EP0948356B1 - Mittel zur identifizierung und therapie metastasierender tumore - Google Patents

Mittel zur identifizierung und therapie metastasierender tumore Download PDF

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EP0948356B1
EP0948356B1 EP97954419A EP97954419A EP0948356B1 EP 0948356 B1 EP0948356 B1 EP 0948356B1 EP 97954419 A EP97954419 A EP 97954419A EP 97954419 A EP97954419 A EP 97954419A EP 0948356 B1 EP0948356 B1 EP 0948356B1
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EP
European Patent Office
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antibodies
cells
antibody
identifying
tumor
Prior art date
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EP97954419A
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EP0948356A1 (de
Inventor
Jonathan Sleeman
Helmut Ponta
Peter Herrlich
Kim Untae
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Karlsruher Institut fuer Technologie KIT
Original Assignee
Forschungszentrum Karlsruhe GmbH
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a means for identifying and suppressing the growth of tumor cells.
  • EP 351313, CA121: 29448, CA 115: 69417, Medline 95085293, CA 111: 209896 disclose antigen-antibody systems in which proteins containing N-glycosidically bound saccharides are used. From these publications, it is known that poly- or monoclonal antibodies which specifically recognize and respond to certain epitopes on the tumor marker proteins and which can be labeled by radioisotopes and / or conjugated to cytocidal or cytotoxic agents are applicable to the diagnosis and therapy of metastatic tumors are.
  • Antibodies respond to specific epitopes.
  • different tumors express different markers, and on the other hand, a marker always covers only one subset.
  • a marker For tumor control in the context of multi-component therapy, therefore, several different markers are desirable.
  • This object is achieved by means comprising antibodies reactive with glycoproteins of human or animal origin containing N-glycosidically linked saccharides of blood group-specific antigen type B2, 3, 4 or A2 for use in identifying and suppressing the growth of tumor cells.
  • any variant of proteins of animal or human origin modified with the specific saccharides is contemplated.
  • antibodies is understood to mean mono- or polyvalent antibodies and poly- and monoclonal antibodies, but also those which are fragments thereof and derivatives thereof, including the F (ab ') 2, Fab' and Fab fragments, but also chimeric antibodies or hybrid antibodies having at least two antigenic or epitope binding sites, or bispecific recombinant antibodies (e.g.
  • a method of producing agglutinating monoclonal antibodies to human A erythrocytes is disclosed, for example, in DD 260515.
  • a special clone SIFIN mAK "Anti-A-1 (21III5 / E50)" is used, which has been officially deposited.
  • a cost effective method for producing a monoclonal IgM anti-A antibody is described which is used for routine blood grouping in humans leaves.
  • no concrete use of the described or similar antibodies for identifying and suppressing the growth of tumor cells is disclosed in these documents.
  • polyclonal antibodies there are a number of methods available for the production of polyclonal antibodies to epitopes.
  • various animals can be immunized in a manner known per se by injection with the glycoprotein according to the invention, or fragments thereof, and the desired polyclonal antibodies can be obtained and purified from the sera obtained by known methods.
  • Various adjuvants for enhancing the immune response to the protein administration may also be used, depending on the animal selected for immunization - for example Freund's adjuvant, mineral gels such as aluminum hydroxide, surfactants such as polyanions, peptides, oil emulsions, hemocyanins, dinitrophenol or lysolecithin ,
  • monoclonal antibodies are preferred. Particularly preferred is the antibody M - N # 1, which is from the DSMZ, German Collection of Microorganisms and cell cultures GmbH, Braunschweig deposited cell culture DSM ACC 2333 is available.
  • the monoclonal antibodies preferred for use in the invention can be obtained by any technique available for the production of antibodies via cell line culture. Such known techniques include, for example, those described by Kohler, G. & Milstein, C., 1975, loc. cit., or Taggart & Samloff, Science 219, 1228-1230, 1983, with hybridoma cells or those with human B cell hybridomas (Kozbor et al., Immunology Today 4, 72-79, 1983).
  • the antibodies can be purified by known methods, for example by immunoabsorption or immunoaffinity chromatography, by HPLC (High Performance Liquid Chromatography) or combinations thereof.
  • Antibody fragments containing the idiotype of the molecule can likewise be prepared by known methods.
  • F (ab ') 2 fragments can be obtained by pepsin digestion of the complete polyclonal or monoclonal antibody.
  • Fab 'fragments can be obtained by, for example, reducing the disulfide bridges of the subject F (ab') 2 fragment and Fab fragments can be created, for example, by treating the antibody molecules with papain and a reducing agent.
  • Any known method can be used to identify and select antibodies, fragments or derivatives thereof. For example, characterized in that they are dedektierbar after appropriate labeling when they have bound to isolated or purified antigen, or by immunoprecipitation of the purified eg via polyacrylamide gels antigen, or in that antibodies against the blood group antigens with other blood group-specific antibodies compete for binding to sugar side chains.
  • the present invention also provides the use of hybridoma cell lines for the production of the antibodies or a preparation for the use according to the invention for the preparation of an enteral, parenteral, systemic, topically and / or locally administered administration form, as well as for the preparation of an injection, infusion or Perfusion suitable dosage form and for the identification of tumor cells in vitro.
  • agents with such antibodies find use in tumor diseases in animals and humans, which include the prevention or prophylaxis, control, diagnosis or treatment thereof.
  • the use of the antibodies according to the invention is based on the surprising observation that proteins with N-glycosidically bound saccharides which belong to the blood group-specific antigens of the type B2, 3, 4 or type A2 allow the identification and treatment of different types of tumors.
  • proteins with O-glycosidically bound saccharides have proved unsuitable.
  • the clinical use of the antibodies of the invention for a variety of disorders, diseases and conditions is particularly advantageous.
  • the antibody preparation may be administered systemically, topically or locally to or into the tissue or organ concerned.
  • a systemic mode of action is desirable, for example, when different organs or organ systems are in need of treatment.
  • a local effect would be in To consider if only the local manifestations of a tumor are to be influenced.
  • the antibodies in question can be administered via any enteral or parenteral route of administration known to the person skilled in the art.
  • administration for example, the intravenous, intravascular, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, oral or intrathecal route.
  • More local administration may be, for example, subcutaneous, intracutaneous, intracardiac, intralobar, intramedullary, intrapulmonary, or in or to the tissue to be treated (connective, bone, muscle, nerve, epithelial, or bone).
  • the antibody preparations can be administered once or several times, even intermittently, per day over several days, weeks or months and in different doses.
  • an antibody preparation suitable for the abovementioned applications it is possible to use the injectable, physiologically tolerated solutions known to the person skilled in the art in sterile form.
  • the known aqueous isotonic solutions for example saline or a corresponding plasma protein solution without gamma globulin, are available.
  • the preparation may also be in the form of a lyophilizate or dry preparation, which can be reconstituted with one of the known injectable solutions immediately before use under sterile conditions, for example as kit-of-parts.
  • the final preparation of an antibody preparation for injection, infusion or perfusion to be used according to the invention is carried out by mixing antibodies purified according to known definitions according to the abovementioned definitions with one of the physiologically tolerated solutions mentioned, which may optionally be supplemented with known carriers or excipients (eg serum albumins , Dextrose, sodium bisulfite, EDTA).
  • carriers or excipients eg serum albumins , Dextrose, sodium bisulfite, EDTA.
  • the amount of antibody to be administered depends on the nature and severity of the disease or disorder to be treated or the condition to be affected and the particular patient (animal or human). However, the starting point is a dosage of 0.5-2, preferably 0.7-1.5 mg / kg of body weight of the respective antibody per dosage unit to be used.
  • NM-081 Goshetal, 1983, InVitro 19, 919-928
  • MT-450 Kim 1986, J. Surg., Opa133, 151-165
  • MTLN2 MTNL3, MTLy, MTPa, MTC
  • FCS Fetal Calf Serum
  • Tissue culture cells were harvested with PBS / 5 mM EDTA and then washed three times in PBs.
  • 10 female BalbC / B16 F1 hybrid mice previously ingested with pre-serum were injected intracutaneously with 2 x 10 6 tumor or tissue culture cells carrying no desired antigens (as tolerogens against which antibodies were produced) not interested).
  • each mouse was injected intraperitoneally with 200mg / kg cyclophosphamide.
  • the mice were again injected with the tolerogen and cyclophosphamide. Ten days after that, test bleeding was taken.
  • mice Three weeks after the last dose of Tolerogen, 2x10 6 tumor or tissue culture cells for which antibodies are to be produced were injected intracutaneously (as immunogen). The immunogen was injected twice more every 3 weeks. Ten days after the last immunization, test bleeds were taken. The test bleeds taken after the tolerogen and immunogen immunizations were compared with the respective prescers using cell ELISA's with tolerogen and immunogen as targets. This made it possible to identify those mice in which the immune response to tolerogen was maximally disrupted and in which the immune response to immunogen was maximally enhanced. These mice were used for the Production of hybridoma cells selected. Four weeks after the last test bleeding, the spleens were removed from the mice and the spleen cells were fused with SP2 / 0 myeloma cells.
  • Hybridoma cells were prepared by the method of Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory manual; Cold Spring Habor Laboratory press, manufactured. The hybrodomas were tested in cell ELISA for antibody production using the immunogen as a target. Antibodies were prepared from conditioned medium from ELISA positive hybridoma cells using Protein G agarose (Dianova) as the affinity column. Cell ELISA: Target cells were harvested by PBS / 5 mM EDTA and resuspended in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) / 10% FCS (2x106 / ml).
  • the cells were lysed with PBS / 1% NP40 / 1 mM PMSF, centrifuged and supplemented with dialyzed FCS, incubated, then washed and incubated further with methionine-containing medium.
  • cells were lysed in RIPA (radioimmunoprecipitation) buffer and aliquots were immunoprecipitated with 5 ⁇ g of antibody.
  • the antigen / antibody matrix bead complex was first washed in 100 mM phosphate buffer, pH 7.0. Buffer was removed and then the matrix beads were for 5 minutes in 5 ⁇ l 1% SDS / 20 mM phosphate, pH 7.0, boiled. The enzymes were then added in 45 ⁇ l 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) / 1 mM CaSO.
  • tumor cells were injected into rats together with antibodies (200 ⁇ g / rat). Thereafter, twice weekly for four weeks, the animals received 200 ⁇ g antibody subcutaneously at the site of tumor cell injection. on support plates with 8 recessed chambers (Nunc) used. Cells from cell suspensions were fixed to silane-coated carrier plates using a Cytospin centrifuge. In both cases, the cells fixed on the support plates were washed three times with PBS, fixed in 4% paraformaldehyde and then incubated for 30 minutes in PBS / 10% FCS (FPBS). Then, an antibody solution (in FPBS) was added and incubation continued for 2 hours. The cells were then washed three times with PBS and incubated for 1 h with Texas Red conjugated rabbit anti-mouse Ig diluted in FPBS. After two washes with PBS, the stained cells were mounted on the chamber slides.
  • oligosaccharides anchored to a solid matrix were obtained from Chembiomed Ltd. (Edmonton, Canada). The chemical structure of the oligosaccharides is shown in Table 4.
  • the mAb MN # 1 (0.2 ⁇ g in 200 ⁇ l PBS / 1 & BSA) was incubated at room temperature for one hour with 10 mg loaded (or unloaded as a control) Synsorb® beads. After incubation, supernatants were collected and tested for reactivity against blood group B salivary mucins as follows. Saliva from individuals of blood group B or blood group 0 was heated immediately after collection for 15 minutes in a boiling water bath and then centrifuged for 5 minutes at 13,000 g.
  • ELISA plates NUNC Immunoplates
  • PBS PBS, 3 BSA.
  • 100 ⁇ l of the supernatants, after absorption of MN # 1 to the SYNSORB® beads were pipetted onto the coated ELISA plates in duplicates.
  • the plates were washed with PBS and then incubated with 100 ⁇ l goat anti-mouse IgG alkaline phosphatase (Sigma, St. Louis, Mo., USA) for 1 hour at room temperature incubated.
  • bound antibodies were detected with p-nitrophenyl phosphate (Sigma).
  • mice were first immunized with the non-metastatic rat mammary carcinoma cell line NM-081 (as tolerogen). After one or two days, the mice were treated with cyclophosphamide to kill the activated immune cells. After three weeks, the injection of tolerogen and cyclophosphamide was repeated. After another three weeks, the mice were given the metastatic rat mammary carcinoma cell line MT-450 (as immunogen).
  • Spleen cells from immunized mice were used to generate hybridomas. None of the hybridomas produced antibodies that recognized the tolerogen alone with the efficacy of subtractive immunization.
  • One of the hybridomas produced an antibody (MN # 1) that specifically reacted in cell ELISAs only with the metastatic MT-450 cell line. This antibody also shows immunofluorescent staining with MT-450 cells ( Figure 1) and can be used for immunoprecipitation. However, it does not show reactivity in Western blots.
  • MT-450 cells were injected into rat mammary gland tissue followed by either MN # 1 antibody or a control isotype of the same isotype treated.
  • the M-N # 1 antibody suppressed the growth of the tumors, resulting in both the formation of tumors in fewer animals than in the control, and the fact that the tumors were significantly smaller than in the control animals.
  • the antibody also had an inhibitory effect on metastasis growth in the lymph nodes of the tumor-bearing animals.
  • the survival period of the animal treated with the M-N # 1 antibody was also significantly longer than for control animals (FIG. 2).
  • MN # 1 epitope is not obligatory for all tumors for the metastasis process.
  • MN # 1 antigen is also expressed under physiological conditions in animals.
  • Epithelia with glandular properties responded positively (Table 2).
  • Leukocytes from the spleen, thymus or lymph node macrophages from the peritoneum were negative.
  • paraffin sections were the Epithelium of the corpus and antrum region of the stomach, the pancreatic azinal cells and the basal cells of the intestinal crypts stained. Also in the bone marrow one found strong reactivity.
  • MN # 1 epitope is expressed on metastatic mammary tumors.
  • this antigen occurs on mammary tissue.
  • Normal mammary gland tissue shows no reaction with the MN # 1 antibody, even during pregnancy and lactation.
  • strong expression of the MN # 1 epitope is found two days after cessation of lactation, at the onset of breast regression, and during the recovery phase ( Figure 4).
  • a characteristic of this recovery phase is the removal of cells by apoptosis (programmed cell death). Other organs can also regress through apoptosis.
  • the tissue of the gland also shows, like normal mammary tissue, no expression of the M-N # 1 epitope.
  • M-N # 1 antigen is expressed on apoptotic tissue.
  • M-N # 1 antigen could no longer be immunoprecipitated with M-N # 1 antibodies. Since the immunoprecipitability of the M-N # 1 antigen was not destroyed after heat treatment of the MT-450 lysate, the antigen recognized by M-N # 1 is likely to be a sugar residue. This was confirmed as treatment of the MT-450 cells with tunikamycin also leads to loss of the immunoprecipitable material (Figure 6).
  • MN # 1 antibody Binding of protein to MN # 1 antibody is inhibited by increasing amounts of D-fucose and D-galactose. L-fucose has no influence on the binding (FIG. 8).
  • reaction is with the epithelium of the pylorus but not the duodenum and jejunum or erythrocytes when the individuals secrete blood group antigen (Table 3).
  • the MN # 1 antibody eventually binds in EUSA experiments on human saliva from blood group B individuals. This binding can be blocked by synthetically produced type B2,3,4 and type A2 blood group sugar, but not by type B1, A1,3,4 or H. Binding blocking is dependent on 1-2 bound fucose (Table 5) ).
  • the cell lines were performed with the CD44 specific antibodies 5G8 and 1.
  • LASML Steeman et al., Cancer Research 56 3134-3141, 1996) and with the MN # 1 antibody.
  • the staining intensity was subjectively determined on a four-part scale (-, no staining, +++, strong staining).
  • the metastatic potential corresponds to the classification made in the publication Sleeman et al., 1996, Cancer Res.56, 3134-3141. About 10% of the cells were heavily stained.
  • M-N # 1 antibodies The binding of M-N # 1 antibodies to oligosaccharides fixed to a solid matrix is described in Materials and Methods.
  • the MN # 1 antigen is part of an N-glycosidically bound sugar residue.
  • Radiolabeled cell lysates of MT-450 cells were immunoprecipitated with MN # 1 and the precipitated proteins were separated on an SDS acrylamide gel. MN # 1 precipitated proteins migrate as smears (1st lane).
  • the letters indicate the treatment of immunoprecipitates prior to gel electrophoretic separation: NGF: N-glycosidase F; OG: 0-glycosidase; N: neuraminidase.
  • Re-IP.ed means that the enzyme-treated immunoprecipitates were "re-precipitated".
  • MN # 1-T 450 cells were treated with tunikamycin for the time indicated prior to labeling with radioactive methionine and immunoprecipitated after labeling. The control is a precipitation without antibodies.
  • NGF N-glycosidase F indicates immunoprecipitated proteins treated with NGF prior to separation.
  • MT-450 cells were labeled with 14 C-methionine and the extracts were purified on a Ulex Europaeus lectin column. Bound proteins were eluted and precipitated without antibody (cont) or with MN # 1 antibodies.
  • NGF indicates N-glycosidase F treatment.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mittel zur Identifizierung und Unterdrückung des Wachstums von Tumorzellen.
  • Eine der häufigsten Krankheitsursachen ist in der westlichen Welt das Auftreten von bösartigen Tumoren. Problematisch ist heute nach wie vor die frühzeitige Erkennung der Tumore und deren nachfolgende Behandlung. In den letzten Jahren ist eine Anzahl von Markern zur Feststellung des Tumorwachstums und der Bildung von Metastasen beschrieben worden (vgl. Potter-Jordan, K. und Lippman, M., 1994, Hematol. Oncol. Clin. North Am. 8, 73 bis 100 (1994)). Einige diese Marker, z.B. erbE-2, Cathepsin D., haben sich in einer Vielzahl von Studien als gut brauchbar erwiesen. In jüngster Zeit haben Varianten des Proteins CD44 an Bedeutung gewonnen (Kaufmann et al. Lancet 345, 615 bis 619 (1995), EP 0531300, DE-OS 4134982). Aus EP 351313, CA121: 29448, CA 115: 69417, Medline 95085293, CA 111: 209896 sind schließlich Antigene-Antikörper-Systeme bekannt, bei denen Proteine, die N-glykosidisch gebundene Saccharide enthalten, Verwendung finden. Aufgrund dieser Veröffentlichungen ist bekannt, daß poly- oder monoklonale Antikörper, die spezifisch bestimmte Epitope auf den Tumormarkerproteinen erkennen und damit reagieren und die durch Radioisotope markiert und/oder mit cytocidal oder cytotoxisch wirkenden Stoffen konjugiert werden können, zur Diagnose und Therapie von metastasierenden Tumoren anwendbar sind.
  • Antikörper reagieren auf spezifische Epitope. In der Regel exprimieren verschiedene Tumoren unterschiedliche Marker, und ein Marker deckt andererseits immer nur ein Subset ab. Für eine Tumorbekämpfung im Rahmen einer Mehrkomponententherapie sind daher mehrere unterschiedliche Marker wünschenswert.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es demgemäß, ein Mittel zur Identifizierung und zur Unterdrückung des Wachstums von Tumoren zu entwickeln, das möglichst für unterschiedliche Tumore gleichermaßen einsetzbar ist.
  • Diese Aufgabe wird durch Mittel enthaltend Antikörper, die mit Glycoproteiden menschlicher oder tierischer Herkunft, enthaltend N-glycosidisch gebundene Saccharide des blutgruppenspezifischen Antigen-Typs B2, 3, 4 oder A2 reagieren, zur Verwendung bei der Identifizierung und Unterdrückung des Wachstums von Tumorzellen gelöst.
  • Für die Zwecke der Erfindung kommt jede beliebige Variante von Proteinen tierischer oder menschlicher Herkunft die mit den spezifischen Sacchariden modifiziert sind, in Betracht.
  • Unter dem Begriff Antikörper sind mono- oder polyvalente Antikörper und poly- und monoklonale Antikörper zu verstehen, aber auch solche, die Fragmente davon darstellen und Derivate davon, einschließlich der F(ab')2, Fab' und Fab Fragmente, aber auch chimäre Antikörper oder Hybridantikörper mit mindestens zwei Antigen- bzw. Epitopbindungsstellen, oder bispezifische rekombinante Antikörper (beispielsweise Quadrome, Triome), Interspecies-Hybridantikörper, Anti-idiotypische Antikörper und solche davon, die chemisch modifiziert wurden und als Derivate dieser Antikörper zu verstehen sind und die entweder über die bekannten konventionellen Verfahren der Antikörpergewinnung oder über DNA-Rekombination, via Hybridomatechniken oder Antikörper-Engineering oder synthetisch oder semisynthetisch nach an sich bekannter Weise herstellbar sind und Neutralisierung- oder Bindungseigenschaften hinsichtlich der oben beschriebenen und definierten Zuckerketten aufweisen. Aus der vielfältigen Literatur sei nur beispielhaft hingewiesen auf Arbeiten von Köhler, G. & Milstein, C., Nature 256, 495 bis497, 1975; Biocca, S. et al., Embo, J. 9, 101 bis 108, 1990; Bird, R.E. et al., Science 242, 423 bis 426, 1988; Boss, M.A. et al., Nucl. Acids Res. 12, 3791 bis3806, 1984; Boulianne, G.L. et al., Nature 312, 643 bis 646, 1984; Bukovsky, J. & Kennett, R.H., Hybridoma fi, 219 bis228, 1987; Diano, M. et al., Anal. Biochem. 166, 223 bis 229, 1987; Huston, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879 bis 5883, 1988; Jones, P.T. et al., Nature 321, 522 bis 525, 1986; Langone, J.J. & Vunakis, H.V. (Hrsg.), Methods Enzymol, 121, Academic Press, London, 1987; Morrison, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851 bis 6855, 1984; Oi, V.T. & Morrison S.L., Bio Techniques 4, 214 bis 221, 1986; Riechmann, L. et al., Nature 332, 323 bis 327, 1988; Tramontano, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 736 bis 6740, 1986; Wood, C.R. et al., Nature 314, 446 bis 449, 1985.
  • Ein Verfahren zur Herstellung von agglutinierenden, monoklonalen Antikörpern gegen humane A-Erythrozyten wird beispielsweise in DD 260515 offenbart. Dazu wird ein spezieller Klon SIFIN mAK "Anti-A-1 (21III5/E50)" eingesetzt, der offiziell hinterlegt wurde. Ebenfalls wird in der Arbeit von Voak, D. et al., Vox Sanguinis 39(3), 134-140, 1980 ein kostengünstiges Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen IgM-anti-A-Antikörpers beschrieben, der sich zur routinemäßigen Blutgruppenbestimmung am Menschen einsetzen läßt. Allerdings wird in diesen Schriften keine konkrete Verwendung der beschriebenen oder ähnlicher Antikörper zur Identifizierung und Unterdrückung des Wachstums von Tumorzellen offenbart.
  • Hinsichtlich der Herstellung von polyklonalen Antikörpern gegen Epitope stehen eine Anzahl von Verfahren zur Verfügung. Es können z.B. für diesen Zweck in an sich bekannter Weise verschiedene Tiere durch Injektion mit dem erfindungsgemäßen Glycoproteid, oder Fragmenten davon, immunisiert werden und aus den danach gewonnenen Seren die gewünschten polyklonalen Antikörper nach bekannten Methoden gewonnen und gereinigt werden. Verschiedene Adjuvantien zur Erhöhung der Immunantwort auf die Protein-Gabe können, abhängig von dem für die Immunisierung ausgewählten Tier, ebenfalls verwendet werden - beispielsweise Freund's Adjuvant, Mineralgele wie z.B. Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen wie z.B. Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Hemocyanine, Dinitrophenol oder Lysolecithin. Erfindungsgemäß bevorzugt sind monoklonale Antikörper. Besonders bevorzugt ist der Antikörper M - N#1,der aus dem bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig hinterlegten Zellkultur DSM ACC 2333 erhältlich ist.
  • Die für die erfindungsgemäße Verwendung bevorzugten monoklonalen Antikörper können durch jede beliebige Technik erhalten werden, die für die Herstellung von Antikörpern über Kultivierung von Zellinien zur Verfügung stehen. Zu derartigen bekannten Techniken zählen z.B. die von Köhler, G. & Milstein, C., 1975, loc. cit., oder Taggart & Samloff, Science 219, 1228 bis1230, 1983, beschriebenen Verfahren mit Hybridomazellen oder solche mit humanen B Zell Hybridomen (Kozbor et al., Immunology Today 4, 72 bis 79, 1983). Auch die Verwendung von Genbibliotheken aus B-Lymphozyten (Ward et al., 1989; Nature 341, 544-546) und "Kombonatorischen" Bibliotheken auf Phagenvektoren (Mc Cafferty et al., 1990, Nature 348, 552-554; Krang et al.; 1991, PNAS88,4363-4366) zählen zu diesen Verfahren
  • Die Antikörper können nach bekannten Methoden gereinigt werden, beispielsweise über Immunoabsorptions- oder Immunoaffinitätschromatographie, über HPLC (High Performance Liquid Chromatography) oder Kombinationen davon. Antikörper Fragmente, welche den Idiotyp des Moleküls enthalten, können gleichermaßen nach bekannten Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise können F(ab')2 Fragmente durch Pepsin Verdauung des vollständigen poly- oder monoklonalen Antikörpers erhalten werden. Fab' Fragmente können erhalten werden, indem beispielsweise die Disulfidbrücken des betreffenden F(ab')2 Fragments reduziert werden und Fab Fragmente können geschaffen werden beispielsweise durch Behandlung der Antikörpermoleküle mit Papain und einem Reduktionsmittel.
  • Zur Identifizierung und Selektion von Antikörpern, Fragmenten oder Derivaten davon kann jedes bekannte Verfahren verwendet werden. Beispielsweise dadurch, daß diese nach entsprechender Markierung dedektierbar sind, wenn sie an isoliertes oder gereinigtes Antigens gebunden haben oder über Immunprazipitation des z.B. über Polyacrylamidgele gereinigten Antigens, oder dadurch, daß Antikörper gegen die Blutgruppenantigene mit anderen blutgruppenspezifischen Antikörpern um das Binden an Zuckerseitenketten konkurrieren.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist aber auch die Verwendung von Hybridomzellinien zur Herstellung der Antikörper bzw. einer Präparation für die erfindungsgemäße Verwendung zur Herstellung einer enteral, parenteral, systemisch, lokal und/oder topisch zu verabreichenden Applikationsform, sowie zur Herstellung einer zur Injektion, Infusion oder Perfusion geeigneten Darreichungsform und zur Identifizierung von Tumorzellen in vitro.
  • Erfindungsgemäß finden Mittel mit derartigen Antikörpern Verwendung bei Tumorerkrankungen bei Tier und Mensch, die die Prävention oder Prophylaxe, Kontrolle, Diagnose oder Behandlung derselben umfassen.
  • Die erfindungsgemäße Verwendung der Antikörper beruht auf der überraschenden Beobachtung, daß Proteine mit N-glycosidisch gebundenen Sacchariden, die zu den blutgruppenspezifischen Antigenen des Typs B2, 3, 4 oder Typ A2 gehören,die Identifizierung und Behandlung verschiedenartiger Tumore erlaubt. Experimente haben gezeigt, daß nicht beliebige Glycoproteine zur Herstellung der Antikörper eingesetzt werden können. So haben sich Proteine mit O-glycosidisch gebundenen Sacchariden als ungeeignet erwiesen. Somit ist insbesondere der klinische Einsatz der erfindungsgemäßen Antikörper für eine Vielzahl von Störungen, Erkrankungen und Zuständen besonders vorteilhaft.
  • Abhängig von der Art und Ursache der zu behandelnden Erkrankung oder Störung oder des zu beeinflussenden Zustands in einem tierischen oder menschlichen Körper kann es wünschenswert sein, die Antikörperpräparation systemisch, lokal oder topisch an das oder in das betreffende Gewebe oder Organ zu applizieren. Eine systemische Wirkungsweise ist beispielsweise dann erwünscht, wenn unterschiedliche Organe oder Organsysteme behandlungsbedürftig sind. Demgegenüber wäre eine lokale Wirkung in Betracht zu ziehen, wenn nur die örtliche Manifestationen eines Tumors zu beeinflussen ist.
  • Die betreffenden Antikörper können über jede dem Fachmann bekannte enterale oder parenterale Applikationsroute verabreicht werden. Für die systemische Applikation bietet sich beispielsweise die intravenöse, intravaskuläre, intramuskuläre, intraarterielle, intraperitoneale, orale oder intrathecale Route an. Eine eher lokale Verabreichung kann beispielsweise subcutan, intracutan, intrakardial, intralobär, intramedullär, intrapulmonal oder in oder an das zu behandelnde Gewebe (Binde-, Knochen-, Muskel-, Nerven-, Epithel- oder Knochengewebe) erfolgen. Abhängig von der zu erzielenden Dauer und Stärke der immunsuppressiven Wirkung können die Antikörperpräparationen einmal oder mehrmals, auch intermittierend, pro Tag über mehrere Tage, Wochen oder Monate und in unterschiedlichen Dosen verabfolgt werden. Zur Herstellung einer für die genannten Applikationen geeignete Antikörperpräparation können die dem Fachmann bekannten injizierbaren, physiologisch verträglichen Lösungen in steriler Form verwendet werden. Zur Herstellung einer gebrauchsfertigen Lösung zur parenteralen Injektion oder Infusion stehen die bekannten wäßrigen isotonischen Lösungen, beispielsweise Saline oder eine entsprechende Plasmaproteinlösung ohne Gammaglobulin, zur Verfügung. Die Präparation kann aber auch in Form eines Lyophilisates bzw. Trockenpräparates vorliegen, welches mit einer der bekannten injizierbaren Lösungen unmittelbar vor dem Gebrauch unter sterilen Bedingungen rekonstituiert werden kann, z.B. als kit-of-parts. Die endgültige Herstellung einer erfindungsgemäß zu verwendenden Antikörperpräparation für die Injektion, Infusion oder Perfusion erfolgt durch Vermischen von nach bekannten Methoden gereinigten Antikörpern gemäß oben angegebener Definitionen mit einem der genannten physiologisch verträglichen Lösungen, welche gegebenenfalls supplementiert sein können mit bekannten Träger- oder Hilfsstoffen (z.B. Serumalbumine, Dextrose, Natriumbisulfit, EDTA).
  • Die Menge der zu verabreichenden Antikörper hängt ab von der Art und Schwere der zu behandelnden Krankheit oder Störung oder des zu beeinflussenden Zustands und des betreffenden Patienten (Tier oder Mensch). Auszugehen ist jedoch von einer zu verwendenden Dosierung von 0,5 - 2, vorzugsweise 0,7 - 1,5mg/kg Körpergewicht des betreffenden Antikörpers pro Dosiseinheit.
  • Im folgenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf den folgenden Versuchsbericht näher beschrieben:
    • Materialien und Methoden.
  • Zellinien: Die NM-081 (Goshetal, 1983, InVitro 19, 919-928), MT-450 (Kim 1986, J. Surg. Opa133,151-165) sowie MTLN2, MTNL3, MTLy, MTPa, MTC (Nevietal, 1982, J. Natl. Cancer Inst.68, 507-517; Lichtmer et al., 1987, Invasion Matastaxis 7, 73-82) Zellinien wurden in DME gezogen ergänzt mit 10 % FCS (Fetal Calf Serum). Die Linien RBA und MTAB wurden von der American Type Culture Collection (ATCC, Nummer CRL 1747 und CRL 1666) bezogen.
    Subtraktive Immunisierung: Gewebekulturzellen wurden mit PBS/5mM EDTA geerntet und dann dreimal in PBs gewaschen. Für jede Subtraktion wurden 10 weibliche BalbC/B16 F1 Hybridmäuse, denen zuvor Präserum entnommen worden war, mit 2×106 Tumor- oder Gewebekulturenzellen, welche keine gewünschten Antigene tragen, intracutan injiziert (als Tolerogen, gegen welches Antikörper produziert werden, an denen man nicht interessiert ist). Nach 24h und nach 48h wurden jeder Maus 200mg/kg Cyclophosphamid intra peritoneal injiziert. Drei Wochen später wurden den Mäusen entsprechend nochmals das Tolerogen und Cyclophosphamid injiziert. Zehn Tage hierauf wurden Testblutungen genommen. Drei Wochen nach der letzten Injektion von Tolerogen wurden 2x106 Tumor- oder Gewebekulturzellen, für welche Antikörper hergestellt werden sollen, intracutan injiziert (als Immunogen). Das Immunogen wurde nach jeweils 3 Wochen noch zweimal injiziert. Zehn Tage nach der letzten Immunisierung wurden Testblutungen genommen. Die nach den Tolerogen- und Immunogenimmunisierungen genommenen Testblutungen wurden zusammen mit den jeweiligen Präseren verglichen, wobei Zell-ELISA's mit Tolerogen und Immunogen als Targets eingesetzt wurden. Dadurch war es möglich, jene Mäuse zu identifizieren, in denen die Immunantwort auf Tolerogen maximal zerstört und in denen die Immunantwort auf Immunogen maximal verstärkt war. Diese Mäuse wurden für die Herstellung von Hybridomazellen ausgewählt. Vier Wochen nach der letzten Testblutung wurde den Mäusen die Milz entnommen und die Milzzellen mit SP2/0 Myelomzellen fusioniert.
  • Monoklonale Antikörper: Hybridomazellen wurden nach der Methode von Harlow und Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory manual; Cold Spring Habor Laboratory press, hergestellt. Die Hybrodome wurden in Zell-ELISA's auf Produktion von Antikörper getestet, wobei das Immunogen als Target verwendet wurde. Antikörper wurden aus konditioniertem Medium von im ELISA Test positiven Hybridomazellen hergestellt, wobei Protein G-Agarose (Dianova) als Affinitätssäule verwendet wurde. Zell-ELISA: Targetzellen wurden mittels PBS/5 mM EDTA geerntet und in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)/10% FCS resuspendiert (2x106/ml). 50 µl Antikörper Testlösung wurden jeweils in U-förmiger Vertiefung von Trägerplatten (96 Vertiefungen pro Platte) pipettiert und 50 µl Aliquots von Zellen wurden dann zugegeben. Die Mischung aus Zellen und Antikörpern wurde bei 37°C für 3h inkubiert und dann dreimal mit 200 µl Aliquots von PBS gewaschen. Primär gebundene Antikörper wurden mit Kanninchen-Antimaus Antikörpern, welche an Merretichperoxidase gekoppelt waren, inkubiert und anschließend mit ABTS (2,2' Azino-di-(3-ethyl-benzthiazolin-sulphonate(6) detektiert.
  • Immunpräzipitation: Zellen wurden durch Inkubation mit (35S)L-Methionin (500mCi/ml) 4 h in methioninfreiem RPMI-Medium, welches mit dialysiertem FCS, supplementiert war, inkubiert. Für eine pulse- chase-Analyse wurden Zellen mit (35S)L-Methionin (500mCi/ml) über 15 Minuten im methioninfreiem RPMI-Medium, ergänzt mit dialysiertem FCS, inkubiert, dann gewaschen und mit methioninhaltigem Medium weiterinkubiert. Für Immunpräzipitationen wurden Zellen in RIPA (RadioImmunPräzipitation) Puffer lysiert und Aliquots wurden mit 5µg Antikörper immunpräzipitiert. Zur Reinigung von Proteinen, die aus Ulex Europaea Lectin binden, wurden die Zellen mit PBS/1% NP40/1mM PMSF lysiert, zentrifugiert und ergänzt mit dialysiertem FCS, inkubiert, dann gewaschen und mit methioninhaltigem Medium weiterinkubiert. Für Immunpräzipitationen wurden Zellen in RIPA (RadioImmunPräzipitation) Puffer lysiert und Aliquots wurden mit 5µg Antikörper immunpräzipitiert. Zur Reinigung von Proteinen, die aus Ulex Europaea Lectin binden, wurden die Zellen mit PBS/1% NP40/1mM PMSF lysiert, zentrifugiert und die Lysate für eine Stunde bei 4°C mit Ulex Europaea Lectinkügelchen inkubiert. Die Kügelchen wurden dann dreimal mit PBS gewaschen und der überschüssige Puffer entfernt. Die Kügelchen wurden in 1% SDS/20mM Phosphat bei pH 7,0 gekocht. Ein 20facher Überschuß an RIPA-Puffer wurde sodann hinzugefügt und der Überstand wurde für die Immunupräzipation nach der Abtrennung von den Ulex Europaea Lectinkügelchen verwendet. In Experimenten, in denen immunpräzipitierte Proteine mit 0,5U N-Gycosidase F, 2,5mU O-Glycosidase oder 5mU Neuraminidase behandelt wurden, wurde der Antigen/Antikörper-Matrixkügelchenkom- plex zunächst in 100mM Phosphatpuffer, pH 7,0, gewaschen. Puffer wurde entfernt und dann wurden die Matrixkügelchen für 5 Minuten in 5µl 1%SDS/20mM Phosphat, pH 7,0, gekocht. Die Enzyme wurden dann in 45µl 20mM Phosphatpuffer (pH 7,0)/1mM CaSO4 zugegeben. Die Effektivität der Enzymumsetzung wurde bestätigt durch Vergleich mit ähnlichen Verdauungsprozessen an immunopräzipitiertem CD44v4-v7 Protein, welches von jedem der genannten Enzyme verdaut wird. Immunopräzipitierte Proteine wurden mittels SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)-PAGE (Polyacrylamid-Gelelektrophorese) abgetrennt. Gele wurden mit PPO (2,5 Diphenyloxazol) behandelt, und röntgensensitivem Filmmaterial ausgesetzt.
    Metastasentests: Weiblichen w/Fu Ratten wurden subcutan 5x105 MT-450 Zellen in PBS injiziert. Die Tiere wurden regelmäßig überwacht bis die Größe ihrer Tumore gesetzliche Grenzen erreicht hatte oder die Ratten moribund wurden. Dann wurden die Tiere getötet und Autopsien vorgenommen. In Therapieexperimenten mit Antikörpern wurden Tumorzellen zusammen mit Antikörpern (200µg/Ratte) in Ratten injiziert. Danach erhielten die Tiere zweimal wöchentlich über vier Wochen 200µg Antikörper subcutan an der Stelle der Tumorzelleninjektion. auf Trägerplatten mit 8 vertieften Kammern (Nunc) herangezogen. Zellen aus Zellsuspensionen wurden an silanbeschichteten Trägerplatten fixiert mittels einer Cytospin Zentrifuge. In beiden Fällen wurden die auf den Trägerplatten fixierten Zellen dreimal mit PBS gewaschen, in 4% Paraformaldehyd fixiert und dann für 30 Minuten in PBS/10%FCS (FPBS) inkubiert. Darauf wurde eine Antikörperlösung (in FPBS) zugegeben und die Inkubation für 2h fortgesetzt. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und 1h mit Texas Red konjungierten Kanninchen Anti-Maus Ig, verdünnt in FPBS, inkubiert. Nach zwei Waschvorgängen mit PBS wurden die gefärbten Zellen auf den Chamber slides montiert.
    • Bindung an synthetische Oligosaccharide
  • Blutgruppenspezifische Oligosaccharide, die an einer festen Matrix verankert sind (SYNSORB®), wurden von Chembiomed Ltd. (Edmonton, Canada) bezogen. Die chemische Struktur der Oligosaccharide ist in Tabelle 4 dargestellt. Der mAb M-N#1 (0,2 µg in 200 µl PBS/1& BSA) wurde bei Raumtemperatur eine Stunde mit 10 mg beladenen (oder unbeladenen als Kontrolle) SYNSORB®-Kügelchen inkubiert. Nach Inkubation wurden die Überstände gesammelt und auf Reaktivität gegen Speichelmucine der Blutgruppe B wie folgt getestet. Speichel von Individuen der Blutgruppe B oder Blutgruppe 0 wurde unmittelbar nach Sammlung für 15 Minuten im kochenden Wasserbad erhitzt und anschließend 5 Minuten bei 13.000 g zentrifugiert. Der klare Überstand wurde 1:80 mit 0,1 M Karbonatpuffer pH 9 verdünnt. Mit dieser Verdünnung wurden ELISA Platten (NUNC Immunoplates) 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschung der Platten mit PBS wurden diese mit PBS, 3 BSA inkubiert. Je, 100 µl der Überstände, nach Absorption von M-N#1 an die SYNSORB®-Kügelchen wurden in Duplikaten auf die beschichteten ELISA-Platten pipettiert. Nach Inkubation über Nacht bei 0°C wurden die Platten mit PBS gewaschen und anschließend mit 100 µl Ziegen gegen Maus IgG, die alkalische Phosphatase gebunden haben (Sigma, St. Louis, MO, USA), für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschung mit PBS wurden gebundene Antikörper mit p-Nitrophenylphosphat (Sigma) nachgewiesen.
    • Ergebnisse und Diskussion
  • Es ist gelungen, durch subtraktive Immunisierung monoklonale Antikörper herzustellen, welche spezifisch mit Epitopen auf metastasierenden Tumoren von Mammakarzinomzellinien von Ratten reagieren. Mäuse wurden zunächst mit der nicht-metastasierenden Ratten-Mammakarzinomzellinie NM-081 (als Tolerogen) immunisiert. Nach einem bzw. zwei Tagen wurden die Mäuse mit Cyclophosphamid behandelt, um die aktivierten Immunzellen abzutöten. Nach drei Wochen wurde die Injektion von Tolerogen und Cyclophosphamid wiederholt. Nach weiteren drei Wochen wurde den Mäusen die metastasierende Ratten-Mammakarzinomzellinie MT-450 (als Immunogen) appliziert. Die Effektivität der Immunisierung und der Cyclophosphamidbehandlung wurde durch Zell-ELISAs mit Seren, die jeweils vor oder nach Behandlung mit Tolerogen, Cyclophosphamid bzw. Immunogen entnommen wurden, getestet, wobei NM-081 Zellen oder MT-450 Zellen als Targets verwendet wurden. Kein Serum zeigte eine Immunreaktion gegenüber dem Tolerogen 10 Tage nach der zweiten Immunisierung und Cyklophosphamidbehandlung, demonstrierend die Effektivität der Cyclophosphamidbehandlung. Alle diese Seren zeigten aber eine verstärkte Reaktivität gegenüber dem Immunogen.
  • Milzzellen von immunisierten Mäusen wurden zur Generierung von Hybridomen verwendet. Keines der Hybridome produzierte Antikörper, welche das Tolerogen alleine erkannten mit der Wirksamkeit der subtraktiven Immunisierung.
    Eines der Hybridome produzierte einen Antikörper (M-N#1), der in Zell ELISAs spezifisch nur mit der metastasierenden MT-450 Zellinie reagierte. Dieser Antikörper zeigt auch Immunfluoreszenzanfärbung mit MT-450 Zellen (Fig. 1) und kann für Immunpräzipation verwendet werden.. Er zeigt allerdings keine Reaktivität in Westernblots.
  • Um zu prüfen, ob der Antikörper nicht nur ein metastasenspezifisch exprimiertes Epitop erkennt, sondern im Stande ist, Tumormetastasierung zu unterbinden, wurden MT-450 Zellen in Brustdrüsengewebe von Ratten injiziert und nachfolgend entweder mit dem M-N#1-Antikörper oder mit einem Kontrollantikörper gleichen Isotyps behandelt. Der M-N#1Antikörper unterdrückte das Wachstum der Tumore, was zum einen dazu führte, daß sich in weniger Tieren als in der Kontrolle Tumore ausbildeten, zum anderen die angewachsenen Tumore deutlich kleiner als in den Kontrolltieren waren. Weiterhin hatte der Antikörper auch hemmende Wirkung auf Metastasenwachstum in den Lymphknoten der tumortragenden Tiere. Auch die Überlebensperiode der mit dem M-N#1-Antikörper behandelten Tier war deutlich länger als für Kontrolltiere (Fig. 2).
  • Zur Prüfung der Spezifität des M-N#1-Antikörpers wurden verschiedene Mammatumorzellinien in Gewebekultur und Tumore der MT-W9 Mammatumorserie, von der es Linien mit unterschiedlichem Metastasierungspotential gibt, in Gewwebeschnitten immunhistologisch mit M-N#1-Antikörper angefärbt (Fig. 3). Von den Tumoren der MT-W9 Serie reagierten die Antikörper mit den metastasierenden MT-450 und MT-449, nicht aber mit den nicht-metastasierenden MT-W9A und MT-W9B. Von den Zellen in Kultur reagierten keine der Linien mit geringem Metastasierungspotential (Tabelle 1). Von den metastasierenden Mammakaninomzellinien reagierten einige mit dem Antikörper, einige allerdings nicht. Dies bedeutet, daß die Expression des M-N#1-Epitopes nicht für alle Tumore obligatorisch für den Metastasierungsprozeß ist.
    Um zu ermitteln, ob das M-N#1-Antigen auch unter physiologischen Bedingungen in Tieren exprimiert wird, wurden eine Reihe von Rattengeweben auf Reaktivität mit dem M-N#1-Antikörper untersucht. Positiv reagierten Epithelien mit Drüseneigenschaften (Tabelle 2). Leukozyten aus der Milz, dem Thymus oder von Lymphknoten Makrophagen aus dem Peritoneum waren negativ. In Paraffinschnitten wurden das Epithel der Korpus- und Antrumregion des Magens, die azinalen Zellen des Pankreas und die basalen Zellen der Darmkrypten angefärbt. Auch im Knochenmark fand man starke Reaktivität. Eine Ursache, warum das M-N#1-Epitop auf metastasierenden Brustdrüsentumoren exprimiert ist, könnte sein, daß auch unter normalen physiologischen Bedingungen dieses Antigen auf Brustdrüsengewebe vorkommt. Normales Brustdrüsengewebe zeigt keine Reaktion mit dem M-N#1-Antikörper, auch nicht während Schwangerschaft und Laktation. Interessanterweise findet man starke Expression des M-N#1Epitops zwei Tage nach Ende der Laktation, zu Beginn der Rückbildung der Mamma und während der Rückbildungsphase (Fig. 4).
  • Ein Charakteristikum dieser Rückbildungsphase ist die Entfernung von Zellen durch Apoptose (programmierter Zelltod). Auch andere Organe können sich durch Apoptose rückbilden. Dazu gehört die Vorstehdrüse nach Kastration. Auch das Gewebe der Vorstehdrüse zeigt, wie normales Brustdrüsengewebe, keine Expression des M-N#1-Epitops. Bereits zwei Tage nach Kastration, mit Beginn der Rückbildung der Drüse, findet man starke Expression von M-N#1-Antigen und diese Expression wird während der Regressionsperiode aufrechterhalten (Fig. 5). Diese Daten suggerieren, daß das M-N#1-Antigen auf apoptotischem Gewebe exprimiert wird.
  • Zur Identifizierung des Antigens, welches mit dem M-N#1-Antikörper interagiert, wurde reaktives Material aus einem Zellysat mit M-N#1 Antikörper immunpräzipitiert und anschließend das präzipitierte Material gelelektrophoretisch aufgetrennt. Das präzipierte Material trennte sich nicht in diskrete Banden auf, sondern war als "Schmier" sichtbar, suggerierend, daß es sich um post-translational modifiziertes Material handeln könnte. Das immunpräzipitierte Material wurde daher der Behandlung mit verschiedenen Glykosidasen unterzogen. Nur die Behandlung mit N-GlykosidaseF hatte Effekt und führte zu einer Reduktion des "Schmiers" auf zwei Banden mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 49/51 kD (Fig. 6). Chondroitinsulfat und Heparansulfat-Modifikationen wurden ausgeschlossen.
  • Interessanterweise konnte M-N#1-Antigen nach Behandlung mit N-GlykosidaseF Behandlung nicht mehr mit M-N#1-Antikörpern immunpräzipitiert werden. Da nach Hitzebehandlung des MT-450 Lysates die Immunpräzipitierbarkeit des M-N#1-Antigens nicht zerstörte wurde, ist das von M-N#1 erkannte Antigen wahrscheinlich ein Zuckerrest. Dies wurde bestätigt, indem auch Behandlung der MT-450 Zellen mit Tunikamycin zu Verlust des immunpräzipitierbaren Materials führt (Fig. 6).
  • Durch Markierung von MT-450 Zellen mit radioaktiver Fucose wurde gezeigt, daß der von dem M-N#1-Antikörper erkannte, N-glykosidisch gebundene Zucker, fucosiliert ist: i). Aus Lysaten von fucosemarkierten Zellen präzipitierte der Antikörper Proteine mit ähnlichem Molekulargewicht wie aus 35S-markierten Zellen (Fig. 7). ii) Behandlung der immunpräzipizierten Proteine mit N-GlykosidaseF führt zur Abspaltung der Fucose (Fig. 7). iii)Reinigung von fucosilierten Proteinen mit Ulex Europaea Lectin und anschließende Immunpräzipitation mit M-N#1-Antikörper identifizierte Proteine mit ähnlichem Molekulargewicht wie nach 35S-Markierung (Fig. 7). iv) Die Bindung von Protein an M-N#1-Antikörper wird durch steigende Mengen von D-Fucose und D-Galaktose gehemmt. L-Fucose hat keinen Einfluß auf die Bindung (Fig. 8). v) Die Reaktivität des M-N#1-Antikörpers mit menschlichen Erythrozyten und vaskulärem Endothel ist abhängig vom Blutgruppenstatus. Man findet Reaktivität mit Erythrozyten von B und AB Individuen (nicht gezeigt) und mit Epithel des Pylorus und Duodenum von B Individuen, wenn sie Blutgruppenantigen sezernieren. Von A Individuen findet man Reaktion mit Epithel des Pylorus, nicht aber des Duodenums und Jejunum oder Erythrozyten, wenn die Individuen Blutgruppenantigen sezernieren (Tabelle 3). vi) Der M-N#1-Antikörper bindet schließlich in EUSA-Experimenten an menschlichen Speichel von Blutgruppe B Individuen. Diese Bindung kann durch synthetisch hergestelltem Blutgruppenzucker des Typs B2,3,4 und des Typs A2 blockiert werden, nicht aber durch Typ B1, A1,3,4 oder H. Die Blockierung der Bindung ist von 1-2 gebundener Fucose abhängig (Tabelle 5). Tabelle 1 Immunfluoreszenzfärbung von Mammakarzinomzellen aus Ratten
    Zellinien Metastasierungspotential 5G8 1.1ASML M-N#1
    MTLN2 ++ +++ +++ -
    MTLN3 +++ ++ ++ -
    MTC + +++ +(+) -
    MTLy +++ ++ ++ ++*
    MTPA + ++ (+) -
    RBA +++ ++ +(+) -
    MAT B +++ +++ +++ ++*
    • Immunfluoreszenzfärbung
  • Die Zellinien wurden mit den CD44 spezifischen Antikörpern 5G8 und 1. LASML (Sleeman et al., Cancer Research 56 3134-3141, 1996) und mit dem M-N#1 Antikörper durchgeführt. Die Färbungsintensität wurde subjektiv auf einer vierteiligen Skala (-, keine Färbung, +++, starke Färbung) bestimmt. Das Metastasierungspotential entspricht der Einteilung, wie sie in der Publikation Sleeman et al., 1996, Cancer Res.56, 3134-3141 vorgenommen wurde. etwa 10% der Zellen waren stark gefärbt. Tabelle 2 Immunhistologische Färbung von Normalgeweben
    Gewebe M-N#1Färbung
    MT.450 Tumor +++
    Gehirn -
    Niere -
    Muskel -
    Haut -
    Herz -
    Lunge -
    Leber -
    Lymphknoten -
    Thymus -
    Milz -
    Testis -
    Ovar -
    Zervix (+)
    E12,5Embryo -
    Pankreas +++
    Gastrointestinal Trakt: Zunge -
    Gastrointestinal Trakt: Oesophagus -
    Gastrointestinal Trakt: Magen-Mageneingang -
    Gastrointestinal Trakt: Magen-Hauptmagen +++
    Gastrointestinal Trakt: Magen Magenausgang +++
    Gastrointestinal Trakt Duodenum (+)
    Gastrointestinal Trakt: Ileum +
    Gastrointestinal Trakt: Blindarm -
    Gastrointestinal Trakt: Dickdarm +
    Mamma Fettgewebe -
    Gastrointestinal Trakt Duodenum (+)
    Gastrointestinal Trakt: Ileum +
    Gastrointestinal Trakt: Blindarm -
    Gastrointestinal Trakt: Dickdarm +
    Mamma Fettgewebe -
    Speichekdrüre +
    Rückenrnark(Oberschenkelknochen) +++
  • Paraffinschnitte wurden mit M-N#1 Antikörpern immunhistochemisch gefärbt (Material und Methoden) und subjektiv nach einer vierstufigen Skala (siehe Tabelle 1) ausgewertet. Tabelle 3 Immunperoxidasefärbung mit M-N#1 Antikörpern der Gastrodudenums von Individuen die für den Blutgruppenstatus ABO sezernierend oder nicht sezernierend phänotypisiert wurden
    Phänotyp der Spender Pylorus Duodenum
    Oberflächenepithel Drüse Oberflächenepithel Brünner's Drüse
    A nichtsezernierend - - - -
    B nichtsezernierend +++a -/+++b - ++/-
    0 nichtsezernierend - - - -
    A sezernierend +++/-c - - . -
    B sezernieren ++++ ++++/- +++/- ++++
    0 sezernierend - - - -
    c. starke Färbung der überwiegenden Mehrzahl von Zellen.
    Tabelle 4 Struktur von ABH verwandten Oligosacchariden, die in Bindungsstudien verwendet wurden
    Name Chemische Struktur
    B Disaccharid Gala1-3Galβ1-R
    B Trisaccharid Gala1-3(Fucal-2)Gaβ1-R
    B Typ 1 Gala1-3(Fucal1-2)Galβ1-3 GcNAcβ1-R
    B Typ 2 Gala1-3(Fucal1-2)Galβ1-4 GlcNAcβ1-R
    B Typ 3 Gala1-3(Fucal1-2)Galβ1-3 GlcNAca1-R
    B Typ 4 Gala1-3(Fucal1-2)Galβ1-3 GlcNAcβ1-R
    B linear Gala1-3Galβ1-4 GlcNAcβ1-R
    Trisaccharid
    A Typ 1 GalNAca1-3(Fucal-2)Galβ1-3GlcNAc1-R
    A Typ 2 GalNAca1-3(Fucal-2)Galβ1-4GlcNAcβ1-R
    A Typ 3 GalNAca1-3(Fucal-2)Galβ1-3GalNAca1-R
    A Typ 4 GalNAca1-3(Fucal-2)Galβ1-3GalNAcβ1-R
    A Leb GalNAca1-3(Fucal-2)Galβ1-3(Fucal-4)GlcNacβ1-R
    A Ley GalNAca1-3(Fucal-2)Galβ1-4(Fucal-3)GlcNacβ1-R
    H Typ 1 Fucal-2Galβ1-3GlcNAcβ1-R
    H Typ 2 Fucal-2Galβ1-4GlcNAcβ1-R
    H Typ 3 Fucal-2Galβ1-3GlcNAca1-R
    H Typ 4 Fucal-2Galβ1-3GlcNAcβ1-R
    R=(CH2)8-CO-NH-Chromosorb
    Tabelle 5 Bindung von M-N#1 an festgekoppelte Oligosaccharide
    Antigen %Adsorption
    B tri 93
    B Typ 1 0
    B Typ 2 97
    B Typ 3 97
    B Typ 4 98
    B Typ 5 68
    Kontrolle 0
  • Die Bindung von M-N#1 Antikörpern an Oligosacchariden, die an einer festen Matrix fixiert sind, ist in Material und Methoden beschrieben.
    • Legenden zu den Abbildungen Abbildung 1
  • Immunfluoreszenzfärbung von NM-081 und MT-450 Zellen mit dem M-N#1-Antikörper. Nur die MT-450 Zellen werden durch den Antikörper angefärbt (rote Immunfluoreszenz).
    • Abbildung 2
  • Wirkung des M-N#1-Antikörpers auf Tumorwachstum und Überleben von tumortragenden Ratten.
    Tumorwachstum in A. (Volumen des primären Tumors) und Überleben in B. von Wistar Furth Ratten, die subkutan mit 5x105 MT-450 Zellen injiziert wurden und danach mit je 200 µg Kontrollantikörper (IB7) oder M-N#1 zweimal pro Woche behandelt wurden, ist dargestellt.
    • Abbildung 3
  • Immunhistochemische Färbung von Paraffinschnitten von Tumoren der MT Serie mit den M-N#1-Antikörpern
    • Abbildung 4
  • Immunhistochemische Färbung von Paraffinschnitten von Mammageweben weiblicher BDX-Ratten nach Laktationsende mit den M-N#I-Antikörpern. Zum Zeitpunkt 0 wurden die Jungen der Ratten entfernt.
    • Abbildung 5
  • Immunhistochemische Färbung von Paraffinschnitten von Prostatagewebe der Ratte mit dem M-N#1-Antikörper. Männliche BDX Ratten wurden zum Tag 0 kastriert und zu den angegebenen Zeiten Prostatagewebe entnommen und mit M-N#1-Antikörpern angefärbt.
    • Abbildung 6
  • Das M-N#1-Antigen ist Teil eines N-glycosidisch gebundenen Zuckerrestes. Radioaktiv markierte Zellysate von MT-450 Zellen wurden mit M-N#1 immunpräzipitiert und die präzipitierten Proteine wurden auf einem SDS Acrylamidgel aufgetrennt.
    M-N#1 präzipitierte Proteine wandern als Schmier (1. Bahn). Die Buchstaben indizieren die Behandlung der Immunpräzipitäten vor der gelelektrophoretischen Trennung: NGF: N-GlykosidaseF; OG: 0-Glykosidase; N: Neuraminidase. Re-IP.ed bedeutet, daß die enzymbehandelten Immunpräzipitate "repräzipitiert" wurden. Der rechte Teil der Abbildung zeigt das Resultat einer Tunikamyzin-Behandlung. M-N#1-T 450 Zellen wurden vor Markierung mit radioaktivem Methionin für die angegebene Zeit mit Tunikamyzin behandelt und nach Markierung immunpräzipitiert. Die Kontrolle stellt eine Präzipitation ohne Antikörper dar.
    • Abbildung 7
  • Nachweis der Fucosylierung des M-N#1-Antigens.
  • MT-450 Zellen wurden mit radioaktiver Fucose markiert, und Proteine in Lysaten dieser Zellen wurden mit M-N#1 präzipitiert (Kontrolle = Präzipitation ohne Antikörper). Dargestellt ist die Auftrennung der präzipitierten Proteine auf SDS Polyacrylamidgelen. NGF (N-GlycosidaseF) indiziert immun präzipitierte Proteine, die vor der Auftrennung mit NGF behandelt wurden. Für das Experiment "U.Europaeus" (rechter Teil der Abbildung) wurden MT-450 Zellen mit 14C-Methionin markiert und die Extrakte über eine Ulex Europaeus Lektinsäule gereinigt. Gebundene Proteine wurden eluiert und ohne Antikörper (cont) oder mit M-N#1 Antikörpern präzipitiert. NGF indiziert N-GlycosidaseF Behandlung.
    • Abbildung 8
  • Kompetition der M-N#1-Bindung mit Fucose und Galactose. Proteine in Lysaten von radioaktiv markierten (14C-Methionin) MT-450 Zellen wurden mit M-N#1-Antikörpern in Abwesenheit oder steigenden Konzentrationen von Fucose oder Galaktose immunpräzipitiert und gelelektrophoretisch aufgetrennt.
    Figure imgb0001
    Figure imgb0002
    Figure imgb0003

Claims (5)

  1. Mittel enthaltend Antikörper, die mit Glycoproteiden menschlicher oder tierischer Herkunft, enthaltend N-glycosidisch gebundene Saccharide des blutgruppenspezifischen Antigen-Typs B2, 3, 4 oder A2 reagieren, zur Verwendung bei der Identifizierung und Unterdrückung des Wachstums von Tumorzellen.
  2. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend einen monoklonalen Antikörper M-N#1, der aus der Zellkultur mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC 2333 erhältlich ist.
  3. Verwendung des Mittels nach einem der Ansprüche 1 bis 2 zur Herstellung einer enteral, parenteral, systemisch, lokal und/oder topisch zu verabreichenden Apptikationsform.
  4. Verwendung des Mittels nach einem der Ansprüche 1 bis 2 zur Herstellung einer zur Injektion, Infusion oder Perfusion geeigneten Darreichungsform.
  5. Verwendung eines Mittels gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2 zur Identifizierung von Tumorzellen in vitro.
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