EP1425306A2 - Nanopartikel mit daran immobilisiertem biologisch aktivem tnf - Google Patents

Nanopartikel mit daran immobilisiertem biologisch aktivem tnf

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Publication number
EP1425306A2
EP1425306A2 EP02797581A EP02797581A EP1425306A2 EP 1425306 A2 EP1425306 A2 EP 1425306A2 EP 02797581 A EP02797581 A EP 02797581A EP 02797581 A EP02797581 A EP 02797581A EP 1425306 A2 EP1425306 A2 EP 1425306A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
tnf
group
protein
carrier
immobilized
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02797581A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Günter Tovar
Thomas Schiestel
Herwig Brunner
Klaus Pfizenmaier
Matthias Grell
Peter Scheurich
Angela Hammer
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Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Original Assignee
Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
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    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/191—Tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin [LT], i.e. TNF-beta
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    • A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/06—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent

Definitions

  • the present invention relates to nanoparticles with tumor necrosis factor (TNF) immobilized thereon, TNF being directed in the form of a trimer and immobilized on the support while maintaining its biological activity, methods for the directed immobilization of TNF on nanoparticles, and the use of the immobilized TNF comprising nanoparticles for the identification and / or isolation of TNF binding partners as well as for the identification and / or isolation of inhibitors of the interaction between TNF and its binding partners, the use of such nanoparticles for the production of a pharmaceutical composition, in particular for the therapy of tumors, and pharmaceutical and diagnostic compositions containing such nanoparticles.
  • TNF tumor necrosis factor
  • the tumor necrosis factor belongs to the class of cytokines, which are substances that are produced and secreted by a large number of cell types and which, as intercellular mediators, regulate a large number of cellular processes. Cytokines include, for example, lymphokines, interleukins, monokines and growth factors.
  • the tumor necrosis factor (TNF, also called TNF or cachectin) is the eponymous member of a large gene family of cytokines that are structurally homologous and have diverse, partially overlapping biological properties.
  • TNF lymphotoxin alpha
  • LT- ⁇ lymphotoxin alpha
  • FasL CD27L, CD30L , CD40L, TWEAK, OX40L, EDA, AITRL, VEGI, LIGHT, 4-1BBL, APRIL, BLYS, RANKL and TRAIL, for each of which one or more specific membrane receptors exist (Locksley et al, Cell, 104: 487-501, 2001 ).
  • TNF tumor necrosis factor
  • the molecules of the tumor necrosis factor (TNF) ligand family are involved in a large number of primarily immunoregulatory processes via their complementary receptors, which are grouped together as a TNF receptor family.
  • the members of the TNF ligand family are type II membrane proteins (Locksley et al, see above). Of these Membrane-like forms can, however, also derive soluble forms in many cases through specific proteolysis or alternative splicing. In some cases, the soluble and membrane-bound forms of members of the TNF ligand family can differ considerably in their bioactivity (Grell et al, Cell, 1995).
  • TNF lymphotoxin
  • LT- ⁇ lymphotoxin
  • TNF lymphotoxin
  • TNF a real secreted protein
  • This membrane TNF is a real transmembrane protein, which is in trimeric form and is biologically active. It could be shown that membrane TNF has a special spectrum of cellular effects that are not achieved by soluble TNF and also not by LT- ⁇ (Grell et al., Cell, 83 (1995), 793-802).
  • TNF TNF-binding protein
  • FasL TRAIL
  • CD40L FasL, TRAIL and CD40L
  • TNF is mainly formed by macrophages / monocytes, lymphocytes and mast cells and has an impact on inflammation, sepsis, lipid and protein metabolism, blood dung, angiogenesis, wound healing and immune defense and exerts cytotoxic or cytostatic effects on certain tumor cells.
  • Lymphotoxin- ⁇ also has a cytotoxic effect on some tumor cell lines. Relatively little is known about the molecular basis of the diverse TNF- ⁇ effects in vivo and in vitro. Analysis of the crystal structure of the recombinant, soluble TNF- ⁇ molecule has shown that this substance is an oligomeric protein which consists of three identical subunits, each of 17.5 kDA.
  • TNF- ⁇ -oligomers have to bind to the membrane receptors so that at least in physiological solutions some of the different biological activities of TNF- ⁇ can be induced. Although it has been shown that TNF- ⁇ occurs in solution as an oligomer, it has been found, however, that these non-covalently linked TNF- ⁇ oligomers are unstable and are converted into inactive forms. However, it is assumed that the structural changes of TNF- ⁇ also take place in vivo, since monomers and oligomers are found in varying proportions in the brain-spinal cord fluid of patients with meningitis.
  • TNF- ⁇ was originally identified as an endotoxin-induced factor that can induce tumor necrosis in mice.
  • the anti-tumor effect of TNF- ⁇ is not only due to the cytotoxic effects against Tu morzellen results, but also based on an activation of antitumor effector immune cells in the blood, for example macrophages, cytotoxic lymphocytes and neutrophils.
  • the anti-tumor effect of TNF- ⁇ is also based on a specific damage to tumor blood vessels.
  • TNF- ⁇ has very low stability and exerts pleiotropic effects in vivo
  • previous attempts to use TNF- ⁇ have not been successful. It has been shown that when TNF- ⁇ is administered, extremely severe systemic side effects such as fever and low blood pressure occur before therapeutically effective doses are reached.
  • TNF- ⁇ has very limited stability and exerts pleiotropic effects in vivo
  • biologically active proteins such as cytokines
  • biologically active proteins very often have poor stability and short half-lives.
  • the proteins are rapidly removed from the blood by the liver, kidneys and other organs, the clearance rate depending on the size of the molecules and the extent of proteolysis. Plasma proteases in particular cause the degradation of such proteins and cause the rapid loss of biological activity.
  • Hurst et al. Anal ⁇ Chem., 71 (1999), 4727-4733, describe the covalent surface modification of magnetic polymer particles with a size in the ⁇ m range with TNF antibodies, with which TNF can subsequently be fished from a complex solution. This procedure is used for sample preparation of MALDI-TOF-MS procedures.
  • the immobilization of a protein via an antibody is in principle a directional immobilization. However, such protein immobilization is very unstable with respect to covalent binding.
  • TNF is not covalently bound. TNF is then slowly released from the particles and is: only biologically active in dissolved form.
  • the present invention is therefore based on the technical problem of providing means and methods for immobilizing tumor necrosis factor (TNF) or another member of the TNF family on a support surface, TNF being immobilized in such a way that its prior to The immobilization of existing biological activities can also be maintained in the immobilized state, so that immobilized TNF can, for example, interact with its receptors and thus its biological activities can be induced.
  • TNF tumor necrosis factor
  • the immobilized TNF or another molecule of the same family should in particular have those biological properties that characteristic of the membrane-like form of the TNF molecule - or of the membrane-like one
  • TNF in the immobilized state should be usable both for in vitro investigations, for example with regard to its interactions with other cellular components, and as a medicament for the treatment of diseases, in particular tumor diseases, without the side effects known in the prior art occur.
  • no significant degradation of the carrier systems or of immobilized TNF should take place ' or, in the case of an in vivo application, the degradation should only take place after deployment the biological activity of immobilized TNF take place at a later date.
  • the present invention solves the technical problem on which it is based by providing nanoparticles comprising a support with a surface having functional groups 1A and at least one monomer of a protein of the TNF family, this at least one monomer having the functional groups 1A has binding complementary functional groups 2A and is connected to the functional groups 1A of the carrier via the functional groups 2A.
  • the invention therefore provides that via a bond between the first functional groups 1A present on the support surface and functional groups 2A present in the monomer of the protein of the TNF family, which are complementary to the functional groups 1A and have an affinity with them , preferably covalent bond, can immobilize the monomer on the surface takes place.
  • the functional group 2A is preferably positioned within the monomer of the protein of the TNF family in such a way that it is arranged outside the domains responsible for the biological activity at a suitable distance from these domains, and thus to maintain the biological activity of the monomers or one Monomer complex ensured on the carrier.
  • the functional group 2A it can be provided that only one monomer is connected to the support in the manner shown and is thus immobilized.
  • it can also be provided that several, in particular three, monomers are each connected to the support via their functional groups 2A and, in a particularly preferred embodiment, are immobilized in the form of a trimer.
  • first monomer is connected via its functional groups 2A to the functional groups 1A of the support, but this first monomer is associated with at least one via, for example, a covalent or non-covalent bond further, for example two further monomers, is present in a biologically functional unit, for example in the form of a trimer.
  • this one or more further monomers are not directly covalently or non-covalently linked to the support, but are immobilized on the support solely by the interaction with the first monomer.
  • each of these monomers can therefore take place, on the one hand, by virtue of the fact that this monomer forms an affine, preferably covalent, bond directly via its functional groups 2A with the functional groups 1A of the support.
  • the immobilization can also be given by the fact that a monomer is associated with another monomer via a non-covalent or covalent bond, which in turn is linked via its functional groups 2A to the functional groups 1A of the support, so that the associated monomer does not bind directly to the support.
  • the invention also provides that each monomer has a Has bond both to the carrier and to another monomer.
  • each monomer unit carries a functional group which is suitable for a preferably covalent immobilization. It is preferred that each trimer is immobilized via three covalent bonds. However, it is also possible for only one or two covalent bonds to form between the TNF trimer and the particle and for the trimer to be stabilized by disulfide bridges between the monomers and / or non-covalent interactions.
  • bioactive heteromers for example LT- ⁇ LT-ß 2 or LT- ⁇ 2 LT-ß ⁇ , which again preferably have three or else one or two covalent bonds are immobilized.
  • the bioactivity of membrane-bound TNF is achieved, inter alia, by arranging several TNF trimers adjacent to one another on the cell surface.
  • corresponding receptors are bound and arranged in a complementary manner on the neighboring cell.
  • the corresponding signal response is only triggered when this receptor cluster has formed.
  • Precisely such a clustering and the associated signal cascade is triggered by the immobilization of the TNF on the particle surface, ie on the ß particles are TNF molecules immobilized on the particle surface in a favorable geometric density.
  • This density of the TNF immobilizates is achieved, inter alia, by attaching the functional groups 1 A and 1 B used for binding the TNF molecules in an appropriate density (this is demonstrated, for example, by zeta potential measurements, compare FIG. 12).
  • these monomers are monomers which are identical to one another, that is to say trimers formed from homomers are immobilized.
  • trimers formed from heteromers are immobilized.
  • a “protein of the TNF family” (TNF: tumor necrosis factor) is understood to mean the TNF molecule itself and all members of the proteins belonging to the TNF family, the specific activities in vivo and / or in vitro via appropriate receptors that are specific for the respective TNF family member, that is to say exercise complementary receptors, in particular TNF- ⁇ , LT- ⁇ and LT- ⁇ , FasL, TRAIL, CD40L, CD27L, CD30L, OX40L, EDA, AITRL , VEGI, LIGHT, TWEAK, 4-1BBL, APRIL, BLYS and RANKL.
  • TNF tumor necrosis factor
  • TNF protein of the TNF family ⁇ is used synonymously with the abbreviation TNF and vice versa, unless stated otherwise.
  • TNF is therefore a protein that has an in vivo influence on inflammation, sepsis, lipid and protein metabolism, blood formation, angiogenesis, wound healing and immune defense and in vitro and / or in vivo, among other things, cytotoxic (apoptosis and necrosis ) or cytostatic effects, but also influences cell proliferation and differentiation.
  • TNF is also a protein that is at least temporarily on a cell surface within a natural cell assembly and controls the communication of the cell with its environment.
  • TNF can come into contact with cells on the surface of which the complementary receptors (for example, for TNF of TNFRl and TNFR2, for TRAIL, TRAILR 1-4) are present and trigger TNF-specific signals and thus TNF-specific effects.
  • the complementary receptors for example, for TNF of TNFRl and TNFR2, for TRAIL, TRAILR 1-4
  • the present invention solves the technical problem on which it is based by providing nanoparticles comprising a support with a surface having functional groups 1A and TNF immobilized on the support with the functional groups 1A binding complementary functional groups 2A, with TNF immobilized in the form of a trimer.
  • the present invention provides nanoparticulate carrier systems, in particular nanoparticles, with TNF immobilized thereon, the immobilization being based on an affine binding of TNF to the nanoparticle surface.
  • the ' immobilization of TNF on the nanopar The particles are made according to the invention via a bond between the first functional groups 1A on the support surface and the functional groups Apen 2A in the TNF molecule, which are complementary to the functional groups 1A and can form an affine, preferably covalent, bond with them ,
  • the functional group 2A of TNF is preferably positioned within the TNF molecule in such a way that it is arranged outside the domains responsible for the biological TNF activity at a suitable distance from these domains. In this way, it is possible according to the invention to immobilize TNF in a directed manner and to retain the biological activities on the carrier.
  • TNF is fixed on the support surface according to the invention in such a way that the three-dimensional structure of the domain (s) required for the biological activity is not changed compared to non-immobilized TNF. and that the TNF domain (s) is / are freely accessible to them upon contact with cellular reactants.
  • TNF is fixed in the form of trimers. According to the invention, it is provided that the breakdown of TNF trimers is prevented by the introduction of certain protein elements, in particular those protein structures which naturally form firmly linked trimers. After such stabilization, it is then provided according to the invention that not every TNF subunit of a TNF trimer has affine bonds between the functional groups 1A and 2A on the surface of the nanoparticle. Carrier must be fixed, but it is sufficient if at least one TNF subunit of a trimer is bound to the carrier.
  • the carrier systems used according to the invention are compact or hollow nanoparticles with sizes between 5 and 500 nm. These consist of either organic or inorganic particle materials. According to the invention, the type of material can be varied in accordance with the later application, the carrier of the nanoparticles preferably consisting of biologically compatible and / or biodegradable materials.
  • the nanoparticles according to the invention on the surface of which TNF is fixed, behave like cells with respect to the immobilized TNF molecules.
  • the nanoparticles according to the invention can, for example, come into contact with cells on the surface of which one or more TNF receptors, for example TNFR1 and TNFR2, are present and can trigger TNF-specific signals and thus TNF-specific effects.
  • the nanoparticles are at least one dimension smaller than 1 ⁇ m, they are also referred to as “nanocytes” according to the invention.
  • the nanoparticles according to the invention react on the one hand in analogy to membrane-bound molecules, but on the other hand also develop completely new surprising functions, the nanocytes according to the invention have a very broad application potential.
  • the nanoparticles can be used as Tools for molecular biological, cell biological and clinical research are used.
  • the use of the nanoparticles according to the invention offers the advantage that established methods can be used for the determination of bioactivity and thus rapid material screening can be carried out.
  • the nanoparticles according to the invention can be used, for example, in vitro in order to investigate the mode of action of membrane-bound molecules, in particular in signal transduction. Compared to direct cell-cell interaction, the nanoparticles according to the invention have the advantage that individual effects can be investigated in isolation.
  • the nanoparticles according to the invention can therefore also be used for in vitro diagnostics, for example in order to recognize and / or label certain cells, in particular tumor cells.
  • cells can be brought into a desired state or there is the possibility of switching back and forth between different cell states.
  • the nanoparticles of the invention can also be used to particular cells from complex biological media or liquids, such as to isolate blood or trigger directly in these liquids or media in these cells appropriate reactions, such as tion differentiation, Prol 'iferation or apoptosis.
  • technical systems can also be constructed on the basis of the nanoparticles according to the invention that allow a targeted and continuous separation of certain cells.
  • the nanoparticles according to the invention in particular those with biologically compatible or biodegradable carrier systems, can be used in vivo for the therapy of various diseases. Using the erfindungsge 'Maessen nanoparticles all diseases can be piert therapy-in which the normal cell-cell interaction is disturbed, that particular tumor diseases, wound healing processes and similar principle. However, nanoparticles according to the invention can also be used for tasks that normally take over cells of the immune system.
  • the nanoparticles according to the invention in particular those based on biologically compatible or biodegradable carrier systems, can advantageously be applied directly in vivo.
  • the nanoparticles according to the invention can also be deposited in the form of porous films. Microporous systems have great potential for extracorporeal therapeutic applications, for example in the field of tumor therapy, in order to selectively detect freely circulating malignant cells and, if appropriate, to kill them.
  • a “protein” is understood to mean a molecule which comprises at least two amino acids connected to one another via an amide bond Oligopeptide, a polypeptide or a part thereof, for example a domain or a binding see, be.
  • the protein especially TNF, can be of natural or synthetic origin. It can contain ain and / or unnatural and / or unusual amino acids modified by genetic engineering methods compared to the wild-type protein.
  • a protein, in particular a TNF molecule can be derivatized compared to the wild-type form, for example have glycosylations, it can be shortened, it can be fused with other proteins or it can be linked to molecules of another type, for example carbohydrates.
  • nanoparticles are understood to mean binding matrices which comprise a support with a surface on which chemically reactive functional groups are arranged, which have affine bonds, that is to say, with complementary functional groups of molecules to be bound, in particular TNF molecules covalent and / or non-covalent bonds, and thus fix the molecules stably on their surfaces
  • the supports of the nanoparticles consist of chemically inert inorganic or organic materials and have a size of less than 1 ⁇ m, preferably from 5 to 500 nm.
  • a “first functional group 1A” is understood to mean a chemical group that is applied to the surface of the nanoparticle carrier and that is capable of having a complementary functional group 2A that is, for example, on the TNF to be immobilized -Molecule is present to interact in such a way that an affine, preferably covalent Bond between the two binding partners can take place.
  • the first functional group is 1 A of Provisionober- surfactant selected from the group consisting nooeuvre from amino group, carboxyl group, epoxy group, doadmi Maleinimi-, alkyl ketone, Aldehydgru 'ppe, zinoli hydrazine, hydrazide group, thiol group and thionyl oester group.
  • the functional groups 2A of the TNF molecules to be immobilized are selected from a group which contains the same species as for the functional group 1A of the carrier surface.
  • the surface of a nanoparticle according to the invention thus has a first functional group 1A, which is covalently linked to a functional group 2A of the TNF molecule to be immobilized, the functional surface group 1A being a different group than the t. functional protein group 2 A is.
  • the two groups 1 A and 2 A which are bonded to one another must be complementary to one another, that is to say be able to form a covalent bond with one another.
  • the functional group 2A of the protein to be immobilized is a carboxy group.
  • a carboxy group is used as the functional surface group 1A
  • the functional complementary protein group 2A is according to the invention an amino group.
  • a thiol group is selected as the functional surface group 1A
  • the complementary protein group is a maleimido group according to the invention.
  • the complementary functional protein group 2A according to the invention is a thiol group.
  • the functional complementary protein group 2A is a hydrazine or hydrazide group.
  • the functional complementary protein group 2A is, according to the invention, an alkyl ketone, in particular methyl ketone or aldehyde group.
  • the functional group 1A on the carrier surface of the nanoparticle is particularly preferably a maleimido group and the functional group 2A of TNF is a thiol group.
  • TNF is directed as a trimer and is immobilized on the surface of the nanoparticles according to the invention while maintaining its biological activity.
  • immobilized TNF is synthetic, naturally occurring or recombinantly produced TNF with a wild-type sequence or with an imitated sequence. According to the invention it is also possible that TNF is chemically modified.
  • the term “directionally immobilized” or “directional immobilization” means that a molecule, in particular TNF, is immobilized on a support at defined positions within the TNF molecule in such a way that the three-dimensional structure of the for the biological activity required TNF domain (s) is not changed compared to the non-immobilized state and that this TNF domain (s), for example binding pockets for cellular reaction partners, is / are freely accessible to them upon contact with cellular reaction partners , "Directionally immobilized” also means that TNF is fixed on the support surface in such a way that the immobilized protein cannot or only very slowly be degraded by protein-degrading enzymes when it is later used in a cellular or cell-like environment. This means that the immobilized TNF molecule is oriented on the carrier surface in such a way that it offers as few points of attack for proteases as possible.
  • TNF in particular the TNF trimer
  • TNF after immobilization on the surface of a nanoparticle can perform the same or almost the same biological functions to at least a similar extent as the same TNF molecules in the non-immobilized state under suitable conditions in vitro conditions or the same TNF molecules in their natural cellular environment.
  • trimer or “TNF trimer” is understood to mean a compound which is formed by linking three subunits, in particular three TNF monomers, the linking of the monomers to one another preferably being effected by disulfide bridging between cysteine residues ,
  • the trimerization of TNF leads to a stabilization of the molecules compared to the TNF monomer.
  • the three TNF subunits linked to form a trimer can be identical TNF monomers, ie the trimer can be present as a homotrimer. According to the invention, however, the trimer can also comprise different TNF monomers, which can differ both in terms of their composition, for example amino acid sequence, and in terms of their length.
  • the immobilized TNF trimer not every TNF subunit has to be bound to the surface of the nanoparticle support.
  • the TNF trimer can also be fixed to nanoparticles by only one TNF subunit of the trimer being fixed to the support via a covalent bond between its functional group 2A and the functional group 1A.
  • trimer formation occurs spontaneously either before or during immobilization by high-affinity binding of a non-covalent type, but also in particular by covalent disulfide bridging between cysteine residues.
  • the TNF molecules to be immobilized contain a natural or synthetically produced multimerization module which trimerizes TNF by high-affinity binding of a non-covalent type, but in particular by forming covalent disulfide bridges, and thus regular and stable trimerization of TNF.
  • the Tenascin C multimerization module is particularly preferably introduced into the TNF molecules to be immobilized by genetic engineering or using chemical synthesis methods. The TNF molecules modified in this way are then trimerized either before or during immobilization on the nanoparticles according to the invention.
  • the surface of the nanoparticle according to the invention has further functional groups 1 B and TNF which has complementary groups 2 B which bind ( functional groups 1 B), the functional groups 1 B and 2 B according to the invention in particular can enter into a non-covalent bond.
  • a “second functional group 1 B” is understood to mean a chemical group that is capable of interacting with a complementary functional group 2 B that is present in a TNF molecule to be immobilized interact so that a non-covalent bond can take place between the two binding partners.
  • the second functional group 1B of the support surface is selected from the group consisting of oligohistidine group, Strep-Day I, Strep-Day II, desthiobiotin, biotin, chitin, chitin derivatives, chitin-binding domain, metal ion chelate complex, streptavidin, streptactin, Avidin and neutravidin.
  • the functional group 2 B of the TNF molecule to be immobilized is selected from a group which contains the same species as for the functional group 1 B of the support surface.
  • the surface of a nanoparticle according to the invention thus has a functional group 1 B which is non-covalently linked to a functional group 2 B of TNF, the functional surface group 1 B being a different group than the functional TNF group 2 B ,
  • the two groups which are in non-covalent bond with one another must be complementary to one another, that is to say be able to form a non-covalent bond with one another.
  • the functional complementary TNF group 2 B is an oligohistidine group. If an oligohistidine group is used as the functional surface group 1 B, the functional complementary TNF group 2 B is a metal chelate complex.
  • Strep Day I Strep Day II
  • Biotin or Desthiobiotin is used as the functional surface group 1 B
  • the complementary functional TNF- Group 2 B streptavidin, streptactin, avidin or neutravidin are used. If streptavidin, streptactin, avidin or neutravidin is used as the functional surface group 1 B.
  • strep day I strep day II, biotin or desthiobiotin is used as the complementary functional TNF group.
  • chitin or a chitin derivative is used as the functional surface group 1 B
  • a chitin-binding domain is used as the functional complementary TNF group 2 B.
  • a chitin binding domain is used as the functional surface group 1 B
  • chitin or a chitin derivative is used as the functional complementary TNF group 2 B.
  • the above-mentioned functional groups of the support surface and / or of TNF are preferably connected to the TNF molecule or the support surface to be immobilized by means of a spacer or are introduced onto the support or into the TNF molecule using a spacer.
  • the spacer thus serves on the one hand as a spacer between the functional groups and the carrier or the TNF molecule, and on the other hand also as a carrier for the functional group.
  • such a spacer can be an alkylene or ethylene glycol spacer with 2 to 50 C atoms, which is substituted in a preferred embodiment and has heteroatoms.
  • the spacer can be flexible and / or linear.
  • the spacer When using a spacer in connection with the first functional group 1A of the surface, the spacer binds covalently a side chain of an amino acid of TNF, where the amino acid to which the binding occurs can be a natural or unnatural amino acid. If the amino acid is a natural amino acid, it becomes an unnatural amino acid in the sense of the invention by binding to the spacer and the associated functional first surface group 1A.
  • the spacer connects a functional TNF group 2A with a support, this is preferably done via an anchor group arranged on the support, which is preferably designed as a silane with reactive groups, for example with SiO groups on the surface of the preferably oxidized see Si carrier can form covalent Si-O-Si bonds (silox bonds).
  • an anchor group arranged on the support, which is preferably designed as a silane with reactive groups, for example with SiO groups on the surface of the preferably oxidized see Si carrier can form covalent Si-O-Si bonds (silox bonds).
  • the spacer either connects a functional group of the support surface with TNF or a functional group of the protein with the support, the functional group also being able to be regarded as a component of the spacer, that is to say one of its functional groups.
  • the first functional surface group 1A is the amino group, carboxy group, epoxy group, maleimido group, alkyl ketone group, aldehyde group, hydrazine group, hydrazide group, thiol group or thioester group, which are used by means of a spacer, for example in the case an alkyl ketone group using levulinic acid, with a Side chain of a natural or unnatural amino acid present in the TNF molecule to be immobilized are connected or introduced into the TNF molecule through the spacer. If the connection to a natural amino acid takes place, this becomes an unnatural amino acid by binding with the spacer having the functional group.
  • a “carrier” is understood to mean a chemically inert substance which serves as a framework for the TNF molecule to be immobilized.
  • the carrier consists of a biologically compatible material.
  • the carrier a compact or hollow particle with a size of 5 nm to 500 nm.
  • biologically compatible means that the carrier or the surface of the nanoparticle both in terms of its material composition and in terms of its structure neither in the body of a recipient nor in isolated biological tissues or fluids does it cause an immunological, toxic or other reaction and does not or hardly disrupt cellular or molecular processes.
  • a biocompatible carrier is “biodegradable”, this means that a carrier in the body of a recipient or in biological tissues or liquids can be slowly broken down or metabolized, preferably after the TNF molecule immobilized on the carrier has its biological activity has unfolded, the products of degradation or metabolism not causing any immunological, toxic or other reactions and moreover being readily absorbable in the body of the recipient.
  • the carrier of the nanoparticle according to the invention contains or consists of a biologically compatible, preferably an inorganic or an organic material.
  • the nanoparticle according to the invention consists of an inorganic carrier material such as silicon, Si0 2 , SiO, a silicate, Al 2 0 3 , Si0 2 -Al 2 0 3 , Zr0 2 , Fe 2 0 3 , Ag 2 0, Zr 2 0 3 , Ta 2 0 5 , zeolite, Ti0 2 , glass, indium tin oxide, hydroxylapatite, calcium phosphate, calcium carbonate, Au, Fe 3 0 4 , ZnS, CdSe or a mixture thereof.
  • An organic, biologically compatible carrier material can be substances such as polypropylene, polystyrene, polyacrylates or a mixture thereof.
  • the carrier of the nanoparticle according to the invention consists of or contains a biodegradable material.
  • the biodegradable materials must be stable for the period of use, but can then be broken down so that separable fragments are obtained.
  • these are polyesters of polylactic acid, which have been additionally stabilized by crosslinking and are therefore biodegradable in a controlled manner.
  • a polyester of polylactic acid in particular poly (D, L-lactic acid-co-glycolic acid) (PLGA).
  • the carriers of the nanoparticles according to the invention can be produced using conventional processes known in the art, such as sol-gel synthesis processes, emulsion polymerization, suspension polymerization.
  • the surfaces of the nanoparticle carrier are formed by chemical modification reactions with specific functional groups. These functional groups have a chemical reactivity which is suitable for reacting with specific functional groups introduced into TNF molecules. TNF is bound both covalently and non-covalently via a chemical reaction between the TNF and the surface.
  • the carriers, in particular their surfaces, are therefore provided with suitable functional groups 1 A or functional groups 1 A and 1 B after they have been produced using customary processes, for example graft polymerization, silanization, chemical derivatization, etc.
  • the density of the functional groups and the distance between these groups can be optimized.
  • the surroundings of the functional groups can also be prepared for the most efficient, directed immobilization.
  • the inorganic carrier for example in the form of quartz, silica, diatomaceous earth, Silica gel and / or Si0 2 powder present silanized carrier before applying the functional groups 1 A and 1 B, preferably after prior hydrophilization.
  • the number of functional groups 1 A and 1 B of the surface can be varied by adding diluent silanes in the preferably provided silanization.
  • diluent silane is understood to mean an organosilane which carries biochemically inert functional groups and which, moreover, is not able to bind a spacer which carries the functional surface groups.
  • the diluent silane is preferably used in order to reduce the non-specific binding of proteins to the surface of the support in addition to the dilution effect.
  • the diluent silane has 2 to 20 alkylene groups starting from the silane head group, which are preferably followed by 2 to 6 oxoethylene groups and are terminated by, for example, a hydroxyl group or methyl ether group.
  • the thinner silanes on the support surface promote the self-assembly effect by means of the corresponding alkyl chain length.
  • these diluent silanes which are used in the silanization of the carrier, prevent the unspecific adsorption of proteins on the nanoparticle surface by added corresponding functional units, such as, for example, oligoethyl lenglycol units.
  • corresponding functional units such as, for example, oligoethyl lenglycol units.
  • other chemical compounds can also be used, provided they have a protein-repellent effect on their non-specific binding behavior.
  • the nanoparticles in particular the surface, have additional functionalities.
  • the support can in particular have fluorescent markings, UV / Vis markings, superparamagnetic functions, ferromagnetic functions and / or radioactive markings. Due to the functionalities used according to the invention, appropriately equipped nanoparticles can be easily detected and / or isolated using suitable devices.
  • the surface of the nanoparticle carrier can also have additional chemical compounds. These additional chemical functionalities apply. among other things after the later use of the nanocytes according to the invention. If these are to be used, for example, for the therapy and / or diagnosis of diseases, the nanoparticles can contain suitable chemical compounds with a therapeutic and / or diagnostic effect. In a particularly preferred embodiment it is provided that the nanoparticles according to the invention additionally contain medicinal substances such as cytostatics. Accordingly, they are particularly suitable for the therapy of tumor diseases. According to the invention, however, it can also be provided that the functionalization of the carrier takes place using one or more chemical compounds which are used for steric stabilization and / or
  • A serves to prevent a change in the conformation of immobilized TNF and / or to prevent the attachment of a further biologically active compound to the carrier. It is particularly preferred according to the invention that this chemical compound is a polyethylene glycol, an oligoethylene glycol, dextran or a mixture thereof.
  • the carrier can also contain other biological functions.
  • This further preferred embodiment carries ligands, for example peptides or proteins, on its surface which specifically bind selected tissues or cells.
  • the TNF molecule to be immobilized can be of natural or synthetic origin. It can also be modified from the wild-type protein by genetic engineering methods and / or contain unnatural and / or unusual amino acids.
  • the TNF molecule to be immobilized is produced by peptide-synthetic methods or by in vitro translation.
  • unnatural, preferably linker-spacer-bearing amino acids are specifically incorporated in the production, so that subsequently a directed TNF immobilization to the support, which is compatible with the preservation of the biological TNF activity, is possible.
  • the application of the principle of incorporation of unnatural amino acids also enables the targeted and selective incorporation of fluorophores or other markers on these unnatural amino acids.
  • these modifications can consist in that amino acids that occur naturally in the TNF molecule are replaced by unnatural amino acids, that is to say that a naturally occurring amino acid is removed in a certain position and an unnatural amino acid is inserted in the same place.
  • the insertion of an unnatural amino acid can be obtained by inserting a stop codon at the desired location, or carried out by using the use of a loaded with the corresponding unnatural amino acid suppressor tRN ⁇ and a thus carried out for in vitro translation approach.
  • Such unnatural amino acids are compounds which have an amino acid function and a radical R and are not defined by a naturally occurring genetic code, for example L- (6, 7-dimethyloxycoumaryl) alanine.
  • amino acids preferably have an alkyl ketone group or an aldehyde group, thioester group, thiol group, hydrazine group or hydrazide group.
  • These unnatural amino acids can be generated by genetic engineering or during chemical synthesis of TNF are inserted into the molecule, preferably together with a spacer or linker.
  • At least one amino acid is thus derivatized from TNF, in particular by introducing an alkyl ketone group, thiol group, aldehyde group, thioester group, hydrazine group and / or hydrazide group.
  • one of the preceding functions is connected via a spacer to the side chain of an unnatural or natural amino acid, or the spacer has such a function.
  • the spacer can be flexible or linear and, for example, have a chain length of 2 to 50 atoms.
  • the spacer is formed by alkylene groups which are optionally substituted and / or contain heteroatoms.
  • the spacer is formed by the binding of a side chain of an amino acid of TNF, for example lysine, to levulinic acid (4-oxopentanoic acid), a methyl ketone group being introduced at the same time and the spacer being accordingly formed from the side chain and levulinic acid.
  • TNF for example lysine
  • levulinic acid 4-oxopentanoic acid
  • a methyl ketone group being introduced at the same time and the spacer being accordingly formed from the side chain and levulinic acid.
  • the unnatural amino acid to be used already has an alkyl ketone group, aldehyde group, thiol group, thioester group, hydrazide group or hydrazine group, the aforementioned derivatization is no longer necessary. It can therefore be provided that a naturally occurring amino acid, for example lysine, to be modified, for example by derivatization of its side chain, in particular its primary amino group, with the carboxylic acid function of A levulinic acid. TNF molecules which have such a naturally occurring amino acid with unnatural derivatization are modified in the sense of the present teaching.
  • the modification of TNF takes place by introducing tags, that is to say markings, in particular at least three histidine residues, preferably oligohistidines, into the TNF molecule, preferably at the C-terminus or N-terminus, such
  • tags can also be arranged intramolecularly.
  • the surface of the carrier for example the silanized surface of the carrier, is provided with functional groups by applying metal chelate complexes. In this way, non-covalent binding of the metal chelate complexes to the oligohistidine residue of the TNF molecule to be immobilized is achieved.
  • the metal component of the metal chelate complex is a divalent metal cation, in particular nickel 2 "1" .
  • the form of the metal chelate complex is nickel-NTA (NTA: nitrilotriacetic acid), in particular a derivative thereof.
  • NTA nickel-NTA
  • the metal chelate complex, in particular Ni-NTA or a derivative thereof is bonded to the surface of the support, for example by means of a bond between a primary amino group of the NTA derivative and a surface-bonded epoxy group.
  • TNF is modified by adding at least one Strep day, for example Strep day I or Strep day II or biotin or desthiobiotin, to this, preferably at the C-terminus or N-terminus
  • a “strep tag” is also understood to mean functional and / or structural equivalents, provided that streptavidin and / or its equivalents can bind.
  • streptavidin therefore also covers the purposes of the present invention its functional and / or structural equivalents.
  • the surface of the carrier preferably an inorganic carrier, in particular the silanized surface of the carrier, is provided with streptactin, avidin, neutravidin or streptavidin.
  • the binding provided according to the invention between the TNF molecules to be immobilized and the surface of the carrier thus takes place through an affinity binding between, for example, strep tag and, for example, streptavidin. It is also possible that, for example, streptavidin on the TNF molecule and, for example, the strep tag as a functional group of the carrier. gers is provided. Of course, according to the invention it is also possible to carry out several of the modifications mentioned on the TNF molecule to be immobilized, for example an unnatural amino acid which contains oligohistidine and / or strep tags.
  • the invention therefore provides for TNF molecules modified with unnatural amino acids, natural but unnaturally derivatized amino acids, specific histidine and / or strep tags to be bound with surfaces that are complementarily reactive in such a way that a suitable binding of the TNF molecules and thus this is immobilized.
  • modified TNF molecules themselves are also the subject of the present invention.
  • bound TNF completely retains its biological functions.
  • the provided linkers or spacers between the carrier and TNF surface satisfy the steric requirements for immobilizing TNF while maintaining its activity.
  • the invention also enables the site-specific incorporation of reporter or marker groups, for example fluorophores, spin labels, gold particles for light scattering, etc., in positions which do not impair the functional properties of TNF.
  • reporter or marker groups for example fluorophores, spin labels, gold particles for light scattering, etc.
  • the immobilized and possibly also labeled TNF molecules are more stable against enzymatic or chemical degradation by maintaining their native conformation and retain their biological functions.
  • the biological activities that are based on protein-protein interaction are conveyed by the immobilized TNF molecules.
  • the TNF molecule is labeled with markers which allow its detection.
  • markers which allow its detection.
  • These can be, for example, fluorophores, spin labels, gold particles, radioactive markers or the like.
  • these markers for example the fluorophores, are able to show a specific change in the fluorescence emission when a binding partner to be detected in a test is bound to the bound TNF molecule.
  • the fluorophores can be inserted into the TNF to be immobilized using amino acids, in particular unnatural amino acids.
  • Fluorine markers suitable according to the invention are, for example, N-methyl-aza-tryptophan or coumarin derivatives, such as DCA (6, 7-dimethoxy-4-coumaryl) or NBD (N- ⁇ -7-nitro-benzofurazan-LN-diaminopropionic acid). According to the invention this can be done immobilizing TNF molecules can also be labeled with fluorophores that enable single-molecule detection, for example the fluorescent dyes CyDye (Ammersham Pharmacia Freiburg) or Alexa (Molecular Probes, Eugene, USA).
  • the detection according to the invention of surface-bound ligands of the immobilized TNF molecule can be carried out, for example, by matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry (MALDI-TOF).
  • MALDI-TOF matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry
  • the ace spectroscopic detection includes the identification and characterization of the bound ligands in situ as well as the spatially resolved analysis.
  • the detection of the surface-bound ligands can be done by fluorescence spectroscopy.
  • the binding of the ligand to the solid-phase ligand, ie TNF, immobilized according to the invention causes a change in the fluorescence properties of the fluorescence markers used according to the invention, which enables the binding events to be quantified.
  • the present invention thus also relates to methods for detecting an interaction of mobilized TNF with, for example, ligands such as receptors, functional or structural equivalents, analogs, agonists, antagonists or the like, in particular for the purpose of medical research and diagnostics, the nanoparticles according to the invention being used to identify the above-mentioned binding partners of immobilized TNF.
  • ligands such as receptors, functional or structural equivalents, analogs, agonists, antagonists or the like
  • the nanoparticles according to the invention being used to identify the above-mentioned binding partners of immobilized TNF.
  • appropriate nanoparticles with TNF immobilized thereon are brought into contact with a solution to be investigated which contains potential binding partners and an interaction or an inhibition of this interaction is demonstrated.
  • the aforementioned method thus also represents a method for identifying or screening potential binding partners, for example potential ligands, of the TNF immobilized according to the invention.
  • the invention likewise relates to methods for the quantitative isolation of substances which react, that is to say bind, with the TNF molecule immobilized according to the invention.
  • substances are, in particular, proteins.
  • the methods according to the invention and the nanoparticles according to the invention can also be used to identify substances which act, for example, as modulators, ie amplifiers, inducers or inhibitors for the, in particular physiological, interactions of TNF with other proteins.
  • Such inhibitors to be detected can be, for example, genetically modified, the body's own proteins, chemically synthesized compounds from substance libraries or other unknown substances that may have therapeutic benefits.
  • Interaction of the second reactant with the first Detect th reactants by a suitable detection method can be also preferably provided that the interaction of the second reactant with the first reactant ⁇ in the presence or ex entity is detected by suitable detection method of a potential modulator, for example, inducer or inhibitor and as potential inducers or inhibitors in their effectiveness, for example as Medicines that can be checked.
  • a potential modulator for example, inducer or inhibitor
  • potential inducers or inhibitors to be checked can come, for example, from substance libraries.
  • the inhibitor or the second reactant for example a protein, is a protein identified in genome sequencing projects.
  • the present invention thus also relates to methods for identifying and / or detecting a substance which interacts between immobilized.
  • the present invention also relates to methods for the directed immobilization of TNF on a
  • TNF activity the surface of an inorganic see or modified organic carrier by applying a first functional group 1A and optionally a second functional group IB and modified complementary functional groups 2A and optionally functional groups 2A having modified TNF molecules with the modified nanoparticle surface in such a way that a covalent bond between the functional groups 1 A and 2 A and, if necessary, a non-covalent bond between the groups 1 B and 2 B takes place in such a way that the protein binds to the nanoparticle while maintaining its biological activity.
  • the functional groups 1A and 2A are selected from the group consisting of amino group, carboxy group, epoxy group, maleimido group, alkyl ketone group, aldehyde group, hydrazine group, hydrazide group, thiol group and thioester group.
  • the functional groups 1 B and 2 B are selected according to the invention from the group consisting of oligohistidine group, Strep day I, Strep day II, desthiobiotin, biotin, chitin, chitin derivatives, chitin binding domain, metal ion chelate complex, streptavidin, streptactin, avidin and neutravidin.
  • the functional groups 1 A, 1 B, 2 A and / or 2 B can be connected to the carrier and / or protein using a spacer.
  • the functional groups 1A and 1B are applied to the carrier surface by means of graft polymerization, silanization or chemical derivatization.
  • the carrier can first be hydrophylized and then silanized.
  • the support surface is silanized, for example, with an organosilane, in particular SiR ⁇ R 2 R 3 R4, where R 1 to R 3 hydrolyzable groups such as alkoxy groups or halides, preferably chlorides, and R 4 is an organic radical which acts as a spacer with a first functional group 1 A or as a binding point for a spacer carrying the first functional group 1A.
  • R 4 is used as a binding site, for example as an epoxy group, for which the spacer having the functional group is designed, the functional groups are applied to the surface after the silanization, that is to say for example the maleimido group, etc ..
  • the density of the functional groups or the distance of the functional groups from the surface and thus the flexibility can be optimized if necessary.
  • the surroundings of the functional groups on the carrier surface are prepared for electrostatic and steric equipment for the most efficient, directed immobilization.
  • the carrier surfaces can also be equipped with molecules such as polyethylene glycols, oligoethylene glycols, dextrans and the like in order to prevent an undesired change in the conformation of the immobilized TNF molecules, which prevents the unspecific adsorption of other bio- to minimize logical connections and / or to sterically stabilize the carrier systems.
  • a coated surface of the nanoparticle carrier is immobilized, the appropriate protein modification being selected depending on the surface modification.
  • the TNF molecule to be immobilized is brought into contact with the modified surface under such conditions that degradation of the protein is minimized or prevented.
  • the invention provides for the nanoparticles according to the invention to be masked, if appropriate with the aid of a stealth method, in particular by packaging in, for example, liposomes, in order to achieve adequate biological circulation when the nanoparticles according to the invention are used later.
  • the nanoparticles with the TNF immobilized thereon on a membrane, the resulting film being mechanically and / or chemically stabilized by crosslinking.
  • the present invention also relates to the use of the nanoparticles according to the invention for the production of a pharmaceutical composition, in particular for tumor therapy.
  • a “pharmaceutical composition” is used to diagnose a see, therapeutic and / or prophylactic purposes understood mixture that contains natural or synthetically produced active ingredients in a form that can be easily administered to the patient. It is therefore provided according to the invention that the pharmaceutical composition to be produced contains the active substance, in particular TNF, in a form immobilized on a nanoparticle.
  • the pharmaceutical composition can be a solid or liquid mixture.
  • a pharmaceutical composition can optionally contain one or more pharmaceutical carriers and further additives such as stabilizers, thickeners, release agents, lubricants, colorants, odorants, flavorings, builders, emulsifiers or the like.
  • the present invention therefore also relates to a pharmaceutical composition which contains the nanoparticles according to the invention, ie does the TNF appear in immobilized form ? contains a nanoparticle according to the invention.
  • SEQ ID No. 1 shows the coding DNA sequence of a TNF fusion protein using the example of CysHisTNF (construct 1) with nucleotides 1 to 546;
  • SEQ ID No. 2 shows the translated amino acid sequence of amino acids 1 to 181 derived from SEQ ID No. 1;
  • SEQ ID No. 3 shows the coding DNA sequence of a TNF fusion protein using the example of TNC-TNF (construct 2) with nucleotides 1 to 705, and
  • SEQ ID No. 4 shows the translated amino acid sequence derived from SEQ ID No. 3 with amino acids 1 to 234.
  • Figure 1 shows the results of a bioassay with the target cell KYM-1.
  • FIG. 1 shows the results of electrophoresis.
  • FIG. 3 shows the results of a further bioassay with the target cell KYM-1.
  • FIG. 4 shows the results of a bioassay, the effect of nanoparticles according to the invention on KYM-1 tumor cells compared to that of soluble human recombinant TNF as a control being investigated.
  • FIG. 5 shows the results of a bioassay, the effect of nanoparticles according to the invention on Co-Io205 tumor cells compared to that of soluble human recombinant TNF as a control being investigated.
  • Controls were with soluble human TNF with or without coincubation with the monoclonal agent antibody 80M2, which itself has no agonistic activity.
  • FIG. 6 shows the results of a further bioassay with the target cell KYM-1, the effect of the nanoparticles according to the invention compared to that of soluble human recombinant TNF as a positive control and nanoparticles not loaded with TNF as a negative control being investigated.
  • FIG. 7 shows the results of a further bioassay with mouse fibroblasts which express human TNFR2 and are therefore a cell model for recording bioactivity similar to membrane TNF.
  • the figure shows the properties of the TNF nanocytes (conjugate) comparable to the natural membrane TNF in comparison to positive (80M2 plus TNF) and negative (hu-TNF, 80M2, unloaded particles) controls.
  • FIG. 8 shows the results of waveguide spectroscopy resonance analyzes, in which the modified tumor necrosis factor receptor 1 (TNFRl-Fc) was immobilized on a carboxymethyldextran matrix (CMD matrix) via ⁇ -amino groups and binding studies were then carried out with CyHISTNF.
  • CMD matrix carboxymethyldextran matrix
  • the plotting of the association rate constant (kon) against the CysHisTNF concentration is another method of determining the K D value and is used to determine the K D value determined.
  • the intersection of the straight line with the Y axis corresponds to the half-life t ⁇ / 2 of the ligand-receptor complex and is therefore a measure of the stability of the CysHisTNF-receptor complex.
  • FIG. 9 shows the results of waveguide spectroscopy resonance analyzes, the modified tumor necrosis factor receptor 2 (TNFR2-Fc) being immobilized on a CMD matrix via ⁇ -amino groups and then binding studies carried out using CyHISTNF.
  • the plot of the extent of binding of CysHisTNF (extent) against the concentration used (ligate) results in a binding curve that describes the maximum possible binding in the saturation range (Bmax).
  • Bmax maximum possible binding in the saturation range
  • the intersection of the straight line with the Y axis corresponds to the half-life t ⁇ 2 of the ligand-receptor complex and is ? thus a measure of the stability of the CysHisTNF-receptor complex.
  • FIG. 10 shows the results of waveguide spectroscopy resonance analyzes, the modified tumor necrosis factor receptor 1 (TNFRl-Fc) being immobilized on a CMD matrix via ⁇ -amino groups and then binding studies with TNF carried out.
  • the plot of the amount of TNF binding (extent) against the concentration used (ligate) results in a binding curve that describes the maximum possible binding in the saturation range (Bmax).
  • Bmax the maximum possible binding in the saturation range
  • the intersection of the straight line with the Y axis corresponds to the half-life t ⁇ 2 of the ligand-receptor complex and is thus a measure of the stability of the TNF-receptor complex.
  • FIG. 11 shows the result of Ase from waveguide spectroscopy resonance analyzes, the modified tumor necrosis factor receptor 2 (TNFR2-Fc) being immobilized on a CMD matrix via ⁇ -amino groups and then binding studies with TNF carried out.
  • the plot of the amount of TNF binding (extent) against the concentration used (ligate) results in a binding curve that describes the maximum possible binding in the saturation range (Bmax).
  • Bmax the maximum possible binding in the saturation range
  • the intersection of the straight line with the Y axis corresponds to the half-life t ⁇ 2 of the ligand-receptor complex and is thus a measure of the stability of the TNF-receptor complex.
  • FIG. 12 shows the results of zeta potential studies.
  • Magnetic iron oxide carriers 200 ml of a 1 M FeCl 3 solution and 5 ml of a 2 M FeS0 4 solution in 2 M HCl were added to 250 ml of a 0.7 M NH 3 solution with vigorous stirring. The mixture was then stirred for 30 minutes and the black solid formed was washed with 200 ml of water. The precipitate was stirred for 30 minutes with 100 ml of 2 M HN0 3 and washed ⁇ three times with 100 ml of water. The superparamagnetic iron oxide carriers were resuspended in 50 ml of a 0.1 M tetramethylammonium hydroxide solution. This gave 2 g of iron oxide particles with an average particle size of 10 nm.
  • Example 1.2 50 mg of the magnetic iron oxide particles obtained in Example 1.2 were washed twice with 5 ml of ethanol and then taken up in 200 ml of ethanol. 12 mmol of tetraethoxysilane and 90 mmol of NH 3 were added to the solution. The mixture was then stirred at room temperature for 24 hours. The particles were then cleaned by multiple centrifugation. 600 mg of magnetic composite particles with an average particle size of 150 nm were obtained.
  • a 1% by weight aqueous suspension of the supports obtained in Examples 1.1 to 1.4 was mixed with 10% by volume of 25% ammonia. 20% by weight of amino pro pyltriethoxysilane, based on the carrier, was added and the mixture was stirred at room temperature for one hour. The particles were cleaned by repeated centrifugation. The particles obtained have functional amino groups on their surface (zeta potential in 0.1 M acetate buffer: +35 mV).
  • the Siliea particles obtained carry functional carboxy groups (zeta potential in 0.1 M acetate buffer: -25 mV) on their surface and have an average particle size of 160 nM.
  • This dextran surface is particularly suitable for the immobilization of proteins whose tertiary structure is disturbed by adsorption processes on the carrier surface.
  • a 1 M ethylenediamine solution in 0.1 M MES buffer pH 5.0 was prepared.
  • 500 ⁇ g of the carboxy- (dextran) -modified carrier and 30 ⁇ l of a 500 ⁇ mol / ml EDC solution in MES buffer were added. Then three hours was shaken at room temperature '. The carriers were then washed several times with MES buffer. Carriers with an average particle size of 160 nm and a zeta potential of + 25 mV in 0.1 M acetate buffer.
  • amines can also be used in an analogous manner, for example 4, 7, 10-trioxa-l, 13-tridecanediamine (or higher homologs) or tris (2-aminoethyl) amine.
  • NTA Nitrilotriacetic acid
  • amino-functionalized particles e.g. 2.1, 2.2, 2.5
  • 10 mM phosphate buffer pH: 7.0
  • heterofunctional polyethylene glycols such as mPEG-succinimidyl-propionate, t-Boc-NH-PEG-succinimidyl-propionate, maleinimido-PEG-succinimidyl-propionate or mixtures thereof
  • protective groups are present on the surface, they are removed by treatment with 1% trifluoroacetic acid for 2 hours.
  • the particles are washed twice with 1 ml of 10 mM phosphate buffer (pH: 7.0).
  • This surface is particularly suitable for the immobilization of proteins via disulfide bridges.
  • Example 2.3 the concentration of succinic anhydride is reduced.
  • the isoelectric point of the carrier system varies within a wide range, for example between 8 and 3, by a suitable choice of the NH 2 / COOH ratio. This is a crucial parameter for controlling the reactivity when reacting with proteins, since systems with the same charge repel each other ,
  • the first graph shows the implementation of unmodified silica particles with aminosilanes (analogous to example 2.1.).
  • these amino-functionalized surfaces are implemented with succinic anhydride (analogous to example 2.3.).
  • the resulting carboxy groups on the particle surface can be further reacted, for example, with ethylenediamine, as can be seen in graph 3 (analogously to example 2.5.).
  • the zeta potential and thus the density of the functional groups on the particle surface can be controlled by varying the modifier concentration.
  • the reaction is carried out as in Examples 2.6 or 2.7, but using a mixture of the two modifiers.
  • His-tag-bearing proteins are aligned non-covalently in a first step, this state then being permanently fixed by forming a covalent disulfide bridge.
  • the surface-modified nanoparticles produced above were used to immobilize TNF molecules.
  • the TNF molecules were coupled to the inert carriers in a directional manner while maintaining their signaling ability, so that when the nanoparticles were used, an interaction with a TNF receptor was possible and the signal response of the cell was measurable in defined cell systems.
  • the linker-modified fusion protein CysHisTNF was constructed, which has a reactive thiol group near the N-terminus, .. which, for example, can form a covalent bond with a maleimido group on the surface of nanoparticles.
  • the protein was additionally provided with a Gly-rich linker with a His tag consisting of two or more histidine residues, whereby the protein can be bound to an affinity matrix loaded with Ni 2+ and eluted with imidazole.
  • the His tag allows non-covalent binding of CysHisTNF to metal ion chelate complexes, in particular nickel-nitrilotriacetic acid (NTA) groups on the surface of nanoparticles.
  • NTA nickel-nitrilotriacetic acid
  • the functional protein was cloned using standard methods, for example using methods for site-specific mutagenesis, and is detailed below.
  • the DNA sequence is shown in SEQ ID No. 1 with nucleotides 1 to 546.
  • the associated amino acid sequence with amino acids 1 to 181 is shown in SEQ ID No. 2.
  • the structure from the N-terminus to the C-terminus is as follows:
  • linker 1 poly-Gly linker with a Cys (NT 25-27, AA 9) and a His tag (NT 43-60, AA 15-20): NT 1-78, AA 1-26
  • TNF module mature form of the human TNF protein (17.5 kDa form, recombinant TNF, Swissprot # P01375, AA 1-157) with deletion of the N-terminal 2 AA (TNF delta a 1 , 2 ): NT 79-543, AA 27-181
  • CysHisTNF This fusion protein (abbreviated: CysHisTNF) was produced as follows:
  • the TNF fragment (AA 3-181) was cut out from another PinPointHisTNF construct (prokaryotic vector PinPoint TM Xa-3, described in "PinPoint TM Xa Protein Purification System", Promega) by restriction digestion of the plasmid DNA with SacI and HindIII The fragment isolated after preparative agarose gel electrophoresis and DNA elution was inserted into a modified vector (pQE 5, QIAexpress®, Qiagen) which had been previously digested with BamHI and HindIII.
  • PinPointHisTNF construct prokaryotic vector PinPoint TM Xa-3, described in "PinPoint TM Xa Protein Purification System", Promega
  • the construct was sequenced to verify the cDNA sequence. '
  • the construct obtained in this way allows prokaryotic expression of the fusion protein CysHisTNF. This was largely carried out according to the manufacturer's instructions (QIAexpress® System, Qiagen). IPTG was not added to induce expression (basal induction).
  • the bacterial lysate (cytoplasmic extract) was used for the enrichment.
  • the TNF protein was purified by means of affinity chromatography (IMAC, HiTrap® affinity column, Amershampharmacia biotech). According to the manufacturer, the protein was bound to an affinity matrix loaded with Ni 2+ and eluted with imidazole.
  • FIG. 1 shows the result of the investigation with regard to the induction of apoptosis on TNF-sensitive tumor cell lines.
  • the figure shows that the TNF fusion protein CysHisTNF has a high bioactivity.
  • FIG. 1 shows cells of the human rhabdomyosarcoma line KYM-1. These were cultivated at 37 ° C, as in Grell et al., 1995 and Grell et al. , 1994. For the bioassay, 1 ⁇ 10 4 cells / well were sown in 96-well microtiter plates and incubated under culture conditions overnight.
  • the cells were then cultured for 16-20 h in the presence of titrated concentrations of human recombinant TNF- ⁇ (A) or CysHisTNF [bacterial lysate ( ⁇ ), purified protein (T)] and the metabolic cell activity via an MTT test quantified (Grell et al., 1995).
  • the absorbance was determined at 550 nm. The mean values from a typical experiment + SD are shown.
  • a fusion protein with the multimerization domain from the tenascin C molecule was constructed.
  • the multimerization domain from this molecule allows targeted covalent trimerization of the TNF fusion protein and contains at the N- Terminus two cysteine residues.
  • This fusion protein was cloned by standard methods, as described in detail below (Example 2).
  • the DNA sequence is in SEQ ID No. 3 with the
  • the associated amino acid sequence with amino acids 1 to 234 is shown in SEQ ID No. 4.
  • TNF-module mutated form of ⁇ - natural TNF precursor protein human (26 kDa membrane form, Swissprot # P01375, 233 AA) with 'Delet, ions of the N-terminal 56 AA and of AA 78-89 (TNF de ⁇ ta 56, 78- 89), ie deletion of the cytoplasmic domain, the transmembrane domain and the TACE cleavage site of the TNF precursor peptide: NT 133-627, AA 45-209
  • fusion protein was expressed, inter alia, in prokaryotic cells, in particular in E. coli, mammalian cells and in the baculovirus expression system. TNF fusion proteins can be functionally expressed in mammalian cells as described in
  • TNF-fusion protein TNC-TNF was also expressed prokaryotically.
  • TNF fusion protein with the multimerization domain from the Tenascin C molecule (AA 110-139, Swiss Prot. Accession No. P10039, chicken; or Swiss Prot. Accession No. P24821, human) (described in Wüest et al. , 2002, patent WO 02/22833).
  • This domain with a so-called "coiled-coil” structure allows targeted covalent trimerization of the TNF fusion protein and contains two cysteine residues at the N-terminal.
  • the exact position of the thiol groups within the protein sequence depends on the selected expression system (different linker sequences).
  • the TNC- TNF contains 2 cys at positions 10 and 12 (SEQ ID No. 3).
  • the TNC-TNF fragment (AA 9-234, see sequence 2) was derived from a construct / plasmid pGD105TNC-TNF (eukaryotic expression vector pGD105, described in EP 0 953 639) cut out and subcloned into a prokaryotic vector.
  • the plasmid DNA pGD105TNC-TNF was amplified by means of primers 1 and 2 and proof-reading PCR, as a result of which the interfaces Pst I and HindIII were introduced.
  • the sequence segment coding for the tenasc'in and the TNF domain was obtained by PstI / HindIII digestion.
  • the isolated fragment was inserted into the corresponding sites of the modified pQE-5 vector (Qiagen).
  • the vector pQE-5 was previously digested with PstI and HindIII.
  • Example 1 (Example 1) expressed. In deviation from this, the bacterial cells were cultivated at 30 ° C. (without induction of expression). In FIG. 2, the result of a gelelektrophoreti- separation rule according to the expression 'of TNF fusion protein is depicted. Western blot analysis shows that under non-reducing loading
  • the TNC-TNF is cleaned as described in 3.1.1.
  • FIG. 3 shows the result of the examination with regard to the induction of apoptosis on TNF-sensitive tumor cell lines.
  • the figure shows that the TNC-TNF has a high biological activity.
  • the KYM-1 cells (1.1 ⁇ 10 4 cells / well) were cultivated as described in FIG. 1.
  • the cells were incubated with serial dilutions of soluble human recombinant TNF- ⁇ (D) and TNC-TNF [bacterial lysate (•)] for 16 h at 37 ° C.
  • the proportion of living cells was quantified using an MTT test (see FIG. 1).
  • the absorbance was determined at 560 nm.
  • the mean values ⁇ SD are shown in each case.
  • TNF fusion proteins see 3.1.1 and 3.1.2
  • a maleimido-activated surface see Example 2.9
  • final concentration of the nanoparticles between 500 and 1000 ⁇ g / ml.
  • the two coupling components were mixed and for 30-45 min. incubated at room temperature in 2 ml of 10 mM sodium phosphate buffer pH 7.2 (final volume).
  • the particles were separated from the soluble component by centrifugation at 13,000 rp (Eppendorf cooling centrifuge 5403) for 10 min. at 4 ° C.
  • the carrier-immobilized TNF fusion protein was washed twice with 1-2 ml PBS and taken up in RPMI 1640 medium with a proportion of 5% FCS or PBS (depending on the further analyzes). '
  • TNF molecules were immobilized on the nanoparticles.
  • the nanoparticles obtained with TNF immobilized on them were characterized with regard to their biological activity using defined cellular test systems, in particular tumor cell lines. These cell systems enable sensitive detection a differential biological activity of soluble and nanoparticle-coupled TNF variants.
  • the cytotoxic effect of the nanoparticles A according to the invention with TNF immobilized thereon on KYM-1 cells, Colo205 cells and MF-R2Fas cells was recorded.
  • the effect of the nanoparticles according to the invention with TNF immobilized thereon was compared with the effect of human recombinant TNF- ⁇ in solution as a control.
  • the tests with regard to the effect of the nanoparticles and soluble TNF according to the invention on the cell lines mentioned above were carried out using standard methods.
  • the ECso values of immobilized and in solution TNF were determined and compared.
  • the KYM-1 cells were cultivated as described in FIG. 1.
  • the cells were incubated for 18 h at 37 ° C. in the presence of titrated concentrations of the conjugates from the coupling approaches A 1 - A 3 (carrier see 2.1).
  • the proportion of living cells was determined by the MTT method.
  • Human recombinant TNF- ⁇ ( ⁇ ) was used as the standard (see Fig. 1).
  • the loading of the particles with CysHisTNF was determined using a sandwich ELISA (OPTEIA TM Human TNF- ⁇ Elisa Kit, BD PharMingen).
  • Table 1 shows the EC o values for the TNF conjugates as compared to recombinant human TNF- ⁇ .
  • the bioassay to determine the effect of immobilized and non-immobilized TNF on the target cells Colo205 was carried out according to standard methods. Control approaches were carried out with soluble TNF with or without coincubation with the monoclonal antibody 80M2, which itself has no agonistic activity.
  • the Results relating to the effect of the nanoparticles according to the invention on these target cells in comparison with the effect of soluble human recombinant TNF on the target cell An Colo205 are summarized in FIG. 5 and Table 2.
  • the colon carcinoma cell line Colo205 was seeded in 96-well microtiter plates (1.1 ⁇ 10 4 cells / well) and incubated overnight, as described in Grell et al., 1995.
  • the Colo205 cells were serialized Dilutions of the conjugates from the coupling approaches A 1 - A 3 were incubated at 37 ° C. for 40 h.
  • Colo205 cells were additionally cultured with soluble human recombinant TNF- ⁇ (V) in the absence and presence of the TNF receptor R2-specific antibody 80M2 (0, ⁇ ; 1 ⁇ g / ml).
  • This onoclonal antibody itself has no agonistic activity, but together with soluble hu-TNF TNF receptor R2 induces specific signals (Grell et al., 1994).
  • the proportion of living cells was determined by the MTT standard method (cf. FIG. 1).
  • the loading of the particles with CysHisTNF was determined by means of a sandwich ELISA (cf. FIG. 4).
  • the Colo205 tumor cell line is largely resistant to the cytotoxic effect of soluble TNF, while stimulation of the TNF-R2 receptor with membrane-bound TNF, the so-called pro-form of TNF, as well as with immobilized TNF, leads to the induction of apoptosis.
  • the membrane-TNF equivalent properties of the TNF-conjugated nanoparticles (nanocytes) are confirmed in Example 4 in a further cell model.
  • the following figures further demonstrate the bioactivity mediated by conjugates / NANOCYTES on tumor cell lines.
  • surface-modified carriers were used which have a dextran layer '(CMD matrix, see 2.4).
  • the TNF receptor R2 stimulation was demonstrated via the induction of apoptosis (see FIGS. 6 + 7).
  • the specific biological activity / functionality of the conjugate was first determined in a standardized cytotoxicity test on KYM-1 cells (implementation see FIGS. 1 and 4).
  • the carriers described in 2.4 were used for the coupling approach.
  • Human recombinant TNF- ⁇ (D) was used as the standard.
  • Unloaded particles do not induce apoptosis (0).
  • the proportion of living cells was determined by the MTT standard method.
  • the loading of the particles with CysHisTNF (•) was quantified using a sandwich ELISA.
  • the biological activity of the conjugate described in FIG. 6 was determined in a further bioassay on mouse fibroblasts (1.2 ⁇ 10 4 cells / well) (FIG. 7).
  • This cell line expresses a TNF-R2-Fas chimeric TNF receptor, which expresses the cytoplasmic domain of the death receptor Fas (CD95) and the extra- contains the cellular domain of the human TNF receptor R2, as described in Krippner-Heidenreich et al., 2002.
  • the cell line is highly sensitive to the membrane form of hu-TNF-a [membrane equivalent
  • a stimulus (0) see Fig. 7], but largely resistant to soluble hu-TNF- ⁇ ( ⁇ ).
  • the proportion of living cells was determined by the crystal violet staining / method;
  • the loading of the particles with CysHisTNF (•) was determined by means of a sandwich ELISA (cf. FIG. 4).
  • TNFRl-Fc Modified tumor necrosis factor receptors 1
  • TNFR2-Fc tumor necrosis factor receptors 2
  • CMD matrix carboxymethyldextran matrix
  • Binding studies were then carried out. Different concentrations of TNF or Cys-TNF to the receptors were tracked online over time for binding. Regeneration occurred after each binding, that is to say the bound ligand was removed from the immobilized matrix. see. A receptor-loaded matrix was therefore available for at least 10 bonds. The following parameters could now be determined from the raw data obtained in this way:
  • the plotting of the association rate constant (kon) against the TNF or CysHisTNF concentration is another method of determining the K D value and is used to determine the K value determined under point 2.
  • the point of intersection of the straight line with the Y axis corresponds to the half-life t 2/2 of the ligand-receptor complex and is thus a measure of the stability of the TNF or CysHisTNF-receptor complex.
  • TNF-Selectokine a novel prodrug generated for tumor targeting and site-speeifie activation of tumor necrosis factor , Oncogene 21, 4257-4265 (2002)

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Nanopartikel mit daran immobilisiertem Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) oder Cytokin, wobei TNF oder das Cytokin vorzugs- weise in Form eines Trimers gerichtet und unter Beibehaltung seiner biologischen Aktivität am Träger immobilisiert ist, Verfahren zur gerichteten Immobilisierung von TNF oder Cytokin an Nanopartikeln, die Verwendung der immobilisierten TNF oder Cytokin aufweisenden Nanopartikel zur Identifizierung und/oder Isolierung von Cytokinoder TNF- Bindungspartnern sowie zur Identifizierung und/oder Isolierung von Hemmstoffen der Interaktion zwischen TNF oder Cytokin und seinen Bindungspartnern, die Verwendung derartiger Nanopartikel zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, insbesondere zur Therapie von Tumoren, sowie pharmazeutische und diagnostische Zusammensetzungen, die derartige Nanopartikel enthalten.

Description

Nanopartikel mit daran immobilisiertem biologisch aktivem TNF
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Nanopartikel mit daran immobilisiertem Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) , wobei TNF in Form eines Trimers- gerichtet und unter Beibehaltung seiner biologischen Aktivität am Träger immobilisiert ist, Verfahren zur gerichteten Immobilisierung von TNF an Nanopartikeln, die Verwendung der immobilisierten TNF aufweisenden Nanopartikel zur Identifizierung und/oder Isolierung von TNF-Bindungspartnern sowie zur Identifizierung und/oder Isolierung von Hemmstoffen der Interaktion zwischen TNF und seinen Bindungspartnern, die Verwendung derartiger Nanopartikel zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, insbesondere zur Therapie von Tumoren, sowie pharmazeutische und diagnostische Zusammensetzungen, die derartige Na- nopartikel enthalten.
In lebenden biologischen Geweben ist eine koordinierte Signalübertragung zwischen unterschiedlichen Zellen und/oder Zellkompartimenten, das heißt über Membranstrukturen hinweg, erforderlich, um die Ho- möostase zu erhalten und eine Adaption an äußere Veränderungen zu ermöglichen. Während die durch lösliche Mediatoren vermittelten inter- und intrazellulären Signaltransduktions-Mechanismen bereits heute anhand zahlreicher Beispiele gut charakteri- siert sind, sind interzelluläre Signale, die durch membranständige Interaktionspartner vermittelt werden, oft "noch weitgehend unverstanden. Zellvermit- telte Signale sind jedoch für alle vielzelligen Organismen und damit auch für die Aufrechterhaltung multizellulärer Organverbände bei höheren Lebewesen essentiell. So hat sich gezeigt, dass normale Kör- perzellen bei Entfernung aus ihrem Gewebeverband wichtige Überlebenssignale verlieren. Sie sterben dann über einen Prozess ab, der als Anoikis (Vereinsamung) bezeichnet wird, wobei dessen molekularer Mechanismus dem programmierten Zelltod (Apopto- se) entspricht. Die Kenntnis solcher Überlebenssignale und ihrer molekularen Wirkmechanismen ist insbesondere für das gesamte Gebiet der Onkologie relevant, da Tumorzellen genau diese Regulationssysteme umgehen beziehungsweise ausschalten müssen, damit maligne Tumore gebildet werden können.
Die Probleme bei der Erforschung interzellulärer Signalmechanismen sind teilweise rein technischer Art. So ist es beispielsweise in vielen Fällen nicht möglich oder aus methodischen oder techni- sehen Gründen sehr aufwendig, zwei unterschiedliche Zellpopulationen räumlich und zeitlich kontrolliert interagieren zu lassen und dabei ihre Reaktionen parallel zu beobachten. Darüber hinaus löst eine solche Interaktion stets eine Vielzahl von Signalen aus, die nicht oder kaum der großen Zahl von Signalmolekülen zugeordnet werden können. Um die Wirkung eines einzelnen Signalstoffes gezielt bestimmen zu können, werden im Stand der Technik daher rekombinante lösliche Derivate membranständiger Li- ganden und ihrer Rezeptoren hergestellt und untersucht. Die auf diese Weise erhaltenen Daten können jedoch zu einer Fehleinschätzung der eigentlichen physiologischen Bedeutung eines definierten Signalprozesses führen, da das zugrunde liegende Testsystem gegenüber dem tatsächlichen Geschehen eine grobe Vereinfachung darstellt.
Der Tumor-Nekrose-Faktor gehört zu der Klasse der Cytokine, bei denen es sich um Substanzen handelt, die von einer Vielzahl von Zellarten gebildet und sezerniert werden und die als interzelluläre Mediatoren eine Vielzahl zellulärer Prozesse regulieren. Cytokine umfassen beispielsweise Lymphokine, Inter- leukine, Monokine und Wachstumsfaktoren. Der Tumor Nekrose Faktor (TNF, auch TNF- oder Kachektin genannt) ist das namensgebende Mitglied einer großen Gen-Familie von Cytokinen, die strukturell homolog sind und vielfältige, teilweise überlappende biologische Eigenschaften besitzen. Zu den heute bekannten Mitgliedern gehören TNF selbst und u.a. Lympho- toxin alpha (LT-α) , das wie TNF an die gleichen Rezeptoren (TNFR1 und TNFR2) bindet und daher sehr ähnliche Signaleigenschaften aufweist, sowie LT-ß, FasL, CD27L, CD30L, CD40L, TWEAK, OX40L, EDA, AITRL, VEGI, LIGHT, 4-1BBL, APRIL, BLYS, RANKL und TRAIL, für die jeweils ein oder mehrere spezifische Membranrezeptoren existieren (Locksley et al, Cell, 104:487-501, 2001). Die Moleküle der Tumornekrose- faktor (TNF) -Ligandenfamilie sind über ihre komplementären Rezeptoren, die als TNF-Rezeptorfa ilie zusammengefasst sind, an einer Vielzahl vor allem immunregulatorischer Prozesse beteiligt. Von ganz wenigen Ausnahmen abgesehen handelt es sich bei den Mitgliedern der TNF-Ligandenfamilie um Membranproteine des Typ II (Locksley et al, s.o.). Von diesen membranständigen Formen können sich durch spezifische Proteolyse oder alternatives Spleißen jedoch in vielen Fällen auch lösliche Formen ableiten. In manchen Fällen können sich die löslichen und memb- ranständigen Formen von Mitgliedern der TNF- Ligandenfamilie beträchtlich in ihrer Bioaktivität unterscheiden (Grell et al, Cell, 1995) . Im Gegensatz zu Lymphotoxin (LT-α) , das ein echtes sezer- niertes Protein darstellt, wird TNF, wie die meis- ten anderen Mitglieder der TNF-Familie von der produzierenden Zelle jedoch immer erst als membranständiges TNF produziert, aus dem sich das klassische lösliche Cytokin TNF erst durch proteolytische Spaltung bildet. Dieses Membran-TNF stellt ein ech- tes Transmembranprotein dar, welches in trimerer Form vorliegt und biologisch aktiv ist. Dabei konnte gezeigt werden, dass Membran-TNF ein besonderes Spektrum an zellulären Wirkungen besitzt, die von löslichem TNF und auch von LT-α nicht erreicht wer- den (Grell et al . , Cell, 83 (1995), 793-802). Interessanterweise verhalten sich andere Mitglieder der TNF Familie ähnlich, d.h. sie sind in der normalen, membranständigen Form bioaktiv und als proteoly- tisch prozessierte lösliche oder anderweitig in löslicher Form vorkommende Moleküle entweder biologisch gänzlich inaktiv oder zeigen, wie im Falle von TNF, ein eingeschränktes Wirkspektrum. Beispielsweise ist dies außer bei TNF auch für FasL, TRAIL und CD40L gezeigt (Wajant und Pfizenmaier, Onkologie, 24:6-10, 2001). TNF wird vor allem von Makrophagen/Monocyten, Lymphocyten und Mastzellen gebildet und hat Einfluss auf Entzündungen, Sepsis, den Lipid- und Proteinstoffwechsel, die Blutbil- dung, Angiogenese, Wundheilung und Immunabwehr und übt cytotoxische beziehungsweise cytostatische Wirkung auf bestimmte Tumorzellen aus. Lymphotoxin-α wirkt ebenfalls cytotoxisch auf einige Tumorzellli- nien. Über die molekulare Basis der vielfältigen TNF-α-Wirkungen in vivo und in vitro ist relativ wenig bekannt. Die Analyse der Kristallstruktur des rekombinanten, löslichen TNF-α-Moleküls hat ergeben, dass diese Substanz ein oligomeres Protein ist, das aus drei identischen Untereinheiten von jeweils 17,5 kDA besteht.
Bislang sind zwei verschiedene TNF-spezifische
Membranrezeptoren von 55 kDA (TNFRl) und 75 kDA (TNFR2) identifiziert worden. Es ist bekannt, dass TNF-α-Oligomere an die Membranrezeptoren binden müssen, damit zumindest in physiologischen Lösungen einige der verschiedenen biologischen Aktivitäten von TNF-α induziert werden können. Obwohl gezeigt worden ist, dass TNF-α in Lösung als Oligomer vor- kommt, hat sich jedoch herausgestellt, dass diese t nicht-kovalent verknüpften TNF-α-Oligomere instabil sind und in inaktive Formen überführt werden. Man geht allerdings davon aus, dass die strukturellen Veränderungen von TNF-α auch in vivo erfolgen, da Monomere und Oligomere in unterschiedlichen Anteilen in der Hirn-Rückenmark-Flüssigkeit von Patienten mit Meningitis gefunden werden.
TNF-α wurde ursprünglich als ein Endotoxin- induzierter Faktor identifiziert, der die Nekrose von Tumoren in Mäusen induzieren kann. Es ist jedoch bekannt, dass die Antitumor-Wirkung von TNF-α nicht nur aus den cytotoxischen Wirkungen gegen Tu- morzellen resultiert, sondern auch auf einer Aktivierung von Antitumor-Effektor-Immunzellen im Blut, beispielsweise Makrophagen, cytotoxische Lymphocyten und Neutrophilen, basiert. Die Antitumorwirkung von TNF-α beruht ferner auf einer spezifischen Schädigung von Tumor-Blutgefäßen.
Da TNF-α sehr geringe Stabilität aufweist und in vivo pleiotrope Wirkungen ausübt, waren die bisherigen Versuche, TNF-α als systemisches Antitumor- Mittel einzusetzen, nicht erfolgreich. Es zeigte sich, das bei Verabreichung von TNF-α äußerst schwere systemische Nebenwirkungen, wie Fieber und niedriger Blutdruck auftreten, bevor therapeutischwirksame Dosen erreicht werden. Trotz der nach wie vor großen Erwartungen bezüglich einer potentiellen Verwendung von TNF-α als Antitumormittel ist die klinische Anwendbarkeit dieser Substanz also nach wie vor stark eingeschränkt.
Im Allgemeinen ist es schwer, biologisch aktive Proteine, wie Cytokine, für therapeutische Zwecke einzusetzen, da biologisch aktive Proteine sehr häufig geringe Stabilität und kurze Halbwertzeiten aufweisen. Die Proteine werden durch Leber, Nieren und andere Organe schnell aus dem Blut entfernt, wobei die Clearance-Rate von der Größe der Moleküle und dem Ausmaß der Proteolyse abhängt. Insbesondere Plasma-Proteasen verursachen den Abbau solcher Proteine und bewirken den schnellen Verlust der biologischen Aktivität.
Um diese Probleme zu überwinden, wurden in den letzten Jahren Systeme zur Immobilisierung biolo- gisch aktiver Proteine an oder in Trägersystemen entwickelt. Beispielsweise sind Controlled Release- Systeme für therapeutische Wirkstoffe oder Arzneistoffe bekannt, wobei Arzneistoffe beispielsweise durch Einschluss in eine Matrix, immobilisiert werden. Nach Verabreichung solcher Controlled-Release- Systeme werden dann die Arzneistoffe durch Degradationsprozesse innerhalb des lebenden Körpers kontrolliert freigesetzt. Bei diesen Systemen ist die Konformation des Wirkstoffes im immobilisierten Zustand nicht entscheidend. Wichtig ist vielmehr, dass nach der Freisetzung der Wirkstoff im aktiven Zustand vorliegt.
Auch die Immobilisierung von Proteinen an partiku- läre Systeme ist bekannt (Cell Separation and Protein Purification, Technical Handbook, 2. Ausgabe (1996) , Dynal, Oslo) , wobei die Proteinbindung an die Partikel jedoch unselektiv, beispielsweise mittels Adsorption, und nicht gerichtet erfolgt (Mi- chaelis et al., Anticancer Drugs, 11 (5) (2000), 369-376) . Darüber hinaus ist eine einfache Übertragung der dabei gewonnenen Erkenntnisse auf die Immobilisierung an Nanopartikeln nicht ohne weiteres möglich, da eine Variation der funktioneilen Ober- flächengruppen immer mit einem Eingriff in das kolloidale System verbunden ist und beispielsweise eine unerwünschte Koagulation auslösen kann.
Yokozawa et al., Exp. Hematol., 28 (10) (2000), 1129-1136, beschreiben die nicht-kovalente Immobi- lisierung von Fas-spezifischen Antikörpern auf 2,5 μ großen Gelatine-Beads . Dabei werden die Antikörper adsorptiv, das heißt nicht gerichtet, immobili- siert. Diese künstliche Zellen genannte Systeme können auf Zielzellen Apoptose auslösen.
Hurst et al . , Anal^ Chem. , 71 (1999), 4727-4733, beschreiben die kovalente Oberflächenmodifizierung von magnetischen Polymerpartikeln mit einer Größe im μm-Bereich mit TNF-Antikörpern, mit denen anschließend TNF aus einer komplexen Lösung gefischt werden kann. Dieses Verfahren dient zur Probenvorbereitung von MALDI-TOF-MS-Verfahren. Die Immobili- sierung eines Proteins über einen Antikörper ist zwar im Prinzip eine gerichtete Immobilisierung. Eine derartige Protein-Immobilisierung ist jedoch gegenüber einer kovalenten Bindung sehr instabil.
Ferner ist die Immobilisierung von TNF auf Agarose- Partikeln beziehungsweise in PLGA-Partikeln bekannt (Kanulainen et al., J. Biol. Chem., 273/31 (1996), 18759-18766; Iwata et al . , J. Microencaps . , 16 (1999), 777-792). Auch hier erfolgt keine kovalente Anbindung von TNF. TNF wird anschließend langsam von den Partikeln freigesetzt und ist: erst in gelöster Form biologisch aktiv.
Chong et al., Cell. Immunol . , 134 (1) (1991), 96- 110, beschreiben die Immobilisierung von Tumor- Membranproteinen auf hydrophoben Partikeln. Diese Pseudocytes genannten Systeme werden genutzt, um auf anderen Zellen die Produktion von Cytokinen, beispielsweise TNF, zu stimulieren und dadurch die Lyse von Tumorzellen auszulösen. Hierbei handelt es sich also um einen indirekten Ansatz. Poiesi et al., Cytokine, 5/6 (1993), 539-545, beschreiben die Immobilisierung von TNF auf planaren Chip-Oberflächen für Oberflächen-Plasmonen- Resonanz-Untersuchungen. Zur Immobilisierung wurden Verfahren der Standard-Proteinchemie wie EDC und NHS eingesetzt. Hier zeigte sich, dass das Molekül nicht stabil gebunden wurde, da ein Teil des TNF durch Waschen entfernt werden konnte.
Fassina et al., Arch. Biochem. Biophys . , 296 (1992) , 137-143, beschreiben die Herstellung ulti- merer komplementärer Peptide für TNF. Diese wurden anschließend auf Chromatographie-Säulen beziehungsweise Mikrotiterplatten immobilisiert. Diese Oberflächen wurden dann genutzt, um TNF-Trimere aus komplexen Matrices abzutrennen. Allerdings ist die Wechselwirkung zwischen Peptid und TNF zu gering, um TNF dauerhaft zu immobilisieren.
Kamada et al., Cancer Res., 60 (2000), 6416-6420, beschreiben die kovalente Konjugation von TNF mit Polymeren wie PVP oder PEG, um die biologische Aktivität und die biologische Verfügbarkeit zu erhöhen. Hierzu werden kurzkettige Polymere an Ami- nogruppen des TNF kovalent gebunden, einzelne TNF Moleküle quasi mit Polymer beschichtet. Durch die Immobilisierung der Polymere auf dem TNF wird keinerlei Quervernetzung oder ähnliches erreicht, die TNF Trimere also auch nicht stabilisiert. Im Gegenteil, die Bioaktivität des TNFs nimmt mit dem Grad der Beschichtung stark ab. Durch diesen Ansatz soll die Bioverfügbarkeit der gelösten TNF-Form verbessert werden. Im Gegensatz zu der vorliegenden Er- findung kann damit die Wirkungsweise der membranständigen Form nicht erreicht werden.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher das technische Problem zugrunde, Mittel "und Verfahren zur Im- mobilisierung von Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) beziehungsweise einem anderen Mitglied der TNF-Familie an einer Trägeroberfläche bereitzustellen, wobei TNF so immobilisiert wird, dass seine vor der Immobilisierung vorhandenen biologischen Aktivitäten auch im immobilisierten Zustand beibehalten werden, so dass immobilisiertes TNF beispielsweise mit seinen Rezeptoren wechselwirken kann und dadurch seine biologischen Aktivitäten induziert werden können. Das immobilisierte TNF -beziehungsweise ein anderes Molekül der gleichen Familie- soll insbesondere diejenigen biologischen Eigenschaften aufweisen, die charakteristisch für die membranständige Form des TNF-moleküls -respektive der membranständigen
Form eines anderen Mitglieds der TNF-Familie- sind. Dabei soll TNF im immobilisierten Zustand, also ge- t- meinsam mit seinem Träger, sowohl für in vitro- üntersuchungen, beispielsweise bezüglich seiner Wechselwirkungen mit anderen zellulären Bestandteilen, als auch als Arzneistoff zur Behandlung von Krankheiten, insbesondere von Tumorerkrankungen einsetzbar sein, ohne dass die im Stand der Technik bekannten Nebenwirkungen auftreten. Im Zeitraum der Verwendung soll keine nennenswerte Degradation der Trägersysteme beziehungsweise von immobilisiertem TNF stattfinden' beziehungsweise bei einer in vivo- Anwendung soll die Degradation erst nach Entfaltung der biologischen Aktivität von immobilisierten TNF zu einem späteren Zeitpunkt stattfinden.
Die vorliegende Erfindung löst das ihr zugrunde liegende technische Problem durch die Bereitstel- lung von Nanopartikeln, umfassend einen Träger mit einer funktioneile Gruppen 1 A aufweisenden Oberfläche und zumindest einem Monomer eines Proteins der TNF-Familie, wobei dieses mindestens eine Monomer die funktionellen Gruppen 1 A bindende komple- mentäre funktioneile Gruppen 2 A aufweist und über die funktioneilen Gruppen 2 A mit den funktionellen Gruppen 1 A des Trägers verbunden ist. Die Erfindung sieht also vor, dass über eine Bindung zwischen ersten auf der Trägeroberfläche vorhandenen funktionellen Gruppen 1 A und in dem Monomer des Proteins der TNF-Familie vorhandenen funktionellen Gruppen 2 A, die komplementär zu den funktionellen Gruppen 1 A sind und mit diesen eine affine, vorzugsweise kovalente Bindung, eingehen können, eine Immobilisierung des Monomers an der pberfläche stattfindet. Vorzugsweise ist die funktionelle Gruppe 2 A so innerhalb des Monomers des Proteins der TNF-Familie positioniert, dass sie außerhalb der für die biologische Aktivität erantwortlichen Domänen in einem geeigneten Abstand zu diesen Domänen angeordnet ist, und so eine Beibehaltung der biologischen Aktivität der Monomeren oder eines Monomer-Komplexes auf dem Träger gewährleistet. Erfindungsgemäß kann vorgesehen sein, dass lediglich ein Monomer in der dargestellten Weise mit dem Träger verbunden und so immobilisiert ist. Erfindungsgemäß kann in bevorzugter Ausführungsform jedoch auch vorgesehen sein, dass mehrere, insbesondere drei Monomere, jeweils über ihre funktionellen Gruppen 2 A mit dem Träger verbunden sind, und in besonders bevorzugter Ausführungsform in Form eines Trimers immobilisiert sind. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann vorgesehen sein, dass lediglich ein erstes Monomer über seine funktionellen Gruppen 2 A mit den funktioneilen Gruppen 1 A des Trägers verbunden ist, wobei jedoch dieses erste Monomer über zum Beispiel eine kovalente oder nicht-kovalente Bindung assoziiert mit mindestens einem weiteren, zum Beispiel zwei weiteren Monomeren, in biologisch funktioneller Einheit, zum Beispiel in Form eines Trimers, vorliegt. Dieses eine oder mehrere weitere Monomere sind in bevorzugter Ausführung nicht direkt kovalent oder nicht- kovalent mit dem Träger verbunden, sondern allein durch die Wechselwirkung mit dem ersten Monomer am Träger immobilisiert. Die Immobilisierung eines je- den dieser Monomere kann also einerseits dadurch geschehen, dass dieses Monomer direkt eine affine, vorzugsweise kovalente Bindung, über seine funktionelle Gruppen 2 A mit den funktionellen Gruppen 1 A des Trägers eingeht. Andererseits kann erfindungs- gemäß die Immobilisierung auch dadurch gegeben sein, dass ein Monomer über eine nicht-kovalente oder kovalente Bindung assoziiert zu einem anderen Monomer vorliegt, welches wiederum über seine funktionellen Gruppen 2 A mit den funktionellen Gruppen 1 A des Trägers verbunden ist, sodass das assoziierte Monomer gar keine direkte Bindung zu dem Träger eingeht. Die Erfindung sieht in einer bevorzugten Ausführung auch vor, dass jedes Monomer eine Bindung sowohl zu dem Träger als auch zu einem weiteren Monomer aufweist.
Es gibt also erfindungsgemäß verschiedene Möglichkeiten TNF als Tri er zu immobilisieren. Jede Mono- mereinheit trägt in bevorzugter Ausführungsform eine funktionelle Gruppe, die für eine bevorzugt kovalente Immobilisierung geeignet ist. Bevorzugt ist es so, daß jedes Trimer über drei kovalente Bindungen immobilisiert ist. Es aber auch möglich, daß sich nur eine oder zwei kovalente Bindungen zwischen TNF-Trimer und Partikel ausbilden und das Trimer durch Disulfid-Brücken zwischen den Monomeren und/oder nicht-kovalente Wechselwirkungen stabilisiert wird. Erfindungsgemäß ist es, zum Beispiel bei LT-α und LT-ß, auch möglich, daß sich bioaktive Heteromere bilden z.B. LT-αιLT-ß2 oder LT-α2LT-ßι, die auch wieder bevorzugt über drei oder aber über ein bzw. zwei kovalente Bindungen immobilisiert werden. t '
Die Bioaktivität von membranständigem TNF wird unter anderem erfindungsgemäß dadurch erreicht, daß mehrere TNF-Trimere auf der Zelloberfläche benachbart angeordnet sind. Bei der Wechselwirkung dieser Zelle mit einer benachbarten Zelle werden entsprechende Rezeptoren gebunden und auf der Nachbarzelle komplementär arrangiert. Erst wenn sich dieser Re- zeptor-Cluster gebildet hat, wird die entsprechende Signalantwort ausgelöst. Genau ein solches Cluste- ring und die damit verbundene Signalkaskade wird durch die Immobilisierung des TNF auf der Partikeloberfläche ausgelöst, d.h. auf den erfindungsgemä- ßen Partikeln sind TNF-Moleküle in günstiger geometrischer Dichte an der Partikeloberfläche immobilisiert. Diese Dichte der TNF-Immobilisate wird unter anderem dadurch erreicht, dass die zur Bindung der TNF-Moleküle genutzten funktionellen Gruppen 1 A und 1 B in entsprechender Dichte angebracht werden (dies wird z.B. durch Zetapotenzialmessungen nachgewiesen, vergleich Figur 12) .
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegen- den Erfindung kann in dem Fall, dass mehr als ein Monomer immobilisiert am Träger vorliegt, diese Monomere einander gleiche Monomere sind, dass heisst aus Homomeren gebildete Trimere immobilisiert vorliegen. In einer weiteren Ausführungsform kann vor- gesehen sein, dass mehrere Monomere verschiedener Art vorliegen, dass heißt in besonders bevorzugter Ausführungsform aus Heteromeren gebildete Trimere immobilisiert vorliegen.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wer- den unter einem „Protein der TNF-Familie" (TNF: Tumor-Nekrose-Faktor) das TNF-Molekül selbst sowie alle Mitglieder der zur TNF-Familie gehörigen Proteine verstanden, die spezifische Aktivitäten in vivo und/oder in vitro über entsprechende, für das jeweilige TNF-Familienmitglied spezifische, dass heißt komplementäre Rezeptoren ausüben, insbesondere TNF-α, LT-α und LT-ß, FasL, TRAIL, CD40L, CD27L,, CD30L, OX40L, EDA, AITRL, VEGI, LIGHT, TWEAK, 4-1BBL, APRIL, BLYS und RANKL. Im folgenden wird der Begriff „Protein der TNF-Familieλ gleichbedeutend mit der Abkürzung TNF und umgekehrt verwendet, wenn nicht anders angegeben. Erfinduηgsge- maß ist TNF daher ein Protein, dass in vivo Ein- fluss auf Entzündungen, Sepsis, den Lipid- und Proteinstoffwechsel, die Blutbildung, Angiogenese, Wundheilung und Immunabwehr hat und in vitro und/oder in vivo unter anderem cytotoxische (Apop- tose und Nekrose) beziehungsweise cytostatische, Wirkungen ausübt, aber auch Zellproliferation und Differenzierung beeinflusst. TNF ist darüber hinaus ein Protein, das sich zumindest zeitweise an einer Zelloberfläche innerhalb eines natürlichen Zellverbandes befindet und die Kommunikation der Zelle mit ihrer Umgebung steuert. Insbesondere kann TNF mit Zellen, auf deren Oberfläche die komplementären Rezeptoren (zum Beispiel für das TNF der TNFRl und TNFR2, für TRAIL die TRAILR 1-4) vorliegen, in Kontakt treten und TNF-spezifische Signale und damit TNF-spezifische Wirkungen auslösen.
Die vorliegende Erfindung löst das ihr zugrunde liegende technische Problem in bevorzugter Ausfüh- rungsform der vorliegenden Erfindung durch die Be- reitstellung von Nanopartikeln, umfassend einen Träger mit einer funktionelle Gruppen 1 A aufweisenden Oberfläche und an dem Träger immobilisiertem TNF mit die funktionellen Gruppen 1 A bindenden komplementären funktionellen Gruppen 2 A, wobei TNF in Form eines Trimers immobilisiert ist.
Die vorliegende Erfindung stellt in bevorzugter Ausführung nanopartikuläre Trägersysteme, insbesondere Nanopartikel, mit daran immobilisiertem TNF bereit, wobei die Immobilisierung auf einer affinen Bindung von TNF an die Nanopartikel-Oberflache basiert. Die' Immobilisierung von TNF an den Nanopar- tikeln erfolgt erfindungsgemäß über eine Bindung zwischen ersten auf der Trägeroberfläche vorhandenen funktionellen Gruppen 1 A und im TNF-Molekül vorhandenen funktionellen Grup Apen 2 A, die komple- mentär zu den funktionellen Gruppen 1 A sind und mit diesen eine affine, vorzugsweise kovalente Bindungen eingehen können. Vorzugsweise ist die funktionelle Gruppe 2 A von TNF innerhalb des TNF- Moleküls so positioniert, dass sie außerhalb der für die biologische TNF-Aktivität verantwortlichen Domänen in einem geeigneten Abstand zu diesen Domänen angeordnet ist. Auf diese Weise ist es erfindungsgemäß möglich, TNF gerichtet und unter Beibehaltung seiner biologischen Aktivitäten auf dem Träger zu immobilisieren.
Nach TNF-Immobilisierung ist TNF erfindungsgemäß so auf der Trägeroberfläche fixiert, dass die dreidimensionale Struktur der für die biologische Aktivität erforderlichen Domäne (n) gegenüber nicht- immobilisiertem TNF nicht verändert ist. und dass die TNF-Domäne (n) bei Kontakt mit zellulären Reaktionspartnern für diese frei zugänglich ist/sind. Dabei ist TNF in Form von Trimeren fixiert. Erfindungsgemäß ist es vorgesehen, dass der Zerfall von TNF-Trimeren durch die Einbringung bestimmter Proteinelemente verhindert wird, insbesondere solchen Proteinstrukturen, die natürlicherweise fest verknüpfte Trimere bilden. Nach einer solchen Stabilisierung ist dann erfindungsgemäß vorgesehen, dass nicht jede TNF-Üntereinheit eines TNF-Trimers über affine Bindungen zwischen den funktionellen Gruppen 1 A und 2 A an der Oberfläche des Nanopartikel- Trägers fixiert sein muss, sondern es ist ausreichend, wenn mindestens eine TNF-Untereinheit eines Trimers am Träger gebunden ist.
Erfindungsgemäß ist insbesondere vorgesehen, dass es sich bei' den erfindungsgemäß verwendeten Trägersystemen um kompakte oder hohle Nanopartikel mit Größen zwischen 5 und 500 nm handelt. Diese bestehen entweder aus organischen oder anorganischen Partikelmaterialien. Die Art des Materials kann er- findungsgemäß entsprechend der späteren Anwendung variiert werden, wobei der Träger der Nanopartikel vorzugsweise aus biologisch verträglichen und/oder biologisch abbaubaren Materialien besteht.
Erfindungsgemäß verhalten sich daher die erfin- dungsgemäßen Nanopartikel, an deren Oberfläche TNF fixiert ist, bezüglich der immobilisierten TNF- Moleküle wie Zellen. Das heißt, die erfindungsgemäßen Nanopartikel können beispielsweise mit Zellen, auf deren Oberfläche einer oder mehrere TNF- Rezeptoren, beispielsweise TNFRl und TNFR2 vorhanden sind, in Kontakt treten und TNF-spezifische Signale und damit TNF-spezifische Wirkungen auslösen. Da die Nanopartikel zumindest in einer Dimension kleiner als 1 um sind, werden sie erfindungs- gemäß auch als „Nanocytes" bezeichnet.
Da die erfindungsgemäßen Nanopartikel einerseits in Analogie zu membranständigen Molekülen reagieren, andererseits aber auch vollkommen neue überraschende Funktionen entwickeln, besitzen die erfindungs- gemäßen Nanocytes ein sehr breites Anwendungspoten- tiäl. Erfindungsgemäß können die Nanopartikel als Werkzeuge für die molekularbiologische, zellbiologische und klinische Forschung eingesetzt werden. Dabei bietet die Verwendung der erfindungsgemäßen Nanopartikel den Vorteil, das etablierte Verfahren für die Bioaktivitätsbestimmung verwendet werden können und somit ein schnelles Materialscreening durchgeführt werden kann.
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel können beispielsweise in vitro eingesetzt werden, um die Wir- kungsweise membranständiger Moleküle, insbesondere bei der Signaltransduktion, zu untersuchen. Gegenüber der direkten Zell-Zell-Interaktion bieten die erfindungsgemäßen Nanopartikel den Vorteil, dass einzelne Effekte isoliert untersucht werden können. Die erfindungsgemäßen Nanopartikel lassen sich daher auch für die in vitro-Diagnostik einsetzen, um beispielsweise bestimmte Zellen, insbesondere Tumorzellen, zu erkennen und/oder zu markieren. Darüber hinaus können unter Verwendung der erfindungs- gemäßen Nanopartikel gezielt Zellen in „einen er- wünschten Zustand überführt werden beziehungsweise besteht die Möglichkeit, zwischen verschiedenen Zell-Zuständen hin- und herzuschalten.
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel können auch dazu verwendet werden, bestimmte Zellen aus komplexen biologischen Medien oder Flüssigkeiten, wie Blut, zu isolieren oder direkt in diesen Flüssigkeiten oder Medien bei diesen Zellen entsprechende Reaktionen auszulösen, wie beispielsweise Differenzie- rung, Prol'iferation oder auch Apoptose. Darüber hinaus können auf der Basis der erfindungsgemäßen Nanopartikel auch technische Systeme konstruiert werden, die eine gezielte und kontinuierliche Separation bestimmter Zellen erlauben .
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel , insbesondere solche mit biologisch verträglichen oder biologisch abbaubaren Trägersystemen, können in vivo für die Therapie verschiedener Krankheiten eingesetzt werden. Unter Verwendung der erfindungsge'mäßen Nanopartikel können prinzipiell alle Krankheiten thera- piert werden, bei denen die normale Zell-Zell- Interaktion gestört ist, also insbesondere Tumorerkrankungen, Wundheilungsprozesse und ähnliche. Erfindungsgemäße Nanopartikel können aber auch für Aufgaben, die normalerweise Zellen des Immunsystems übernehmen, verwendet werden. Vorteilhafterweise können die erfindungsgemäßen Nanopartikel, insbesondere solche auf der Basis biologisch verträglicher oder biologisch abbaubarer Trägersysteme, direkt in vivo appliziert werden. Die erfindungsgemäßen Nanopartikel können auch in Form poröser Filme abgeschieden werden. Mikroporöse Systeme besitzen ein großes Potential für extrakorporale therapeutische Anwendungen, beispielsweise auf dem Gebiet der Tumortherapie, um frei zirkulierende maligne Zellen selektiv zu erkennen und gegebenenfalls abzutöten.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „Protein" ein Molekül verstanden, das mindestens zwei über eine Amidbindung miteinander verbundene Aminosäuren umfasst. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann ein Protein, insbe- sondere TNF, also auch ein Peptid, zum Beispiel ein Oligopeptid, ein Polypeptid oder ein Teil davon, beispielsweise eine Domäne oder eine Bindungsta- sehe, sein. Das Protein, insbesondere TNF, kann natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein. Es kann durch gentechnische Verfahren gegenüber dem Wildtyp-Protein modifiziert se Ain und/oder unnatür- liehe und/oder ungewöhnliche Aminosäuren enthalten. Ein Protein, insbesondere ein TNF-Molekül, kann gegenüber der Wildtyp-Form derivatisiert sein, beispielsweise Glykosylierungen aufweisen, es kann verkürzt sein, es kann mit anderen Proteinen fusio- niert sein oder mit Molekülen anderer Art, beispielsweise Kohlenhydraten, verbunden sein.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter „Nanopartikeln" Bindematrices verstanden, die einen Träger mit einer Oberfläche umfassen, an dem chemisch reaktive funktionelle Gruppen angeordnet sind, die mit komplementären funktionellen Gruppen von zu bindenden Molekülen, insbesondere TNF-Molekülen, affine Bindungen, also kovalente und/oder nicht-kovalente Bindungen, eingehen und auf diese Weise die Moleküle an ihren Oberflächen stabil fixieren können. Die Träger der Nanopartikel bestehen aus chemisch inerten anorganischen oder organischen Materialien und besitzen eine Größe von weniger als 1 μm, vorzugsweise von 5 bis 500 nm.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer „ersten funktionellen Gruppe 1 A" eine auf der Oberfläche des Nanopartikel-Trägers aufgebrachte chemische Gruppe verstanden, die in der Lage ist, mit einer komplementären funktionellen Gruppe 2 A, die beispielsweise auf dem zu immobilisierenden TNF-Molekül vorhanden ist, derart zu interagieren, dass eine affine, bevorzugt kovalente Bindung zwischen den beiden Binduhgspartnern stattfinden kann.
In bevorzugter Ausführungsform der Erfindung ist die erste funktionelle Gruppe 1 A der Trägerober- fläche ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ami- nogruppe, Carboxygruppe, Epoxygruppe, Maleinimi- dogruppe, Alkylketongruppe, Aldehydgru'ppe, Hydra- zingruppe, Hydrazidgruppe, Thiolgruppe und Thi- oestergruppe.
Erfindungsgemäß sind die funktionellen Gruppen 2 A der zu immobilisierenden TNF-Moleküle ausgewählt aus einer Gruppe, die die gleichen Spezies wie für die funktionelle Gruppe 1 A der Trägeroberfläche enthält. Ein erfindungsgemäßer Nanopartikel weist also in seiner Oberfläche eine erste funktionelle Gruppe 1 A auf, die kovalent mit einer funktionellen Gruppe 2 A des zu immobilisierenden TNF- Moleküls verknüpft ist, wobei die funktionelle 0- berflächen-Gruppe 1 A eine andere Gruppe als die t. funktionelle Protein-Gruppe 2 A ist. Die beiden miteinander in Bindung tretenden Gruppen 1 A und 2 A müssen dabei komplementär zueinander sein, das heißt in der Lage sein, eine kovalente Bindung miteinander einzugehen.
Wird erfindungsgemäß als funktionelle Gruppe 1 A beispielsweise eine Aminogruppe verwendet, ist die funktionelle Gruppe 2 A des zu immobilisierenden Proteines eine Carboxygruppe. Wird erfindungsgemäß umgekehrt eine Carboxygruppe als funktionelle Ober- flächen-Gruppe 1 A verwendet, ist erfindungsgemäß die funktionelle komplementäre Protein-Gruppe 2 A eine Aminogruppe. Wird erfindungsgemäß als funktionelle Oberflächen-Gruppe 1 A eine Thiolgruppe gewählt, ist erfindungsgemäß die komplementäre Protein-Gruppe eine Maleinimidogr Auppe. Wird umgekehrt eine Maleinimidogruppe als funktionelle Oberflächen-Gruppe 1 A ausgewählt, ist erfindungsgemäß die komplementäre funktionelle Protein-Gruppe 2 A eine Thiolgruppe. Wird erfindungsgemäß als funktionelle Oberflächen-Gruppe 1 A eine Alkylketongruppe, ins- besondere Methylketon- oder Aldehydgruppe verwendet, ist die funktionelle komplementäre Protein- Gruppe 2 A eine Hydrazin- oder Hydrazidgruppe. Wird erfindungsgemäß umgekehrt eine Hydrazin- oder Hydrazidgruppe als funktionelle Oberflächen-Gruppe 1 A verwendet, ist erfindungsgemäß die funktionelle komplementäre Protein-Gruppe 2 A eine Alkylketon-, insbesondere Methylketon- oder Aldehydgruppe.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugt handelt es sich bei der funktionellen Gruppe 1 A auf der Träger- Oberfläche des Nanopartikels um eine Maleinimido- Gruppe und bei der funktionellen Gruppe 2 A von TNF um eine Thiol-Gruppe.
In bevorzugter Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass TNF als Trimer gerichtet und unter Beibehaltung seiner biologischen Aktivität auf der Oberfläche der erfindungsgemäßen Nanopartikel immobilisiert vorliegt.
Erfindungsgemäß handelt es sich bei immobilisiertem TNF um synthetisches, natürlicherweise vorkommendes oder rekombinant hergestelltes TNF mit Wildtyp- Sequenz oder mit imitierter Sequenz. Erfindungsgemäß ist es auch möglich, dass TNF chemisch modifiziert vorliegt .
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung be- deutet der Begriff „gerichtet immobilisiert" oder „gerichtete Immobilisierung", dass ein Molekül, insbesondere TNF, an definierten Positionen innerhalb des TNF-Moleküls dergestalt an einem Träger immobilisiert ist, dass die dreidimensionale Struktur der für die biologische Aktivität erforderli- chen TNF-Domäne (n) gegenüber dem nicht- immobilisierten Zustand nicht verändert ist und dass diese TNF-Domäne (n) , beispielsweise Bindungstaschen für zelluläre Reaktionspartner, bei Kontakt mit zellulären Reaktionspartnern für diese frei zu- gänglich ist/sind. „Gerichtet immobilisiert,, bedeutet auch, dass die Fixierung von TNF auf der Trägeroberfläche so erfolgt, dass das immobilisierte Protein bei einer späteren Verwendung in einer zellulären beziehungsweise zellähnlichen Umgebung durch Protein-degradierende Enzyme nicht oder nur sehr langsam degradiert werden kann. Das heißt, das immobilisierte TNF-Molekül ist auf der Trägeroberfläche so ausgerichtet, das es so wenig wie möglich Angriffspunkte für Proteasen bietet.
„Beibehaltung der biologischen Aktivität" bedeutet, dass TNF, insbesondere das TNF-Trimer, nach Immobilisierung an der Oberfläche eines Nanopartikels die gleichen oder nahezu gleichen biologischen Funktionen in zumindest ähnlichem Ausmaß ausüben kann wie die gleichen TNF-Moleküle im nicht-immobilisierten Zustand unter geeigneten in vitro-Bedingungen be- ziehungsweise die gleichen TNF-Moleküle in ihrer natürlichen zellulären Umgebung.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird
A unter einem „Trimer" oder „TNF-Trimer" eine Verbin- düng verstanden, die durch Verknüpfung von drei Untereinheiten, insbesondere drei TNF-Monomeren, gebildet wird, wobei die Verknüpfung der Monomere untereinander vorzugsweise durch Disulfid- Brückenbildung zwischen Cystein-Resten erfolgt. Die Trimerisierung von TNF führt gegenüber dem TNF- Monomer zu einer Stabilisierung der Moleküle. Bei den drei zu einem Trimer verknüpften TNF- Untereinheiten kann es sich um identische TNF- Monomere handeln, das heisst das Trimer kann als Homotrimer vorliegen. Das Trimer kann erfindungsgemäß aber auch unterschiedliche TNF-Monomere umfassen, wobei sich diese sowohl bezüglich ihrer Zusammensetzung, beispielsweise Aminosäuresequenz, als auch bezüglich ihrer Länge unterscheiden können. Ferner muss bei dem immobilisierten -TNF-Trimer nicht jede TNF-Untereinheit an der Oberfläche des Nanopartikel-Trägers gebunden sein. Das TNF-Trimer kann auch dadurch an Nanopartikeln fixiert sein, das nur eine TNF-Untereinheit des Trimers über eine kovalente Bindung zwischen seiner funktionellen Gruppe 2 A und der funktionellen Gruppe 1 A am Träger fixiert ist.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Trimer- Bildung entweder vor oder während der Immobilisie- rung durch hochaffine Bindung nicht-kovalenter Art, aber auch insbesondere durch kovalente Disulfid- Brückenbildung zwischen Cystein-Resten spontan er-- folgt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die zu immobilisierenden TNF-Moleküle ein natürliches oder synthetisch hergestelltes Multimerisierungmodul enthalten, das die Trimererisierung von TNF durch hochaffine Bindung nicht-kovalenter Art, aber insbesondere durch Ausbildung von kovalenten Disul- fidbrücken, und damit eine regelmäßige und stabile Trimerisierung von TNF bewirkt. Erfindungsgemäß be- sonders bevorzugt wird das Tenascin C- Multimerisierungsmodul in die zu immobilisierenden TNF-Moleküle auf gentechnischem Wege oder unter Verwendung chemischer Syntheseverfahren eingeführt. Die so modifizierten TNF-Moleküle werden dann ent- weder vor oder während der Immobilisierung an den erfindungsgemäßen Nanopartikeln trimerisiert .
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Oberfläche des erfindungsgemäßen Nanopartikels weitere funktionel- le Gruppen 1 B und TNF weitere, die ( funktionellen Gruppen 1 B bindende komplementäre Gruppen 2 B aufweist, wobei die funktionellen Gruppen 1 B und 2 B erfindungsgemäß insbesondere eine nicht-kovalente Bindung eingehen können.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer „zweiten funktionellen Gruppe 1 B" eine chemische Gruppe verstanden, die in der Lage ist, mit einer komplementären funktionellen Gruppe 2 B, die in einem zu immobilisierenden TNF-Molekül vor- handen ist, derart zu interagieren, dass eine nicht-kovalente Bindung zwischen den beiden Bindungspartnern stattfinden kann. In bevorzugter Ausführungsform der Erfindung ist die zweite funktionelle Gruppe 1 B der Trägeroberfläche ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Oligohistidingruppe, Strep-Tag I, Strep-Tag II, Desthiobiotin, Biotin, Chitin, Chitinderivate, Chitinbindedomäne, Metallionenchelatkomplex, Strepta- vidin, Streptactin, Avidin und Neutravidin.
Erfindungsgemäß ist die funktionelle Gruppe 2 B des zu immobilisierenden TNF-Moleküls ausgewählt aus einer Gruppe, die die gleichen Spezies wie für die funktionelle Gruppe 1 B der Trägeroberfläche enthält. Ein erfindungsgemäßes Nanopartikel weist also in seiner Oberfläche eine funktionelle Gruppe 1 B auf, die nicht-kovalent mit einer funktionellen Gruppe 2 B von TNF verknüpft ist, wobei die funktionelle Oberflächen-Gruppe 1 B eine andere Gruppe als die funktionelle TNF-Gruppe 2 B ist. Die beiden miteinander in nicht-kovalente Bindung tretenden Gruppen müssen komplementär zueinander sein, das heißt in der Lage sein, eine nicht-kovalente Bindung miteinander einzugehen.
Wird erfindungsgemäß als funktionelle Oberflächen- Gruppe 1 B ein Metallionenchelatkomplex verwendet, ist die funktionelle komplementäre TNF-Gruppe 2 B eine Oligohistidingruppe. Wird als funktionelle O- berflächengruppe 1 B eine Oligohistidingruppe verwendet, ist die funktionelle komplementäre TNF- Gruppe 2 B ein Metallchelatkomplex.
Wird als funktionelle Oberflächen-Gruppe 1 B Strep- Tag I, Strep-Tag II, Biotin oder Desthiobiotin verwendet, wird als komplementäre funktionelle TNF- Gruppe 2 B Streptavidin, Streptactin, Avidin oder Neutravidin eingesetzt. Wird als funktionelle Oberflächen-Gruppe 1 B .Streptavidin, Streptactin, Avidin oder Neutravidin eingesetzt, wird als komple- mentäre funktionelle TNF-Gruppe 2 B Strep-Tag I, Strep-Tag II, Biotin oder Desthiobiotin eingesetzt.
Wird in einer weiteren Ausführungsform' Chitin oder ein Chitinderivat als funktionelle Oberflächen- Gruppe 1 B eingesetzt, wird als funktionelle kom- plementäre TNF-Gruppe 2 B eine Chitinbindungsdomäne eingesetzt. Wird als funktionelle Oberflächen- Gruppe 1 B eine Chitinbindungsdomäne eingesetzt, wird als funktionelle komplementäre TNF-Gruppe 2 B Chitin oder ein Chitinderivat eingesetzt.
Die vorstehend genannten funktionellen Gruppen der Trägeroberfläche und/oder von TNF werden erfindungsgemäß vorzugsweise mittels eines Spacers mit dem zu immobilisierenden TNF-Molekül beziehungsweise der Trägeroberfläche verbunden beziehungsweise unter Verwendung eines Spacers an den Träger oder in das TNF-Molekül eingeführt. Der Spacer dient somit einerseits als Abstandshalter der funktionellen Gruppen zu dem Träger beziehungsweise dem TNF- Molekül, andererseits aber auch als Träger für die funktionelle Gruppe. Ein derartiger Spacer kann erfindungsgemäß ein Alkylen oder Ethylenglykol-Spacer mit 2 bis 50 C-Atomen sein, der in bevorzugter Ausführungsform substituiert ist und Heteroatome aufweist. Erfindungsgemäß kann der Spacer flexibel und/oder linear sein. Bei Verwendung eines Spacers im Zusammenhang mit der ersten funktionellen Gruppe 1 A der Oberfläche bindet der Spacer kovalent an eine Seitenkette einer Aminosäure von TNF, wobei die Aminosäure, an die die Bindung erfolgt, eine natürliche oder unnatürliche Aminosäure sein kann. Sofern die Aminosäure eine natürliche Aminosäure ist, wird sie durch Bindung an den Spacer und die damit verbundene funktionelle erste Oberflächen- Gruppe 1 A zu einer unnatürlichen Aminosäure im Sinne der Erfindung.
Sofern der Spacer eine funktionelle TNF-Gruppe 2 A mit einem Träger verbindet, geschieht dies vorzugsweise über eine auf dem Träger angeordnete Ankergruppe, die vorzugsweise als Silan mit reaktiven Gruppen ausgeführt ist, beispielsweise die mit Si- OH-Gruppen der Oberfläche des vorzugsweise oxidi- sehen Si-Trägers kovalente Si-O-Si-Bindungen (Si- lox-Anbindungen) ausbilden kann.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung verbindet der Spacer entweder eine funktionelle Gruppe der Trägeroberfläche mit TNF oder eine funktionelle Gruppe des Proteins mit dem Träger, wobei die funktionelle Gruppe auch als Bestandteil des Spacers, das heißt eine seiner funktionellen Gruppen, angesehen werden kann.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden als erste funktionelle Oberflächen-Gruppe 1 A die Aminogruppe, Carboxygruppe, E- poxygruppe, Maleinimidogruppe, Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Hydrazingruppe, Hydrazidgrupe, Thiolgruppe oder Thioestergruppe verwendet, die mit- tels eines Spacers, beispielsweise im Falle einer Alkylketongruppe mittels Lävulinsäure, mit einer Seitenkette einer in dem zu immobilisierenden TNF- Molekül vorhandenen natürlichen oder unnatürlichen Aminosäure verbunden werden beziehungsweise durch den Spacer in das TNF-Molekül eingeführt werden. Sofern die Verbindung zu einer natürlichen Aminosäure erfolgt, wird diese durch die Bindung mit dem die funktionelle Gruppe aufweisenden Spacer zu einer unnatürlichen Aminosäure.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „Träger" ein chemisch inerter Stoff verstanden, der als Gerüst für das zu immobilisierende TNF-Molekül dient. In bevorzugter Ausführungsform der Erfindung besteht der Träger aus einem biologisch verträglichen Material. Erfindungs- gemäß ist der Träger ein kompaktes oder hohles Partikel mit einer Größe von 5 nm bis 500 nm. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „biologisch verträglich", dass der Träger beziehungsweise die Oberfläche des Nanoparti- kels sowohl hinsichtlich seiner Materialzusammen- Setzung als auch hinsichtlich seiner Struktur weder im Körper eines Rezipienten noch in isolierten biologischen Geweben oder Flüssigkeiten eine immunologische, toxische oder sonstige Reaktion hervorruft und zelluläre oder molekulare Prozesse nicht oder kaum stört. Wenn ein biologisch verträglicher Träger „biologisch abbaubar" ist, bedeutet dies, dass ein Träger im Körper eines Rezipienten beziehungsweise in biologischen Geweben oder Flüssigkeiten langsam abgebaut beziehungsweise metabolisiert werden kann, vorzugsweise, nachdem das am Träger immobilisierte TNF-Molekül seine biologische Aktivität entfaltet hat, wobei die Produkte des Abbaus beziehungsweise der Metabolisierung keine immunologischen, toxischen oder sonstigen Reaktionen hervorrufen und darüber hinaus im Körper des Rezipienten gut resorbierbar sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass der Träger des erfindungsgemäßen Nanopartikels ein biologisch verträgliches, vorzugsweise ein anorganisches oder ein organi- sches, Material enthält oder aus diesem besteht. In bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht der erfindungsgemäße Nanopartikel aus einem anorganischen Trägermaterial wie Silicium, Si02, SiO, einem Silikat, Al203, Si02-Al203, Zr02, Fe203, Ag20, Zr203, Ta205, Zeolith, Ti02, Glas, Indiumzinnoxid, Hydroxylapatit, Calciumphosphat, Calci- umcarbonat, Au, Fe304, ZnS, CdSe oder ein Gemisch davon. Bei einem organischen, biologisch verträglichen Trägermaterial kann es sich um Stoffe wie Po- lypropylen, Polystyrol, Polyacrylate oder ein Gemisch davon handeln.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform besteht der Träger des erfindungsgemäßen Nanopartikels aus einem biologisch abbaubaren Material oder enthält dieses. Die biologisch abbaubaren Materialien müssen für den Zeitraum der Anwendung stabil sein, können danach jedoch so abgebaut werden, dass ausscheidbare Bruchstücke erhalten werden. Insbesondere handelt es sich dabei um Polyester der Po- lymilchsäure, die durch Quervernetzung zusätzlich stabilisiert wurden und dadurch in besonderer Weise kontrolliert biologisch abbäubar sind. Besonders bevorzugt ist die Verwendung eines Polyesters von Polymilchsäure, insbesondere Poly (D, L-milchsäure- co-glykolsäure) (PLGA) .
A
Die Herstellung der Träger der erfindungsgemäßen Nanopartikel kann unter Verwendung üblicher, auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren, wie Sol-Gel- Synthese-Verfahren, Emulsionspolymerisation , Suspensionspolymerisation erfolgen.
Die Oberflächen des Nanopartikel-Trägers werden durch chemische Modifizierungsreaktionen mit spezifischen funktionellen Gruppen ausgebildet. Diese funktionellen Gruppen weisen dabei eine chemische Reaktivität auf, die geeignet ist, mit spezifischen in TNF-Moleküle eingebrachten funktionellen Gruppen zu reagieren. Die Bindung von TNF erfolgt dabei sowohl kovalent als auch nicht-kovalent über eine chemische Reaktion zwischen TNF und Oberfläche. Die Träger, insbesondere deren Oberflächen, werden daher nach ihrer Herstellung unter Verwendung übli- eher Verfahren, beispielsweise Propfpolymerisation, Silanisierung, chemischer Derivatisierung etc. mit geeigneten funktionellen Gruppen 1 A beziehungweise funktionellen Gruppen 1 A und 1 B versehen. Die Dichte der funktionellen Gruppen und der Abstand dieser Gruppen zueinander können optimiert werden. Auch die Umgebung der funktionellen Gruppen kann hinsichtlich einer möglichst effizienten gerichteten Immobilisierung vorbereitet werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der anorganische Träger, beispiels- weise der in Form von Quarz, Kieselerde, Kieselgur, Silikagel und/oder Si02-Pulver vorliegende Träger vor Ausbringen der funktionellen Gruppen 1 A und 1 B silanisiert, vorzugsweise nach vorhergehender Hydrophilisierung.
In besonders bevorzugter Ausführungsform kann vorgesehen sein, dass die Anzahl der funktionellen Gruppen 1 A und 1 B der Oberfläche durch Zugabe von Verdünnersilanen bei der vorzugsweise vorgesehenen Silanisierung variiert werden kann. Unter dem Beg- riff Verdünnersilan wird ein Organosilan, das biochemisch inerte funktionelle Gruppen trägt, verstanden, das überdies nicht in der Lage ist, einen die funktionellen Oberflächen-Gruppen tragenden Spacer zu binden. Vorzugsweise wird das Verdünner- silan eingesetzt, um neben dem Verdünnungseffekt auch die unspezifische Bindung von Proteinen an die Oberfläche des Trägers zu reduzieren. In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Verdünnersilan von der Silankopfgruppe ausgehend 2 bis 20 Alky- lengruppen auf, an die sich vorzugsweise 2 bis 6 Oxoethylengruppen anschließen und durch beispielsweise eine Hydroxygruppe oder Methylethergruppe terminiert sind.
In besonders bevorzugter Ausführungsform ist vorge- sehen, dass die Verdünnersilane der Trägeroberfläche durch entsprechende Alkylkettenlänge den Self- Assembly-Effekt begünstigen. Zudem kann vorgesehen sein, dass diese Verdünnersilane, die bei der Silanisierung des Trägers verwendet werden, die unspe- zifische Adsorption von Proteinen an der Nanoparti- kel-Oberfläche durch zugefügte entsprechende funktionelle Einheiten, wie zum Beispiel Oligoethy- lenglykol-Einheiten, verringern. Erfindungsgemäß können auch andere chemische Verbindungen eingesetzt werden, sofern sie bezüglich ihres unspezifischen Bindungsverhaltens Protein-abweisend wirken.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Nanopartikel, insbesondere die Oberfläche, zusätzliche Funktionalitäten aufweisen. Erfindungsgemäß kann der Träger insbesondere Fluoreszenzmarkierungen, UV/Vis-Markierungen, superparamagnetische Funktio- nen, ferromagnetische Funktionen und/oder radioaktive Markierungen aufweisen. Aufgrund der erfindungsgemäß eingesetzten Funktionalitäten können entsprechend ausgestattete Nanopartikel unter Verwendung geeigneter Vorrichtungen leicht detektiert und/oder isoliert werden.
Die Oberfläche des Nanopartikelträgers kann erfindungsgemäß aber auch zusätzliche chemische Verbindungen aufweisen. Diese zusätzlich aufgebrachten chemischen Funktionalitäten richten sich. unter an- derem nach der späteren Verwendung der erfindungsgemäßen Nanocytes. Sollen diese beispielsweise zur Therapie und/oder Diagnose von Krankheiten verwendet werden, können die Nanopartikel geeignete chemische Verbindungen mit therapeutischer und/oder diagnostischer Wirkung enthalten. In besonders bevorzugter Ausführungsform ist vorgesehen, dass die erfindungsgemäßen Nanopartikel zusätzlich Arzneistoffe wie Cytostatika enthalten. Sie sind dementsprechend besonders zur Therapie von Tumorerkran- kungen geeignet. Erfindungsgemäß kann aber auch vorgesehen sein, dass die Funktionalisierung des Trägers unter Verwendung einer oder mehrerer chemischer Verbindungen erfolgt, die zur sterischen Stabilisierung und/oder
A zur Verhinderung einer Konformationsänderung von immobilisiertem TNF und/oder zur Verhinderung der Anlagerung einer weiteren biologisch aktiven Verbindung an den Träger dient. Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist, dass es sich bei dieser chemi- sehen Verbindung um ein Polyethylenglykol, ein Oli- goethylenglykol, Dextran oder ein Gemisch davon handelt .
Der Träger kann neben zusätzlichen chemischen Funktionen auch weitere biologische Funktionen enthal- ten. Diese weitere bevorzugte Ausführungsform trägt Liganden, zum Beispiel Peptide oder Proteine, an ihrer Oberfläche, die ausgesuchte Gewebe oder Zellen spezifisch binden.
Erfindungsgemäß kann das zu immobilisierende TNF- Molekül natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein. Es kann auch durch gentechnische Verfahren gegenüber dem Wildtyp-Protein modifiziert sein und/oder unnatürliche und/oder ungewöhnliche Aminosäuren enthalten.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das zu immobilisierende TNF- Molekül nach peptidsynthetischen Verfahren oder durch in vitro-Translation hergestellt. Dabei werden in bevorzugter Ausführungsform bei der Herstel- lung unnatürliche, vorzugsweise Linker-Spacer- tragende Aminosäuren gezielt eingebaut, so dass nachfolgend eine gerichtete und mit dem Erhalt der biologischen TNF-Aktivität kompatible TNF- Immobilisierung an den Träger möglich ist. Die Anwendung des Prinzip des Einbaus unnatürlicher Ami- nosäuren ermöglicht darüber hinaus den gezielten und selektiven Einbau von Fluorophoren oder anderen Markern an diesen unnatürlichen Aminosäuren.
In besonders bevorzugter Weise können diese Modifikationen darin bestehen, dass in dem TNF-Molekül natürlicherweise vorkommende Aminosäuren durch unnatürliche Aminosäuren ausgetauscht sind, das heißt, in einer bestimmten Position eine natürlicherweise vorkommende Aminosäure entfernt und an gleicher Stelle eine unnatürliche Aminosäure inser- tiert wird. Das Einfügen einer unnatürlichen Aminosäure kann durch das Einfügen eines Stop-Codons an der gewünschten Stelle, durch das Verwenden beziehungsweise den Einsatz einer mit der entsprechenden unnatürlichen Aminosäure beladenen Supressor-tRNÄ und eines damit durchgeführten f in vitro- Translationsansatzes erfolgen. Solche unnatürlichen Aminosäuren sind Verbindungen, die eine Aminosäurefunktion und einen Rest R aufweisen und nicht über einen natürlich vorkommenden genetischen Code defi- niert sind, zum Beispiel L- (6, 7-Dimethyloxy- coumaryl) -Alanin. In bevorzugter Weise weisen diese Aminosäuren eine Alkylketongruppe oder eine Alde- hydgruppe, Thioestergruppe, Thiolgruppe, Hydra- zingruppe oder Hydrazidgruppe auf. Diese unnatürli- chen Aminosäuren können durch gentechnologische Verfahren oder während einer chemischen Synthese von TNF in das Molekül eingefügt werden, vorzugsweise zusammen mit einem Spacer oder Linker.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist also zumindest eine Aminosäure von TNF derivatisiert, insbesondere durch Einführung einer Alkylketongruppe, Thiolgruppe, Aldehydgruppe, Thioestergruppe, Hydrazingruppe und/oder Hydrazidgruppe. Insbesondere wird eine der vorhergehenden Funktionen über einen Spacer mit der Seitenket- te einer unnatürlichen oder natürlichen Aminosäure verbunden beziehungsweise der Spacer weist eine solche Funktion auf. Der Spacer kann in bevorzugter Ausführungsform flexibel oder linear sein und beispielsweise eine Kettenlänge von 2 bis 50 Atomen aufweisen. Der Spacer ist in weiterer bevorzugter Ausführungsform durch gegebenenfalls substituierte und/oder Heteroatome enthaltende Alkylengruppen gebildet .
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Spacer durch die Bindung einer Seitenkette einer Aminosäure von TNF, beispielsweise Lysin, an Lävulinsäure (4-Oxopentansäure) gebildet, wobei gleichzeitig eine Methylketongruppe eingeführt wird und der Spacer dem gemäß aus Seitenkette und Lävulinsäure gebildet wird.
Sofern die einzusetzende unnatürliche Aminosäure bereits eine Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Thiolgruppe, Thioestergruppe, Hydrazidgruppe oder Hydrazingruppe aufweist, ist eine vorgenannte Deri- vatisierung nicht mehr nötig. Es kann also vorgesehen sein, eine natürlicherweise vorkommende Amino- säure, beispielsweise Lysin, zu modifizieren, beispielsweise durch Derivatisierung von deren Seitenkette, insbesondere deren primärer Aminogruppe, mit der Carbonsäurefunktion der A Lävulinsäure. TNF- Moleküle, die eine solche natürlicherweise vorkommende Aminosäure mit unnatürlicher Derivatisierung aufweisen, sind im Sinne der vorliegenden Lehre modifiziert. Der Einbau von beispielsweise Lävulinsäure in eine unnatürliche oder natürliche Amino- säure ermöglicht es, an definierter Stelle der Sequenz eine Ketofunktion einzubauen, die dann selektiv beispielsweise mit einem Hydrazin oder Hydrazid zu Hydrazon reagieren kann.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Modifikation von TNF dadurch, dass Tags, also Markierungen, insbesondere mindestens drei Histidin-Reste, vorzugsweise Oligohistidine, in das TNF-Molekül eingeführt werden, vorzugsweise am C-Terminus oder N-Terminus, Solche Tags können jedoch auch intramolekular angeordnet sein. In einer derartigen Ausführungsform ist vorgesehen, die Oberfläche des Trägers, beispielsweise die silanisierte Oberfläche des Trägers, durch Aufbringen von Metallchelatkomplexen mit funktionellen Gruppen zu versehen. Auf diese Weise wird eine nicht-kovalente Bindung der Metall- chelatkomplexe mit dem Oligohistidin-Rest des zu immobilisierenden TNF-Moleküls erreicht. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stellt die Metallkomponente des Metallchelatkomple- xes ein zweiwertiges Metallkation, insbesondere Nickel2"1", dar. In einer besonders bevorzugten Ausfüh- rungsform ist der Metallchelatkomplex Nickel-NTA (NTA: Nitrilotriessigsäure) , insbesondere ein Derivat davon. Der Metallchelatkomplex, insbesondere Ni-NTA oder ein Derivat davon, ist in bevorzugter Ausführungsform an der Oberfläche des Trägers gebunden, beispielsweise mittels einer Bindung zwischen einer primären Aminogruppe des NTA-Derivats und einer Oberflächen-gebundenen Epoxygruppe.
Erfindungsgemäß kann auch vorgesehen sein, die Mo- difizierung von TNF dadurch vorzunehmen, dass diesem, vorzugsweise am C-Terminus oder N-Terminus, mindestens ein Strep-Tag, beispielsweise Strep-Tag I oder Strep-Tag II oder Biotin oder Desthiobiotin hinzugefügt wird. Im Zusammenhang mit der vorlie- genden Erfindung werden unter einem „Strep-Tag" auch funktionelle und/oder strukturelle Äquivalente verstanden, sofern Streptavidin und/oder dessen Ä- quivalente binden können. Der Begriff „Streptavidin" erfasst im Sinne der vorliegenden Erfindung also auch dessen funktionelle und/oder, strukturelle Äquivalente. In dieser Ausführungsform ist vorgesehen, die Oberfläche des Trägers, vorzugsweise eines anorganischen Trägers, insbesondere die silanisier- te Oberfläche des Trägers, mit Streptactin, Avidin, Neutravidin oder Streptavidin zu versehen. Die erfindungsgemäß vorgesehene Bindung zwischen zu immobilisierenden TNF-Molekülen und Oberfläche des Trägers erfolgt also durch eine Affinitätsbindung zwischen beispielsweise Strep-Tag und beispielsweise Streptavidin. Es ist auch möglich, dass beispielsweise Streptavidin am TNF-Molekül und beispielsweise das Strep-Tag als funktionelle Gruppe des Trä- gers vorgesehen ist. Selbstverständlich ist es erfindungsgemäß auch möglich, mehrere der genannten Modifikationen an dem zu immobilisierenden TNF- Molekül vorzunehmen, zum Beispiel eine unnatürliche Aminosäure, die Oligohistidin- und/oder Strep-Tags enthält, einzuführen.
Die Erfindung sieht also vor, beispielsweise mit unnatürlichen Aminosäuren, natürlichen, jedoch unnatürlich derivatisierten Aminosäuren, spezifischen Histidin- und/oder Strep-Tags modifizierte TNF- Moleküle mit dazu komplementär reaktiven Oberflächen derart zur Bindung zu bringen, dass eine geeignete Anbindung der TNF-Moleküle und damit eine Immobilisierung dieser erfolgt.
Wie vorstehend beschrieben modifizierte TNF- Moleküle selbst sind auch Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
In vorteilhafter Weise behält gebundenes _ TNF dabei vollständig seine biologische Funktionen bei. Durch die bereitgestellten Linker beziehungsweise Spacer zwischen Träger- und TNF-Oberflache wird den steri- schen Anforderungen für eine Immobilisierung von TNF unter Erhalt seiner Aktivität Genüge getan. Zudem ermöglicht die Erfindung auch den ortsspezifi- sehen Einbau von Reporter- oder Markergruppen, zum Beispiel Fluorophoren, Spin-Labeln, Goldpartikeln für Lichtstreuung etc. in Positionen, die die funktionellen Eigenschaften von TNF nicht beeinträchtigen. Die Vorteile der erfindungsgemäßen Nanoparti- kel und des erfindungsgemäßen Verfahrens zur spezifischen und gerichteten Immobilisierung und Markie- rung von TNF im Vergleich zum Stand der Technik resultieren aus den spezifischen chemischen Reaktionen zwischen TNF-Molekülen, die mit unnatürlichen Aminosäuren oder spezifischen Gruppen modifiziert wurden und komplementär reaktiven Festphasen sowie aus der selektiven Modifikation des zu immobilisierenden TNF-Moleküls. Die immobilisierten und gege- benenfalls auch markierten TNF-Moleküle sind durch den Erhalt ihrer nativen Konformation stabiler ge- gen enzymatischen oder chemischen Abbau und behalten ihre biologischen Funktionen bei. Dabei werden insbesondere die biologischen Aktivitäten, die auf Protein-Protein-Wechselwirkung beruhen, durch die immobilisierten TNF-Moleküle weitervermittelt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass das TNF-Molekül mit Markern, die seinen Nachweis erlauben, markiert ist. Dabei kann es sich beispielsweise um Fluo- rophore, Spin-Label, Goldpartikel, radioaktive Mar- ker oder ähnliches handeln. In besonders, bevorzug- ter Weise sind diese Marker, beispielsweise die Fluorophore, in der Lage, bei der Bindung eines in einem Test nachzuweisenden Bindungspartners an das gebundene TNF-Molekül eine spezifische Änderung der Fluoreszenzemission zu zeigen. Die Fluorophore können in das zu immobilisierende TNF mittels Aminosäuren, insbesondere unnatürlicher Aminosäuren, eingefügt werden. Erfindungsgemäß geeignet Fluor- marker sind beispielsweise N-Methyl-Aza-Tryptophan oder Coumarinderivate, wie DCA(6, 7-Dimethoxy-4- coumaryl) oder NBD (N-ß-7-nitro-benzofurazan-L-N- diaminopropionsäure) . Erfindungsgemäß kann das zu immobilisierende TNF-Molekül auch mit Fluorophoren markiert sein, die eine Einzelmoleküldetektion ermöglichen, zum Beispiel die Fluoreszenzfarbstoffe CyDye (Ammersham Pharmacia Freiburg) oder Alexa (Molecular Probes, Eugene, USA) .
Die erfindungsgemäß ermöglichte Detektion von ober- flächengebundenen Liganden des immobilisierten TNF- Moleküls, also zum Beispiel der Nachweis eines Zelloberflächen-Rezeptors, kann zum Beispiel durch Matrix-unterstützte Laser-Desorptions/Ionisations- Massenspektrometrie (MALDI-TOF) erfolgen. Der as- senspektroskopische Nachweis umfasst die Identifizierung und Charakterisierung der gebundenen Liganden in situ sowie die ortsaufgelöste Analytik. Der Nachweis der oberflächengebundenen Liganden kann durch Fluoreszenzspektroskopie erfolgen. Die Bindung des Liganden an den erfindungsgemäß immobilisierten Festphasen-Liganden, also TNF, ruft eine Änderung der Fluoreszenzeigenschaften der erfin- dungsgemäß eingesetzten Fluoreszenzmarker hervor, die eine Quantifizierung der Bindungsereignisse ermöglicht .
Die vorliegende Erfindung betrifft also auch Verfahren zum Nachweis einer Interaktion von i mobili- siertem TNF mit beispielsweise Liganden wie Rezeptoren, funktionellen oder strukturellen Äquivalenten, Analoga, Agonisten, Antagonisten oder ähnlichen, insbesondere zum Zweck der medizinischen Forschung und Diagnostik, wobei die erfindungsgemäßen Nanopartikel eingesetzt werden, um die vorgenannten Bindungspartner von immobilisiertem TNF zu identifizieren. Gemäß diesem Verfahren werden erfindungs- gemäße Nanopartikel mit daran immobilisiertem TNF mit einer zu untersuchenden Lösung, die potentielle Bindungspartner enthält, in Kontakt gebracht und eine Wechselwirkung oder eine Hemmung dieser Wech- selwirkung nachgewiesen. Das vorgenannte Verfahren stellt also auch ein Verfahren zum Identifizieren oder Screenen von potentiellen Bindungspartnern, beispielsweise potentiellen Liganden, des erfindungsgemäß immobilisierten TNF dar.
Ebenso betrifft die Erfindung Verfahren zum quantitativen Isolieren von Substanzen, die mit dem erfindungsgemäß immobilisierten TNF-Molekül reagieren, das heißt binden. Bei solchen Substanzen handelt es sich insbesondere um Proteine.
In besonders bevorzugter Weise können die erfindungsgemäßen Verfahren und die erfindungsgemäßen Nanopartikel auch eingesetzt werden, um Stoffe zu identifizieren, die beispielsweise als Modulatoren, das heißt Verstärker, Induktoren oder Hemmstoffe für die, insbesondere physiologischen, Interaktionen von TNF mit anderen Proteinen fungieren. Derartige nachzuweisende Hemmstoffe können beispielsweise gentechnisch veränderte, körpereigene Proteine, chemische synthetisierte Verbindungen aus Substanz- bibliotheken oder andere auch unbekannte Substanzen sein, die gegebenenfalls therapeutischen Nutzen mit sich bringen können.
In einer weiteren Ausführungsform kann vorgesehen sein, TNF zu immobilisieren, das einen ersten von zwei Reaktanten trägt oder diesen darstellt und die
Wechselwirkung des zweiten Reaktanten mit dem ers- ten Reaktanten durch eine geeignete Nachweismethode nachweist. Dabei kann vorzugsweise auch vorgesehen sein, dass die Wechselwirkung des zweiten Reaktanten mit dem ersten Reaktanten^in Gegenwart oder Ab- Wesenheit eines potentiellen Modulators, zum Beispiel Induktors oder Inhibitors durch geeignete Nachweisverfahren nachgewiesen wird und so potentielle Induktoren oder Inhibitoren in ihrer Wirksamkeit, beispielsweise als Arzneimittel, überprüft werden können. Die zu überprüfenden potentiellen Induktoren oder Inhibitoren können beispielsweise aus Substanzbibliotheken stammen. In besonders bevorzugter Ausführungsform kann vorgesehen sein, dass der Inhibitor oder der zweite Reaktant, also zum Beispiel ein Protein, eine in Genom-Sequenzier- Projekten identifiziertes Protein ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft also auch Verfahren zur Identifizierung und/oder Detektion einer Substanz, die die Interaktion zwischen immobili- . siertem TNF und dessen Interaktionspa^rtner modifi- _ zieren, insbesondere fördern oder hemmen kann, wobei das an Nanopartikeln immobilisierte TNF zusammen mit einem, vorzugsweise aufgereinigten und isolierten, Interaktionspartner, in Gegenwart oder Ab- Wesenheit der zu testenden Substanz inkubiert und eine Auswirkung dieser Substanz auf die Interaktion zwischen immobilisiertem TNF und dessen Bindungspartner nachgewiesen wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur gerichteten Immobilisierung von TNF an einem
Nanopartikel unter Beibehaltung der biologischen
TNF-Aktivität, wobei die Oberfläche eines anorgani-- sehen oder organischen Trägers durch Aufbringen einer ersten funktionellen Gruppe 1 A und gegebenenfalls einer zweiten, funktionellen Gruppe 1 B modifiziert und komplementäre funktionelle Gruppen 2 A und gegebenenfalls funktionelle Gruppen 2 B aufweisende modifizierte TNF-Moleküle mit der modifizierten Nanopartikel-Oberfläche derart in Kontakt gebracht, dass eine kovalente Bindung zwischen den funktionellen Gruppen 1 A und 2 A und gegebenen- falls eine nicht-kovalente Bindung zwischen den Gruppen 1 B und 2 B dergestalt stattfindet, dass das Protein gerichtet und unter Beibehaltung seiner biologischen Aktivität an das Nanopartikel bindet.
Erfindungsgemäß ist insbesondere vorgesehen, dass die funktionellen Gruppen 1 A und 2 A ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Carboxygruppe, Epoxygruppe, Maleinimidogruppe, Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Hydrazingruppe, Hydrazidgruppe, Thiolgruppe und Thioestergruppe. Die funktionellen Gruppen 1 B und 2 B sind erfindungsgemäß ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Oligohistidingruppe, Strep-Tag I, Strep-Tag II, Desthiobiotin, Biotin, Chitin, Chitinderivate, Chitinbindedomäne, Metallionenchelatkomplex, Strepta- vidin, Streptactin, Avidin und Neutravidin. Erfindungsgemäß können die funktionellen Gruppen 1 A, 1 B, 2 A und/oder 2 B unter Verwendung eines Spacers mit dem Träger und/oder Protein verbunden sein.
In bevorzugter Ausführungsform werden die funktio- nellen Gruppen 1 A und 1 B mittels Propfpolymerisa- tion, Silanisierung oder chemischer Derivatisierung auf die Trägeroberfläche aufgebracht. Beispielswei- se kann der Träger nach seiner Herstellung zunächst hydrophylisiert und dann silanisiert werden. Die Silanisierung der .Trägeroberfläche erfolgt beispielsweise mit einem Organosilan, insbesondere SiRιR2R3R4, wobei Ri bis R3 hydrolisierbare Gruppen wie Alkoxygruppen oder Halogenide, bevorzugt Chloride, und R4 ein organischer Rest ist, der als Spacer mit einer ersten funktionellen Gruppe 1 A oder als Bindestelle für einen die erste funktio- nelle Gruppe 1 A tragenden Spacer ausgeführt sein kann. Sofern in einer anderen Ausführungsform der Erfindung R4 als Bindestelle, zum Beispiel als Epo- xygruppe, für den die funktionelle Gruppe aufweisenden Spacer ausgeführt ist, werden im Anschluss an die Silanisierung die funktionellen Gruppen auf die Oberfläche aufgebracht, das heißt zum Beispiel die Maleinimidogruppe usw..
Die Dichte der funktionellen Gruppen oder der Abstand der funktionellen Gruppen von der Oberfläche und damit die Flexibilität können gegebenenfalls optimiert werden. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Umgebung der funktionellen Gruppen auf der Trägeroberfläche bezüglich elektrostatischer und sterischer Ausstattung für eine möglichst effizien- te, gerichtete Immobilisierung vorbereitet wird. Darüber hinaus können die Trägeroberflächen zusätzlich mit Molekülen wie Polyethylenglykolen, Oli- goethylenglykolen, Dextranen und ähnlichen ausgestattet werden, um eine unerwünschte Konformation- sänderung der immobilisierten TNF-Moleküle zu verhindern, die unspezifische Adsorption anderer bio- logischer Verbindungen zu minimieren und/oder die Trägersysteme sterisch zu stabilisieren.
In einem weiteren Schritt wird TNF an der modifi-
A zierten Oberfläche des Nanopartikelträgers immobi- lisiert, wobei je nach Oberflächenmodifikation die entsprechende Proteinmodifikation zu wählen ist. Dabei wird das zu immobilisierende TNF-Molekül erfindungsgemäß mit der modifizierten Oberfläche unter solchen Bedingungen in Kontakt gebracht, dass ein Abbau des Proteins minimiert oder verhindert wird.
Nach der TNF-Immobilisierung an der Trägeroberfläche ist erfindungsgemäß vorgesehen, die erfindungsgemäßen Nanopartikel gegebenenfalls mit Hilfe eines Stealth-Verfahrens, insbesondere durch Verpacken in beispielsweise Liposomen, zu maskieren, um bei späterer Verwendung der erfindungsgemäßen Nanopartikel eine ausreichende biologische Zirkulation zu erreichen.
Erfindungsgemäß besteht auch die Möglichkeit, die Nanopartikel mit dem daran immobilisierten TNF auf einer Membran abzuscheiden, wobei der entstehende Film durch Quervernetzung mechanisch und/oder chemisch stabilisiert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Nanopartikel zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, insbesondere zur Tumortherapie. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer „phar- mazeutischen Zusammensetzung" ein zu diagnosti- sehen, therapeutischen und/oder prophylaktischen Zwecken verwendetes Gemisch verstanden, das natürliche oder synthetisch hergestellte Wirkstoffe in einer beim Patienten gut applizierbaren Form ent- hält. Erfindungsgemäß ist also vorgesehen, dass die herzustellende pharmazeutische Zusammensetzung den Wirkstoff, insbesondere TNF, in einer an einem Nanopartikel immobilisierten Form enthält. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann ein festes oder flüssiges Gemisch sein. Eine pharmazeutische Zusammensetzung kann gegebenenfalls einen oder mehrere pharmazeutische Träger sowie weitere Zusatzstoffe wie Stabilisatoren, Verdickungsmittel, Trennmittel, Gleitmittel, Farbstoffe, Geruchsstoffe, Geschmacks- Stoffe, Gerüststoffe, Emulgatoren oder ähnliche enthalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die erfindungsgemäßen Nanopartikel enthält, das heißt also, die TNF in immobilisierter Form an ?einem erfindungsgemäßen Nanopartikel enthält.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Die Erfindung wird anhand der Figuren und der fol- genden Beispiele näher erläutert.
Sequenzprotokoll :
SEQ ID Nr. 1 zeigt die kodierende DNA-Sequenz eines TNF-Fusionsproteins am Beispiel von CysHisTNF (Kon- strukt 1) mit den Nukleotiden 1 bis 546; SEQ ID Nr. 2 zeigt die von SEQ ID Nr. 1 abgeleitete translatierte Aminosäuresequenz der Aminosäuren 1 bis 181;
SEQ ID Nr. 3 zeigt die kodierende DNA-Sequenz eines TNF-Fusionsproteins am Beispiel von TNC-TNF (Kon- strukt 2) mit den Nucleotiden 1 bis 705, und
SEQ ID Nr. 4 zeigt die von SEQ ID Nr. 3 abgeleitete translatiere Aminosäuresequenz mit den Aminosäuren 1 bis 234.
Die Figuren zeigen:
Figur 1 zeigt die Ergebnisse eines Biotests mit der Zielzelle KYM-1.
Figur 2 zeigt die Ergebnisse einer Elektrophorese.
Figur 3 zeigt die Ergebnisse eines weiteren Bio- tests mit der Zielzelle KYM-1.
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Figur 4 zeigt die Ergebnisse eines Biotests, wobei die Wirkung erfindungsgemäßer Nanopartikel auf KYM- 1-Tumorzellen im Vergleich zu der von löslichem humanem rekombinanten TNF als Kontrolle untersucht wurde.
Figur 5 zeigt die Ergebnisse eines Biotests, wobei die Wirkung erfindungsgemäßer Nanopartikel auf Co- Io205-Tumorzellen im Vergleich zu der von löslichem humanem rekombinanten TNF als Kontrolle untersucht wurde. Kontrollen wurden mit löslichem humanem TNF mit oder ohne Coinkubation mit dem monoclonalen An- tikörper 80M2, der selbst keine agonistische Aktivität besitzt, durchgeführt.
Figur 6 zeigt die Ergebnisse eines weiteren Bio- tests mit der Zielzelle KYM-1, wobei die Wirkung erfindungsgemäßer Nanopartikel im Vergleich zu der von löslichem humanem rekombinanten TNF als Positiv-Kontrolle sowie nicht mit TNF beladenen Nano- partikeln als Negativkontrolle untersucht wurde.
Figur 7 zeigt die Ergebnisse eines weiteren Bio- tests mit Mausfibroblasten, die humanen TNFR2 exprimieren und damit ein Zellmodell zur Erfassung membranTNF ähnlicher Bioaktivität sind. Die Figur zeigt die dem natürlichen Membran-TNF vergleichbaren Eigenschaften der TNF-Nanocytes (Konjugat) im Vergleich zu positiv (80M2 plus TNF) und negativ (hu-TNF, 80M2, unbeladene Partikel) Kontrollen.
Figur 8 zeigt die Ergebnisse von Wellenleiterspektroskopie-Resonanz-Analysen, wobei der modifizierte Tumornekrosefaktor-Rezeptor 1 (TNFRl-Fc) über α- Aminogruppen auf eine Carboxymethyldextran-Matrix (CMD-Matrix) immobilisiert und danach Bindungsstudien mit CyHISTNF durchgeführt wurden. Die Auftragung des Ausmaßes an Bindung von CysHisTNF (extent) gegen die eingesetzte Konzentration (ligate) resul- tiert in einer Bindungskurve, die im Sättigungsbereich die maximal mögliche Bindung beschreibt (Bmax) . Durch die Auftragung des Quotienten aus dem Ausmaß der Bindung und der CysHisTNF-Konzentration (extent/ligate) gegen das Ausmaß der Bindung (ex- tent) wird eine Geradengleichung erhalten, deren Steigung der negativen Affinitätskonstanten KD ent- spricht (Scatchard Plot) . Die Auftragung der Assoziationsraten-Konstante (kon) gegen die CysHisTNF- Konzentration ist eine weitere Methode, den KD-Wert zu bestimmen und dient zur Bestimmung des ermittel- ten KD-Wertes. Der Schnittpunkt der Geraden mit der Y-Achse entspricht der Halbwertzeit tι/2 des Ligand- Rezeptor-Komplexes und ist somit ein Maß der Stabilität des CysHisTNF-Rezeptor-Komplexes.
Figur 9 zeigt die Ergebnisse von Wellenleiterspekt- roskopie-Resonanz-Analysen, wobei der modifizierte Tumornekrosefaktor-Rezeptor 2 (TNFR2-Fc) über α- Aminogruppen auf eine CMD-Matrix immobilisiert und danach Bindungsstudien mit CyHISTNF durchgeführt wurden. Die Auftragung des Ausmaßes an Bindung von CysHisTNF (extent) gegen die eingesetzte Konzentration (ligate) resultiert in einer Bindungskurve, die im Sättigungsbereich die maximal mögliche Bindung beschreibt (Bmax) . Der Schnittpunkt der Geraden mit der Y-Achse entspricht der Halbwertzeit tι2 des Ligand-Rezeptor-Komplexes und ist ?somit ein Maß der Stabilität des CysHisTNF-Rezeptor-Komplexes.
Figur 10 zeigt die Ergebnisse von Wellenleiterspektroskopie-Resonanz-Analysen, wobei der modifizierte Tumornekrosefaktor-Rezeptor 1 (TNFRl-Fc) ü- ber α-Aminogruppen auf eine CMD-Matrix immobilisiert und danach Bindungsstudien mit TNF durchgeführt wurden. Die Auftragung des Ausmaßes an Bindung von TNF (extent) gegen die eingesetzte Konzentration (ligate) resultiert in einer Bindungs- kurve, die im Sättigungsbereich die maximal mögliche Bindung beschreibt (Bmax) . Der Schnittpunkt der Geraden mit der Y-Achse entspricht der Halbwertzeit tι2 des Ligand-Rezeptor-Komplexes und ist somit ein Maß der Stabilität des TNF-Rezeptor-Komplexes .
Figur 11 zeigt die Ergebnis Ase von Wellenleiter- spektroskopie-Resonanz-Analysen, wobei der modifi- zierte Tumornekrosefaktor-Rezeptor 2 (TNFR2-Fc) ü- ber α-Aminogruppen auf eine CMD-Matrix immobilisiert und danach Bindungsstudien mit TNF durchgeführt wurden. Die Auftragung des Ausmaßes an Bindung von TNF (extent) gegen die eingesetzte Kon- zentration (ligate) resultiert in einer Bindungskurve, die im Sättigungsbereich die maximal mögliche Bindung beschreibt (Bmax) . Der Schnittpunkt der Geraden mit der Y-Achse entspricht der Halbwertzeit tι2 des Ligand-Rezeptor-Komplexes und ist somit ein Maß der Stabilität des TNF-Rezeptor-Komplexes.
Figur 12 zeigt die Ergebnisse von Zetapotentialun- tersuchungen .
Beispiel 1
Herstellung eines Trägers
1.1 Silica-Träger
Zu 200 ml Ethanol wurden 12 mMol Tetraethoxysilan und 90 mMol NH3 gegeben. Das Gemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend wurden die gebildeten Partikel durch mehrfaches Zentrifugieren gereinigt. Dabei wurden 650 mg Sili- ca-Partikel mit einer mittleren Partikelgröße von 125 nm erhalten.
1.2 Magnetische Eisenoxid-Träger 200 ml einer 1 M FeCl3-Lösung und 5 ml einer 2 M FeS04-Lösung in 2 M HCl wurden unter kräftigem Rühren zu 250 ml einer 0,7 M NH3-Lösung gegeben. Anschließend wurde 30 Minuten gerührt und der gebil- dete schwarze Feststoff wurde mit 200 ml Wasser gewaschen. Anschließend wurde der Niederschlag 30 Minuten mit 100 ml 2 M HN03 gerührt und^ dreimal mit jeweils 100 ml Wasser gewaschen. Die superparamag- netischen Eisenoxid-Träger wurden in 50 ml einer 0,1 M Tetramethylammoniumhydroxid-Lösung resuspendiert. Dabei wurden 2 g Eisenoxid-Partikel mit einer mittleren Partikelgröße von 10 nm erhalten.
1.3 Magnetische Komposit-Träger
50 mg der in Beispiel 1.2 erhaltenen magnetischen Eisenoxid-Partikel wurden zweimal mit 5 ml Ethanol gewaschen und anschließend in 200 ml Ethanol aufgenommen. Zu der Lösung wurden 12 mMol Tetraethoxysi- lan und 90 mMol NH3 gegeben. Anschließend wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurden die Partikel durch mehrfache Zentrifugation gereinigt. Dabei wurden 600 mg magnetische Komposit- Partikel mit einer mittleren Partikelgröße von 150 nm erhalten.
1.4 Fluoreszierende Träger
190 μMol Fluoresceinamin und 170 μMol Isocyana- topropyltriethoxysilan in 50 ml Ethanol wurden 3 Stunden unter Rückfluss gekocht. Zu 50 ml Ethanol wurden 3 mMol Tetraet oxysilan und 880 μl einer Si- lan-Farbstoff-Lösung gegeben. Nach Zugabe von 22,5 mMol NH3 wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur ge- rührt. Anschließend wurden die erhaltenen Partikel durch mehrfache Zentrifugation aufgereinigt . Dabei wurden 160 mg Siliea-Partikel mit einer mittleren Partikelgröße von 110 nm erhalten.
1.5 Organische Polymer-Träger
50 mg des Emulgators p- (ll-'Acrylamido) - undecenoyloxyphenyl-dimethylsulfonium-methylsulfat wurden in 30 ml Wasser unter Rühren gelöst. Anschließend wurde eine Stunde lang Argon durch die Lösung geleitet. Unter Rühren erfolgte dann die Zugabe von 1,8 ml ml Methylmethacrylat . Die entstandene Emulsion wurde auf 60 °C erwärmt. Durch Zugabe von 10 mg 2, 2 ' -Azobis- (2-Amidinopropan) dihydrochlo- rid wurde die Polymerisation gestartet. Nach 5 Stunden wurde die Partikelsuspension abgekühlt und die Partikel wurden durch Zentrifugation gereinigt. Dabei wurden 1,6 g Partikel mit einer mittleren Partikelgröße von 145 nm erhalten. Die erhaltenen Partikel tragen kovalent verknüpfte Sulfoniumgrup- pen auf ihrer Oberfläche (Zetapotential im Phosphat-Puffer, pH 7,0: +22 mV) und sind zur Anbindung von Nukleophilen befähigt.
Beispiel 2
Oberflächenmodifizierung der Träger
2.1 A iniofunktionalisierte Oberfläche
Eine 1 Gew.-% wässrige Suspension der in den Beispielen 1.1 bis 1.4 erhaltenen Träger wurde mit 10 Vol.-% 25 % Ammoniak versetzt. 20 Gew.-% Aminopro- pyltriethoxysilan, bezogen auf die Träger, wurden zugegeben und es wurde eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Partikel wurden durch mehrfaches Zentrifugieren gereinigt. Die erhaltenen Partikel tragen funktionelle Aminogruppen auf ihrer Oberfläche (Zetapotential im 0,1 M Acetat-Puffer : +35 mV).
2.2 Aminofunktionalisierte organische Polymerträger
10 mg der in Beispiel 1.5 erhaltenen Träger wurden in 50 μl eines 10 mMol Phosphatpuffers (pH 7,8) gegeben. Anschließend wurden 950 μl einer 1 M Ethy- lendiamin-Lösung in 10 mMol Phosphatpuffer (pH 7,8) zugegeben. Dann wurde zwei Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Partikel wurden dann durch Zentrifugation aufgereinigt . Die so erhaltenen Träger tragen kovalent gebundene Amino-Gruppen auf ihrer Oberfläche.
2.3 Carboxy-funktionalisierte Oberfläche^
Zunächst wurde eine 2 Gew.-% Suspension aminofunk- tionalisierter Träger in Tetrahydrofuran hergestellt. Zu 10 ml dieser Lösung wurden 260 mg Bernsteinsäureanhydrid gegeben. Nach einer 5- minütigen Behandlung mittels Ultraschall wurde eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurden die Träger durch mehrfaches Zentrifugieren gereinigt. Die erhaltenen Silica-Träger tragen funktionelle Carboxygruppen (Zetapotential im 0,1 M Acetat-Puffer: -35 mV) auf ihrer Oberfläche und besitzen eine mittlere Partikelgröße von 170 nm. 2.4 Carboxydextran-modifizierte Träger
10 mg aminofunktionalisierte Nanopartikel und 1 mg Carboxydextran (Sigma, >55 cps A) wurden zu 1 ml 0,1
M Morpholinoethansulfonsäure-Puffer (MES, pH 5,0) gegeben. Dazu wurden 30 μl einer N-Ethyl-N' - (3- dimethylaminopropyl) -carbodiimid (EDC) -Lösung mit einer Konzentration von 500 μMol/ml zugegeben. Anschließend wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Träger wurden abwechselnd mit MES- und TBE-Puffer (89 mM Tris- (hydroxy- methyl) aminomethan, 89 mM Borsäure, 2 mM Ethylendi- amintetraessigsäure, pH 8,3) gewaschen. Anschließend wurden die gewaschenen Partikel in 1 ml MES- Puffer aufgenommen. Die erhaltenen Siliea-Partikel tragen funktionelle Carboxygruppen (Zetapotential im 0,1 M Acetat-Puffer: -25 mV) auf ihrer Oberfläche und weisen eine mittlere Partikelgröße von 160 nM auf. Diese Dextran-Oberflache ist insbesondere zur Immobilisierung von Proteinen geeignet, deren Tertiärstruktur durch Adsorptionsproz,esse auf der Trägeroberfläche gestört wird.
2.5 Aminofunktionalisierung von Carboxy- (Dextran) - Trägern
Zunächst wurde eine 1 M Ethylendiamin-Lösung in 0,1 M MES-Puffer (pH 5,0) hergestellt. Dazu wurden 500 μg der Carboxy- (Dextran) -modifizierten Träger und 30 μl einer 500 μMol/ml EDC-Lösung in MES-Puffer gegeben. Anschließend wurde drei Stunden bei Raumtemperatur ' geschüttelt. Die Träger wurden danach mehrmals mit MES-Puffer gewaschen. Dabei wurden Träger mit einer mittleren Partikelgröße von 160 nm und einem Zetapotential von + 25 mV im 0,1 M Ace- tat-Puffer erhalten.
Zur Variation der Spacerlänge beziehungsweise der Dichte der funktionellen Gruppen können auch andere Amine in analoger Weise eingesetzt werden, beispielsweise 4, 7, 10-Trioxa-l, 13-tridecandiamin (oder höhere Homologe) oder Tris (2-aminoethyl) -amin.
2.6 Nitrilotriessigsäure (NTA) -Oberfläche
10 mg Carboxy-modifizierte Träger wurden zweimal mit 1 ml Acetonitril (MeCN) gewaschen und anschließend in 1 ml MeCN aufgenommen. Dazu wurden 10 μMol Dicyclohexylcarbodiimid und 10 μMol N-Hydroxy- succinimid gegeben. Anschließend wurde zwei Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wurde einmal mit 1 ml Cyelohexan und einmal mit 1 ml MeCN gewaschen. Die Partikel wurden anschließend in 1 ml MeCN aufgenommen. Dazu wurden 4 μMol N,N-Bis- Carboxymethyl-L-Lysin gegeben und drei Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wurde einmal mit 1 ml Acetonitril und zweimal mit 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen.
Durch diese Umsetzung wird einerseits die Dichte der funktionellen Carboxy-Gruppen erhöht und andererseits können mit dieser Oberfläche Ni2+-Ionen durch Komplexierung gebunden werden. Diese Oberflä¬ che ist dann zur Bindung von His-Tag-modifizierten Proteinen befähigt. 2.7 Pegylierte Partikel
1 mg aminofunktionälisierte Partikel (Bsp.: 2.1, 2.2, 2.5) werden in 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH: 7.0) suspendiert. Anschließend werden bis zu 1 mg heterofunktionelle Polyethylenglykole (wie mPEG- succinimidyl-propionat, t-Boc-NH-PEG-succinimidyl- propionat, Maleinimido-PEG-succinimidyl-propionat oder deren Gemische) zugegeben und 3 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Sind Schutzgruppen auf der Oberfläche vorhanden, werden diese durch eine 2 stündige Behandlung mit 1 % Trifluoressigsäure entfernt. Die Partikel werden zweimal mit 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH: 7.0) gewaschen.
Diese Oberflächen sind zur Vermeidung einer unspe- zifischen Anlagerung von Proteinen geeignet.
Falls diese Oberflächen nach der Deblockierung der Schutzgruppen Aminogruppen tragen, können sie in Bsp. 2.9 weiterverwendet werden. <
2.8 Thiol-Oberflache
10 mg Carboxy-modifizierte Träger wurden zweimal mit 1 ml Acetonitril (MeCN) gewaschen und dann in 1 ml MeCN aufgenommen. Dazu wurden 10 μMol Dicyc- lophexylcarbodiimid und 10- μMol N-Hydroxysuccinimid gegeben und anschließend wurde zwei Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Dann wurde einmal mit 1 ml Cyelohexan und einmal mit 1 ml MeCN gewaschen. Die Träger wurden dann in 1 ml MeCN aufgenommen. Dazu wurden 500 μg Cystein gegeben und drei Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Im Anschluss daran wurde einmal mit 1 ml Acetonitril und zweimal mit 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen.
Diese Oberfläche ist insbesondere zur Immobilisie- rung von Proteinen über Disulfid-Brücken geeignet.
2.9 Maleimido-aktivierte Oberfläche
500 μg aminofunktionalisierte Träger wurden in 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) resuspendiert. Dazu wurden 1,25 μMol Sulfo-Succinimidyl-4- (N- maleimidomethyl) -cyclohexan-1-carboxylat gegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wurde einmal mit kaltem 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und die Träger wurden in 1 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) aufgenommen.
2.10 Iodacetyl-aktivierte Oberfläche
500 μg aminofunktionalisierte Träger wurden in 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) resuspendiert. Dazu wurden 1.25 μMol Succinimidyl- (4-iodoacetyl) - aminobenzoat gegeben und eine Stunde bei Raumtempe- ratur geschüttelt. Danach wurde einmal mit kaltem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und die Träger wurden in 1 ml 10 M Phosphatpuffer (pH 7,0) aufgenommen.
Diese Oberflächen sind zur Ankopplung von Proteinen geeignet, die freie Thiol-Gruppen tragen. 2.11 Oberfläche mit NH2- und COOH-Gruppen
Die Belegung mit funktionellen Gruppen ist in den Beispielen 2.1 bis 2.9 so beschrieben, dass sie quantitativ verläuft. Diese Belegungen lassen sich üblicherweise aber auch durch die Wahl der Reaktionsbedingungen, insbesondere über die Konzentration des Modifikationsmittels, so steuern, dass sie nur teilweise erfolgen. Durch eine entsprechende Wahl der Modifikationsmittel wird erreicht, dass ver- schiedene funktionelle Gruppen nebeneinander auf der Trägeroberfläche vorliegen.
Beispielsweise wird in Beispiel 2.3 die Konzentration an Bernsteinsäureanhydrid verringert. Durch eine geeignete Wahl des Verhältnisses NH2/COOH va- riiert der isoelektrische Punkt des Trägersystems in einem weiten Bereich, beispielsweise zwischen 8 und 3. Dies ist bei der Umsetzung mit Proteinen ein entscheidender Parameter zur Steuerung der Reaktivität, da sich gleichgeladene Systeme 'abstoßen.
2.12 Clustering
Im ersten Graph ist die Umsetzung unmodifizierter Silica Partikel mit Aminosilanen gezeigt (analog Beispiel 2.1.). Im zweiten Graph werden diese Ami- no-funktionalisierten Oberflächen mit Bernsteinsäu- reanhydrid umgesetzt (analog Beispiel 2.3.). Die daraus resultierenden Carboxy-Gruppen an der Partikeloberfläche können z.B. mit Ethylendiamin weiter umgesetzt werden, wie in Graph 3 zu sehen ist (analog Beispiel 2.5.). Es resultieren wieder A ino- funktionalisierte Oberflächen. Durch die Variation der Modifikatorkonzentration kann das Zetapotential und damit die Dichte der funktionellen Gruppen auf der Partikeloberfläche kontrolliert werden.
A 2.13 Trägeroberflächen mit SH- und NTA-Gruppen
Die Reaktion wird wie in den Beispielen 2.6 oder 2.7 durchgeführt, wobei allerdings ein Gemisch der beiden Modifikationsmittel eingesetzt wird. Dadurch werden His-Tag-tragende Proteine in einem ersten Schritt nicht-kovalent ausgerichtet, wobei dieser Zustand durch Ausbildung einer kovalenten Disulfid- Brücke anschließend dauerhaft fixiert wird.
3. Immobilisierung von TNF an Nanopartikeln
Die vorstehend hergestellten oberflächenmodifizier- ten Nanopartikel wurden zur Immobilisierung von TNF-Molekülen verwendet. Dabei wurden die TNF- Moleküle in gerichteter Weise unter Erhalt ihrer Signalfähigkeit an die inerten Träger gekoppelt, so dass bei Verwendung der Nanopartikel eine Wechsel- Wirkung mit einem TNF-Rezeptor möglich und die Signalantwort der Zelle in definierten Zellsystemene messbar war.
3.1 Konstruktion von TNF-Varianten
3.1.1 TNF-Fusionsproteine mit N-terminalen Mo- difikationen (Konstrukt 1)
Es wurde das Linker-modifizierte Fusionsprotein CysHisTNF konstruiert, das in der Nähe des N- Terminus über eine reaktive Thiolgruppe verfügt,.. die beispielsweise mit einer Maleinimido-Gruppe auf der Oberfläche von Nanopartikeln eine kovalente Bindung eingehen kann. Das Protein wurde zusätzlich mit einem Gly-reichen Linker mit einem His-Tag be- stehend aus zwei oder mehr Histidinresten versehen, wodurch das Protein einerseits an eine, mit Ni2+ beladene Affinitätsmatrix gebunden und mit Imidazol eluiert werden kann. Der His-Tag erlaubt andererseits eine nicht-kovalente Bindung von CysHisTNF an Metallionenchelatkomplexen, insbesondere Nickel- Nitrilotriessigsäure (NTA) -Gruppen auf der Oberfläche von Nanopartikeln. Die Klonierung des Funkti- onsproteines erfolgte nach Standardverfahren, beispielsweise unter Verwendung von Verfahren zur site specific-Mutagenese und ist weiter unten detailiert aufgeführt. Die DNA-Sequenz ist in SEQ ID Nr. 1 mit den Nucleotiden 1 bis 546 dargestellt. Die dazugehörige Aminosäuresequenz mit den Aminosäuren 1 bis 181 ist in SEQ ID Nr. 2 dargestellt.
Von dem N-Terminus zum C-Terminus ergibt sich fol- gender Aufbau:
1. Sequenz des Linkers 1 (Ll) : poly-Gly-Linker mit einem Cys (NT 25-27, AA 9) und einem His-tag (NT 43-60, AA 15-20): NT 1-78, AA 1-26
2. TNF-Modul: reife Form des humanen TNF-Proteins (17,5 kDa Form, rekombinantes TNF, Swissprot #P01375, AA 1-157) mit Deletion der N-terminalen 2 AA (TNFdelta 1,2) : NT 79-543, AA 27-181
3. Stop-Codon: NT 544-546 Im folgenden wird die Konstruktion des Linkermodifizierten Fusionsproteins, das am N-Terminus über eine reaktive Thiolgruppe sowie über einen (His) 6-tag für die Reinigung verfügt (SEQ ID Nr. 1) dargestellt.
Dieses Fusionsprotein (abgekürzt: CysHisTNF) wurde wie folgt hergestellt:
Das TNF-Fragment (AA 3-181) wurde aus einem anderen Konstrukt PinPointHisTNF (prokaryotiseher Vektor PinPoint™ Xa-3, beschrieben in „PinPoint™ Xa Protein Purification System", Promega) über eine Restriktionsverdauung der Plasmid-DNA mit Sacl und Hindlll herausgeschnitten. Das nach präparativer Agarosegel-Elektrophorese nebst DNA-Elution iso- lierte Fragment wurde in einen modifizierten Vektor (pQE 5, QIAexpress®, Qiagen) insertiert. Dieser wurde zuvor mit BamHI und Hindlll verdaut.
Das Konstrukt wurde zur Verifikation der cDNA- Sequenz sequenziert. '
Das so erhaltene Konstrukt erlaubt die prokaryoti- sche Expression des Fusionsproteines CysHisTNF. Diese wurde weitgehend nach den Angaben des Herstellers durchgeführt (QIAexpress® System, Qiagen) . Eine Zugabe von IPTG zur Induktion der Expression erfolgte nicht (Basalinduktion) .
Das bakterielle Lysat (cytoplasmatischer Extrakt) wurde für die Anreicherung eingesetzt. Die Reinigung des TNF-Proteins erfolgte mittels Affinitätschromatographie (IMAC, HiTrap®-Affinitätssäule, Amershampharmacia biotech) . Nach Angaben des Herstellers wurde das Protein an eine mit Ni2+ beladene Affinitätsmatrix gebunden und mit Imidazol elu- iert .
A In Figur 1 ist das Ergebnis der Untersuchung im Hinblick auf die Induktion von Apoptose auf TNF- sensitive Tumorzellinien dargestellt. Die Abbildung zeigt, dass das TNF-Fusionsprotein CysHisTNF über eine hohe Bioaktivität verfügt. Die Figur 1 zeigt Zellen der humanen Rhabdomyosarkomlinie KYM-1. Diese wurden bei 37 °C kultiviert, wie in Grell et al., 1995 sowie Grell et al . , 1994, beschrieben. Für den Bio-Assay wurden 1 x 104 Zellen/well in 96-well Mikrotiterplatten ausgesät und unter Kulturbedin- gungen über Nacht inkubiert. Anschließend wurden die Zellen für 16 - 20 h in Gegenwart titrierter Konzentrationen von humanem rekombinantem TNF-α (A) bzw. CysHisTNF [bakterielles Lysat (■) , gereinigtes Protein (T) ] kultiviert und die metabolische Zell- aktivität über einen MTT-Test quantifiziert (Grell et al., 1995). Die Extinktion wurde bei 550 nm bestimmt. Dargestellt sind jeweils die Mittelwerte aus einem typischen Experiment + SD.
3.1.2 TNF-Fusionsproteine mit natürlichen Lin- kern (Multimerisierungsmodulen) (Konstrukt 2)
Es wurde ein Fusionsprotein mit der Multimerisie- rungsdomäne aus dem Tenascin-C-Molekül (TNC) konstruiert. Die Multimerisierungsdomäne aus diesem Molekül erlaubt eine gezielte kovalente Trimerisie- rung des TNF-Fusionsproteins und enthält am N- Terminus zwei Cysteinreste . Die Klonierung dieses Fusionsproteines erfolgte nach Standardverfahren, wie weiter unten (Beispiel 2) detailiert beschrieben. Die DNA-Sequenz ist in SEQ ID Nr. 3 mit den
A Nueleotiden 1 bis 705 dargestellt. Die dazugehörige Aminosäuresequenz mit den Aminosäuren 1 bis 234 ist in SEQ ID Nr. 4 dargestellt.
Vom N-Terminus zum C-Terminus ergibt sich folgender Aufbau:
1. Sequenz des Linkers 1 (Ll) : NT 1-24, AA 1-8
2. Trimerisierungsdomäne des Tenascins (vom Huhn) : NT 25-114, AA 9-38
3. Sequenz des Linkers 2 (L2): NT 115-132, AA 39- 44
4. TNF-Modul: mutierte Form des natürlichen, humanen TNF-Vorläuferproteins (26 kDA Membranform, Swissprot #P01375, 233 AA) mit' Delet,ionen der N- terminalen 56 AA und von AA 78-89 (TNFdeιta ι-56, 78- 89), d.h. Deletion der cytoplasmatischen Domäne, der Transmembrandomäne und der TACE-Spaltstelle des TNF-Vorläuferpeptids: NT 133-627, AA 45-209
5. Sequenz des Linkers 3 (L3) : NT 628-645, AA 210-215
6. myc-tag: NT 646-684, AA 216-228
7. His-tag: NT 685-702, AA 229-234
8. Stop-Codon: NT 703-705 Das Fusionsprotein wurde unter anderem in prokary- ontischen Zellen, insbesondere in E. coli, Säugerzellen und im Baculovirus-Expressionssystem expri- miert. TNF-Fusionsproteine lassen sich funktionell exprimieren in Säugerzellen, wie beschrieben in
Wüest, T., 2001; Wüest et al . , 2002, Patent 2002, sowie im Baculovirus-System.
Wie im folgenden gezeigt, wurde das TNF- Fusionsprotein TNC-TNF auch prokaryotisch expri- miert.
Beispiel 2 (Konstrukt 2)
Konstruktion eines TNF-Fusionsproteins mit der Mul- timerisierungsdomäne aus dem Tenascin C-Molekül (AA 110-139, Swiss Prot . Accession No. P10039, Huhn; oder Swiss Prot. Accession No. P24821, human) (beschrieben in Wüest et al., 2002, Patent WO 02/22833) .
?• Diese Domäne mit sogenannter „coiled-coil"-Struktur erlaubt eine gezielte kovalente Trimerisierung des TNF-Fusionsproteins und enthält N-terminal zwei Cysteinreste. Die genaue Position der Thiolgruppen innerhalb der Proteinsequenz ist abhängig vom gewählten Expressionssystem (unterschiedliche Linkersequenzen) . Das TNC-TNF enthält 2 Cys an Position 10 und 12 (SEQ ID Nr. 3) .
Das Konstrukt 2 wurde wie folgt hergestellt:
Das TNC-TNF-Fragment (AA 9-234, siehe Sequenz 2) wurde aus einem Konstrukt/Plasmid pGD105TNC-TNF (eukaryotischer Expressionsvektor pGD105, beschrieben in EP 0 953 639) herausgeschnitten und in einen prokaryotischen Vektor subkloniert.
Hierzu wurde die Plasmid-DNA pGDl05TNC-TNF mittels der Primer 1 und 2 und proof-reading PCR amplifi- ziert, wodurch die Schnittstellen Pst I und Hindlll eingeführt wurden. Der für die Tenasc'in- und die TNF-Domäne kodierende Sequenzabschnitt wurde durch einen Pstl/Hindlll Verdau erhalten. Das isolierte Fragment wurde in die entsprechenden sites des modifizierten pQE-5 Vektors (Qiagen) eingesetzt. Der Vektor pQE-5 wurde zuvor mit PstI und Hindlll verdaut.
Alle Klonierungs- und PCR-Amplifikationsschritte erfolgten nach Standardmethoden mit den nachfolgenden Primern. Das Konstrukt wurde zur Verifikation der cDNA-Sequenz sequenziert.
Primer 1 i
5' AAC TGC AGC CTG TGG CTG TGC GGC TGC CCC AGA CAT CAA G 3'
Primer 2
5' CCC AAG CTT GGG TTA ATG ATG ATG GTG ATG 3'
Das so erhaltene Konstrukt wurde wie das Konstrukt
1 (Beispiel 1) exprimiert. Abweichend davon wurden die Bakterienzellen bei 30 °C kultiviert (ohne Induktion der Expression) . In Fig. 2 ist das Ergebnis einer gelelektrophoreti- schen Auftrennung nach der Expression ' des TNF- Fusionsproteins dargestellt. Die Western-Blot Analyse zeigt, dass unter nicht reduzierenden Be-
A dingungen auch bei prokaryotiseher Expression trimer organisiertes TNC-TNF vorliegt. Unter reduzierenden Bedingungen wandert das Protein entsprechend dem kalkulierten MW des monomeren TNC-TNF von ca. 29 kDa.
Die Reinigung des TNC-TNF erfolgt wie in 3.1.1 beschrieben.
In Fig. 3 ist das Ergebnis der Untersuchung im Hinblick auf die Induktion von Apoptose auf TNF- sensitive Tumorzellinien dargestellt. Die Abbildung zeigt, dass das TNC-TNF über eine hohe biologische Aktivität verfügt.
Für den Bio-Assay wurden die KYM-1 Zellen (1,1 x 104 Zellen/well) wie in Fig. 1 beschrieben kultiviert. Die Zellen wurden mit seriellen'- Verdünnungen von löslichem humanem rekombinanten TNF-α (D) sowie TNC-TNF [bakterielles Lysat (•)] für 16 h bei 37 °C inkubiert. Der Anteil der lebenden Zellen wurde ü- ber einen MTT-Test quantifiziert (siehe Fig. 1) . Die Extinktion wurde bei 560 nm bestimmt. Darge- stellt sind jeweils die Mittelwerte ± SD. 3.2 Kovalente Immobilisierung von TNF-Fusionspro- teinen an oberflächenmodifizierten Trägerpartikeln
A
Die neu hergestellten TNF-Fusionsproteine (siehe 3.1.1 und 3.1.2) wurden mit Nanopartikeln mit Ma- leinimido-aktivierter Oberfläche (vgl. Beispiel 2.9) umgesetzt (Endkonzentration der Nanopartikel zwischen 500 und 1000 μg/ml) .
Die beiden Kopplungskomponenten wurden gemischt und für 30 - 45 min. bei Raumtemperatur in 2 ml 10 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,2 (Endvolumen) inkubiert. Die Abtrennung der Partikel von der löslichen Komponente erfolgte durch Zentrifugation bei 13 000 rp (Eppendorf Kühlzentrifuge 5403) für 10 min. bei 4°C. Das Carrier-immobilisierte TNF- Fusionsprotein wurde zweimal mit 1 - 2 ml PBS gewaschen und in RPMI 1640-Medium mit einem Anteil von 5 % FCS bzw. PBS aufgenommen (in Abhängigkeit von den weiteren Analysen) . '
3.3 Nachweis der Immobilisierung und der biologischen Aktivität von immobilisiertem TNF
Anhand von Bio-Assays sowie ELISA-Tests wurde nachgewiesen, dass eine Immobilisierung der TNF- Moleküle an den Nanopartikeln erfolgte. Die erhal- tenen Nanopartikel mit daran immobilisiertem TNF wurden bezüglich ihrer biologischen Aktivität unter Verwendung definierter zellulärer Testsysteme, insbesondere Tumorzelllinien, charakterisiert. Diese Zellsysteme ermöglichen eine sensitive Erfassung einer differentiellen biologischen Aktivität löslicher und Nanopartikel-gekoppelter TNF-Varianten.
Insbesondere wurde die cytotoxische Wirkung der erfindungsgemäßen Nanopartikel A mit daran immobili- siertem TNF auf KYM-1-Zellen, Colo205-Zellen und MF-R2Fas-Zellen (Mausfibroblasten mit Chimären TNF- Rezeptor 2) erfasst. Diese Zellsysteme** ermöglichen eine sensitive Erfassung einer differentiellen Bioaktivität löslicher und Matrix-gekoppelter Varian- ten von TNF, wie beschrieben in Grell et al., 1995, Grell et al . , 1993, Krippner-Heidenreich et al., 2002. Die Wirkung der erfindungsgemäßen Nanopartikel mit daran immobilisiertem TNF wurde mit der Wirkung von in Lösung befindlichem humanem rekombi- nanten TNF-α als Kontrolle verglichen. Die Tests bezüglich der Wirkung der erfindungsgemäßen Nanopartikel und löslichem TNF auf die vorstehend genannten Zelllinien erfolgte nach Standardverfahren. Dabei wurden die ECso-Werte von immobilisiertem und in Lösung befindlichem TNF ermittelt und vergli- chen.
Induktion von Apoptose in TNF-sensitiven Tumorzel- linien (siehe Fig. 4-7)
Für den Bio-Assay wurden die KYM-1 Zellen, wie in Fig. 1 beschrieben, kultiviert.
Die Zellen wurden in Gegenwart titrierter Konzentrationen der Konjugate aus den Kopplungsansätzen A 1 - A 3 (Träger vgl. 2.1) für 18 h bei 37°C inkubiert. Der Anteil der lebenden Zellen wurde durch die MTT-Methode bestimmt. Humaner rekombinanter TNF-α (Δ) wurde als Standard eingesetzt (siehe Fig. 1) . Die Beladung der Partikel mit CysHisTNF wurde mittels Sandwich-ELISA (OPTEIA™ Human TNF-α Elisa Kit, BD PharMingen) bestimmt.
Die unter Verwendung der Tumorzelllinie KYM 1 erhaltenen Ergebnisse sind in Figur 4 und Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 zeigt die EC5o-Werte für die TNF-Konjugate im Vergleich zu menschlichem rekombinanten TNF-α.
Tabelle 1
Der Biotest zur Bestimmung der Wirkung von immobilisierten und nicht-immobilisierten TNF auf die Zielzellen Colo205 wurde nach Standardverfahren durchgeführt. Kontrollansätze wurden dabei mit löslichem TNF mit oder ohne Coinkubation mit dem mo- noclonalen Antikörper 80M2, der selbst über keine agonistische Aktivität verfügt, durchgeführt. Die Ergebnisse bezüglich der Wirkung der erfindungsgemäßen Nanopartikel auf diese Zielzellen im Vergleich zu der Wirkung von löslichem humanem rekombinanten TNF auf die Zielzelle An Colo205 sind in Fi- gur 5 und Tabelle 2 zusammengefasst .
Für den Bio-Assay wurde die Colonkarzinom-Zellinie Colo205 in 96-well Mikrotiterplatten ausgesäht (1,1 x 104 Zellen/well) und über Nacht inkubiert, wie beschrieben in Grell et al., 1995. Die Colo205- Zellen wurden mit seriellen Verdünnungen der Konjugate aus den Kopplungsansätzen A 1 - A 3 für 40 h bei 37 °C inkubiert. Colo205-Zellen wurden zusätzlich mit löslichem humanem rekombinantem TNF-α (V) in Ab- und Anwesenheit des TNF-Rezeptor R2 spezifi- sehen Antikörpers 80M2 (0, Δ; 1 μg/ml) kultiviert. Dieser onoklonale Antikörper verfügt selbst über keine agonistische Aktivität, induziert aber zusammen mit löslichem hu-TNF TNF-Rezeptor R2 spezifische Signale (Grell et al., 1994). Der Anteil der lebenden Zellen wurde durch die MTT-Stta>ndardmethode bestimmt (vgl. Fig. 1) . Die Beladung der Partikel mit CysHisTNF wurde mittels Sandwich-ELISA (vgl. Fig. 4) bestimmt.
Tabelle 2
Die Ergebnisse der durchgeführten biologischen As- says sowie der ELISA-Tests belegen, dass eine Immobilisierung der verwendeten TNF-Varianten an die Nanopartikel erfolgte. Die an dem erfindungsgemäßen Nanopartikel immobilisierten TNF-Moleküle0 weisen im Vergleich zum löslichen Protein eine veränderte, dem membranständigen TNF ähnliche Bioaktivität auf, wie aus der Figur 5 ersichtlich. Die Tumorzelllinie Colo205 ist gegen den cytotoxischen Effekt von löslichem TNF weitgehend resistent, während die Stimulation des TNF-R2-Rezeptors mit membranständigem TNF, der sogenannten Pro-Form von TNF, ebenso wie mit immobilisiertem TNF zur Induktion von Apoptose führt. Die Membran-TNF äquivalenten Eigenschaften der TNF-konjugierten Nanopartikel (Nanocytes) werden in Beispiel 4 in einem weiteren Zellmodell bestätigt. Beispiel 4
Die nachfolgenden Figuren belegen weiter die durch Konjugate/ NANOCYTES vermittölte Bioaktivität auf Tumorzellinien. In den dargestellten Beispielen wurden oberflächen-modifizierte Träger eingesetzt, die über eine Dextranschicht verfügen '(CMD-Matrix, siehe 2.4). Durch Testung der Konjugate auf geeigneten Zellen, wurde die TNF-Rezeptor R2-Stimulation über die Induktion von Apoptose nachgewiesen (siehe Fig. 6+7)
Die spezifische biologische Aktivität/Funktionalität des Konjugates wurde zunächst in einem standardisierten Zytotoxizitätstest auf KYM-1 Zellen bestimmt (Durchführung vgl. Fig. 1 bzw. 4). Für den Kopplungsansatz wurden die in 2.4 beschriebenen Träger eingesetzt. Humaner rekombinanter TNF- α (D) wurde als Standard eingesetzt. Unbeladene Partikel bewirken keine Induktion von Apoptose (0) . Der Anteil der lebenden Zellen wurde durch die MTT- Standardmethode bestimmt. Die Beladung der Partikel mit CysHisTNF (•) wurde mittels Sandwich-ELISA quantifiziert .
Die biologische Aktivität des in Fig. 6 beschriebenen Konjugates wurde in einem weiteren Bio-Assay auf Mausfibroblasten bestimmt (1,2 x 104 Zellen/well) (Fig. 7) .
Diese Zellinie exprimiert einen Chimären TNF- Rezeptor TNF-R2-Fas, der die cytoplasma-tisehe Domäne des Todesrezeptors Fas (CD95) und die extra- zelluläre Domäne des humanen TNF-Rezeptors R2 enthält, wie beschrieben in Krippner-Heidenreich et al., 2002. Die Zellinie ist hochsensitiv gegenüber der Membranform von hu-TNF-a [membran-äquivalenter
A Stimulus (0), siehe Fig. 7], aber weitgehend resis- tent gegenüber löslichem hu-TNF-α (□) . Der Anteil der lebenden Zellen wurde durch die Kristallvio- lett-Färbung/-Methode bestimmt; Die Beladung der Partikel mit CysHisTNF (•) wurde mittels Sandwich- ELISA bestimmt (vgl. Fig. 4).
Damit ist gezeigt, dass das Matrix-gekoppelte TNF äquivalente Eigenschaften von membranständigem TNF aufweist .
Beispiel 5
TNF- und CysHisTNF-Interaktion mit TNF-Rezeptor 1 und TNF-Rezeptor 2
Die nachstehenden Affinitäts-Messungen erfolgten mittels Wellenleiterspektroskopie-Resonanz-Analysen unter Verwendung einer IAsys-Vorrichtung (Thermo- Labsystem Camebridge, Großbritannien) . Dabei wurden modifizierte Tumornekrosefaktor-Rezeptoren 1 (TNFRl-Fc) oder Tumornekrosefaktor-Rezeptoren 2 (TNFR2-Fc) über α-Aminogruppen auf eine Carboxymethyldextran-Matrix (CMD-Matrix) immobilisiert. Danach wurden Bindungsstudien durchgeführt. Für die Bindung wurden unterschiedliche Konzentrationen von TNF beziehungsweise Cys-TNF an die Rezeptoren über die Zeit online verfolgt. Nach jeder Bindung erfolgte eine Regeneration, das heißt, der gebundene Ligand wurde von der immobilisierten Matrix abgewa- sehen. Eine Rezeptor-beladene Matrix stand dadurch für mindestens 10 Bindungen zur Verfügung. Aus den so erhaltenen Rohdaten konnten nun folgende Parameter ermittelt werden:
1. Die Auftragung des Ausmaßes an Bindung von TNF beziehungsweis CysHisTNF (extent) gegen die eingesetzte Konzentration (ligate) resultiert in einer Bindungskurve, die im Sättigungsbereich die maximal mögliche Bindung be- schreibt (Bmax) .
2. Durch die Auftragung des Quotienten aus dem Ausmaß der Bindung und der TNF beziehungsweise CysHisTNF-Konzentration (extent/ligate) gegen das Ausmaß der Bindung (extent) wird eine Geradengleichung erhalten, deren Steigung der negativen Affinitätskonstanten KD entspricht (Scatchard Plot) .
3. Die Auftragung der Assoziationsraten- Konstante (kon) gegen die TNF- b'eziehungswei- se CysHisTNF-Konzentration ist eine weitere Methode, den KD-Wert zu bestimmen und dient zur Bestimmung des unter Punkt 2 ermittelten K-Wertes. Außerdem entspricht der Schnittpunkt der Geraden mit der Y-Achse der Halb- wertzeit tχ/2 des Ligand-Rezeptor-Komplexes und ist somit ein Maß der Stabilität des TNF- beziehungsweise CysHisTNF-Rezeptor-Komplexes .
Diese drei Auftragsformen wurden für CysHisTNF an immobilisiertem TNFRl-Fc (Figur 8), CysHisTNF an immobilisiertem TNFR2-FC (Figur 9), TNF an immobi- lisiertem TNFR2-Fc (Figur 10) und TNF an immobilisiertem TNFRl-Fc (Figur 11) gewählt. Es wurden mindestens jeweils zwei unabhängige Experimente durchgeführt. Wie in der Tabell Ae 4 zusammengefasst, zeigt sich, dass TNF und CysHisTNF mit einer ähnlichen Affinität an den modifizierten TNF-Rl-Rezeptor binden (KD = 2-5 nM) . Auch die Halbwertzeiten dieser Liganden mit TNFRl-Fc mit 8- bis 14 Minuten entsprechen einander. Letzteres ist auch der Fall für die Halbwertzeiten an TNFR2-Fc, die für TNF ca. 8 Minuten und für CysHisTNF ca. 3 Minuten betragen. Lediglich die Affinitätskonstanten von TNF und CysHisTNF an modifizierten TNFR2 sind für CysHisTNF ca. eine Größenordnung niedriger (KD = 10 nM für CysHisTNF und KD = 1 nM für TNF) .
Diese Werte belegen die hochaffine und spezifische Bindung des CysHisTNF an beide bekannten Rezeptoren. Obwohl die Zahlenwerte mit Hilfe von oberflächengekoppelten Rezeptoren (TNFRl-Fc und TNFR2-Fc) erhalten wurden, die künstlich dimerisiert wurden, erlauben sie dennoch Rückschlüsse auf die Situation der Bindung an Rezeptoren einer Zelle, bei der durch den trimeren Liganden eine Trimerisierung der Rezeptoren erfolgt
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammmengefasst. Tabelle 4
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Claims

Ansprüche
1. Nanopartikel, umfassend einen Träger mit einer funktionelle Gruppen 1 A aufweisenden Oberfläche und zumindest einem Monomer eines Proteins der TNF- Familie (TNF: Tumor-Nekrose-Faktor), wobei dieses mindestens eine Monomer die funktionellen Gruppe 1 A bindende komplementäre funktionelle Gruppen 2 A aufweist und über die funktionellen Gruppen 2 A mit den funktionellen Gruppen 1 A des Trägers verbunden ist .
2. Nanopartikel nach Anspruch 1, wobei drei Monomere jeweils über ihre funktionellen Gruppen 2 A mit den funktionellen Gruppen 1 A des Trägers verbunden sind.
3. Nanopartikel nach Anspruch 2, wobei die drei Monomere als Trimer immobilisiert am Nanopartikel vorliegen.
4. Nanopartikel nach Anspruch 1, wobei mindestens ein weiteres Monomer eines Proteins der TNF-Familie assoziiert zu dem mit dem Träger verbundenen Monomer immobilisiert am Nanopartikel vorliegt.
5. Nanopartikel nach Anspruch 4, wobei zwei weitere Monomere eines oder mehrerer Proteine der TNF- Familie assoziiert zu dem mit dem Träger verbünde- nen Monomer immobilisiert am Nanopartikel vorliegen und dabei ein Trimer bilden.
6. Nanopartikel nach einem d Aer Ansprüche 1 bis 5, wobei die Monomere gleiche Monomere sind.
7. Nanopartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Monomere verschiedene Monomere sind.
8. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Protein der TNF-Familie TNF-α, Lymphotoxin LT-α, LT-ß, FasL, TRAIL oder CD40L ist.
9 . Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend einen Träger mit einer funktionelle Gruppen 1 A aufweisenden Oberfläche und zumindest einem an dem Träger immobilisiertem Protein der TNF-Familie mit die funktionellen Gruppen 1 A bindenden komplementären funktionellen Gruppen 2 A, wobei das Protein der TNF-Familie in Form eines Trimers immobilisiert ist.
10. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Trimer, insbesondere TNF-Trimer, durch kovalente Bindung zwischen den funktionellen Gruppen 1 A und 2 A gerichtet und unter Beibehaltung seiner biologischen Aktivität am Träger immobilisiert ist.
11. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die funktionelle Gruppe 1 A ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Carboxygruppe, Epoxygruppe, Maleinimidogruppe, Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Hydrazingruppe, Hydrazidgruppe, Thiolgruppe und Thioestergruppe.
12. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die die funktionelle Gruppe 1 A bindende, komplementäre funktionelle Gruppe 2 A ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Carboxygruppe, Epoxygruppe, Maleinimidogruppe, Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Hydrazingruppe, Hydrazidgruppe, Thiolgruppe und Thioestergruppe.
13. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Protein der TNF-Familie ein synthetisches, natürlicherweise vorkommendes oder re- kombinant hergestelltes Protein mit Wildtyp-Sequenz oder mit mutierter Sequenz ist.
14. Nanopartikel nach Anspruch 13, wobei das Protein der TNF-Familie chemisch modifiziert vorliegt.
15. Nanopartikel nach Anspruch 13 oder 14, wobei das Protein der TNF-Familie ein natürliches oder synthetisches Multimerisierungsmodul aufweist.
16. Nanopartikel nach Anspruch 15, wobei das Protein der TNF-Familie das Tenascin C- Multimerisierungsmodul aufweist.
17. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Oberfläche weitere funktionelle Gruppen 1 B und das mindestens eine Monomer des Proteins der TNF-Familie weitere die funktionellen Gruppen 1 B bindende komplementäre funktionelle Gruppen 2 B aufweist.
18. Nanopartikel nach Anspruch 17, wobei zwischen den funktionellen Gruppen 1 B und 2 B eine nicht- kovalente Bindung vorliegt.
19. Nanopartikel nach Anspruch 17 oder 18, wobei die weitere funktionelle Gruppe 1 B ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Oligohistidingruppe, Strep-Tag I, Strep-Tag II, Desthiobiotin, Biotin, Chitin, Chitinderivate, Chitinbindedomäne, Metallionenchelatkomplex, Streptavidin, Streptactin, Avi- din und Neutravidin.
20. Nanopartikel nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei die die funktionelle Gruppe 1 B bindende, komplementäre funktionelle Gruppe 2 B ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Oligohistidingruppe, Strep-Tag I, Strep-Tag II, Desthiobiotin, Biotin, Chitin, Chitinderivate, Chitinbindedomäne, Metallionenchelatkomplex, Streptavidin, Streptactin, Avidin und Neutravidin.
21. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die funktionelle Gruppe 1 A und/oder
1 B über Spacer mit der Oberfläche des Nanopartikels verbunden oder Bestandteil e^ines Spacers ist/sind.
22. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die funktionelle Gruppe 2 A und/oder
2 B über Spacer mit dem mindestens einem Monomer des Proteins der TNF-Familie verbunden oder Bestandteil eines Spacers ist/sind.
23. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die funktionelle Gruppe 2 A struktureller Bestandteil einer unnatürlichen Aminosäure des mindestens einen Monomers des Proteins der TNF- Familie ist, insbesondere einer mit einem Spacer derivatisierten Aminosäure.
24. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die funktionelle Gruppe 2 A und/oder 2 B mit einer Ankergruppe des Trägers verbunden ist/sind.
25. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Metallionenchelatkomplex ein zweiwertiges Kation als Metallkomponente enthält.
26. Nanopartikel nach Anspruch 25, wobei der Metallionenchelatkomplex ein Ni-NTA (Nickel- Nitrilotriessigsäure) -Derivat ist.
27. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Träger aus einem biologisch verträglichen Material besteht.
28. Nanopartikel nach Anspruch 27, wobei der Träger ein anorganisches Material enthält oder aus diesem besteht .
29. Nanopartikel nach Anspruch 28, wobei das anorganische Trägermaterial Silicium, Si02, SiO, ein Silikat, Al203 , Si02»Al203, Zr02, Fe03, Ag20, Zr203, Ta205, Zeolith, Ti02, Glas, Indiumzinnoxid, Hydroxy- lapatit, Au, Fe304, ZnS, CdSe, Calciumphosphat , Calciumcarbonat oder ein Gemisch davon ist.
30. Nanopartikel nach Anspruch 27, wobei der Träger ein organisches biologisch nicht-abbaubares Material enthält oder aus diesem besteh .
31. Nanopartikel nach Anspruch 30, wobei das Trägermaterial ein Polymer ist, das durch radikalische Polymerisation erzeugt wird.
A
32. Nanopartikel nach Anspruch 30, wobei das Trägermaterial Polypropylen, Polystyrol, ein Polyacry- lat oder ein Gemisch davon ist.
33. Nanopartikel nach Anspruch 27, wobei der Träger ein biologisch abbaubares Material enthält oder aus diesem besteht .
34. Nanopartikel nach Anspruch 33, wobei das Trägermaterial ein Polyester von Polymilchsäure, insbesondere Poly- (D, L-milchsäure-co-glykolsäure) ist.
35. Nanopartikel nach Anspruch 34, wobei der Polyester durch Quervernetzung zusätzlich stabilisiert ist.
36. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Träger kompakt oder hohl ist und eine Größe von 5 nm bis 500 nm aufweist.
37. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Träger zusätzliche Funktionalitäten aufweist.
38. Nanopartikel nach Anspruch 37, wobei der Träger eine Fluoreszenzmarkierung, eine UV/Vis-Markierung, eine superpara agnetische Funktion, eine ferromag- netische Funktion und/oder eine radioaktive Markierung aufweist.
39. Nanopartikel nach Anspruch 37 oder 38, wobei der Träger eine zur Therapie und/oder Diagnose geeignete chemische Verbindung aufweist.
40. Nanopartikel nach Anspruch 39, wobei die chemische Verbindung ein Cytostatikum ist.
41. Nanopartikel nach einem der Ansprüche 37 bis 40, wobei der Träger eine chemische Verbindung aufweist, die zur sterischen Stabilisierung und/oder zur Verhinderung einer Konformationsänderung von immobilisiertem Protein der TNF-Familie und/oder zur Verhinderung der Anlagerung einer weiteren biologisch aktiven Verbindung an den Träger dient .
42. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Träger weitere biologische Funktionen, insbesondere Liganden wie Peptide oder Proteine aufweist, die insbesondere gewebe- oder zellspezifisch sind.
43. Nanopartikel nach Anspruch 41 oder 42, wobei die chemische Verbindung ein Polyethylenglykol, ein Oligoethylenglykol, Dextran oder ein Gemisch davon ist .
44. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das immobilisierte Protein der TNF- Familie einen Marker aufweist.
45. Nanopartikel nach Anspruch 44, wobei der Marker ein Fluorophor, ein Spin-Label, eine radioaktive Markierung und/oder ein Goldpartikel ist, insbesondere angebracht an Aminosäuren des Proteins der TNF-Familie, vorzugsweise an dessen Seitenketten.
46. Nanopartikel nach Anspruch 45, wobei das Fluo- rophor N-Methyl-Aza-Tryptophan oder ein Coumarin- Derivat wie DCA (6 , 7-Dimethoxy-4-Coumaryl) oder NBD
(N-ß-7-nitro-benzofurazan-L-NΛ-diaminopropionsäure) ist .
47. Nanopartikel nach Anspruch 45, wobei das Fluo- rophor CyDye oder Alexa ist .
48. Verfahren zur gerichteten Immobilisierung von Proteinen der TNF-Familie an einem Nanopartikel unter Beibehaltung ihrer biologischen Aktivität, wobei die Oberfläche eines anorganischen oder organischen partikulären Trägers durch Aufbringen von funktionellen Gruppen 1 A modifiziert und komplementäre funktionelle Gruppen 2 A aufweisende modifizierte Moleküle der TNF-Familie mit dieser Oberfläche derart in Kontakt gebracht werden, dass eine kovalente Bindung zwischen den funktionellen Gruppen 1 A und 2 A dergestalt stattfindet, dass das Protein der TNF-Familie gerichtet und, unter Beibehaltung seiner biologischen Aktivität an das Nanopartikel bindet.
49. Verfahren nach Anspruch 48, wobei die funktionellen Gruppen 1 A und 2 A ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Carboxygruppe, Epoxygruppe, Maleinimidogruppe, Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Hydrazingruppe, Hydrazidgruppe, Thiolgruppe und Thioestergruppe.
50. Verfahren nach Anspruch 48 oder 49, wobei Moleküle der TNF-Familie als Homo- oder Heterotrimere immobilisiert werden.
51. Verfahren nach Anspruch 48, 49 oder 50, wobei die Bildung des Trimers spontan erfolgt.
52. Verfahren nach Anspruch 48, 49 oder 50, wobei die Bildung des Trimers durch ein im Molekül der TNF-Familie enthaltenes Multimerisierungsmodul bewirkt wird.
53. Verfahren nach Anspruch 52, wobei das Molekül der TNF-Familie das Tenascin-C- Multimerisierungsmodul enthält.
54. Verfahren nach einem der Ansprüche 48 bis 53, wobei die Oberfläche des Trägers durch Aufbringen weiterer funktionellen Gruppen 1 B modifiziert wird und die Moleküle des Proteins der TNF-Familie v/eitere komplementäre funktionelle Gruppen 1 B aufweisen, so dass bei Inkontaktbringen der Moleküle mit der Oberfläche eine nicht-kovalente Bindung zwischen den funktionellen Gruppen 1 B und 2 B stattfindet .
55. Verfahren nach Anspruch 54, wobei die funktionellen Gruppen 1 B und 2 B ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Oligohistidingruppe, Strep-Tag I, Strep-Tag II, Desthiobiotin, Biotin, Chitin, Chitinderivate, Chitinbindedomäne, Metallionenchelatkomplex, Streptavidin, Streptactin, Avidin und Neutravidin.
56. Verfahren nach einem der Ansprüche 48 bis 55, wobei die funktionellen Gruppen 1 A, 1 B, 2 A und/oder 2 B unter Verwendung eines Spacers mit dem Träger und/oder Molekül des Proteins der TNF- Familie verbunden werden oder Bestandteil des Spacers sind.
57. Verfahren nach einem der A Ansprüche 46 bis 54, wobei die Modifizierung der Oberfläche mittels Propfpolymerisation, Silanisierung oder chemischer Derivatisierung erfolgt.
58. Verfahren nach einem der Ansprüche 48 bis 57, wobei die Bedingungen, unter den die Proteine mit den Oberflächen in Kontakt gebracht werden, so ausgewählt werden, dass ein Abbau von TNF minimiert oder verhindert wird.
59. Verfahren nach einem der Ansprüche 48 bis 58, wobei zusätzliche chemische Verbindungen zur sterischen Stabilisierung und/oder zur Verhinderung einer Konformationsänderung des immobilisierten Proteins der TNF-Familie und/oder zur Verhinderung der Anlagerung einer weiteren biologisch aktiven Verbindung und/oder mit biologischer Aktivität auf die Oberfläche aufgebracht werden.
60. Verfahren nach Anspruch 59, wobei der Träger weitere biologische Funktionen, insbesondere Liganden wie Peptide oder Proteine aufweist, die insbesondere gewebe- oder zellspezifisch sind.
61. Verfahren nach einem der Ansprüche 48 bis 60, wobei die Nanopartikel nach Immobilisierung des Mo- nomeres des Proteins der TNF-Familie unter Verwendung eines Stealth-Verfahrens maskiert werden, um eine ausreichende Biozirkulation zu erreichen.
62. Verfahren nach Anspruch 61, wobei die Nanopartikel in Liposomen verpackt werden.
63. Verfahren zur Identifizi Aerung und/oder Detek- tion einer eine Interaktion zwischen immobilisierten Protein der TNF-Familie und dessen komplementärer Rezeptoren modifizierenden, insbesondere fördernden oder hemmenden Substanz, wobei an einem Nanopartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 47 immobilisiertes Protein der TNF-Familie zusammen mit seinen Rezeptoren in Gegenwart oder Abwesenheit der zu testenden Substanz inkubiert und eine Auswirkung der Substanz auf die Interaktion zwischen immobilisiertem Proteine der TNF-Familie und dessen Rezeptoren nachgewiesen wird.
64. Verwendung eines Nanopartikels nach einem der Ansprüche 1 bis 47 zur Identifizierung und/oder I- solierung eines Bindungspartners von immobilisiertem Protein der TNF-Familie.
65. Verwendung eines Nanopartikels nach einem der Ansprüche 1 bis 47 zur Identifizierung und/oder Isolierung von Hemmstoffen der Interaktion von immobilisiertem Protein der TNF-Familie mit seinen Bindungspartnern.
66. Verwendung eines Nanopartikels nach einem der Ansprüche 1 bis 47 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Therapie von Tumoren, entzündlichen Erkrankungen oder Erkrankungen des Immunsystems, zur Wundheilung oder zur Modifikation angiogenetischer Prozesse.
67. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Nanopartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 47.
68. Diagnostische Zusammense Atzung, umfassend ein
Nanopartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 47.
69. Verfahren nach einem der Ansprüche 48 bis 62, wobei die Nanopartikel mit daran immobilisiertem TNF auf einer Membran abgeschieden werden und der dabei entstehende Film durch Quervernetzung mechanisch und/oder chemisch stabilisiert wird.
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