, 63 and / or 79) are derived.
  • a use according to the invention is preferably characterized in that the determination of the physiological state is carried out at different points in time of the same process, optionally using several chips of identical construction.
  • a use according to the invention is preferably characterized in that the process is a fermentation, in particular the fermentative production of a commercially usable product, particularly preferably the production of a protein or a low-molecular chemical compound.
  • each of these proteins together with the respective nucleotide sequence, including the relevant homology areas, is a separate subject of the present application.
  • the respective biochemical functions performed by these proteins are also noted in Table 3 and can be checked using the database information given above. According to the invention, they are regarded as the enzymes which carry out the corresponding biochemical functions which the enzymes specified in the sequence listing in vivo in ß. Exercise hcheniformis. These items are listed below; the respective specified percentage identity homology values via an appropriate computer algorithm, for example about the program Vector NTI ® Suite, Fa InforMax, Bethesda, USA, are reviewed.
  • all integer numbers as well as all intermediate fractional numbers are to be understood:
  • acetoin dehydrogenase E1 component (AcoA; E.C.1.2.4.-) with an amino acid sequence that corresponds to that in SEQ ID NO. 84 amino acid sequence given at least 74% and increasingly preferably to 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 , 95, 96, 97, 98, 99 and 100% are identical; in connection with a nucleic acid (acoA) coding for an alpha subunit of the acetoin dehydrogenase E1 component (AcoA; E.C.1.2.4.-) with a nucleotide sequence that corresponds to that in SEQ ID NO.
  • 83 specified nucleotide sequence is at least 85% and increasingly preferably to 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 and 100% identical, in particular over the partial area which the nucleotide positions 201 to 872 according to SEQ ID NO. 83 corresponds.
  • specified nucleotide sequence is at least 91% and increasingly preferably 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 and 100% identical, in particular over the portion that corresponds to nucleotide positions 201 to 764 according to SEQ ID NO. 85 corresponds to.
  • alkyl hydroperoxide reductase / NADH dehydrogenase (AhpF; EC1.6.99.3) with an amino acid sequence that corresponds to that in SEQ ID NO. 88 amino acid sequence given is at least 92% and increasingly preferably 93, 94, 95, 96, 97, 97.5, 98, 99 and 100% identical; in connection with a nucleic acid (ahpF) coding for a large subunit of alkyl hydroperoxide reductase / NADH dehydrogenase (AhpF; EC1.6.99.3) with a nucleotide sequence which corresponds to that in SEQ ID NO.
  • nucleotide sequence at least 87% and increasing preferably 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 and 100% is identical, in particular over the partial area which corresponds to nucleotide positions 201 to 1730 according to SEQ ID NO. 87 corresponds.
  • Aconitase hydratase (CitB; E.C.4.2.1.3) with an amino acid sequence that corresponds to that in SEQ ID NO. 90 amino acid sequence indicated is at least 93% and increasingly preferably 94, 95, 96, 97, 97.5, 98, 99 and 100% identical; in connection with a nucleic acid (citB) coding for an aconitase hydratase (CitB; E.C.4.2.1.3) with a nucleotide sequence which corresponds to that in SEQ ID NO.
  • 89 specified nucleotide sequence is at least 93% and increasingly preferably 92, 93, 94, 95, 96, 97, 97.5, 98, 99 and 100% identical, in particular over the portion that corresponds to nucleotide positions 201 to 2927 according to SEQ ID NO. 89 corresponds.
  • - Class III stress response-linked ATPase (ClpC) with an amino acid sequence that corresponds to that in SEQ ID NO. 92 amino acid sequence given is at least 95% and increasingly preferably 96, 96.5, 97, 98, 99 and 100% identical; in connection with a nucleic acid (clpC) coding for a class III stress response-linked ATPase (ClpC) with a nucleotide sequence which corresponds to that in SEQ ID NO.
  • 91 specified nucleotide sequence is at least 84% and increasingly preferably 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 and 100% identical, in particular over the partial area which corresponds to nucleotide positions 201 to 2633 according to SEQ ID NO. 91 corresponds.
  • Proteolytic subunit of the ATP-dependent protease (class III heat shock protein; EC 3.4.21.92; CIpP) with an amino acid sequence that corresponds to that in SEQ ID NO. 94 amino acid sequence indicated is at least 97% and increasingly preferably 98, 98.5, 99, 99.5 and 100% identical; in connection with a nucleic acid (clpP) coding for a proteolytic subunit of the ATP-dependent protease (class III heat shock protein; EC 3.4.21.92; CIpP) with a nucleotide sequence which corresponds to that in SEQ ID NO.
  • clpP nucleic acid
  • 93 specified nucleotide sequence is at least 86% and increasingly preferably to 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 and 100% identical, in particular over the sub-region that the nucleotide positions 1 to 549 according to SEQ ID NO. 93 corresponds.
  • 96 amino acid sequence given is at least 92% and increasingly preferably 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 and 100% identical; in connection with a nucleic acid (codY) coding for a Pleitropen transcription repressor (CodY) with a nucleotide sequence which corresponds to that in SEQ ID NO. 95 specified nucleotide sequence is at least 88% and increasingly preferably to 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 and 100% identical, in particular over the partial area which corresponds to the nucleotide positions 201 to 980 SEQ ID NO. 95 corresponds.
  • CspB major cold shock protein with an amino acid sequence that corresponds to that in SEQ ID NO. 98 amino acid sequence indicated is at least 98% and increasingly preferably 98.5, 99, 99.5 and 100% identical; in connection with a nucleic acid (cspB) coding for a main cold shock protein (CspB) with a nucleotide sequence which corresponds to that in SEQ ID NO. 97 specified nucleotide sequence is at least 97% and increasingly preferably 98, 98.5, 99, 99.5 and 100% identical, in particular over the portion that corresponds to nucleotide positions 201 to 401 according to SEQ ID NO. 97 corresponds.
  • 99 specified nucleotide sequence is at least 88% and increasingly preferably 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 and 100% identical, in particular over the partial area which corresponds to nucleotide positions 201 to 1229 SEQ ID NO. 99 corresponds.
  • Class I heat shock protein (molecular chaperone; DnaK) with an amino acid sequence that corresponds to that in SEQ ID NO. 102 amino acid sequence specified is at least 94% and increasingly preferably 95, 96, 97, 98, 99 and 100% identical, in particular over the portion that corresponds to amino acid positions 1 to 480 according to SEQ ID NO. 102 corresponds; in connection with a nucleic acid (dnaK) coding for a class I heat shock protein (molecular chaperone; DnaK) with a nucleotide sequence which corresponds to that in SEQ ID NO.
  • 101 indicated nucleotide sequence is at least 88% and increasingly preferably 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 and 100% identical, in particular over the portion which corresponds to nucleotide positions 1 to 1440 according to SEQ ID NO , 101 corresponds.
  • Enolase (Eno; E.C.4.1.2.11) with an amino acid sequence that corresponds to that in SEQ ID NO. 104 amino acid sequence indicated is at least 98% and increasingly preferably 98.5, 99, 99.5 and 100% identical; in connection with a nucleic acid (eno) coding for an enolase (Eno; E.C.4.1.2.11) with a nucleotide sequence that corresponds to that in SEQ ID NO. 103 specified nucleotide sequence is at least 94% and increasingly preferably 95, 96, 97, 98, 99 and 100% identical, in particular over the portion that corresponds to nucleotide positions 201 to 1493 according to SEQ ID NO. 103 corresponds.
  • 105 specified nucleotide sequence is at least 91% and increasingly preferably 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 and 100% identical, in particular over the portion that corresponds to nucleotide positions 201 to 608 according to SEQ ID NO. 105 corresponds.
  • - Class I heat shock protein with an amino acid sequence that corresponds to that in SEQ ID NO. 108 amino acid sequence given is at least 96% and increasingly preferably 97, 97.5, 98, 98.5, 99, 99.5 and 100% identical; in connection with a nucleic acid (groEL) coding for a class I heat shock protein (chaperonin; GroEL) with a nucleotide sequence which corresponds to that in SEQ ID NO. 107 specified nucleotide sequence is at least 90% and increasingly preferably 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 and 100% identical, in particular over the portion that corresponds to the nucleotide positions 201 to 1835 according to SEQ ID NO. 107 corresponds.
  • - Catalase (KatA; EC1.11.1.6) with an amino acid sequence that corresponds to that in SEQ ID NO. 110 specified amino acid sequence at least 90% and increasing preferably 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 and 100% identical; in connection with a nucleic acid (katA) coding for a catalase (KatA; EC1.11.1.6) with a nucleotide sequence which corresponds to that in SEQ ID NO.
  • 109 specified nucleotide sequence is at least 86% and increasingly preferably to 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 and 100% identical, in particular over the portion that corresponds to the nucleotide positions 201 to 1661 according to SEQ ID NO. 109 corresponds.
  • nucleotide sequence is at least 85% and increasingly preferably to 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 and 100% identical, in particular over the partial area which the nucleotide positions 201 to 1661 according to SEQ ID NO. 111 corresponds.
  • - Glycine betaine ABC transporter with an amino acid sequence that corresponds to that in SEQ ID NO. 114 amino acid sequence given at least 82% and increasingly preferably to 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 92.5 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 and 100% is identical; in connection with a nucleic acid (opuAB) coding for a glycine-betaine ABC transporter (OpuAB) with a nucleotide sequence which corresponds to that in SEQ ID NO.
  • 113 specified nucleotide sequence is at least 85% and increasingly preferably to 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 and 100% identical, in particular over the partial area which the nucleotide positions 201 to 1055 according to SEQ ID NO. 113 corresponds.
  • PstS Phosphate binding protein with an amino acid sequence that corresponds to that in SEQ ID NO. 116 amino acid sequence given is at least 82% and increasingly preferably 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 and 100% identical; in connection with a nucleic acid (pstS) coding for a phosphate binding protein (PstS) with a nucleotide sequence which corresponds to the one in SEQ ID NO.
  • nucleotide sequence at least 84% and increasingly preferred to 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 and 100% is identical, in particular over the partial area which corresponds to nucleotide positions 201 to 1118 according to SEQ ID NO. 115 corresponds.
  • Phosphoribosylaminoimidazole succinocarboxamide synthetase (PurC; E.C. 6.3.2.6) with an amino acid sequence that corresponds to that in SEQ ID NO. 118 amino acid sequence given is at least 90% and increasingly preferably 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 and 100% identical; in connection with a nucleic acid (purC) coding for a phosphoribosylaminoimidazole succinocarboxamide synthetase (PurC; E.C. 6.3.2.6) with a nucleotide sequence which corresponds to that in SEQ ID NO.
  • 117 specified nucleotide sequence is at least 89% and increasingly preferably 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 and 100% identical, in particular over the partial area which corresponds to nucleotide positions 201 to 917 according to SEQ ID NO. 117 corresponds.
  • Phosphoribosylglycinamide formyl transferase (PurN; E.C. 2.1.2.2) with an amino acid sequence that corresponds to that in SEQ ID NO. 120 indicated amino acid sequence at least to 76% and increasingly preferably to 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 , 97, 98, 99 and 100% are identical; in connection with a nucleic acid ⁇ purN) coding for a phosphoribosylglycinamide formyl transferase (PurN; E.C.
  • nucleotide sequence which corresponds to that in SEQ ID NO. 119 specified nucleotide sequence is at least 84% and increasingly preferably 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 and 100% identical, in particular over the partial area which corresponds to nucleotide positions 201 to 788 according to SEQ ID NO. 119 corresponds.
  • - uracil permease with an amino acid sequence that corresponds to that in SEQ ID NO. 122 amino acid sequence given at least 69% and increasingly preferably to 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 , 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 and 100% is identical; in connection with a nucleic acid (pyrP) coding for a uracil permease (PyrP) with a nucleotide sequence which corresponds to that in SEQ ID NO.
  • 121 specified nucleotide sequence is at least 89% and increasingly preferably 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 and 100% identical, in particular over the portion that corresponds to nucleotide positions 201 to 1505 according to SEQ ID NO. 121 corresponds.
  • SigB RNA polymerase-specific general (alternative) stress sigma factor
  • 124 amino acid sequence indicated is at least 85% and increasingly preferably 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 and 100% identical; in connection with a nucleic acid (sigB) coding for an RNA polymerase-specific general (alternative) stress sigma factor (SigB) with a nucleotide sequence which corresponds to that in SEQ ID NO. 123 nucleotide sequence specified is at least 98% and increasingly preferably 98.5, 99, 99.5 and 100% identical, in particular over the portion that corresponds to the nucleotide positions 201 to 998 according to SEQ ID NO. 123 corresponds.
  • sigB nucleic acid
  • SigB RNA polymerase-specific general (alternative) stress sigma factor
  • Thioredoxin (TrxA) with an amino acid sequence that corresponds to that in SEQ ID NO. 126 amino acid sequence indicated is at least 98.5% and increasingly preferably 99, 99.5 and 100% identical; in connection with a nucleic acid (trxA) coding for a thioredoxin (TrxA) with a nucleotide sequence which corresponds to that in SEQ ID NO. 125 specified nucleotide sequence is at least 93% and increasingly preferably 94, 95, 96, 97, 98, 99 and 100% identical, in particular over the portion that corresponds to nucleotide positions 201 to 515 according to SEQ ID NO. 125 corresponds.
  • Table 3 shows the surprising observation that the sequences of these genes and proteins despite the high relationship of ß. subtilis and ß. Hcheniformis in most cases are not very identical.
  • Table 3 shows the surprising observation that the sequences of these genes and proteins despite the high relationship of ß. subtilis and ß. Hcheniformis in most cases are not very identical.
  • each of these nucleotide sequences shown in the present application is as a probe on chips for controlling biological processes. Because, as described above, these genes are considered representative to indicate the metabolic situation of an organism, in particular a microorganism used for fermentation. According to the previous statements, smaller regions of these genes, which are advantageously located near the 5 'end, are preferred.
  • the common features of the respective sequences can be used to detect comparable gene products across species boundaries. probes areas different from one another can be used to detect such mRNA next to one another with one and the same chip, for example if one of these genes is expressed in cells of the other species or if the cultures are mixed. This can also be used to detect contamination, for example, with representatives of the other species (or with other microorganisms, for example E. coli using the probes described above). This is particularly important for purity control, for example during fermentation.
  • Another possible technical application is the targeted inactivation of the genes in question, for example via homologous recombination, in strains which are used for the synthesis of other compounds or in which the genes in question are to be specifically switched off in order to produce a homologous gene, for example for a more active product to provide trans.
  • the respective enzymes specified under the even numbers of the sequence listing are capable of the specific biochemical reactions which correspond to their role in the respective metabolic pathway. Accordingly, they can be used to perform comparable reactions in vitro. Enzymes are increasingly being used as catalysts, especially for the synthesis of natural products such as vitamins, antibiotics or medicines. Compared to conventional processes, they are characterized in particular by mostly lower temperatures, good environmental compatibility and high regioselectivity.
  • the enzymes used for this purpose can advantageously be obtained from the associated DNA sequences specified in the sequence listing under the odd numbers by the genes in question being known from ⁇ in a manner known per se.
  • Hcheniformis DSM 13 or comparable strains can be isolated or synthesized and introduced into expression vectors.
  • Another option is to use the to have the chemical reaction of interest catalyzed by microorganisms which have obtained the activities in question in this way.
  • This strain contains the plasmid pKK177glucC with the gene of ⁇ -glucosidase, the expression of which by fac promoter and the addition of isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG) is induced, and this strain also carries the plasmid pUBS520, which constitutively expresses a minor arglI iRNA (Brinkmann et al., 1989).
  • the cultivation was carried out as fed-batch fermentation in a 6 l Biostat ED fermentor (B. Braun Biotech. Int., Melsungen). All fermentations took place in a glucose-ammonium-based mineral salt medium at a temperature of 35 ° C as in Teich et al. (1998; J. Biotechnol., Vol. 8, pp. 197-210). Induction was carried out by adding 1 mM IPTG.
  • RNA probes were synthesized in vitro with the T7 RNA polymerase from a PCR product that contained a T7 promoter sequence.
  • the following primers were used for the synthesis of the corresponding PCR products:
  • the hybridization signals on the filter were quantified using the Lumi imager from Röche Diagnostics (FIG. 1).
  • both ibpB and dnaK are maximally expressed. Both chaperones are obviously needed at this point. Conversely, both genes can be regarded as markers for this special physiological state of E. coli.
  • PCR primers for this analysis should have properties similar to one another (GC content, melting point, etc.).
  • the size of the corresponding PCR product should be between 300 and 750 bp (optimal: 500 bp).
  • the computer program "Primer 3" was used to derive the primer sequences. This program is available at http: // www- genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi, or http: // www- genome.
  • the strain used for this experiment is Bacillus subtilis 168.
  • the cells were cultured in minimal medium (Stülke et al., 1993; J. Gen. Microbiol., Vol. 139, pp. 2041-2045).
  • the main culture was inoculated with an overnight culture so that an initial OD S4 o n m of 0.05 was reached.
  • the culture was incubated in a small fermenter (500 ml working volume) at 37 ° C.
  • the first sampling for the RNA analysis took place at an OD of 0.4 (corresponds to zero sample in the exponential growth phase, or before the stress).
  • the second sample for RNA isolation was carried out 30 min, 1 h and 2 h after the transition to the stationary growth phase.
  • the cells were disrupted with the RiboLyser (ThermoLifeSciences) by mechanical destruction of the cells by the glass beads in the reaction vessel (glass beads 0.1-0.11 mm 0, B. Braun Biotech) caused by the rotary movements of the RiboLysers.
  • the RiboLyser ThermoLifeSciences
  • acidic phenol is added to the reaction mixture.
  • the reaction vessels are placed on ice to allow them to cool somewhat.
  • RNA isolation and purification were carried out using the KingFisher (ThermoLifeSciences).
  • the KingFisher is an automatic pipetting machine. Biological substances bound to magnetic particles are transferred to various reaction vessels using bar magnets. To isolate the entire RNA from the lysed cells, the KingFisher is used in combination with the MagNA Pure LC RNA Isolation Kit I (Röche Diagnostics). The device is operated at 4 ° C.
  • the acoA gene is maximally expressed in the early stationary phase, that is to say that glucose limitation has occurred in the present example.
  • This gene can therefore be used as a marker gene for this special physiological state of ⁇ . be viewed subtilis, or a probe according to the invention for this gene should be able to indicate this condition.
  • dnaK and grs / ß mRNA amounts of ß Licheniformis ZeWen during a heat shock was performed using Northem blot analysis. For this purpose cells from the strain were ß. Hcheniformis DSM16 cultivated in LB medium at 37 ° C. With a pre-culture in logarithmic growth state, the fermenter culture was inoculated so that an OD was reached 5 oo of about 0.05. At an OD of 0.4, the first sample for RNA isolation was taken. This sample represents the control. The heat stress was carried out at 54 ° C. for 10 minutes. A cell sample for RNA isolation was then taken again.
  • both probes for the heat shock situation give a signal which is higher than that of the control, the cfnaK probe delivering a particularly clear result compared to the control.
  • Example 2 Analogously to example 2, the aco / A mRNA level was examined here in the course of a fermentation, specifically using DNA chips according to the invention and again using rea /./ me-RT-PCR for comparison.
  • the samples containing acoA-mRNA were then quantified in two different ways: (A) as described in Example 2 using a rea / f / me RT-PCR using the LightCycler (from Röche Diagnostics) and (B) using chips according to the invention doped with probes for this gene.
  • This chip was constructed as described in the Hintsche et al. (1997), EXS, 80, pp. 267-283 and the applications WO 00/62048 A2, WO 00/67026 A1 and WO 02/41992 (see above).
  • the DNA probe for the detection of the acoA mRNA was 20 nucleotides long and from an area near the beginning of the coding area according to SEQ ID NO. 1 derived. The result is shown in FIG. 5. The course of the curve in FIG.
  • FIG. 5B which shows the course of the electrical signals obtained in nA and obtained via an electrochip according to the invention, shows in principle the same curve course, in particular the sharp rise in glucose limitation towards the end of the fermentation.
  • the intermediate maximum to be read off in A after 5 h is not apparent from this, but the error bars in FIG. A also allow that there was in fact no maximum here.
  • the main culture was inoculated with an overnight culture so that an initial OD at 540 nm of 0.05 was achieved.
  • the cultures were incubated in 1 liter medium in 5 liter shaking flasks at 37 ° C. and samples were taken at the times indicated in FIG. These were worked up as described in Examples 2 and 4 and the mRNA coding for the alkaline protease AprE was detected both via an RT-PCR light cycler and via an electrical DNA chip according to the invention.
  • the latter was doped with a probe specific for this gene, which was 20 nucleotides long and from a region near the beginning of the coding region of the associated ⁇ . Hcheniformis known gene had been derived.
  • FIG. 6 This gives the cell density, given in optical density at 500 nm (OD ⁇ OOnm), the proportion of specific mRNA determined by the LightCycler in the total RNA, given in molecule cycles per ⁇ g (LightCycler) and the signals of the aprE Probe doped electrical biochips in nA (EBC).
  • the data show that the expression of the aprE gene is detectable after 4 h, ie at the beginning of the stationary phase, and then increases. This observation correlates with the known regulation of the gene by a stationary phase promoter.
  • the cultures were incubated in a 500 ml medium in a fermenter Biostat Q from Braun Biotech International (Melsungen) at 37 ° C. At a time during the exponential growth phase (0 min in Figure 7) 1.5 ⁇ M KH 2 PO 4 were added to the medium. This leads to a state of phosphate deficiency that should affect expression of the pstS gene.
  • samples were taken as described in Examples 2 and 4, processed, and the mRNA coding for the phosphate-binding protein PstS was analyzed using an RT-PCR light cycler and an electrical DNA detector according to the invention. Chip proven. The latter was doped with a probe specific for this gene, which was 20 nucleotides long and from a region near the beginning of the coding region of the one under SEQ ID NO. 115 DNA sequence specified had been derived.
  • FIG. 7 This gives the cell density, given in optical density at 500 nm (OD500nm), the proportion of the specific mRNA determined by the LightCycler in the total RNA, given in molecule cycles per ⁇ g (LightCycler) and the signals determined at three points in time with a ps S probe doped electrical biochips in nA (EBC).
  • the data show a decrease in cell density immediately after the onset of phosphate deficiency and a recovery in bacterial growth after approx. 100 to 150 min. This correlates with the expression of the pstS gene that can be detected in both measurement methods. According to the invention, a correspondingly doped chip can thus be used to detect a phosphate deficiency situation.
  • cells from the strain were ß. Hcheniformis DSM 13 cultured in minimal medium similar to Examples 5 and 6.
  • the main culture was inoculated with an overnight culture so that an initial OD at 540 nm of 0.05 was achieved.
  • the cultures were incubated in a 500 ml medium in a fermenter Biostat Q from Braun Biotech International (Melsungen) at 37 ° C.
  • this medium contained the small amount of 0.05% by weight of glucose, so that a glucose deficiency appeared comparatively early, already during the exponential growth phase, which should affect the expression of the acoA gene.
  • samples were taken as described in Examples 2 and 4, processed, and the mRNA coding for the acetoin dehydrogenase E1 component AcoA was determined both via an RT-PCR light cycler and via an electrical device according to the invention DNA chip detected.
  • the latter was doped with a probe specific for this gene, which was 20 nucleotides long and from a region near the beginning of the coding region of the one under SEQ ID NO. 83 specified DNA sequence had been derived.
  • FIG. 8 This results in the cell density, given in optical density at 500 nm (OD ⁇ OOnm), the proportion of specific mRNA determined by the LightCycler in the total RNA, given in molecule cycles per ⁇ g (LightCycler) and the signals of the pstö determined at three points in time Probe doped electrical biochips in nA (EBC).
  • a chip according to the invention for detecting a fermentation of a production organism of the genus Bacillus established for technical fermentations is doped simultaneously with several probes, specifically for the following genes (Table 5, part 1):
  • these probes are advantageously derived from the sequences cited here and specified in the sequence listing.
  • Example 5 the fermentative production of a protease is followed analogously to Example 5.
  • a corresponding chip is additionally equipped with probes for the following genes (Table 5. Part 2 .:
  • a chip according to the invention is doped with probes for the same genes as specified in Table 5, Part 1.
  • the fermentative production of an amylase is followed analogously to example 8.
  • a corresponding chip is additionally equipped with probes for the following genes (Table 6):
  • Figure 1 ibpB and dnaK as marker genes of the gram-negative bacterium
  • A Expression of the ibpB gene; determined via isolation of the mRNA at the relevant point in time, binding to a nylon membrane and hybridization with an / opß-specific digoxigenin-labeled probe.
  • Figure 2 The gene acoA as a marker gene of the gram-positive bacterium Bacillus subtilis for glucose limitation and presence of acetoin. Determined by Northem blot analysis with an acoA probe (see example).
  • Figure 3 The genes dnaK and sigB as marker genes of the gram-positive bacterium
  • Figure 4 Schematic representation of the at // ' ne monitoring of a bioprocess with electrical DNA chips according to the invention
  • nucleic acids for example DNA
  • nucleic acid analogs for example compounds which are difficult to hydrolyze and have an analog structure
  • RNA preparation was a fed-batch fermentation of ⁇ . subtilis examined for the gene acoA.
  • Figure 6 Monitoring of the product gene apr £ by RT-PCR and with an electrical chip according to the invention during the fermentation of ⁇ . Hcheniformis DSM 13 according to Example 5. Mean:
  • OD500nm cell density
  • LightCycler Share of the specific mRNA determined for six points in time by the LightCycler in the total RNA, given in molecule cycles per ⁇ g;
  • EBC signals of the electrical biochip doped with an aptE probe, measured at two points in time, in measured nA.
  • FIG. 7 Monitoring of the pstS gene indicating phosphate deficiency by means of RT-PCR and with an electrical chip according to the invention during the fermentation of ⁇ .
  • OD500nm cell density
  • LightCycler Share of the specific mRNA determined for five points in time by the LightCycler in the total RNA, given in molecule cycles per ⁇ g;
  • EBC signals of the electrical biochip doped with a ps.S probe determined at three points in time in measured nA.
  • FIG. 8 Monitoring of the gene acoA indicating glucose limitation by means of RT-PCR and with an electrical chip according to the invention during the fermentation of ⁇ .
  • OD500nm cell density
  • LightCycler Share of the specific mRNA determined for five points in time by the LightCycler in the total RNA, given in molecule cycles per ⁇ g;
  • EBC signals of the electrical biochip doped with an acoA probe, measured at three points in time, in measured nA.

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Abstract

Die vorliegende Anmeldung betrifft folgende Auswahl prozesskritischer Gene, die dazu geeignet sind, den Verlauf von Bioprozessen zu überwachen: acoA, ahpC, ahpF, citB, clpC, clpP, codY, cspA, cspB, des, dnaK, eno, glnR, groEL, groL, gsiB, ibpA, ibpB, katA, katE, IctP, Idh, opuAB, phoA, phoD, pstS, purC, purN, pyrB, pyrP, sigB, tnrA, trxA und ydjF, beziehungsweise für im betrachteten Organismus gleich regulierte Gene aus den jeweils durch diese Gene gekennzeichneten Stoffwechselwegen. Die Anmeldung betrifft Chips, die mit entsprechenden Nukleinsäure- oder Nukleinsäure-Analogon-Sonden dotiert sind, sowie entsprechende Verfahren und Verwendungen. So können beispielsweise Fermentationen zur industriellen Herstellung biologischer Produkte monitoriert werden, insbesondere von gramnegativen Bakterien wie E. coli oder von grampositiven Bakterien wie B. subtilis oder B. licheniformis. Zusätzlich werden die Sequenzen der zugehörigen Gene und Proteine aus E. coli, B. subtilis, und B. licheniformis offenbart, die aus B. licheniformis erstmals. Diese Gene und Proteine aus B. licheniformis werden somit in den Schutzbereich einbezogen.

Description

DNA-Chips zur Bioprozeßkontrolle
Die vorliegende Erfindung betrifft mit Nukleinsäure-Sonden dotierte Chips, die dazu geeignet sind, den Verlauf von Bioprozessen zu überwachen, sowie die Verwendung entsprechender Sonden auf solchen Chips, beziehungsweise Verfahren und Verwendungsmöglichkeiten, die auf derartigen Chips beruhen, und hierfür geeignete Gene.
Bei der technischen Nutzung biologischer Prozesse stellt sich das sehr grundlegende Problem, deren Verlauf zu überwachen, um zum gewünschten Ergebnis zu gelangen, um Ressourcen zu schonen und/oder um in einer gegebenen Zeit ein optimales Ergebnis zu erzielen. Unter biologischen Prozessen sind beispielsweise die Kultur von Mikroorganismen auf einer Agarplatte oder in Schüttelkultur zu verstehen, insbesondere aber deren Fermentation, beziehungsweise die Gewinnung von Rohstoffen über die Fermentation von Mikroorganismen. Hierzu gibt es einen reichhaltigen Stand der Technik, sowohl was einzellige Eukaryonten wie Hefen oder Streptomyceten, als auch was gramnegative oder grampositive Bakterien angeht.
Die Überwachung derartiger Prozesse geschieht einerseits durch die Beobachtung der sich im Laufe des Prozesses wandelnden Eigenschaften und Anforderungen der betrachteten Organismen, was sich beispielsweise in der optischen Dichte und Viskosität des Mediums, in aufgenommenen oder abgegebenen Gasen, in Änderungen des pH- Werts oder sich wandelnden Nährstoffbedürfnissen niederschlägt. Hierzu kann man auch die Messung enzymatischer Aktivitäten über geeignete Assays rechnen, beispielsweise den Nachweis interessierender Aktivtäten im Kulturüberstand.
Andererseits sind in den letzten Jahren verschiedene Techniken entwickelt worden, um die Stoffwechselprozesse der betreffenden Organismen auf der Ebene der Genexpression zu verfolgen. Eine gängige Methode hierfür ist die Verwendung von Genen für leicht nachzuweisende Proteine als Indikatoren für die Aktivität der Promotoren für die eigentlich interessierenden Gene (Promotor-Analyse, Genexpressions-Analyse). Hierfür sind auch entsprechende Apparaturen (sogenannte (Bio-)Sensoren) entwickelt worden, um ein möglichst zeitnahes Ergebnis zu erhalten. Einen Überblick über die Anwendung der Sensor-Technologie auf biologische Fragen bietet beispielsweise der Aufsatz „Biosensor Microsystems" von G.Urban (2001) in Sensors Update, 8, S. 189- 214.
Beispielsweise in der Arbeit „On-Iine monitoring of gene expression" (I.Biran et al., 1999, Microbiology, 145, S. 2129-2133) wird ein elektrochemischer Sensor zur On-line-Analyse von E. co//-Kulturen beschrieben. Demnach kann das /acZ-Gen unter die Kontrolle des Promotors des RpoS-abhängigen Gens osmY gebracht werden, welches bei Übergang einer Kultur in die stationäre Wachstumsphase exprimiert wird. Die hiervon abgeleitete, im Kulturmedium auftretende ß-Galactosidase-Aktivität kann über einen elektrochemischen Sensor ermittelt werden. Das hierüber erhaltene Signal zeigt somit das Ende der exponentiellen Wachstumsphase der betreffenden Kultur an.
Andere Techniken befassen sich mit dem Nachweis der interessierenden mRNA, beziehungsweise der abgeleiteten Proteine selbst. Hierzu gehören (1.) die Proteom- Analyse, das heißt die Betrachtung der Veränderung der Ausstattung der betreffenden Zellen mit Proteinen, welche zumeist über 2-dimensionale Gelelektrophorese der Zellysate erfolgt, (2.) die Analyse der gebildeten mRNA (Transkriptom) über ein in analoger Weise erstelltes „genomisches DNA-Array" und (3.) die Chip-Technologie.
Letztere befindet sich in einem vergleichsweise frühen Entwicklungsstadium. Während die beiden zuerst genannten Methoden letzlich auf quantitativen Isolierungen und zeitaufwendingen Analysen der betreffenden Makromoleküle beruhen, liegt der Chip- Technologie das Prinzip zugrunde, auf physikalisch auslesbaren Trägem (Chips) Sonden für Proteine oder für Nukleinsäuren anzubringen, die unmittelbar auf das Vorhandensein der betreffenden Proteine, beziehungsweise Nukleinsäuren ansprechen. Gegenüber den beiden zuerst genannten Technologien verspricht man sich von derartigen Chips eine zum betrachteten Prozeß zeitnahe Analyse (At line-Analyse). Ein weiterer Vorteil ist der Bedarf an vergleichsweise kleinen Probenmengen.
Das Prinzip von Chip-basierten Messungen wird beispielsweise in dem Artikel „Real-time electrochemical monitoring: toward green analytical chemistry" von J. Wang (Acc. Chem. Res.; ISSN 0001-4842; Rec. Sept. 12, 2001 , S. A-F) schematisch in Figur 2 vorgestellt. Demnach wird die zu analysierende Probe mit einer Erkennungsschicht (biorecognition layer) in Kontakt gebracht, bei der es sich beispielsweise um Enzym, Antikörper, Rezeptor oder DNA handeln kann; das hierüber empfangene Signal wird über einen Umwandler (Transducer), beispielsweise eine amperometrische oder potentiometrische Elektrode, über einen Verstärker (amplification/processing) als elektrische Spannung oder als elektrisches Potential ausgegeben. In der betreffenden Arbeit werden auch optische Systeme angesprochen, denen gegenüber die elektronisch auswertbaren Systeme hinsichtlich der Miniaturisierbarkeit und anderer Vorteile dem Autor günstiger erschienen.
Der Stand der Technik ist bezüglich des Aufbaus und der Funktionsweise derartiger Chips also breit aufgefächert: grundsätzlich wird zwischen Protein-bindenden und Nukleinsäuren, das heißt insbesondere mRNA erkennenden Chips unterschieden. Aufgrund der vorliegenden Erfindung können die Protein-spezifischen außer Betracht bleiben. mRNA erkennende Chips sind i.d.R. mit komplementären DNA-Molekülen dotiert. Unter den DNA-Chip-Analysen gibt es solche mit einer PCR-Amplifikation der Zielsequenz und solche ohne Amplifikation. Ferner gibt es solche mit optischer Auswertung der auf die Erkennung zurückzuführenden Signale und solche mit elektrischer Auswertung.
Die optischen Detektionsmethoden erfordern zum Teil einen Verstärkungsmechanismus der Signale. Hierfür werden zum Beispiel Fluorophore, Acridiniumester oder eine indirekte Detektion über sekundäre Bindungsvorgänge, zum Beispiel über Biotin, Avidin/Streptavidin oder Digoxigenin beschrieben. Im letzteren Falle werden zum optischen Nachweis Digoxigenin-spezifische Antikörper eingesetzt, die mit einem Enzym markiert werden. Dabei wird die Enzymaktivität entweder kolorimetrisch oder über Lumineszenz nachgewiesen. Nach Westin et al. (2000), Nature Biotechnol., 18, S. 199- 204, kann die Hybridisierung mit einer PCR auf dem DNA-Chip gekoppelt werden, um so die gesamte Nachweisreaktion auf einem Chip durchführen zu können („Lab-on-a-Chip- Konzept").
Weitere Arbeiten beschrieben die Entwicklung von DNA-Chips, die das Prinzip der Kapillarelektrophorese zur DNA-Sequenzierung, beziehungsweise Trennung miniaturisieren (Woolley und Mathies (1994), Proc. Natl. Acad. Sei., 91, S. 11348-11352; Liu et al. (2000), Proc. Natl. Acad. Sei., 97, S. 5369-5374).
Elektrisch auslesbare DNA-Chips sind in einigen Publikationen prinzipiell bereits vorgestellt worden (Hoheisel (1999), DECHEMA Jahresbericht 1999., S. 8-11; Hintsche et al. (1997), EXS, 80, S. 267-283). Wright et al. (2000; Anal. Biochem., 282, S. 70-79) nutzten einen „lon-Channel-Sensor" (ICS) zur DNA-Detektion, wie er erstmalig von Cornell et al. (1997; Nature, 387, S. 580-583) beschrieben wurde. Dabei handelt es sich um ein Verfahren, bei dem die Leitfähigkeit molekularer lonenkanäle durch eine Bindungsreaktion detektiert wird. Im wesentlichen stellt der Sensor ein Impedanz- Element dar. Cheng et al. (1998; Nat. Biotechnol., 16, S. 541-546) zufolge können elektrische Impulse zu einer Verstärkung der Hybridisierungsreaktion auf optischen DNA-Chips genutzt werden. Fritsche et al. (2002; Laborwelt II) schlugen ein elektrisches Chip-System vor, das mit metallischen Nanopartikeln arbeitet, die zum Beispiel an Oligonukleotide gebunden sind. Bei diesem System wird durch eine sogenannte „metallische Verstärkung" während der Hybridisierungsreaktion ein Abfall des elektrischen Widerstandes an der Elektrode ausgelöst, der dann als Signal meßbar ist.
Ein weiterer Ansatz basiert auf einem elektrischen Detektionsprinzip, in dem DNA- Sonden verwendet werden, die durch die Markierung mit einem geeigneten Enzym (zum Beispiel alkalische Phosphatase) nach der Hybridisierung zu einem elektrisch aktiven Substrat führen, das dann durch eine Redox-Reaktion an der Elektrode detektierbar ist (Hintsche et al. (1997), EXS, 80, S. 267-283).
Wenn man sich dazu entscheidet, einen bestimmten Chip-Typus, beispielsweise einen auf Nukleinsäuren ansprechenden Chip zur Überwachung von Bioprozessen einzusetzen, so stellt sich das konkretere Problem, welche Genaktivitäten beobachtet werden sollen. Für die Anfertigung und den Gebrauch des entsprechend hergestellten Chips kann dann wieder auf den Stand der Technik zurückgegriffen werden.
In der Zahl der mit einem Nukleinsäure-Chip gleichzeitig analysierbaren Gene bestehen technisch bedingte Grenzen. So sind optisch auslesbare Chips, was die Zahl der Sonden, die auf dem Chip aufgebracht werden können, den elektrisch auswertbaren derzeit überlegen. Deren Grenzen werden durch die Miniaturisierbarkeit der elektronischen Meßeinheiten gesetzt. Es stellt sich somit das biologische Problem, welche Genaktivitäten den betrachteten Prozeß, abbilden. Hierzu gehört auch die Überwachung der Produktbildung, wenn es sich beispielsweise um eine fermentative Produktherstellung handelt. Gleichzeitig sollten aber auch Kontrollgene eingeschlossen werden, die anzeigen, wenn der Prozeß sich in eine Richtung entwickelt, die nicht beabsichtigt ist. Im Zuge dieses Monitoring sollte aus Praktikabilitätsgründen einerseits eine nicht zu hohe Zahl an verschiedenen Genen beobachtet werden. Andererseits ist die Erfassung eines breiten Spektrums an Genaktivitäten mit ein und demselben Chip wünschenswert, beispielsweise um eine Vielzahl von möglichen Szenarien zu erkennen, beispielsweise aber auch wenn parallel mehrere Organismenstämme beobachtet oder derselbe Wirt zur Bildung verschiedener Produkte genutzt werden soll, damit nicht jedesmal ein neuer Chip entwickelt werden muß.
Von besonderem technischen Interesse sind biotechnologische Prozesse mit grampositiven Bakterien. Denn diese werden besonders aufgrund ihrer Fähigkeit zur Sekretion zur industriellen Herstellung von Wertstoffen eingesetzt. Hierunter haben solche der Gattung Bacillus und hierunter, wiederum, die Spezies B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. agaradherens, B. Hcheniformis, B. lentus und B. globigii derzeit die wirtschaftlich größte Bedeutung.
Mit der simultanen Beobachtung der Aktivität mehrerer Gene in Bakterien (multiparametrische Erfassung) befassen sich beispielsweise die im folgenden vorgestellten und anschließend in Tabelle 1 zusammengefaßten Arbeiten.
In dem Artikel „Monitoring of genes that respond to process-related stress in large-scale bioprocesses" von Schweder et al. (1999), Biotech. Bioeng., 65, S. 151-159, wird die Veränderung der mRNA-Spiegel verschiedener durch Streß-Faktoren induzierbarer Gene, nämlich clpB, dnaK (induziert bei Hitzeschock), uspA (Glucose-Mangel), proil (osmotischer Streß), p/7 und traf (O2-Mangel) und ackA (Glucose-Überschuß) im Verlauf einer Fermentation von E. coli und in der nachfolgenden Konzentrierungsphase beschrieben. Sie wurden über eine PCR-basierte, auf herkömmliche Weise durchgeführte Methode erfaßt. Hierbei wurden unterschiedliche Expressionsraten bereits an verschiedenen Stellen des Reaktors und sekundenschnelle Reaktionen auf veränderte Bedingungen festgestellt. Die Gene proU und ackA waren während des Wachstums sehr aktiv, bei Glucose-Mangel aber deutlich weniger. Die Gene clpB, dnaK, p/7 und frd blieben dagegen während des Wachstums konstant und zeigten bei Glucose- Überschuß und (damit verbunden) bei O2-Mangel eine erhöhte Expression. uspA blieb sowohl bei Wachstum als auch bei Glucose-Mangel vergleichsweise konstant. Ausgangspunkt dieser Arbeit war die Überlegung, die genannten Gene als Indikatoren für das Monitoring eines Bioprozesses einzusetzen; für uspA, zumindest, wurde diese Hoffnung jedoch enttäuscht.
Eine weitere Fermentation von E. coli wird in der Arbeit „Monitoring of genes that respond to overproduction of an insoluble recombinant protein in Eschenchia coli glucose-limited fed-batch fermentations" von Jürgen et al. (2000), Biotech. Bioeng., 70, S. 217-224, beschrieben. Hierin wird die Expression der Gene Ion, dnaK, ibpB, htrA, ppiB, groEL, tig, s6, 19 und dps, teilweise auf mRNA-, teilweise auf Proteinebene, teilweise auf beiden Ebenen betrachtet. Dabei erfolgte die Untersuchung über 2D-PAGE, beziehungsweise die DNA-array-Technik. Angesichts der Ergebnisse, die in der vorliegenden Anmeldung in Tabelle 1 zusammengestellt sind, wird vorgeschlagen, rekombinante Bioprozesse wie die heterologe Protein-Herstellung über (unmittelbar) Prozeß-relevante Proteine und Reporter-Gene wie ibpB zu verfolgen.
Mit einer weiteren Beobachtung des Fermentationsverlaufs bei Expression eines rekombinanten Proteins durch £. coli befaßt sich die Arbeit „Genomic analysis of high- cell-density recombinant Eschenchia coli fermentation and "cell conditioning" for improved recombinant protein yield" von R.T.Gill et al. (2001; Biotech. Bioeng., 72, S. 85- 95). Hierin wird beschrieben, daß die Streß-Gene degP, uvrB, alpA, mltB, recA, ftsH, ibpA, aceA und groEL unter den genannten Bedingungen bei hoher Zelldichte gegenüber niedriger Zelldichte verstärkt exprimiert werden. Der Stärke der Reaktion nach gruppierten sie sich untereinander zu gewissen Clustem. Dies wurde über einen auf RT-PCR und DNA-Microarray beruhenden und durch Dot-blot-Analyse ergänzten Ansatz ermittelt, der auf Proben von zwei Zeitpunkten der Fermentation angewendet wurde, eben zu Beginn bei niedriger Zelldichte und gegen Ende bei hoher Zelldichte. Hieraus wurden „Cell Conditioning'-Ansätze entwickelt, um die Streß-Antwort der Zellen herabzusetzen.
Grundsätzliche Unterschiede in den Expressionsmustern grampositiver Organismen gegenüber denen von gramnegativen Bakterien werden mit der Arbeit „Proteome and transcriptome based analysis of Bacillus subtilis cells overproducing an insoluble heterologous protein" von Jürgen et al. (2001), Appl. Microbiol. Biotechnol., 55, S. 326- 332 aufgedeckt. Darin wird die Expression u.a. der Gene dnaK, groEL, grpE, clpP, clpC, clpX, rpsB und rplJ in B. subtilis beschrieben, wie sie über die DNA-macro-array- Technik, beziehungsweise über zweidimensionale Polyacrylgelelektrophorese ermittelt werden können. Hiernach werden in grampositiven zur Überexpression eingesetzten Bakterien die Gene für die Purin- und die Pyrimidin-Synthese sowie die bestimmter ribosomaler Proteine stärker exprimiert, als aufgrund der Erkenntnisse an gramnegativen Bakterien zu erwarten war. Ein weiterer Unterschied betrifft die Proteasen Lon und Clp.
Tab. 1 : Gene, deren Expressionsänderung bei Fermentationen in den genannten
Dokumenten beschrieben worden ist Abk.: Glc: Glucose; σ: jeweiliger Transkriptionsfaktor gram-negativer Bakterien;
+: erhöhtes mRNA-Niveau; -: verringertes mRNA-Niveau; Es ist jeweils vermerkt, wenn nur auf verändertes Protein-Niveau getestet worden ist.
Prinzipiell könnten alle diese Gene im Verlaufe eines biologischen Prozesses wie der Bakterienkultur oder der Fermentation beobachtet werden und gäben damit jeweils eine ganz spezielle Aussage über den jeweiligen physiologischen Aspekt der betreffenden Kultur. Prinzipiell könnten damit alle dazu genutzt werden, um einen solchen Prozeß zu überwachen. Andererseits stellt sich angesichts des Aufwands die Frage, auf welche dieser Indikator-Gene ein entsprechendes Monitoring eingeschränkt werden kann, ohne daß wesentliche Aspekte übersehen werden. Denn je weniger Gene beobachtet werden müssen, desto einfacher sind die betreffenden Sensoren herstellbar und desto geringer wird der technische Aufwand für das gewählte Detektionssystem.
Einzelne dieser Gene oder sogar Chips mit einzelnen dieser Gene werden inzwischen in mehreren Publikationen offenbart oder zumindest die Möglichkeit ihrer Herstellung aufgezeigt. So offenbaren beispielsweise die beiden Patentanmeldungen DE 10136987 A1 und DE 10108841 A1 jeweils ein Gen aus Corynebacterium glutamicum, nämlich clpC beziehungsweise citB. Beide Gene werden als relevant für den Aminosäure-Stoffwechsel beschrieben, weshalb eine kommerziell interessante Nutzung dieser Gene darin bestehen soll, sie zu inaktivieren oder zumindest abzuschwächen, um die fermentative Herstellung von Aminosäuren durch diesen Mikroorganismus zu optimieren. Weitere Anwendungsmöglichkeiten können nach diesen Anmeldungen darin bestehen, Sonden für die betreffenden Gen-Produkte auf Nukleinsäure-bindenden Chips vorzulegen.
Auf der anderen Seite werden zunehmend mehr Genomdaten verschiedener Organismen publiziert, die eine solche Fülle von Sequenzdaten enthalten, daß hieraus eine repräsentative Auswahl wünschenswert erscheint. So offenbart die Patentanmeldung WO 02/055655 A2 mehr als 1.800 DNA-Sequenzen, die durch die vollständige Sequenzierung des Genoms des Mikroorganismus Methylococcus capsulatus ermittelt worden sind. Hierunter befindet sich eines aus dem Lipid-Stoffwechsel, nämlich eno, welches neben auch im Rahmen der vorliegenden Patentanmeldung von Interesse ist, auf Grund dieser Anmeldung allein aber nicht in Betracht gezogen worden wäre.
Während also praktisch alle diese Gene jeweils für sich oder in Gruppen im Stand der Technik charakterisiert und teilweise als Indikatoren für den physiologischen Zustand der betreffenden Zellen diskutiert worden sind, geht die für die vorliegende Erfindung getroffene Auswahl an Genen für eine Kontrolle biologischer Prozesse, insbesondere Fermentationen von grampositiven Bakterien nicht aus dem Stand der Technik hervor.
Es stellte sich somit die Aufgabe, Gene zu identifizieren, vorzugsweise einen repräsentativen Querschnitt von Genen zu identifizieren, die geeignet sind, um über Änderungen von Stoffwechselaktivitäten anzuzeigen, wie ein beobachteter Bioprozeß verläuft. Insbesondere sollte hier auf Fermentationen, besonders solche Fermentationen geachtet werden, die der Herstellung von biologischen Wertstoffen dienen. Dementsprechend sollten solche physiologischen Zustände erkennbar werden, die anzeigen, daß die betreffenden Zellen den Weg des optimalen Wachstumsverlaufs verlassen. Hierzu gehören beispielsweise Hungerzustände gegenüber verschiedenen Nährstoffen oder Streßsituationen wie beispielsweise Hitze- oder Kälteschock, Scherstreß, oxidativer Streß oder Sauerstofflimitation.
Ziel war es, Sonden für diese Gene zu entwickeln, um sie für die Überwachung (Monitoring) entsprechender Bioprozesse einsetzen zu können.
Eine weitere Aufgabe bestand darin, einen mit Sonden auf eine repräsentative Auswahl von Markergenen dotierten Sensor zu entwickeln, der geeignet ist, bei der Überwachung eines auf Mikroorganismen, insbesondere grampositiven oder gramnegativen Bakterien beruhenden Bioprozesses Änderungen der diesen Prozeß kennzeichnenden Stoffwechselaktivitäten schneller als nach herkömmlichen, insbesondere auf Gelelektrophoresen beruhende Methoden anzuzeigen. Hiermit sollte sich der Vorteil ergeben, mit möglichst kurzer Zeitverzögerung in den betreffenden Prozeß eingreifen zu können. Denn durch die Möglichkeit zu zeitnahen Regulationen sollte sich ein Bioprozeß effizienter durchführen lassen.
Solch ein Sensor sollte für mehrere miteinander vergleichbare Prozesse einsetzbar und mit vergleichsweise geringfügigen Variationen an spezifische Einsatzmöglichkeiten anzupassen sein. Vorzugsweise sollte er auf Bioprozesse auf der Grundlage von ßac///t/s-Spezies, insbesondere B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. lentus, B globigii, und ganz besonders auf B. Hcheniformis ausgerichtet sein. Unter Bioprozessen standen Fermentationen, insbesondere die technische Herstellung von Produkten, ganz besonders von überexprimierten Proteinen im Vordergrund. Ferner sollte solch ein Sensor entsprechende Verfahren zur Messung des physiologischen Zustands der betrachteten Zellen sowie entsprechende Verwendungsmöglichkeiten zur Überwachung der betrachteten biologischen Prozesse ermöglichen.
Der erste Teil dieser Aufgabe wird durch Identifizierung der folgenen Gene gelöst: acoA, ahpC, ahpF, citB, clpC, clpP, codY, cspA, cspB, des, dnaK, eno, glnR, groEL, groL, gsiB, ibpA, ibpB, katA, katE, IctP, Idh, opuAB, phoA, phoD, pstS, purC, purN, pyrB, pyrP, sigB, tnrA, trxA und ydyF.
Die weitergefaßte Aufgabe wird durch einen Chip gelöst, der mit Nukleinsäure- oder Nukleinsäure-Analogon-Sonden für mindestens vier der folgenden Gene: acoA, ahpC, ahpF, citB, clpC, clpP, codY, cspA, cspB, des, dnaK, eno, glnR, groEL, groL, gsiB, ibpA, ibpB, katA, katE, IctP, Idh, opuAB, phoA, phoD, pstS, purC, purN, pyrB, pyrP, sigB, tnrA, trxA und ydjF, beziehungsweise für im betrachteten Organismus gleich regulierte Gene aus den jeweils durch diese Gene gekennzeichneten Stoffwechselwegen dotiert ist.
Je nach zu beobachtendem Prozeß können Sonden für weitere Gene beziehungsweise Genprodukte enthalten sein.
Die erfindungsgemäß zur Bioprozeßkontrolle einsetzbaren Gene werden zusammen mit den Funktionen der jeweils abgeleiteten Proteine und dem physiologischen Signal, für welches sie stehen, in folgender Tabelle 2 zusammengestellt, sofern letzteres aus der Funktion nicht eindeutig ersichtlich ist. Zusammenfassend handelt es sich um Gene, deren Genprodukte in folgenden Stoffwechselzusammenhängen aktiv werden: Zellwandsynthese, DNA-Replikation, Membrantransportmechanismen C-Metabolismus (Kohlenstoff haushält), Citratcyclus (Tricarbonsäurezyklus; TCA), Atmungskette, N- Metabolismus (Stickstoff haushält), P-Metabolismus (Phophathaushalt),
Aminosäuresynthese, Purin-, und Pyrimidinsynthese, Translation, einschließlich ribosomaler Gene, Sekretion, Anaerobiosis und Sporulation, sofern die betreffenden Organismen dazu in der Lage sind.
Zusätzlich wird in Tabelle 2 auf die zugehörigen DNA- und Aminosäuresequenzen verwiesen, die beispielsweise aus Bacillus subtilis, Eschenchia coli und/oder B. Hcheniformis erhalten werden können und dieser Tabelle entsprechend im Sequenzprotokoll zur vorliegenden Anmeldung unter den Nummern SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID NO. 126 angegeben sind.
Tab. 2: Erfindungsgemäß zur Bioprozeßkontrolle einsetzbare Gene, die
Funktionen der jeweils abgeleiteten Proteine und die damit verbundenen Signale und Verweis auf die aus den entsprechenden Organismen identifizierten Sequenzen, wie sie im Sequenzprotokoll zur vorliegenden Anmeldung angegeben sind.
Im Sequenzprotokoll umfassen die betreffenden DNA-Sequenzen Geweils ungeradzahlig), die für das jeweilige Protein codierenden Bereiche sowie jeweils ca. 200 bp stromauf- und stromabwärts davon, ungeachtet dessen, ob diese Bereiche die jeweils vollständigen nichtcodierenden Bereiche des Gens erfassen oder in Bereiche hineinragen, die bereits die Nachbargene betreffen. Bei SEQ ID NO. 93 (clpP aus ß Hcheniformis) ist nur ein Teil des Gens angegeben; Vergleich mit der entsprechenden Sequenz von ß. subtilis (SEQ ID iO. 11) läßt vermuten, daß am 5'-Ende ca. 48 bp und damit 16 Aminosäuren fehlen. Bei SEQ ID NO. 101 (dnaK aus ß Hcheniformis) ist nur der codierende Bereich angegeben. Bei SEQ ID NO. 101 bestehen zudem gewisse Unsicherheiten in sieben Positionen gegen Ende des Gens, die im Sequenzprotokoll mit „n" bezeichnet werden. Sie finden sich auf Aminosäure-Ebene als Eintrag „Xaa" für die sieben Positionen 481 , 494, 495, 496, 499, 509 und 557 gemäß SEQ ID NO. 102 wieder. Dies würde sich ändern, falls sich in Zukunft ergeben sollte, daß eine dieser Positionen (etwa 1480) Teil eines Stop-Codons wäre; dann lägen die nachfolgenden Unsicherheiten bereits im 3'-nichtcodierenden Bereich. Dies wirkt sich in jedem Fall jedoch nur in geringem Maße auf die vorliegende Erfindung aus, da wie unten erläutert eher nahe dem δ'-Ende gelegene Bereiche zur Herstellung von Sonden bevorzugt sind.
Die geradzahligen Sequenz-Nummern stehen jeweils für die abgeleiteten Aminosäuresequenzen. Sie dienen beispielsweise über Sequenzdatenbank-Vergleiche der Überprüfung der Genfunktion und können möglicherweise dazu dienen, um etwa über Rückübersetzung des genetischen Codes ähnliche Nukleinsäuren erkennende Sonden zu generieren. All diese Gene sind jeweils für sich im Stand der Technik beschrieben. Sie können für die verschiedenen Organismen aus allgemein zugänglichen Datenbanken entnommen werden. Dies trifft insbesondere auf die gut charakterisierten Spezies ß. subtilis und £. coli zu, die allgemein als Modellorganismen der grampositiven, beziehungsweise gramnegativen Bakterien angesehen werden. Die beispielsweise im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen wurden aus den Datenbanken des Institut Pasteur, 25,28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX 15, Frankreich, entnommen, welche über die Internet-Adressen http://genolist.pasteur.fr/Colibri/ (für E. coli), beziehungsweise http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/ (für ß. subtilis) zugänglich sind (Stand: 16.8.2002). Weitere hierfür geeignete Datenbanken sind die des EMBL-European Bioinformatics Institute (EBI) in Cambridge, Großbritannien (http://www.ebi.ac.uk), Swiss-Prot (Geneva Bioinformatics (GeneBio) S.A., Genf, Schweiz; http://www.genebio.com/sprot.html) oder GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).
Die genannten Gene kennzeichnen bei den betrachteten Organismen bestimmte Stoffwechselwege. Dem Fachmann sind an sich aus den meisten dieser Wege weitere gleich regulierte Gene bekannt, die deshalb in den Schutzbereich der vorliegenden Anmeldung einbezogen werden.
Insbesondere bei Bakterien kann die gleiche Regulation von einem Fachmann auf einfache Weise überprüft werden: Denn Bakterien bilden von den Genen, die in einem Operon hintereinanderliegen und über denselben Promotor reguliert werden, eine zusammenhängende mRNA (polycistronische mRNA). Diese hybridisiert mit allen Sonden gegen jedes der auf dieser mRNA abgebildeten Gene. Bei Eukaryonten können gleich regulierte Gene auf eine andere Weise identifiziert werden: Hierzu müssen nach an sich bekannten Methoden die Promotoren identifiziert werden, welche die Expression der betreffenden Gene regulieren. Hierbei sind gleich regulierte Gene daran zu erkennen, daß ihnen die gleichen Promotoren vorangestellt sind.
Insofern bezeichnet der Ausdruck „im betrachteten Organismus gleich regulierte Gene" bei Eukaryonten solche Gene, die im betrachteten Organismus von denselben Promotoren reguliert werden, und bei Bakterien solche Gene, die in diesem Bakterium zusammen mit den hier bezeichneten Genen auf einer polycistronischen mRNA liegen. Eine Sonde ist erfindungsgemäß eine chemische Verbindung, die in der Lage ist, über Wasserstoffbrückenbindungen mRNA-Moleküle zu binden, so wie dies beispielsweise auch bei der Wechselwirkung der beiden Stränge einer DNA oder der DNA-RNA- Wechselwirkung erfolgt. Chemisch gesehen handelt es sich dabei beispielsweise um DNA, welche gegenüber Hydrolyse stabiler ist als RNA. Im Stand der Technik sind darüber hinaus weitere Moleküle bekannt, insbesondere chemisch synthetisierte, die biomimetisch dieselbe Wechselwirkung ermöglichen, aber stabiler als DNA sind. Solche Nukleinsäure-Analogon-Sonden kennzeichnen bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Anmeldung.
Als betrachtete Organismen kommen prinzipiell alle Pflanzen, Tiere und Mikroorganismen in Frage. So geht beispielsweise aus der Anmeldung DE 19860313 A1 mit dem Titel „Verfahren zur Erkennung und Charakterisierung von Wirkstoffen gegen Pflanzen-Pathogene" hervor, daß es in Pflanzen, insbesondere Nutzpflanzen Stoffwechselsituationen gibt, die beobachtet werden müssen. Ebenso können beispielsweise Nutztiere oder Labortiere beobachtet werden. Von nicht geringem kommerziellen Interesse sind eukaryontische Zellkulturen, etwa bei der Herstellung monoklonaler Antikörper, und insbesondere die fermentative Herstellung von Lebensmitteln, etwa über die von Hefen betriebene alkoholische Gärung. Bakterien werden insbesondere zur technischen Herstellung von Proteinen oder niedermolekularen Wertstoffen (Biotransformation), etwa von Vitaminen oder Antibiotika genutzt.
In bevorzugten Ausführungsformen sind erfindungsgemäße Chips mit zunehmend bevorzugt mindestens 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 28, 30, 32 oder 34 der genannten Sonden dotiert, um ein möglichst breites Spektrum an Stoffwechselsituationen zu erfassen.
Von den aufgeführten Genen sind die meisten sowohl in grampositiven als auch in gramnegativen Bakterien bekannt. Einzelne dieser Gene sind zum gegenwärtigen Zeitpunkt lediglich aus einzelnen Organismengruppen wie etwa gramnegativen oder grampositiven Bakterien bekannt. Sollten hierzu in Zukunft homologe, das heißt über Hybridisierung erkennbare Vertreter in anderen Gruppen gefunden werden, so werden sie entsprechend in den Anspruchsbereich eingeschlossen. Denn erfindungsgemäß kommt es nicht darauf an, die exakte Nukleotidabfolge zu ermitteln sondern über Hybridisierung ein zutreffendes Signal zu erhalten. So kann beispielsweise das Gen groEL aus einem grampositiven Organismus wie ß. subtilis über homologe Hybridisierung mit einer Sonde für das Gen groL aus E. coli identifiziert werden. Da die zugehörigen Genprodukte in beiden Organismenklassen dieselbe Funktion ausüben, nämlich die eines Chaperons, kann aus der Detektion dieses Signals auf eine Streßsituation des betrachteten Organismus geschlossen werden, bei der eine Vielzahl fehlgefalteter Proteine auftreten. Dieselbe Sonde ist analog auch auf andere Spezies anwendbar, die ein gro -ähnliches Chaperon bilden.
Dies gilt umso mehr für stärker miteinander verwandte Organismen wie beispielsweise ß. subtilis und ß. Hcheniformis. In den Fällen, wo aus einem dieser Organismen oder anderen grampositiven Bakterien die betreffende Sequenz nicht bekannt ist, kann auf die jeweils tatsächlich bekannten zurückgegriffen werden. So sind die Beispiele 8 und 9 insgesamt auf diverse Bacillus-Spezies anwendbar, wobei vom Fachmann erwartet werden darf, daß er von einer bekannten Sequenz nicht nur eine sondern ein paar alternative Sonden herstellt. Er erlangt somit über Vorversuche und vorteilhafterweise im Vergleich zu bekannten Quantifizierungsmethoden (vgl. Beispiele der vorliegenden Anmeldung) Gewißheit über die Nachweisbarkeit des interessierenden Genprodukts.
Es ist beispielsweise auch zu erwarten, daß eine Sonde, die von dem 5'-Ende des Gens clpP aus ß. subtilis (SEQ ID NO. 11) abgeleitet ist, das entsprechendes Genprodukt von ß. Hcheniformis nachzuweisen vermag, dessen zugehörige DNA-Sequenz in SEQ ID NO. 93 nur unvollständig angegeben werden konnte (siehe oben). Allerdings ist letztere, sobald die Sequenz vollständig vorliegt, zu diesem Zweck erfindungsgemäß stärker bevorzugt, weil es mit Sicherheit zur Ableitung einer Sonde mit 100% Sequenzidentität dienen kann.
Andere Gene, die im betrachteten Organismus gleich reguliert sind und auf den jeweils durch diese Gene gekennzeichneten Stoffwechselwegen liegen, können als gleichwertige Indikatoren dienen. So kann die beispielsweise die Wahl der für den Purin- Stoffwechsel charakteristischen Gene purC oder purN in gewisser Hinsicht als willkürlich angesehen werden. In alternativen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden ein oder mehrere andere Gene ausgewählt, die ebenfalls für die Purin-Synthese benötigt werden, sofern sie für dasselbe Signal stehen wie purC und/oder purN. Das gleiche gilt auch für die Gene der übrigen betrachteten Stoffwechselleistungen: Zellwandsynthese, DNA-Replikation, Membrantransportmechanismen C-Metabolismus (Kohlenstoffhaushalt), Citratcyclus (Tricarbonsäurezyklus; TCA), Atmungskette, N- Metabolismus (Stickstoffhaushalt), P-Metabolismus (Phophathaushalt),
Aminosäuresynthese, Pyrimidinsynthese, Translation, einschließlich ribosomaler Gene, Sekretion, Anaerobiosis und ggf. Sporulation.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Chip auf grampositive Bakterien, insbesondere ß. subtilis oder ß. Hcheniformis ausgerichtet. Hierfür empfiehlt es sich, ihn mit Sonden zu dotieren, die aus der Gruppe der Gene acoA, ahpC, ahpF, citB, clpC, clpP, codY, cspB, des, dnaK, eno, glnR, groEL, gsiB, katA, katE, IctP, Idh, opuAB, phoA, phoD, pstS, purC, purN, pyrB, pyrP, sigB, tnrA, trxA und ydjF, beziehungsweise für im betrachteten Organismus gleich regulierte Gene aus den jeweils durch diese Gene gekennzeichneten Stoffwechselwegen ausgewählt sind.
Die zugehörigen DNA-Sequenzen sind im Sequenzprotokoll unter den Nummern SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19, 23, 25, 29, 31 , 33, 37, 43, 45, 49, 51, 53, 55, 59, 61, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77 und 81 für ß. subtilis beziehungsweise SEQ ID NO. 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123 und 125 für ß. Hcheniformis angegeben. Von diesen können entsprechend dem oben Gesagten auch Sonden für andere grampositive Bakterein abgeleitet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Chip auf gramnegative Bakterien, insbesondere E. coli oder Klebsieila ausgerichtet. Hierfür empfiehlt es sich, ihn mit Sonden zu dotieren, die aus der Gruppe der Gene clpP, cspA, cspB, dnaK, groL, ibpA, ibpB, katE, phoA, pstS, und trxA, beziehungsweise für im betrachteten Organismus gleich regulierte Gene aus den jeweils durch diese Gene gekennzeichneten Stoffwechselwegen ausgewählt sind.
Die zugehörigen DNA-Sequenzen sind im Sequenzprotokoll unter den Nummern SEQ ID NO. 13, 17, 21 , 27, 35, 39, 41, 47, 57, 63 und 79 für E. coli angegeben. Von diesen können entsprechend dem oben Gesagten auch Sonden für Klebsiella und andere gramnegative Bakterein abgeleitet werden.
Entsprechend den oben gemachten Ausführungen können von einzelnen Stoffwechselwegen jeweils einzelne Vertreter ausreichend sein, um ein entsprechendes Signal zu ergeben. Insbesondere bei elektronisch auswertbaren Chips ist es zudem notwendig, die Gesamtzahl der Sonden auf einem Chip gering zu halten. Chips bevorzugter Ausführungsformen sind deshalb dadurch gekennzeichnet, daß von folgenden Genpaaren jeweils nur eines oder ein anderes im betrachteten Organismus gleich reguliertes Gen aus dem jeweils durch eines dieser Gene gekennzeichneten Stoffwechselweg vorhanden ist: ahpC oder ahpF; clpC oder clpP; cspA oder cspB; ibpA oder ibpB; IctP oder Idh; phoA oder phoD; purC oder purN; pyrB oder pyrP.
Für bestimmte biologische Prozesse, insbesondere die Bildung gewerblich relevanter Verbindungen durch Mikroorganismen werden in der Regel nicht die Wildtyp-Stämme eingesetzt, sondern solche, die auf den betreffenden Prozeß ausgerichtet sind. Hierzu gehört neben der Transformation mit den für die eigentliche Produktherstellung verantwortlichen Genen das Versehen mit Selektionsmarkern oder weitere Anpassungen des Stoffwechsels, bis hin zu Auxotrophien. Derartige Stämme besitzen ein besonderes Anforderungsprofil an die Wachstumsbedingungen und besitzen z.T. Stoffwechselgene, die gegenüber den Wildtypgenen mutiert sind. Da erfindungsgemäße Chips vorteilhafterweise auf eben diese Stämme, ganz besonders den betrachteten Bioprozeß ausgerichtet sein sollen, müssen diese Stamm-spezifischen Eigenheiten berücksichtigt werden und können sich in der Wahl der betreffenden Sonden widerspiegeln. Das gilt insbesondere dann, wenn als Sonden nicht die kompletten Gensequenzen sondern nur Teile hiervon eingesetzt werden.
In bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich also um Chips die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich um Sonden handelt, die auf die betreffenden Gene aus dem für den Bioprozeß gewählten Organismus ansprechen, vorzugsweise solche, die von Genen dieses Organismus abgeleitet sind.
Dies gilt besonders dann, wenn es sich bei dem für den Bioprozeß ausgewählten Organismus um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer Bakterien handelt.
Abhängig von der Art des gewünschten Produkts werden verschiedene Organismen gewählt. Hierunter sind im Sinne der Erfindung nicht allein die Produktionsstämme zu verstehen sondern auch alle dem Produktionsprozeß vorgeschalteten Organismen, beispielsweise zur Klonierung entsprechender Gene oder zur Auswahl geeigneter Expressionsvektoren.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen oder um Pilze, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders Sacharomyces oder Schizosaccharomyces. Denn diese werden als Wirtszellen insbesondere für die Genprodukte von Eukaryonten eingesetzt, besonders wenn diese spezielle, nur durch diese Stämme durchführbare Modifikationen erfahren sollen. Hierzu gehören beispielsweise Glykosylierungen.
Aber auch die Ausrichtung erfindungsgemäßer Chips auf die Überwachung des Verlaufs, insbesondere des Wachstums von Zellkulturen höherer Eukaryonten, etwa von Nagetieren oder von Menschen werden umfaßt.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme Bakterien oder solche der Gattung Bacillus, hierunter insbesondere ß. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. Hcheniformis, B. agaradherens,
B. stearothermophilus, B. lentus oder ß. globigii. Denn dies sind technisch besonders wichtige Produktionsstämme. Sie werden insbesondere zur Produktion niedermolekularer chemischer Verbindungen, etwa von Vitaminen oder von Antibiotika oder zur Produktion von Proteinen, insbesondere Enzymen eingesetzt. Hierbei sind besonders Amylasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidoreduktasen und Proteasen besonders hervorzuheben.
In einer nicht minder bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um gramnegative Bakterien, insbesondere um solche der Gattungen Eschenchia coli oder Klebsiella. Diese dienen sowohl im Labormaßstab beispielsweise der Klonierung und Expressionsanalyse als auch im großtechnischen Maßstab der Herstellung biologischer Wertstoffe.
Mit der vorliegenden Anmeldung werden nicht nur die oben beschriebenen Gene als interessante Kandidaten für die Prozeßüberwachung dargestellt sondern auch entsprechende Sequenzen zur Verfügung gestellt. Diese sind im Sequenzprotokoll aufgeführt, wobei die ungeradzahligen Sequenznummem jeweils die Gene und die geradzahligen Sequenznummern die abgeleiteten Genprodukte bezeichnen. In bevorzugten Ausführungsformen sind erfindungsgemäße Chips somit dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine, zunehmend bevorzugt mehrere Sonden von den Sequenzen abgeleitet sind, die im Sequenzprotokoll unter den Nummern SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123 und 125 aufgeführt sind.
Wie oben ausgeführt dienen die beobachteten Prozesse einem technischen Interesse, das mit weiteren spezifischen Genen verbunden ist. Hierbei handelt es sich beispielsweise in dem Fall, daß ein Protein hergestellt werden soll, um das Gen für dieses Protein und in dem Fall, daß eine niedermolekulare Verbindung hergestellt werden soll, um ein oder mehrere Genprodukte, die auf dem Syntheseweg der betreffenden Verbindung liegen. Es können auch andere zelleigene Gene betroffen sein, etwa Stoffwechselgene, die im Zuge der Produktherstellung verstärkt gebildet werden müssen, beispielsweise eine zelleigene Oxidoreduktase, wenn das Produkt aus einem Edukt oder einem Zwischenprodukt über Oxidation oder Reduktion erhalten werden soll. Dies illustriert Beispiel 5, in welchem ein Chip mit einer Sonde für das Gen des interessierenden Produkts eingesetzt wird. Und die Beispiele 8 und 9 zeigen, welche Gene zusätzlich über einen erfindungsgemäßen Chip monitoriert werden können, wenn eine bestimmtes Enzym fermentativ hergestellt werden soll.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich somit um Chips, die zusätzlich mit mindestens einer Sonde für ein zusätzliches Gen dotiert sind, insbesondere einem solchen, das in einem Stoffwechsel-bedingten Zusammenhang zu dem oder den prozeßbedingt zusätzlich exprimierten Gen(en) steht, ganz besonders für eines von diesen oder dieses selbst.
In den Fällen, daß ein gebildetes Polypeptid selbst von Interesse ist oder eine endogene Aktivität verändert ist, handelt es sich in bevorzugten Ausführungsformen um Chips, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich bei dem prozeßbedingt zusätzlich exprimierten Gen um das für ein gewerblich einsetzbares Protein handelt, insbesondere um eine Amylase, Cellulase, Lipase, Oxidoreduktase oder Protease, oder um eines, das auf einem Syntheseweg für eine niedermolekulare chemische Verbindung liegt oder diesen wenigstens zum Teil reguliert. Aus dem einleitend dargestellten Stand der Technik ist die Gestaltung von Chips bekannt, die mit Nukleinsäuren dotiert sind. Sie basieren auf dem Prinzip der Nukleinsäure-Hybridisierung der zu detektierenden mRNA mit der auf dem Chip vorgelegten Sonde. Je nach System zur Auswertung des durch die Hybridisierung ausgelösten Signals wird zwischen Chips mit einem optischen und mit einem elektrischen Analysesystems unterschieden. Erfindungsgemäß sind prinzipiell beide Systeme anwendbar.
Solche Chips werden folgendermaßen zur Kontrolle (Monitoring) des jeweils betrachteten Bioprozesses eingesetzt: Aus dem Prozeß wird zu einem bestimmten Zeitpunkt eine Probe mit dem zu analysierenden biologischem Material entnommen; aus diesem wird, nach an sich bekannten Methoden, beispielsweise unter Zellaufschluß und Verwendung einen denaturierenden Puffers RNA, insbesondere mRNA isoliert. Diese wird markiert vorteilhafterweise in einem Puffer über/durch den Chip geleitet. Bei Hybridisierung (Sandwich-Markierung) einer präparierten RNA mit der homologen auf dem Chip bereitgestellten Sonde (Target-Nukleinsäure, beispielsweise Target-DNA oder Target-Nukleinsäureanalog) ergibt sich ein entsprechendes optisch oder elektronisch auswertbares Signal. Dieses beruht beispielsweise auf der Hybridisierung mit einer zweiten Sonde oder auf einer sekundären Nachweisreaktion, etwa über eine RT-PCR.
Da von derselben Sonde in der Regel jeweils mehrere Moleküle an den Chip gebunden sind, ist die Stärke des Hybridisierungssignal über einen gewissen - im Einzelfall ggf. zu optimierenden - Bereich proportional zur Zahl der zum Zeitpunkt der Probennahme in der Probe vorhandenen spezifischen mRNA. Auf diese Weise ist die Stärke des Signals ein direktes Maß für die Aktivität des betreffenden Gens zu dem Zeitpunkt der Probennahme.
Die Zeitspanne zwischen Probennahme und Messung sollte dabei so kurz wie möglich gehalten werden, beispielsweise über eine weitgehend automatisierte Probennahme, deren Aufarbeitung und Leitung über/durch den Sensor.
Limitierend für die Brauchbarkeit einer Sonde ist also jeweils das Maß der Homologie zwischen der bereitgestellten Sonde und der mRNA, die über Hybridisierung erkannt werden soll. Letztlich entscheidet das Maß an Hybridisierung der Sonde mit der zu detektierenden mRNA (siehe oben) über deren Brauchbarkeit als Sonde und muß im Einzelfall experimentell optimiert und/oder über Anpassung der Signalauswertung berücksichtigt werden. Es muß unter den durch den Aufbau der Meßapparatur, und sonstigen Einflüssen vorgegebenen Bedingungen eine Hybridisierung erfolgen, die spezifisch nur auf das interessierende Gen zurückgeführt werden kann, ausreichend stark ist, um ein positives Signal zu ergeben, und andererseits nicht zu stark ist, als daß die mRNA nach Erzeugung des Signals wieder abdiffundiert, um die Bindungsstelle für das nächste Molekül freizumachen, beziehungsweise ein Abklingen des Signals zu ermöglichen.
Allerdings ist es nötig, vor Verwendung erfindungsgemäßer Chips für einen interessierenden Organismus das Maß der Homologie zwischen den betreffenden Genen abzuschätzen, bei nicht ausreichender Affinität der zu detektierenden mRNAs zu den vorgelegten Sonden solche über dieselben erfindungsgemäßen Gene aus näher verwandten Spezies auf dem Chip zu verankern und Kalibrierungsmessungen durchzuführen, um verläßliche Aussagen darüber zu erhalten, welche Signalstärke welcher Konzentration an spezieller mRNA entspricht.
Um eine optimale Hybridisierung zu erreichen, sind Chips bevorzugter Ausführungsformen dadurch gekennzeichnet, daß eine, bevorzugt mehrere Sonden einzelsträngig, in Form des codogenen Strangs bereitgestellt werden. Denn dieser hybridisiert mit dem codierenden Strang der DNA, beziehungsweise mit der entsprechenden mRNA.
Erfindungsgemäße Chips sollten vorteilhafterweise mehrmals verwendbar sein, insbesondere während eines einzelnen beobachteten Prozesses, in dessen Verlauf eine ständige Überwachung erstrebenswert ist. Um hierfür die Haltbarkeit erfindungsgemäßer Chips, insbesondere gegenüber Nukleinsäure-hydrolysierenden Enzymen zu erhöhen, sind erfindungsgemäße Chip dadurch gekennzeichnet, daß eine, bevorzugt mehrere Sonden in Form einer DNA, vorzugsweise eines Nukleinsäureanalogs zur Verfügung gestellt werden. Eine DNA ist an sich weniger hydrolyseempfindlich als etwa eine RNA. Schwerhydrolysierbare Analoga, in denen beispielsweise das Phosphat des Zucker- Phosphatsrückgrats ersetzt ist, sind demgegenüber jedoch bevorzugt. Derartige Verbindungen sind im Stand der Technik bekannt. Die betreffenden Sonden wären, etwa nach dem Vorbild des mit dieser Anmeldung verbundenen Sequenzprotokolls entsprechend zu synthetisieren.
Zum Nachweis einer mRNA ist oft keine Hybridisierung über die ganze Seqzuenzlänge erforderlich. Die spezifischen Sonden brauchen deshalb weniger den Bereich des Gens zu umfassen, der in mRNA umgeschrieben wird, als den, der tatsächlich als mRNA nachzuweisen ist. Vorteilhaft ist hierfür eine Auswahl eines Bereichs, der nahe dem 5'- Ende der mRNA liegt, da dieser zuerst in mRNA transkribiert wird und somit nach Aktivierung des Gens als erstes nachweisbar ist. Dies kommt einem zeitnahen Nachweis entgegen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind erfindungsgemäße Chips somit dadurch gekennzeichnet, daß eine, bevorzugt mehrere Sonden Genbereiche umfassen, die von dem zu untersuchenden Organismus in mRNA umgeschrieben werden, insbesondere die Genbereiche, die nahe dem 5'-Ende der mRNA liegen.
mRNA-Moleküle liegen oft in einer Sekundärstruktur vor, die auf Hybridisierung einzelner mRNA-Bereiche mit eigenen, anderen Bereichen beruht. So kommt es beispielsweise zu Loop- oder Stem-Ioop-Strukturen. Solche Bereiche hybridisieren in der Regel jedoch weniger leicht mit anderen Nukleinsäuremolekülen, auch wenn diese homolog sind.
In bevorzugten Ausführungsformen sind erfindungsgemäße Chips deshalb dadurch gekennzeichnet, daß eine, bevorzugt mehrere Sonden auf Fragmente der betreffenden Nukleinsäuren ansprechen, insbesondere auf solche, die in der betreffenden mRNA, bezogen auf die jeweilige Gesamt-mRNA ein geringes Maß an Sekundärfaltung aufweisen.
Die für die Nachweisreaktion eingesetzten Sonden brauchen nur Teile der zu detektierenden mRNA zu umfassen, sofern das über sie erhältliche Signal noch spezifisch genug ist. Diese Spezifität setzt die untere Grenze für die Länge der betreffenden Sonden.
Die Identifizierung von geeigneten Sonden wird normalerweise unter Zuhilfenahme spezialisierter Software durchgeführt. Beispiele für solche Software sind das Programm Array Designer der Fa. Premier Biosoft International, USA, oder das Programm Primer 3, welches auf der Internetseite http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi frei zugänglich ist. Neben den schon erwähnten Sekundärstrukturen berücksichtigen diese Softwareprogramme beispielsweise auch vorgegebene Sondenlängen sowie Schmelztemperaturen.
Vorzugsweise ist also ein erfindungsgemäßer Chip dadurch gekennzeichnet, daß eine, bevorzugt mehrere Sonden eine Länge von weniger als 200 Nukleotiden, und zunehmend bevorzugt von weniger als 150, 120, 100, 80, beziehungsweise von 20 bis 60, 30 bis 50 und besonders bevorzugt von 45 bis 55 Nukleotiden aufweisen. In den Beispielen der vorliegenden Anmeldung haben sich bereits solche Sonden als brauchbar erwiesen, die jeweils lediglich 20 Basen lang waren.
Erfindungsgemäße Chips sind vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, daß durch die Bindung der mRNA an die betreffende Sonde ein elektrisches Signal ausgelöst wird.
In dem bereits erwähnten Artikel J. Wang (Acc. Chem. Res.; ISSN 0001-4842; Rec. Sept. 12, 2001, S. A-F) werden die Vorteile eines elektrisch auswertbaren Systems gegenüber einem optischen System diskutiert. Femer wird auf verschiedene im Stand der Technik entwickelte Ausführungsformen solcher Sensoren verwiesen.
So beträgt zum gegenwärtigen Zeitpunkt die Zeitspanne von der Probennahme bis zum Messen des Signals für optisch auswertbare Chips ungefähr 24 h. Mithilfe eines elektrischen Systems liegt der Zeitbedarf momentan bei ca. 2h (vgl. Figur 4). Demgegenüber ist die Zahl der gleichzeitig analysierbaren Proben bei elektrisch auswertbaren Chips derzeit auf maximal 12 Sonden beschränkt, wobei jedoch eine rasche Entwicklung dafür spricht, daß in Kürze auf einem Chip mehr Analyseplätze zur Verfügung gestellt werden können. Limitierend hierfür sind die elektronischen Auswerte- Einheiten für die verschiedenen Signale.
Eine im Stand der Technik etablierte Methoden zur mRNA-Quentifizierung stellt beispielsweise die RT-PCT dar. Diese wird in dem Artikel „Quantification of Bacterial mRNA by One-Step RT-PCR Using the LightCycler System" (2003) von S.Tobisch, T.Koburger, B.Jürgen, S.Leja, M.Hecker und T.Schweder in BIOCHEMICA, Band 3, Seiten 5 bis 8 beschrieben. Demgegenüber besitzt die Detektion über Elektro-Chips einen weiteren, in Beispiel 4 und Figur 5 illustrierten Vorteil, nämlich die höhere Zuverlässigkeit der Daten. Denn diese weisen, wie dort gezeigt ist, gegenüber der RT- PCR deutlich geringere Schwankungsbreiten auf.
Die Herstellung entsprechender elektronisch auswertbarer Chips wird beispielsweise in den Patentanmeldungen WO 00/62048 A2, WO 00/67026 A1 und WO 02/41992 beschrieben, deren Offenbarungsgehalt vollständig in die vorliegende Anmeldung einbezogen wird.
Die Funktionsweise elektrisch auslesbarer Chips einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann wie folgt beschrieben werden: Die genspezifischen Sonden sind auf an sich bekannte Weise kovalent an magnetische Beads gebunden, die sich in hierfür vorgesehenen Kammern der Chips befinden. Die spezifische Hybridisierung der entsprechenden mRNA an die jeweiligen Beads erfolgt in dieser Hybridisierungskammer, die temperierbar ist und von den betreffenden Lösungen durchspült werden kann. Die Beads werden in dieser Kammer durch einen Magneten festgehalten. Nach der Hybridisierung der RNA-Proben an die Beads-gebundenen DNA-Sonden erfolgt ein Waschschritt zur Beseitigung der nicht-gebundenen RNA, so daß in der Inkubationskammer nur noch spezifische Hybride vorhanden sind, und zwar gebunden an den magnetischen Beads.
Nach dem Waschen wird eine Detektionssonde in die Inkubationskammer eingeleitet, die über eine Biotin-Extravidin-gebundene alkalische Phosphatase markiert ist. Diese Sonde bindet an eine zweite freie Region der hybridisierten mRNA. Dieses Hybrid wird anschließend erneut gewaschen und mit dem Substrat der alkalischen Phosphatase Para-Aminophenolphosphat (pAPP) inkubiert. Die enzymatische Reaktion in der Inkubationskammer führt zur Freisetzung des redoxaktiven Produkts para-Aminophenol (pAP). Dieses wird nun über den Red/Ox-Elektrode auf dem elektrischen Chip geleitet und das Signal zu einem Potentiostaten gesendet.
Eine System-spezifische Software (zum Beispiel MCDDE32) liest die erhaltenen Daten und die Ergebnisse können mit Hilfe eines weiteren Programms (zum Beispiel Origin) auf einem Computer ausgewertet und dargestellt werden.
Selbstverständlich ist dieser Prozeß sowohl hinsichtlich der technischen Gestaltung der Chips als auch der Auswertung variierbar. So kann beispielsweise die Nachweisreaktion auch durch eine andere, wegen des elektrischen Meßprinzips vorzugsweise jedoch eine Redoxreaktion erfolgen.
Eine Leistung der vorliegenden Erfindung besteht darin, prozeßkritische Gene identifiziert und der Analyse über entsprechend gestaltete Biochips zugänglich gemacht zu haben. Der Vorteil von Chips gegenüber konventionellen Nachweismethoden besteht neben dem Zeitgewinn und der höheren Genauigkeit darin, daß mit der Bereitstellung mehrerer Sonden auf einem Träger gleichzeitig in derselben Probe die Aktivitäten von mehreren verschiedenen Genen nachgewiesen werden können.
So wird mit der vorliegenden Erfindung die Verwendung entsprechender Sonden zur Verfügung gestellt, die so ausgewählt sind, daß sie ein für die meisten Fermentationsverläufe repräsentatives Bild über verschiedene physiologische Zustände der betreffenden gramnegativen und grampositiven ergeben. Dies gilt insbesondere für die der Spezies E. coli (vgl. Beispiel 1 und Figur 1), ß. subtilis (vgl. Beispiel 2 und Figur 2) und ß. Hcheniformis (vgl. Beispiel 3 und Figur 3). Die hierin beschriebenen Sonden, die spezifisch für die Gene ibpB, dnaK, acoA und sigB sind, können demnach auf an sich bekannte Weise an entsprechende Chips gebunden und zur Analyse von Bioprozessen eingesetzt werden. In Beispiel 4 und Beispiel 7 wird die Glucose-Hunger anzeigende acoA-mRNA von ß. subtilis beziehungsweise ß. Hcheniformis über Chips nachgewiesen, in Beispiel 6 das Phosphatmangel anzeigende Genprodukt von pstS von ß. Hcheniformis und in Beispiel 5 mit aprE eine mRNA für ein interessierendes Genprodukt. Elektrisch auswertbare Chips mit gleichzeitig elf Sonden werden in den Beispielen 8 und 9 beschrieben, wobei sieben Sonden die allgemeine Stoffwechselsituation widerspiegeln, jeweils eine auf das interessierende Produkt gerichtet ist und jeweils drei weitere Gene solche Aspekte des Stoffwechsels monitorieren, die in einem Zusammenhang mit dem interessierenden Produkt stehen (vergleiche Tabellen 5 und 6). Hierbei handelt es sich bei dem Produkt Protease um Sonden zu Genen des Stickstoffmetabolismus und bei dem Produkt Amylase um Sonden zu Genen des Kohlenhydratstoffwechsels. In analoger Weise ließen sich beispielsweise bei einer Biotransformation die Genaktivitäten beobachten, die für die chemische Umsetzung der betreffenden Substrate benötigt werden.
Ein eigener Erfindungsgegenstand ist somit die Verwendung von Nukleinsäure- oder Nukleinsäure-Analogon-Sonden für mindestens vier der folgenden Gene: acoA, ahpC, ahpF, citB, clpC, clpP, codY, cspA, cspB, des, dnaK, eno, glnR, groEL, groL, gsiB, ibpA, ibpB, katA, katE, IctP, Idh, opuAB, phoA, phoD, pstS, purC, purN, pyrB, pyrP, sigB, tnrA, trxA und ydjF, beziehungsweise für im betrachteten Organismus gleich regulierte Gene aus den jeweils durch diese Gene gekennzeichneten Stoffwechselwegen, gebunden an einen zuvor beschriebenen Chip zur Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus.
Hierunter sind solche Verwendungen bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß mindestens eine, zunehmend bevorzugt mehrere Sonden von den Sequenzen abgeleitet sind, die im Sequenzprotokoll unter den Nummern SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111 , 113, 115, 117, 119, 121, 123 und 125 aufgeführt sind.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen dieses Gegenstands und deren Erläuterungen ergeben sich aus den oben gemachten Ausführungen zu den erfindungsgemäßen Chips.
Einen weiteren eigenen Erfindungsgegenstand bilden entsprechend dem oben Gesagten Verfahren zur Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus durch Einsatz eines oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Chips.
Vorzugsweise ist ein erfindungsgemäßes Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem für den Bioprozeß ausgewählten Organismus um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer Bakterien handelt.
Vorzugsweise ist ein erfindungsgemäßes Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen oder um Pilze handelt, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders Sacharomyces oder Schizosaccharomyces.
Vorzugsweise ist ein erfindungsgemäßes Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme Bakterien oder solche der Gattung Bacillus handelt, hierunter insbesondere ß. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. Hcheniformis, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. lentus oder ß. globigii, hierunter besonders bevorzugt mit Sonden, die von den im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen aus ß. subtilis oder ß. Hcheniformis (SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 43, 45, 49, 51, 53, 55, 59, 61, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 111 , 113, 115, 117, 119, 121, 123 und/oder 125) abgeleitet sind.
Vorzugsweise werden dafür Sonden eingesetzt, die von den betreffenden Genen möglichst verwandter Spezies, besonders bevorzugt des jeweiligen Organismus selbst abgeleitet sind.
Damit sind bei ß. subtilis und ß. Hcheniformis solche Verfahren gemeint, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich um ß. subtilis oder ß. Hcheniformis handelt, wobei für ß. subtilis die Sonden von den im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen aus ß. subtilis (SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 43, 45, 49, 51 , 53, 55, 59, 61, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77 und/oder 81) abgeleitet sind, beziehungsweise für ß. Hcheniformis die Sonden von den im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen aus ß. Hcheniformis (SEQ ID NO. 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123 und/oder 125) abgeleitet sind.
Vorzugsweise ist ein erfindungsgemäßes Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den gramnegativen Bakterien um solche der Gattungen Eschenchia coli oder Klebsieila handelt, bevorzugt mit Sonden, die von den im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen aus E. coli (SEQ ID NO. 13, 17, 21, 27, 35, 39, 41, 47, 57, 63 und/oder 79) abgeleitet sind.
Wegen seiner großen Bedeutung insbesondere für Versuche im Labormaßstab sind hierunter solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich um E. coli handelt.
Vorzugsweise ist ein erfindungsgemäßes Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung des physiologischen Zustands zu verschiedenen Zeitpunkten desselben Prozesses durchgeführt wird, optional unter Einsatz mehrerer baugleicher Chips.
Vorzugsweise ist ein erfindungsgemäßes Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Prozeß um eine Fermentation, insbesondere um die fermentative Herstellung eines gewerblich einsetzbaren Produkts, besonders bevorzugt um die Herstellung eines Proteins oder einer niedermolekularen chemischen Verbindung handelt.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung eines erfindungsgemäßen Chips zur Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus dar.
Bevorzugte Ausführungsformen solcher Verwendungen wie auch der Verwendung der in der vorliegenden Erfindung definierten Gensonden ergeben sich aus den bisher gemachten Ausführungen.
Vorzugsweise ist eine erfindungsgemäße Verwendung dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem für den Bioprozeß ausgewählten Organismus um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer Bakterien handelt.
Vorzugsweise ist eine erfindungsgemäße Verwendung dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen oder um Pilze handelt, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders Sacharomyces oder Schizosaccharomyces.
Vorzugsweise ist eine erfindungsgemäße Verwendung dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme Bakterien oder solche der Gattung Bacillus handelt, hierunter insbesondere ß. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. Hcheniformis, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. lentus oder ß. globigii, hierunter besonders bevorzugt mit Sonden, die von den im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen aus ß. subtilis oder ß. Hcheniformis (SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11 , 15, 19, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 43, 45, 49, 51 , 53, 55, 59, 61 , 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123 und/oder 125) abgeleitet sind.
Sofern es sich bei den beobachteten Organismen um ß. subtilis oder ß. Hcheniformis handelt, sind darunter solche Verwendungen bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß für ß. subtilis die Sonden von den im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen aus ß. subtilis (SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 43, 45, 49, 51, 53, 55, 59, 61, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77 und/oder 81) abgeleitet sind, beziehungsweise für ß. Hcheniformis die Sonden von den im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen aus ß. Hcheniformis (SEQ ID NO. 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 111 , 113, 115, 117, 119, 121, 123 und/oder 125) abgeleitet sind.
Vorzugsweise ist eine erfindungsgemäße Verwendung dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den gramnegativen Bakterien um solche der Gattungen Eschenchia coli oder Klebsieila handelt, bevorzugt mit Sonden, die von den im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen aus E. coli (SEQ ID NO. 13, 17, 21, 27, 35, 39, 41, 47, 57, 63 und/oder 79) abgeleitet sind.
Hierunter sind solche Verwendungen bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich um E. coli handelt.
Vorzugsweise ist eine erfindungsgemäße Verwendung dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung des physiologischen Zustands zu verschiedenen Zeitpunkten desselben Prozesses durchgeführt wird, optional unter Einsatz mehrerer baugleicher Chips.
Vorzugsweise ist eine erfindungsgemäße Verwendung dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Prozeß um eine Fermentation, insbesondere um die fermentative Herstellung eines gewerblich einsetzbaren Produkts, besonders bevorzugt um die Herstellung eines Proteins oder einer niedermolekularen chemischen Verbindung handelt.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung wurden die meisten erfindungsgemäß einsetzbaren und in Tabelle 2 aufgeführten Gene auch aus Bacillus Hcheniformis DSM 13 isoliert und sequenziert. Dieser Stamm ist über die Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de) allgemein erhältlich. Er trägt bei der American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (http://www.atcc.org) die Hinterlegungsnummer ATCC 14580. Die Sequenzierungen erfolgten über allgemein bekannte Verfahren.
Die im Stand der Technik noch nicht beschriebenen DNA- und Aminosäuresequenzen dieser prinzipiell jedoch bekannten Enzyme sind im Sequenzprotokoll zur vorliegenden Anmeldung aufgeführt. In folgender Tabelle 3 sind sie noch einmal zusammen mit den betreffenden Nummern der Sequenzprotokolls zusammengestellt. Hinzu kommen die jeweils zu ß. subtilis ermittelten Homologiewerte, sofern nicht eine andere, noch höher homologe bekannt war; diese ist dann ebenfalls vermerkt, ß. subtilis ist einer der nächsten Verwandten von ß. Hcheniformis, so daß erwartungsgemäß keine noch ähnlicheren DNA- und Aminosäuresequenzen bekannt sein sollten. Darauf gründet der jeweils in den zugehörigen Ansprüchen angegebene Schutzbereich.
Tab. 3: Erfindungsgemäße Gene und abgeleitete Proteine aus ß. Hcheniformis
Angegeben sind jeweils die Homologiewerte zu den zugehörigen Sequenzen aus ß. subtilis als einem der nächstähnlichen Organismen, sofern nicht eine noch ähnlichere Sequenz bekannt war (angegeben).
Jedes dieser Proteine stellt somit zusammen mit der jeweils zugehörigen Nukleotidsequenz, unter Einbeziehung der betreffenden Homologiebereiche einen eigenen Gegenstand der vorliegenden Anmeldung dar. Die von diesen Proteinen ausgeübten jeweiligen biochemischen Funktionen sind ebenfalls in Tabelle 3 vermerkt und können anhand der oben angegebenen Datenbankangaben überprüft werden. Erfindungsgemäß werden sie als die Enzyme angesehen, die die entsprechenden biochemischen Funktionen ausüben, welche die im Sequenzprotokoll exakt angegebenen Enzyme in vivo in ß. Hcheniformis ausüben. Diese Gegenstände werden im folgenden aufgeführt; die jeweiligen, in Prozent Identität angegebenen Homologiewerte können über einen entsprechenden Computer- Algorithmus, beispielsweise über das Programm Vector NTI® Suite, Fa. InforMax, Bethesda, USA, überprüft werden; hierbei sind sowohl alle ganzzahligen als auch alle dazwischen liegenden gebrochenen Zahlenwerte zu verstehen:
- Alpha-Untereinheit der Acetoin-Dehydrogenase E1-Komponente (AcoA; E.C.1.2.4.-) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 84 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 74% und zunehmend bevorzugt zu 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist; im Zusammenhang mit einer für eine Alpha-Untereinheit der Acetoin- Dehydrogenase E1-Komponente (AcoA; E.C.1.2.4.-) codierenden Nukleinsäure (acoA) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 83 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 85% und zunehmend bevorzugt zu 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 872 gemäß SEQ ID NO. 83 entspricht.
- Kleine Untereinheit der Alkylhydroperoxid-Reductase (AhpC; E.C.1.6.4.-) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 86 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 95% und zunehmend bevorzugt zu 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist; im Zusammenhang mit einer für eine Kleine Untereinheit der Alkylhydroperoxid- Reductase (AhpC; E.C.1.6.4.-) codierenden Nukleinsäure (ahpC) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 85 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 91% und zunehmend bevorzugt zu 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 764 gemäß SEQ ID NO. 85 entspricht.
- Große Untereinheit der Alkylhydroperoxid-Reductase / NADH-Dehydrogenase (AhpF; E.C.1.6.99.3) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 88 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 92% und zunehmend bevorzugt zu 93, 94, 95, 96, 97, 97,5 98, 99 und 100% identisch ist; im Zusammenhang mit einer für eine Große Untereinheit der Alkylhydroperoxid-Reductase / NADH-Dehydrogenase (AhpF; E.C.1.6.99.3) codierenden Nukleinsäure (ahpF) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 87 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 87% und zunehmend bevorzugt zu 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 1730 gemäß SEQ ID NO. 87 entspricht.
- Aconitase-Hydratase (CitB; E.C.4.2.1.3) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 90 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 93% und zunehmend bevorzugt zu 94, 95, 96, 97, 97,5, 98, 99 und 100% identisch ist; im Zusammenhang mit einer für eine Aconitase-Hydratase (CitB; E.C.4.2.1.3) codierenden Nukleinsäure (citB) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 89 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 93% und zunehmend bevorzugt zu 92, 93, 94, 95, 96, 97, 97,5, 98, 99 und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 2927 gemäß SEQ ID NO. 89 entspricht.
- Klasse Ill-Streßantwort-verbundene ATPase (ClpC) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 92 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 95% und zunehmend bevorzugt zu 96, 96,5, 97, 98, 99 und 100% identisch ist; im Zusammenhang mit einer für eine Klasse Ill-Streßantwort-verbundene ATPase (ClpC) codierenden Nukleinsäure (clpC) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 91 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 84% und zunehmend bevorzugt zu 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 2633 gemäß SEQ ID NO. 91 entspricht.
Proteolytische Untereinheit der ATP-abhängigen Protease, (Klasse III- Hitzeschockprotein; E.C. 3.4.21.92; CIpP) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 94 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 97% und zunehmend bevorzugt zu 98, 98,5, 99, 99,5 und 100% identisch ist; im Zusammenhang mit einer für eine Proteolytische Untereinheit der ATP-abhängigen Protease, (Klasse III- Hitzeschockprotein; E.C. 3.4.21.92; CIpP) codierenden Nukleinsäure (clpP) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 93 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 86% und zunehmend bevorzugt zu 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 1 bis 549 gemäß SEQ ID NO. 93 entspricht. - Pleitroper Transkriptionsrepressor (CodY) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 96 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 92% und zunehmend bevorzugt zu 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist; im Zusammenhang mit einer für einen Pleitropen Transkriptionsrepressor (CodY) codierenden Nukleinsäure (codY) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 95 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 88% und zunehmend bevorzugt zu 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 980 gemäß SEQ ID NO. 95 entspricht.
- Haupt-Kälteschock-Protein (CspB) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 98 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 98% und zunehmend bevorzugt zu 98,5, 99, 99,5 und 100% identisch ist; im Zusammenhang mit einer für ein Haupt-Kälteschock-Protein (CspB) codierenden Nukleinsäure (cspB) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 97 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 97% und zunehmend bevorzugt zu 98, 98,5, 99, 99,5 und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 401 gemäß SEQ ID NO. 97 entspricht.
- Fettsäure-Desaturase (Des; E.C.1.14.99.-) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 100 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 73% und zunehmend bevorzugt zu 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist; im Zusammenhang mit einer für eine Fettsäure-Desaturase (Des; E.C.1.14.99.-) codierenden Nukleinsäure (des) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 99 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 88% und zunehmend bevorzugt zu 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 1229 gemäß SEQ ID NO. 99 entspricht.
Klasse I-Hitzeschockprotein (molekulares Chaperon; DnaK) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 102 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 94% und zunehmend bevorzugt zu 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 1 bis 480 gemäß SEQ ID NO. 102 entspricht; im Zusammenhang mit einer für ein Klasse I- Hitzeschockprotein (molekulares Chaperon; DnaK) codierenden Nukleinsäure (dnaK) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 101 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 88% und zunehmend bevorzugt zu 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 1 bis 1440 gemäß SEQ ID NO. 101 entspricht.
- Enolase (Eno; E.C.4.1.2.11) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 104 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 98% und zunehmend bevorzugt zu 98,5, 99, 99,5 und 100% identisch ist; im Zusammenhang mit einer für eine Enolase (Eno; E.C.4.1.2.11) codierenden Nukleinsäure (eno) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 103 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 94% und zunehmend bevorzugt zu 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 1493 gemäß SEQ ID NO. 103 entspricht.
- Transkriptionsrepressor des Glutamin-Synthetase-Gens (GlnR) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 106 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 83% und zunehmend bevorzugt zu 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist; im Zusammenhang mit einer für einen Transkriptionsrepressor des Glutamin-Synthetase-Gens (GlnR) codierenden Nukleinsäure (glnR) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 105 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 91% und zunehmend bevorzugt zu 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 608 gemäß SEQ ID NO. 105 entspricht.
- Klasse-I-Hitzeschockprotein (Chaperonin; GroEL) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 108 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 96% und zunehmend bevorzugt zu 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5 und 100% identisch ist; im Zusammenhang mit einer für ein Klasse-I-Hitzeschockprotein (Chaperonin; GroEL) codierenden Nukleinsäure (groEL) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 107 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 90% und zunehmend bevorzugt zu 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 1835 gemäß SEQ ID NO. 107 entspricht.
- Catalase (KatA; E.C.1.11.1.6) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 110 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 90% und zunehmend bevorzugt zu 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist; im Zusammenhang mit einer für eine Catalase (KatA; E.C.1.11.1.6) codierenden Nukleinsäure (katA) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 109 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 86% und zunehmend bevorzugt zu 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 1661 gemäß SEQ ID NO. 109 entspricht.
- Catalase (KatE; E.C.1.11.1.6) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 112 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 74% und zunehmend bevorzugt zu 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist; im Zusammenhang mit einer für eine Catalase (KatE; E.C.1.11.1.6) codierenden Nukleinsäure (katE) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 111 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 85% und zunehmend bevorzugt zu 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 1661 gemäß SEQ ID NO. 111 entspricht.
- Glycin-Betain-ABC-Transporter (OpuAB) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 114 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 82% und zunehmend bevorzugt zu 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 92,5 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist; im Zusammenhang mit einer für einen Glycin-Betain-ABC- Transporter (OpuAB) codierenden Nukleinsäure (opuAB) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 113 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 85% und zunehmend bevorzugt zu 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 1055 gemäß SEQ ID NO. 113 entspricht.
- Phosphat-bindendes Protein (PstS) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 116 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 82% und zunehmend bevorzugt zu 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist; im Zusammenhang mit einer für ein Phosphat-bindendes Protein (PstS) codierenden Nukleinsäure (pstS) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 115 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 84% und zunehmend bevorzugt zu 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 1118 gemäß SEQ ID NO. 115 entspricht.
- Phosphoribosylaminoimidazol-Succinocarboxamid-Synthetase (PurC; E.C. 6.3.2.6) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 118 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 90% und zunehmend bevorzugt zu 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist; im Zusammenhang mit einer für eine Phosphoribosylaminoimidazol-Succinocarboxamid-Synthetase (PurC; E.C. 6.3.2.6) codierenden Nukleinsäure (purC) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 117 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 89% und zunehmend bevorzugt zu 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 917 gemäß SEQ ID NO. 117 entspricht.
- Phosphoribosylglycinamid-Formyltransferase (PurN; E.C. 2.1.2.2) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 120 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 76% und zunehmend bevorzugt zu 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist; im Zusammenhang mit einer für eine Phosphoribosylglycinamid-Formyltransferase (PurN; E.C. 2.1.2.2) codierende Nukleinsäure {purN) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 119 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 84% und zunehmend bevorzugt zu 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 788 gemäß SEQ ID NO. 119 entspricht.
- Uracil-Permease (PyrP) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 122 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 69% und zunehmend bevorzugt zu 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist; im Zusammenhang mit einer für eine Uracil-Permease (PyrP) codierenden Nukleinsäure (pyrP) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 121 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 89% und zunehmend bevorzugt zu 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 1505 gemäß SEQ ID NO. 121 entspricht. - RNA-Polymerase-spezifischer genereller (alternativer) Streß-Sigma-Faktor (SigB) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 124 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 85% und zunehmend bevorzugt zu 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist; im Zusammenhang mit einer für einen RNA-Polymerase-spezifischen generellen (alternativen) Streß-Sigma- Faktor (SigB) codierenden Nukleinsäure (sigB) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 123 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 98% und zunehmend bevorzugt zu 98,5, 99, 99,5 und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 998 gemäß SEQ ID NO. 123 entspricht.
- Thioredoxin (TrxA) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 126 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 98,5% und zunehmend bevorzugt zu 99, 99,5 und 100% identisch ist; im Zusammenhang mit einer für ein Thioredoxin (TrxA) codierenden Nukleinsäure (trxA) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 125 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 93% und zunehmend bevorzugt zu 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 515 gemäß SEQ ID NO. 125 entspricht.
Aus Tabelle 3 geht die überraschende Beobachtung hervor, daß die Sequenzen dieser Gene und Proteine trotz der hohen Verwandtschaft von ß. subtilis und ß. Hcheniformis in den meisten Fällen nicht sehr identisch sind. Hierbei gibt es, wie über ein allgemein bekanntes Alignment jeweils feststellbar ist, auch innerhalb der betreffenden Gene Bereiche mit einem höheren und solche mit einem niedrigeren Maß an Übereinstimmung.
Eine in der vorliegenden Anmeldung dargestellte Einsatzmöglichkeit für jede dieser Nukleotidsequenzen ist die als Sonde auf Chips zur Kontrolle biologischer Prozesse. Denn wie oben beschrieben werden diese Gene als repräsentativ angesehen, um die Stoffwechselsituation eines Organismus, insbesondere eines für eine Fermentation eingesetzten Mikroorganismus anzuzeigen. Entsprechend den bisherigen Ausführungen werden dafür kleinere, vorteilhafterweise nahe dem 5'-Ende gelegene Bereiche dieser Gene bevorzugt.
Dabei können die Gemeinsamkeiten der jeweiligen Sequenzen ausgenutzt werden, um über Spezies-Grenzen hinweg vergleichbare Genprodukte nachzuweisen. Sonden gegen zueinander unterschiedliche Bereiche können ausgenutzt werden, um mit ein und denselben Chip solche mRNA nebeneinander nachzuweisen, etwa wenn eines dieser Gene in Zellen der anderen Spezies exprimiert wird oder wenn es sich um Mischkulturen handelt. Damit können auch Verunreinigungen beispielsweise mit Vertretern der anderen Spezies (oder mit anderen Mikroorganismen, etwa E. coli über die oben ausgeführten Sonden) nachgewiesen werden. Dies ist insbesondere zur Reinheitskontrolle, etwa bei einer Fermentation von Bedeutung.
Eine andere technische Einsatzmöglichkeit ist die der gezielten Inaktivierung der betreffenden Gene, etwa über homologe Rekombination, in Stämmen die zur Synthese anderer Verbindungen genutzt werden oder bei denen die betreffenden Gene gezielt ausgeschaltet werden sollen, um ein homologes, beispielsweise für ein aktiveres Produkt codierendes Gen in trans bereitzustellen.
Darüber hinaus sind die jeweiligen unter den geradzaligen Nummern des Sequenzprotokolls angegebenen Enzyme zu den bestimmten biochemischen Reaktionen befähigt, die ihrer Rolle im jeweiligen Stoffwechselweg entsprechen. Dementsprechend können sie verwendet werden, um vergleichbare Reaktion in vitro durchzuführen. So werden insbesondere für die Synthese von Naturstoffen wie Vitaminen, Antibiotika oder auch von Medikamenten zunehmend als Katalysatoren Enzyme eingesetzt. Sie zeichnen sich gegenüber herkömmlichen Verfahren insbesondere durch meist niedrigere Temperaturen, gute Umweltverträglichkeit und hohe Regioselektivität aus.
Dies gilt insbesondere für Produkte, die mit den in vivo auf diesen Wegen gelegenen Stoffwechselprodukten übereinstimmen. Das sind beispielsweise die Transkriptionsrepressoren CodY oder GlnR zur Regulation der betreffenden Wege, die Desaturase aus dem Fettsäuremetabolismus (Des) oder die Faktoren PurC, PurN und PyrP aus dem Nukletidstoffwechsel.
Die für diese Zwecke eingesetzten Enzyme können vorteilhafterweise aus den im Sequenzprotokoll unter den ungeradzaligen Nummern angegebenen, zugehörigen DNA- Sequenzen erhalten werden, indem die betreffenden Gene auf an sich bekannte Weise aus ß. Hcheniformis DSM 13 oder vergleichbaren Stämmen isoliert oder synthetisiert und in Expressionsvektoren eingebracht werden. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die interessierende chemische Reaktion von Mikroorganismen katalysieren zu lassen, die die betreffenden Aktivitäten auf diese Weise erhalten haben.
Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung sowie bevorzugte Ausführungsformen werden durch die nachfolgenden Beispiele erläutert beziehungsweise gehen aus diesen selbst hervor.
Beispiele
Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie sie beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis „Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Sp ng Harbour Laboratory Press, New York, 1989, oder vergleichbaren einschlägigen Werken angegeben sind. Enzyme und Baukästen (Kits) wurden nach den Angaben der jeweiligen Hersteller eingesetzt.
Beispiel 1
Analyse der Expression der Gene ibpB und dnaK des gramnegativen Bakteriums
Eschenchia coli
Für die Bestimmung der ibpB- und αVjaK-mRNA-Level vor und nach Überproduktion eines unlöslichen Modellproteins (α-Glycosidase von Saccharomyces cerevisiae) in Eschenchia coli wurde die Slot-blot-Analyse verwendet. Der E. coli Stamm RB791 [F~, IN(rmD - rrnE)Λ , λ", laclqL8] wurde für die Experimente verwendet. Dieser Stamm enthält das Plasmid pKK177glucC mit dem Gen der α-Glucosidase, dessen Expression durch den fac-promoter und die Zugabe von Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert wird. Weiterhin trägt dieser Stamm das Plasmid pUBS520, das eine minor- argll-iRNA konstitutiv exprimiert (Brinkmann et al., 1989).
Die Kultivierung wurde als Fed-batch-Fermentation in einem 6 I-Biostat ED Fermentor (Fa. B. Braun Biotech. Int., Melsungen) durchgeführt. Alle Fermentationen erfolgten in einem Glukose-Ammonium basierten Mineralsalzmedium bei einer Temperatur von 35°C wie bei Teich et al. (1998; J. Biotechnol., Bd. 8, S. 197-210) beschrieben. Die Induktion erfolgte durch die Zugabe von 1 mM IPTG.
Für die mRNA-Analyse wurden die Zellen in 400μl (1:1 (v/v)) Killing-Puffer (20mM Tris- HCI pH 7.5, 20 mM NaN3, 5 mM MgCI2) aufgenommen und zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet bei -80°C bis zur weiteren Analyse gelagert. Gesamt- RNA wurde mit dem High Pure-RNA Isolation Kit (Fa. Röche Diagnostics) isoliert. Definierte Mengen der isolierten RNA wurden mit 10χSSC (1.5 M NaCI, 0.15 M Na- Citrat, pH 7) verdünnt und auf eine positiv geladene Nylonmembran aufgetragen. Anschließend erfolgte die Hybridisierung mit einer Digoxigenin-markierten spezifischen RNA-Sonde entsprechend der Vorgaben des Handbuchs von Röche Diagnostics. Die RNA-Sonden wurden in vitro mit der T7 RNA Polymerase von einem PCR-Produkt synthetisiert, das eine T7-Promotorsequenz enthielt. Die folgenden Primer wurden für die Synthese der entsprechenden PCR-Produkte verwendet:
5'GCTTTACCGTTCTGCTATTGG und 5'CTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGTTGATTTCGATACGGCGC
für ibpB (vgl. Allen et al.,1992; J. Bacteriol., Bd. 174, S.6938-6947), und
5'GGGTAAAATAATGGTATCG und 5'CTAATACGACTCACTATAGGGAGACTTTGATGTTCATGTGTTTC
für dnaK (Bardwell and Craig, 1984; Proc. Natl. Acad. Sei., Bd. 81. S. 848-852).
Die Hybridisierungssignale auf dem Filter wurden mit dem Lumi-Imager von der Firma Röche Diagnostics quantifiziert (Figur 1).
Man erkennt, daß 1 h nach Induktion des Expressionssystems und damit verbundener Bildung von Proteinaggregaten (inclusion bodies) sowohl ibpB als auch dnaK maximal exprimiert werden. Beide Chaperone werden offensichtlich zu diesem Zeitpunkt benötigt. Umgekehrt können beide Gene als Marker für diesen speziellen physiologischen Zustand von E. coli angesehen werden.
Beispiel 2
Analyse der Expression des Gens acoA des grampositiven Bakteriums Bacillus subtilis
Für die Analyse der acoA-mRNA-Level vor und nach Glucoselimitaton wurden die Northern-blot-Analyse sowie die realtime- (RT-) PCR mit Hilfe des LightCyclers (Fa. Röche Diagnostics) nach Herstellerangaben verwendet. Die PCR-Primer für diese Analyse sollten zueinander ähnliche Eigenschaften (GC-Gehalt, Schmelzpunkt etc.) besitzen. Die Größe des entsprechenden PCR-Produkts sollte zwischen 300 und 750 bp (optimal: 500 bp) liegen. Zum Ableiten der Primersequenzen wurde das Computerprogramm „Primer 3" verwendet. Dieses Programm ist unter http://www- genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi, beziehungsweise http://www- genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi im Internet frei verfügbar (Stand 9.9.2002). Das beispielsgemäße Vorgehen wird auch in dem Artikel „Quantification of Bacterial mRNA by One-Step RT-PCR Using the LightCycler System" (2003) von S.Tobisch, T.Koburger, B.Jürgen, S.Leja, M. Hecker und T.Schweder in BIOCHEMICA, Band 3, Seiten 5 bis 8 beschrieben.
Der Stamm, der für diesen Versuch verwendet wurde, ist Bacillus subtilis 168. Die Zellen wurden in Minimalmedium (Stülke et al., 1993; J. Gen. Microbiol., Bd. 139, S. 2041- 2045) kultiviert. Die Hauptkultur wurde mit einer Übernachtkultur so beimpft, daß eine Anfangs-ODS4o nm von 0,05 erreicht wurde. Die Kultur wurde in einem kleinen Fermenter (500 ml Arbeitsvolumen) bei 37°C inkubiert. Die erste Probenahme für die RNA-Analyse erfolgte bei einer OD von 0,4 (entspricht Nullprobe in der exponentiellen Wachstumsphase, beziehungsweise vor dem Streß). Das Probenvolumen wird dabei genau auf OD 16 eingestellt ( zum Beispiel OD500 = 0,4 -> 16:0,4 = 40 ml ernten). Die zweite Probe für die RNA-Isolation erfolgte 30 min, 1 h sowie 2 h nach dem Übergang in die stationäre Wachstumsphase.
Der Aufschluß der Zellen erfolgte mit dem Gerät RiboLyser (Fa. ThermoLifeSciences) durch eine mechanische Zerstörung der Zellen durch die im Reaktionsgefäß vorhandenen Glaskügelchen (Glasperlen 0,1-0,11 mm 0, Fa. B. Braun Biotech) hervorgerufen durch die Drehbewegungen des RiboLysers. Um RNAse-Aktivität zu vermeiden, wird dem Reaktionsansatz saures Phenol zugesetzt. Nach dem Zellaufschluß werden die Reaktionsgefäße auf Eis gestellt, um sie etwas abkühlen zu lassen.
Die RNA-Isolation und Reinigung erfolgte mit dem KingFisher (Fa. ThermoLifeSciences). Der KingFisher ist ein Pipettierautomat. Es werden an Magnetpartikel gebundene biologische Substanzen mittels Stabmagneten in verschiedene Reaktionsgefäße überführt. Zur Isolation der gesamten RNA aus den aus lysierten Zellen wird der KingFisher in Kombination mit dem MagNA Pure LC RNA Isolation Kit I (Fa. Röche Diagnostics) genutzt. Das Gerät wird bei 4°C betrieben.
Die Analyse der acoA-mRNA Mengen vor und nach dem Streß erfolgte mit Hilfe der Northern-blot-Analysen nach Standard-Protokollen. Das Ergebnis ist in Figur 2 dargestellt. Tabelle 4: Über Quantifizierung der Signale der Northem-blot-Analyse von Figur 2 ermittelte Expressionsniveaus des Gens acoA zu verschiedenen Zeitpunkten während das Wachstums von ß. subtilis.
Man erkennt, daß das Gen acoA in der frühen stationären Phase maximal exprimiert wird, daß hier also im vorliegenden Beispiel Glucose-Limation aufgetreten ist. Dieses Gen kann also als Markergen für diesen speziellen physiologischen Zustand von ß. subtilis angesehen werden, beziehungsweise eine erfindungsgemäße Sonde für dieses Gen sollte diesen Zustand anzeigen können.
Beispiel 3
Analyse mRNA-Niveaus der Gene dnaK und sigB des grampositiven Bakteriums
Bacillus Hcheniformis bei Hitzeschock
Die Bestimmung der dnaK- und grs/ß-mRNA-Mengen von ß. licheniformis-ZeWen während eines Hitzeschocks wurde mittels Northem-blot-Analyse durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden Zellen des Stammes ß. Hcheniformis DSM16 in LB-Medium bei 37°C kultiviert. Mit einer Vorkultur im logarithmischen Wachstumszustand wurde die Fermenterkultur so beimpft, daß eine OD5oo von ca. 0,05 erreicht wurde. Bei einer OD von 0,4 wurde die erste Probe für die RNA-Isolation genommen. Diese Probe stellt die Kontrolle dar. Der Hitzestreß erfolgte für 10 Minuten bei 54°C. Im Anschluß daran wurde wiederum eine Zellprobe für die RNA-Isolation entnommen.
Die Zellen beider Proben (Kontrolle, Streß) wurden wiederum mittels des Geräts RiboLyser (siehe oben) aufgeschlossen. Aus dem Lysat wurde mit Hilfe des Geräts KingFisher (siehe oben) und des MagNA Pure LC RNA Isolation Kit I (siehe oben) die Gesamt-RNA isoliert. Definierte Mengen der isolierten RNA wurden wiederum nach Standardmethoden über Gelelektrophorese aufgetrennt und wie oben mit einer Digoxigenin-markierten spezifischen DNA-Sonde nach Herstellerangaben hybridisiert. Die Sonden zur Detektion der jeweiligen mRNA wurden nach Standard-Methoden mit der T7 RNA Polymerase von PCR-Produkten dieser Gene synthetisiert, die jeweils in Vektoren mit T7-Promotor kloniert worden waren. Das Ergebnis der Hybridisierungen mit der dnaK- und der sigB- spezifischen Sonde ist in Figur 3 A, beziehungsweise B dargestellt.
Man erkennt, daß beide Sonden für die Hitzeschocksituation ein Signal ergeben, das über dem der Kontrolle liegt, wobei die cfnaK-Sonde gegenüber der Kontrolle ein besonders klares Ergebnis liefert.
Beispiel 4
Analyse der Expression des Gens acoA des grampositiven Bakteriums Bacillus subtilis über erfindungsgemäße DNA-Chips
Analog zu Beispiel 2 wurde hier der aco/A-mRNA-Spiegel im Verlauf einer Fermentation untersucht, und zwar unter Einsatz erfindungsgemäßer DNA-Chips und zum Vergleich wiederum über rea/./me-RT-PCR. Dafür wurde wie in Beispiel 2 ß. subtilis 168 in einem 500 ml-Fermenter in Minimalmedium bei 37°C kultiviert. Zu regelmäßigen Zeitpunkten wurden Proben für die RNA-Analyse genommen, die Zellen in der beschriebenen Weise über das Gerät RiboLyser (Fa. ThermoLifeSciences) aufgeschlossen und die RNA (jeweils 10 μg Gesamt-RNA) wiederum über das Gerät KingFisher (Fa. ThermoLifeSciences) isoliert und gereinigt. Die acoA-mRNA enthaltenden Proben wurden sodann auf zwei verschiedene Arten quantifiziert: (A) wie in Beispiel 2 beschrieben über eine rea/f/me-RT-PCR mit Hilfe des LightCyclers (Fa. Röche Diagnostics) und (B) über erfindungsgemäße Chips, die mit Sonden für dieses Gen dotiert waren.
Dieser Chip war so aufgebaut wie in dem Artikel Hintsche et al. (1997), EXS, 80, S. 267- 283 und den Anmeldungen WO 00/62048 A2, WO 00/67026 A1 und WO 02/41992 (siehe oben) beschrieben. Die DNA-Sonde zur Detektion der acoA-mRNA war 20 Nukleotide lang und vom einem Bereich nahe des Anfangs des codierenden Bereichs gemäß SEQ ID NO. 1 abgeleitet. Das Ergebnis ist in Figur 5 dargestellt Aus dem Kurvenverlauf in Figur 5 A, der die über den RT-PCR-Light-Cycler ermittelten relativen Absorptionen wiedergibt, geht hervor, daß das bei Glukosemangel induzierte Gen (vergleiche Beispiel 2) bis zum Zeitpunkt 5 zunehmend exprimiert wird, danach das Niveau der zugehörigen mRNA wieder leicht absinkt, um gegen Ende, zum Zeitpunkt 8, ein deutlich höheres Maximum zu erreichen. Gegen Ende der Fermentation waren die C-Quellen des Fermentationsmediums also bereits stark verbraucht, so daß sich für die Zellen ein Glucosemangel einstellte. Diese Meßwerte sind, wie die Fehlerbalken in Figur 5 A zeigen, allerdings mit einer starken Schwankungsbreite behaftet.
Figur 5 B, die den Verlauf der in nA angegebenen, über einen erfindungsgemäßen Elektro-Chip erhaltenen elektrischen Signale wiedergibt, zeigt prinzipiell den gleichen Kurvenverlauf, insbesondere das starke Ansteigen der Glucoselimitation gegen Ende der Fermentation. Das in A abzulesende Zwischenmaximum nach 5 h geht hieraus nicht hervor, doch lassen die Fehlerbalken in Figur A auch zu, daß hier in der Tat kein Maximum gelegen hat.
Der Vergleich beider Kurven lehrt, daß beide Meßtechniken prinzipiell gleiche Ergebnisse liefern. Ein deutlicher Vorteil der erfindungsgemäßen Chip liegt jedoch in der signifikant geringeren Schwankungsbreite der erhaltenen Daten.
Beispiel 5
Monitoring des Produkt-Gens aprE mittels RT-PCR sowie mit einem erfindungsgemäßen elektrischen Chip während der Fermentation von B. Hcheniformis DSM 13
In diesem Beispiel wird der Verlauf der Expression des Gens aprE durch Bacillus Hcheniformis DSM13 untersucht. Dabei handelt es sich um das für eine extrazelluläre alkalische Protease dieses Stamms (Subtilisin E) natürlicherweise codierende Gen, welches in vivo während der stationären Wachstumsphase induziert wird. Diese Analyse entspricht in der Anwendung der vorliegenden Erfindung dem Monitoring eines interessierenden Produkt-Gens bei der fermentativen Herstellung des interessierenden Proteins durch einen solchen Mikroorganismus. Hierfür wurden Zellen des Stamms ß. Hcheniformis DSM13 in Minimalmedium (Stülke et al., (1993), J. Gen. Microbiol., Band 139, Seiten 2041 - 2045) kultiviert. Die Hauptkultur wurde mit einer Übernachtkultur so beimpft, daß eine Anfangs-OD bei 540 nm von 0,05 erreicht wurde. Die Kulturen wurden in jeweils 1 I Medium in 5 I-Schüttelkolben bei 37°C inkubiert und zu in Figur 6 angegebenen Zeitpunkten Proben genommen. Diese wurden wie in den Beispielen 2 und 4 beschrieben aufgearbeitet und die für die alkalische Protease AprE codierende mRNA sowohl über einen RT-PCR-Light-Cycler als auch über einen erfindungsgemäßen elektrischen DNA-Chip nachgewiesen. Letzterer war mit einer für dieses Gen spezifischen Sonde dotiert, die 20 Nukleotide lang und von einem Bereich nahe des Anfangs des codierenden Bereichs des zugehörigen, aus ß. Hcheniformis bekannten Gens abgeleitet worden war.
Das Ergebnis ist in Figur 6 dargestellt. Hieraus gehen die Zelldichte, angegeben in optischer Dichte bei 500 nm (ODδOOnm), der Anteil der über den LightCycler ermittelten spezifischen mRNA an der Gesamt-RNA, angegeben in Moleküklen pro μg (LightCycler) und die zu zwei Zeitpunkten ermittelten Signale des mit der aprE-Sonde dotierten elektrischen Biochips in nA (EBC) hervor.
Die Daten zeigen, daß die Expression des Gens aprE nach 4 h, also mit Beginn der stationären Phase nachweisbar ist und anschließend ansteigt. Diese Beobachtung korreliert mit der bekannten Regulation des Gens durch einen Stationärphasenpromoter.
Beispiel 6
Monitoring des Phosphatmangel anzeigenden Gens pstS mittels RT-PCR sowie mit einem erfindungsgemäßen elektrischen Chip während der Fermentation von B. Hcheniformis DSM 13
In diesem Beispiel wird der Verlauf der Expression des Gens pstS durch Bacillus Hcheniformis DSM13 untersucht. Dabei handelt es sich wie in Tabelle 2 dargestellt um das für ein Phosphat-bindendes Protein codierendes Gen, das von diesem Stamm in vivo bei Phosphat-Hunger induziert wird. Diese Analyse entspricht in der Anwendung der vorliegenden Erfindung dem Monitoring eines entsprechenden Streßsignals bei der Fermentation solch eines Mikroorganismus. Hierfür wurden Zellen des Stamms ß. Hcheniformis DSM13 ähnlich wie in Beispiel 5 in Minimalmedium kultiviert. Die Hauptkultur wurde mit einer Übemachtkultur so beimpft, daß eine Anfangs-OD bei 540 nm von 0,05 erreicht wurde. Die Kulturen wurden in jeweils 500 ml Medium in einem Fermenter Biostat Q der Fa. Braun Biotech International (Melsungen) bei 37°C inkubiert. Zu einem Zeitpunkt während der exponentiellen Wachstumsphase (0 min in Figur 7) wurden dem Medium 1,5 μM KH2PO4 zugesetzt. Dies führt zu einem Zustand des Phosphatmangels, der sich auf die Expression des Gens pstS auswirken sollte.
Zu den in Figur 7 angegebenen Zeitpunkten wurden wie in den Beispielen 2 und 4 beschrieben Proben genommen, diese aufgearbeitet und die für das Phosphat-bindende Protein PstS codierende mRNA sowohl über einen RT-PCR-Light-Cycler als auch über einen erfindungsgemäßen elektrischen DNA-Chip nachgewiesen. Letzterer war mit einer für dieses Gen spezifischen Sonde dotiert, die 20 Nukleotide lang und von einem Bereich nahe des Anfangs des codierenden Bereichs der unter SEQ ID NO. 115 angegebenen DNA-Sequenz abgeleitet worden war.
Das Ergebnis ist in Figur 7 dargestellt. Hieraus gehen die Zelldichte, angegeben in optischer Dichte bei 500 nm (OD500nm), der Anteil der über den LightCycler ermittelten spezifischen mRNA an der Gesamt-RNA, angegeben in Moleküklen pro μg (LightCycler) und die zu drei Zeitpunkten ermittelten Signale des mit einer ps S-Sonde dotierten elektrischen Biochips in nA (EBC) hervor.
Die Daten zeigen, einen Rückgang der Zelldichte unmittelbar nach Einsetzen des Phophatmangels und eine Erholung des Bakterienwachstums nach ca. 100 bis 150 min. Dies korreliert mit der auf beide Meßmethoden nachweisbaren Expression des Gens pstS. Somit kann erfindungsgemäß ein entsprechend dotierter Chip dazu verwendet werden, um eine Phosphatmangelsituation zu erfassen.
Beispiel 7
Monitoring des Glucoselimitation anzeigenden Gens acoA mittels RT-PCR sowie mit einem erfindunsgemäßen elektrischen Chip während der Fermentation von B. Hcheniformis DSM 13 In diesem Beispiel wird der Verlauf der Expression des Gens acoA durch Bacillus Hcheniformis DSM13 untersucht Dabei handelt es sich wie in Tabelle 2 dargestellt um das für die Acetoin-Dehydrogenase E1 -Komponente (TPP-abhhängige α-Untereinheit; E.C. 1.2.4.-) codierende Gen, das von diesem Stamm in vivo bei Glucose-Limitation induziert wird. Wie Beispiel 6 entspricht diese Analyse in der Anwendung der vorliegenden Erfindung dem Monitoring eines entsprechenden Streßsignals bei der Fermentation solch eines Mikroorganismus.
Hierfür wurden Zellen des Stamms ß. Hcheniformis DSM 13 ähnlich wie in Beispiel 5 und 6 in Minimalmedium kultiviert. Die Hauptkultur wurde mit einer Übernachtkultur so beimpft, daß eine Anfangs-OD bei 540 nm von 0,05 erreicht wurde. Die Kulturen wurden in jeweils 500 ml Medium in einem Fermenter Biostat Q der Fa. Braun Biotech International (Melsungen) bei 37°C inkubiert. Dieses Medium enthielt jedoch die geringe Menge von 0,05 Gew.-% Glucose, so daß sich vergleichsweise früh, bereits während der exponentiellen Wachstumsphase ein Glucosemangel einstellt, der sich auf die Expression des Gens acoA auswirken sollte.
Zu den in Figur 8 angegebenen Zeitpunkten wurden wie in den Beispielen 2 und 4 beschrieben Proben genommen, diese aufgearbeitet und die für die Acetoin- Dehydrogenase E1-Komponente AcoA codierende mRNA sowohl über einen RT-PCR- Light-Cycler als auch über einen erfindungsgemäßen elektrischen DNA-Chip nachgewiesen. Letzterer war mit einer für dieses Gen spezifischen Sonde dotiert, die 20 Nukleotide lang und von einem Bereich nahe des Anfangs des codierenden Bereichs der unter SEQ ID NO. 83 angegebenen DNA-Sequenz abgeleitet worden war.
Das Ergebnis ist in Figur 8 dargestellt. Hieraus gehen die Zelldichte, angegeben in optischer Dichte bei 500 nm (ODδOOnm), der Anteil der über den LightCycler ermittelten spezifischen mRNA an der Gesamt-RNA, angegeben in Moleküklen pro μg (LightCycler) und die zu drei Zeitpunkten ermittelten Signale des mit der pstö-Sonde dotierten elektrischen Biochips in nA (EBC) hervor.
Die Daten zeigen, ein verhalteneres Wachstum als beispielsweise in Figur 6 und das Einsetzen der Expression des Markergens acoA nach ca. 130 min als Reaktion auf die Glukosemangelsituation. Somit kann erfindungsgemäß ein entsprechend dotierter Chip dazu verwendet werden, um eine Glucosemangelsituation zu erfassen. Beispiel 8
Beispielbeladung für eine Fermentation zur Proteaseherstellung mit einem
Produktionsorganismus der Gattung Bacillus
Analog den vorangegangenen Beispielen wird ein erfindungsgemäßer Chip zur Erfassung einer Fermentation eines für technische Fermentationen etablierten Produktionsorganismus der Gattung Bacillus gleichzeitig mit mehreren Sonden dotiert, und zwar für folgende Gene (Tabelle 5. Teil 1):
Diese Sonden werden entsprechend den in der Beschreibung gemachten Angaben vorteilhafterweise aus den hier zitierten, im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen abgeleitet.
In diesem Beispiel wird analog Beispiel 5 die fermentative Herstellung einer Protease verfolgt. Dafür wird ein entsprechender Chip zusätzlich mit Sonden für folgende Gene bestückt (Tabelle 5. Teil 2.:
In diesem Fall ist die die Wachstumsdaten (Nr. 1 bis 7) ergänzende Beobachtung des Stickstoffmetabolismus deshalb sinnvoll, weil sich die Bildung des interessierenden, vorzugsweise überexprimierten Gens auf die Verwertung von N-Quellen auswirkt und dementsprechend im Verlauf einer erfolgreichen Fermentation der Stickstoffmetabolismus angeregt wird. Dies ergänzt oder ersetzt Fermentationsbegleitende Assays auf die Enzymaktivität.
Beispiel 9
Beispielbeladung für eine Fermentation zur Amylaseherstellung mit einem
Produktionsorganismus der Gattung Bacillus
Zur Beobachtung einer Fermentation zur Herstellung einer Amylase mit einem Produktionsorganismus der Gattung Bacillus wird ein erfindungsgemäßer Chip mit Sonden für dieselben Gene dotiert wie in Tabelle 5, Teil 1 angegeben. In diesem Beispiel • wird analog Beispiel 8 die fermentative Herstellung einer Amylase verfolgt. Dafür wird ein entsprechender Chip zusätzlich mit Sonden für folgende Gene bestückt (Tabelle 6):
In diesem Fall ist die die Wachstumsdaten (Nr. 1 bis 7) ergänzende Beobachtung des C- Metabolismus deshalb sinnvoll, weil sich die Bildung des interessierenden, vorzugsweise überexprimierten Gens auf die Verwertung von C-Quellen auswirkt und dementsprechend im Verlauf einer erfolgreichen Fermentation der Glucosestoffwechsel angeregt wird. Dies ergänzt oder ersetzt Fermentations-begleitende Assays auf die Enzymaktivität. Beschreibung der Figuren
Figur 1 : ibpB und dnaK als Markergene des gramnegativen Bakteriums
Eschenchia coli für die Bildung von Proteinaggregaten (inclusion bodies; vgl. Beispiel 1); Induktion des Expressionssystems bei Oh; ab diesem Zeitpunkt entstehen Proteinaggregate.
A: Expression des Gens ibpB; bestimmt über Isolierung der mRNA zum betreffenden Zeitpunkt, Bindung an einer Nylon-Membran und Hybridisierung mit einer /opß-spezifischen Digoxigenin-markierten Sonde.
B: Expression des Gens dnaK; bestimmt ananlog A.
Figur 2: Das Gen acoA als Markergen des gram-positiven Bakteriums Bacillus subtilis für Glukoselimitation und Acetoinanwesenheit.bestimmt über Northem-blot-Analyse mit einer acoA-Sonde (vgl. Beispiel).
A: RNA-Gel mit folgender Bahnenbelegung:
1. frühe logarithmische Phase (OD500 = 0,4)
2. Transient-Phase (Übergang von der exponentiellen zur stationären Phase)
3. frühe stationäre Phase (45 min nach Ende der logarithmischen Phase)
4. späte stationäre Phase (180 min nach Ende der logarithmischen Phase)
5. Erholung nach Zugabe von Glucose
B: Northemblot des unter A gezeigten Gels mit einer ac oA-Sonde
Figur 3: Die Gene dnaK und sigB als Markergene des gram-positiven Bakteriums
Bacillus Hcheniformis für Hitzeschock, bestimmt über Northern-blot-
Analyse mit dnaK-, beziehungsweise sgß-Sonden (vgl. Beispiel 3). A: Northemblot, getestet mit der dnaK-Sonöe; mit der folgender
Bahnenbelegung:
M Marker
Co Kontrolle
54°C Nach dem Hitzeschock von 54°C
Co Kontrolle 54°C Nach dem Hitzeschock von 54°C B: Northemblot, getestet mit der s/gß-Sonde; Bahnenbelegung wie in A.
Figur 4: Schematische Darstellung des at //'ne-Monitoring eines Bioprozesses mit erfindungsgemäßen elektrischen DNA-Chips
Die zeitnahe Überwachung des Bioprozesses geschieht vorteilhafterweise über folgende Arbeitsschritte; zusätzlich angegeben ist der jeweilige, ungefähre Zeitbedarf:
1. Probennahme (wenige Sekunden);
2. Zellaufschluß über Routine-Methoden (ca. 5 min);
3. RNA-Isolierung über Routine-Methoden (ca. 20 min);
4. Hybridisierung auf einem erfindungsgemäß mit Nukleinsäuren (beispielsweise DNA) oder Nukleinsäure-Analoga (beispielsweise schwer hydrolysierbaren, analog aufgebauten Verbindungen) beladenen Chip;
5. Erfassung der elektrischen Signale eines entsprechend konstruierten Elektro- Chips; alternativ wäre auch die Aufnahme optischer Signale von einem optischen DNA-Chip möglich;
6. Vorzugsweise Rechner-gestützte Datenauswertung (wenige Minuten).
Bei Einsatz elektrischer Chips ergibt sich eine ungefähre Gesamtanalysenzeit von ca. 2 bis 3 h, bei Einsatz konventioneller optischer DNA-Chips von ca. 12 h.
Figur 5: Vergleich der Sensitivität der Messung beim Einsatz von Elektrischen
DNA-Chips im Vergleich zu RT-PCR
Wie in Beispiel 4 beschrieben, wurde dieselbe Gesamt-RNA-Präparation einer Fed-batch Fermentation von ß. subtilis hinsichtlich des Gens acoA untersucht. A: Messung der relativen Absorptionen im RT-PCR-Light-Cycler;
B: Messung der elektrischen Signale (in nA) über einen erfindungsgemäßen
Elektro-Chip. Man erkennt deutlich den prinzipiell gleichen Kurvenverlauf, doch eine signifikant geringere Schwankungsbreite bei Einsatz eines erfindungsgemäßen Chip.
Figur 6: Monitoring des Produkt-Gens apr£ mittels RT-PCR sowie mit einem erfindungsgemäßen elektrischen Chip während der Fermentation von ß. Hcheniformis DSM 13 gemäß Beispiel 5. Dabei bedeuten:
OD500nm: Zelldichte;
LightCycler: Anteil der für sechs Zeitpunkte über den LightCycler ermittelten spezifischen mRNA an der Gesamt-RNA, angegeben in Moleküklen pro μg;
EBC: zu zwei Zeitpunkten ermittelte Signale des mit einer aptE-Sonde dotierten elektrischen Biochips in gemessenen nA.
Figur 7: Monitoring des Phosphatmangel anzeigenden Gens pstS mittels RT-PCR sowie mit einem erfindungsgemäßen elektrischen Chip während der Fermentation von ß. Hcheniformis DSM 13 gemäß Beispiel 6.
Dabei bedeuten:
OD500nm: Zelldichte;
LightCycler: Anteil der für fünf Zeitpunkte über den LightCycler ermittelten spezifischen mRNA an der Gesamt-RNA, angegeben in Moleküklen pro μg;
EBC: zu drei Zeitpunkten ermittelte Signale des mit einer ps.S-Sonde dotierten elektrischen Biochips in gemessenen nA.
Figur 8: Monitoring des Glucoselimitation anzeigenden Gens acoA mittels RT-PCR sowie mit einem erfindunsgemäßen elektrischen Chip während der Fermentation von ß. Hcheniformis DSM 13 gemäß Beispiel 7.
Dabei bedeuten:
OD500nm: Zelldichte;
LightCycler: Anteil der für fünf Zeitpunkte über den LightCycler ermittelten spezifischen mRNA an der Gesamt-RNA, angegeben in Moleküklen pro μg;
EBC: zu drei Zeitpunkten ermittelte Signale des mit einer acoA-Sonde dotierten elektrischen Biochips in gemessenen nA.

Claims

Patentansprüche
1. Chip, dotiert mit Nukleinsäure- oder Nukleinsäure-Analogon-Sonden für mindestens vier der folgenden Gene: acoA, ahpC, ahpF, citB, clpC, clpP, codY, cspA, cspB, des, dnaK, eno, glnR, groEL, groL, gsiB, ibpA, ibpB, katA, katE, IctP, Idh, opuAB, phoA, phoD, pstS, purC, purN, pyrB, pyrP, sigB, tnrA, trxA und ydjF, beziehungsweise für im betrachteten Organismus gleich regulierte Gene aus den jeweils durch diese Gene gekennzeichneten Stoffwechselwegen.
2. Chip nach Anspruch 1, dotiert mit zunehmend bevorzugt mindestens 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 28, 30, 32 oder 34 der genannten Sonden.
3. Chip nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dotiert mit Sonden, die aus der Gruppe der Gene acoA, ahpC, ahpF, citB, clpC, clpP, codY, cspB, des, dnaK, eno, glnR, groEL, gsiB, katA, katE, IctP, Idh, opuAB, phoA, phoD, pstS, purC, purN, pyrB, pyrP, sigB, tnrA, trxA und ydjF, beziehungsweise für im betrachteten Organismus gleich regulierte Gene aus den jeweils durch diese Gene gekennzeichneten Stoffwechselwegen ausgewählt sind.
4. Chip nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dotiert mit Sonden, die aus der Gruppe der Gene clpP, cspA, cspB, dnaK, groL, ibpA, ibpB, katE, phoA, pstS, und trxA, beziehungsweise für im betrachteten Organismus gleich regulierte Gene aus den jeweils durch diese Gene gekennzeichneten Stoffwechselwegen ausgewählt sind.
5. Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß von folgenden Genpaaren jeweils nur eines oder ein anderes im betrachteten Organismus gleich reguliertes Gen aus dem jeweils durch eines dieser Gene gekennzeichneten Stoffwechselweg vorhanden ist: ahpC oder ahpF; clpC oder clpP; cspA oder cspB; ibpA oder ibpB; IctP oder Idh; phoA oder phoD; purC oder purN; pyrB oder pyrP.
6. Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Sonden handelt, die auf die betreffenden Gene aus dem für den Bioprozeß gewählten Organismus ansprechen, vorzugsweise solche, die von Genen dieses Organismus abgeleitet sind.
7. Chip nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem für den Bioprozeß ausgewählten Organismus um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer Bakterien handelt.
8. Chip nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen oder um Pilze handelt, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders Sacharomyces oder Schizosaccharomyces.
9. Chip nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme Bakterien oder solche der Gattung Bacillus handelt, hierunter inbesondere ß. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. Hcheniformis, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. lentus oder ß. globigii.
10. Chip nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den gramnegativen Bakterien um solche der Gattungen Eschenchia coli oder Klebsiella handelt.
11. Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine, zunehmend bevorzugt mehrere Sonden von den Sequenzen abgeleitet sind, die im Sequenzprotokoll unter den Nummern SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121 , 123 und 125 aufgeführt sind.
12. Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 11, zusätzlich dotiert mit mindestens einer Sonde für ein zusätzliches Gen, insbesonderen einem solchen, das in einem Stoffwechsel-bedingten Zusammenhang zu dem oder den prozeßbedingt zusätzlich exprimierten Gen(en) steht, ganz besonders für eines von diesen oder dieses selbst.
13. Chip nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem prozeßbedingt zusätzlich exprimierten Gen um das für ein gewerblich einsetzbares Protein handelt, insbesondere um eine Amylase, Cellulase, Lipase, Oxidoreduktase oder Protease, oder um eines, das auf einem Syntheseweg für eine niedermolekulare chemische Verbindung liegt oder diesen wenigstens zum Teil reguliert.
14. Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß eine, bevorzugt mehrere Sonden einzelsträngig, in Form des codogenen Strangs bereitgestellt werden.
15. Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß eine, bevorzugt mehrere Sonden in Form einer DNA, vorzugsweise eines Nukleinsäureanalogs zur Verfügung gestellt werden.
16. Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß eine, bevorzugt mehrere Sonden Genbereiche umfassen, die von dem zu untersuchenden Organismus in mRNA umgeschrieben werden, insbesondere die Genbereiche, die nahe dem 5'-Ende der mRNA liegen.
17. Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß eine, bevorzugt mehrere Sonden auf Fragmente der betreffenden Nukleinsäuren ansprechen, insbesondere auf solche, die in der betreffenden mRNA, bezogen auf die jeweilige Gesamt-mRNA ein geringes Maß an Sekundärfaltung aufweisen.
18. Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß eine, bevorzugt mehrere Sonden eine Länge von weniger als 100 Nukleotiden, vorzugsweise von 20 bis 60 Nukleotiden, besonders bevorzugt von 45 bis 55 Nukleotiden aufweisen.
19. Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß durch die Bindung der mRNA an die betreffende Sonde ein elektrisches Signal ausgelöst wird.
20. Verwendung von Nukleinsäure- oder Nukleinsäure-Analogon-Sonden für mindestens vier der folgenden Gene: acoA, ahpC, ahpF, citB, clpC, clpP, codY, cspA, cspB, des, dnaK, eno, glnR, groEL, groL, gsiB, ibpA, ibpB, katA, katE, IctP, Idh, opuAB, phoA, phoD, pstS, purC, purN, pyrB, pyrP, sigB, tnrA, trxA und ydjF, beziehungsweise für im betrachteten Organismus gleich regulierte Gene aus den jeweils durch diese Gene gekennzeichneten Stoffwechselwegen, gebunden an einen in den Ansprüchen 1 bis 19 bezeichneten Chip zur Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus.
21. Verwendung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine, zunehmend bevorzugt mehrere Sonden von den Sequenzen abgeleitet sind, die im Sequenzprotokoll unter den Nummern SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123 und 125 aufgeführt sind.
22. Verfahren zur Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus durch Einsatz eines Chips nach einem der Ansprüche 1 bis 19.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem für den Bioprozeß ausgewählten Organismus um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer Bakterien handelt.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen oder um Pilze handelt, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders Sacharomyces oder Schizosaccharomyces.
25. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme Bakterien oder solche der Gattung Bacillus handelt, hierunter inbesondere ß. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. Hcheniformis, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. lentus oder ß. globigii, hierunter besonders bevorzugt mit Sonden, die von den im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen aus ß. subtilis oder ß. Hcheniformis (SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11 , 15, 19, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 43, 45, 49, 51 , 53, 55, 59, 61, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 81 , 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111 , 113, 115, 117, 119, 121, 123 und/oder 125) abgeleitet sind.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ß. subtilis oder ß. Hcheniformis handelt, wobei für ß. subtilis die Sonden von den im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen aus ß. subtilis (SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11 , 15, 19, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 43, 45, 49, 51, 53, 55, 59, 61, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77 und/oder 81) abgeleitet sind, beziehungsweise für ß. Hcheniformis die Sonden von den im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen aus ß. Hcheniformis (SEQ ID NO. 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 111 , 113, 115, 117, 119, 121, 123 und/oder 125) abgeleitet sind.
27. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den gramnegativen Bakterien um solche der Gattungen Eschenchia coli oder Klebsiella handelt, bevorzugt mit Sonden, die von den im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen aus £. coli (SEQ ID NO. 13, 17, 21, 27, 35, 39, 41, 47, 57, 63 und/oder 79) abgeleitet sind.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um £ coli handelt
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung des physiologischen Zustands zu verschiedenen Zeitpunkten desselben Prozesses durchgeführt wird, optional unter Einsatz mehrerer baugleicher Chips.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 29, wobei es sich bei dem Prozeß um eine Fermentation, insbesondere um die fermentative Herstellung eines gewerblich einsetzbaren Produkts, besonders bevorzugt um die Herstellung eines Proteins oder einer niedermolekularen chemischen Verbindung handelt.
31. Verwendung eines Chips nach einem der Ansprüche 1 bis 19 zur Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus.
32. Verwendung nach Anspruch 20, 21 oder 31, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem für den Bioprozeß ausgewählten Organismus um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer Bakterien handelt.
33. Verwendung nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen oder um Pilze handelt, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders Sacharomyces oder Schizosaccharomyces.
34. Verwendung nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme Bakterien oder solche der Gattung Bacillus handelt, hierunter inbesondere ß. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. Hcheniformis, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. lentus oder ß. globigii, hierunter besonders bevorzugt mit Sonden, die von den im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen aus ß. subtilis oder ß. Hcheniformis (SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11 , 15, 19, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 43, 45, 49, 51, 53, 55, 59, 61, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123 und/oder 125) abgeleitet sind.
35. Verwendung nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um B. subtilis oder ß. Hcheniformis handelt, wobei für ß. subtilis die Sonden von den im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen aus ß. subtilis (SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11 , 15, 19, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 43, 45, 49, 51 , 53, 55, 59, 61 , 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77 und/oder 81) abgeleitet sind, beziehungsweise für ß. Hcheniformis die Sonden von den im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen aus ß. Hcheniformis (SEQ ID NO. 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121 , 123 und/oder 125) abgeleitet sind.
36. Verwendung nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den gramnegativen Bakterien um solche der Gattungen Eschenchia coli oder Klebsiella handelt, bevorzugt mit Sonden, die von den im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen aus E. coli (SEQ ID NO. 13, 17, 21, 27, 35, 39, 41, 47, 57, 63 und/oder 79) abgeleitet sind.
37. Verwendung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um £. coli handelt.
38. Verwendung nach einem der Ansprüche 20, 21 oder 31 bis 37, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung des physiologischen Zustands zu verschiedenen Zeitpunkten desselben Prozesses durchgeführt wird, optional unter Einsatz mehrerer baugleicher Chips.
39. Verwendung nach einem der Ansprüche 20, 21 oder 31 bis 38, wobei es sich bei dem Prozeß um eine Fermentation, insbesondere um die fermentative Herstellung eines gewerblich einsetzbaren Produkts, besonders bevorzugt um die Herstellung eines Proteins oder einer niedermolekularen chemischen Verbindung handelt.
40. Alpha-Untereinheit der Acetoin-Dehydrogenase E1-Komponente (AcoA; E.C.1.2.4.-) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 84 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 74% und zunehmend bevorzugt zu 80%, 90% und 100% identisch ist.
41. Für eine Alpha-Untereinheit der Acetoin-Dehydrogenase E1-Komponente (AcoA; E.C.1.2.4.-) codierende Nukleinsäure (acoA) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 83 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 85% und zunehmend bevorzugt zu 90%, 95% und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 872 gemäß SEQ ID NO. 83 entspricht.
42. Kleine Untereinheit der Alkylhydroperoxid-Reductase (AhpC; E.C.1.6.4.-) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 86 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 95% und zunehmend bevorzugt zu 97%, 98% und 100% identisch ist.
43. Für eine Kleine Untereinheit der Alkylhydroperoxid-Reductase (AhpC; E.C.1.6.4.-) codierende Nukleinsäure (ahpC) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 85 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 91% und zunehmend bevorzugt zu 94%, 97% und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 764 gemäß SEQ ID NO. 85 entspricht.
44. Große Untereinheit der Alkylhydroperoxid-Reductase / NADH-Dehydrogenase (AhpF; E.C.1.6.99.3) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 88 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 92% und zunehmend bevorzugt zu 95%, 97,5% und 100% identisch ist.
45. Für eine Große Untereinheit der Alkylhydroperoxid-Reductase / NADH- Dehydrogenase (AhpF; E.C.1.6.99.3) codierende Nukleinsäure (ahpF) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 87 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 87% und zunehmend bevorzugt zu 90%, 95% und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 1730 gemäß SEQ ID NO. 87 entspricht.
46. Aconitase-Hydratase (CitB; E.C.4.2.1.3) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 90 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 93% und zunehmend bevorzugt zu 95%, 97,5% und 100% identisch ist.
47. Für eine Aconitase-Hydratase (CitB; E.C.4.2.1.3) codierende Nukleinsäure (citB) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 89 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 93% und zunehmend bevorzugt zu 95%, 97,5% und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 2927 gemäß SEQ ID NO. 89 entspricht.
48. Klasse Ill-Streßantwort-verbundene ATPase (ClpC) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 92 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 95% und zunehmend bevorzugt zu 96,5%, 98% und 100% identisch ist.
49. Für eine Klasse Ill-Streßantwort-verbundene ATPase (ClpC) codierende Nukleinsäure (clpC) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 91 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 84% und zunehmend bevorzugt zu 90%, 95% und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 2633 gemäß SEQ ID NO. 91 entspricht.
50. Proteolytische Untereinheit der ATP-abhängigen Protease, (Klasse III- Hitzeschockprotein; E.C. 3.4.21.92; CIpP) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 94 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 97% und zunehmend bevorzugt zu 98%, 99% und 100% identisch ist.
51. Für eine Proteolytische Untereinheit der ATP-abhängigen Protease, (Klasse III- Hitzeschockprotein; E.C. 3.4.21.92; CIpP) codierende Nukleinsäure (clpP) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 93 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 86% und zunehmend bevorzugt zu 90%, 95% und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 1 bis 549 gemäß SEQ ID NO. 93 entspricht.
52. Pleitroper Transkriptionsrepressor (CodY) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 96 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 92% und zunehmend bevorzugt zu 94%, 97% und 100% identisch ist.
53. Für einen Pleitroper Transkriptionsrepressor (CodY) codierende Nukleinsäure (codY) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 95 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 88% und zunehmend bevorzugt zu 92%, 96% und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 980 gemäß SEQ ID NO. 95 entspricht.
54. Haupt-Kälteschock-Protein (CspB) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 98 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 98% und zunehmend bevorzugt zu 98,5%, 99% und 100% identisch ist.
55. Für ein Haupt-Kälteschock-Protein (CspB) codierende Nukleinsäure (cspB) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 97 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 97% und zunehmend bevorzugt zu 98%, 99% und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 401 gemäß SEQ ID NO. 97 entspricht.
56. Fettsäure-Desaturase (Des; E.C.1.14.99.-) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 100 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 73% und zunehmend bevorzugt zu 80%, 90% und 100% identisch ist.
57. Für eine Fettsäure-Desaturase (Des; E.C.1.14.99.-) codierende Nukleinsäure (des) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 99 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 88% und zunehmend bevorzugt zu 93%, 97% und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 1229 gemäß SEQ ID NO. 99 entspricht.
58. Klasse I-Hitzeschockprotein (molekulares Chaperon; DnaK) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 102 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 94% und zunehmend bevorzugt zu 96%, 98% und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 1 bis 480 gemäß SEQ ID NO. 102 entspricht.
59. Für ein Klasse I-Hitzeschockprotein (molekulares Chaperon; DnaK) codierende Nukleinsäure (dnaK) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 101 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 88% und zunehmend bevorzugt zu 92%, 96% und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 1 bis 1440 gemäß SEQ ID NO. 101 entspricht.
60. Enolase (Eno; E.C.4.1.2.11) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 104 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 98% und zunehmend bevorzugt zu 98,5%, 99% und 100% identisch ist
61. Für eine Enolase (Eno; E.C.4.1.2.11) codierende Nukleinsäure (eno) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 103 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 94% und zunehmend bevorzugt zu 96%, 98% und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 1493 gemäß SEQ ID NO. 103 entspricht.
62. Transkriptionsrepressor des Glutamin-Synthetase-Gens (GlnR) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 106 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 83% und zunehmend bevorzugt zu 90%, 95% und 100% identisch ist.
63. Für einen Transkriptionsrepressor des Glutamin-Synthetase-Gens (GlnR) codierende Nukleinsäure (glnR) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 105 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 91% und zunehmend bevorzugt zu 93%, 96% und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 608 gemäß SEQ ID NO. 105 entspricht.
64. Klasse-I-Hitzeschockprotein (Chaperonin; GroEL) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 108 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 96% und zunehmend bevorzugt zu 97%, 98% und 100% identisch ist.
65. Für ein Klasse-I-Hitzeschockprotein (Chaperonin; GroEL) codierende Nukleinsäure (groEL) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 107 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 90% und zunehmend bevorzugt zu 93%, 96% und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 1835 gemäß SEQ ID NO. 107 entspricht
66. Catalase (KatA; E.C.1.11.1.6) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 110 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 90% und zunehmend bevorzugt zu 93%, 96% und 100% identisch ist.
67. Für eine Catalase (KatA; E.C.1.11.1.6) codierende Nukleinsäure (katA) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 109 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 86% und zunehmend bevorzugt zu 90%, 95% und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 1661 gemäß SEQ ID NO. 109 entspricht.
68. Catalase (KatE; E.C.1.11.1.6) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 112 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 74% und zunehmend bevorzugt zu 80%, 90% und 100% identisch ist.
69. Für eine Catalase (KatE; E.C.1.11.1.6) codierende Nukleinsäure (katE) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 111 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 85% und zunehmend bevorzugt zu 90%, 95% und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 1661 gemäß SEQ ID NO. 111 entspricht.
70. Glycin-Betain-ABC-Transporter (OpuAB) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 114 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 82% und zunehmend bevorzugt zu 85%, 92,5% und 100% identisch ist.
71. Für einen Glycin-Betain-ABC-Transporter (OpuAB) codierende Nukleinsäure (opuAB) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 113 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 85% und zunehmend bevorzugt zu 90%, 95% und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 1055 gemäß SEQ ID NO. 113 entspricht.
72. Phosphat-bindendes Protein (PstS) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 116 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 82% und zunehmend bevorzugt zu 88%, 93% und 100% identisch ist.
73. Für ein Phosphat-bindendes Protein (PstS) codierende Nukleinsäure (pstS) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 115 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 84% und zunehmend bevorzugt zu 90%, 95% und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 1118 gemäß SEQ ID NO. 115 entspricht
74. Phosphoribosylaminoimidazol-Succinocarboxamid-Synthetase (PurC; E.C. 6.3.2.6) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 118 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 90% und zunehmend bevorzugt zu 93%, 96% und 100% identisch ist
75. Für eine Phosphoribosylaminoimidazol-Succinocarboxamid-Synthetase (PurC; E.C. 6.3.2.6) codierende Nukleinsäure (purC) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 117 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 89% und zunehmend bevorzugt zu 95%, 98% und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 917 gemäß SEQ ID NO. 117 entspricht.
76. Phosphoribosylglycinamid-Formyltransferase (PurN; E.C. 2.1.2.2) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 120 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 76% und zunehmend bevorzugt zu 80%, 90% und 100% identisch ist.
77. Für eine Phosphoribosylglycinamid-Formyltransferase (PurN; E.C. 2.1.2.2) codierende Nukleinsäure (purN) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 119 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 84% und zunehmend bevorzugt zu 90%, 95% und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 788 gemäß SEQ ID NO. 119 entspricht.
78. Uracil-Permease (PyrP) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 122 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 69% und zunehmend bevorzugt zu 80%, 90% und 100% identisch ist.
79. Für eine Uracil-Permease (PyrP) codierende Nukleinsäure (pyrP) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 121 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 89% und zunehmend bevorzugt zu 92%, 96% und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 1505 gemäß SEQ ID NO. 121 entspricht.
80. RNA-Polymerase-spezifischer genereller (alternativer) Streß-Sigma-Faktor (SigB) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 124 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 85% und zunehmend bevorzugt zu 90%, 95% und 100% identisch ist.
81. Für einen RNA-Polymerase-spezifischen generellen (alternativen) Streß-Sigma- Faktor (SigB) codierende Nukleinsäure (sigB) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 123 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 98% und zunehmend bevorzugt zu 98,5%, 99% und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 998 gemäß SEQ ID NO. 123 entspricht.
82. Thioredoxin (TrxA) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 126 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 98,5% und zunehmend bevorzugt zu 99%, 99,5% und 100% identisch ist.
83. Für ein Thioredoxin (TrxA) codierende Nukleinsäure (trxA) mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 125 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 93% und zunehmend bevorzugt zu 95%, 97% und 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleotidpositionen 201 bis 515 gemäß SEQ ID NO. 125 entspricht.
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102004013988A1 (de) * 2004-03-19 2005-10-13 Henkel Kgaa Der Faktor RecA aus Bacillus licheniformis und recA-inaktivierte Sicherheitsstämme für die biotechnologische Produktion
WO2006073514A2 (en) * 2004-08-25 2006-07-13 Tufts University Compositions, methods and kits for repressing virulence in gram positive bacteria
DE102004061664A1 (de) * 2004-12-22 2006-07-06 Henkel Kgaa Nukleinsäure-bindende Chips zur Detektion von Phosphatmangelzuständen im Rahmen der Bioprozesskontrolle
DE102005022145A1 (de) * 2005-05-13 2006-11-16 Henkel Kgaa Nukleinsäure-bindende Chips zur Detektion von Glucosemangelzuständen im Rahmen der Bioprozeßkontrolle
DE102005042572A1 (de) * 2005-09-08 2007-03-15 Henkel Kgaa Nukleinsäure-bindende Chips zur Detektion von Stickstoffmangelzuständen im Rahmen der Bioprozeßkontrolle
EP1772522A1 (de) * 2005-10-04 2007-04-11 Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno Kontrolle der Konservierung mit Biomarkern
EP2643452A4 (de) * 2010-11-22 2014-07-02 Univ Florida Manipulation eines wärmetoleranten gerinnungs-bacillus zur herstellung von d(-)-milchsäure
EP3688166A4 (de) * 2017-09-28 2021-06-23 Precision Fermentation, Inc. Verfahren, vorrichtungen und computerprogrammprodukte zur hefeleistungsüberwachung in fermentationssystemen
EP3763828A1 (de) * 2019-07-08 2021-01-13 Nemri, Adnane Verfahren zur überwachung von fermentationsprozessen, vorrichtung und system dafür
AU2022226582A1 (en) 2021-02-24 2023-09-07 Precision Fermentation , Inc. Devices and methods for monitoring

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6582908B2 (en) * 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
IL107815A (en) * 1992-12-04 2003-12-10 Du Pont Genetic constructs comprising a stress-responsive promoter linked to a lux reporter operon and methods of use in environmental testing
DE19860313B4 (de) * 1998-12-24 2007-10-11 Felsenstein, Friedrich, Dr. Verfahren zur Erkennung und Charakterisierung von Wirkstoffen gegen Pflanzen-Pathogene
DE19916867A1 (de) * 1999-04-14 2000-10-19 Fraunhofer Ges Forschung Anordnung und Verfahren zur Herstellung planarer Arrays mit immobilisierten Molekülen
DE10108841A1 (de) * 2000-08-31 2002-03-14 Degussa Neue für das citB-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
EP1313856B1 (de) * 2000-08-31 2007-03-21 Degussa GmbH Citb gen aus corynebakterien und seine verwendung zur herstellung von l-aminosäuren
DE10136987A1 (de) * 2000-09-09 2002-03-21 Degussa Für das clpC-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
EP1315744A1 (de) * 2000-09-09 2003-06-04 Degussa AG Nukleotidsequenzen, die das clpc gen kodieren
AU2001296718A1 (en) * 2000-10-06 2002-04-15 Novozymes A/S Methods for monitoring multiple gene expression
DE10058394C1 (de) * 2000-11-24 2002-07-11 Siemens Ag Verfahren für die biochemische Analytik und zugehörige Anordnung
AU2002241409A1 (en) * 2001-01-12 2002-07-24 Tigr Metylococcus capsulatus genes and dna array for the determination of gene expression in metylococcus capsulatus

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
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DE10242433A1 (de) 2004-03-25

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