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Gebiet der Erfindung
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Diese Erfindung betrifft Mikroteilchen,
die durch Sprühtrocknen
hergestellt werden können,
und deren therapeutische Verwendung. Die Erfindung betrifft insbesondere
Fibrin-Versiegelungsmittel.
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Hintergrund der Erfindung
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Fibrin-Versiegelungsmittel ist ein
aus Fibrinogen und Thrombin zusammengesetzter biologischer Klebstoff,
der in großem
Umfang verwendet wird, um die Wundheilung zu unterstützen und
um einen nahtlosen Verschluss von operationsbedingten Wunden bereitzustellen.
Fibrinogen ist das hauptsächliche
Strukturprotein im Blut, das für
die Bildung von Gerinnseln verantwortlich ist.
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Damit eine Gerinnselbildung auftritt,
muss Fibrinogen durch Thrombin, eine Serinprotease, die durch Faktor
Xa in ihre aktive Form umgewandelt wird, proteolytisch gespalten
und in Fibrin-Monomer
umgewandelt werden. Fibrin-Monomere lagern sich zu Fibrillen zusammen
und bilden schließlich
Fasern in einem dreidimensionalen Netzwerk. Die Bildung eines Gerinnsels
erfordert auch die Aktivität
von Faktor XIII. Faktor XIII ist eine Serinprotease, die durch Thrombin
in Gegenwart von Calcium in ihre aktive Form umgewandelt wird. Aktivierter
Faktor XIII (FXIIIa) wandelt dann die nicht-kovalenten Bindungen
zwischen den zusammengelagerten Fibrin-Monomeren durch Transaminierung
in kovalente Bindungen um. Dies macht das Fibrin-Gel weniger anfällig gegenüber einem
proteolytischen Verdau durch Plasmin und erhöht auch die Festigkeit insgesamt
und Steifheit des Gels. Fibrin-Gel wird durch enzymatische und phagozytäre Stoffwechselwege
leicht resorbiert.
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Um diesen Gerinnungsprozess in Form
eines biologischen Klebstoffs zu reproduzieren, enthält die Fibrinogen-Komponente
eines Fibrin-Versiegelungsmittels üblicherweise Faktor XIII und
die Thrombin-Komponente wird in einer Calciumchloridlösung hergestellt.
Die beiden Komponenten werden entweder nacheinander oder gleichzeitig
auf die der Reparatur bedürfende
Stelle aufgetragen, typischerweise mittels einer Spritze oder durch
Aufsprühen.
Fibrin-Versiegelungsmittel haftet leicht an feuchten Oberflächen und
wird, ist es einmal polymerisiert, zu einem halb-steifen, hämostatischen,
fluiddichten Klebstoff, der in der Lage ist, Gewebe oder Materialien
in der gewünschten
Konfiguration zu halten.
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Gegenwärtig werden Fibrin-Versiegelungsmittelprodukte
auf die Wundstelle als Lösungen
aufgetragen, z. B. unter Verwendung einer Doppelspritzen-Vorrichtung,
die das Fibrinogen und das Thrombin in dem Moment, wo sie austreten,
mischt. Der Hauptnachteil von derartigen Abgabesystemen besteht
in einer Gerinnselbildung innerhalb der Vorrichtung, was zu Blockierungen
in Nadeln und Schläuchen
führt.
Die Doppelspritzen-Systeme sind auch umständlich zu befüllen und
zu handhaben. Ferner können
sich möglicherweise,
wenn es ein inadäquates
Mischen der Fibrinogen- und Thrombin-Lösungen gibt, nur schwache Gerinnsel
bilden.
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Viele Wundstellen nässen und
dies kann zu einer signifikanten Anhäufung von Fluid an dem Ort
führen.
Wenn Lösungen
der Komponenten eines Fibrin-Versiegelungsmittels auf solche Stellen
aufgetragen werden, werden sie oftmals weggespült.
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US-A-4427651 offenbart eine versprühbare Zubereitung
für eine
beschleunigte Hämostase
und optimierte biochemische Kontrolle des Verschlusses von Wunden,
welche eine pulverförmige
Mischung von 15–60 Gew.-%
Thrombin, 5–80
Gew.-% eines exsikkativ wirkenden und stabilisierenden Mittels (Albumin,
Globulin und/oder Fibrinogen) und 1–10 Gew.-% Fibrinolyse-Inhibitor
enthält.
Die pulverförmige
Mischung ist in einem niedrig siedenden wasserfreien Lösemittel,
das als Treibmittel verwendet wird, suspendiert.
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WO-A-9213495 offenbart ein lyophilisiertes
Fibrinogen-Pulver, das durch Ausfällen ohne Kontrolle der Teilchengröße hergestellt
wird. Das Pulver wird vor einer Verwendung üblicherweise hydratisiert,
mit den oben beschriebenen Nachteilen. Es wird auch vorgeschlagen,
dass das Pulver direkt verwendet werden kann, wenn das Gefäß oder die
Wunde, die verschlossen werden sollen, klein ist und der Blutverlust
nicht schnell erfolgt. In diesem Falle ist die Reaktion abhängig von
der Anwesenheit von endogenem Thrombin. Bei größeren Wunden wird der stärkere Blutfluss
das endogene Material fortwaschen und es wird keine Gerinnung stattfinden.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Es ist jetzt erkannt worden, dass
das Sprühtrocknen
als Mittel oder Maßnahme
nützlich
ist, um neue, lösliche
Mikroteilchen (einschließlich
Mikrokapseln), welche Fibrinogen oder Thrombin umfassen, zu erhalten.
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Jeweilige Fibrinogen enthaltende
und Thrombin enthaltende lösliche
Mikroteilchen können
zusammen in stabiler trockener Form formuliert werden. Diese Formulierung
kann nachfolgend aktiviert werden, wie gewünscht, um ein Fibrin-Versiegelungsmittel
zu erhalten, das bei der Wundtherapie und -reparatur nach chirurgischen
Eingriffen nützlich
ist. Sie kann die primären
Ziele, gute Flusseigenschaften, eine verstärkte, wirksame Abgabe an den
Ort der Aktivität
und Auflösung
nur an Ort und Stelle, nicht in dem Abgabesystem, erfüllen.
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Beschreibung der Erfindung
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Mikroteilchen, die Fibrinogen oder
Thrombin umfassen, können
durch die in WO-A-9218164, WO-A-9609814 und WO-A-9618388 beschriebenen
Vorgehensweisen hergestellt werden. Diese Sprühtrocknungs- und damit verbundenen
Teilchenhandhabungsprozesse ermöglichen
die Herstellung von löslichen
Protein-Mikrokapseln mit definierter Größenverteilung, z. B. von bis
zu 50 μm
Durchmesser. Wie in jenen Dokumenten beschrieben, können die
Mikro teilchen beispielsweise reproduzierbar hergestellt werden,
z. B. mit 90% oder mehr (bezogen auf die Masse) von bis zu 20 μm, z. B.
1 bis 10 μm,
oder bis zu 5 μm
Größe oder von
Submikron-Größe, sofern
gewünscht.
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Mikroteilchen der Erfindung können durch
Sprühtrocknen
einer Lösung
des Wirkstoffs allein hergestellt werden. Eine alternative Vorgehensweise
umfasst ein gemeinsames Sprühtrocknen,
bei welchem Fibrinogen oder Thrombin und ein anderes wandbildendes
Material formuliert und sprühgetrocknet
werden, wodurch ein Mikroteilchen erhalten wird, bei welchem der
Wirkstoff in die Wand des Teilchens inkorporiert ist.
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Das Fibrinogen oder Thrombin kann
volle Länge
aufweisen oder ein jegliches aktives Fragment davon sein. Fragmente
sind bekannt; siehe Coller et al., J. Clin. Invest. 89: 546–555 (1992).
Fibrinogen-Ausgangsmaterial kann eine eingefrorene Lösung sein,
obwohl ein lyophilisiertes Pulver, das vor einer Sprühtrocknung einer
Rekonstitution bedarf, verwendet werden kann.
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Die Sprühtrocknung von Proteinen in
Gegenwart von Trägersubstanzen,
wie Zuckern (z. B. Saccharose, Lactose oder Mannitol) oder anderen
Proteinen, stabilisiert das Protein von Interesse und stellt auch
deren wirksame Verdünnung
sicher, wenn niedrige Dose benötigt
werden. Der Zucker kann bei der Therapie von Wunden eine vorteilhafte
Wirkung haben.
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Geeignete andere Proteine können in
der Natur vorkommen oder können
rekombinant sein. Sie können
als „wandbildende
Materialien" wirken,
wie in WO-A-9218164, wo verschiedene Beispiele angegeben werden,
beschrieben. Ein bevorzugtes Material ist HSA (menschliches Serumalbumin).
Beispielsweise wird Fibrinogen allein oder in Anwesenheit von variierenden
Mengen von Trägersubstanzen,
wie HSA (z. B. Fibrinogen : HSA-Verhältnisse von 1 : 1, 1 : 3, 3
: 1) und Zuckern (z. B. Mannitol), sprühgetrocknet.
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Die Mikroteilchen dieser Erfindung
können
die physikalischen Eigenschaften aufweisen, die in den drei oben
identifizierten Veröffentlichungen
beschrieben werden, z. B. dass sie glatt und kugelförmig sind,
obwohl die Größe nicht
so kritisch ist, da Einatembarkeit kein wichtiges Kriterium ist.
Es können
bekannte Bedingungen eingesetzt werden, um beispielsweise Mikroteilchen
von z. B. ca. 1,5 μm
oder ca. 10 μm
Durchmesser herzustellen, welche eine optimale Rückgewinnung von einem der beiden
Proteine von Interesse sicherstellen können.
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Es ist festgestellt worden, dass
durch Sprühtrocknen
von Fibrinogen hergestellte Mikroteilchen überraschend wirksam und löslich sind.
Die Verwendung von sprühgetrockneten
Fibrinogen-Zubereitungen
kann dementsprechend in Krankenhauseinrichtungen besonders vorteilhaft
sein, da die Solubilisierung von gefriergetrocknetem Fibrinogen
15 min oder länger
dauern kann und üblicherweise
ein Erwärmen
erfordert. Dies ist ein geschwindigkeitslimitierender Schritt und
kann bei der Verabreichung von Fibrin-Versiegelungsmittel-Zubereitungen an
Patienten eine beträchtliche
Verzögerung
bewirken.
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Die Konzentration der Thrombin-Komponente
im Fibrin-Versiegelungsmittel ist relativ gering (z. B. 150 μg Thrombin
pro 40 mg Fibrinogen). Dementsprechend wird Thrombin vorzugsweise
mit Trägersubstanzen, wie
HSA, Saccharose, Lactose oder Mannitol, in verschiedenen Anteilen
sprühgetrocknet.
Dies stellt eine homogene Formulierung bereit, wie sie detaillierter
in der Anmeldung Nr. PCT/GB97/00953 beschrieben wird.
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Calciumionen, z. B. als Calciumchlorid,
können
in das Thrombin-Ausgangsmaterial
eingearbeitet werden. Alternativ kann Calciumchlorid den Mikrokapseln
nach der Verarbeitung zugesetzt werden.
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Mikroteilchen der Erfindung können sterilisiert
werden, sofern erforderlich oder gewünscht. Sterile Verarbeitung,
Bestrahlung mit γ-Strahlen
und Ethylenoxid sind Beispiele von geeigneten Techniken.
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Obwohl die Komponenten der Mikrokapseln
bei einem Fibrin-Versiegelungsmittel
der Erfindung vorzugsweise wasserlöslich sind und die Mikroteilchen
vorzugsweise durch Sprühtrocknen
einer geeigneten Lösung
erhalten werden, können
die Mikroteilchen, die erhalten werden können, rieselfähig, diskret
oder einzeln und im wesentlichen wasserfrei sein. Dies bedeutet,
dass die Komponenten eines erfindungsgemäßen Fibrin-Versiegelungsmittels
nicht aktiviert werden, bis sie benetzt werden, z. B. indem sie
am Ort der Wunde mit Flüssigkeit
in Kontakt kommen. Die Wirkstoffe können dementsprechend als eine
trockene Mischung abgegeben werden, obwohl ein getrenntes Auftragen
der verschiedenen Mikroteilchen ebenfalls in Betracht gezogen wird.
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Ein Fibrin-Versiegelungsmittelprodukt
in Form eines trockenen Pulvers kann von besonderem Wert sein, wenn
ein Auftragen auf eine große
Oberfläche
erforderlich ist. Dies umfasst operative Eingriffe und die Reparatur
von verletzungsbedingten Schäden
an verschiedenen Organen, wie der Leber und der Milz. Eine weitere
vorteilhafte Anwendung besteht bei der Hauttransplantation für Patienten
mit Verbrennungen und speziell, wenn Hautepidermislagen in vitro
kultiviert und dann auf die Wundstelle transferiert werden. Die
Verwendung von Fibrin-Versiegelungsmittel hat sich bei der letzteren
Indikation als besonders wirksam erwiesen bei Patienten mit schweren
Verbrennungen, da eine biologisch verträgliche Verankerung für Hauttransplantate
bereitgestellt wird. Es kann auch bei der Behandlung von topischen
Geschwüren
geeignet sein.
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Produkte der Erfindung können im
wesentlichen trocken sein. Dies bedeutet, dass sie mit absorbierenden
Materialien formuliert werden können,
was unter anderem gegenüber
flüssigen
Fibrin-Versiegelungsmitteln
den Vorteil hat, dass das Produkt am Wirkort, z. B. für eine Hämostase,
getrocknet und auf konzentriert wird. Ein geeignetes derartiges
Material ist Carboxymethylcellulose.
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In die Formulierung kann auch ein
NO-Fänger
oder, allgemeiner, ein jegliches Material, das die Aggregation von
Gerinnseln fördert,
ihren Zusammenbruch hemmt oder die Fibrin-Lyse hemmt, aufgenommen
werden. Ein Material, wie Albumin, verfügt über SH-Gruppen. Diese können NO aus dem Ort der Aggregation
entfernen und folglich die Gerinnselbildung verstärken.
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Wie in WO-A-9609814 detaillierter
beschrieben, können
sprühgetrocknete
Mikroteilchen funktionelle Gruppen beibehalten, die für das Binden
von therapeutischen Mitteln zur Verfügung stehen. Im Rahmen dieser Erfindung
kann an die Mikroteilchen ein Arzneimittel gebunden werden, sofern
gewünscht
am Ort der Anwendung. Folglich kann beispielsweise ein zytotoxisches
Arzneimittel verwendet werden, wo gewünscht wird, Hautkrebs zu behandeln.
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Andere Arzneimittel, die in Produkte
der Erfindung aufgenommen werden können, z. B. jene, die Fibrinogen
enthalten, sind Gerinnungsfaktoren, wie die Faktoren VII, VIII,
IX, X und XIII und von Willebrand-Faktor. Diese können durch
gemeinsames Sprühtrocknen
inkorporiert werden.
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Es ist unlängst beobachtet worden, dass
Mikrobläschen
aus denaturiertem Albumin sich vorzugsweise an geschädigtes Endothel
anheften. Dies legt nahe, dass Produkte der Erfindung sich an Wundstellen
anhäufen
werden, nicht nur aufgrund der Aktivierung von Fibrinogen, sondern
auch, wenn es eine Albumin-Komponente des Mikroteilchens gibt.
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Das folgende Beispiel veranschaulicht
die Erfindung.
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Beispiel
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Es wurde ein Fibrin-Versiegelungsmittel
hergestellt. Dieses umfasste eine trockene Pulvermischung von Mikroteilchen,
die Fibrinogen bzw. Thrombin umfassten.
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Fibrinogen (SNBTS) wurde mit 600
mg Saccharose formuliert. Die Sprühtrocknung wurde unter Verwendung
eines Mini Spray Dryer-Geräts mit einem
Sammelgefäß ausgeführt. Die
Bedingungen waren, wie folgt:
| Einlasstemperatur: | 100°C |
| Auslasstemperatur: | 65°C |
| Zerstäubungsdruck: | 1,0
bar |
| Zerstäubungsart: | Schlick
970/0 |
| Einspeisrate: | 1
g/min |
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Es wurde eine Trägersubstanz-Endbeladung von
20% erzielt. Die unter Verwendung eines kinetischen Assays nachgewiesene
Aktivität
betrug 13,88 mg/100 mg. Die theoretische Aktivität beträgt 10 mg/100 mg. Dies zeigte
eine vollständige
Bewahrung der biologischen Aktivität des Fibrinogens an.
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Getrennt davon wurde 1 g D-Mannitol
(Roquette, ESEX4) in 10 ml 40 mM CaCl2 gelöst. Die
resultierende Lösung
wurde verwendet, um 1 Fläschchen
Thrombin (SNBTS) zu rekonstituieren. Die verwendeten Sprühtrocknungsbedingungen
waren wie oben mit der Ausnahme, dass die Auslasstemperatur ca.
62°C betrug
und die Einspeisrate auf 0,75 g/min verringert wurde.
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Ein Thrombin-Gerinnungsassay enthüllte eine
Thrombin-Aktivität
von 91,86 Einheiten/100 mg. Ein Vergleich ergab eine günstige Übereinstimmung
mit der theoretischen Aktivität
von 93 Einheiten/100 mg.
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Die jeweiligen Fibrinogen und Thrombin
enthaltenden Mikroteilchen wurden unter Bildung einer 50 : 50-Mischung
in einem Glasfläschchen
gemischt. Das Fläschchen
wurde 20 min auf einen Walzenmischer gelegt.
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Die Mischung wurde in verschiedenen
Mischungsmengen in einem Fleisch-Haftungs-Assay ausgewertet. Jeder
Assay erfordert zwei Abschnitte Leber (2,5 cm × 2,5 cm). Ein Leber-Abschnitt
wird auf einem Stück
Karton angeheftet. Beide Abschnitte werden in Aluminiumfolie eingeschlagen
und 20 min bei 37°C
inkubiert.
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Der lose Leberabschnitt wird auf
einen Baumwollfaden aufgefädelt.
Auf die Oberfläche
beider Leber-Abschnitte wird eine Lösung von 5% menschlichem Serumalbumin
aufgetragen, gefolgt von der in Form von trockenem Pulver vorliegenden
Mischung von Fibrinogen und Thrombin (Fibrin-Versiegelungsmittel).
Die beiden Leber-Abschnitte werden zusammengesetzt und bei 37°C 10 min
inkubiert.
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Die Leber-Abschnitte werden dann
an einer Klammer aufgehängt
und an dem Baumwollfaden wird ein Haken befestigt. An dem Haken
werden Gewichte angebracht und das aufgehängte Gesamtgewicht wird verwendet,
um die Zugfestigkeit der in Form eines trockenen Pulvers vorliegenden
Fibrin-Versiegelungsmittel-Mischung in mg/mm2 zu
berechnen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben.
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