EP1131158A1 - Mehrgefässanordnungen mit verbesserter empfindlichkeit für die optische analytik - Google Patents

Mehrgefässanordnungen mit verbesserter empfindlichkeit für die optische analytik

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Publication number
EP1131158A1
EP1131158A1 EP99956018A EP99956018A EP1131158A1 EP 1131158 A1 EP1131158 A1 EP 1131158A1 EP 99956018 A EP99956018 A EP 99956018A EP 99956018 A EP99956018 A EP 99956018A EP 1131158 A1 EP1131158 A1 EP 1131158A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
vessel
base plate
arrangement according
wall matrix
film
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP99956018A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Frank LÖSCHER
Dirk Meier
Peter Schubert
Stefan Seeger
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Molecular Machines and Industries GmbH
Original Assignee
Molecular Machines and Industries GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Molecular Machines and Industries GmbH filed Critical Molecular Machines and Industries GmbH
Publication of EP1131158A1 publication Critical patent/EP1131158A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • B01L3/5085—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites

Definitions

  • the invention relates to multi-vessel arrangements and the use of these multi-vessel arrangements.
  • Multi-vessel arrangements such as Microtiter plates have become a standard in biochemical analysis because they have the particular advantage of enabling a large number of analyzes or assays in parallel and automatically.
  • assays include, for example, ELISA tests (enzyme-linked immunosorbant assays), the determination of the concentration of chemicals, proteins and DNA, the determination of the ⁇ , ⁇ and / or ⁇ radiation in scintillation measurements, fluorescence, phosphorescence or luminescence measurements etc. a.
  • multi-vessel arrangements have also proven to be advantageous for automated analysis on cell cultures.
  • the analysis is carried out in such a way that the samples in the multi-vessel arrangements are irradiated with light from the UV / VIS wavelength range and the absorption or emission of the samples is determined by suitable detectors.
  • the sensitivity of these measurements was usually due to the optical properties of the plastics used for the manufacture of the multi-vessel arrangements. Polystyrene, limited. Therefore, efforts have recently been made to improve the optical properties of the multi-vessel arrangements by choosing suitable materials or by choosing suitable geometries of the multi-vessel arrangements.
  • the European patent application EP 0 797 088 AI discloses
  • Multi-vessel arrangements with bottoms made of plastic materials that have a particularly high UV permeability.
  • sensitivity of such multi-vessel arrangements is still inadequate for a large number of assays, in which in some cases only the smallest sample amounts down to the single molecule can be analyzed, such as, for example, in substance libraries produced by combinatorial chemistry.
  • a multi-vessel arrangement comprising a vessel wall matrix (1) with continuous depressions and one or more optically transparent base plate (s) (2) attached thereto, characterized in that the base plate (s) with a film (3) fractional groups suitable for the covalent immobilization of molecules is (are) coated.
  • FIG. 1 shows a multi-vessel arrangement according to the invention, comprising a vessel wall matrix (1) with continuous depressions and an optically transparent base plate (2) attached to it, which is coated with the film (3).
  • FIG. 2 shows a multi-vessel arrangement according to the invention, comprising a vessel wall matrix (1) with continuous depressions and a plurality of optically transparent base plates (2) attached to it, which are coated with the film (3), one base plate being present per depression of the vessel wall matrix.
  • the multi-vessel arrangements according to the invention enable independent control of the surface properties of the bottom of the multi-vessel arrangement, through which or on which the optical analysis is carried out, and the vessel wall, which is used only for storing the liquid and for which Analysis is usually not essential.
  • This control of the surface properties of the soil surface can surprisingly increase the sensitivity of optical analysis methods with multi-vessel arrangements.
  • the multi-vessel arrangement according to the invention is not limited with regard to the number of depressions and in particular comprises multi-vessel arrangements with 24 (4 * 6), 48 (6 * 8), 96 (8 * 12), 384 (16 * 24), 864 (24 * 36) or 1536 (32 * 48) wells, but is not limited to these configurations.
  • the advantages of the invention become clearer with an increasing number of depressions, since this is associated with an increasing surface-volume ratio, i.e. Surface effects become more relevant as the number of depressions increases.
  • the dimensions of the multi-vessel arrangements are preferably based on the standards of the "Society of Biomolecular Screening" (SBS), i.e. the multi-vessel arrangement is preferably, regardless of the number of depressions, 86 mm wide and 128 mm long.
  • the vessel wall matrix (1) to be used according to the invention preferably consists of a plastic material, particularly preferably of such a plastic material which has the lowest possible non-specific adsorption for the substance to be analyzed, such as. DNA or proteins.
  • Preferred materials for the vessel wall matrix include polystyrene, polycarbonate, polyethylene and / or polypropylene.
  • plastics can be used according to the invention as the vessel wall matrix, the surfaces of which are coated with substances that form a film on the vessel wall material, which reduces the adsorption of the analyte on the vessel wall matrix.
  • Suitable substances in this regard include, in particular, bovine serum albumin, fluorinated hydrocarbons, oligoethylene oxide-containing polymers such as, for example, polymers from the Pluronics substance class, and polysaccharides such as cellulose and dextran derivatives.
  • the plastic also contains the Vessel wall matrix (1) advantageously an optically non-transparent substance such as titanium dioxide or soot, in order to prevent optical crosstalk between the individual wells.
  • the side of the vessel wall matrix (1) which is connected to the base plate (s) (2) is generally planar, in particular in the case of a large number of depressions.
  • each depression or a group of depressions can also have a cutout in the size of the base plate to be attached thereto, ie in this case there is one depression per depression or used a base plate per group of wells.
  • a multi-vessel arrangement according to the invention can be preferred in terms of a further increase in sensitivity, since optical crosstalk between the individual depressions along the bottom can be prevented in this way.
  • the depressions of the vessel wall matrix used according to the invention can be round, rectangular or square. Round depressions are preferred according to the invention, since they have a smaller surface area compared to the square depressions with the same volume and therefore lead to a lower adsorption of the analyte with otherwise identical properties.
  • the optically transparent base plate (2) of the multi-vessel arrangement which can be used according to the invention advantageously has a particularly high transmission in the wavelength range at which the assay is carried out.
  • Quartz glass or borosilicate glass is particularly preferred for a large number of optical measurements, but other materials such as 4-methylpentene-1 polymer TPX from Mitsui Petrochemical Industries, Japan or polymethyl methacrylate can also be used.
  • the base plate (2) used according to the invention preferably has a small thickness, particularly preferably a thickness below 200 ⁇ m, in particular 130 to 170 ⁇ m, particularly preferably 150 ⁇ m.
  • a base plate that is as thin as possible is particularly desirable when strongly focused light or objectives with a high numerical aperture are used for the assay to be used, such as in fluorescence correlation spectroscopy.
  • Floor plates that have the lowest possible roughness are particularly preferred.
  • the dimensions of the bottom plate depend on the number of wells when using one bottom plate per well. With a 24-part arrangement, the size can be approx. 17 mm * 17 mm. If only one base plate is used for the multi-vessel arrangement according to the invention, the size of the base plate is normally 75 mm * 115 mm.
  • the film (3) used as the coating of the bottom plate (s) of the multi-vessel arrangement according to the invention with functional groups suitable for the covalent immobilization of molecules allows a targeted surface modification of the bottom surface, i.e. the surface that is relevant for the analysis. This can surprisingly increase the sensitivity of optical measurements.
  • the type of film (3) is not restricted if it has suitable functional groups and includes, for example, silane films, Langmuir-Blodgett films and hydrogel films such as dextran films.
  • the functional groups on this film are not limited and include, for example, hydroxy, amino, aldehyde and carboxy groups. Preferably these groups are protected, i.e. that a protective group must be split off before the covalent immobilization of molecules on these groups. Suitable protective groups are known to the person skilled in the art.
  • the film used according to the invention is preferably a Langmuir-Blodgett film, in particular a two or three Langmuir-Blodgett film which can be cross-linked in three dimensions, particularly preferably a Langmuir-Blodgett film based on polysaccharide, in particular cellulose.
  • the film which can be used according to the invention is advantageously photochemically crosslinkable.
  • the Langmuir-Blodgett films which can be used according to the invention have the advantage that, after immobilization of receptors, they have a high specific adsorption with low non-specific adsorption, are stable in storage and provide a topologically very defined surface.
  • the preferred polysaccharide or cellulose derivatives for the Langmuir-Blodgett film preferably have a degree of polymerization of more than 5 and are particularly preferably mixed cellulose ethers which have a) at least one hydrophobic and b) at least one substituent containing a nitrogen atom.
  • the mixed cellulose ethers have a trialkylsilyl group as substituent a and an aminoalkyl group as substituent b), the alkyl radical in particular having 1 or 2 carbon atoms in substituent a) and 2 to 8 carbon atoms in substituent b).
  • the polysaccharide derivative can also contain c) at least one further substituent which carries a photochemically, radically or thermally crosslinkable group.
  • the preferred mixed cellulose ethers are to be understood primarily as those compounds in which some of the OH groups of the basic cellulose structure on the H are replaced by organic or organosilyl groups, ie the atom directly adjacent to the 0 is a C or Si.
  • this term can also be understood to mean derivatives which additionally carry further substituents (in particular on the 0 of the OH group), for example the substituent c) is such.
  • substituent c in the concrete molecules (see Lothar Brandt in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A5, 2nd edition, keyword “Cellulose Ethers", p.
  • At least one monomolecular layer, preferably 2 to 10 monomolecular layers, of the polysaccharide derivative is applied to the bottom plate, the latter preferably being a hydrophobic substituent with alkyl, alkenyl, aryl, alkylsilyl, alkenesilyl and / or or arylsilyl residues, but also other substituents which enable transfer to surfaces using the Langmuir-Blodgett (LB) and / or Langmuir-Blodgett-Schäfer (LBS) technique.
  • LB Langmuir-Blodgett
  • LBS Langmuir-Blodgett-Schäfer
  • This layer can be applied by incubation in a solution, by a Seif Assembly (SA) process or preferably using the Langmuir-Blodgett or Langmuir-Blodgett-Schäfer technique.
  • SA Seif Assembly
  • the polysaccharide derivatives are suitable for adhering to both hydrophilic and hydrophobic surfaces. This class of substances can thus be applied and used as a surface-modifying film. _ / 8891
  • These layers are additionally stabilized when photopolymerizable or thermally polymerizable groups are incorporated into the molecule (s), e.g. Cinnamoyl groups, but also all other groups known in chemistry, since these stabilize the layer by crosslinking before, during and after the transfer.
  • the polymerizable groups can either be attached to the above-mentioned polysaccharide derivative or in the form of another molecule which is mixed with the polysaccharide derivative and applied to or in the layer.
  • the polymerization can take place within a monolayer; however, if several monolayers are present one above the other, the polymerization can also take place between molecules of the individual layers.
  • the multi-vessel arrangement according to the invention can be produced as follows.
  • the bottom plate is coated with the film, for example with the Langmuir-Blodgett film described above.
  • a preformed vessel wall matrix for example a vessel wall matrix produced by injection molding polystyrene, is first cleaned in a separate operation, for example by ultrasound treatment.
  • the vessel wall matrix is then preferably immersed in a solution containing a substance which reduces the adsorption of analytes such as protein or DNA on the wall of the vessel wall matrix, for example in bovine serum albumin.
  • the vessel wall matrix is then dried.
  • an adhesive is then applied, for example with the aid of a roller, for example a silicone rubber adhesive, an epoxy resin adhesive or an acrylate adhesive (for example Loctite).
  • a roller for example a silicone rubber adhesive, an epoxy resin adhesive or an acrylate adhesive (for example Loctite).
  • Light-activated ones are particularly preferred
  • the vessel wall matrix pretreated in this way is carefully pressed onto the base plate coated with the Langmuir-Blodgett film.
  • the adhesive can also be applied directly to the base plate using screen printing technology in a pattern which corresponds to the contact area with the vessel wall matrix.
  • the multi-vessel arrangement according to the invention is thus obtained.
  • the glued-on base plate preferably has only a minimal level difference of approximately 1 mm to the outer edge of the plastic body. This ensures that all depressions of the multi-vessel arrangement according to the invention can be measured optically from the bottom side and that there is no steric obstruction of the measuring optics by the edge of the vessel wall matrix.
  • the surface is preferably protected with a lid and / or a film.
  • the lid is preferably designed so that it is positively positioned on the top of a multi-vessel arrangement according to the invention. Furthermore, it also enables the multi-vessel arrangements to be stacked in a positively positioned manner.
  • the size of the lid is preferably about 86 mm * 128mm * 8mm.
  • Molecules that determine the surface properties depending on the type of analysis method or assay can then be covalently coupled to the bottom of a multi-vessel arrangement according to the invention for carrying out optical assays.
  • the homogeneous assays in which the multi-vessel arrangement according to the invention can be used particularly advantageously include the fluorescence correlation assays, fluorescence polarization immunosorbent assays and Förster energy transfer assays.
  • heterogeneous assays in which the multi-vessel arrangement according to the invention can be used particularly advantageously include all optical assays in which a concentration of the analyte on the bottom surface is advantageous, such as evanescence assays or assays in which to excite fluorescence with a strongly focused laser beam the surface is scanned.
  • the surface film on the base plate is derivatized with molecules. While in homogeneous assays the aim is to immobilize molecules as little adsorption of the analyte as possible in order to ensure a high mobility of the analyte on the surface, in heterogeneous assays the aim is to immobilize the analyte.
  • the film is therefore preferably modified with, for example, bovine serum albumin, substances containing 01igoethylene oxide chains, fluorinated hydrocarbons or polysaccharides such as cellulose or dextran derivatives.
  • substances are coupled to the film that are able to bind the analyte.
  • suitable substances which are able to bind the analyte for example DNA, proteins such as e.g. Antibodies or peptides.
  • the molecules can be covalently immobilized directly on the reactive groups of the surface film or after protective groups have been split off beforehand.
  • the molecules are suitable, for example, for the direct coupling of molecules existing aminoalkyl groups.
  • the aminoalkyl groups serve as nucleophilic agents and form covalent bonds with molecules carrying electrophilic groups.
  • the films have silyl groups, for example trialkyl, triaryl or trialkenylsilyl groups, the surface properties can be changed in such a way that the silyl groups are split off after coating, so that hydroxyl groups remain. This can be achieved, for example, through the action of acid. These hydroxyl groups can then serve as functional groups for covalent immobilization.
  • the assays can be carried out in a manner familiar to those skilled in the art.
  • a glass plate was coated with a layer of aminoalkyl trimethylsilyl ether cellulose (ATMSC) and then with a layer of cinnamoyl trimethylsilyl ether cellulose
  • the multi-tube arrangement was produced as in Example 1, except that the plastic frame was not incubated with 0.2 mg / ml bovine serum albumin, but with 0.1 mg / ml streptavidin.
  • the subsequent measurement was also carried out as in the example according to the invention, except that values of 1,663 events or 2,170 events were obtained.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Mehrgefässanordnungen sowie die Verwendung dieser Mehrgefässanordnungen für optische Assays. Insbesondere stellt die Erfindung eine Mehrgefässanordnung bereit, umfassend eine Gefässwandmatrix (1) mit durchgehenden Vertiefungen und eine oder mehrere daran angebrachte optisch transparente Bodenplatte(n) (2), dadurch gekennzeichnet, dass die Bodenplatte(n) mit einem Film (3) mit zur kovalenten Immobilisierung von Molekülen geeigneten funktionellen Gruppen beschichtet ist (sind). Der Film auf der Bodenplatte ist vorzugsweise ein Langmuir-Blodgett-Film, besonders bevorzugt ein Langmuir-Blodgett-Film auf Cellulose-Basis. Weiterhin stellt die Erfindung Mehrgefässanordnungen bereit, umfassend eine Gefässwandmatrix mit durchgehenden Vertiefungen und eine oder mehrere daran angebrachte optisch transparente Bodenplatte(n), die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Bodenplatte(n) mit einem Film beschichtet ist (sind), der mit Rezeptormolekülen oder Molekülen derivatisiert ist, die eine geringe unspezifische Proteinadsorption aufweisen.

Description

Mehrgefäßanordnungen mit verbesserter Empfindlichkeit für die optische Analytik
Die Erfindung betrifft Mehrgefäßanordnungen sowie die Verwendung dieser Mehrgefäßanordnungen.
Mehrgefäßanordnungen wie z.B. Mikrotiterplatten sind zu einem Standard in der biochemischen Analytik geworden, da sie insbesondere den Vorteil aufweisen, eine Vielzahl von Analysen oder Assays parallel und automatisiert zu ermöglichen. Solche Assays schließen beispielsweise ELISA- Tests (Enzyme-linked Immunosorbant Assays) , die Bestimmung der Konzentration von Chemikalien, Proteinen und DNA, die Bestimmung der α-, ß- und/oder γ-Strahlung bei Szintillationsmessungen, Fluoreszenz-, Phosphoreszenz- oder Lumineszenzmessungen etc. ein. Weiterhin haben sich Mehrgefäßanordnungen auch für die automatisierte Analyse an Zellkulturen als vorteilhaft erwiesen. Im Regelfall erfolgt die Analyse derart, daß die Proben in den Mehrgefäßanordnungen mit Licht aus dem UV/VIS- Wellenlängenbereich bestrahlt werden und die Absorption bzw. Emission der Proben durch geeignete Detektoren bestimmt wird. Die Empfindlichkeit dieser Messungen war jedoch aufgrund der optischen Eigenschaften der für die Herstellung der Mehrgefäßanordnungen verwendeten Kunststoffe, i.d.R. Polystyrol, beschränkt. Daher sind in jüngster Zeit Anstrengungen unternommen worden, die optischen Eigenschaften der Mehrgefäßanordnungen durch Wahl geeigneter Materialien bzw. durch Wahl geeigneter Geometrien der Mehrgefäßanordnungen zu verbessern. So offenbart die Europäische Patentanmeldung EP 0 797 088 AI
Mehrgefäßanordnungen mit Böden aus Kunststoffmaterialien, die eine besonders hohe UV-Durchlässigkeit aufweisen. Die Empfindlichkeit solcher Mehrgefäßanordnungen ist jedoch nach wie vor für eine Vielzahl von Assays, bei denen teilweise nur geringste Probenmengen bis hinunter zum Einzelmolekül zu analysieren sind, wie beispielsweise bei durch kombinatorische Chemie hergestellten Substanzbibliotheken, unzureichend .
Es ist daher die erfindungsgemäße Aufgabe,
Mehrgefäßanordnungen mit einer verbesserten Empfindlichkeit für optische Analyseverfahren bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine Mehrgefäßanordnung, umfassend eine Gefäßwandmatrix (1) mit durchgehenden Vertiefungen und eine oder mehrere daran angebrachte optisch transparente Bodenplatte (n) (2), dadurch gekennzeichnet, daß die Bodenplatte (n) mit einem Film (3) mit zur kovalenten Immobilisierung von Molekülen geeigneten fraktionellen Gruppen beschichtet ist (sind) .
Die Figuren 1 und 2 zeigen bevorzugte erfindungsgemäße Mehrgefäßanordnungen. Figur 1 zeigt eine erfindungsgemäße Mehrgefäßanordnung, umfassend eine Gefäßwandmatrix (1) mit durchgehenden Vertiefungen und eine daran angebrachte optisch transparente Bodenplatte (2) , die mit dem Film (3) beschichtet ist. Figur 2 zeigt eine erfindungsgemäße Mehrgefäßanordnung, umfassend eine Gefäßwandmatrix (1) mit durchgehenden Vertiefungen und mehrere daran angebrachte optisch transparente Bodenplatten (2) , die mit dem Film (3) beschichtet sind, wobei pro Vertiefung der Gefäßwandmatrix eine Bodenplatte vorliegt.
Die erfindungsgemäßen Mehrgefäßanordnungen ermöglichen im Gegensatz zu den Mehrgefäßanordnungen des Standes der Technik eine unabhängige Kontrolle der Oberflächeneigenschaften des Bodens der Mehrgef ßanordnung, durch den bzw. an dem die optische Analytik durchgeführt wird, und der Gefäßwand, die lediglich zur Aufbewahrung der Flüssigkeit dient und für die Analyse in der Regel nicht wesentlich ist. Durch diese Kontrolle der Oberflächeneigenschaften der Bodenoberfläche kann die Empfindlichkeit optischer Analyseverfahren mit Mehrgefäßanordnungen überraschend erhöht werden.
Die erfindungsgemäße Mehrgefäßanordnung ist bezüglich der Anzahl der Vertiefungen nicht beschränkt und umfaßt insbesondere Mehrgefäßanordnungen mit 24 (4*6) , 48 (6*8) , 96 (8*12), 384 (16*24), 864 (24*36) bzw. 1536 (32*48) Vertiefungen, ist jedoch nicht auf diese Konfigurationen beschränkt. Die Vorzüge der Erfindung werden jedoch mit zunehmender Anzahl an Vertiefungen deutlicher, da diese mit einem zunehmenden Oberflächen-Volumen-Verhältnis einhergeht, d.h. Oberflächeneffekte werden bei steigender Anzahl an Vertiefungen relevanter. Die Abmessungen der Mehrgefäßanordnungen orientieren sich vorzugsweise an den Standards der "Society of Biomolecular Screening" (SBS) , d.h. die Mehrgefäßanordnung ist vorzugsweise und unabhängig von der Anzahl der Vertiefungen 86 mm breit und 128 mm lang.
Die erfindungsgemäß zu verwendende Gefäßwandmatrix (1) besteht vorzugsweise aus einem Kunststoffmaterial, besonders bevorzugt aus einem solchen Kunststoffmaterial, welches eine möglichst geringe unspezifische Adsorption für die zu analysierende Substanz, wie z.B.. DNA bzw. Proteine aufweist. Bevorzugte Materialien für die Gefäßwandmatrix schliessen Polystyrol, Polycarbonat, Polyethylen und/oder Polypropylen ein. Weiterhin können als Gefäßwandmatrix Kunststoffe erfindungsgemäß verwendet werden, deren Oberflächen mit Substanzen beschichtet sind, die einen Film auf dem Gefäßwandmaterial bilden, der die Adsorption des Analyten an der Gefäßwandmatrix vermindert. Geeignete Substanzen diesbezüglich schliessen insbesondere Rinderserumalbumin, fluorierte Kohlenwasserstoffe, Oligoethylenoxid-haltige Polymere wie beispielsweise Polymere der Substanzklasse Pluronics sowie Polysaccharide wie z.B. Cellulose- und Dextran-Derivate ein. Weiterhin enthält der Kunststoff der Gefäßwandmatrix (1) vorteilhafterweise eine optisch nicht transparente Substanz wie Titandioxid oder Ruß, um so ein optisches Ubersprechen zwischen den einzelnen Vertiefungen zu verhindern. Die Seite der Gefäßwandmatrix (1) , die mit der bzw. den Bodenplatten (2) verbunden wird, ist im Regelfall planar, insbesondere bei einer großen Anzahl von Vertiefungen. Bei einer geringeren Anzahl von Vertiefungen und damit i.d.R. einer größeren Fläche einer jeden Vertiefung kann auch jede Vertiefung bzw. eine Gruppe von Vertiefungen, beispielsweise 4 oder 9 Vertiefungen, eine Aussparung in der Größe der daran anzubringenden Bodenplatte aufweisen, d.h. in diesem Fall wird pro Vertiefung bzw. pro Gruppe von Vertiefungen eine Bodenplatte verwendet. Obwohl dies bezüglich der Herstellung nicht bevorzugt ist, kann eine solche erfindungsgemäße Mehrgefäßanordnung bezüglich einer weiteren Empfindlichkeitserhöhung bevorzugt sein, da so ein optisches Ubersprechen zwischen den einzelnen Vertiefungen entlang des Boden verhindert werden kann. Die Vertiefungen der erfindungsgemäß verwendeten Gefäßwandmatrix können rund, rechteckig oder quadratisch sein. Erfindungsgemäß bevorzugt sind runde Vertiefungen, da diese bei gleichem Volumen gegenüber den quadratischen Vertiefungen eine geringere Oberfläche aufweisen und daher bei ansonsten gleichen Eigenschaften zu einer geringeren Adsorption des Analyten führen.
Die erfindungsgemäß verwendbare, optisch transparente Bodenplatte (2) der Mehrgefäßanordnung weist vorteilhafterweise in dem Wellenlängenbereich, bei der der Assay durchgeführt wird, eine besonders hohe Transmission auf. Für eine Vielzahl von optischen Messungen ist insbesondere Quarzglas oder Borosilikatglas bevorzugt, jedoch können auch weitere Materialien wie z.B. das 4-Methyl-penten- 1-Polymer TPX von Mitsui Petrochemical Industries, Japan bzw. Polymethylmethacrylat verwendet werden. Die erfindungsgemäß verwendete Bodenplatte (2) weist vorzugsweise eine geringe Dicke auf, besonders bevorzugt eine Dicke unter 200 μm, insbesondere 130 bis 170 μm, besonders bevorzugt 150 μm. Eine möglichst dünne Bodenplatte ist insbesondere dann erwünscht, wenn für den zu verwendenden Assay stark fokussiertes Licht bzw. Objektive mit einer hohen numerischen Apertur verwendet werden, wie beispielsweise bei der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie . Besonders bevorzugt sind Bodenplatten, die eine möglichst geringe Rauhigkeit aufweisen. Die Abmessungen der Bodenplatte hängen bei Verwendung einer Bodenplatte pro Vertiefung von der Anzahl der Vertiefungen ab. Bei einer 24er Anordnung kann die Größe ca. 17 mm * 17 mm betragen. Wird nur eine Bodenplatte für die erfindungsgemäße Mehrgefäßanordnung verwendet, so beträgt die Größe der Bodenplatte normalerweise 75 mm * 115 mm.
Der als Beschichtung der Bodenplatte (n) der erfindungsgemäßen Mehrgefäßanordnung verwendete Film (3) mit zur kovalenten Immobilisierung von Molekülen geeigneten funktionellen Gruppen erlaubt eine gezielte Oberflächenmodifizierung der Bodenoberfläche, d.h. der Oberfläche, die für die Analyse relevant ist . Hierdurch kann die Empfindlichkeit von optischen Messungen überraschend erhöht werden.
Die Art des Filmes (3) ist nicht beschränkt, sofern dieser geeignete funktioneile Gruppen aufweist, und umfaßt beispielsweise Silanfilme, Langmuir-Blodgett-Filme und Hydrogel-Filme wie beispielsweise Dextran-Filme .
Die funktioneilen Gruppen an diesem Film sind nicht beschränkt und schliessen beispielsweis Hydroxy-, A ino- , Aldehyd-, und Carboxy-Gruppen ein. Vorzugsweise liegen diese Gruppen geschützt vor, d.h. daß vor der kovalenten Immobilisierung von Molekülen an diese Gruppen eine Schutzgruppe abgespalten werden muß. Geeignete Schutzgruppen sind dem Fachmann bekannt.
Der erfindungsgemäß verwendete Film ist vorzugsweise ein Langmuir-Blodgett-Film, insbesondere ein zwei- oder dreidimensional vernetzbarer Langmuir-Blodgett-Film, besonders bevorzugt ein Langmuir-Blodgett-Film auf Polysaccharid- , insbesondere Cellulosebasis . Vorteilhafterweise ist der erfindungsgemäß verwendbare Film photochemisch vernetzbar. Die erfindungsgemäß verwendbaren Langmuir-Blodgett-Filme weisen den Vorteil auf, daß sie p.ach Immobilisierung von Rezeptoren eine hohe spezifische Adsorption bei geringer unspezifischer Adsorption aufweise i, lagerstabil sind und eine topologisch sehr definierte Oberfläche bereitstellen.
Die bevorzugten Polysaccharid- oder Cellulose-Derivate für den Langmuir-Blodgett-Film weisen vorzugsgwiese einen Polymerisationsgrad von mehr als 5 und sind besonders bevorzugt gemischte Celluloseether, die a) mindestens einen hydrophoben und b) mindestens einen ein Stickstoff-Atom enthaltenden Substituenten aufweisen.
In bevorzugten Ausführungsformen weisen die gemischten Celluloseether als Substituenten a) eine Trialkylsilyl- und als Substituenten b) eine Aminoalkylgruppe auf, wobei der Alkylrest insbesondere im Substituenten a) 1 oder 2 C-Atome und im Substituenten b) 2 bis 8 C-Atome hat. Zusätzlich kann das Polysaccharidderivat noch c) mindestens einen weiteren Substituenten enthalten, der eine photochemisch, radikalisch oder thermisch vernetzbare Gruppe trägt.
Unter den bevorzugten gemischten Celluloseethern sind vorwiegend solche Verbindungen zu verstehen, bei denen einzelne der OH-Gruppen des Cellulosegrundgerüstes am H durch organische oder Organosilylgruppen ersetzt sind, d.h. das direkt dem 0 benachbarte Atom ein C oder Si ist. Darüber hinaus können unter dieser Bezeichnung aber auch noch Derivate verstanden werden, die zusätzlich weitere Substituenten (insbesondere am 0 der OH-Gruppe) tragen, beispielsweise ist der Substituent c) ein solcher. In den konkreten Molekülen (siehe dazu Lothar Brandt in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A5, 2. Auflage, Stichwort "Cellulose Ethers", S. 461 ff.) muß nicht jede einzelne Moleküleinheit (Anhydroglucose-Einheit) im Celluloseethermolekül an einer oder mehreren OH-Gruppen substituert sein, sondern die Verbindungsbezeichnung bezieht sich auf die Gesamtheit der Moleküle bzw. Moleküleinheiten, stellt also eine Mittelwertbezeichnung dar; im allgemeinen sind maximal 3 OH-Gruppen pro Moleküleinheit substituierbar . Zur Herstellung bzw. zum Verhalten von die Substituenten a) oder c) (jedoch nicht b) ) enthaltenden Cellulosederivaten wird auf Frank Löscher et al . , Proc.SPIE Vol. 2928, 1996, S.209 bis 219 und auf Dieter Klemm et al . , Z. Chem. , 24. Jg. (1984), Heft 2, S. 62 in "4-Dimethylamino-pyridin- katalysierte Synthese von Celluloseestern über organlösliche Synthese von Celluloseestern über organolösliche Trimethylcellulose" verwiesen.
Zur Beschichtung der Bodenplatte wird mindestens eine monomolekulare Schicht, vorzugsweise 2 bis 10 monomolekulare Schichten des Polysaccharidderivates auf die Bodenplatte aufgebracht, wobei dieses als Substituenten a) bevorzugt einen hydrophoben Substituenten mit Alkyl-, Alkenyl-, Aryl-, Alkylsilyl-, Alkensilyl- und/oder Arylsilyl-Resten, aber auch andere Substituenten, die den Übertrag auf Oberflächen mit der Langmuir-Blodgett- (LB) und/oder Langmuir-Blodgett- Schäfer- (LBS) -Technik ermöglichen, aufweist.
Die Aufbringung dieser Schicht kann durch Inkubation in einer Lösung, durch einen Seif-Assembly- (SA) -Prozeß oder vorzugsweise mit der Langmuir-Blodgett- oder Langmuir- Blodgett-Schäfer-Technik erfolgen. Die Polysaccharidderivate sind geeignet, sowohl auf hydrophilen wie auf hydrophoben Oberflächen zu haften. Somit kann diese Substanzklasse als oberflächenmodifizierender Film aufgetragen und verwendet werden. _ / 8891
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Eine zusätzliche Stabilisierung erfahren diese Schichten, wenn photopolymerisierbare oder thermisch polymerisierbare Gruppen in das/die Molekül (e) eingebaut werden, z.B. Cinnamoylgruppen, aber auch alle anderen in der Chemie bekannten Gruppen, da diese durch die Polymerisation vor, während und nach der Übertragung die Schicht vernetzend stabilisieren.
Hierbei können die polymerisierbaren Gruppen entweder am obengenannten Polysaccharidderivat angebracht sein oder aber in Form eines weiteren Moleküls, das vermischt mit dem Polysaccharidderivat auf oder in die Schicht aufgebracht wird, vorliegen. Die Polymerisation kann innerhalb einer Monolage stattfinden; sind jedoch mehrere Monolagen übereinander vorhanden, kann die Polymerisation auch zwischen Molekülen der einzelnen Schichten stattfinden.
Die erfindungsgemäße Mehrgefäßanordnung kann wie folgt hergestellt werden.
Die Bodenplatte wird mit dem Film beschichtet, beispielsweise mit dem oben beschriebenen Langmuir-Blodgett-Film. Eine vorgeformte Gefäßwandmatrix, beispielsweise eine durch Spritzguß von Polystyrol hergestellte Gefäßwandmatrix, wird in einem getrennten Arbeitsgang zunächst gereinigt, beispielsweise durch Ultraschallbehandlung. Anschließend wird die Gefäßwandmatrix vorzugsweise in eine Lösung enthaltend eine Substanz, die die Adsorption von Analyten wie Protein bzw. DNA an der Wand der Gefäßwandmatrix herabsetzt, wie beispielsweise in das Rinderserumalbumin, getaucht. Anschließend erfolgt eine Trocknung der Gefäßwandmatrix.
An den Kanten der Gefäßwandmatrix, die die Kontaktfläche mit der aufzubringenden Bodenplatte bilden sollen, wird dann ein Kleber, beispielsweise mit Hilfe einer Rolle, angebracht, beispielsweise ein Silikonkautschukkleber, ein Epoxidharzklebstoff oder ein Acrylatkleber (z.B. Loctite) . Besonders bevorzugt sind lichtaktivierbare
Einkomponentenkleber. Die so vorbehandelte Gefäßwandmatrix wird vorsichtig auf die mit dem Langmuir-Blodgett-Film beschichtete Bodenplatte gedrückt. Alternativ kann der Kleber auch direkt auf die Bodenplatte mit Hilfe der Siebdrucktechnik in einem Muster aufgetragen werden, welches der Kontaktfläche mit der Gefäßwandmatrix entspricht. So wird die erfindungsgemäße Mehrgefäßanordnung erhalten. Die aufgeklebte Bodenplatte weist vorzugsweise nur einen minimalen Niveauunterschied von ca. 1 mm zur äußeren Kante des Kunststoffkörpers auf. Somit wird gewährleistet, daß sämtliche Vertiefungen der erfindungsgemäßen Mehrgefäßanordnung optisch von der Bodenseite vermessen werden können und es zu keiner sterischen Behinderung der Meßoptik durch den Rand der Gefäßwandmatrix kommt.
Nach erfolgter Herstellung der erfindungsgemäßen Mehrgefäßanordnung wird die Oberfläche vorzugsweise mit einem Deckel und/oder einer Folie geschützt. Der Deckel ist vorzugsweise so konstruiert, daß er auf der Oberseite einer erfindungsgemäßen Mehrgefäßanordnung zwangspositioniert ist. Desweiteren ermöglicht er auch das zwangspositionierte Stapeln der Mehrgefäßanordnungen. Die Größe des Deckels beträgt vorzugsweise etwa 86 mm*128mm*8mm. Die Verwendung einer Folie weist den Vorteil auf, daß die Oberfläche der Bodenplatte auch dann geschützt bleibt, wenn beispielsweise in eine Vertiefung mittels einer Spritze mit Nadel, die durch die Folie hindurchgestochen wird, Flüssigkeit eingegeben wird.
An den Boden einer erfindungsgemäßen Mehrgefäßanordnung können dann für die Durchführung von optischen Assays Moleküle kovalent angekoppelt werden, die abhängig von der Art des Analyseverfahrens bzw. Assays die Oberflächeneigenschaften bestimmen. Hierbei ist zwischen homogenen und heterogenen Assays zu unterscheiden, d.h. Assays, bei denen der Analyt in Lösung vorliegt, und Assays, bei denen der Analyt, wie z.B. ein Rezeptor oder Ligand, an einem an einer Oberfläche befindlichen Liganden oder Rezeptor bindet. Zu den homogenen Assays, bei denen die erfindungsgemäße Mehrgefäßanordnung besonders vorteilhaft zu verwenden ist, gehören die Fluoreszenzkorrelations-Assays, Fluoreszenzpolarisations-Immunosorbent-Assay und Förster- Energietransfer-Assays . Zu den heterogenen Assays, bei denen die erfindungsgemäße Mehrgefäßanordnung besonders vorteilhaft zu verwenden ist, gehören alle optischen Assays, bei denen eine Aufkonzentrierung des Analyten an der Bodenoberfläche vorteilhaft ist, wie z.B. Evaneszenzassays oder Assays, bei denen zur Anregung von Fluoreszenz mit einem stark fokussierten Laserstrahl die Oberfläche abgerastert wird.
Abhängig von der Art des Assays wird die Oberflächenfilm auf der Bodenplatte mit Molekülen derivatisiert . Während bei homogenen Assays durch die Immobilisierung von Molekülen auf eine möglichst geringe Adsorption des Analyten abgezielt wird, um so eine hohe Beweglichkeit des Analyten an der Oberfläche sicherzustellen, wird bei heterogenen Assays auf die Immobilisierung des Analyten abgezielt. Bei homogenen Assays wird daher der Film vorzugsweise mit beispielsweise Rinderserumalbumin, 01igoethylenoxidketten-haltigen Substanzen, fluorierten Kohlenwasserstoffen oder Polysacchariden wie Cellulose- oder Dextran-Derivaten modifiziert. Bei heterogenen Assays werden hingegen an den Film Substanzen gekoppelt, die den Analyten zu binden vermögen. Abhängig von der Art des Analyten weiß der Fachmann, wie geeignete Substanzen auszuwählen sind, die den Analyten zu binden vermögen, beispielsweise, DNA, Proteine wie z.B. Antikörper oder Peptide.
Eine kovalente Immobilisierung der Moleküle kann direkt an die reaktiven Gruppen des Oberflächenfilms oder nach vorheriger Abspaltung von Schutzgruppen erfolgen. Im Falle der oben beschriebenen Langmuir-Blodgett-Filme eignen sich beispielsweise zur direkten Ankopplung von Molekülen die vorhandenen Aminoalkylgruppen. Die Aminoalkylgruppen dienen als nukleophiles Agens und bilden kovalente Bindungen mit elektrophile Gruppen tragenden Molekülen. Andererseits können, sofern die Filme Silylgruppen, z.B. Trialkyl-, Triaryl- oder Trialkenylsilylgruppen, aufweisen, die Oberflächeneigenschaften in der Weise verändert werden, daß die Silylgruppen nach der Beschichtung abgespalten werden, so daß Hydroxygruppen verbleiben. Dies kann z.B. durch die Einwirkung von Säure erreicht werden. Diese Hydroxygruppen können dann als funktionelle Gruppen für die kovalente Immobilisierung dienen.
Nach der Immobilisierung der Moleküle können die Assays in dem Fachmann geläufiger Art und Weise durchgeführt werden.
Vergleichs ersuche
1. Beispiel 1
(a) Eine Glasplatte wurde mit einer Schicht Aminoalkyl- trimethylsilyl-ethercellulose (ATMSC) und anschließend mit einer Schicht Cinnamoyltrimethylsilyl-ethercellulose
(CTMSC) beschichtet. Bezüglich der Details des Beschichtungsverfahrens wird auf "ultrathin cellulose based layers for detection of Single antigen molecules, Advanced Materials 1998, 10, Nr. 13" verwiesen. Anschließend wurde über eine Lemieux-Oxidation Streptavidin an die Cellulose-Oberflache gekoppelt
(siehe beigefügte Publikation) .
(b) Parallel hierzu wurde ein Kunststoffrahmen, d.h. die Gefäßwandmatrix, 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit 0,2 mg/ml Rinderserum-Albumin inkubiert.
(c) Anschließend wurde der Kunststoffrahmen an die Cellulose-modifizierte Glasplatte geklebt.
(d) Zur Messung wurden dann 0,08 ml 10~10 M Biotin-CY5- Konjugat, synthetisiert an der Universität Regensburg, in die Vertiefungen der Mehrgefäßanordnung einpipettiert und hierin 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluß wurde zweimal mit Phosphatpuffer (PBS) gewaschen, und die Bindung des Biotin-CY5-Konjugats an der Oberfläche wurde fluoreszenzspektroskopisch durch konfokale Fluoreszenzspektroskopie mit einem LB8®- Counter (MMI GmbH, Heidelberg) gemessen. Es wurden 10 Linien mit je 0,5 mm und 2.000 Messpunkten pro Linie gemessen. Die Messzeit pro Punkt betrug 0,5 msec. 300 counts wurden als ein Event gewertet. Die Messung wurde zweimal durchgeführt . (e) Es wurden Werte von 43.892 Events bzw. 46.253 Events erhalten.
2. Beispiel 2
Die Mehrgefäßanordnung wurde wie in dem Beispiel 1 hergestellt, nur dass der Kunststoffrahmen nicht mit 0,2 mg/ml Rinderserum-Albumin inkubiert wurde, sondern mit 0,1 mg/ml Streptavidin. Auch die nachfolgende Messung wurde wie in dem erfindungsgemäßen Beispiel durchgeführt, nur dass Werte von 1.663 Events bzw. 2.170 Events erhalten wurden.

Claims

PATENTANSPRUCHE
1. Mehrgefäßanordnung, umfassend eine Gefäßwandmatrix (1) mit durchgehenden Vertiefungen und eine oder mehrere daran angebrachte optisch transparente Bodenplatte (n) (2), dadurch gekennzeichnet, daß ausschließlich die Bodenplatte (n) mit einem Film (3) mit zur kovalenten Immobilisierung von Molekülen geeigneten funktionellen Gruppen beschichtet ist
(sind) .
2. Mehrgefäßanordnung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gefäßwandmatrix (1) aus Kunststoff besteht .
3. Mehrgefäßanordnung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Gefäßwandmatrix
(1) aus einem lichtundurchlässigen Material besteht.
4. Mehrgefäßanordnung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Bodenplatte (n) (2) aus Quarzglas besteht (bestehen) .
5. Mehrgefäßanordnung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Film (3) ein Langmuir-Blodgett-Film ist.
6. Mehrgefäßanordnung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Langmuir-Blodgett-Film ein Langmuir- Blodgett-Film auf Cellulose-Basis ist.
7. Mehrgefäßanordnung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Bodenplatte (n) (2) mit Hilfe eines Klebers an der Gefäßwandmatrix angebracht ist (sind) .
8. Mehrgefäßanordnung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Kleber ein mit Licht härtbarer Kleber ist .
9. Mehrgefäßanordnung umfassend eine Gefäßwandmatrix mit durchgehenden Vertiefungen und eine oder mehrere daran angebrachte optisch transparente Bodenplatte (n) , die dadurch gekennzeichnet ist, daß ausschließlich die Bodenplatte (n) mit einem Film beschichtet ist (sind) , der mit Rezeptormolekülen derivatisiert ist.
10. Mehrgefäßanordnung umfassend eine Gefäßwandmatrix mit durchgehenden Vertiefungen und eine oder mehrere daran angebrachte optisch transparente Bodenplatte (n) , die dadurch gekennzeichnet ist, daß ausschließlich die Bodenplatte (n) mit einem Film beschichtet ist (sind) , der mit Molekülen derivatisiert ist, die eine geringe unspezifische Proteinadsorption aufweisen.
11. Verwendung einer Mehrgefäßanordnung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche für optische Analyseverfahren.
GEÄNDERTE ANSPRÜCHE
[beim Internationalen Büro am 3. April 2000 (03.04.00) eingegangen; ursprüngliche Ansprüche 1,5,6 und 10 geänderte; neuer Anspruch 12 hinzugefügt; alle weiteren Ansprüche unverändert (3 Seiten)]
1. Mehrgefäßanordnung, umfassend eine Gefäßwandmatrix (1) mit durchgehenden Vertiefungen und eine oder mehrere daran angebrachte optisch transparente Bodenplatte (n) (2), dadurch gekennzeichnet, dass ausschließlich die Bodenplatte (n) mit mindestens einer monomolekularen Schicht eines
Polysaccharidderivates (3) mit zur kovalenten Immobilisierung von Molekülen geeigneten funktionellen Gruppen beschichtet ist (sind) .
2. Mehrgefäßanordnung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Gefäßwandmatrix (1) aus Kunststoff besteht .
3. Mehrgefäßanordnung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Gefäßwandmatrix
(1) aus einem lichtundurchlässigen Material besteht.
4. Mehrgefäßanordnung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bodenplatte (n)
(2) aus Quarzglas besteht (bestehen) .
5. Mehrgefäßanordnung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine monomolekulare Schicht eines Polysaccharidderivates (3) durch einen Seif -Assembly-Prozess oder durch die Langmuir-Blodgett- Technik aufgebracht wurde .
6. Mehrgefäßanordnung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine monomolekulare Schicht eines Polysaccharidderivates (3) ein Langmuir-Blodgett-Film auf Cellulose-Basis ist.
7. Mehrgefäßanordnung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bodenplatte (n)
(2) mit Hilfe eines Klebers an der Gefäßwandmatrix angebracht ist (sind) .
8. Mehrgefäßanordnung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Kleber ein mit Licht härtbarer Kleber ist .
9. Mehrgef ßanordnung umfassend eine Gefäßwandmatrix mit durchgehenden Vertiefungen und eine oder mehrere daran angebrachte optisch transparente Bodenplatte (n) , die dadurch gekennzeichnet ist, dass ausschließlich die Bodenplatte (n) mit einem Film beschichtet ist (sind) , der mit Rezeptormolekülen derivatisiert ist .
10. Mehrgefäßanordnung umfassend eine Gefäßwandmatrix mit durchgehenden Vertiefungen und eine oder mehrere daran angebrachte optisch transparente Bodenplatte (n) , die dadurch gekennzeichnet ist, dass ausschließlich die Bodenplatte (n) mit einem Film beschichtet ist (sind) , der Rinderserumalbumin, Oligoethylenoxidketten-haltige Substanzen, fluorierte Kohlenwasserstoffe oder Polysaccharide umfasst .
11. Verwendung einer Mehrgefäßanordnung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche für optische Analyseverfahren.
12. Verfahren zur Herstellung einer Mehrgefäßanordnung gemäß einer der Ansprüche 1 bis 8, umfassend die folgenden Schritte : a) Aufbringen mindestens einer monomolekularen Schicht eines Polysaccharidderivates auf die Bodenplatte (n) ; b) Auftragen eines Klebers auf die Kanten der Gefäßwandmatrix, die die Kontaktfläche mit der aufzubringenden Bodenplatte bilden sollen; c) Drücken der so behandelten Gefäßwandmatrix an die beschichtete Bodenplatte (n) .
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