CN1326379A - 能提高光分析灵敏度的多容器体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多容器体及其在光分析中的应用。本发明特别涉及由带有连续穴的一个容器间隔层基体(1)和一个或多个连接到该容器间隔层基体辅助体系上的透光基板(2)构成的多容器体,其特点在于基板是用具有官能基团的膜(3)涂覆的,这种官能基团适合分子共价固定。基板上的膜最好是langmuir-Blodgett膜并且最好是纤维素基langmuir-Blodgett膜。本发明还涉及由带有连续穴的一个容器间隔层基体和一个或多个连接到该容器间隔层基体上的透光基板构成的多容器体,其特点为基板是用带有受体分子或分子表现出较低非特异性蛋白吸附作用的衍生膜涂覆的。
Description
本发明涉及多穴组合件及其应用。
由于类似微量滴定板的多穴组合件性能好,目前已成为生物化学分析中的标准器具,尤其是由于它可以使多个样品平行地自动进行分析或测定,包括如ELISA(酶联免疫测定)试验,确定化学药品、蛋白质和DNA的浓度,或者,在闪烁、荧光、磷光或发光测量等中确定α、β和/或γ辐射。另外,目前已证实多穴组合件能很好用于细胞培养自动分析中。通常,要做的分析是把多穴组合件中的样品用UV/VIS波长范围中内的光照射,用适当的探测器测定样品的光吸收或光发射。但是,这类测定的灵敏度受制造该多穴组合件所用的塑料的光特性限制,这种塑料的典型类型是聚苯乙烯塑料。正因为如此,近年来人们试图通过选择适当的多穴组合件制造材料或结构来提高这种多穴组合件的光特性。为此,EP 0797088A1公开UV光可高度透过的塑料材料制成的带有托盘的多穴组合件。在把微量样品加给单一分子进行分析的大量测试中,这种多穴组合件的灵敏度持续保持不能令人满意,例如因结合化学反应会产生物质库存现象。
因此,本发明的目的在于提供能提高光分析法灵敏度的多穴组合件。
为了达到本发明的目的,提供的多穴组合件是由带有连续穴的一个穴间隔层阵列(1)和一个或多个连接到其上的托盘(2)构成的,其特点在于托盘(2)是用带有适合分子共价固定官能基团的膜(3)涂覆的。
图1和图2表示本发明多穴组合件的最佳实施例。图1表示本发明多穴组合件是由带有连续穴的一个穴间隔层阵列(1)和一个连接到其上且涂覆有膜(3)的托盘(2)构成。图2表示本发明多穴组合件是由带有连续穴的一个穴间隔层阵列(1)和几个连接到其上且涂覆有膜(3)的托盘(2)构成,穴间隔层阵列的每个穴具有一个托盘(2)。
与现有技术中的多穴组合件不同之处在于,本发明的多穴组合件在进行光分析的过程中或在进行光分析时可以独立地控制托盘的表面特性,而穴间隔只用于保持液体,与分析无关。正是由于控制托盘表面特性的这种能力,显著提高了多穴组合件光分析结果的灵敏度。
本发明的多穴组合件中的间隔数目是没有限定的,可以为24(4*6)、48(6*8)、96(8*12)、384(16*24)、864(24*36)或者1536(32*48)个穴,但并不限定于这类结构。不过,穴的数目越大本发明的优点越明显,因为这会增加表面/体积比率,即穴的数目越大相关的表面效应越大。多穴组合件的尺寸最好按SBS(生物分子鉴定协会)的标准来确定,多穴组合件优选宽86mm、长128mm,与穴的数目无关。
本发明的穴间隔层阵列(1)是用塑料材料制备的,特别是用一种对所分析物质(如DNA或蛋白质)的非特异性吸收较低的塑料材料制成的。用于制作穴间隔层阵列的这类材料是聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯和/或聚丙烯。还可以对适用作本发明穴间隔层阵列塑料表面涂覆能在穴间隔层阵列上成膜的物质,以降低分析时在穴间隔层阵列上的吸附。特别适用于此目的的物质有牛血清清蛋白、氟化烃、低聚乙烯氧化物处理过的聚合物,如普鲁兰尼克物质类的聚合物和类似纤维素及葡聚糖衍生物类的聚多糖。另外,穴间隔层阵列(1)塑料最好含有一种类似二氧化钛或灯黑的非透光性物质以防止单个穴之间有光透过。穴间隔层阵列(1)的表面连接着托盘(2)是一种常规的式样,尤其是在穴数目较大情况下更是如此。当穴数较少时,一般每穴所针对的样量较大,从而阵列上每个穴中的样量也较大,例如,穴为4个或者9个时,可以使用托盘大小内的一个穴腔来进行分析,即这种情况下,一个托盘被用于每个穴或其阵列。尽管这不是最佳产品,但使用本发明的一个这种多穴组合件就能提高灵敏度,因为这可以阻止单个穴间沿托盘的光透过。本发明的穴间隔层阵列上的穴可以是圆型、矩型或方型,最好使用圆型穴,因为在相同体积下圆型的表面比方型的表面小,从而在分析测定中产生的吸附较小。
本发明的多穴组合件中所用的透光托盘(2)允许测定波长范围中有很大程度的光通过。大量进行光测定最好使用石英玻璃或硼硅玻璃,不过,也可以使用其它材料,如日本Mitsui石油化学工业公司生产的4-甲基-戊烯-1聚合物TPX或聚甲基丙烯酸甲酯。本发明所用托盘的厚度低于200μm,130-170μm厚较好,最好厚150μm。托盘应尽可能薄,尤其是在测定使用强聚焦光或使用带有大量缝隙的物镜的情况下更是如此,例如,在使用荧光分光镜的情况下。使用表面粗糙度低的托盘特别好。托盘的大小因穴数而定,每个穴用一个托盘。在24穴阵列中尺寸可以约为17mm*17mm。当本发明的多穴组合件只使用一个托盘时,该托盘的大小一般为75mm*115mm。
用于涂覆本发明多穴组合件中的托盘并具有适合分子共价固定官能基团的膜(3)可以是为托盘表面特制的,即该膜在表面相关分析中可以显著加强光测定灵敏度。
对用作膜(3)的性状没有限制,只要它具有适当的官能基团,这类膜包括如硅烷膜、Langmuir-Blodgett膜和水凝胶膜以及葡聚糖膜。
这种膜上的官能基团没有一定的限定,可以包括如氢氧基、氨基、醛基和羧基。这些基团可以是受到保护的,也就是说在分子的共价固定前需要进行保护基的解离。适当的保护基是本领域普通技术人员已知的。
本发明使用的膜可以是Langmuir-Blodgett膜,特别是使用一个两层或三层交联的Langmuir-Blodgett膜,最好是使用基层为多糖类或纤维素的Langmuir-Blodgett膜。有利的是,本发明使用的这种膜是光化学可交联的。本发明使用Langmuir-Blodgett膜的有利之处在于随后稳固受体,它们的特点在于使较低的非特异吸附变为高度特异吸附,这种膜在定位稳定的同时高度限定了外部表面。
把聚多糖或纤维素衍生物用于Langmuiu-Blodgett膜的好处在于它们的聚合化程度高于5,最好是纤维素醚混合物,包括a)至少一种疏水取代基和b)至少一种含有氮原子的取代基。
在最佳实施例中,这种纤维素醚混合物包括作为取代基a)的一种三烷基甲硅烷基和作为取代基b)的一种氨基烷基,特别是在取代基a)中的游离烷基上带1个或2个C原子,在取代基b)中的游离烷基上带有2至8个C原子最好。此外,多糖衍生物也可以具有c)至少又一个作为基团基体的取代基,用于光化学交联、游离交联或热交联。
最佳实施例中所用纤维素醚混合物类的化合物主要是那些纤维素基本结构中的某些OH基的H被有机基团或有机硅烷基团取代的化合物,即直接邻接O原子的是原子是C或Si。此外,这种解释也可以理解为包括另一个作为又一附加取代基基体的又一个衍生物(特别是OH基的O),例如,取代基c)就是这样一个基团。在具体分子中,(参见Lothar Brandt in Ullmann’s of Industrial Chemistry第A5卷,第二版,第461页,有关“纤维素醚”部分),在纤维素醚分子中,并不是每一个单一分子单元(葡糖酐单元)在一个或多个OH基上需要被取代,复合项不涉及全部分子或分子单元,即它代表一个平均数值项,一般指每个分子单元可取代的OH基不超过3个。至于含有取代基a)或c)(但没有b)的纤维素衍生物的产品及表现,参见1996年Frank Loscher等在Proc.SPIE第2928卷第209-219页上的文章以及Dieter Klemm等在Z.Chem.第24版(1984)第2期第62页有关“4-dimethylamino-pyridinkatalysierte Synthese von Celluloseestern über organolslicheSynthese von Celluloseestern über organolsliche trimethylcellulose”的文章。
涂覆托盘至少用聚多糖衍生物一种单分子膜,优选在托盘上使用2-10种聚多糖衍生物单分子膜,这类物质包括作为取代基a)的一种带有烷基、链烯基、芳基、烷基甲硅烷基、链烃甲硅烷基和/或芳基硅基游离基的亲水取代基,但也可以利用langmuir-Blodgett(LB)和/或langmuir-Blodgett-Schafer(LBS)体系使用其它能进行表面涂膜的取代基。
可以在一种溶液中通过温育来施加这种膜,这可以利用自身组合法(SA)或最好使用langmuir-Blodgett(LB)和/或langmuir-Blodgett-Schafer(LBS)体系。聚多糖衍生物适合于连接到亲水表面和疏水表面,因此这类物质不但能被施加而且能用作表面装饰膜。
也可以在分子中通过加入光敏聚合基团或热敏聚合基团来进一步加强这类膜的稳定,例如可以加入肉桂酰基,不过化学中已知的所有其它基团都是可以使用的,只要它们能够在转化前、转化中和转化后通过聚合交联稳定膜就行。
在本步骤中,聚合基团可以施用在前述聚多糖衍生物上,或者,以另外的分子与该聚多糖衍生物混合的形式,聚合基施加于膜上或膜中。聚合可以是在一个单层中发生,不过,在许多单层堆积的情况下,聚合也可以发生在各单层之间的分子中。
本发明的多穴组合件可以根据以下方法来制备:
用膜涂覆托盘,如用上述的langmuir-Blodgett膜。在对穴间隔层阵列预制模的分离作业中,首先清理注模用的聚苯乙烯,如用超声波法来清理。之后,把穴间隔层阵列浸入含有能使穴间隔层阵列对类似蛋白质或DA类分析物减少吸收的物质溶液中,如浸入牛血清清蛋白中,然后把穴间隔层阵列干燥。
可以利用一个辊把一种粘合剂施加到穴间隔层阵列边缘,用于形成固定托盘的接触表面,如施加硅橡胶、环氧树脂或丙烯酸酯粘合剂(如,Loctite)。
最好使用光可活化的单组分粘合剂。把预处理的穴间隔层阵列小心地压在已用8 langmuir-Blodgett膜涂覆的托盘上。或者,把粘合剂直接膜渗到托盘上相应与穴间隔层阵列接触的表面区域中。这样就制成了本发明的多穴组合件。被粘合托盘的水平面和塑料体外缘的水平面间的差异最好不要超过1mm,以确保本发明的多穴组合件所有穴能在托盘侧被识别,而对穴间隔层阵列边缘光识别没有原位妨碍。
制备好本发明的多穴组合件后,表面最好用一个盖体或薄片来保护。把该盖体设置为能正确地自动定位在本发明的多穴组合件的顶部,它还能自动正确地对多穴组合件堆积进行定位。该盖的大小大体为86mm*128mm*8mm。使用一个薄片的好处在于当用带针的注射管穿过薄片把液体加入穴内时托盘表面仍受到保护。
在进行光测定中,在本发明的多穴组合件中的托盘上分子可以进行共价偶联,根据分析方法或测定性质确定表面性状,这在相应的同源测定和异源测定中是不同的。例如,同源测定中分析在溶液中是有效的,而异源测定中类似受体或配体类的分析物是在一个表面处结合到配体或受体上的。本发明的多穴组合件非常适用的同源测定有荧光相关测定、荧光极化免疫吸附剂测定和Forster能量转移测定。本发明的多穴组合件非常适用的是所有的光测定,其好处是能把分析物聚集在托盘表面,如渐消测定或用高聚焦激光束激发荧光的测定。
根据测定的性质用分子来衍化托盘的表面膜。在同源测定中固定分子的目的是为了得到最低限度的分析物吸收,以确保表面上分析物的高度稳定;而在异源测定中目的是固定分析物。其原因于在在同源测定中膜是可以用牛血清清蛋白、含有氧化寡聚乙烯的物质、氟化烃或类似纤维素或葡聚糖衍生物的多糖来调节的,而在异源测定中物质是与能结合分析物的膜偶联的。根据分析物的性质,本领域的普通技术人员知道选择那些适合的物质来促进分析物的结合,这类分物如DNA、类似抗体或多肽的蛋白质。
可以在表面膜的反应基团上或随后相关的保护基团上直接进行分子的共价固定。如上述langmuir-Blodgett膜具有氨基烷基适用于直接与分子偶联。该氨基烷基用作亲核试剂,并与带有疏电基的分子形成共价结合。另一方面,膜上具有甲硅烷基,如三烷基甲硅烷基、三芳基甲硅烷基或三链烯基甲硅烷基,涂覆后表面性状可以变为甲硅烷基解离,以便通过酸处理使氢氧基仍然保留,这就达到了目的。这类氢氧基可以用作共价固定的官能基团。
一旦分子固定,就能利用本领域普通技术人员已知的方式或方法进行测定。
实施例
(1)实施例1
(a)给一块玻璃板涂一层氨基烷基-三甲基硅烷基-醚纤维素(ATMSC),随后再涂一层肉桂酰三甲基硅烷基-醚纤维素(CTMSC),涂覆方法的细节参见“新材料(Advanced Materials)1998,第10卷,第13期记载的:用于单一抗原分子检测的超薄纤维素基层”,然后通过Lemieux氧化作用(参见公开的附件)把抗生蛋白链菌素偶联到该纤维素表面。
(b)把一个塑料格架平行进行处理,也就是说,给穴间隔层阵列加入0.2mg/ml牛血清清蛋白在室温下温育1小时。
(c)之后,把该塑料格架粘到用纤维素处理过的玻璃板上。
(d)为了进行测定,随后把在Regensburg大学合成的0.08ml10-10M的生物素CY5共轭物用移液管加进该多穴组合件的穴中,并在室温下温育1小时。然后,用磷酸缓冲液(PBS)冲洗两次,通过共焦荧光分光镜,利用LB8计数器(MMI GmbH Heidelberg)测定生物素CY5共轭物与表面的结合,每0.5mm测定10条谱线,每条谱线测定2000个点。每个点的测定时间为0.5msec。300个计数的加权平均作为一个结果,测定进行两次。
(e)得到的两次测定结果值分别为43,892和46,253。
(2)实施例2
除了温育塑料格架是用0.1mg/ml抗生蛋白链菌素替换了0.2mg/ml牛血清清蛋白外,采用同实施例1相同的过程制备多穴组合件。随后进行的测定与本发明上述实施例的是相同的,只是所得到的结果值分别为1,663和2,170。
权利要求书
按照条约第19条的修改
1.一种多穴组合件,由带有连续穴的一个穴间隔层阵列(1)和一个或多个固定到其上的托盘(2)组成,其特征在于只给所述托盘涂覆至少是聚多糖衍生物(3)的一种单分子层,该衍生物(3)具有能共价固定分子的官能基团。
2.根据权利要求1所述的多穴组合件,其特征在于所述穴间隔层阵列(1)是由塑料制成的。
3.根据前述任一权利要求所述的多穴组合件,其特征在于所述穴间隔层阵列(1)是由非透光的材料制成的。
4.根据前述任一权利要求所述的多穴组合件,其特征在于所述托盘(2)是由石英玻璃制成的。
5.根据前述任一权利要求所述的多穴组合件,其特征在于所述的至少是聚多糖衍生物(3)的一种单分子层是通过自身组合方法或langmuir-Blodgett体系施加的。
6.根据前述任一权利要求所述的多穴组合件,其特征在于所述的至少是聚多糖衍生物(3)的一种单分子层是一种纤维素基langmuir-Blodgett膜。
7.根据前述任一权利要求所述的多穴组合件,其特征在于所述托盘(2)是利用一种粘合剂固定到所述穴间隔层阵列上的。
8.根据权利要求7所述的多穴组合件,其特征在于所述粘合剂是光固化的粘合剂。
9.一种多穴组合件,是由带有连续穴的一个穴间隔层阵列和一个或多个连接到其上的透光托盘构成,其特征在于只给所有所述的托盘涂膜,该膜是用受体分子衍生的。
10.一种多穴组合件,是由带有连续穴的一个穴间隔层阵列和一个或多个连接到其上的透光托盘构成,其特征在于只给所述的托盘涂膜,该膜含有牛血清清蛋白、带有寡聚乙烯氧化物链、氟化烃或聚多糖物质。
11.在光分析方法中使用前述的任一权利要求所述的多穴组合件。
12.一种生产权利要求1-8任一所述多穴组合件的方法,包括下列步骤:
a)给所述托盘施加至少是聚多糖衍生物的一种单分子层;
b)给所述穴间隔层阵列的边缘施加一种粘合剂形成固定所述托盘的接触表面区域;
c)把被处理的穴间隔层阵列压在所述被涂覆的托盘上。
Claims (11)
1.一种多穴组合件,由带有连续穴的一个穴间隔层阵列(1)和一个或多个固定到其上的托盘(2)组成,其特征在于所述托盘(2)的涂膜(3)用具有能共价固定分子的官能基团。
2.根据权利要求1所述的多穴组合件,其特征在于所述穴间隔层阵列(1)是由塑料制成的。
3.根据权利要求1或2所述的多穴组合件,其特征在于所述穴间隔层阵列(1)是由非透光的材料制成的。
4.根据前述任一权利要求所述的多穴组合件,其特征在于所述托盘(2)是由石英玻璃制成的。
5.根据前述任一权利要求所述的多穴组合件,其特征在于所述的膜(3)是langmuir-Blodgett膜。
6.根据权利要求5所述的多穴组合件,其特征在于所述的langmuir-Blodgett膜是纤维素基langmuir-Blodgett膜。
7.根据前述任一权利要求所述的多穴组合件,其特征在于所述托盘(2)是利用一种粘合剂固定到所述穴间隔层阵列上的。
8.根据权利要求7所述的多穴组合件,其特征在于所述粘合剂是光固化的粘合剂。
9.一种多穴组合件,是由带有连续穴的穴间隔层阵列和一个或多个连接到其上的透光托盘构成,其特征在于只给所述的托盘涂膜,该膜是用受体分子衍生的。
10.一种多穴组合件,是由带有连续穴的穴间隔层阵列和一个或多个连接到其上的透光托盘构成,其特征在于只给所有所述的托盘涂膜,该膜是用由非特异性蛋白吸附较低的受体分子衍生的。
11.在光分析方法中使用前述的任一权利要求所述的多穴组合件。
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