EP0112872A1 - Neue glycerinderivate zur synthese von phospholipiden - Google Patents

Neue glycerinderivate zur synthese von phospholipiden

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Publication number
EP0112872A1
EP0112872A1 EP83902086A EP83902086A EP0112872A1 EP 0112872 A1 EP0112872 A1 EP 0112872A1 EP 83902086 A EP83902086 A EP 83902086A EP 83902086 A EP83902086 A EP 83902086A EP 0112872 A1 EP0112872 A1 EP 0112872A1
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EP
European Patent Office
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alkyl
carbon atoms
benzyl
group
amino
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Pending
Application number
EP83902086A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hansjörg EIBL
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Original Assignee
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
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Filing date
Publication date
Application filed by Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV filed Critical Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Publication of EP0112872A1 publication Critical patent/EP0112872A1/de
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    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/09—Esters of phosphoric acids
    • C07F9/091—Esters of phosphoric acids with hydroxyalkyl compounds with further substituents on alkyl
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
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    • C07C43/03—Ethers having all ether-oxygen atoms bound to acyclic carbon atoms
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    • C07C43/1785—Unsaturated ethers containing hydroxy or O-metal groups having more than one ether bound
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    • C07F9/24—Esteramides
    • C07F9/2404—Esteramides the ester moiety containing a substituent or a structure which is considered as characteristic
    • C07F9/2408—Esteramides the ester moiety containing a substituent or a structure which is considered as characteristic of hydroxyalkyl compounds

Definitions

  • the invention relates to new glycerol derivatives for the synthesis of phospholipids, such as diester, monoester, monoether, ether / ester and diether phospholipids and corresponding phosphoric acid amide analogs.
  • Glycerin phosphatides are extremely important biologically and technically. Isolating pure, uniform glycerol phosphatides from natural tissues is extremely difficult and costly. Their synthesis is particularly problematic when glycerol phosphatides are to be produced in which glycerol with very specific radicals should be acylated in a very specific position.
  • Another disadvantage of this method is that during the acy lation step, a migration of the phosphoric acid residue from the 3 to the 2 position takes place to a considerable extent. Rearrangements of both fatty acids and phosphate residues can also occur during the reacylation of monoacylglycerol phosphoric acid esters (cf. A. Plückthun and EA Dennis, Biochemistry (1982), 21, 1743 - 1750; H. Eibl, Chem. Phys. Lipids ( 1980), 26, 405-429; H. Eibl, Liposomes: From Physical Structure to Therapeutic Application: Chapter 2: Phospholipid Synthesis (1981), 19-59; CG Knight, Ed., Elsevier, Amsterdam).
  • the invention is therefore based on the object to provide starting materials and ways of producing glycerol phosphates (phospholipids) in which the problems mentioned do not occur and which have a defined distribution of acyl, alkyl and phosphate residues over positions 1, 2 and 3 of the Allow glycerol molecule. This object is achieved with the present invention.
  • the invention relates to glycerol derivatives of For my I, II and III
  • Z is methyl, optionally a phenyl radical-containing alkyl with a CC multiple bond in the ⁇ -position, benzyl or an equivalent of a physiologically compatible cation, preferably methyl
  • R 1 and R 2 are identical or different and a hydrogen atom
  • R is alkyl having 1 to 24 carbon atoms or halogen, hydroxy or carboxyalkyl having 2 to 24 carbon atoms, where alkyl can be straight-chain or branched and can contain double or triple bonds , and can be substituted by cycloalkyl having 3 to 6 carbon atoms or by aryl radicals, and in which a hydroxyl and / or carboxy group can also contain a protective group
  • An alkyl group can be branched or, preferably, straight chain and can contain double or triple bonds.
  • An alkyl group with a double bond is, for example, the allyl radical serving as a protective group.
  • Cycloalkyl is, for example, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, methylcyclopentyl and preferably cyclohexyl.
  • An aryl radical is in particular one having 6 to 14 carbon atoms, preferably naphthyl- (1) or - (2), and especially phenyl.
  • An alkyl group substituted with a phenyl radical is, for example, the benzyl group serving as a protective group.
  • An acyl group -COR is derived in particular from saturated and unsaturated natural fatty acids, such as, for example, behenic, lauric, stearic, palmitic, myristic, capric or arachidic acid, and oleic, linoleic or arachidonic acid and more unsaturated fatty acids.
  • Halogen can be fluorine, bromine or iodine and is especially chlorine.
  • a physiologically acceptable cation Z is preferably a mono-, di- or trivalent physiologically acceptable cation, such as. As sodium, potassium, calcium and especially lithium. If Z is alkyl with ⁇ -unsaturation, it is preferably alkyl or its homologues.
  • Protecting groups for the hydroxyl group are, for example, benzyl, allyl, trityl, tetrahydropyranyl, mesyl and tosyl; for the carboxy group, for example, tert-butyl.
  • the precursors of the compounds, of the formulas I, II or III with free hydroxyl groups on the phosphorus can be obtained analogously to a synthetic route known for glycerol derivatives (cf. for example D. Arnold, HU Weltzien and O. Westphal, Liebigs Ann. Chem. 709 (1967 ), 234 to 239; HU Weltzien and O. Westphal, Liebigs Ann. Chem. 709 (1967), 240 to 243; K. Eibl and 0. Westphal, Liebigs Ann. Chem.
  • the compounds of formula I lead to phospholipids of natural configuration (sn-3-phosphates), those of formula II and III to compounds with non-natural configurations (sn-1- or -2-phosphates).
  • glycerol derivatives mentioned above and below can exist both as optically pure stereoisomers and as racemates.
  • the methyl group in formulas I, II and III is superior to corresponding benzyl groups in many respects. It has sufficient stability for the necessary ones Reaction steps, for example the phosphoric acid methyl esters of the formulas I, II and III are stable under catalytic hydrogenolysis, acidic trityl and propenyl elimination under the selected conditions. With lithium bromide, the methyl group can be removed easily and without destroying the phospholipid molecule.
  • the invention therefore also relates to a process for the further processing of the compounds of the formulas I, II or III for the preparation of phospholipids, which is characterized in that
  • Lithium bromide demethylated, or d) for the preparation of mono-ether phospholipids starts from a compound in which R 1 and R 2 are different and R 1 is alkyl, benzyl, allyl or trityl, R 2 is alkyl, benzyl or allyl, one radical R 1 or R 2 is an alkyl group, and demethylated with lithium bromide, or e) for the preparation of ether / ester phospholipids, starts from a compound in which R 1 and R 2 are different and R 1 is alkyl, benzyl, allyl or trityl be means R 2 is alkyl, benzyl or allyl, where a radical R 1 or R 2 is an alkyl group, splits off a benzyl, allyl or trityl group R 1 or R 2, acylates the resulting hydroxyl group, and then demethylates with lithium bromide, or f) for the preparation of diether phospholipids from
  • a compound obtained according to a) to f) cleaves off protective groups which are known per se and / or aminates the phosphorus-containing radical or converts it to another phosphorus-containing radical
  • the cleavage of benzyl, allyl or trityl can also be carried out after the amination or conversion into another phosphorus-containing radical.
  • the processes can also be carried out by starting from a product obtained by one of the process steps and carrying out the remaining process steps. Taking into account all residues present in the molecule, it is also possible, for example, to interchange the order of the individual process steps.
  • acylation of a free hydroxy group can be carried out by Reaction with acid chlorides in the presence of triethylamine or pyridine can be carried out (cf. H. Eibl and 0. Westphal, Liebigs Ann. Chem. 709 (1967), 244).
  • acylation methods known per se for example as described by Gupta et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74 (1977), 4315).
  • Acy lation is particularly easy with free fatty acid and dicyclohexylcarbodiimide in the presence of dimethylaminopyridine.
  • the trityl group is cleaved off under weakly acidic conditions, preferably at a pH of 4 to 6, it being easy to determine the most favorable value taking into account the other substituents in the molecule.
  • the allyl and benzyl protective groups are completely stable.
  • the reaction can be carried out in an aqueous or aqueous-organic medium, but also in a purely organic medium, for example in absolute ethanol, in the presence of HCl or H 2 SO 4 .
  • the organic solvent can be a
  • the reaction particularly when working in a two-phase system, advantageously takes place with vigorous stirring.
  • the temperature is generally 20 to 80 ° C.
  • a higher alcohol such as propanol (2), in a small amount.
  • the benzyl group is split off by catalytic hydrogenolysis.
  • the reaction conditions correspond to the usual conditions.
  • the hydrogenolysis is carried out in an inert solvent, such as ethanol, in the presence of a palladium or platinum / palladium catalyst, preferably at room temperature and under normal pressure (cf. H. Eibl et al, Liebigs Ann. Chemie, 738 (1970), 161).
  • the cleavage of the allyl group (rearrangement into propenyl and subsequent cleavage of propenyl) can be carried out by two different methods, namely 1) under alkaline conditions, such as with potassium tert-butoxide in dimethylformamide and subsequent cleavage with bromine in buffered solution at a pH - Value around 5 to 6, or 2) by rearrangement in the presence of a palladium (carbon) catalyst to form the propenyl group which spontaneously cleaves under these conditions, expediently in 80% methanol, which in the aqueous phase is 20% Contains formic acid, is carried out at reflux temperature. In general, variant 1, i.e. H. cleavage with bromine is preferred.
  • Iodine can also be used to split off the propenyl group in the 1 position (Eibl and Lands, Biochemistry 9 (1970), 423). However, while the propenyl group cannot be split off in the 2-position with iodine, such a split-off can surprisingly be carried out completely and in a few minutes using bromine.
  • the methyl phosphoric acid is demethylated with lithium bromide by boiling in a suitable organic solvent, preferably in methyl ethyl ketone.
  • the amination of the residue containing phosphorus can be carried out in a manner known per se (cf., for example, BH Eibl and A. Nicksch, Chem. Phys. Lipids, 22 (1978), 1; W. Diembeck and H. Eibl, Chem. Phys Lipids, 24 (1979), 237), as well as the subsequent alkylation of a free amino group.
  • Compounds of the formula I and II according to the invention are also of great importance because of their particular effectiveness in the growth of tumors.
  • R 1 denotes the radical - (CH 2 ) m -CH 3 , where m is 13-19
  • R 3 is alkyl with 1 to 12 carbon atoms, alkyl with 2 to 11 carbon atoms substituted by hydroxy or trityloxy, alkyl substituted with carboxy or tert-butyloxycarbonyl to 1 to 11 carbon atoms, 2- (amino- or tert-butyloxycarbonylamino) -2-tert-butyloxycarbonylethyl, 1,2-dihydroxy- or 1,2-isopropylidenedioxy-propyl, pentahydroxy- or pentabenzyloxy-cyclohexyl, or by bromine, amino, methylamino, dimethylamino, trimethylammonio, tert.- Butyl
  • Lyso compounds (1-alkyl-2-OH) according to the invention are based in part on a completely new active principle. They are not detoxified by acyltransferases or only very slowly. This is based on some of the lyso compounds according to the invention in which the radical R 3 z. B. one by
  • acyltransferases no longer attack; Phosphorus lipases A 2 are still attacking, but the acyltransferases can no longer reactylate.
  • Residue - (CH 2 ) m -CH 3 in which m is 13 to 19 and R 2 denotes an acyl residue COR, act as a precursor of the above-mentioned tumor-active substances in natural form. With phospholipase A 2 they go into the active substances in vivo.
  • the 1-alkyl-2-acylglycerol derivatives are not hemolytic; they can therefore be dosed higher without any problems. It is advantageous to use matrix molecules with stable ether structures that are not cleaved by phospholipase A 2 , such as in particular, for. B. 1-octadecyl-2-oleyl compounds.
  • the effectiveness of compounds on the growth of tumors is expedient on tumors in experimental animals proven.
  • Various experimental tumors are used for this, for example the Ehrlich-Ascites tumor, a methylcholanthrene-induced tumor and a myeloma tumor in mice, and also a chemically induced rat tumor.
  • the anti-tumor substances are administered parenterally into the tumor-bearing test animals. Intravenous and intra- or subcutaneous administration is preferred. Oral applicability is with a correspondingly higher dosage of the anti-tumor agent and with a physiologically compatible preparation, for. B. in capsules, not excluded.
  • the invention therefore also relates to medicaments which contain one or more of the abovementioned tumor growth-inhibiting compounds of the formula I or II as active ingredient.
  • these medicaments may also contain, in addition to the compounds of the formulas I and II, to assist therapy, if appropriate, provided that these, together with the compounds according to the invention, do not show any undesirable side effects.
  • the dosage and application essentially correspond to the conditions given for the anti-tumor agents of DE-OS 2 619 686, but due to the higher effectiveness, lower doses and / or less frequent administration can also be considered. In the case of parenteral administration, it has proven expedient to use about 0.05 to 5 mg / kg of body weight as the dosage.
  • One which has proven to be a particularly favorable pharmaceutical composition is one in which the active ingredient component according to the invention consists of a mixture of about 80-95% by weight of 1-alkyl-2-acyl compound and about 20-5% by weight of 1-alkyl -2-OH connection exists. Such a composition is not hemolytic due to the higher content of 1-alkyl-2-anyl compound.
  • the process according to the invention is a very selective, simple and economical method for the production of phospholipids, which is particularly important for the stereo- and position-specific preparation of glycerol phosphatides with two or three different radicals.
  • the following examples illustrate the invention without restricting it.
  • the starting product is 3,4-isopropylidene-D-mannitol (CF Wiggins, J. Chem. Soc. 13, 1946).
  • a solution of 0.1 mol in 1 l of toluene is mixed with 0.5 mol of K-tert-butoxide and boiled under reflux.
  • 0.5 mol of benzyl chloride is added dropwise with stirring.
  • TLC control After completion of the reaction (TLC control), the reaction mixture is extracted with water and the toluene phase is spun in. The residue is taken up in 1 l of methanol / 2-propanol 1: 1 (v / v) for deacetonation, 50 ml of 2N-H 2 SO 4 are added and the mixture is boiled under reflux.
  • 1, 2,5,6-tetrabenzyl-D-mannitol (0.1 mol) is dissolved in 500 ml of benzene, and lead tetraacetate (approx. 0.1 mol) is added in portions until the starting product is completely converted (TLC control) . It is washed twice with 500 ml of water each time, the benzene phase is rotated in and the residue is taken up in 500 ml of methanol. The solution of the aldehydes in methanol is added in portions NaBH 4 (approx. 0.1 mol) was added. After the reaction has ended, 500 ml of diisopropyl ether are added and the mixture is washed with water. The diisopropyl ether phase is spun in and the residue is chromatographed on silica gel. The yield of 1,2-dibenzyl-sn-glycerol is 95%; Rotation value (in substance).
  • 1,2-dibenzyl-sn-glycerol (C 14 H 20 O 3 ; 272.35) calcd. C 74.97 H 7.40 found. C 74.91 H 7.40.
  • 1,2-Dibenzyl-sn-glycero-3-phosphomethyl-N-BOC-serine tert-butyl ester (0.1 mol) are dissolved in 400 ml THF and with 10 g Pd / C (10% Pd on activated carbon ) and 1 g of palladium black. The mixture is left under stirring under a H 2 atmosphere until the H 2 uptake is complete. The reaction is quantitative. The catalyst is filtered off and the solvent is removed in vacuo. The oily residue is directly implemented further.
  • the intermediates with two free hydroxyl groups in the sn-1 and sn-2 positions of the glycerol can now be used with the desired fatty acids are implemented, for example with palmitic acid or with oleic acid.
  • 0.1 mol are dissolved in 300 ml of methylene chloride, the fatty acids (0.25 mol) in 200 ml of methylene chloride, with dicyclohexylcarbodiimide (0.25 mol) and 4-dimethylaminopyridine (0.05 mol) are added.
  • the precipitated urea is filtered off with stirring at 20 ° C., washed with water and the methylene chloride phase is spun in. The residue is purified on silica gel by chromatography. The yield of acylated product is 95%.
  • the residue mainly 1-trityl-2-benzyl-sn-glycero-3-phosphodichloride, is taken up in 500 ml of THF and triethylamine (0.3 mol) is added.
  • triethylamine 0.3 mol
  • bromoalkanols 0.2 mol
  • methanol 1 mol
  • the methanolysis is quickly completed at 30 ° C (approx. 2 hours).
  • 500 ml of diisopropyl ether are added and the organic phase is extracted with water.
  • the diisopropyl ether phase is spun in.
  • the oily residue (0.1 mol) from a) is concentrated in 500 ml CH 3 OH, the 5 ml. Contain H 2 SO 4 , taken up and heated to 50 ° C. The reaction is complete after 10 minutes, the mixture is cooled to 0 ° C. and the crystal is filtered linen trityl methyl ether. After the addition of chloroform, 500 ml, the mixture is washed with 500 ml of 1M NaHCO 3 (pH of the aqueous phase should be at least 5). The chloroform phase is dried over Na 2 SO 4 and evaporated.
  • the residue from a) is taken up in 500 ml of methylene chloride and mixed with palmitic acid (0.25 mol). After addition of dicyclohexylcarbodiimide (0.25 mol) and 4-dimethylaminopyridine (0.05 mol), the mixture is stirred at 20 ° C. for 3 hours. The precipitated urea is filtered off, the filtrate is washed with water and the methylene chloride is removed in vacuo. The residue is chromatographed on silica gel. The yield is 75% based on 1-trityl-2-benzyl-sn-glycerol.
  • the amination of the bromoalkyl esters can be carried out in a manner known per se (cf., for example, BH Eibl and A. Nicksch, Chem. Phys. Lipids 22 (1978) 1; W. Diembeck and H. Eibl, Chem. Phys. Lipids 24 (1979) 237).
  • the reaction with the amine e.g. B. trimethylamine, z. B. in chloroform / propanol (2) (1/1) as a solvent.
  • the phosphoric acid triesters (0.1 mol) from e) are dissolved in 500 ml of chloroform and mixed with 500 ml of 2-propanol which contains trimethylamine (1 mol). After 24 hours at 50 ° C the reaction is complete. The solvent is removed and 500 ml of chloroform, methanol and water are added. The chloroform phase contains 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-N, N, N-trimethylalkanolamine ester. The solvent is removed and the mixture is purified by chromatography. The yields are more than 90%. Monoester phospholipids a) Demethylation
  • the products of the first acylation are demethylated with LiBr; for example, 1-palmitoyl-2-benzyl-sn-glycero-3-phosphomethyl-bromoalkyl ester (0.1 mol) is boiled under reflux with LiBr (0.5 mol) in 500 ml of ethyl methyl ketone. After 60 minutes, the implementation is quantitative.
  • the amination can be carried out as described above under g).
  • 1-Palmitoyl-2-benzyl-sn-glycero-3-phospho-N, N, N-trimethylalkanolamine ester (0.1 mol) are dissolved in alcohol, 1 l, and with 10 g Pd / C catalyst (10% palladium on activated carbon) and 1 g of palladium black. The mixture is stirred until the hydrogen uptake has ended. Debenzylation is quantitative. The catalyst is filtered off and the solvent is removed in vacuo. The residue is taken up in 100 ml of CHCl 3 and precipitated with 400 ml of acetone. The precipitate is filtered off and dried.
  • Mono-ether phospholipids can be prepared in exactly the same way as the mono-ester phospholipids.
  • 1-octadecyl-2-benzyl-sn-glycerol for example, is used as the starting product.
  • Ether / ester phospholipids are obtained if, for example, 1-octadecyl-2-benzyl-sn-glycerol is used as the starting product and the procedure for diester phospholipids, mixed-chain, is used. After phosphorylation a), however, the catalytic debenzylation d) and the second acylation e) take place immediately. Then proceed as described there.
  • 1, 2-diether-sn-glycerols like the 1,2-diester-sn-glycerols, can be converted into the corresponding phospholipids if the same chain procedure is used as for diester phospholipids and process steps b), phosphorylation, e), Demethylation and f), splitting off the protective groups, applies.

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Description

Neue Glycerinderivate zur Synthese von Phospho lipiden
Die Erfindung betrifft neue Glycerinderivate zur Synthese von Phospholipiden, wie Diester-, Monoester-, Mono- äther-, Äther/Ester- und Diäther-phospholipiden und entsprechenden Phosphorsäureamid-Analoga.
Glycerinphosphatide sind biologisch und technisch äußerst wichtige Substanzen. Die Isolierung reiner, einheitlicher Glycerinphosphatide aus natürlichen Geweben ist außerordentlich schwierig und kostspielig. Ihre Synthese ist vor allem dann problematisch, wenn Glycerinphosphatide hergestellt werden sollen, in denen Glycerin mit ganz bestimmten Resten in ganz bestimmter Stellung acyliert sein soll.
E. Cubero Robles et al (Rec. Trav. Chim. 86 (1976),
762; Biochim. Biophys. Acta 187 (1969), 520) beschreiben zum Beispiel eine Synthese von Glycerinphosphatiden mit gemischten Fettsäureresten durch Acylierung von 1-Palmitoyl-sn-glycerin-3-phosphorcholin und Fettsäureanhydriden in Gegenwart von Na2O. Bei diesem Verfahren findet jedoch in hohem Maße ein Austausch der Acylgruppen statt, wodurch die Selektivität, d. h. ganz gezielte Einführung bestimmter Acylreste, in bestimmter Stellung stark vermindert wird (vgl. K. M. Vf. Keough, P. J. Davis, Biochemistry 18 (1979), 1453). Ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens ist es, daß während der Acy lierungsstufe in erheblichem Maße auch eine Wanderung des Phosphorsäurerests aus der 3- in die 2-Stellung erfolgt. Auch bei der Reacylierung von Monoacyl-glycerin phosphorsäureestern können Umlagerungen sowohl von Fettsäuren als auch von Phosphatresten auftreten (vgl. A. Plückthun und E.A. Dennis, Biochemistry (1982), 21 , 1743 - 1750; H. Eibl, Chem. Phys. Lipids (1980), 26, 405 - 429; H. Eibl, Liposomes: From Physical Structure to Therapeutic Application: Chapter 2: Phospholipid Synthesis (1981), 19 - 59; C. G. Knight, Ed., Elsevier, Amsterdam).
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, Ausgangsprodukte und Wege zur Herstellung von Glycerinphos phatiden (Phospholipiden) bereitzustellen, bei denen die genannten Probleme nicht auftreten und die eine definierte Verteilung von Acyl-, Alkyl- und Phosphatresten über die Positionen 1, 2 und 3 des Glycerinmoleküls erlauben. Diese Aufgabe wird mit der vorliegenden Erfindung gelöst.
Gegenstand der Erfindung sind Glycerinderivate der For mein I, II und III
worin Z Methyl, gegebenenfalls einen Phenylrest enthaltendes Alkyl mit einer C-C-Mehrfachbindung in ß-Stellung, Benzyl oder ein Äquivalent eines physiologisch verträglichen Kations, vorzugsweise Methyl, ist, R1 und R2 gleich oder verschieden sind und ein Wasserstoffatom, den Rest R oder den Acylrest -COR bedeuten, in 1- oder 3-Stellung auch Trityl, R Alkyl mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen oder Halogen-, Hydroxy- oder Carboxyalkyl mit 2 bis 24 Kohlenstoffatomen bedeutet, wobei Alkyl geradkettig oder verzweigt und Doppel- oder Dreifachbindungen enthalten kann, und durch Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen oder durch Arylreste substituiert sein kann, und worin eine Hydroxy- und/oder Carboxygruppe auch eine Schutzgruppe enthalten kann, X die Bedeutung O, NH oder N(R 3) besitzt, - und R3, wenn X = 0 ist,
Alkyl mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen oder Halogen-,
Hydroxy- oder Carboxyalkyl oder auch Amino-, Methyl- amino-, Dimethylamino- oder Trimethylammonioalkyl mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen, wobei Alkyl geradkettig oder verzweigt und Doppel- oder Dreifachbindungen enthalten kann, und durch Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen oder durch Arylreste substituiert sein kann, bedeutet, worin eine Hydroxy- und/oder Carboxygruppe auch eine Schutzgruppe enthalten kann, D- oder L-2-tert.-Butyloxycarbonylamino-2-tert.-butyloxy-carbonyläthyl, 1,2- oder 2,3-Isopropyliden-dioxy-propyl, 1,2-, 1,3-oder 2, 3-Dibenzyloxy-propyl, 1,2,3,4,5-Pentabenzyloxy-cyclohexyl oder Aminoalkyl und N-Alkylaminoalkyl mit 2 bis 14 Kohlenstoffatomen in den Alkylresten, worin die Aminogruppen auch Schutzgruppen enthalten können, bedeutet, wenn X = NH ist, Alkyl mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen oder Halogen-, Hydroxy- oder Carboxyalkyl oder auch Amino-, Methylamino-, Dimethylamino- oder Tri- methylammonioalkyl mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen, wobei Alkyl geradkettig oder verzweigt und Doppel- oder Dreifachbindungen enthalten kann, und durch Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen oder durch Arylreste substituiert sein kann, oder 1 , 2-Dihydroxypropyl bedeutet, worin eine Hydroxy- und/oder Carboxygruppe auch eine Schutzgruppe enthalten kann, und, wenn X = N(R3) ist, verschieden oder vorzugsweise gleich ist und Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen oder Halogenalkyl mit 1 bis 12, vorzugsweise 2 bis 12 Kohlenstoffatomen, worin eine Alkylgruppe geradkettig oder verzweigt und Doppel- oder Dreifachbindungen enthalten kann und durch Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen oder durch Arylreste substituiert sein kann, bedeutet.
Eine Alkylgruppe kann verzweigt oder vorzugsweise geradkettig sein und kann Doppel- oder Dreifachbindungen enthalten. Eine Alkylgruppe mit einer Doppelbindung ist zum Beispiel der als Schutzgruppe dienende Allylrest.
Cycloalkyl ist zum Beispiel Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Methylcyclopentyl und vorzugsweise Cyclohexyl.
Ein Arylrest ist insbesondere ein solcher mit 6 bis 14 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Naphthyl-(1) oder -(2), und insbesondere Phenyl. Eine mit einem Phenylrest substituierte Alkylgruppe ist zum Beispiel die als Schutz- gruppe dienende Benzylgruppe. Eine Acylgruppe -COR leitet sich insbesondere von gesättigten und ungesättigten natürlichen Fettsäuren ab, wie zum Beispiel von Behen-, Laurin-, Stearin-, Palmitin-, Myristin-, Caprin- oder Arachinsäure, sowie von öl-, Li- nol- oder Arachidonsäure und von höher ungesättigten Fettsäuren.
Halogen kann Fluor, Brom oder Jod sein, und ist insbesondere Chlor.
Ein physiologisch verträgliches Kation Z ist vorzugsweise ein ein-, zwei- oder dreiwertiges physiologisch verträgliches Kation, wie z. B. Natrium, Kalium, Calcium und insbesondere Lithium. Wenn Z Alkyl bedeutet mit ß-Unsättigung, handelt es sich vorzugsweise um Alkyl oder dessen Homologe.
Schutzgruppen für die Hydroxygruppe sind zum Beispiel Benzyl, Allyl, Trityl, Tetrahydropyranyl, Mesyl und Tosyl; für die Carboxygruppe zum Beispiel tert.-Butyl.
Die Vorstufen der Verbindungen, der Formeln I, II oder III mit freien Hydroxygruppen am Phosphor können analog einem für Glycerinderivate bekannten Syntheseweg erhalten werden (vgl. zum Beispiel D. Arnold, H. U. Weltzien und O. Westphal, Liebigs Ann. Chem. 709 (1967), 234 bis 239; H. U. Weltzien und O. Westphal, Liebigs Ann. Chem. 709 (1967), 240 bis 243; K. Eibl u. 0. Westphal, Liebigs Ann. Chem. 709 (1967), 244 bis 247); vorzugsweise werden sie nach einem der in der deutschen Patentanmeldung P 31 30 867 der gleichen Anmelderin vom 4. August 1981 oder in der deutschen Patentanmeldung "Neue D-Mannitderivate als Ausgangsprodukte zur Synthese von Phospholipiden" der gleichen Anmelderin vom gleichen Anmeldetag für ähnliche Verbindungen bekann ten Verfahren hergestellt. Die Überführung in den Methylester erfolgt dann in an sich bekannter Weise, zum Beispiel durch Umsetzung mit Methanol.
Die Herstellung der Glycerinderivate der Formeln I, II oder III, in denen Z ein Äquivalent eines physiologisch verträglichen Kations ist, kann insbesondere durch Umsetzung des entsprechenden Methylesters (Z = CH3) mit einem Halogenid von Z, z. B. mit Lithiumbromid, erfolgen.
Es hat sich gezeigt, daß man ausgehend von den Zwischenprodukten der Formeln I, II oder III auf einfache und wirtschaftliche Weise Glycerinderivate mit verschiedenen Resten stellungsspezifisch und mit hoher Selektivität herstellen kann.
Die Verbindungen der Formel I führen zu Phospholipiden natürlicher Konfiguration (sn-3-Phosphate), die der Formel II und III zu Verbindungen mit nicht natürlicher Konfiguration (sn-1- oder -2-Phosphate).
Die vorstehend und nachstehend genannten Glycerinderivate können sowohl als optisch reine Stereoisomere als auch als Racemate vorliegen.
Bei zwei gleichkettigen Fettsäuren oder Alkylresten und einem Phosphatrest sind drei Stereoisomere möglich; bei zwei ungleichen Fettsäuren oder Alkylresten und einem Phosphatrest sind sechs Stereoisomere möglich, die alle aus den ZwischenVerbindungen I, II und III erhalten werden können.
Die Methylgruppe in Formel I, II und III ist in vieler Hinsicht entsprechenden Benzylgruppen überlegen. Sie besitzt ausreichende Stabilität für die notwendigen Reaktionsschritte, beispielsweise sind die Phosphor säuremethylester der Formeln I, II und III stabil bei katalytischer Hydrogenolyse, saurer Trityl- und Prope- nylabspaltung unter den gewählten Bedingungen. Mit Lithiumbromid ist die Methylgruppe leicht und ohne Destruktion des Phospholipidmoleküls wieder entfernbar.
Gegenstand der Erfindung ist deshalb auch ein Verfahren zur Weiterverarbeitung der Verbindungen der Formeln I, II oder III zur Herstellung von Phospholipiden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
a) zur Herstellung von Diester-phospholipiden mit gleichen Acylresten von einer Verbindung ausgeht, in der R 1 und R2 = Wasserstoff bedeutet, diese acyliert und danach mit Lithiumbromid demethyliert, oder b) zur Herstellung von Diester-phospholipiden mit ungleichen Acylresten von einer Ausgangsverbindung aus geht, in der R 1 und R2 verschieden sind und R1 Alkanoyl, Benzyl, Allyl oder Trityl und R2 Alkanoyl,
Benzyl oder Allyl bedeutet, wobei ein Rest R1 oder R2 eine Alkanoylgruppe ist, eine Benzyl-, Allyl- oder Tritylgruppe R 1 oder R2 abspaltet, die freiwerdende Hydroxylgruppe acyliert und danach mit Lithiumbromid demethyliert, oder c) zur Herstellung von Monoester-phospholipiden von einer Ausgangsverbindung ausgeht, in der R 1 und R2 verschieden sind und R1 Alkanoyl, Benzyl, Allyl oder Trityl bedeutet, R2 Alkanoyl, Benzyl oder Allyl, wobei ein Rest R 1 oder R2 eine Alkanoylgruppe ist, und mit
Lithiumbromid demethyliert, oder d) zur Herstellung von Monoäther-phospholipiden von einer Verbindung ausgeht, in der R 1 und R2 verschie den sind und R1 Alkyl, Benzyl, Allyl oder Trityl bedeutet, R2 Alkyl, Benzyl oder Allyl, wobei ein Rest R1 oder R2 eine Alkylgruppe ist, und mit Lithiumbromid demethyliert, oder e) zur Herstellung von Äther/Ester-phospholipiden von einer Verbindung ausgeht, in der R1 und R2 verschie den sind und R1 Alkyl, Benzyl, Allyl oder Trityl be deutet, R2 Alkyl, Benzyl oder Allyl, wobei ein Rest R 1 oder R2 eine Alkylgruppe ist, eine Benzyl-, Allyl- oder Tritylgruppe R 1 oder R2 abspaltet, die entstehende Hydroxygruppe acyliert, und danach mit Lithiumbromid demethyliert, oder f) zur Herstellung von Diäther-phospholipiden von einer
Verbindung ausgeht, in der R 1 und R2 Alkyl sind, und mit Lithiumbromid demethyliert,
und wenn erforderlich oder erwünscht, in einer nach a) bis f) erhaltenen Verbindung auf an sich bekannte Weise vorhandene Schutzgruppen abspaltet und/oder den Phosphor enthaltenden Rest aminiert oder in einen anderen Phosphor enthaltenden Rest überführt, wobei die Abspaltung von Benzyl, Allyl oder Trityl auch nach der Aminierung oder Überführung in einen anderen Phosphor enthaltenden Rest erfolgen kann. Nach diesen Verfahren ist auch die Überführung einer Verbindung der Formel I, II oder III in eine andere Verbindung der Formel I, II oder III mit anderen Resten R1, R2, R3 oder Z möglich.
Wenn erwünscht oder zweckmäßig, können die Verfahren auch so durchgeführt werden, daß man von einem nach einer der Verfahrensstufen erhaltenen Produkt ausgeht und die restlichen Verfahrensstufen durchführt. Unter Berücksichtigung aller im Molekül vorhandenen Reste ist es zum Beispiel auch möglich, die Reihenfolge der einzelnen Verfahrensstufen zu vertauschen.
Die Acylierung einer freien Hydroxygruppe kann durch Umsetzung mit Säurechloriden in Gegenwart von Triäthyl amin oder Pyridin durchgeführt werden (vgl. H. Eibl und 0. Westphal, Liebigs Ann. Chem. 709 (1967), 244). Es ist aber auch möglich, nach an sich bekannten anderen Acylierungsmethoden (zum Beispiel wie von Gupta et al, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 74 (1977), 4315 beschrieben) zu arbeiten. Besonders einfach gelingt die Acy lierung mit freier Fettsäure und Dicyclohexylcarbodi imid in Gegenwart von Dimethylaminopyridin.
Die Abspaltung der Tritylgruppe erfolgt unter schwach sauren Bedingungen, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 4 bis 6, wobei der günstigste Wert unter Berücksichtigung der übrigen Substituenten im Molekül leicht eruiert werden kann. Die Allyl- und Benzylschutzgruppen sind hierbei vollkommen stabil. Die Reaktion kann in einem wäßrigen oder wäßrig-organischen, aber auch in einem rein organischen Medium, wie zum Beispiel in absolutem Äthanol, in Gegenwart von HCl oder H2SO4 durchgeführt werden. Das organische Lösungsmittel kann dabei ein mit
Wasser mischbares oder aber auch ein mit Wasser nur teilweise oder nur wenig mischbares inertes Lösungsmittel sein. Die Reaktion erfolgt, insbesondere beim Arbeiten in einem Zweiphasensystem, vorteilhafterweise unter starkern Rühren. Die Temperatur beträgt im allgemeinen 20 bis 80°C. Zur Verbesserung der Löslichkeit kann es zweckmäßig sein, einen höheren Alkohol, wie zum Beispiel Propanol-(2), in kleiner Menge zuzusetzen.
Die Abspaltung der Benzylgruppe erfolgt durch katalytische Hydrogenolyse. Die Reaktionsbedingungen entsprechen dabei den üblichen Bedingungen. Insbesondere führt man die Hydrogenolyse in einem inerten Lösungsmittel, wie zum Beispiel Äthanol, in Gegenwart eines Palladiumoder Platin/Palladium-Katalysators durch, vorzugsweise bei Raumtemperatur und unter Normaldruck (vgl. H. Eibl et al, Liebigs Ann. Chemie, 738 (1970), 161).
Die Abspaltung der Allylgruppe (Umlagerung in Propenyl und nachfolgende Abspaltung von Propenyl) kann nach zwei verschiedenen Methoden erfolgen, nämlich 1) unter alkalischen Bedingungen, wie zum Beispiel mit Kalium tert.-butylat in Dimethylformamid und anschließende Spaltung mit Brom in gepufferter Lösung bei einem pH- Wert um 5 bis 6, oder 2) durch Umlagerung in Gegenwart eines Palladium- (Kohle) -Katalysators unter Bildung der unter diesen Bedingungen instabilen, spontan abspaltenden Propenylgruppe, wobei zweckmäßigerweise in 80 %-igem Methanol, welches in der wäßrigen Phase 20 % Ameisensäure enthält, bei Rückflußtemperatur gearbeitet wird. Im allgemeinen ist die Variante 1, d. h. die Abspaltung mit Brom, bevorzugt. Zur Abspaltung der Propenylgruppe in 1 -Stellung kann auch Jod verwendet werden (Eibl und Lands, Biochemistry 9 (1970), 423). Während aber eine Abspaltung der Propenylgruppe in 2-Stellung mit Jod überhaupt nicht möglich ist, läßt sich eine solche Abspaltung überraschenderweise mit Brom vollständig und in wenigen Minuten durchführen.
Die Demethylierung des Phosphorsäuremethylesters mit Lithiumbromid erfolgt durch Kochen in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, vorzugsweise in Methyläthylketon.
Die Aminierung des Phosphor enthaltenden Restes kann in an sich bekannter Weise erfolgen (vgl. z. B. H. Eibl u. A. Nicksch, Chem. Phys. Lipids, 22 (1978), 1; W. Diembeck und H. Eibl, Chem. Phys. Lipids, 24 (1979), 237) , ebenso die nachträgliche Alkylierung einer freien Aminogruppe. Erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I und II kommt auch eine große Bedeutung aufgrund ihrer besonderen Wirksamkeit auf das Wachstum von Tumoren zu. Es wurde gefunden, daß insbesondere die Glycerinderivate der all gemeinen Formel I und II, in denen R1 den Rest -(CH2)m-CH3, worin m 13 - 19 ist, bedeutet, R2 ein Was serstoffatom und, wenn X = O ist, R3 Alkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, durch Hydroxy oder Trityloxy ധ-substituiertes Alkyl mit 2 bis 11 Kohlenstoffatomen, durch Carboxy oder tert.-Butyloxycarbonyl to-substituiertes Alkyl mit 1 bis 11 Kohlenstoffatomen, 2- (Amino- oder tert.-Butyloxycarbonylamino)-2-tert.-butyloxycarbonyläthyl, 1,2-Dihydroxy- oder 1,2-Isopropylidendioxy-propyl, Pentahydroxy- oder Pentabenzyloxy-cyclohexyl, oder durch Brom, Amino, Methylamino, Dimethylamino, Trimethylammonio, tert.-Butyloxycarbonylamino, tert.-Butyloxycarbonyl-methylamino W-substituiertes Alkyl mit 3-11 Kohlenstoffatomen bedeutet, wenn X = NH ist, R3 Alkyl mit 1 bis
12 Kohlenstoffatomen, durch Brom, Hydroxy, Trityloxy, Amino, Methylamino, Dimethylamino oder Trimethylammonio ധ-substituiertes Alkyl mit 2 - 11 Kohlenstoffatomen, durch Carboxy oder tert.-Butyloxycarbonyl Co-substituiertes Alkyl mit 1 bis 11 Kohlenstoffatomen oder 1,2-Dihydroxy- oder 1,2-Isopropylidendioxy-propyl bedeutet, und, wenn X = N(R 3) ist, R3 verschieden oder vorzugsweise gleich ist und Alkyl mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen oder W-Chloralkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet, eine ausgeprägte tumorwachstumshemmende Wirkung besitzen. Diese Wirkung zeigen sowohl die optisch reinen Verbindungen als auch die Raσemate. Eine besonders gute Wirkung zeigen Verbindungen der Formel II und insbesondere I, in denen R1 n-Octadecyl, R2 Wasserstoff, X = 0 und R3 3-Trimethylammoniopropyl bedeuten.
Die ausgeprägte tumorwachstumshemmende Wirkung der er findungsgemäßen Lyso-Verbindungen (1-Alkyl-2-OH) beruht zum Teil auf einem völlig neuen Wirkprinzip. Sie werden durch Acyltransferasen nicht oder nur sehr langsam entgiftet. Dies beruht bei einigen der erfindungsgemäßen Lysoverbindungen, bei denen der Rest R3 z. B. eine durch
Amino- oder alkylsubstituiertes Amino ധ-substituierte Alkylgruppe mit mehr als 3 Kohlenstoffatomen ist, darauf, daß zwischen P und N mindestens 3 Methylengruppen liegen, wie z. B. in der Gruppierung
In einem solchen Fall greifen Acyltransferasen nicht mehr an; Phosphorlipasen A2 greifen noch an, die Acyltransferasen können aber nicht mehr reacylieren.
Die Verbindungen der Formeln I und II, in denen R1 den
Rest - (CH2)m-CH3, worin m 13 bis 19 ist, und R2 einen Acylrest COR bedeutet, wirken als in natürlicher Form vorliegende Vorläufer der vorstehend genannten tumorwirksamen Substanzen. Sie gehen mit Phospholipase A2 in vivo in die aktiven Substanzen über.
Die 1-Alkyl-2-acyl-glycerinderivate sind im Gegensatz zu den 1-Alkyl-2-OH-Verbindungen, in die sie erst enzymatisch überführt werden, nicht hämolytisch; sie können deshalb problemlos höher dosiert werden. Dabei ist es günstig, Matrixmoleküle mit stabilen Ätherstrukturen zu verwenden, die durch Phospholipase A2 nicht gespalten werden, wie insbesondere z. B. 1-Octadecyl-2-oleyl-Verbindungen.
Die Wirksamkeit von Verbindungen auf das Wachstum von Tumoren wird zweckmäßig an Tumoren in Versuchstieren bewiesen. Hierfür kommen verschiedene experimentelle Tumoren zur Verwendung, beispielsweise der Ehrlich- Ascites-Tumor, ein Methylcholanthren-induzierter Tumor und ein Myelom-Tumor in Mäusen, ferner ein chemisch induzierter Rattentumor. Die Anti-Tumor-Substanzen werden parenteral in die tumortragenden Versuchstiere verabreicht. Bevorzugt wird die intravenöse und die intra- bzw. subkutane Applikation. Auch die orale Applizierbarkeit ist bei entsprechend höherer Dosie rung des Anti-Tumormittels und bei einer physiologisch verträglichen Zubereitung, z. B. in Kapseln, nicht ausgeschlossen.
Gegenstand der Erfindung sind deshalb auch Arzneimittel, die eine oder mehrere der oben genannten tumorwachstums-hemmenden Verbindungen der Formel I oder II als Wirkstoff enthalten. Neben den üblichen pharmazeutischen Konfektionierungs- und/oder Verdünnungsmitteln können diese Arzneimittel neben den Verbindungen der Formel I und II zur Unterstützung der Therapie gegebenenfalls auch noch weitere Wirkstoffe enthalten, sofern diese mit den erfindungsgemäßen Verbindungen zusammen keine unerwünschten Nebenwirkungen zeigen. Die Dosierungsund Anwendungsweise entspricht im wesentlichen den für die Anti-Tumormittel der DE-OS 2 619 686 angegebenen Bedingungen, wobei aber aufgrund der höheren Wirksamkeit auch geringere Dosierungen und/oder eine weniger häufige Verabreichung in Frage kommen können. Als Dosierung hat es sich bei der parenteralen Applikation zweckmäßig erwiesen, etwa 0,05 bis 5 mg/kg Körpergewicht einzusetzen. Um die Anti-Tumormittel über längere Zeit im Kreislauf persistieren zu lassen, ist es häufig sinnvoll, die Mittel täglich oder in 2- bis 3-tägigen Abständen zu applizieren. Als besonders günstige Arzneimittelzusammensetzung hat sich eine solche erwiesen, bei der die erfindungsgemäße Wirkstoffkomponente aus einer Mischung aus ca. 80 - 95 Gew.-% 1-Alkyl-2-acyl-Verbindung und ca. 20 - 5 Gew.-% 1-Alkyl-2-OH-Verbindung besteht. Eine solche Zusammensetzung ist aufgrund des höheren Gehalts an 1-Alkyl-2-anyl-Verbindung nicht hämolytisch.
In den nachfolgenden Schemen A, B und C sind die Möglichkeiten der Variation im Phosphor enthaltenden Rest (polarer Bereich) aufgezeigt, ohne sie darauf zu beschränken (A: Phospholipide; B und C: Phosphatidsäureamide). Ausgehend von den Triphosphosäureestern (A) oder den entsprechenden Phosphorsäureamiden (B, C) können alle wesentlichen Phospholipide natürlicher Membranen oder deren Analoga auf einfache Weise dargestellt werden.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden die bekannten Nachteile der Synthese von Glycerinphosphatiden, insbesondere die Wanderung der Acylreste und/oder des
Phosphorsäurerestes, vermieden. Es hat sich gezeigt, daß die Verbindungen der Formeln I, II und III sehr gute Ausgangsmaterialien zur Herstellung von Glycerinphosphatiden sind, wobei jeder einzelne Verfahrensschritt unter Bedingungen durchgeführt werden kann, durch die die übrigen Substituenten nicht beeinflußt werden.
Zusammenfassend kann also festgestellt werden, daß das erfindungsgemäße Verfahren eine sehr selektive, einfache und wirtschaftliche Methode zur Herstellung von Phospholipiden darstellt, die vor allem für die stereound stellungsspezifische Darstellung von Glycerinphosphatiden mit zwei oder drei verschiedenen Resten von Bedeutung ist. Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter, ohne sie darauf zu beschränken.
Schema A;
Diester-, Monoester-, Äther/Ester-, Monoäther- und Di- ätherphospholipide (R = Glyceringrundkörper mit Resten R1 und R2; X = O) .
Schema B:
Diester-, Monoester-, Äther /Ester-, Monoäther- und Di- ätherglycerinphosphorsäureamide (R = Glyceringrundkörper mit den Resten R1 und R2 ; X = NH) .
Schema C:
Diester-, Monoester-, Äther/Ester-, Monoäther- und Di- ätherglycerin-phosphorsäuredialkylamide (R = Glycerin grundkörper mit den Resten R 1 und R2; X = N (R3) ) .
Beispiele
Diester-Phospholipide gleichkettig
a) 1,2-Dibenzyl-sn-Glycerin
Ausgangsprodukt ist 3,4-Isopropyliden-D-Mannit (C.F. Wiggins, J. Chem. Soc. 13, 1946). Eine Lösung von 0,1 Mol in 1 1 Toluol wird mit 0,5 Mol K-tert.-Butylat versetzt und unter Rückfluß gekocht. Man tropft unter Rühren 0,5 Mol Benzylchlorid ein. Nach Abschluß der Reaktion (DC-Kontrolle) wird das Reaktionsgemisch mit Wasser extrahiert und die Toluolphase einrotiert. Der Rückstand wird zur Deacetonierung in 1 1 Methanol/2-Propanol 1:1 (v/v) aufgenommen, mit 50 ml 2N-H2SO4 versetzt und unter Rückfluß gekocht. Nach Vollständigkeit der Reaktion (DC-Kontrolle) wird mit 1 l Diisopropyläther versetzt und zweimal mit 1 l Wasser gewaschen. Die Diisopropylätherphase wird einrotiert und das Zwischenprodukt, 1 ,2,5,6-Tetrabenzyl-D-Mannit wird chromatographisch an Kieselgel gereinigt. Die Ausbeuten liegen bei 90 - 95 %.
1,2,5,6-Tetrabenzyl-D-Mannit (C34 H38 O6; 542,68) ber. C 75,25 H 7,06 gef. C 75,11 H 6,99
1 ,2,5,6-Tetrabenzyl-D-Mannit (0,1 Mol) wird in 500 ml Benzol gelöst und portionsweise mit Bleitetraacetat (ca. 0,1 Mol) versetzt, bis das Ausgangsprodukt vollständig umgesetzt ist (DC-Kontrolle). Man wäscht zweimal mit jeweils 500 ml Wasser, rotiert die Benzolphase ein und nimmt den Rückstand in 500 ml Methanol auf. Die Lösung der Aldehyde in Methanol wird portionsweise mit NaBH4 (ca. 0,1 Mol) versetzt. Nach Beendigung der Reaktion wird mit 500 ml Diisopropyläther versetzt und mit Wasser gewaschen. Die Diisopropylätherphase wird einrotiert und der Rückstand an Kieselgel chromatographiert. Die Ausbeute an 1,2-Dibenzyl-sn-glycerin beträgt 95 %; Drehwert (in Substanz).
1 , 2-Dibenzyl-sn-Glycerin (C14 H20 O3; 272,35) ber. C 74,97 H 7,40 gef. C 74,91 H 7,40.
b) Phosphorylierung
1 ,2-Dibenzyl-sn-Glycerin (0,1 Mol) werden in 500 ml THF gelöst und mit Triäthylamin (0,2 Mol) versetzt. Man tropft die Lösung unter starkem Rühren bei 15°C zu Phosphoroxychlorid (0,15 Mol) in 100 ml THF. Nach Beendigung der Reaktion (DC-Kontrolle) wird vom ausgefallenen Triäthylaminhydrochlorid abfiltriert, mit 100 ml Toluol versetzt und im Vakuum bei 40°C einrotiert (Entfernung von überschüssigem POCl3) . Der ölige Rückstand besteht hauptsächlich aus 1,2-Dibenzyl-sn-Glycero-3-Phosphorsäuredichlorid, das in 500 ml THF gelöst und tropfenweise mit Triäthylamin (0,3 Mol) und dann mit den entsprechenden Alkoholen, z. B. N-BOC-Serin-tert.-Butylester (0,15 Mol) (BOC = Butyloxycarbonyl) versetzt wird. Nach Beendigung der Reaktion wird mit Methanol (1 Mol) versetzt und nach vollständiger Reaktion aufgearbeitet. Man gibt 500 ml Diisopropyläther zu und extrahiert die organische Phase mit Wasser. Die Diisopropylätherphase wird einrotiert und der Rückstand an Kieselgel chromatographiert. Man erhält 1,2-Dibenzylsn-Glycero-3-Phospho-Methyl-N-BOC-Serin-tert.-Butylester in Ausbeuten von 80 %. 1,2-Dibenzyl-sn-Glycero-3-Phospho-Methyl-N-BOC-Serin tert.-Butylester
(C30H44NO10P; 609 , 67 ) ber. C 59 , 1 0 H 7 , 28 N 2 , 30 P 5 , 08 gef . C 58 , 95 H 7 , 31 N 2 , 1 7 P 5 , 01 .
c) Katalyti sehe Debenzylierung
1,2-Dibenzyl-sn-Glycero-3-Phospho-Methyl-N-BOC-Serin tert.-Butylester (0,1 Mol) werden in 400 ml THF gelöst und mit 10 g Pd/C (10 % Pd auf Aktivkohle) und 1 g Palladiumschwarz versetzt. Man beläßt unter Rühren solange unter H2-Atmosphäre, bis die H2-Aufnähme abgeschlossen ist. Die Reaktion läuft quantitativ ab. Man filtriert den Katalysator ab und entfernt das Lösungsmittel im Vakuum. Der ölige Rückstand wird direkt weiter umgesetzt.
sn-Glycero-3-Phospho-Methyl-N-BOC-Serin-tert.-Butylester (C16 H32 NO10 P; 429,415) ber. C 44,75 H 7,51 N 3,26 P 7,21 gef. C 44,59 H 7,39 N 3,14 P 7,12.
Durch entsprechende Umsetzung mit anderen Alkoholen können weitere zentrale Zwischenprodukte erhalten werden, zum Beispiel:
sn-Glycero-3-Phospho-Methyl-Bromoäthylester (C6 H14 Br O6 P; 269,07) ber. C 26,78 H 5,25 P 11,51 gef. C 26,63 H 5,21 P 11 ,01.
d) Acylierung
Die Zwischenprodukte mit zwei freien Hydroxylgruppen in sn-1-und sn-2-Position des Glycerins können nun mit den gewünschten Fettsäuren umgesetzt werden, beispielsweise mit Palmitinsäure oder mit ölsäure. Dazu werden 0,1 Mol in 300 ml Methylenchlorid gelöst, mit den Fettsäuren (0,25 Mol) in 200 ml Methylenchlorid, mit Dicyclohexylcarbodiimid (0,25 Mol) und 4-Dimethyl-Aminopyridin (0,05 Mol) versetzt. Unter Rühren bei 20°C wird nach Abschluß der Reaktion vom ausgefallenen Harnstoff abfiltriert, mit Wasser gewaschen und die Methylenchloridphase einrotiert. Der Rückstand wird an Kieselgel durch Chromatographie gereinigt. Die Ausbeute an acyliertem Produkt beträgt 95 %.
1 , 2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phospho-Methyl-N-BOC-L-Serintert.-Butylester (C52 H96 N O10 P; 926,32) ber. C 65,17 H 10,10 N 1,46 P 3,23 gef. C 64,86 H 10,11 N 1,47 P 3,17.
e) Demethylierung Der Phosphorsäurediester mit dem geschützten Serin
(0,1 Mol) wird mit einer Lösung von LiBr (0,5 Mol) in Äthylmethylketon, 500 ml, versetzt und 60 Min. unter Rückfluß gekocht. Die Spaltung ist quantitativ. Man versetzt mit Diisopropyläther und extrahiert mit Wasser. Die Diisopropylätherphase wird einrotiert und der Rückstand direkt weiter umgesetzt.
f) Abspaltung der Serinschutzgruppen
Der Rückstand aus e) (0,1 Mol) wird in 300 ml Methylenchlorid gelöst und bei 0°C mit 150 ml Trifluoressigsaure versetzt. Nach Zusatz von 30 ml 70 % HClO 4 wird 60 Minuten bei 0°C gerührt. Die Spaltung ist vollständig. Man versetzt mit 300 ml Chloroform, 600 ml Wasser und 600 ml Methanol. Die Chloroformphase wird in 600 ml 1M NaHCO3 versetzt. Nach Zusatz von 600 ml CH3OH wird kräftig geschüttelt und die Chloroformphase nach Phasenseparation einrotiert. Der Rückstand wird an Kieselgel chromatographiert. Die Ausbeute beträgt 95 %, bezogen auf den Phosphorsäuretriester.
1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoserin
(C42 H77 N Na O10 P; 810,05) ber. C 62,28 H 9,58 N 1,73 P 3,82 gef. C 62,09 H 9,41 N 1,49 P 3,69.
gemischtkettig a) Phosphorylierung
1-Trityl-2-Benzyl-sn-Glycerin (0,1 Mol) wird in 500 ml THF gelöst und mit Triäthylamin (0,2 Mol) versetzt. Man tropft die Lösung bei 15°C unter starkem Rühren zu Phosphoroxychlorid (0,15 Mol) in 100 ml THF. Nach Beendigung der Reaktion wird filtriert, mit 100 ml Toluol versetzt und im Vakuum bei 40 °C einrotiert (überschüssiges Triäthylamin und Phosphoroxychlorid werden abgezogen). Der Rückstand, hauptsächlich 1-Trityl-2-Benzyl-sn-Glycero-3-Phosphodichlorid, wird in 500 ml THF aufgenommen und mit Triäthylamin (0,3 Mol) versetzt. Man tropft in diese Lösung beispielsweise Bromalkanole (0,2 Mol) bei 30 °C ein und versetzt nach Beendigung der Reaktion mit Methanol (1 Mol). Die Methanolyse ist bei 30°C rasch abgeschlossen (ca. 2 Std.). Man versetzt mit 500 ml Diisopropyläther und extrahiert die organische Phase mit Wasser. Die Diisopropylätherphase wird einrotiert.
b) Detritylierung
Der ölige Rückstand (0,1 Mol) aus a) wird in 500 ml CH3OH, die 5 ml konz . H2SO4 enthalten, aufgenommen und auf 50°C erwärmt. Die Reaktion ist nach 10 Min. vollständig, man kühlt auf 0°C und filtriert den kristal linen Trityl-Methyläther ab. Nach Zusatz von Chloroform, 500 ml, wird mit 500 ml 1M NaHCO3 gewaschen (pH der wäßrigen Phase soll mindestens 5 betragen). Die Chloroformphase wird über Na2SO4 getrocknet und einrotiert.
c) Erste Acylierung
Der Rückstand aus a) wird in 500 ml Methylenchlorid aufgenommen und mit Palmitinsäure (0,25 Mol) versetzt. Nach Zusatz von Dicyclohexylcarbodiimid (0,25 Mol) und 4-Dimethyl-Aminopyridin (0,05 Mol) wird bei 20°C für 3 Std. gerührt. Man filtriert vom ausgefallenen Harnstoff ab, wäscht das Filtrat mit Wasser und entfernt das Methylenchlorid im Vakuum. Der Rückstand wird an Kieselgel chromatographiert. Die Ausbeute beträgt 75 % bezogen auf 1-Trityl-2-Benzyl-sn-Glycerin.
d) Katalytische Debenzylierung
1-Palmitoyl-2-Benzyl-sn-Glycero-3-Phospho-Methyl-Bromo-alkylester (0,1 Mol) wird in Diisopropyläther, 500 ml, gelöst und mit 10 g Pd/C-Katalysator (10 % Pd) und
1 g Palladiumschwarz versetzt. Unter H2-Atmosphäre wird solange gerührt, bis die Wasserstoffaufnähme vollständig ist. Man erhält quantitativ 1-Palmitoyl-sn-Glycero-3-Phospho-Methyl-Bromoalkylester. Vom Katalysator wird abfiltriert, THF vom Filtrat abgezogen und der Rückstand in 500 ml Tetrachlorkohlenstoff aufgenommen.
e) Zweite Acylierung
Die Tetrachlorkohlenstofflösung des Phosphorsäuretriesters (0,1 Mol) wird mit Dicyclohexylcarbodiimid (0,25 Mol) und ölsäure (0,25 Mol) versetzt. Nach Zusatz von 4-Dimethyl-Aminopyridin wird bei 20°C solange gerührt, bis die Reaktion vollständig ist (DC-Kontrolle).
Man trennt den Niederschlag durch Filtration ab, ex trahiert mit Wasser und engt die Tetrachlorkohlenstoffphase im Vakuum ein. Der Rückstand wird an Kieselgel chromatographiert. Man erhält 1-Palmitoyl-2-Oleoyl- sn-Glycero-3-Phospho-Methyl-Bromoalkylester in Ausbeu ten von ca. 95 %.
f) Demethylierung Der Phqsphorsäuretriester (0,1 Mol) aus e) wird mit 0,5 Mol LiBr in 500 ml Äthylmethylketon versetzt und 60 Min. unter Rückfluß gekocht. Die Ausbeute an Li-Salz von 1 -Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phospho-Bromoalkylester ist quantitativ.
g) Aminierung Zur Aminierung der Bromoalkylester kann in an sich bekannter Weise verfahren werden (vgl. z. B. H. Eibl und A. Nicksch, Chem. Phys. Lipids 22 (1978) 1; W. Diembeck und H. Eibl, Chem. Phys. Lipids 24 (1979) 237). Die Umsetzung mit dem Amin, z. B. Trimethylamin, erfolgt z. B. in Chloroform/Propanol- (2) (1/1) als Lösungsmittel.
h) Direkte Aminierung der Phosphorsäuretriester
Die Phosphorsäuretriester (0,1 Mol) aus e) werden in 500 ml Chloroform gelöst und mit 500 ml 2-Propanol versetzt, das Trimethylamin (1 Mol) enthält. Nach 24 Std. bei 50 °C ist die Reaktion vollständig. Man zieht das Lösungsmittel ab und versetzt mit jeweils 500 ml Chloroform, Methanol und Wasser. Die Chloroformphase enthält 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phospho-N,N,N-Trimethylalkanolaminester. Man entfernt das Lösungsmittel und reinigt durch Chromatographie. Die Ausbeuten betragen mehr als 90 %. Monoester-Phospholipide a) Demethylierung
Die Produkte der ersten Acylierung (gemischtkettig, Reaktion c) ) werden mit LiBr demethyliert; so wird beispielsweise 1-Palmitoyl-2-Benzyl-sn-Glycero-3-Phospho-Methyl-Bromoalkylester (0,1 Mol) mit LiBr (0,5 Mol) in 500 ml Äthylmethylketon unter Rückfluß gekocht. Nach 60 Min. ist die Umsetzung quantitativ. Die Aminierung kann wie vorstehend unter g) beschrieben erfolgen.
b) Katalytische Debenzylierung
1-Palmitoyl-2-Benzyl-sn-Glycero-3-Phospho-N,N,N-Trimethylalkanolaminester (0,1 Mol) werden in Alkohol, 1 l, gelöst und mit 10 g Pd/C-Katalysator (10 % Palladium auf Aktivkohle) und 1 g Palladiumschwarz versetzt. Man rührt bis zur Beendigung der Wasserstoffaufnähme. Die Debenzylierung erfolgt quantitativ. Man filtriert den Katalysator ab und entfernt das Lösungsmittel im Vakuum. Der Rückstand wird in 100 ml CHCl3 aufgenommen und mit 400 ml Aceton gefällt. Der Niederschlag wird abgesaugt und getrocknet.
Monoäther-Phospholipide Die Monoäther-Phospholipide können auf völlig gleiche Weise wie die Monoester-Phospholipide dargestellt werden. Als Ausgangsprodukt wird in diesem Falle beispielsweise 1-Octadecyl-2-Benzyl-sn-Glycerin verwendet.
Äther/Ester-Phospholipide
Man erhält Äther/Ester-Phospholipide, wenn man beispielsweise 1-Octadecyl-2-Benzyl-sn-Glycerin als Ausgangsprodukt verwendet und nach dem Verfahren für Diester-Phospholipide, gemischtkettig, vorgeht. Nach der Phosphorylierung a) erfolgt jedoch sofort die katalytische Debenzylierung d) und die zweite Acylierung e) . Dann wird, wie dort beschrieben, weiterverfahren.
Diäther-Phospholipide
1 ,2-Diäther-sn-Glycerine können wie die 1,2-Diester-sn-Glycerine in die entsprechenden Phospholipide umgewandelt werden, wenn man wie unter Diester-Phospholipiden, gleichkettig, verfährt und die Verfahrensschritte b) , Phosphorylierung, e) , Demethylierung und f) , Abspaltung der Schutzgruppen, anwendet.

Claims

Patentansprüche
1. Glycerinderivate der Formeln I, II und III
worin Z Methyl, gegebenenfalls einen Phenylrest enthaltendes Alkyl mit einer C-C-Mehrfachbindung in ß-Stel lung, Benzyl oder ein Äquivalent eines physiologisch verträglichen Kations ist, R 1 und R2 gleich oder verschieden sind und ein Wasserstoffatom, den Rest R oder den Acylrest -COR bedeuten, in 1- oder 3-Stellung auch Trityl, R Alkyl mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen oder Halogen-, Hydroxy- oder Carboxyalkyl mit 2 bis 24 Kohlenstoffatomen bedeutet, wobei Alkyl geradkettig oder verzweigt und Doppel- oder Dreifachbindungen enthalten kann, und durch Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen oder durch Arylreste substituiert sein kann, und worin eine Hydroxy- und/oder Carboxygruppe auch eine Schutzgruppe enthalten kann, X die Bedeutung 0,
NH oder N (R 3) besitzt, und R3, wenn X = O ist,
Alkyl mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen oder Halogen-, Amino-, Methylamino-, Dimethylamino-, Trimethylammonio-, Hydroxy- oder Carboxyalkyl mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen, wobei Alkyl geradkettig oder verzweigt und Doppeloder Dreifachbindungen enthalten kann, und durch Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen oder durch Arylreste substituiert sein kann , bedeutet , worin eine Amino-, Hydroxy- und/oder Carboxygruppe auch eine Schutzgruppe enthalten kann, oder D- oder L-2-tert.-Butyloxycarbonylamino-2-tert.-butyloxycarbony1-äthy1-, 1,2-oder 2,3-Isopropylidendioxy-propyl-, 1,2-, 1,3- oder 2 , 3-Dibenzyloxy-propyl-, 1,2,3,4,5-Pentabenzyloxy-cyclohexyl- oder N-Alkylaminoalkyl mit 2 bis 14 Kohlenstoffatomen in den Alkylresten, worin die Aminogruppen auch Schutzgruppen enthalten können, bedeutet, wenn X = NH ist, Alkyl mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen oder Halogen-, Amino-, Methylamino-, Dimethylamino-, Trime- thylammonio-, Hydroxy- oder Carboxyalkyl mit 2 bis 12
Kohlenstoffatomen, wobei Alkyl geradkettig oder verzweigt und Doppel- oder Dreifachbindungen enthalten kann, und durch Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen oder durch Arylreste substituiert sein kann, oder 1,2-Dihydroxypropyl bedeutet, worin eine Amino-, Hydroxy- und/oder Carboxygruppe auch eine Schutzgruppe enthalten kann, und, wenn X = N(R3) ist, gleich oder verschieden ist und Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen oder Halogenalkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen bedeutet, worin eine Alkylgruppe geradkettig oder verzweigt und Doppel- oder Dreifachbindungen enthalten kann, und durch Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen oder durch Arylreste substituiert sein kann.
2. Glycerinderivate der Formel I oder II nach An spruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R1 den Rest -(CH2)m-CH3, worin m 13 - 19 ist, und R2 einen Acylrest COR bedeutet.
3. Glycerinderivate der Formel I oder II nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß R1 den Rest -(CH2) -CH3, worin m 13 - 19 ist, bedeutet, R2 ein
Wasserstoffatom und, wenn X = 0 ist, R3 Alkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, durch Hydroxy oder Trityloxy tu-substituiertes Alkyl mit 2 bis 11 Kohlenstoffatomen, durch Carboxy oder tert.-Butyloxycarbonyl ധ-substituiertes Alkyl mit 1 bis 11 Kohlenstoffatomen, 2- (Aminooder tert.-Butyloxycarbonylamino)-2-tert.-butyloxycarbonyl-äthyl, 1 ,2-Dihydroxy- oder 1,2-Isopropyliden-dioxy-propyl, Pentahydroxy- oder Pentabenzyloxy- cyclohexyl, oder durch Brom, Amino, Methylamino, Dimethylamino, Trimethylammonio, tert.-Butyloxycarbonylamino, tert.-Butyloxycarbonylmethylamino ധ-substituiertes Alkyl mit 3 - 11 Kohlenstoffatomen bedeutet, wenn X = NH ist, R3 Alkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, durch Brom, Hydroxy, Trityloxy, Amino, Methylamino, Dimethylamino oder Trimethylammonio ധ-substituiertes Alkyl mit 2 - 11 Kohlenstoffatomen, durch Carboxy oder tert.-Butyloxycarbonyl ധ-subst. Alkyl mit 1 bis 11 Kohlenstoffatomen oder 1,2-Dihydroxy-oder 1,2-Isopropylidendioxy-propyl bedeutet, und, wenn X = N(R 3) ist, R3 verschieden oder gleich ist und
Alkyl mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen oder ധ-Chloralkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet.
4. Verfahren zur Weiterverarbeitung der Verbindungen der Formeln I, II oder III nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung von Phospholipiden, dadurch gekennzeichnet, daß man a) zur Herstellung von Diester-phospholipiden mit gleichen Acylresten von einer Verbindung ausgeht, in der
R 1 und R2 = Wasserstoff bedeutet, diese acyliert und danach mit Lithiumbromid demethyliert, oder
b) zur Herstellung von Diester-phospholipiden mit ungleichen Acylresten von einer Ausgangsverbindung ausgeht, in der R1 und R2 verschieden sind und R1
Alkanoyl, Benzyl, Allyl oder Trityl und R2 Alkanoyl, Benzyl oder Allyl bedeutet, wobei ein Rest R1 oder R2 eine Alkanoylgruppe ist, eine Benzyl-, Allyl- oder Tritylgruppe R 1 oder R2 abspaltet, die freiwerdende Hydroxylgruppe acyliert und danach mit Lithiumbromid demethyliert, oder
c) zur Herstellung von Monoester-phospholipiden von einer Ausgangsverbindung ausgeht, in der R1 und R2 verschieden sind und R1 Alkanoyl, Benzyl, Allyl oder Trityl bedeutet, R2 Alkanoyl, Benzyl oder Al lyl, wobei ein Rest R 1 oder R2 eine Alkanoylgruppe ist, und mit Lithiumbromid demethyliert, oder
d) zur Herstellung von Monoäther-phospholipiden von einer Verbindung ausgeht, in der R 1 und R2 verschie den sind und R1 Alkyl, Benzyl, Allyl oder Trityl bedeutet, R 2 Alkyl, Benzyl oder Allyl, wobei ein Rest R 1 oder R2 eine Alkylgruppe ist, und mit Lithiumbromid demethyliert, oder
e) zur Herstellung von Äther/Ester-phospholipiden von einer Verbindung ausgeht, in der R1 und R2 verschie den sind und R1 Alkyl, Benzyl, Allyl oder Trityl bedeutet, R2 Alkyl, Benzyl oder Allyl, wobei ein Rest R1 oder R2 eine Alkylgruppe ist, eine Benzyl-, Allyl- oder Tritylgruppe R 1 oder R2 abspaltet, die entstehende Hydroxygruppe acyliert und danach mit Lithiumbromid demethyliert, oder
f) zur Herstellung von Diäther-phospholipiden von einer Verbindung ausgeht, in der R 1 und R2 Alkyl sind, und mit Lithiumbromid demethyliert,
und wenn erforderlich oder erwünscht, in einer nach a) bis f) erhaltenen Verbindung auf an sich bekannte Weise vorhandene Schutzgruppen abspaltet und/oder den
Phosphor enthaltenden Rest aminiert oder in einen anderen Phosphor enthaltenden Rest überführt, wobei die Abspaltung von Benzyl, Allyl oder Trityl auch nach der Aminierung oder Überführung in einen anderen Phosphor enthaltenden Rest erfolgen kann.
5. Arzneimittel enthaltend eine oder mehrere Verbindungen der Formel I oder II nach Anspruch 2 oder 3.
6. Arzneimittel nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff eine Mischung aus ca. 80 - 95 Gew.-% einer 1-Alkyl-2-acylverbindung nach Anspruch 2 und ca. 20 - 5 Gew.-% einer 1-Alkyl-2-OH-Verbindung nach Anspruch 3 enthalten.
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