PL212331B1 - Metoda identyfikacji emetycznych bakterii z grupy Bacillus cereus w substancjach organicznych, zwłaszcza w żywności i mieszanina reakcyjna do identyfikacji emetycznych bakterii z grupy Bacillus cereus w substancjach organicznych, zwłaszcza w żywności - Google Patents
Metoda identyfikacji emetycznych bakterii z grupy Bacillus cereus w substancjach organicznych, zwłaszcza w żywności i mieszanina reakcyjna do identyfikacji emetycznych bakterii z grupy Bacillus cereus w substancjach organicznych, zwłaszcza w żywnościInfo
- Publication number
- PL212331B1 PL212331B1 PL387811A PL38781109A PL212331B1 PL 212331 B1 PL212331 B1 PL 212331B1 PL 387811 A PL387811 A PL 387811A PL 38781109 A PL38781109 A PL 38781109A PL 212331 B1 PL212331 B1 PL 212331B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- emetic
- bacillus cereus
- primers
- reaction
- bacteria
- Prior art date
Links
- 239000002895 emetic Substances 0.000 title claims description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 29
- 241000006378 Bacillus cereus group Species 0.000 title claims description 20
- 235000013305 food Nutrition 0.000 title claims description 19
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 40
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 claims description 35
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 35
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 31
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 31
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 19
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 10
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 9
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 claims description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 31
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 31
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 13
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 12
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 12
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 7
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 6
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 6
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- JWWAHGUHYLWQCQ-UHFFFAOYSA-N cereulide Chemical compound CC(C)CC1OC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(C(C)C)OC(=O)C(C)NC(=O)C(CC(C)C)OC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(C(C)C)OC(=O)C(C)NC(=O)C(CC(C)C)OC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(C(C)C)OC(=O)C(C)NC1=O JWWAHGUHYLWQCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 4
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 4
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 4
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 235000012045 salad Nutrition 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 241001135265 Cronobacter sakazakii Species 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 108010061320 cereulide Proteins 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 2
- 241000194106 Bacillus mycoides Species 0.000 description 2
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 241000187482 Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Species 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 235000012970 cakes Nutrition 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000014670 detection of bacterium Effects 0.000 description 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241001079698 Bacillus cereus ATCC 10876 Species 0.000 description 1
- 241000193752 Bacillus circulans Species 0.000 description 1
- 241000193749 Bacillus coagulans Species 0.000 description 1
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 1
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 1
- 241001629381 Bacillus mycoides NBRC 101238 = DSM 11821 Species 0.000 description 1
- 241000906059 Bacillus pseudomycoides Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 208000001860 Eye Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 1
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000194105 Paenibacillus polymyxa Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 206010067268 Post procedural infection Diseases 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 108010019477 S-adenosyl-L-methionine-dependent N-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 1
- 206010048038 Wound infection Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940054340 bacillus coagulans Drugs 0.000 description 1
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 210000004666 bacterial spore Anatomy 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- -1 dNTP Proteins 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000000741 diarrhetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 208000011323 eye infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 235000013350 formula milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001046 green dye Substances 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 235000008216 herbs Nutrition 0.000 description 1
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 108010000785 non-ribosomal peptide synthase Proteins 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 1
- 235000015927 pasta Nutrition 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000007430 reference method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 235000015067 sauces Nutrition 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 235000013599 spices Nutrition 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007195 tryptone soya broth Substances 0.000 description 1
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku jest metoda identyfikacji emetycznych bakterii z grupy Bacillus cereus w substancjach organicznych, zwłaszcza w żywności, przy zastosowaniu łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym oraz mieszanina reakcyjna do identyfikacji emetycznych bakterii z grupy Bacillus cereus w substancjach organicznych, zwłaszcza w żywności.
Zgodnie z obowiązującą klasyfikacją grupę Bacillus cereus reprezentuje sześć gatunków: Bacillus cereus sensu stricto, Bacillus thuringiensis, Bacillus anthracis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides i Bacillus weihenstephanensis, z tego część chorobotwórczych dla człowieka. Z dostępnych danych wynika, że bakterie z grupy Bacillus cereus stanowią częste zanieczyszczenie żywności pochodzenia zarówno roślinnego (ryż, makarony, płatki, kasza, mąka, warzywa, sałatki i surówki, przyprawy, zioła) jak i zwierzęcego (mleko, produkty mleczne, sosy, drób, ryby). Potencjał chorobotwórczy tej grupy bakterii wyraża się obecnością genów kodujących szereg toksyn mających działanie biologiczne, w tym toksyn biegunkowych (enterotoksyn) oraz toksyny wymiotnej (cereulidyny). Chorobotwórcze szczepy Bacillus cereus sensu stricto, oprócz zatruć pokarmowych, są przyczyną zakażeń przyrannych, infekcji pooperacyjnych, zakażeń oczu, zapalenia opon mózgowych, infekcji przewodu moczowego, uszkodzenia wątroby czy bakteriemii. Referencyjne metody stosowane przy oznaczaniu ilościowym i identyfikacji bakterii z grupy Bacillus cereus w żywności, opisane w normach PN-EN ISO 21871, PN-EN ISO 7932, bazują na metodach mikrobiologicznych, a identyfikacja oparta na cechach morfologicznych lub biochemicznych jest czasochłonna, kosztowna i nie mówi nic o toksynotwórczości szczepów. Brak aktywności antygenowej cereulidyny sprawia, że toksyna ta wykrywana jest przy użyciu złożonych technik chromatograficznych (HPLC-MS), wymagających specjalistycznego sprzętu, bądź skomplikowanych testów biologicznych (ocena ruchliwości plemników dzika - ang. boar spermatozoan assay). Obecnie w diagnostyce mikrobiologicznej coraz częściej stosowane są techniki oparte na analizie kwasów nukleinowych, w tym wykorzystujące łańcuchową reakcję polimerazy (PCR). Podstawą techniki PCR jest powielenie fragmentu/ów DNA, specyficznego dla określonego organizmu, do poziomu umożliwiającego jego szybką i prostą detekcję przy użyciu elektroforezy. Uzyskuje się to stosując krótkie jednoniciowe oligonukleotydy (12-40 nukleotydów). tzw. startery, które determinują rodzaj powielanego fragmentu DNA, oraz enzym - termostabilną polimerazę, która umożliwia powielenie żądanego fragmentu w cyklicznej, trzyetapowej reakcji, złożonej z denaturacji, wiązania starterów oraz syntezy DNA. Po 30 cyklach reakcji uzyskuje się zazwyczaj ponad milion kopii poszukiwanego fragmentu DNA, co pozwala na przeprowadzenie jego identyfikacji metodą elektroforezy żelowej i uwidocznienie wyniku przy zastosowaniu UV.
Udoskonaleniem techniki PCR jest PCR w czasie rzeczywistym (real-time PCR).
Technika ta pozwala na szczegółowe obserwacje każdego z etapów PCR, w tym przebiegu syntezy DNA w czasie, umożliwiając określenie wydajności reakcji oraz ilości badanego DNA w próbie, do czego wykorzystuje się barwniki fluorescencyjne, np. SYBR Green I, SYTO9, Eva Green, SYBR Gold czy ResoLight. Posiadają one wysokie powinowactwo do dwuniciowego DNA, powstającego w wyniku PCR. Łącząc się z dwuniciowym DNA barwniki te, wzbudzone światłem o odpowiedniej długości fali, emitują wychwytywaną przez detektor fluorescencję, której natężenie jest wprost proporcjonalne do ilości syntetyzowanego DNA. Identyfikacja powstałych produktów przeprowadzana jest poprzez analizę krzywej topnienia, z pominięciem elektroforezy. Alternatywą dla barwników fluorescencyjnych są sondy DNA znakowane fluorescencyjnie. Są to krótkie odcinki DNA, komplementarne do poszukiwanej sekwencji, które po przyłączeniu do DNA podczas reakcji PCR emitują fluorescencję o określonej długości fali. Obecnie znanych jest kilka rodzajów sond, np. TaqMan, FRET, molecular beacons, czy scorpions. W analizach z zastosowaniem sond zazwyczaj nie przeprowadza się analizy krzywej topnienia, gdyż otrzymywane wyniki bazują na krzywej fluorescencji uzyskanej podczas reakcji PCR. Zarówno zastosowanie barwników fluorescencyjnych jak i sond posiada wady i zalety. Sondy z powodzeniem wykorzystuje się w reakcjach multiplex, gdzie jednocześnie powielane są dwa lub więcej fragmentów DNA, oraz do oznaczeń ilościowych. Jest to jednak rozwiązanie droższe. Wadą barwników fluorescencyjnych jest ich niespecyficzne łączenie się z każdym dwuniciowym fragmentem DNA, co skutkuje niedokładnością oznaczeń ilościowych. Zaletą barwników fluorescencyjnych jest ich cena oraz możliwość przeprowadzenia analizy krzywej topnienia, co pozwala na uwidocznienie zarówno specyficznych jak i niespecyficznych produktów PCR.
Technika real-time PCR pozwala na znaczne skrócenie czasu analiz - z kilku dni w przypadku klasycznych metod mikrobiologicznych, do kilku godzin, włączając w to izolację DNA. W porównaniu
PL 212 331 B1 do standardowej metody PCR, gdzie czas reakcji wynosi 2-4 godziny, w real-time PCR jest on skrócony nawet do 40 min., a przy tym wyeliminowany zostaje żmudny etap elektroforezy, w którym, potencjalnie, może dojść do zanieczyszczenia próbki. Znana jest z literatury metoda identyfikacji bakterii chorobotwórczych z użyciem barwnika SYBR Green I oraz sond TaqMan do wykrywania Enterobacter sakazakii w żywności przeznaczonej dla niemowląt, przedstawiona przez Liu i wsp., Real time PCR using TaqMan and SYBR Green for detection of Enterobacter sakazakii in infant formula, J. Microbiol. Methods 65: 21-31, 2006. Znana jest także i opisana w publikacji Berrada et al., Quantification of Listeria monocytogenes in salads by real time quantitative PCR, Int. J. Food Microbiol. 10: 202-206, 2006, technika oparta na zastosowaniu sond hybrydyzacyjnych do ilościowego oznaczania Listeria monocytogenes w żywności. Kolejna metoda wykrywania i oznaczania ilościowego Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis przy użyciu barwnika SYBR Green opisana jest w publikacji O'Mahony i Hill, A real time PCR assay for the detection and quantitation of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis using SYBR Green and the Light Cycler, J. Microbiol. Methods 51: 283-293, 2002.
Istotą tych sposobów jest powielanie jednego fragmentu DNA specyficznego dla poszukiwanego mikroorganizmu. W przypadku Enterobacter sakazakii oraz Listeria monocytogenes zastosowano multiplex PCR, jednocześnie z jednym fragmentem DNA bakteryjnego, powielając sztucznie skonstruowany fragment DNA, jako wewnętrzną kontrolę reakcji. Udokumentowano także wykorzystanie realtime PCR do identyfikacji Bacillus cereus, w tym szczepów emetycznych (Messelhausser et al., Realtime-PCR-System zum Nachweis von Bacillus cereus (emetischer Typ) in Lebensmitteln, J. Verbr. Lebensm. 2: 190-193, 2007; Fricker et al., Diagnostic Real-Time PCR assays for the detection of emetic Bacillus cereus strains in foods and recent food-born outbreaks, Appl. Environ. Microbiol. 73, 1892-1898, 2007).
W pracach tych przedstawiono metodę opierającą się na identyfikacji genów odpowiedzialnych za obecność syntetazy cereulidyny, które są kodowane plazmidowo. Rozwiązanie to umożliwia wykrycie tylko szczepów emetycznych Bacillus cereus w żywności, przy zastosowaniu wewnętrznej kontroli reakcji jaką jest syntetyczny fragment DNA powielany jednocześnie z poszukiwanym fragmentem. Zastosowane rozwiązanie opiera się na sondach TaqMan oraz SYBR Green I, przy czym real-time PCR z użyciem SYBR Green I przeprowadzony został bez wewnętrznej kontroli reakcji.
Trudnością w opracowaniu metody jednoczesnego wykrywania bakterii z grupy Bacillus cereus i bakterii potencjalnie emetycznych należących do tej grupy jest fakt, że geny warunkujące syntezę toksyny emetycznej kodowane są plazmidowo. Do identyfikacji mikroorganizmów stosuje się fragmenty DNA charakterystyczne wyłącznie dla danego gatunku. Takim fragmentem jest najczęściej fragment genu 16S rRNA. Stosowane są także fragmenty genów określonych toksyn, specyficznych enzymów lub innych białek, pod warunkiem, że geny te nie występują u innych mikroorganizmów. Geny odpowiedzialne za wytwarzanie toksyny emetycznej u Bacillus cereus sensu stricto scharakteryzowano stosunkowo niedawno (Hoton et al.. The cereulide genetic determinants of emetic Bacillus cereus are plasmid-bome. Microbiol. 151: 2121-2124, 2005; Ehling-Schulz et al., Cereulide synthetase gene cluster from emetic Bacillus cereus: Structure and location on a mega virulence plasmid related to Bacillus anthracis toxin plasmid pXO1. BMC Microbiology 6: 20, 2006). Biorąc pod uwagę ich plazmidowe położenie, nie ma zupełnej pewności, że geny te są specyficzne wyłącznie dla Bacillus cereus. Najbezpieczniejszym działaniem jest zatem jednoczesne potwierdzenie obecności fragmentów DNA specyficznych dla Bacillus cereus i toksyny emetycznej. Trudności z jednoczesną identyfikacją tych dwóch grup genów wynikają z konieczności powielenia DNA chromosomowego i plazmidowego, które występują w różnej ilości w komórkach bakteryjnych. Rozbieżność w ilości tych dwóch typów DNA stanowi szczególne wyzwanie w ustalaniu warunków reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Ze względu na specyfikę tej reakcji, dużo większa czułość w porównaniu z klasyczną PCR, szybsze zmiany temperatury podczas cykli PCR, zastosowanie barwników fluorescencyjnych i substancji stabilizujących, próby zastosowania barwników fluorescencyjnych do jednoczesnego wykrywania kilku fragmentów DNA nie są powszechne. Reakcja musi przebiegać w określonych warunkach fizykochemicznych, tj. optymalnym składzie mieszaniny reakcyjnej, w szczególności stężenia starterów i jonów magnezu, przy zastosowaniu odpowiednich zmian temperatury. Jak wynika z dostępnych danych, próby przeprowadzania reakcji multiplex real-time PCR z wykorzystaniem barwnika SYBR Green I skutkowały niejednoznacznymi wynikami spowodowanymi brakiem odczytu fluorescencji dla jednego z produktów reakcji, mimo że zachodziła amplifikacja obu poszukiwanych produktów (Giglio et al., Demonstration of preferential binding of SYBR Green I to specific DNA fragments in real-time multiplex PCR, Nucleic Acids Research, Vol. 31, No. 22, 2003; Monis et al., Comparison of SYTO9 and SYBR Green I for real-time poly4
PL 212 331 B1 merase chain reaction and investigation of the effect of dye concentration on amplification and DNA melting curve analysis, Anal. Biochemistry 340: 24-34, 2005). W publikacjach tych wykazano, że w zależności od ilości zastosowanych cykli PCR, w wyniku dalszej analizy topnienia produktów reakcji uzyskiwano wynik świadczący o obecności tylko jednego z dwóch poszukiwanych fragmentów DNA (jeden pik na krzywej topnienia). Wyniki te nie były jednak zgodne z wynikami elektroforezy, gdzie wyraźnie widoczne były dwa produkty PCR. Tłumaczono to zjawisko nieodpowiednim stężeniem barwnika SYBR Green I w mieszaninie reakcyjnej, preferencyjnym łączeniem się barwnika z dłuższymi fragmentami DNA oraz zależnością wyników od ilości DNA w próbie poddawanej analizie. Ponieważ jednym z założeń real-time PCR jest wyeliminowanie elektroforezy, powyższy problem może spowodować uzyskiwanie błędnych wyników. W diagnostyce mikrobiologicznej koniecznym jest uzyskiwanie miarodajnych i powtarzalnych wyników, niezależnie od marki zastosowanego sprzętu, odczynników (polimerazy, buforu, użycia gotowego zestawu do przeprowadzania reakcji), ilości cykli PCR czy ilości DNA w badanej próbie.
Mieszaniny reakcyjne stosowane w opisanych wyżej metodach identyfikacji emetycznych bakterii z grupy Bacillus cereus w substancjach organicznych, zwłaszcza w żywności zawierają bufor dla Taq polimerazy, dNTP, polimerazę Taq, jony magnezu, startery takie jak: ces_SYBR_F CACGCCGAAAGTGATTATACCAA + ces_SYBR_R CACGATAAAACCACTGAGATAGTG (Fricker et al., Diagnostic Real-Time PCR assays for the detection of emetic Bacillus cereus strains in foods and recent food-borne outbreaks, Appl. Environ. Microbiol. 73: 1892-1898, 2007) lub Bc fw CGC CGA AAG TGA TTA TAC CAA + BC re TAT GCC CCG TTC TCA AAC TG (Messelhausser et al., Real-time-PCRSystem zum Nachweis von Bacillus cereus (emetischer Typ) in Lebensmitteln, J. Verbr. Lebensm 2: 190-193, 2007), zastosowane do wykrywania tylko fragmentu genu ces, oraz (w przypadku reakcji real-time PCR) barwnik SYBR Green I lub podobny (SYTO 9, Eva Green, SYBR Gold etc.).
Metoda identyfikacji emetycznych bakterii z grupy Bacillus cereus według wynalazku polegająca na tym, że izoluje się z żywności DNA bakteryjne, a następnie poddaje amplifikacji z zastosowaniem łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym, charakteryzuje się tym, że jednocześnie poddaje się amplifikacji fragmenty DNA chromosomowego i plazmidowego, przy użyciu czterech starterów (BcF 5'-TCG AAA TTG AAA GGC GGC-3', BcR 5'-GGT GCC AGC TTA TTC AAC-3', CerF 5'-ATC ATA AAG GTG CGA ACA AGA-3', CerR 5'-AAG ATC AAC CGA ATG CAA CTG-3').
Stosuje się stężenie starterów CerF i CerR w mieszaninie reakcyjnej czterokrotnie wyższe niż stężenie starterów BcF i BcR, zaś stężenie jonów magnezu w mieszaninie reakcyjnej od 1 do 5 mM.
Korzystnie, reakcję prowadzi się w temperaturze przyłączania 30-65°C, z wykorzystaniem barwników fluorescencyjnych (SYBR Green I), w objętości mieszaniny reakcyjnej 10-100 μ|, przy zastosowaniu od 20 do 50 cykli reakcji. Identyfikacji produktów dokonuje się w oparciu o analizę krzywej topnienia przy zmianie temperatury 0,03-0,1°C/s. Metoda identyfikacji emetycznych bakterii z grupy Bacillus cereus według wynalazku jest powtarzalna dla szerokiego zakresu ilości DNA w badanej próbie od 1,5 ng do 500 ng DNA na reakcję o objętości 10-100 μΙ.
Mieszanina reakcyjna według wynalazku zawierająca bufor, polimerazę, jony magnezu, startery i barwnik, charakteryzuje się tym, że zawiera cztery startery (BcF 5'-TCG AAA TTG AAA GGC GGC-3', BcR 5'-GGT GCC AGC TTA TTC AAC-3', CerF 5'-ATC ATA AAG GTG CGA ACA AGA-3', CerR 5'-AAG ATC AAC CGA ATG CAA CTG-3'), przy czym stężenie starterów CerF i CerR w mieszaninie reakcyjnej jest czterokrotnie wyższe niż stężenie starterów BcFi BcR, zaś stężenie jonów magnezu w mieszaninie wynosi od 1 do 5 mM.
Rozwiązanie według wynalazku pozwala na wykrycie komórek bakterii w produktach spożywczych w przeciągu godzin, w tym etapy przygotowania prób, izolacji DNA oraz reakcji real-time PCR. Skrócenie czasu identyfikacji jest wynikiem nowatorskiego zastosowania reakcji multiplex real-time PCR do jednoczesnego wykrywania bakterii z grupy Bacillus cereus oraz szczepów emetycznych z tej grupy, co obniża koszt analizy i skraca czas pracy.
Wynalazek pozwala na identyfikację nie tylko form patogennych Bacillus cereus, ale wszystkich mikroorganizmów należących do tej grupy. Metoda umożliwia rozróżnienie bakterii emetycznych od nieemetycznych należących do grupy Bacillus cereus. Metodę według wynalazku, można zastosować do identyfikacji emetycznych bakterii z grupy Bacillus cereus w procesach, w których stosuje się reakcję PCR oraz PCR w czasie rzeczywistym, niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia.
Fragmenty DNA powielane według wynalazku są specyficzne dla grupy Bacillus cereus (fragment 16S rRNA) oraz szczepów emetycznych Bacillus cereus (fragment genu ces). Doświadczenia
PL 212 331 B1 z wykorzystaniem tej techniki prowadzono na wzorcowych kulturach Bacillus cereus, w tym referencyjnych szczepach emetycznych, oraz na kulturach mikroorganizmów pochodzących z różnych produktów spożywczych, takich jak ryż, kasze, mąki, chleb, sałatki, warzywa, jogurty, torty.
Wynalazek przedstawiony jest na przykładach wykonania i na rysunkach, na których fig. 1 przedstawia krzywą topnienia uzyskaną po reakcji multiplex real-time PCR w 20 μΐ mieszaniny reakcyjnej, fig. 2 przedstawia wyniki elektroforezy produktów uzyskanych po reakcji multiplex real-time PCR na aparacie LightCycler 2.0, fig. 3 przedstawia krzywą topnienia uzyskaną w wyniku przeprowadzenia reakcji multiplex real-time PCR w 10 μΙ mieszaniny reakcyjnej, fig. 4 przedstawia wyniki analizy topnienia uzyskane po reakcji multiplex real-time PCR na aparacie Eppendorf Mastercycler ep realplex, w 25 μΐ mieszaniny reakcyjnej, fig. 5 przedstawia krzywą topnienia uzyskaną w wyniku reakcji multiplex real-time PCR przeprowadzonej na aparacie LightCycler 2.0, fig. 6 przedstawia krzywą topnienia uzyskaną w wyniku przeprowadzenia reakcji multiplex real-time PCR na aparacie LightCycler 2.0, fig. 7 przedstawia wynik reakcji multiplex real-time PCR w postaci krzywej topnienia, uzyskany na aparacie LightCycler 2.0 dla 6 prób DNA wyizolowanych z żywności oraz kontroli negatywnej.
W przykładach od I do V przedstawiono sposób identyfikacji emetycznych bakterii z grupy Bacillus cereus przy użyciu trzech aparatów do real-time PCR z zastosowaniem odczynników różnych producentów, różnej ilości cykli reakcji i stężeń jonów magnezu, przeprowadzony dla czystych kultur Bacillus cereus, natomiast w przykładzie VI pokazano sposób identyfikacji emetycznych bakterii z grupy Bacillus cereus przy użyciu kultur izolowanych z wybranych materiałów organicznych.
P r z y k ł a d I
DNA izolowano przy użyciu komercyjnych zestawów do izolacji bakterii Genomic Mini AX Bacteria firmy A&A Biotechnology z 1 ml czystej hodowli komórek w płynnym podłożu TSB (Tryptone Soya Broth). Jakość oraz ilość wyizolowanego DNA każdorazowo badana była spektrofotometrycznie.
W reakcji użyto starterów o następujących sekwencjach:
| Starter | Sekwencja | Powielany fragment DNA | Źródło |
| BcF | 5'-TCG AAA TTG AAA GGC GGC-3' | 16S rRNA | Hansen et al., Polymerase chain reaction assay for the detection of Bacillus cereus group cells. FEMS Microbiol. Lett. 202,. 209-213. 2001. |
| BcR | 5'- GGT GCC AGC TTA TTC AAC-3' | 16S rRNA | |
| CerF | 5'-ATC ATA AAG GTG CGA ACA AGA-3' | ces | Horwood et al., Evidence for a non-ribosomal peptide synthetase production of cereulide (the emetic toxin) in Bacillus cereus. FEMS Microbiol. Lett. 236, 319-324. 2004. |
| CerR | 5'- AAG ATC AAC CGA ATG CAA CTG-3' | ces |
Reakcję multiplex real-time PCR przeprowadzano w mieszaninie o objętości 20 μΐ w aparacie LightCycler 2.0 firmy Roche przy użyciu odczynników z zestawu LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche) w następujących ilościach:
- H2O wolna od nukleaz do objętości 20 μ|,
- 3,5 mM MgCl2,
- 1 μl 1,25 mM każdego ze starterów BcF i BcR,
- 1 μl 5 mM każdego ze starterów CerF i CerR,
- 2 μl FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche),
- 2 μl DNA bakteryjnego.
PL 212 331 B1
Mieszaninę reakcyjną umieszczano w szklanej kapilarze przeznaczonej do reakcji o objętości μΐ firmy Roche, odwirowywano przy 1500 rpm przez 1,5 minuty po czym umieszczano w rotorze termocyklera LightCycler 2.0 i przeprowadzano reakcję amplifikacji w 40 cyklach na następujących warunkach:
| Etap | Temperatura [°C] | Czas [s] | Pobór fluorescencji | Zmiana temperatury [°C/s] | |
| Pre-inkubacja | 95 | 600 | - | 20 | |
| Amplifikacja | denaturacja | 95 | 0 | - | 20 |
| przyłączanie | 60 | 5 | - | 20 | |
| synteza | 72 | 7 | pojedynczy | 20 | |
| Analiza topnienia | denaturacja | 95 | 0 | - | 20 |
| przyłączanie | 65 | 15 | - | 20 | |
| topnienie | 95 | 0 | ciągły | 0,1 | |
| Chłodzenie | 40 | 30 | - | 20 |
Krzywe topnienia, uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy, przedstawiono na fig. 1 - produkt charakteryzujący się niższą temperaturą topnienia odpowiada fragmentowi genu ces, natomiast produkt o wyższej temperaturze topnienia obrazuje obecność fragmentu 16S rRNA. Obecność dwóch pików na krzywej topnienia świadczy o obecności obu poszukiwanych fragmentów DNA w genomie danego szczepu bakteryjnego, co oznacza, że dany szczep jest emetycznym szczepem z grupy Bacillus cereus. Obecność tylko produktu o wyższej temperaturze topnienia pozwala potwierdzić przynależność danego szczepu do grupy Bacillus cereus z jednoczesnym wykluczeniem jego zdolności do produkcji toksyny emetycznej. Brak jakiegokolwiek produktu oznacza, że badany szczep nie jest przedstawicielem grupy Bacillus cereus i nie jest zdolny do syntezy cereulidyny.
Celem sprawdzenia specyficzności opracowanych warunków reakcji otrzymany produkt poddawano sprawdzeniu metodą elektroforezy w 2% żelu agarozowym wybarwianym bromkiem etydyny, przeprowadzanej przy napięciu 40V w ciągu 2 godzin w buforze TBE. Za wynik dodatni w identyfikacji bakterii z grupy Bacillus cereus uznawano obecność produktu o długości 288pz, natomiast obecność produktu o długości 188pz świadczyła o tym, że szczep jest szczepem emetycznym. Wyniki elektroforezy obrazuje fig. 2, gdzie M - marker masowy (100-500pz, A&A Biotechnology), 1 i 2 - wzorcowy szczep emetyczny B. cereus F4810/72, 3 - emetyczny szczep B. cereus wyizolowany z kaszy, 4 - próba zerowa, 5 - kontrola negatywna, 6 - nieemetyczny wzorcowy szczep B. cereus ATCC 10876.
Każdorazowo identycznym warunkom izolacji i amplifikacji poddawano próbę zerową (dejonizowana H2O wolna od nukleaz) oraz kontrolę negatywną (DNA bakteryjne pochodzące z wzorcowych szczepów nie należących do grupy Bacillus cereus, w tym Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Paenibacillus polymyxa, Staphylococcus aureus, Enterococcus fecalis, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa).
P r z y k ł a d II
Izolacja DNA i startery użyte do amplifikacji były identyczne jak w przykładzie I. Reakcję multiplex real-time PCR przeprowadzano w objętości 10 μl w aparacie LightCycler 480 firmy Roche na płytkach z użyciem odczynników z zestawu LC 480 SYBR Green I Master w następujących ilościach:
- H2O wolna od nukleaz do objętości 10 μΙ,
- 0,5 μl 1,25 mM każdego ze starterów BcF i BcR,
- 0,5 μl 5 mM każdego ze starterów CerF i CerR,
- 5 μl Master Mix (Roche),
- 1,5 μl DNA bakteryjnego.
Mieszaninę reakcyjną nanoszono na dołki białych płytek (Roche), które umieszczano w termocyklerze LightCycler 480 i przeprowadzano reakcję amplifikacji w 40 cyklach na następujących warunkach:
PL 212 331 B1
| Etap | Temperatura [°C] | Czas [s] | Pobór fluorescencji | Zmiana temperatury [°C/s] | |
| Pre-inkubacja | 95 | 600 | - | 4,4 | |
| Amplifikacja | denaturacja | 95 | 1 | - | 4,4 |
| przyłączanie | 60 | 8 | - | 2,2 | |
| synteza | 72 | 9 | pojedynczy | 4,4 | |
| Analiza topnienia | denaturacja | 95 | 5 | - | 4,4 |
| przyłączanie | 65 | 60 | - | 2,2 | |
| topnienie | 97 | - | ciągły | 0,1 | |
| Chłodzenie | 40 | 30 | - | 2 |
Analogicznie jak w przykładzie I reakcji poddawano próbę zerową i kontrolę negatywną a wyniki potwierdzano za pomocą elektroforezy w 2% żelu agarozowym. Wyniki uzyskane przy użyciu odczynników z zestawu LC 480 SYBR Green I Master, w postaci krzywych topnienia, przedstawiono na fig. 3, gdzie pokazano analizę wykonaną dla 9 szczepów B. cereus, w tym 6 emetycznych, wzorcowego szczepu emetycznego B. cereus F4810/72 jako kontroli dodatniej oraz dla kontroli ujemnej. Jak w przykładzie I, niższa temperatura topnienia odpowiada fragmentowi genu ces (syntetazy toksyny emetycznej), a wyższa temperatura topnienia charakteryzuje fragment genu 16S rRNA, którego obecność świadczy o przynależności szczepu do grupy B. cereus.
P r z y k ł a d III
DNA izolowano jak w przykładzie I. Reakcję multiplex real-time PCR przeprowadzono w aparacie Mastercycler ep realplex firmy Eppendorf przy użyciu odczynników firmy Fermentas. Startery użyte do amplifikacji produktów były identyczne jak w przykładzie I. Mieszanina reakcyjna o objętości 25 μΐ składała się z następujących reagentów:
- H2O wolna od nukleaz do objętości 25 μΐ
- 1 μΐ 1,25 mM każdego ze starterów BcF i BcR
- 1 μΐ 5 mM każdego ze starterów CerF i CerR
- 10 μΐ Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Fermentas)
- 2 μΐ DNA bakteryjnego.
Mieszaninę reakcyjną umieszczano w cienkościennych przezroczystych probówkach (PCR Tube Strips, Eppendorf) zamykanych przezroczystymi nakładkami (Masterclear Cap Strips, Eppendorf), które przenoszono do termocyklera Mastercycler ep realplex. Reakcję amplifikacji przeprowadzano w następujących warunkach:
| Etap | Temperatura [°C] | Czas [s] | Pobór fluorescencji | Zmiana temperatury [°C/s] | |
| Pre-inkubacja | 95 | 600 | - | 6,6 | |
| Amplifikacja | denaturacja | 95 | 1 | - | 6,6 |
| przyłączanie | 60 | 8 | - | 4,5 | |
| synteza | 72 | 9 | pojedynczy | 6,6 | |
| Analiza topnienia | denaturacja | 95 | 5 | - | 6,6 |
| przyłączanie | 65 | 60 | - | 4,5 | |
| topnienie | 97 | - | ciągły | 0,03 | |
| Chłodzenie | 40 | 30 | - | 4,5 |
PL 212 331 B1
Wyniki uzyskane przy użyciu odczynników Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Fermentas) ilustruje fig. 4, gdzie przykładowo przedstawiono analizę szczepów emetycznych, w tym referencyjnego szczepu B. cereus F4810/72 (kontrola dodatnia) oraz kontroli ujemnej. Widoczne dwa piki odpowiadają dwóm produktom powstałym w reakcji multiplex real-time PCR, analogicznie jak w przykładach I i II.
P r z y k ł a d IV
Izolację DNA oraz reakcję multiplex real-time PCR przeprowadzano jak w przykładzie I na aparacie LightCycler 2.0 z zastosowaniem odczynników z zestawu FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche), za wyjątkiem zastosowanego stężenia jonów magnezu, które wynosiło 1 mM na reakcję, oraz ilości cykli, których liczba wynosiła 50. Wyniki reakcji obrazuje fig. 5, gdzie dwa piki w temperaturach ~81°C oraz ~89°C na krzywej topnienia pochodzą od referencyjnego szczepu emetycznego B. cereus F4810/72, jeden pik w temp. ~89°C - od nieemetycznego referencyjnego szczepu B. weihenstephanensis DSM 11821, a dwie pozostałe próby to próba zerowa i kontrola ujemna.
P r z y k ł a d V
Izolację DNA oraz reakcję multiplex real-time PCR przeprowadzano jak w przykładzie I, z tym, że stężenie jonów magnezu wynosiło 5 mM, a liczba zastosowanych cykli wynosiła 20. Krzywa topnienia uzyskana w wyniku tak przeprowadzonej reakcji multiplex real-time PCR przedstawiona została na fig. 6, gdzie pokazano krzywą topnienia uzyskaną dla szczepów wzorcowych: emetycznego B. cereus F4810/72, nieemetycznego B. cereus DSM 2302, B.thuringiensis DSM 5725, próby zerowej i kontroli negatywnej.
P r z y k ł a d VI
Z partii ryżu, kaszy i tortów pobierano 20 g próbki i zawieszano w 180 ml zbuforowanej wody peptonowej (Scharlau); całość homogenizowano 2 min. w stomacherze. Każdą z próbek przygotowywano w dwóch wariantach. Wariant pierwszy próbki ogrzewano w 80°C/10 min. w celu aktywacji spor bakteryjnych, co miało znaczenie przy izolacji DNA. Wariant drugi przebiegał bez tego etapu. DNA izolowano jak w przykładzie I. Dalej postępowano jak w przykładzie I lub II. Wyniki reakcji multiplex real-time PCR w postaci krzywej topnienia przedstawiono na fig. 5. Obecne jednocześnie dwa produkty PCR w jednej próbie klasyfikują szczep jako emetyczny B. cereus, obecność tylko produktu o wyższej temperaturze topnienia świadczy o przynależności szczepu do grupy B. cereus, brak produktu w wyniku analizy topnienia mówi o braku przynależności badanego szczepu do grupy B. cereus.
Claims (4)
1. Metoda identyfikacji emetycznych bakterii z grupy Bacillus cereus w substancjach organicznych, zwłaszcza w żywności z której izoluje się DNA bakteryjne a następnie poddaje amplifikacji z zastosowaniem łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym, znamienna tym, że jednocześnie poddaje się amplifikacji fragmenty DNA chromosomowego i plazmidowego, przy użyciu czterech starterów (BcF 5'-TCG AAA TTG AAA GGC GGC-3', BcR 5'-GGT GCC AGC TTA TTC AAC-3', CerF 5'-ATC ATA AAG GTG CGA ACA AGA-3', CerR 5'-AAG ATC AAC CGA ATG CAA CTG-3'), przy czym stosuje się stężenie starterów CerF i CerR w mieszaninie reakcyjnej czterokrotnie wyższe niż stężenie starterów BeF i BcR.
2. Metoda według zastrz. 1, znamienna tym, że stosuje się stężenie jonów magnezu w mieszaninie reakcyjnej od 1 do 5 mM.
3. Metoda według zastrz. 1, znamienna tym, że reakcję prowadzi się w temperaturze przyłączania 30-65°C, z wykorzystaniem barwników fluorescencyjnych (SYBR Green I), w objętości mieszaniny reakcyjnej 10-100 pi, przy zastosowaniu od 20 do 50 cykli reakcji.
4. Mieszanina reakcyjna do identyfikacji emetycznych bakterii z grupy Bacillus cereus w substancjach organicznych, zwłaszcza w żywności zawierająca bufor, polimerazę, jony magnezu, startery i barwnik, znamienna tym, że zawiera cztery startery (BcF 5'-TCG AAA TTG AAA GGC GGC-3', BcR 5'-GGT GCC AGC TTA TTC AAC-3', CerF 5'-ATC ATA AAG GTG CGA ACA AGA-3', CerR 5'-AAG ATC AAC CGA ATG CAA CTG-3'), przy czym stężenie starterów CerF i CerR w mieszaninie reakcyjnej jest czterokrotnie wyższe niż stężenie starterów BcF i BcR, zaś stężenie jonów magnezu w mieszaninie reakcyjnej wynosi od 1 do 5 mM.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL387811A PL212331B1 (pl) | 2009-04-16 | 2009-04-16 | Metoda identyfikacji emetycznych bakterii z grupy Bacillus cereus w substancjach organicznych, zwłaszcza w żywności i mieszanina reakcyjna do identyfikacji emetycznych bakterii z grupy Bacillus cereus w substancjach organicznych, zwłaszcza w żywności |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL387811A PL212331B1 (pl) | 2009-04-16 | 2009-04-16 | Metoda identyfikacji emetycznych bakterii z grupy Bacillus cereus w substancjach organicznych, zwłaszcza w żywności i mieszanina reakcyjna do identyfikacji emetycznych bakterii z grupy Bacillus cereus w substancjach organicznych, zwłaszcza w żywności |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL387811A1 PL387811A1 (pl) | 2010-10-25 |
| PL212331B1 true PL212331B1 (pl) | 2012-09-28 |
Family
ID=43013884
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL387811A PL212331B1 (pl) | 2009-04-16 | 2009-04-16 | Metoda identyfikacji emetycznych bakterii z grupy Bacillus cereus w substancjach organicznych, zwłaszcza w żywności i mieszanina reakcyjna do identyfikacji emetycznych bakterii z grupy Bacillus cereus w substancjach organicznych, zwłaszcza w żywności |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL212331B1 (pl) |
-
2009
- 2009-04-16 PL PL387811A patent/PL212331B1/pl not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL387811A1 (pl) | 2010-10-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gasanov et al. | Methods for the isolation and identification of Listeria spp. and Listeria monocytogenes: a review | |
| Palomares et al. | Rapid detection and identification of Staphylococcus aureus from blood culture specimens using real-time fluorescence PCR | |
| Yuan et al. | Development of the saltatory rolling circle amplification assay for rapid and visual detection of Alicyclobacillus acidoterrestris in apple juice | |
| Forghani et al. | A novel pentaplex real time (RT)-PCR high resolution melt curve assay for simultaneous detection of emetic and enterotoxin producing Bacillus cereus in food | |
| US11479826B2 (en) | Nucleic acids and methods for the detection of Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) | |
| KR101712451B1 (ko) | 디지털 pcr을 이용한 식중독균의 검출 방법 | |
| Milton et al. | Novel saltatory rolling circle amplification assay for rapid and visual detection of Campylobacter jejuni in chicken meat | |
| KR101961648B1 (ko) | 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 특이적 프라이머 및 이를 이용한 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 검출방법 | |
| Fatima et al. | Microbial DNA extraction from soil by different methods and its PCR amplification | |
| Oh et al. | Simultaneous identification of seven foodborne pathogens and Escherichia coli (Pathogenic and Nonpathogenic) using capillary electrophoresis–based single-strand conformation polymorphism coupled with multiplex PCR | |
| JP5048622B2 (ja) | 乳酸菌検出用ｐｃｒプライマー | |
| KR101961652B1 (ko) | 바이셀라 비리데센스의 특이적 프라이머 및 이를 이용한 바이셀라 비리데센스의 검출방법 | |
| KR101299627B1 (ko) | 식중독 세균 동시 검출용 프라이머 및 이의 용도 | |
| KR20170030190A (ko) | Lamp를 이용한 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출용 프라이머 및 그 용도 | |
| PL212331B1 (pl) | Metoda identyfikacji emetycznych bakterii z grupy Bacillus cereus w substancjach organicznych, zwłaszcza w żywności i mieszanina reakcyjna do identyfikacji emetycznych bakterii z grupy Bacillus cereus w substancjach organicznych, zwłaszcza w żywności | |
| KR102178672B1 (ko) | 분자비콘을 포함하는 등온비색 검출용 조성물 및 이의 용도 | |
| Ueda et al. | Identification of cereulide-producing Bacillus cereus by nucleic acid chromatography and reverse transcription real-time PCR | |
| Smith et al. | Molecular diagnostics in food safety: rapid detection of food-borne pathogens | |
| Kaynak et al. | A Rapid and Cost‐Efficient Technique for Simultaneous/Duplex Detection of Listeria Monocytogenes and Escherichia Coli O157: H7 Using Real Time PCR | |
| Zara et al. | Detection, quantification, and identification of yeast in winemaking | |
| US7439022B2 (en) | Nucleic acids for detection of Listeria | |
| KR20170057929A (ko) | 유전자 증폭 방법을 이용한 식중독 유발 세균의 검출 방법 및 이 방법에 사용되는 키트 | |
| JP2012187067A (ja) | ラクトバチルス属細菌の定量方法 | |
| US20060240442A1 (en) | Methods and oligonucleotides for the detection of Salmonella SP., E coli 0157:H7, and Listeria monocytogenes | |
| JP2003250557A (ja) | ジャイレース遺伝子を用いてラクトバチルス・ブレビス菌のビール混濁性を判定する方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LICE | Declarations of willingness to grant licence |
Free format text: RATE OF LICENCE: 10% Effective date: 20120502 |
|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20120416 |