EP0804933B1 - Lagerstabile Fibrinogen-Präparate - Google Patents

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EP0804933B1
EP0804933B1 EP97106568A EP97106568A EP0804933B1 EP 0804933 B1 EP0804933 B1 EP 0804933B1 EP 97106568 A EP97106568 A EP 97106568A EP 97106568 A EP97106568 A EP 97106568A EP 0804933 B1 EP0804933 B1 EP 0804933B1
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EP
European Patent Office
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acid
fibrinogen
vitamin
preparation
solution
Prior art date
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EP97106568A
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French (fr)
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EP0804933A3 (de
EP0804933B2 (de
EP0804933A2 (de
Inventor
Thomas Dr. Seelich
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Baxter AG
Original Assignee
Baxter AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Application filed by Baxter AG filed Critical Baxter AG
Publication of EP0804933A2 publication Critical patent/EP0804933A2/de
Publication of EP0804933A3 publication Critical patent/EP0804933A3/de
Application granted granted Critical
Publication of EP0804933B1 publication Critical patent/EP0804933B1/de
Publication of EP0804933B2 publication Critical patent/EP0804933B2/de
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Expired - Lifetime legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L24/00—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices
    • A61L24/04—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices containing macromolecular materials
    • A61L24/10—Polypeptides; Proteins
    • A61L24/106—Fibrin; Fibrinogen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the invention relates to storage-stable fibrinogen preparations for Preparation of concentrated fibrinogen solutions for Use as a tissue adhesive or for the preparation of Fibrinogen solutions for other applications, e.g. for Infusion purposes.
  • the storage-stable fibrinogen preparations can either be in lyophilized form or as frozen (especially highly concentrated) fibrinogen solutions are present and have the advantage of being easier and faster than before known ready-to-use preparations Reconstituted fibrinogen or tissue adhesive solutions or can be liquefied.
  • the invention also includes those from the Fibrinogen or Tissue adhesive solutions.
  • Tissue adhesives based on fibrinogen are used for seamless or seam-supporting connection of human or animal tissue or organ parts, for Wound sealing, hemostasis and promoting wound healing used.
  • thrombin converts the (soluble) fibrinogen contained in the ready-to-use, liquid tissue adhesive into (insoluble) fibrin and activates factor XIII, which is also contained, to factor XIIIa. This cross-links the fibrin formed to a high polymer, which is essential for the effectiveness of the tissue adhesive.
  • the required thrombin activity can either come from the tissue to be glued (the wound areas) itself or can be added to the tissue glue during the gluing process in the form of a solution containing thrombin and Ca 2+ ions.
  • Tissue adhesives based on fibrinogen are already out AT-B-359 653, AT-B-359 652 and AT-B-369 990. she contain fibrinogen and factor XIII and others Proteins such as fibronectin and albumin and optionally Antibiotics.
  • Tissue adhesives come in the form of either frozen solutions or as a lyophilisate, since they are not very stable as liquid solutions and not for are durable for a long time. This leads to the fact that the commercial products are either thawed before they are used, i.e. liquefied, or reconstituted from their lyophilisate Need to become. Both measures are not with one insignificant expenditure of time.
  • the fibrinogen content is from at least 70 mg / ml of the ready-to-use Tissue adhesive solution and factor XIII content required, taking the ratio of factor XIII to Fibrinogen, expressed in units of factor XIII per Grams of fibrinogen, at least 80.
  • Such preparations enable i.a. safe hemostasis, good adhesion of the adhesive to the wound or Fabric surfaces, high resilience of the bonds or Wound seals, a complete absorbability of the Glue in the course of the wound healing process, and she have wound-healing properties.
  • the required high fibrinogen content causes that the lyophilized or liquid frozen Fibrinogen preparations only gradually and with increased Temperature - generally only above 25 ° C, mostly above 30 ° C -
  • liquid tissue adhesive be reconstituted or liquefied (“melted") can.
  • Relatively thin fluid tissue adhesive solutions are particularly advantageous when the tissue adhesive is through thin catheters inserted into the interior of body cavities and to be applied there, or when using the Spray technology, whereby the fabric adhesive is sprayed and used as thin layer is applied to wound surfaces.
  • Appropriate Application devices for tissue adhesives are already available Available (EP 0 315 222, EP 0 455 626).
  • the solubility of the fibrinogen preparations can change the use of virus inactivation procedures still deteriorate. These are preferably such performed that the lyophilized material one Heat treatment, for example according to EP 0 159 311, is subjected.
  • EP-A-0 345 246 a lyophilized fibrinogen preparation which in addition to fibrinogen, at least one biologically compatible Contains surfactant.
  • the addition of surfactants causes one improved wetting of the lyophilisate with the Solvent, which causes the rate of dissolution, not but the solubility of the fibrinogen itself - in one given temperature - is improved.
  • Such preparations must therefore also at temperatures above 25 ° C, preferably at 37 ° C to be reconstituted.
  • EP-A-085 923 describes a lyophilized Fibrinogen preparation, which in addition to fibrinogen Contains substance that a urea or Has guanidine residue.
  • Tissue adhesive preparations have a cytotoxic effect on growth inhibit by fibroblasts and to a changed, unphysiological fibrin structure, causing the desired elasticity of the fibrin is lost (cf. Redl et al, Medical World 36, 769-76 (1985).
  • With the Inhibition of growth of the fibroblasts i.e. those cells those who initiate the wound healing process go the desired ones wound healing properties of tissue adhesives lost on fibrinogen basis. Due to the lack of elasticity The fibrin produced will also be the required high Resilience of the bonds in vivo questioned.
  • the object of the present invention is Storage stable fibrinogen preparations in lyophilized or to provide liquid-frozen form that quickly and easily - preferably without use of additional aids such as heating and / or stirring devices - for ready-to-use fibrinogen or Tissue adhesive solutions reconstituted or liquefied can be, the ready to use Tissue adhesive solutions (with a fibrinogen content of at least 70 mg / ml) already thin enough below 25 ° C are easy to process, and still not the disadvantages of known preparations discussed above, in particular those according to EP-A-085 923.
  • the preparations contain, in addition to fibrinogen and, if appropriate, further proteins and auxiliaries and additives, at least one substance which improves the solubility of fibrinogen or lowers its liquefaction temperature and lowers the viscosity of a ready-to-use tissue adhesive solution at room temperature.
  • the substance is selected not only according to its effect on the solubility of fibrinogen, but also after the formation of a physiological fibrin structure if the dissolved preparation reacts with an activator and fibrin clots are formed.
  • the relevant evidence can be provided after mixing the fibrinogen solution with the same volume of a thrombin-CaCl 2 solution (essentially consisting of 4 IU thrombin and 20 to 40 ⁇ mol CaCl 2 per ml) if the clots formed have a physiological fibrin structure, i.e. the typical, spatially branched structure, as it is formed when thrombin acts on fibrinogen under physiological conditions, ie at an ionic strength of about 0.15 and a pH of about 7.4.
  • the physiological structure is characterized by an opaque and tough-elastic clot. SEM images of typical physiological or non-physiological fibrin clots are described, for example, in the publication by Redl et al. Medical World 36, 769-76 (1985).
  • the preparation according to the invention is composed in such a way that when used as a tissue adhesive there is no cytotoxic Has an effect, so it is very well tolerated by cells, a good one Enables cell growth and thus an ideal prerequisite for good wound healing. Evidence of this can after diluting the tissue adhesive with the same Volume of a semi-isotonic or isotonic sodium chloride solution are provided if no harmful effects Fibroblasts is detectable.
  • a fibrinogen or tissue adhesive solution is in the generally referred to as non-cytotoxic when in Cell overlay test according to Redl et al. (see above) none has a harmful effect on fibroblasts.
  • tissue adhesive to a substance that has solubility the preparation improved or their Liquefaction temperature lowers and the viscosity of the ready-to-use tissue adhesive solution at room temperature lowers the other desired biochemical and physical properties of the tissue adhesive practical not be affected.
  • the storage-stable fibrinogen preparation according to the invention in liquid-frozen form contains one solubility-improving substance, so that it is in a Temperature from 0 to 25 ° C, preferably below 20 ° C, particularly preferably below 15 ° C, to a solution with a Fibrinogen content of at least 70mg / ml is liquefiable.
  • a lower condensing temperature means at the same time a faster liquefaction frozen, concentrated fibrinogen solution if this for example an ambient temperature of 20 ° C - 25 ° C (Room temperature) is exposed. This applies in particular to the frozen preparations according to the invention, which in Ready-to-use, sterile disposable syringes filled and out Sterility double in plastic wrap are welded in.
  • the lyophilized fibrinogen or tissue adhesive preparations have the advantage that these at room temperature without special aids (e.g. the combined heating and stirring device according to AT-B-371 719) in acceptable time, i.e. in a period of about one half a minute to 15 minutes, preferably less than 7 Minutes, particularly preferably less than 5 minutes to one Solution with a fibrinogen content of at least 70 mg / ml, can be reconstituted. So far, this was only with Preparations according to EP-A-085 923 the case; however point these preparations, as mentioned above, others serious disadvantages.
  • special aids e.g. the combined heating and stirring device according to AT-B-371 719
  • preparations according to the invention also allow the particularly quick and easy provision of Fibrinogen solutions for other purposes, for example for Infusion.
  • the preparations according to the invention contain one or several of the substances selected from the group of Nucleic bases, nucleosides or nucleotides and Benzoic acid, p-aminobenzoic acid (vitamin H '), p-aminosalicylic acid, hydroxybenzoic acid, hydroxysalicylic acid, Phenylalanine, procaine, niacin, niacinamide, picolinic acid, Vitamin B6 (pyridoxine), hydroxypyridines, Pyridine dicarboxylic acids, pyridine sulfonic acids, Piperidine carboxylic acid esters, pyrimidine, barbituric acid, uracil, Uridine, uridine phosphates, thymine, cytosine, cytidine, Hydroxypyrimidines, thiamine (vitamin B1), morpholine, Pyrrolidone, imidazole, histidine, hydantoin, Pyrazole dicarboxylic
  • Fibrinogen preparations are advantageously higher accordingly Ratios of the amount of the substance based on fibrinogen to choose.
  • the substance can be in an amount from 0.12-12 mmol, preferably 0.28-5.6 mmol / g fibrinogen, be included.
  • the type and amount of the substance should be chosen so that the ready-to-use tissue adhesive preparation is sufficiently fluid at room temperature to be sprayed without any problems, corresponding to a viscosity of less than 400 mm 2 / s (400 cSt.), Preferably less than 300 mm 2 / s (300 cSt). and after mixing the ready-to-use tissue adhesive solution with a thrombin-CaCl 2 solution in a ratio of 1: 1, physiological clots are formed.
  • the fibrinogen preparations according to the invention are further characterized by their relatively low salt content, so that the osmolarity of the concentrated tissue adhesive solution is preferably less than 500 mOsm, most preferably less than 400 mOsm. This limitation is necessary to enable the desired good cell compatibility (absence of cytotoxic properties). It was only through the substances according to the invention that it was possible to create lyophilized fibrinogen preparations with a relatively low salt content, which, as described above, can nevertheless be reconstituted without problems at room temperature, relatively thin liquid tissue adhesive solutions (with a fibrinogen content of at least 70 mg / ml), and are well tolerated by cells.
  • Preparations known so far are either at Room temperature readily soluble, but damaging to cells (Beriplast®, Biocol®, Bolheal HG-4®) or well cell-compatible, but only at elevated temperature - preferably at 37 ° C - reconstitutable (Tissucol®).
  • the preparations according to the invention can be based on their Composition also available as virus-safe preparations to be provided, even in spite of pretreatments Solve inactivation and / or depletion of viruses well.
  • Multi-stage treatment methods are particularly effective Heat treatment processes, e.g. Steam treatment at 60 ° C and 80 ° C according to EP-159 311 or combinations of chemical and / or physical treatment methods.
  • a heat treatment process is particularly preferred added the solubility-improving substance to the preparation and, if necessary, a nanofiltration before filling in the final container.
  • the preparation according to the invention preferably also contains Factor XIII, but also fibronectin and possibly low Amounts of plasminogen, which include for the course of the Wound healing can be beneficial.
  • a Preparation according to the invention essentially only Fibrinogen exist, i.e. the only active substance fibrinogen contain.
  • tissue adhesive based on fibrinogen and a plasminogen activator inhibitor or plasmin inhibitor, such as aprotinin, ⁇ 2 -plasmin inhibitor, ⁇ 2 -macroglobulin and the like.
  • the ready-to-use tissue adhesive solution generally contains 70 to 120 mg fibrinogen, optionally 0.50 to 50 U factor XIII, optionally 0.5 to 15 mg fibronectin, 0 to 150 ⁇ g plasminogen and 0 to 20,000 KIU aprotinin, preferably 1,000 to 15,000 KIU aprotinin per ml.
  • a preferred preparation furthermore contains low surfactant concentrations to improve the wettability of the lyophilized preparation or to improve the frozen preparations.
  • a virus inactivated (steamed) Tissue adhesive preparation was made according to known methods (see AT-B-369 653, EP 0 345 246) as follows manufactured:
  • a plasma cryoprecipitate from pooled human citrate plasma was mixed with a buffer solution (pH 6.5) containing 6.6 g sodium citrate.2H 2 O, 3.4 g NaCl, 10 g glycine, 25,000 KIE aprotinin and 200 IU heparin per 1 at 2 ° C washed and centrifuged.
  • the precipitate was adjusted to a protein concentration of 42 g / l with a further buffer solution containing 9.0 g glycine, 1.0 g sodium citrate. 2H 2 O, 25,000 KIE aprotinin and 0.2 g Triton WR 1339.
  • Tissue adhesive solutions were used in the following liquefaction test certainly:
  • the frozen samples are first in a to 10 ° C incubated for 30 minutes. After that the temperature at intervals of 30 minutes by 2.5 ° C elevated. After each incubation period, the Physical state of the samples by tilting the tubes assessed. The transition from the solid to the liquid state does not occur abruptly, but over a range of several Temperature levels, being gelatinous and viscous Intermediate states are run through.
  • This simple test can be used to assess whether a tissue adhesive solution at a given temperature is sufficiently thin to be applied easily to be able to.
  • tissue adhesive solutions mentioned after mixing with the same volume of a thrombin-CaCl 2 solution (4 IU thrombin and 40 ⁇ mol CaCl 2 per ml, produced from Thrombin 500, Immuno AG) form physiological, opaque, viscoplastic clots as desired ,
  • Example 2 Influence of niacinamide on the viscosity of Tissue adhesive solutions
  • Example 4 Influence of niacinamide on the reconstitution time of lyophilized tissue adhesive preparations
  • a lyophilized, virus inactivated Tissue adhesive preparation was made up to the heating step prepared analogously to Example 1.
  • the material was then dissolved with distilled H 2 O or aqueous niacinamide solutions of different concentrations to a protein concentration of 30 g / l, sterile filtered, filled in 4.0 ml portions into sterile end containers (glass vials) and lyophilized.
  • Example 5 Cell Compatibility of According to the Invention tissue adhesives
  • tissue adhesive preparations from Example 4 were made after Redl et al., Med. Welt 36, 769-776, 1985, on their Cell compatibility checked. Served as a negative control a well-known cytotoxic tissue adhesive preparation according to EP-A-0 085 923.
  • a purified lyophilized fibrinogen preparation (bulk material) was developed essentially according to L.A. Kazal et al, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 113, 989-994, 1963, by glycine precipitation from a human plasma fraction containing fibrinogen manufactured.
  • This material was adjusted to a residual moisture of 7 to 8% and heated for further virus inactivation under an N 2 atmosphere at 60 ° C. for 10 hours and then at 80 ° C. for 3 hours.
  • the solutions were 50 ml each 125 ml bottles filled and lyophilized.
  • the example shows the favorable influence according to the invention solubility-improving substances on the solubility of heated lyophilized fibrinogen preparations that assembled according to infusion preparations and for optimal tolerability after reconstitution about isotonic are.
  • a human plasma fraction containing fibrinogen was analyzed with Tween 80 treated, as already essentially in AU-B-18306/92 described to inactivate viruses such as HIV which possibly occur in human plasma.
  • the material further purified by precipitation with glycine, as in Example 6 described.
  • the precipitate was washed with a 25 mM Sodium citrate solution pH 7.3 washed at 0-2 ° C.
  • the purified precipitate became a solution of 50g protein and 10 mmol sodium citrate (pH 7.3) per liter and lyophilized.
  • the lyophilized raw material was then placed on a Moisture adjusted from 7-8% and for further Virus inactivation heated. The heating was done under Nitrogen atmosphere over a period of 10 hours at 60 ° C and then for 1 hour at 80 ° C.
  • the material was then containing a solution 40 mmol histidine.HCl, 40 mmol niacinamide, 80 mg Tween 80 and 100 000 KIE aprotinin / l to a protein concentration of 40 g / l dissolved and the pH adjusted to pH 7.3 with NaOH.
  • Virus-inactivated human albumin (from IMMUNO) was added (6 g / l) and human purified factor XIII, which according to the regulation of A 1548/93 for Virus inactivation was treated (15,000 U / l).
  • the solution was sterile filtered and 2.5 ml each in sterile Final container (glass bottles) filled and lyophilized.
  • a ready-to-use tissue adhesive solution was obtained, the per ml 90 mg fibrinogen, 2.5 mg fibronectin, 15 mg Albumin, 100 ⁇ mol histidine and 100 ⁇ mol niacinamide contained.
  • the average reconstitution time at room temperature was determined as described in Example 4 and was only 4 Minutes.
  • This example shows that a combination of solubility-improving substances according to the invention are used, is particularly suitable for the production of readily soluble lyophilized tissue adhesive preparations, which at the same time guarantee a high level of virus security through the two different and described independent measures to inactivate viruses in the course the manufacturing process.

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Description

Die Erfindung betrifft lagerstabile Fibrinogenpräparate zur Bereitung von konzentrierten Fibrinogenlösungen zur Verwendung als Gewebeklebstoff oder zur Bereitung von Fibrinogenlösungen für andere Anwendungen, beispielsweise für Infusionszwecke.
Die lagerstabilen Fibrinogenpräparate können entweder in lyophilisierter Form oder als tiefgefrorene (insbesondere hochkonzentrierte) Fibrinogenlösungen vorliegen, und haben den Vorteil, dass sie einfacher und rascher als bisher bekannte vergleichbare Präparate zu gebrauchsfertigen Fibrinogen- bzw. Gewebeklebstofflösungen rekonstituiert bzw. verflüssigt werden können.
Die Erfindung beinhaltet weiters auch die aus den erfindungsgemässen Präparaten erhältlichen Fibrinogen- bzw. Gewebeklebstofflösungen.
Gewebeklebstoffe auf Basis von Fibrinogen werden zum nahtlosen bzw. nahtunterstützenden Verbinden von menschlichen oder tierischen Gewebe- oder Organteilen, zur Wundversiegelung, Blutstillung und Förderung der Wundheilung eingesetzt.
Ihre Wirkungsweise beruht darauf, dass durch Einwirkung von Thrombin das im gebrauchsfertigen, flüssigen Gewebeklebstoff enthaltene (lösliche) Fibrinogen in (unlösliches) Fibrin übergeführt und der ebenfalls enthaltene Faktor XIII zu Faktor XIIIa aktiviert wird. Dieser vernetzt das gebildete Fibrin zu einem Hochpolymer, was für die Wirksamkeit des Gewebeklebstoffes wesentlich ist. Die benötigte Thrombinaktivität kann entweder aus dem zu klebenden Gewebe (den Wundflächen) selbst stammen oder in Form einer Thrombin und Ca2+-Ionen enthaltenden Lösung dem Gewebeklebstoff bei der Klebung zugesetzt werden.
Gewebeklebstoffe auf Basis von Fibrinogen sind bereits aus AT-B-359 653, AT-B-359 652 und AT-B-369 990 bekannt. Sie enthalten neben Fibrinogen und Faktor XIII noch weitere Proteine, wie Fibronectin und Albumin und gegebenenfalls Antibiotika. Gewebeklebstoffe kommen entweder in Form von tiefgefrorenen Lösungen oder als Lyophilisat in den Handel, da sie als flüssige Lösungen wenig stabil und nicht für längere Zeit haltbar sind. Dieser Umstand führt dazu, dass die Handelsprodukte vor ihrer Applikation entweder aufgetaut, d.h. verflüssigt, oder aus ihrem Lyophilisat rekonstituiert werden müssen. Beide Massnahmen sind mit einem nicht unerheblichen Zeitaufwand verbunden.
Für die optimale Klebung ist ein Gehalt an Fibrinogen von mindestens 70 mg/ml der gebrauchsfertigen Gewebeklebstofflösung und ein Gehalt an Faktor XIII erforderlich, wobei das Verhältnis des Faktors XIII zu Fibrinogen, ausgedrückt in Einheiten des Faktors XIII pro Gramm Fibrinogen, mindestens 80 beträgt.
Solche Präparate ermöglichen u.a. eine sichere Blutstillung, eine gute Haftfähigkeit des Klebstoffes an den Wund- bzw. Gewebsflächen, eine hohe Belastbarkeit der Klebungen bzw. Wundversiegelungen, eine vollkommene Resorbierbarkeit des Klebstoffes im Verlauf des Wundheilungsprozesses, und sie haben wundheilungsfördernde Eigenschaften.
Der erforderliche hohe Fibrinogengehalt bewirkt allerdings, dass die lyophilisierten bzw. flüssig-tiefgefrorenen Fibrinogenpräparate erst allmählich und bei erhöhter Temperatur - im allgemeinen erst über 25°C, zumeist über 30°C - zum gebrauchsfertigen, flüssigen Gewebeklebstoff rekonstituiert bzw. verflüssigt ("aufgeschmolzen") werden können.
Ärztlicherseits besteht der Wunsch nach einer raschen Verfügbarkeit der gebrauchsfertigen Gewebeklebstofflösung, da dies insbesondere in chirurgischen Notsituationen von entscheidender Bedeutung sein kann.
Für die Bereitstellung der gebrauchsfertigen Lösung sollen ausserdem möglichst wenig Handgriffe erforderlich sein, um bei Operationen das Hilfspersonal möglichst wenig zu belasten, und es wird als Vorteil empfunden, wenn dazu keine zusätzlichen Hilfsmittel erforderlich sind.
Weiters besteht ärztlicherseits der Wunsch nach gebrauchsfertigen Gewebeklebstofflösungen, die trotz ihres hohen Fibrinogengehaltes bereits bei Raumtemperatur, etwa bei 20°C, dünnflüssig genug sind, um leicht verarbeitet werden zu können.
Relativ dünnflüssige Gewebeklebstofflösungen sind insbesondere dann von Vorteil, wenn der Gewebeklebstoff durch dünne Katheter in das Innere von Körperhöhlen eingeführt und dort appliziert werden soll, oder auch bei Anwendung der Sprühtechnik, wobei der Gewebeklebstoff versprüht und als dünne Schicht auf Wundflächen aufgebracht wird. Entsprechende Applikationsgeräte für Gewebeklebstoffe stehen bereits zur Verfügung (EP 0 315 222, EP 0 455 626).
Die Löslichkeit der Fibrinogenzubereitungen kann sich durch die Anwendung von Virusinaktivierungsverfahren noch verschlechtern. Diese werden vorzugsweise derart durchgeführt, dass das lyophilisierte Material einer Hitzebehandlung, beispielsweise gemäss EP 0 159 311, unterzogen wird.
Es hat daher nicht an Versuchen gefehlt, die Auflösbarkeit von lyophilisierten Fibrinogenzubereitungen zu verbessern.
Es ist bekannt, dass die Auflösbarkeit von Lyophilisaten durch bestimmte Zusätze verbessert werden kann. So beschreibt EP-A-0 345 246 eine lyophilisierte Fibrinogenzubereitung, die neben Fibrinogen noch mindestens ein biologisch verträgliches Tensid enthält. Der Zusatz von Tensiden bewirkt eine verbesserte Benetzung des Lyophilisates mit dem Lösungsmittel, wodurch zwar die Lösungsgeschwindigkeit, nicht aber die Löslichkeit des Fibrinogens an sich - bei einer gegebenen Temperatur - verbessert wird. Solche Präparate müssen daher ebenfalls bei Temperaturen über 25°C, vorzugsweise bei 37°C, rekonstituiert werden.
EP-A-085 923 beschreibt eine lyophilisierte Fibrinogenzubereitung, die neben Fibrinogen noch eine Substanz enthält, die einen Harnstoff- oder einen Guanidinrest aufweist. Es hat sich allerdings gezeigt, dass nach diesem Vorschlag hergestellte lyophilisierte Gewebeklebstoffpräparationen zytotoxisch wirken, das Wachstum von Fibroblasten hemmen und zu einer veränderten, unphysiologischen Fibrinstruktur führen, wodurch die erwünschte Elastizität des Fibrins verlorengeht (vgl. Redl et al, Medizinische Welt 36, 769-76 (1985). Mit der Wachstumshemmung der Fibroblasten, also derjenigen Zellen, die den Wundheilungsprozess einleiten, gehen die erwünschten wundheilungsfördernden Eigenschaften von Gewebeklebstoffen auf Fibrinogenbasis verloren. Durch die fehlende Elastizität des entstandenen Fibrins wird weiters die geforderte hohe Belastbarkeit der Klebungen in vivo in Frage gestellt.
Die vorliegende Erfindung stellt sich die Aufgabe, lagerstabile Fibrinogenpräparate in lyophilisierter oder flüssig-tiefgefrorener Form zur Verfügung zu stellen, die rasch und in einfacher Weise - vorzugsweise ohne Verwendung von zusätzlichen Hilfsmitteln wie Wärme- und/oder Rührgeräten - zu gebrauchsfertigen Fibrinogen- bzw. Gewebeklebstofflösungen rekonstituiert bzw. verflüssigt werden können, wobei die gebrauchsfertigen Gewebeklebstofflösungen (mit einem Fibrinogengehalt von mindestens 70 mg/ml) bereits unter 25°C dünnflüssig genug sind, um leicht verarbeitet werden zu können, und trotzdem nicht die oben erörterten Nachteile bekannter Präparate, insbesondere solcher entsprechend EP-A-085 923, aufweisen.
Die gestellte Aufgabe wird erfindungsgemäss dadurch gelöst, dass die Präparationen neben Fibrinogen und gegebenenfalls weiteren Proteinen sowie Hilfs- und Zusatzstoffen mindestens eine Substanz enthalten, die die Löslichkeit von Fibrinogen verbessert bzw. deren Verflüssigungstemperatur erniedrigt und die Viskosität einer gebrauchsfertigen Gewebeklebstofflösung bei Raumtemperatur absenkt. Dabei erfolgt die Auswahl der Substanz nicht nur.nach deren Wirkung auf die Löslichkeit von Fibrinogen, sondern auch nach der Bildung einer physiologischen Fibrinstruktur, wenn das gelöste Präparat mit einem Aktivator reagiert und Fibrinclots gebildet werden. Der diesbezügliche Nachweis kann nach Mischen der Fibrinogenlösung mit dem gleichen Volumen einer Thrombin-CaCl2-Lösung (im wesentlichen bestehend aus 4 I.E. Thrombin und 20 bis 40 µmol CaCl2 pro ml) erbracht werden, wenn die gebildeten Clots eine physiologische Fibrinstruktur, also die typische, räumlich verzweigte Struktur aufweist, wie sie bei Einwirkung von Thrombin auf Fibrinogen unter physiologischen Bedingungen, d.h. bei einer Ionenstärke von etwa 0,15 und einem pH-Wert von etwa 7,4 gebildet wird. Makroskopisch ist die physiologische Struktur durch einen undurchsichtigen und zähelastischen Clot gekennzeichnet. REM-Aufnahmen von typischen physiologischen bzw. nicht physiologischen Fibrinclots werden beispielsweise in der Publikation von Redl et al. Medizinische Welt 36, 769-76 (1985) gezeigt.
Das erfindungsgemässe Präparat ist derart zusammengesetzt, dass es bei Anwendung als Gewebeklebstoff keine zytotoxische Wirkung hat, also sehr gut zellverträglich ist, ein gutes Zellwachstum ermöglicht und damit eine ideale Voraussetzung für eine gute Wundheilung bietet. Der Nachweis dafür kann nach dem Verdünnen des Gewebeklebstoffes mit dem gleichen Volumen einer halbisotonen oder isotonen Natriumchloridlösung erbracht werden, wenn keine schädigende Wirkung auf Fibroblasten nachweisbar ist.
Eine Fibrinogen- bzw. Gewebeklebstofflösung wird im allgemeinen als nicht-zytotoxisch bezeichnet, wenn sie im Zellüberschichtungstest nach Redl et al. (siehe oben) keine schädigende Wirkung auf Fibroblasten ausübt.
Weiters ist das erfindungsgemässe Präparat vorzugsweise so zusammengesetzt, dass auch alle weiteren Anforderungen, die an einen Gewebeklebstoff zu stellen sind, nämlich
  • Virussicherheit
  • hohe Belastbarkeit der Klebungen bzw. Wundversiegelungen, sowie sichere und anhaltende Blutstillung,
  • regelbare Haltbarkeit der Klebungen im Körper, durch einen variablen Gehalt an Plasminogen bzw. Fibrinolyseinhibitor,
  • vollkommene Resorbierbarkeit des Klebstoffes im Verlaufe des Wundheilungsprozesses,
  • wundheilungsfördernde Eigenschaften,
erfüllt sind, d.h. dass durch den erfindungsgemässen Gehalt des Gewebeklebstoffes an einer Substanz, die die Löslichkeit der Präparation verbessert bzw. deren Verflüssigungstemperatur erniedrigt und die Viskosität der gebrauchsfertigen Gewebeklebstofflösung bei Raumtemperatur absenkt, die sonstigen erwünschten biochemischen und physikalischen Eigenschaften des Gewebeklebstoffes praktisch nicht beeinträchtigt werden.
Dies kann unter anderem durch folgende weitere Testungen nachgewiesen werden:
  • Gerinnungsreaktion nach Mischen mit einer Thrombinlösung (Gerinnungszeit)
  • Vernetzung der Fibrin-γ- und α-Ketten
  • Fibrinolyseresistenz
  • Reissfestigkeit
  • Klebefestigkeit.
Unter Verflüssigungstemperatur wird diejenige Temperatur verstanden, bei der beim Erwärmen einer tiefgefrorenen konzentrierten Fibrinogenlösung Verflüssigung eintritt.
Das erfindungsgemässe lagerstabile Fibrinogenpräparat in flüssig-tiefgefrorener Form enthält eine löslichkeitverbessernde Substanz, so dass es bei einer Temperatur von 0 bis 25°C, vorzugsweise unter 20°C, besonders bevorzugt unter 15°C, zu einer Lösung mit einem Fibrinogengehalt von mindestens 70mg/ml verflüssigbar ist. Eine erniedrigte Verflüssigungstemperatur bedeutet gleichzeitig eine raschere Verflüssigung einer tiefgefrorenen, konzentrierten Fibrinogenlösung, wenn diese beispielsweise einer Umgebungstemperatur von 20°C - 25°C (Raumtemperatur) ausgesetzt wird. Dies gilt insbesondere für die erfindungsgemässen tiefgefrorenen Präparate, die in gebrauchsfertigen, sterilen Einmalspritzen abgefüllt und aus Gründen der Sterilität zweifach in Plastikfolien eingeschweisst sind.
Durch die notwendige doppelte Umhüllung ist der Wärmeübergang erschwert, weshalb solcherart abgepackte, tiefgefroren gelagerte Präparate bisher nur mit Hilfe eines Wasserbades (37°C) in akzeptabler Zeit verflüssigt, d.h. gebrauchsfertig gemacht werden konnten. Die Verwendung eines Wasserbades ist jedoch umständlich und mit Nachteilen verbunden, z.B. hinsichtlich der Aufrechterhaltung steriler Bedingungen.
Aber auch die erfindungsgemässen lyophilisierten Fibrinogen- bzw. Gewebeklebstoffpräparationen haben den Vorteil, dass diese bei Raumtemperatur ohne besondere Hilfsmittel (wie z.B. dem kombinierten Wärme- und Rührgerät gemäss AT-B-371 719) in akzeptabler Zeit, d.h. in einem Zeitraum von etwa einer halben Minute bis zu 15 Minuten, vorzugsweise weniger als 7 Minuten, besonders bevorzugt weniger als 5 Minuten zu einer Lösung mit einem Fibrinogengehalt von mindestens 70 mg/ml, rekonstituiert werden können. Bisher war dies nur bei Präparationen gemäss EP-A-085 923 der Fall; jedoch weisen gerade diese Präparationen, wie oben erwähnt, andere schwerwiegende Nachteile auf.
Weiters erlauben die erfindungsgemässen Präparate auch die besonders rasche und einfache Bereitstellung von Fibrinogenlösungen für andere Zwecke, beispielsweise zur Infusion.
Es wurde überraschenderweise gefunden, dass eine Reihe von Substanzen die weiter oben beschriebenen Anforderungen erfüllen, d.h. die Löslichkeit von Fibrinogen erhöhen, die Verflüssigungstemperatur von konzentrierten, tiefgefrorenen Fibrinogen- bzw. Gewebeklebstofflösungen, sowie deren Viskosität bei Raumtemperatur erniedrigen ohne die weiter oben beschriebenen unerwünschten Nebenwirkungen von Zusatzstoffen gemäss EP-A-085 923 hervorzurufen.
Die erfindungsgemässen Präparationen enthalten eine oder mehrere der Substanzen ausgewählt aus der Gruppe der Nukleinbasen, Nukleoside oder Nukleotide und Benzoesäure, p-Aminobenzoesäure (Vitamin H'), p-Aminosalicylsäure, Hydroxybenzoesäure, Hydroxysalicylsäure, Phenylalanin, Prokain, Niacin, Niacinamid, Picolinsäure, Vitamin B6 (Pyridoxin), Hydroxypyridinen, Pyridin-dicarbonsäuren, Pyridinsulfonsäuren, Piperidin-carbonsäureester, Pyrimidin, Barbitursäure, Uracil, Uridin, Uridinphosphaten, Thymin, Cytosin, Cytidin, Hydroxypyrimidinen, Thiamin (Vitamin B1), Morpholin, Pyrrolidon, Imidazol, Histidin, Hydantoin, Pyrazol-dicarbonsäuren, Phenazon, Adenosin, Adenosin-Phosphaten, Inosin, Guanosin-Phosphaten, Brenzschleimsäure (Furan-2-carbonsäure), Ascorbinsäure (Vitamin C) und Xantosin, vorzugsweise in einer Menge von 0,03 mmol - 3 mmol, am meisten bevorzugt in einer Menge von 0,07 mmol - 1,4 mmol/g Fibrinogen.
Zur Bereitung von Infusionslösungen aus lyophilisierten Fibrinogenpräparaten ist es vorteilhaft entsprechend höhere Verhältnisse der Menge an der Substanz bezogen auf Fibrinogen zu wählen. Beispielsweise kann die Substanz in einer Menge von 0,12-12 mmol, vorzugsweise 0,28-5,6 mmol/g Fibrinogen, enthalten sein.
Die Art und Menge der Substanz ist so zu wählen, dass das gebrauchsfertige Gewebeklebstoffpräparat bei Raumtemperatur dünnflüssig genug ist, um problemlos versprüht werden zu können, entsprechend einer Viskosität von weniger als 400 mm2/s (400 cSt.), vorzugsweise weniger als 300 mm2/s (300 cSt). und nach Mischen der gebrauchsfertigen Gewebeklebstofflösung mit einer Thrombin-CaCl2-Lösung im Verhältnis 1:1 physiologische Clots gebildet werden.
Die erfindungsgemässen Fibrinogenpräparate zeichnen sich weiters durch ihren relativ geringen Salzgehalt aus, so dass die Osmolarität der konzentrierten Gewebeklebstofflösung vorzugsweise weniger als 500 mOsm, am meisten bevorzugt weniger als 400 mOsm beträgt. Diese Begrenzung ist notwendig, um die erwünschte gute Zellverträglichkeit (Abwesenheit zytotoxischer Eigenschaften) zu ermöglichen. Erst durch die erfindungsgemässen Substanzen wurde es möglich, lyophilisierte Fibrinogenpräparate mit relativ niedrigem Salzgehalt zu schaffen, die, wie weiter oben beschrieben, trotzdem problemlos bei Raumtemperatur zu gebrauchsfertigen, relativ dünnflüssigen Gewebeklebstofflösungen (mit einem Fibrinogengehalt von mindestens 70 mg/ml) rekonstituiert werden können, und gut zellverträglich sind.
Bisher bekannt gewordene Präparate sind entweder bei Raumtemperatur gut löslich, jedoch zellschädigend (Beriplast®, Biocol®, Bolheal HG-4®) oder gut zellverträglich, jedoch erst bei erhöhter Temperatur - vorzugsweise bei 37°C - rekonstituierbar (Tissucol®).
Die erfindungsgemässen Präparate können aufgrund ihrer Zusammensetzung auch als virussichere Präparate zur Verfügung gestellt werden, die sich auch trotz Vorbehandlungen zu Inaktivierung und/oder Abreicherung von Viren gut lösen. Besonders wirksame Behandlungsverfahren sind mehrstufige Hitzebehandlungsverfahren, z.B. Dampfbehandlung bei 60°C und 80°C gemäss EP-159 311 oder aber Kombinationen von chemischen und/oder physikalischen Behandlungsverfahren.
Besonders bevorzugt ist ein Hitzebehandlungsverfahren bevor die löslichkeitverbessernde Substanz dem Präparat zugesetzt wird und gegebenenfalls eine Nanofiltration vor dem Abfüllen in die Endbehälter.
Vorzugsweise enthält das erfindungsgemässe Präparat weiterhin Faktor XIII, aber auch Fibronektin und gegebenenfalls geringe Mengen an Plasminogen, was u.a. für den Verlauf der Wundheilung von Vorteil sein kann.
Andererseits kann in bestimmten Fällen auch ein erfindungsgemässes Präparat im wesentlichen nur aus Fibrinogen bestehen, also als einzige Wirksubstanz Fibrinogen enthalten.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform betrifft einen Gewebeklebstoff auf Basis von Fibrinogen und einem Plasminogen-Aktivator-Inhibitor oder Plasmininhibitor, wie Aprotinin, α2-Plasmininhibitor, α2-Makroglobulin und dergleichen. Die gebrauchsfertige Gewebeklebstofflösung enthält im allgemeinen 70 bis 120 mg Fibrinogen, gegebenenfalls 0,50 bis 50 E Faktor XIII, gegebenenfalls 0,5 bis 15 mg Fibronectin, 0 bis 150 µg Plasminogen und 0 bis 20.000 KIU Aprotinin, vorzugsweise 1.000 bis 15.000 KIU Aprotinin pro ml. Ein bevorzugtes Präparat enthält weiters geringe Tensidkonzentrationen zur besseren Benetzbarkeit des lyophilisierten Präparates bzw. zur Verbesserung der tiefgefrorenen Präparate.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1: Verflüssigungstemperaturen verschiedener tiefgefrorener Gewebeklebstofflösungen
Ein virusinaktiviertes (dampfbehandeltes) Gewebeklebstoffpräparat wurde nach an sich bekannten Methoden (vgl. AT-B-369 653, EP 0 345 246) folgendermassen hergestellt:
Ein Plasmakryopräzipitat aus gepooltem humanem Citratplasma wurde mit einer Pufferlösung (pH 6,5) enthaltend 6,6 g Natriumcitrat.2H2O, 3,4 g NaCl, 10 g Glycin, 25.000 KIE Aprotinin und 200 I.E. Heparin pro 1 bei 2°C gewaschen und zentrifugiert. Der Niederschlag wurde mit einer weiteren Pufferlösung enthaltend 9,0 g Glycin, 1,0 g Natriumcitrat.2H2O, 25.000 KIE Aprotinin und 0,2 g Triton WR 1339, auf eine Proteinkonzentration von 42 g/l eingestellt. Es wurden sodann pro l 4,5 g reines Humanalbumin und 15.000 E Faktor XIII zugesetzt und der pH-Wert auf 7,3 eingestellt. Die Lösung wurde im Ganzen lyophilisiert, auf einen Feuchtigkeitsgehalt von 7,5% eingestellt und unter N2-Atmospäre 10 Stunden lang auf 60°C erhitzt. Das solcherart virusinaktivierte Material wurde mit destilliertem H2O zu einer Proteinkonzentration von 47 g/l gelöst, sterilfiltriert, und nochmals lyophilisiert. Portionen des lyophilisierten Materials wurden mit destilliertem H2O ohne oder mit den in Tabelle 1 angegebenen Zusätzen zu einer Fibrinogenkonzentration von 85 mg/ml gelöst (=gebrauchsfertige Gewebeklebstofflösung), je 2 ml in Röhrchen verfüllt und tiefgefroren.
Die Verflüssigungstemperatur der so erhaltenen tiefgefrorenen Gewebeklebstofflösungen wurde im folgenden Verflüssigungstest bestimmt:
Die tiefgefrorenen Proben werden zunächst in einem auf 10°C temperierten Wasserbad 30 Minuten lang inkubiert. Danach wird die Temperatur in Abständen von 30 Minuten um jeweils 2,5°C erhöht. Nach jeder Inkubationsperiode wird der Aggregatzustand der Proben durch Kippen der Röhrchen beurteilt. Der Übergang vom festen in den flüssigen Zustand erfolgt nicht abrupt, sondern über einen Bereich mehrerer Temperaturstufen, wobei gallertige und zähflüssige Zwischenzustände durchlaufen werden.
Entsprechend diesem Test wird eine Probe erst dann als "flüssig" bezeichnet, wenn sich beim Kippen des Röhrchens praktisch sofort wieder ein waagrechter Flüssigkeitsspiegel einstellt, d.h. wenn die Probe beim Fliessen keinen "Bauch" bildet.
Mit Hilfe dieses einfachen Tests kann beurteilt werden, ob eine Gewebeklebstofflösung bei einer gegebenen Temperatur ausreichend dünnflüssig ist, um problemlos angewendet werden zu können.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt.
Zusätzlich wurde überprüft, ob die angeführten Gewebeklebstofflösungen nach Mischen mit dem gleichen Volumen einer Thrombin-CaCl2-Lösung (4 I.E. Thrombin und 40 µmol CaCl2 pro ml, hergestellt aus Thrombin 500, Immuno AG) wie erwünscht physiologische, undurchsichtige, zähelastische Clots bilden.
Dies war bei allen angeführten Gewebekebstofflösungen der Fall.
Ergebnisse:
zugesetzte Substanz Gruppe bzw. Verbindung Konz. mM Verflüss.- Temp. °C
kein Zusatz (Vergleich) - - 27,5
Benzoesäure (Na-Salz ) Benzol- 200 15
p-Aminobenzoesäure (Na-Salz) Benzol-, Vitamin 25 20
50 12,5
p-Aminosalicylsäure (Na-Salz) Benzol- 50 15
100 10
p-Hydroxybenzoesäur e (Na-Salz) Benzol- 50 15
100 10
Phenylalanin Benzol- 100 20
Procain, HCl Benzol- 50 15
Niacin (Na-Salz) Pyridin- 50 22,5
100 10
Pyridin-, Vitamin 50 12,5
Niacinamid 100 10
200 <10
Picolinsäure Pyridin- 50 22,5
100 10 - 12,5
Pyridoxin, HCl Adermin, Vitamin B6 Pyridin-, Vitamin 50 ≤ 10
Pyridin-2,6-dicarbonsäure.Na Pyridin- 50 10
2-Hydroxypyridin Pyridin- 50 15
100 12,5
3-Hydroxypyridin Pyridin- 200 17,5
4-Hydroxypyridin Pyridin- 50 10
Pyridin-2,3-dicarbon-säure.Na Pyridin- 50 17,5 - 20
Pyridin-3-sulfonsäure.Na Pyridin- 50 20
100 15
200 10
Pyperidin-4 carbon-säureethylester Piperidin 100 20
Pyrimidin Pyrimidin- 50 22,5
100 12,5
Barbitursäure.Na Pyrimidin- 50 10
Uracil Pyrimidin-, Nucleinbase 25 22,5
Uridin Pyrimidin-Nucleosid 50 10
Uridin-5'-phosphat Pyrimidin- 25 10
Thymin Pyrimidin-, Nucleinbase 25 22,5
Cytosin Pyrimidin-, Nucleinbase 25 10
Cytidin Pyrimidin-, Nucelotid 50 12,5
4-Hydroxypyrimidin (4,3H-Pyrimidon) Pyrimidin- 50 10
Morpholin Morpholin- 100 15
α-Pyrrolidon Pyrrol- 50 10-12,5
100 10
Imidazol Imidazol- 100 17,5
200 12,5
Histidin Imidazol- 50 20
100 12,5
Hydantoin Imidazol- 50 22,5
100 10
Pyrazol-3,5-dicarbonsäure Pyrazol- 25 12,5
Phenazon, Antipyrin Pyrazol- 50 12,5
Adenosin Purin-, Nucelosid 25 12,5
Inosin Purin-, Nucleosid 25 12,5
50 10
Adenosin-5'-phosphat Purin-, Nucleotid 6,25 22,5
12,5 10
Guanosin-5'-phosphat Purin-, Nucleotid 6,25 15
12,5 10
Furan-2-carbonsäure, Brenzschleimsäure Furan- 100 17,5
200 10
Furan-3-carbonsäure Furan- 100 22,5
200 12,5
Ascorbinsäure Furan-, Vitamin 50 15
Xanthosin Purin-, Nucleosid 25 12,5
50 10
Beispiel 2: Einfluss von Niacinamid auf die Viskosität von Gewebeklebstofflösungen
Analog zu Beispiel 1 wurden flüssig-tiefgefrorene Gewebeklebstofflösungen (Gehalt an gerinnbarem Protein: 81mg/ml) mit unterschiedlichem Gehalt an Niacinamid hergestellt.
Nach Auftauen wurde die kinematische Viskosität bei verschiedenen Temperaturen in einem Kapillarviskosimeter gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt.
Abhängigkeit der kinematischen Viskosität einer Gewebeklebstofflösung vom Gehalt an Niacinamid bei verschiedenen Temperaturen:
Niacinamid (mM) Viskosität mm2/s (cSt) bei °C
10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 30,0 37,0
0(Vergleich) 812 432 238 107 58,6
25 1152 531 294 184 92,6 54,8
50 850 471 277 184 132 81,3 52,9
100 1035 556 332 216 152 114 73,7 52,0
200 646 424 286 207 152 118 93,5 66,2
Beispiel 3: Einfluss von Pyridoxin.HCl auf die Viskosität von Gewebeklebstofflösungen
Durchführung analog Beispiel 2; Ergebnisse Tabelle 3.
Abhängigkeit der kinematischen Viskosität einer Gewebeklebstofflösung vom Gehalt an Pyridoxin.HCl.
Pyridoxin. HCl (mM) Viskosität mm2/s (cSt) bei °C
12,5 15 17,5 20 22,5 25 30 37
0(Vergleich) 812 432 238 107 59
12,5 695 372 214 97 57
25 945 459 252 159 85 51
50 1151 583 323 196 147 85
100 803 499 315 215 153 116 63 47
Beispiel 4: Einfluss von Niacinamid auf die Rekonstitutionszeit von lyophilisierten Gewebeklebstoffpräparationen
Ein lyophilisiertes, virusinaktiviertes Gewebeklebstoffpräparat wurde bis zum Erhitzungsschritt analog Beispiel 1 hergestellt.
Das Material wurde danach mit destilliertem H2O bzw. wässrigen Niacinamidlösungen unterschiedlicher Konzentration zu einer Proteinkonzentration von 30 g/l gelöst, sterilfiltriert, in Portionen zu je 4,0 ml in sterile Endbehälter (Glasfläschchen) abgefüllt und lyophilisiert.
Nach Rekonstitution mit 1,0 ml H2O oder wässriger Aprotininlösung wurden gebrauchsfertige Gewebeklebstofflösungen mit einem Fibrinogengehalt von 85 mg/ml erhalten. Die benötigten Rekonstitutionszeiten bei Raumtemperatur, unter leichtem Schütteln von Hand, wurden an mehreren Fläschchen jeder Variante bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengestellt.
Aprotinin bis zu einer Konzentration von 3000 KIE/ml im Lösungsmittel hatte auf die Rekonstitutionszeit keinen merklichen Einfluss.
Rekonstitutionszeiten von lyophilisierten Gewebeklebstoffpräparationen in Abhängigkeit vom Gehalt an Niacinamid.
Niacinamid, Endkonzentrat (mM) Rekonstitutionszeit bei RT (Min.)
0 (Vergleich) >20
50 9-11
100 6-8
200 4-5
Beispiel 5: Zellverträglichkeit von erfindungsgemässen Gewebeklebstoffen
Die Gewebeklebstoffpräparationen aus Beispiel 4 wurden nach Redl et al., Med. Welt 36, 769-776, 1985, auf ihre Zellverträglichkeit überprüft. Als Negativkontrolle diente ein bekannt zytotoxisches Gewebeklebstoffpräparat entsprechend EP-A-0 085 923.
Ergebnisse:
Sämtliche Präparationen aus Beispiel 4 (mit einem Gehalt an Niacinamid bis zu 200 mmol/l) erwiesen sich als gut zellverträglich. Das Gewebeklebstoffpräparat entsprechend EP-A-0 085 923 führte hingegen erwartungsgemäss zu schwerer Zellschädigung innerhalb weniger Minuten, wodurch die Empfindlichkeit des Testsystems sichergestellt war.
Beispiel 6:
Ein gereinigtes lyophilisiertes Fibrinogen-Präparat (Bulk-Material) wurde im wesentlichen nach L.A. Kazal et al, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 113, 989-994, 1963, durch Glycinfällung aus einer Fibrinogen enthaltenden Humanplasmafraktion hergestellt.
Dieses Material wurde auf eine Restfeuchte von 7 bis 8 % eingestellt und zur weiteren Virusinaktivierung unter N2-Atmosphäre 10 h lang auf 60°C, und danach 3 h auf 80°C erhitzt.
Die Analyse des Materials ergab folgende Zusammensetzung:
Protein 73,0% (g/g)
Gerinnbares Protein (Fibrinogen) 69,4% (g/g)
Na3-Citrat.2H2O 19,5% (g/g)
Aus Aliquots dieses Materials wurden Lösungen, enthaltend 22 g Fibrinogen und 10 g Humanalbumin pro Liter, pH 7,4, mit unterschiedlichem Gehalt an Niacinamid hergestellt, wobei die Osmolarität der Lösungen durch Zugabe von NaCl auf jeweils etwa 300 mOsm eingestellt wurde.
Nach Sterilfiltration wurden die Lösungen zu je 50 ml in 125 ml-Flaschen gefüllt und lyophilisiert.
Die so erhaltenen lyophilisierten Fibrinogen-Präparationen wurden mit je 50 ml H2O bei Raumtemperatur unter leichtem Umschwenken von Hand gelöst und die Rekonstitutionszeiten bestimmt. Dabei wurde der Endpunkt sehr streng definiert: Eine Präparation wurde erst dann als gelöst betrachtet, wenn im durchscheinenden Licht kein ungelöstes Partikel mehr sichtbar war. Die Ergebnisse (Mittelwerte aus drei Bestimmungen) sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:
Zusatz Niacinamid- Konzentration mmol/l mmol/g Fibrinogen Rekonstitutionszeit bei RT (Min.)
0 (Vergleich) 0 0 21
Niacinamid 50 2,3 13
Niacinamid 100 4,5 7
Das Beispiel zeigt den günstigen Einfluss erfindungsgemässer löslichkeitverbessernder Substanzen auf die Auflösbarkeit von erhitzten lyophilisiertem Fibrinogen-Präparationen, die entsprechend Infusionspräparaten zusammengesetzt und zur optimalen Verträglichkeit nach Rekonstitution etwa isoton sind.
Beispiel 7:
Eine fibrinogenhältige humane Plasmafraktion wurde mit Tween 80 behandelt, wie bereits im wesentlichen in der AU-B-18306/92 beschrieben, um Viren, wie HIV, zu inaktivieren, die möglicherweise im menschlichen Plasma vorkommen können.
Nach dem ersten Virusinaktivierungsschritt wurde das Material weiters durch eine Präzipitation mit Glycin gereinigt, wie in Beispiel 6 beschrieben. Das Präzipitat wurde mit einer 25 mM Natriumzitratlösung pH 7,3 bei 0-2°C gewaschen. Das gereinigte Präzipitat wurde zu einer Lösung von 50g Protein und 10 mmol Natriumzitrat (pH 7.3) pro Liter aufgelöst und lyophilisiert.
Das lyophilisierte Rohmaterial wurde dann auf eine Feuchtigkeit von 7-8% eingestellt und zur weiteren Virusinaktivierung erhitzt. Das Erhitzen erfolgte unter Stickstoffatmosphäre über eine Dauer von 10 Stunden bei 60°C und anschließend von 1 Std. bei 80°C.
Anschließend wurde das Material mit einer Lösung enthaltend 40 mmol Histidin.HCl, 40 mmol Niacinamid, 80 mg Tween 80 und 100 000 KIE Aprotinin/l zu einer Proteinkonzentration von 40 g/l aufgelöst und der pH mit NaOH auf pH 7,3 eingestellt. Virusinaktiviertes humanes Albumin (Fa. IMMUNO) wurde zugesetzt (6 g/l) sowie humaner gereinigter Faktor XIII, welcher nach der Vorschrift der A 1548/93 zur Virusinaktivierung behandelt wurde (15 000 E/l).
Die Lösung wurde steril filtriert und zu je 2,5 ml in sterile Endbehälter (Glasflaschen) abgefüllt und lyophilisiert. Nach Rekonstitution mit jeweils 1,0 ml Wasser oder Aprotininlösung wurde eine gebrauchsfertige Gewebeklebstofflösung erhalten, die pro ml 90 mg Fibrinogen, 2,5 mg Fibronektin, 15 mg Albumin, 100 µmol Histidin und 100 µmol Niacinamid enthielt. Die durchschnittliche Rekonstitutionszeit bei Raumtemperatur wurde wie in Beispiel 4 beschrieben bestimmt und betrug nur 4 Minuten.
Dieses Beispiel zeigt, daß eine Kombination von löslichkeitsverbessernden Substanzen, die erfindungsgemäß eingesetzt werden, sich besonders eignet zur Herstellung von gut löslichen lyophilisierten Gewebeklebstoffpräparationen, die gleichzeitig ein hohes Maß an Virussicherheit garantieren durch die beschriebenen zwei unterschiedlichen und unabhängigen Maßnahmen zur Inaktivierung von Viren im Zuge des Herstellungsverfahrens.

Claims (14)

  1. Lagerstabiles Fibrinogenpräparat in lyophilisierter Form oder in flüssig-tiefgefrorener Form zur raschen Bereitung einer gebrauchsfertigen Gewebeklebstofflösung, dadurch gekennzeichnet, dass das Präparat eine die Löslichkeit von Fibrinogen verbessernde Substanz enthält und diese Substanz ausgewählt ist aus Nukleinbasen, Nukleoside oder Nukleotide und Benzoesäure, p-Aminobenzoesäure (Vitamin H'), p-Aminosalicylsäure, Hydroxybenzoesäure, Hydroxysalicylsäure, Phenylalanin, Prokain, Niacin, Niacinamid, Picolinsäure, Vitamin B6 (Pyridoxin), Hydroxypyridinen, Pyridin-dicarbonsäuren, Pyridinsulfonsäuren, Piperidin-carbonsäureester, Pyrimidin, Barbitursäure, Uracil, Uridin, Uridinphosphaten, Thymin, Cytosin, Cytidin, Hydroxypyrimidinen, Thiamin (Vitamin B1), Morpholin, Pyrrolidon, Imidazol, Histidin, Hydantoin, Pyrazol-dicarbonsäuren, Phenazon, Adenosin, Adenosin-Phosphaten, Inosin, Guanosin-Phosphaten, Brenzschleimsäure (Furan-2-carbonsäure), Ascorbinsäure (Vitamin C) und Xantosin."
  2. Lagerstabiles Fibrinogenpräparat in lyophilisierter Form gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
    (i) die Rekonstitutionszeit bei Auflösen mit Wasser bei Raumtemperatur zu einer Lösung mit einem Fibrinogengehalt von mindestens 70 mg/ml bis zu 15 Minuten, vorzugsweise weniger als 7 Minuten beträgt, und
    (ii) die aus dem Präparat erhaltene gebrauchsfertige Gewebeklebstofflösung nach Mischen mit einer Thrombin-CaCl2-Lösung Fibrinclots mit physiologischer Fibrinstruktur ausbildet.
  3. Lagerstabiles Fibrinogenpräparat in flüssigtiefgefrorener Form gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
    (i) dieses Präparat bei einer Temperatur von 0 bis 25°C, vorzugsweise unter 20°C, zu einer Lösung mit einem Fibrinogengehalt von mindestens 70 mg/ml verflüssigbar ist, und
    (ii) die aus dem Präparat erhaltene gebrauchsfertige Gewebeklebstofflösung nach Mischen mit einer Thrombin-CaCl2-Lösung Fibrinclots mit physiologischer Fibrinstruktur ausbildet.
  4. Präparat nach einem der Ansprüche 1 - 3, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Substanz in der gewählten Konzentration im Präparat keine zytotoxische Wirkung hat.
  5. Präparat nach einem der Ansprüche 1 - 4, dadurch gekennzeichnet, dass die die Löslichkeit von Fibrinogen verbessernde Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe der Nukleinbasen, Nukleoside oder Nukleotide.
  6. Präparat nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der die Löslichkeit von Fibrinogen verbessernden Substanz um Benzoesäure, p-Aminobenzoesäure (Vitamin H'), p-Aminosalicylsäure, Hydroxybenzoesäure, Hydroxysalicylsäure, Phenylalanin, Prokain, Niacin, Niacinamid, Picolinsäure, Vitamin B6 (Pyridoxin), Hydroxypyridine, Pyridin-dicarbonsäuren, Pyridinsulfonsäuren, Piperidin-carbonsäureester, Pyrimidin, Barbitursäure, Uracil, Uridin, Uridin-Phosphate, Thymin, Cytosin, Cytidin, Hydroxyprimidine, Thiamin (Vitamin B1), Morpholin, Pyrrolidon, Imidazol, Histidin, Hydantoin, Pyrazol-dicarbonsäuren, Phenazon, Adenosin, Adenosin-Phosphate, Inosin, Guanosin-Phosphate, Brenzschleimsäure (Furan-2-carbonsäure), Ascorbinsäure (Vitamin C) und Xantosin handelt.
  7. Präparat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz in einer Menge von 0,03 bis 3 mmol, vorzugsweise von 0,7 bis 1,4 mmol/g Fibrinogen enthalten ist.
  8. Präparat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewebeklebstofflösung nach dem Mischen mit dem gleichen Volumen einer Thrombin-CaCl2-Lösung, im wesentlichen bestehend aus 4 I.E. Thrombin und 40 µmol CaCl2 pro ml, nach längstens 10 Minuten bei 37°C einen undurchsichtigen und zähelastischen Fibrinclot ausbilden kann.
  9. Präparat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewebeklebstofflösung keine zytotoxische Wirkung hat.
  10. Präparat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass nach Verdünnen der Gewebeklebstofflösung mit dem gleichen Volumen einer isotonen Natriumchloridlösung keine schädigende Wirkung auf Fibroblasten nachweisbar ist
  11. Gebrauchsfertige Gewebeklebstofflösung, erhältlich durch Rekonstituieren bzw. Verflüssigen des Präparates nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10.
  12. Lyophilisiertes Fibrinogenpräparat, enthaltend eine die Löslichkeit von Fibrinogen verbessernde Substanz, ausgewählt aus der Gruppe der Nukleinbasen, Nukleoside oder Nukleotide oder der folgenden Gruppe:
    Benzoesäure, p-Aminobenzoesäure (Vitamin H'), p-Aminosalicylsäure, Hydroxybenzoesäure, Phenylalanin, Procain, Niacin, Niacinamid, Picolinsäure, Vitamin B6 (Pyridoxin), Hydroxypyridinen, Pyridindicarbonsäuren, Pyridinsulfonsäuren, Piperidin-carbonsäureester, Pyrimidin, Barbitursäure, Uracil, Uridin, Uridin-Phosphaten, Thymin, Cytosin, Cytidin, Hydroxypyrimidinen, Thiamin (Vitamin B1), Morpholin, Pyrrolidon, Imidazol, Histidin, Hydantoin, Pyrazol-dicarbonsäuren, Phenazon, Adenosin, Adenosin-Phosphaten, Inosin, Guanosin-Phosphaten, Brenzschleimsäure (Furan-2-carbonsäure), Ascorbinsäure (Vitamin C) und Xantosin.
  13. Fibrinogenpräparat nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz in einer Menge von 0,12 bis 12 mmol/g Fibrinogen enthalten ist.
  14. Fibrinogenpräparat nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz in einer Menge von 0,28 bis 5,6 mmol/g Fibrinogen enthalten ist.
EP97106568A 1996-04-30 1997-04-21 Lagerstabile Fibrinogen-Präparate Expired - Lifetime EP0804933B2 (de)

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