EA037102B1 - Способ анализа гликозаминогликанов, гепаринов и их производных методом ямр (ядерного магнитного резонанса) - Google Patents

Способ анализа гликозаминогликанов, гепаринов и их производных методом ямр (ядерного магнитного резонанса) Download PDF

Info

Publication number
EA037102B1
EA037102B1 EA201990005A EA201990005A EA037102B1 EA 037102 B1 EA037102 B1 EA 037102B1 EA 201990005 A EA201990005 A EA 201990005A EA 201990005 A EA201990005 A EA 201990005A EA 037102 B1 EA037102 B1 EA 037102B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
ans
ppm
nmr
sulfo
signals
Prior art date
Application number
EA201990005A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201990005A1 (ru
Inventor
Гильермо Франко
Ибон Гутьерро
Original Assignee
Лабораториос Фармасеутикос Рови, С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Лабораториос Фармасеутикос Рови, С.А. filed Critical Лабораториос Фармасеутикос Рови, С.А.
Publication of EA201990005A1 publication Critical patent/EA201990005A1/ru
Publication of EA037102B1 publication Critical patent/EA037102B1/ru

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N24/00—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects
    • G01N24/08—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects by using nuclear magnetic resonance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N24/00—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects
    • G01N24/08—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects by using nuclear magnetic resonance
    • G01N24/087—Structure determination of a chemical compound, e.g. of a biomolecule such as a protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01R—MEASURING ELECTRIC VARIABLES; MEASURING MAGNETIC VARIABLES
    • G01R33/00—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables
    • G01R33/20—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance
    • G01R33/44—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance using nuclear magnetic resonance [NMR]
    • G01R33/46—NMR spectroscopy
    • G01R33/4625—Processing of acquired signals, e.g. elimination of phase errors, baseline fitting, chemometric analysis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01R—MEASURING ELECTRIC VARIABLES; MEASURING MAGNETIC VARIABLES
    • G01R33/00—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables
    • G01R33/20—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance
    • G01R33/44—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance using nuclear magnetic resonance [NMR]
    • G01R33/46—NMR spectroscopy
    • G01R33/4633—Sequences for multi-dimensional NMR

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • High Energy & Nuclear Physics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Signal Processing (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение описывает аналитический метод ядерного магнитного резонанса гликозаминогликанов в целом и гепаринов и низкомолекулярных гепаринов, а также их производных, в частности, что позволяет идентифицировать их и произвести относительное количественное определение их характерных сигналов с помощью 1H ЯМР и 1H-13C HSQC.

Description

(54) СПОСОБ АНАЛИЗА ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ, ГЕПАРИНОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ МЕТОДОМ ЯМР (ЯДЕРНОГО МАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА)
037102 Bl (31) 16382350.3 (32) 2016.07.19 (33) ЕР (43) 2019.06.28 (86) РСТ/ЕР2017/068285 (87) WO 2018/015463 2018.01.25 (71)(73) Заявитель и патентовладелец:
ЛАБОРАТОРИОС
ФАРМАСЕУТИКОС РОВИ, С.А. (ES) (72) Изобретатель:
Франко Гильермо, Гутьерро Ибон (ES) (74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU) (56) US-B1-7968082
S.-N.M.C.G. OLIVEIRA ET AL. /'Structural and functional analyses of biosimilar enoxaparins available in Brazil THROMBOSIS AND HAEMOSTASIS, vol. 113, no. 1, 25 September 2014 (2014-09-25), pages 53-65, XP055312810, DE ISSN: 0340-6245, DOI: 10.1160/TH14-05-0411 abstract; figs. 1, 2; p. 57
MOURIER PIERRE A.J. ET AL.: Analytical and statistical comparability of generic enoxaparins from the US market with the originator product, JOURNAL OF PHARMACEUTICAL AND BIOMEDICAL ANALYSIS, vol. 115, 29 July 2015 (2015-07-29), pages 431-442, XP029272868, ISSN: 0731-7085, D01:10.1016/J.JPBA.2015.07.038 abstract; supplementary datab; figs.HS-19S
MICHAEL WEBER ET AL.: Using highperformance quantitative NMR (HP-qNMR) for certifying traceable and highly accurate purity values of organic reference materials with uncertainties <0.1%, ACCREDITATION AND QUALITY ASSURANCE, vol. 18, no. 2, 18 January 2013 (2013-01-18), pages 91-98, XP055312811, Berlin/Heidelberg ISSN: 0949-1775, DOL 10.1007/ S00769-012-0944-9 fig. 4
MASSIMO FRANCHINI ET AL.: The evolution of anticoagulant therapy, BLOOD TRANSFUSION, vol. 14, no. 2, 1 March 2016 (2016-03-01), pages 175-84, XP055404540, Italy ISSN: 1723-2007, DOL 10.2450/2015.0096-15 p. 177, col. 1
M.A. LIMA ET AL.: Ultra-low-molecularweight heparins: Precise structural features impacting specific anticoagulant activities, THROMBOSIS AND HAEMOSTASIS, vol. 109, no. 3, 17 January 2013 (2013-01-17), pages 471-478, XP055418248, DE ISSN: 0340-6245, DOL 10.1160/TH12-11-0795 figs 3, 5; table 3, p.473-475
FELISA REYES-ORTEGA ET AL.: Smart heparin-based bioconjugates synthesized by a combination of ATRP and click chemistry, POLYMER CHEMISTRY, vol. 4, no. 9, 1 January 2013 (2013-01-01), page 2800, XP055418249, GB ISSN: 1759-9954, DOL 10.1039/c3py00055a abstract; fig· 2
YONGMEI X.U. ET AL.: Homogeneous low-molecular-weight heparins with reversible anticoagulant activity, NATURE CHEMICAL BIOLOGY, vol. 10, no. 4, 1 April 2014 (2014-04-01), pages 248-250, XP055306990, Basingstoke ISSN: 1552-4450, DOI:10.1038/nchembio.l459 abstract; supplementary information
037102 В1 (57) Изобретение описывает аналитический метод ядерного магнитного резонанса гликозаминогликанов в целом и гепаринов и низкомолекулярных гепаринов, а также их производных, в частности, что позволяет идентифицировать их и произвести относительное количественное определение их характерных сигналов с помощью Н ЯМР и 'Н-^С HSQC.
Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение описывает способ анализа с применением ядерного магнитного резонанса (1Н ЯМР и 1Н-13С HSQC) для характеристики гликозаминогликанов в целом и гепаринов и низкомолекулярных гепаринов, а также их производных, в частности; способ позволяет провести их количественный анализ.
Предпосылки создания изобретения
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) является одной из наиболее важных и широко распространенных аналитических методик, используемых для определения характеристики гликозаминогликанов в целом и гепаринов и низкомолекулярных гепаринов, а также их производных, в частности.
Возможность проведения как одномерных, так и двумерных экспериментов делает этот метод очень чувствительным при определении незначительных изменений в молекулярной структуре, что делает его предпочтительным способом определения соответственной характеристики этих соединений.
Гликозаминогликаны (GAG) представляют собой линейные и отрицательно заряженные полисахариды со средней молекулярной массой от 10 до 100 кДа (The Structure of Glycosaminoglycans and their Interactions with Proteins. Gandhi NS and Mancera RL. Chem Biol Drug Des 2008; 72:455-482). Существуют две крупные группы гликозаминогликанов: несульфатированные (как, например, гиалуроновая кислота) и сульфатированные (как, например, хондроитинсульфат, дерматансульфат, кератансульфат, гепарин и гепарансульфат). Цепи гликозаминогликанов образованы отдельными дисахаридами или соединениями дисахаридов, состоящими из уроновой кислоты (D-глюкуроновой кислоты или L-идуроновой кислоты) и аминосахара (D-галактозамин или D-глюкозамин).
Гиалуроновая кислота: Хондроитинсульфат:
Формула 1. Общая структура дисахаридной единицы для различных типов гликозаминогликанов.
Гепарин представляет собой полисахарид семейства гликозаминогликанов, соединение уроновой кислоты (L-идуроновой или D-глюкуроновой кислоты) и D-глюкозамина, связанных попеременно. Lидуроновая кислота может быть 2-С-сульфатированной, а D-глюкозамин может быть Nсульфатированным и/или 6-С-сульфатированным и реже N-ацетилированным или 3-Oсульфатированным (Mapping and quantification of the major oligosaccharides component of heparin. Linhardt R.J., Rice K.G., Kim Y.S. et al., Biochem J 1988; 254:781-787). Основной повторяющейся единицей дисахарида является трисульфатированный дисахарид, 2-O-сульфо-L-идуроновая кислота (1 —>4) 2-N-сульфо-6O-сульфо-D-глюкозамин.
Происхождение этой структурной вариативности, присутствующей в цепях олигосахаридов гепарина, обнаруживается при их биосинтезе и в механизме регуляции биосинтеза. Так, на первой стадии биосинтеза тетрасахаридный фрагмент, образованный глюкозо-галактозо-галактозо-ксилозой, связывается с белковой сердцевиной, начиная процесс биосинтеза гликопротеиновой цепи. Затем остатки глюкуроновой кислоты (GlcA) и остатки N-ацетилглюкозамина (GlcNAc) попеременно объединяются, формируя полисахаридную цепь длиной приблизительно в 300 единиц. При этом происходит удлинение цепи и под действием различных ферментов в ней происходят изменения. Таким образом, действие ферментов N-деацетилазы/N-сульфотрансферазы вызывает N-деацетилирование и N-сульфатирование блоков GlcNAc, превращая их в N-сульфоглюкозамин (GlcNS). С5-эпимераза катализирует трансформацию определенных единиц GlcA в идуроновую кислоту (IdoA), за чем следует 2-О-сульфатирование под воздействием 2-O-сульфотрансферазы. Далее, 6-O-сульфотрансфераза переносит 6-О-сульфогруппу на отдельные единицы GlcNS и GlcNAc. Наконец, 3-О-сульфотрансфераза действует на определенные единицы Nсульфо-6-О-сульфоглюкозамина (GlcNS6S), образуя остатки N-сульфо-3,6-ди-О-сульфоглюкозамина (GlcNS3S6S).
По-видимому, случайный и частичный характер начального N-деацетилирования в основном и отвечает за образование структурной гетерогенности в гепарине в первой фазе его биосинтеза. Структурная вариативность в отношении степени и положения сульфатирования является следствием частичного
- 1 037102 характера модификаций биосинтетических ферментов, которые приводят к выработке молекул гепарин натрия с переменной моделью замещения дисахаридов.
Гепарин предпочтительно используется в качестве натриевой соли, но его также можно использовать в качестве соли других щелочных или щелочноземельных металлов, и в основном он используется в антитромботической и антикоагулянтной медицине (Anticoagulant therapy for major arterial and venous thromboembolism. Tran HAM, Ginsberg JS. Basic principles and clinical practice. Colman R.W., Marder V.J., Clowes A.W., George J.N., Goldhaber S.Z. (Ред.). Lippincott Williams and Wilkins; 2006:1673-1688).
Гепарины можно классифицировать в зависимости от их молекулярной массы, а именно нефракционированный гепарин (UFH), низкомолекулярный гепарин (LMWH) со средней молекулярной массой менее 8000 Да и ультранизкомолекулярный гепарин (ULMWH) со средней молекулярной массой менее 3000 Да (Chemoenzymatic synthesis of homogenous ultra low molecular weight heparins. Xu Y. et al., Science 2011; 334: 498-501). LMWH и ULMWH происходят от деполимеризации исходной молекулы UFH, и процесс ее получения может вводить определенные характеристики в структуру молекулы. Таким образом, полученная структура молекулы происходит, с одной стороны, из-за структуры гепарина, используемого в качестве исходного материала, а с другой стороны - из-за характерных остатков, генерируемых и свойственных используемому способу получения.
Процесс получения эноксапарин натрия (β-элиминация бензилового эфира гепарина в водной среде под действием щелочи) и бемипарин натрия (β -элиминация в безводной среде под действием щелочи) генерирует на концах большинства видов соединений 4,5-ненасыщенную 2-О-сульфоуроновую кислоту (AU2S) на невосстанавливающем конце и 2-N-сульфо-6-O-сульфоглюкозамин на восстанавливающем конце молекулы. Кроме того, невосстанавливающий конец может иметь структуры 4,5-ненасыщенной 2О-уроновой кислоты (AU). На восстанавливающем конце вышеупомянутого остатка можно найти 2-Nсульфо-6-С-сульфоманнозамин (щелочная обработка катализирует эпимеризацию в С2) в дополнение к другим двум видам 1,6-ангидропроизводных: 2-N-сульфо-1,6-ангидроглюкозамин (1,6-an.A) и 2-Nсульфо-1,6-ангидроманнозамин (1,6-an.M).
Формула 2. Структуры, присутствующие на восстанавливающем и невосстанавливающем концах в эноксапарин и бемипарин натрия.
В процессе получения в других низкомолекулярных гепаринах также образуются остатки. Например, на невосстанавливающем конце тинзапарин натрия, который получают методом β-элиминации путем обработки гепариназами, присутствует 4,5-ненасыщенная 2-С-сульфоуроновая кислота (AU2S)
Формула 3. Структуры, присутствующие на восстанавливающем и невосстанавливающем концах в тинзапарин натрия.
Дальтепарин натрия получают путем обработки азотистой кислотой, которая образует остаток 2,5ангидроманнитола на восстанавливающем конце молекулы
Формула 4. Структуры, присутствующие на восстанавливающем и невосстанавливающем концах в дальтпарин натрия.
- 2 037102
В настоящем описании моносахаридный остаток, присутствующий в цепях гепарина означает те моносахаридные остатки или компоненты, которые обычно присутствуют в цепях LMWH/UFH/GAG. Список этих остатков включает 4,5-ненасыщенную 2-О-сульфоуроновую кислоту (ΔU2S), 4,5ненасыщенную уроновую кислоту (ΔΠ), 2-N-сульфо-1,6-ангидроглюкозамин (1,6-an.A), 2-N-сульфо-1,6ангидроманнозамин (1,6-an.M), 2-N-сульфо-6-O-сульфоглюкозамин (ANS6S), 2,5-ангидроманнит, Nсульфоглюкозамин, глюкуроновую кислоту, N-сульфо-6-O-сульфоглюкозамин, 2-О-сульфоидуроновую кислоту, идуроновую кислоту, N-сульфо-3-О-сульфоглюкозамин, N-сульфо-3,6-ди-О-сульфоглюкозамин, галактуроновую кислоту, ксилозу, N-ацетилглюкозамин и N-ацетил-6-O-сульфоглюкозамин.
ЯМР-спектроскопия позволяет идентифицировать остатки, типичные для процессов получения гепарина и низкомолекулярного гепарина.
Одним из преимуществ использования ЯМР для структурной характеристики является то, что для его анализа образцы не требуют предварительных дериватизаций или хроматографического фракционирования. Другими словами, образец непосредственно анализируют с помощью ЯМР без необходимости проведения промежуточных обработок.
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса используется для определения последовательности моносахаридных остатков, присутствующих в этих соединениях, и однозначно определяет точки Nацетилирования и N- и О-сульфатирования по всей олигосахаридной цепи. Кроме того, этот метод позволяет конкретно определить ориентацию аномерных связей и провести различие между идуроновой кислотой и эпимерами глюкуроновой кислоты (Advancing Analytical Methods for Characterization of Anionic Carbohydrate Biopolymers. Langeslay D.J. PhD Thesis UC Riverside 2013). Однако, учитывая высокую степень микрогетерогенности и полидисперсности этих соединений, комплексная характеристика гепаринов и низкомолекулярных гепаринов в настоящее время остается проблемой.
Кроме того, этот метод может быть использован для получения информации о тех структурных остатках, которые образуются в процессе получения гепаринов и низкомолекулярных гепаринов, как например, состояние эпимеризации уроновых кислот (идуроновая кислота против глюкуроновой кислоты), соотношение сульфатированных и несульфатированных 4,5-уронатных остатков на невосстанавливающем конце (для низкомолекулярных гепаринов, продуцируемых методом β-элиминации или путем обработки гепариназами).
Аналогично, и благодаря своей высокой чувствительности этот метод использовался в качестве метода скрининга для определения примесей, присутствующих в гликозаминогликанах (Analysis and characterization of heparin impurities. Beni S. et al., Anal Bioanal Chem 2011, 399:527-539).
Последним достижением науки было раскрытие различных методов и экспериментов с применением ЯМР для структурной характеристики гликозаминогликанов в целом, а также гепаринов и низкомолекулярных гепаринов, в частности. Так, например, 13С-ЯМР-спектроскопия была использована для определения степени сульфатирования в гепарине натрия различного животного происхождения (Characterization of Sulfation Patterns of Beef and Pig Mucosal Heparins by Nuclear Magnetic Resonance. Casu B. et al., Arzneim.-Forsch./Drug Res. 1996.46:472-477).
1Н-ЯМР-спектроскопия была наиболее широко используемой методикой для изучения этих соединений, поскольку она задействует большое количество ядер и имеет высокое гиромагнитное отношение. Диапазон от 1,8 до 2,1 м.д. содержит сигналы, соответствующие N-ацетильным группам или метильным группам восстанавливающих концов, которые могут быть синтезированы. Диапазон от 2,8 до 4,6 м.д. содержит большинство сигналов сахаридного кольца и имеет высокую степень наложения между сигналами, что затрудняет извлечение структурной информации непосредственно из этой области. В диапазоне от 4,6 до 6,0 м.д. - это сигналы, соответствующие аномерным протонам. Так как это область, которая имеет намного меньшую заполненность сигналами, из нее можно извлечь много информации. Кроме того, в случае LMWH, полученных с использованием механизма β-элиминации, она также содержит сигналы, соответствующие Н4 на невосстанавливающих концах молекулы.
Двумерные эксперименты (2D ЯМР) позволяют преодолеть проблемы одномерных экспериментов, в основном благодаря наложению сигналов, а также тому, что спектры имеют два частотных измерения и другую интенсивность сигнала, что позволяет им стать мощным инструментом для обозначения олигосахаридных структур, полученных из гепарина (Characterization of currently marketed heparin products: composition analysis by 2D-NMR. Keire D.A. et al. Anal. Methods 2013.5:2984-2994).
Спектры TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY, полная корреляционная спектроскопия) являются отличной отправной точкой для структурного анализа олигосахаридов, поскольку полученная в результате информация позволяет сопоставить ядра, найденные в одной и той же спиновой системе, а в этом случае все протоны в одном и том же моносахариде.
Другим двумерным экспериментом, имеющим особое значение для структурной характеристики этого типа соединений, является 1Н-13С HSQC (Heteronuclear Single-Quantum Correlation, гетероядерная одноквантовая корреляция), которая коррелирует химические сдвиги протонов с химическими сдвигами углерода 13 и позволяет назначать первичные структуры олигосахаридов, полученных из GAG и моносахаридного состава (Structural elucidation of the tetrasaccharide pool in enoxaparin sodium. Ozug J. et al., Anal.
- 3 037102
Bioanal. Chem. 2002.403:2733-2744; Structural features of low molecular weight heparins affecting their affinity to antithrombin. Bisio A. et al., Thromb. Hemost. 2009.102:865-873).
Увеличение спектральной дисперсии, достигаемое с помощью этого двумерного метода, позволяет количественно определять интегралы сигналов, которые накладываются в соответствующие одномерные спектры (Low-molecular-weight heparins: structural differentiation by two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy. Guerrini M. et al., Semin Thromb Hemost 2007.33:478-487).
Метод ядерного магнитного резонанса, по определению, представляет собой метод количественной спектроскопии, поскольку интенсивность резонансных линий прямо пропорциональна числу резонансных ядер (спинов). Это теоретически позволяет с точностью определить количество молекулярных структур.
Увеличение интенсивности магнитных полей, используемых в ЯМР, позволило значительно снизить пределы обнаружения. Однако отсутствие точных методик, которые рассматривают и контролируют как экспериментальные способы, так и обработку и оценку спектров, означает, что измерения, проведенные на идентичных образцах в различных лабораториях, могут существенно отличаться (Validation of quantitative NMR. Malz F. and Jancke H. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2005.38:813823).
Сложность спектров ядерного магнитного резонанса гликозаминогликанов в целом и гепаринов и низкомолекулярных гепаринов, а также их производных, в частности, означала, что до настоящего времени не были разработаны специальные методы валидации, которые позволяют количественно определять его характерные сигналы и, следовательно, подходящую характеристику и дифференциацию этих соединений.
Следовательно, авторы настоящего изобретения смогли преодолеть это препятствие современной науки, сумев разработать способ, который позволяет однозначно дифференцировать гепарины друг от друга. Благодаря способу, разработанному в рамках настоящего изобретения, процентные значения полученного моносахаридного состава позволяют дифференцировать низкомолекулярные гепарины, полученные в ходе различных процессов, а также гепарин натрия и другие гликозаминогликаны.
Сущность изобретения
Авторы настоящего изобретения разработали способ, который позволяет количественно определять характерные сигналы гликозаминогликанов в целом и гепаринов и низкомолекулярных гепаринов, а также их производных в частности, с использованием одномерного ядерного магнитного резонанса Ή ЯМР и/или двумерного ядерного магнитного резонанса Щ-13С HSQC. Количественное определение этих сигналов позволяет определить моносахаридный состав олигосахаридных цепей каждого из этих соединений, что является характерной особенностью для соединения.
Следовательно, в отношении первого аспекта изобретение обеспечивает способ анализа состава, содержащего моносахаридные остатки, присутствующие в цепях гепарина или выходящие из них, с помощью одномерного ядерного магнитного резонанса Ή ЯМР и/или двумерного ядерного магнитного резонанса Щ-13С HSQC, который состоит из следующих этапов:
a) получение состава, включающего по меньшей мере один моносахаридный остаток, присутствующий в цепях гепарина, и получение его спектра путем одномерного ядерного магнитного резонанса 1H ЯМР и/или двумерного ядерного магнитного резонанса Щ-13С HSQC с использованием диметилмалоновой кислоты (DMMA) в качестве внутреннего эталона, и затем
b) выявление в спектре ЯМР факта присутствия или отсутствия как минимум одного сигнала как минимум одного остатка, выбранного из группы, состоящей из 4,5-ненасыщенной 2-О-сульфоуроновой кислоты (ΔU2S), 4,5-ненасыщенной уроновой кислоты (ΔU), 2-Ы-сульфо-1,6-ангидроглюкозамина (1,6an.A), 2-Ы-сульфо-1,6-ангидроманнозамина (1,6-an.M), 2-N-сульфо-6-O-сульфоглюкозамина (ANS6S), 2, 5-ангидроманнита, N-сульфоглюкозамина, глюкуроновой кислоты, N-сульфо-6-O-сульфоглюкозамина, 2-О-сульфоидуроновой кислоты, идуроновой кислоты, N-сульфо-3-О-сульфоглюкозамина, N-сульфо-3,6ди-O-сульфоглюкозамина, галактуроновой кислоты, ксилозы, N-ацетилглюкозамина и N-ацетил-6-Oсульфоглюкозамина, отличающегося тем, что наличие указанных сигналов в определенной относительной пропорции ее нормализованных интегралов по отношению к DMMA или их отсутствие составляет образец, который позволяет идентифицировать гепарин, который представляет собой моносахаридный остаток, путем сравнения модели, полученной в анализе, с эталоном, ранее полученным для разных гепаринов при тех же условиях.
Подходящая количественная оценка характерных сигналов этих продуктов и их моносахаридного состава или характерных остатков позволяет соответствующим образом дифференцировать полисахариды друг от друга и определить их происхождение, а в случае низкомолекулярных гепаринов - подтвердить, что продукты были изготовлены в соответствии с заявленным способом.
Это количественное определение остатков измеряется в процентах и в относительной форме по отношению к полной структуре каждого гепарина. Получение характерной картины каждой из структур, которая позволяет однозначно выводить и идентифицировать как анализируемый гепарин, так и процесс, посредством которого он был получен. Таким образом, способ по настоящему изобретению может ис- 4 037102 пользоваться как в качестве системы или методики контроля качества (для оценки того, соответствуют ли анализируемые гепарины определенному эталону или фальсифицированы), так и в качестве метода анализа и определения характерных сигналов новых структур гепарина, для которых впоследствии этот же способ может использоваться как система или методика контроля качества.
Кроме того, одобрение со стороны органов здравоохранения биосимиляров и/или дженериков некоторых низкомолекулярных гепаринов, как и в случае с эноксапарин натрием, происходит после надлежащим образом выполненного сопоставления между биосимиляром/дженериком и эталонной молекулой, которое должно продемонстрировать, среди прочих аспектов, подходящую степень структурного сходства между обоими продуктами. Одним из основных аспектов структурного уровня, который необходимо продемонстрировать, является то, что относительная доля моносахаридов, которые образуют свои олигосахаридные цепи, после статистической оценки соответствуют критериям биоподобия. Для них способ по настоящему изобретению является особенно селективным.
Авторы настоящего изобретения подтвердили, что, хотя структурная характеристика с помощью ядерного магнитного резонанса широко используется для характеристики этих соединений, однако в литературе нет методов количественного анализа гликозаминогликана с помощью ЯМР. Отсутствие этих методов препятствует надлежащей сопоставимости между идентичными образцами, которые были изучены и оценены в условиях, не соответствующих установленным экспериментальным условиям.
Таким образом, в литературных публикациях можно найти, что значения относительной пропорции, которые предоставляются для различных остатков компонентов этих соединений, значительно отличаются друг от друга, что ясно указывает на то, что они являются недостаточно корректными методами (Generic versions of enoxaparin available for clinical use in Brazil are similar to the original drug. Glauser B.F., Vairo B.C., Oliveira C.P.M., Cinelli L.P., Pereira M.S. and Mourao P.A.S. J Thromb Haemost 2011.9; 1419-1422).
С целью создания селективного количественного способа определения доли сигналов, соответствующих остаткам, присутствующим в структуре этих соединений, что позволяет провести надлежащее сопоставление результатов и позволяет избежать ошибки, вызванной условиями, в которых ЯМРэксперименты выполняются, авторы изобретения обнаружили, что использование диметилмалоновой кислоты (DMMA) в качестве внутреннего эталона в экспериментах 1Н ЯМР и HSQC для относительной количественной оценки сигналов, которые соответствуют разным компонентным моносахаридам, является подходящим, поскольку, среди других аспектов, время продольной релаксации (Т1) составляет менее 1 с, аналогично Т1 аномерных протонов и углеродов (Molecular Weight of Heparin using 13C Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. Desai U.R. and Linhardt R.J., J Pharm Sci 1995.84(2); 212-215), что позволяет хорошо переносить поляризацию и, следовательно, увеличивать интенсивность сигналов, что делает способ пригодным для этой цели.
Таким образом, процесс ЯМР-анализа этих соединений характеризуется, в первую очередь, использованием диметилмалоновой кислоты в качестве внутреннего эталона для количественного определения характерных сигналов этих продуктов, как с использованием Ή ЯМР, так и 1Н-13С HSQC.
Неожиданно было обнаружено, что селекция диметилмалоновой кислоты (DMMA) в качестве внутреннего эталона при ее применении как для 1H ЯМР, так и для 1Н-13С HSQC позволяет количественно определять процентное значение характерных сигналов в гликозаминогликанах, обычно связанных с гепаринами, с высокой специфичностью, точностью, повторяемостью и линейностью, а также между сигналом спектра ЯМР и концентрацией характерных остатков анализируемого гликозаминогликана, что позволяет разработать способ количественного анализа указанных гликозаминогликанов, которого не существует на сегодняшний день.
Краткое описание фигур
Фиг. 1. Диаграмма процесса биосинтеза гепарина.
Фиг. 2. Специфичность. 1H ЯМР-спектры.
Фиг. 3. Специфичность. 1Н-13С HSQC-спектры.
Фиг. 4. 1H ЯМР-линейность.
Фиг. 5. 1Н-13С HSQC-линейность.
Фиг. 6. 1Н ЯМР-спектр эноксапарин натрия.
Фиг. 7. 1Н-13С HSQC-спектр эноксапарин натрия.
Аббревиатуры и акронимы.
В настоящей спецификации используются следующие аббревиатуры и акронимы:
- 5 037102
ЯМР: Ядерный магнитный резонанс
HSQC: Гетероядерная одноквантовая корреляция GAG: Гликозаминогликан
UFH: Нефракционированный гепарин LMWH: Низкомолекулярный гепарин ULMWH: Ультранизкомолекулярный гепарин Да: Дальтон
AU2S: 4,5-ненасыщенная 2-О-сульфоуроновая кислота
Δυ: 4,5-ненасыщенная уроновая кислота
1,6- ап.А: 2-М-сульфо-1,6-ангидроклюкозамин
1,6- ап.М: 2-Ы-сульфо-1,6-ангидроманнозамин TOCSY: Полная корреляционная спектроскопия TSP: 3-(триметилсилил)пропионовая кислота-Д4 натриевая соль DMMA: Диметилмалоновая кислота МГц: Мегагерц м.д.: Миллионная доля δ: Химический сдвиг SW: Спектральная ширина TD: Промежуток времени
Т1: Время продольной релаксации ANS : Ν-сульфоглюкозамин
G: Глюкуроновая кислота
ANS6S: Ν-сульфо-6-0-сульфоглюкозамин I2S: 2-О-сульфоидуроновая кислота I: Идуроновая кислота
ANS3S: Ν-сульфо-3-0-сульфоглюкозамин Gal: Галактуроновая кислота Ху1: Ксилоза
ANAc: N-ацетилглюкозамин
A6S: 6-О-сульфоглюкозамин
А60Н: Глюкозамин
G2S: Сульфогулуроновая 2-0 кислота М: Маннозамин
MNS6S: N-сульфо-б-О-сульфоманнозамин
Ерох: Эпоксид ared: ос-аномер 3red: β-аномер
Подробное описание изобретения
Экспериментальные испытания.
Количественные ЯМР-испытания были выполнены с использованием спектрометра ядерного магнитного резонанса (ЯМР) фирмы Bruker AVIII-600 о AVIII-800. В качестве внутреннего эталона использовали следующие реагенты: оксид дейтерия (D2O) 99,9%, 3-(триметилсилил) пропионовая кислота-б4 натриевая соль (TSP) и диметилмалоновая кислота (DMMA, эталон для количественного ЯМР, степень чистоты TraceCERT).
a) Инструментальные настройки.
Частота: 1Н: 600/800 МГц, 13С: 150,9/201,2 МГц.
Температура: 298 К.
b) Параметры поглощения (количественный 1H ЯМР).
90° импульс: определяется из качественного 1Н-спектра.
Диапазон поглощения: SW=10-12 м.д/ТО=64-128к
Задержка интервала сканирования d1 должна удовлетворять условию d1+AQ>20 с.
Количество сканирований: 12.
c) Параметры поглощения (HSQC).
90° импульс: определяется из качественного 1Н-спектра.
Диапазон поглощения: SW2 (1Н)=6 м.д./TD(F2)=1k SW1 (13С)=120 м.д./TD(F1)=256-384.
Время между импульсами d1=1,8-2 с.
Количество сканирований: 12.
d) Параметры обработки (1Н).
Интервал обработки: SI=64-256K.
Функция-окно: отсутствует.
Регулировка фазы: ручная.
Исходная настройка: автоматическая (abs).
e) Параметры обработки (HSQC).
- 6 037102
Интервал обработки: SI(F2)=2k.
Функция обработки: QSINE, SSB=2.
Регулировка фазы: ручная.
Исходная настройка: автоматическая.
f) Для приготовления образца готовят следующие растворы:
раствор A [TSP] 1 мг/мл.
Раствор В [D2O-TSP] 0,002 мг/мл: 40 мкл A [TSP]+19,96 мл D2O, общий объем=20 мл.
Раствор С [DMMA] 1,2 мг/ мл.
Испытательный образец: 50 мг исследуемого продукта помещают в 500 мкл раствора В [D2O-TSP] и добавляют 100 мкл раствора С [DMMA] диметилмалоновой кислоты и помещают в пробирку для ЯМР диаметром 5 мм.
g) Процесс.
ЯМР-пробирку, содержащую образец, вводят в спектрометр. Затем регулируют однородность магнитного поля и гармонию волны оптимизируют для ядер 1H и 13С. Затем выполняется качественный 1Н спектр с параметрами, аналогичными указанным выше, за исключением следующего:
Время между импульсами d1=1-2 с.
Количество сканирований: 1-4.
Затем значение импульса 90° определяется с помощью автоматической импульсной программы (TOPSPIN). Затем выполняется количественный 1Н-спектр с параметрами, указанными в аналитическом методе, со значением импульса 90° (Р1), которое было определено ранее. После получают спектр HSQC с указанными выше параметрами. Полученные спектры затем обрабатывают в соответствии с вышеупомянутыми параметрами, принимая в качестве эталона химического сдвига сигнал TSP-d4 при 0 м.д.
Сигнал диметилмалоновой кислоты появляется при следующих химических сдвигах:
1H ЯМР: синглет, который появляется при 1,2-1,4 м.д.
HSQC: сигнал при 1,2-1,4 и 26-27 м.д.
Параметры, подлежащие оценке при определении валидации метода для количественного ЯМР, были следующими:
Специфичность.
С определенностью устанавливает пригодность аналитического метода для измерения и/или идентификации интересующих аналитов одновременно или по отдельности в присутствии других химических веществ, которые могут присутствовать в образце.
Данные, полученные в спектрах 1H ЯМР в ходе этих экспериментов, были следующими:
Образец Состав Химический сдвиг, м.д.
I, растворитель D2O II, эталон химического d2o-tsp сдвига III, внутренний эталон D2O-DMMA IV, образец GAG D2O-TSP-DMMA-GAG 4,79 0, 00 1,42 1,8-8,0
И в 1H 13C-HSQC спектрах:
Химический Химический
Образец Состав сдвиг 1Н, м.д. III, внутренний D2O-DMMA 1,42 эталон d2o-tsp-dmma- IV, образец: GAG 1,8-8,0 GAG Проверяется отсутствие помех между сигналами как в спектрах сдвиг 13С, м.д. 25, 42 24-112 ‘и ЯМР, так и в 1H 13C-HSQC (фиг.
и 3). Это демонстрирует, что в способе возможно без помех различать сигналы, формирующие структуру исследуемого соединения, и сигналы других продуктов, присутствующих в образце, таких как растворитель (оксид дейтерия, D2O), внутренний эталон (диметилмалоновая кислота, DMMA) и эталонный химический сдвиг (TSP-d4).
Предел количественной оценки и линейность.
В соответствии с этими параметрами определяется, с одной стороны, минимальное количество аналита, которое может быть точно и безошибочно определено количественно, а с другой стороны, способность способа получать результаты в прямой пропорциональности (посредством математических преобразований) к концентрации аналита в образце в пределах установленного интервала.
Для установления предела количественной оценки и линейности количественно подсчитывают интегралы ЯМР-сигналов DMMA (т.е. интеграл области сигнала ЯМР, соответствующей DMMA) на эноксапарин натрии, легированном на 7 уровнях концентрации внутреннего эталона, путем независимых взвешиваний трех экземпляров. Эти уровни соответствуют следующим рабочим концентрациям:
0,2 мМ: 13,5% рабочей концентрации,
0,3 мМ: 20,3% рабочей концентрации,
- 7 037102
0,76 мМ: 50% рабочей концентрации,
1,2 мМ: 80,1% рабочей концентрации,
1,5 мМ: 100% рабочей концентрации,
1,8 мМ: 120% рабочей концентрации,
2,27 мМ: 150,2% рабочей концентрации.
Критерии приемлемости, установленные для выполнения этого критерия линейности, заключаются в том, что в полученной линии коэффициент корреляции для обоих экспериментов составляет >0,99. На фиг. 4 и 5 графически представлены интегральные значения сигнала DMMA в зависимости от концентраций DMMA (мМ) для спектров 1H ЯМР и 1H 13C-HSQC. Критерий приемлемости легко выполняется для обоих спектров.
Предел количественной оценки устанавливается для концентрации DMMA в 0,20 мМ. Таким образом, сигналы образцов, исследованных с интенсивностью меньшей, чем интенсивность сигнала DMMA, соответствующего этой концентрации, не могут быть соответственно количественно определены и, следовательно, они не могут быть использованы для определения относительной доли остатков, присутствующих в молекуле.
Точность.
Способ выражает близость между значением, которое принимается обычно в качестве истинного или эталонного значения, и найденным экспериментальным значением. Для расчета и оценки экспериментального значения концентрации образцов в способе сравнивают уравнения с линией, полученной в предыдущем разделе (линейность).
Точность выражается как процент восстановления при оценке известного количества внутреннего эталона
Хш
Процент восстановления (R) =----------------------х 100 где
Xm - найденное среднее значение;
μ - значение, принятое как истинное.
Установленные критерии приемлемости заключаются в том, что значения восстановления составляют от 70,0 до 130,0% для концентрации, соответствующей пределу концентрации, и от 80,0 до 120,0% для других уровней.
Данные, полученные для экспериментов 1H NMR и HSQC, были следующими:
а) Ή ЯМР
Конц. вычисленная, Восстановление, 41
Концентрация, мМ
мМ ЯМР
0, 204 0,228 111,77
0, 307 0,330 107,31
0, 758 0,737 97,26
1,212 1, 175 96, 90
1,514 1,488 98,29
1, 817 1,810 99, 65
2,274 2,318 101,94
Концентрация, мМ Конц. вычисленная, мМ Восстановление, HSQC
0,204 0,243 119,17
0, 307 0,337 109,81
0, 758 0,727 95, 96
1,212 1,140 94,03
1,514 1,488 98,29
1,817 1,823 100,32
2,274 2,328 102,37
b) HSQC
Вывод, сделанный из этого анализа как для эксперимента 1H ЯМР, так и для HSQC, в соответствии с критериями приемлемости подтверждает пригодность параметров точности для тех сигналов, которые соответствуют образцу, с интенсивностью, превышающей интенсивность предела количественной оценки.
Точность - повторяемость.
Вариабельность метода изучается путем проведения серии анализов на одном и том же образце в одних и тех же условиях работы в одной и той же лаборатории и за короткий период времени.
Для этого для каждой концентрации проводили три последовательных анализа. Повторяемость метода выражается как коэффициент вариации (CV) серии измерений и математически рассчитывается следующим образом:
- 8 037102 ς
CV (%) ---------------X 100
X где s - стандартное отклонение;
X - среднее арифметическое для результатов.
Критерии приемлемости, установленные для выполнения этих критериев точности, заключаются в том, что коэффициент вариации для всех уровней составляет <7%.
Данные, полученные для обоих экспериментов, были следующими:
Концентрация, мМ CV,% гН ЯМР CV,% HSQC
0,204 5, 55 3,40
0,307 0, 09 2,29
0,758 1, 62 1,45
1,212 1,74 2,52
1,514 1,41 1,01
1,817 2, 16 3, 99
2,274 2,30 2,73
Вывод, сделанный из этого анализа как для эксперимента 1H ЯМР, так и для HSQC, в соответствии с критериями приемлемости подтверждает пригодность параметров точности для тех сигналов, которые соответствуют образцу, с интенсивностью, превышающей интенсивность предела количественной оценки.
Примеры
Ниже приведенные конкретные примеры служат для иллюстрации характера настоящего изобретения. Эти примеры включены только для иллюстративных целей и не должны интерпретироваться как какие-либо заявленные ограничения изобретения.
Пример 1. Исследование эноксапарин натрия методом 1H ЯМР.
мг эноксапарин натрия растворяют в 500 мкл раствора D2O-TSP (раствор В) и добавляют 100 мкл раствора DMMA (раствор С). Полученный раствор вводят в пробирку диаметром 5 мм.
Полученная концентрация DMMA в растворе для анализа составляет 1,5 мМ.
Эксперименты проводятся в ЯМР-спектрометре фирмы Bruker AVIII-800.
Основные идентифицированные сигналы:
Химический Химический сдвиг, м.д.
Сигнал сдвиг, м.д. Сигнал
Н4 AU2S 5, 992 Hl G 4,628
Н4 AU2 5,825 H6 ANS6S 4,344
Н1 1,6-Ап.А 5,616 H6' ANS6S 4,210
Hl ANS(-G) 5,585 H3 ANS 3, 670
Hl 1,6-An.M 5,569 H2 ANS3S 3,395
Hl AU2S 5,509 H2 ANS 3,293
Hl ANS6S 5,405 NAc 2,047
Hl I2S 5,228 DMMA 1,320
Hl I H5 I2S 5,012 4,836 TSP 0, 069
После того, как были получены значения интегралов сигналов как DMMA, так и остальной части остатков, получают нормализованные значения упомянутых остатков путем деления значения его интегралов на значение интеграла, соответствующего сигналу DMMA. Эта нормализация может быть выполнена, поскольку концентрация внутреннего эталона поддерживается постоянной по отношению к концентрации остатка для всех экспериментов, что позволяет избежать межэкспериментальной вариабельности, которая может возникнуть при анализе серии из нескольких партий продуктов.
Как только нормализованные значения остатков будут получены, относительный процент каждого из них рассчитывается в соответствии со следующей формулой:
нормализованное значение сигнала X % сигнал X =------------------------------------------------------х 100
Σ нормализованное значение всех сигналов
Для уточнения выполненных шагов полученные результаты показаны для серии из четырех образцов M1, М2, М3 и М4 эноксапарин натрия.
В проведенных экспериментах были получены следующие интегральные значения для каждого из выбранных сигналов:
- 9 037102
Сигнал Интеграл М4
М 1 М2 М3
Н4 AU2S 2767732.83 2988384.02 3075705.31 2332763.55
H4AU 114294.94 135658.19 143037.09 94201.86
Н1 1,6-ап.А 404060.73 472871.53 509930.86 351978.17
Н1 1,6-ап.М 2535227.20 2700027.94 2844751.53 2160178.72
Hl AU2S 3541377.06 3818336.16 3951288.34 2999870.34
Hl ANS6S 10350026.69 10716882.48 10780945.33 8442504.14
Hl I2S 8922576.12 9202191.38 9486264.66 7346708.47
Н5 I2S 8924825.12 9540022.53 10041127.64 7751650.03
Н2 ANS 16351247.22 16802874.61 17051664.14 13189968.22
NAc 8054931.36 7973188.48 8124533.56 6388424.34
DMMA 1464255.27 1415020.17 1485242.95 1279612.94
где М соответствует образцу.
Чтобы получить нормализованные значения интегралов исследуемых сигналов, они делятся на значение интеграла DMMA:
Сигнал Μ 1 Нормализованный интеграл
М2 М3 М4
Н4 AU2S 1.890 2.112 2.071 1.823
H4AU 0.078 0.096 0.096 0.074
Н1 1,6-ап.А 0.276 0.334 0.343 0.275
Н1 1,6-ап.М 1.731 1.908 1.915 1.688
Hl AU2S 2.419 2.698 2.660 2.344
Hl ANS6S 7.068 7.574 7.259 6.598
Hl I2S 6.094 6.503 6.387 5.741
Н5 I2S 6.095 6.742 6.761 6.058
Н2 ANS 11.167 11.875 11.481 10.308
NAc 5.501 5.635 5.470 4.992
DMMA 1.000 1.000 1.000 1.000
И, наконец, из этих нормализованных значений рассчитывается относительная доля каждого из этих сигналов к совокупности всех сигналов:
Сигнал М 1 Относительная доля, % М4
М2 М3
Н4 AU2S 4.47 4.64 4.66 4.57
H4AU 0.18 0.21 0.22 0.18
Н1 1,6-ап.А 0.65 0.73 0.77 0.69
Н1 1,6-ап.М 4.09 4.20 4.31 4.23
Hl AU2S 5.72 5.93 5.99 5.88
Hl ANS6S 16.70 16.65 16.33 16.54
Hl I2S 14.40 14.30 14.37 14.39
Н5 I2S 14.40 14.83 15.21 15.18
Н2 ANS 26.39 26.11 25.83 25.83
NAc 13.00 12.39 12.31 12.51
Количественное определение характерных и хорошо дифференцированных сигналов эноксапарин натрия (как правило, соответствующих аномерным протонам, H1) показано в следующей таблице с наблюдаемыми значениями относительной долевой пропорции:
Сигнал Химический сдвиг, Относительная доля, %
м.д
Н4 AU2S 5,99 4,3-4,7
Н4 AU 5,82 0,2
Н1 1,6-ап.А 5,62 0,7-0,9
Н1 1,6-ап.М 5,57 4,1-4,4
Hl AU2S 5,51 5,7-6,0
Hl ANS6S 5,40 16,1-16,7
Hl I2S 5,23 13,1-14,4
Н5 I2S 4,84 14,3-16,3
Н2 ANS 3,29 24,3-26,6
NAc 2,05 12,0-15,3
- 10 037102
Набор сигналов, соответствующих пикам, найденным в определенном спектре ЯМР, будь-то одномерный 1Н ЯМР и/или двумерный 1Н-13С HSQC, или их отсутствие в относительных пропорциях его нормализованных интегралов, обозначенных параметром относительная доля (%) - это то, что в настоящей спецификации называется модель сигнала или просто модель.
Пример 2.
Такое же решение, используемое в примере 1, используется для проведения исследования с использованием 1Н-13С HSQC. Основные идентифицированные сигналы:
Сигнал δ 1зС; м д δ Ή, м.д. Сигнал δ !3C, м.д. δ !H, м.д.
C4-H4AU 110.71 5.82 СЗ-НЗ Gal 85.45 3.78
С4-Н4 AU2S 108.97 5.99 СЗ-НЗ Gal 84.85 3.83
Cl-H1G//Gal 106.62 4.66 С4-Н4 ANS6S(-G)// ANS6S red 80.94 3.84
Cl-Hl Xyl 105.79 4.45 C2-H2 I2S 78.53 4.34
Cl-Hl G(-ANAc) 105.13 4.50 СЗ-НЗ Xyl 77.82 3.72
Cl-Hl I(-A6S) 104.94 5.01 C2-H2 AU2S 77.42 4.62
Cl-Hl G(-ANS) 104.77 4.60 C2-H2 G(-AN6S) 75.70 3.40
Cl-Hl I(-A6OH) 104.67 4.94 СЗ-НЗ ANS6S (-G) 72.47 3.66
Cl-Hl Gal 104.30 4.54 СЗ-НЗ ANS6S red 72.29 3.77
Cl-Hl 1,6-an.A 104.22 5.61 C5-H5 I2S 72.01 4.83
Cl-Hl G(-ANS3S)103.91 4.61 СЗ-НЗ I2S 71.87 4.21
Cl-Hl 1,6-an.M 103.91 5.57 C5-H5 ANS6S(-G) 71.72 4.09
Cl-Hl AU 103.88 5.16 C5-H5 MNS6S red 70.98 4.15
Cl-Hl G2S 102.99 4.75 C5-H5 ANS6S red 70.64 4.12
C1-H1.I2S 102.09 5.22 C6-H6 1,6-an.A// 1,6-an.M 67.53 3.77
Cl-Hl I2S(-1,6- 101.59 an.M) 5.36 C5-H5 Xyl 65.89 4.12
Cl-Hl ANS(-G) 100.50 5.58 C5-H5 Xyl 65.86 3.40
Cl-Hl ANAc 100.23 5.31 C3-H3 AU2S 65.75 4.32
Cl-Hl AU2S 100.18 5.51 C6-H6 Gal 63.90 3.74
Cl-Hl ANS(-I2S) 99.78 5.40 C2-H2 ANS6S red// ANS(-I2S) 60.82 3.28
Cl-Hl ANS6S 99.43 5.43 C2-H2 ANS6S(-G) 60.52 3.29
Cl-Hl ANS,3S 99.06 5.51 C2-H2 MNS6S red 60.38 3.60
Cl-Hl ANS Pred 98.73 4.71 C2-H2 1,6-an.A 58.50 3.21
Cl-Hl ANS(-I) 98.42 5.34 C2-H2 ANAc 56.68 3.92
Cl-Hl Mared 95.74 5.39 C2-H2 1,6-an.M 55.09 3.47
Cl-Hl I2S ared 95.70 5.42 DMMA 26.73 1.32
Cl-Hl I2spred 94.76 Cl-Hl ANS ared//93.97 4.97 5.45 NAc 24.87 2.05
ANS6S red
Эти сигналы могут быть ассоциированы с моносахаридными компонентами молекулы, так что количественное определение сигналов позволяет определить их моносахаридный состав.
Интегралы для каждого из этих сигналов были нормализованы, исходя из значения, установленного для интеграла DMMA, используя тот же процесс, который был описан для экспериментов с использованием 1Н ЯМР. Количественное определение характерных сигналов эноксапарин натрия показано в следующей таблице:
Сигнал Cl-Hl ANS-I2S Cl-Hl ANS-I Cl-Hl ANS-G Cl-Hl ANS.3S Cl-Hl ANAc Cl-Hl ANAc-ared Относительная доля, % 25, 6-26, 9 2,6-3,0 5,1-5,5 1,5-1,7 2,7-3,5 < LC
- 11 037102
Cl-Hl ANS-red 3, 8-4,9
С1-Н1 1,6-ап.А 1,2-1,5
С1-Н1 1,6-ап.М 1, 6-1,9
Cl-Hl MNS-ared 1,0-1,3
Cl-Hl I2S 24,5-27,5
Cl-Hl I-A6S 2,4-2,7
Cl-Hl I-A6OH 0,3-0,4
Cl-Hl G-ANS.3S 1,4-1,6
Cl-Hl G-ANS 4,2-4,4
Cl-Hl G-ANAc 1,9-2,6
Cl-Hl G2S 1,1-1,6
Cl-Hl AU2S 11,5-12,4
Cl-Hl Au 0,3-0,5
Cl-Hl I2S-red 1,0-1,4
C5-H5 Gal-A < LC-0,5
Epox < LC-0,4
Эти эксперименты показывают, что, используя описанные выше экспериментальные условия, с помощью ядерного магнитного резонанса (1Н ЯМР и 1Н-13С HSQC) можно создать способ анализа гликозаминогликанов в целом и гепаринов и низкомолекулярных гепаринов, а также их производных, в частности, что позволяет проводить их количественный анализ.
Пример 3. Исследование бемипарин натрия методом 1H ЯМР.
Основные идентифицированные сигналы:
Сигнал Химический сдвиг, м.д. Сигнал Химический сдвиг, м.д.
H4 AU2S 5.992 Hl G 4.628
H4AU 5.825 H6 ANS6S 4.344
Hl 1,6-An A 5.616 H6’ ANS6S 4.210
Hl ANS(-G) 5.585 НЗ ANS 3.670
Hl 1,6-AnM 5.569 Н2 ANS3S 3.395
Hl AU2S 5.509 Н2 ANS 3.293
Hl ANS6S 5.405 NAc 2.047
Hl I2S 5.228 DMMA 1.320
Hl I 5.012 TSP 0.069
H5 I2S 4.836
Количественное определение характерных и хорошо дифференцированных сигналов бемипарин натрия (как правило, соответствующих аномерным протонам, H1) показано в следующей таблице с наблюдаемыми значениями относительной долевой пропорции для серии из шести образцов.
Пример 4.
Такое же решение, используемое в примере 3, используется для проведения исследования с использованием 1Н-13С HSQC. Основные идентифицированные сигналы:
- 12 037102
Сигнал δ !3C, м.д. δ !Н, м.д. Сигнал § i 3C, м.д. δ !Н, м.д.
С4-Н4 AU 110.71 5.82 C3-H3 Gal 85.45 3.78
С4-Н4 AU2S 108.97 5.99 C3-H3 Gal 84.85 3.83
Cl-Hl G//Gal 106.62 4.66 C4-H4 ANS6S(-G)// 80.94 3.84
ANS6S red
Cl-Hl Xyl 105.79 4.45 C2-H2 I2S 78.53 4.34
Cl-Hl G(-ANAc) 105.13 4.50 C3-H3 Xyl 77.82 3.72
Cl-Hl I(-A6S) 104.94 5.01 C2-H2 AU2S 77.42 4.62
Cl-Hl G(-ANS) 104.77 4.60 C2-H2 G(-AN6S) 75.70 3.40
Cl-Hl I(-A6OH) 104.67 4.94 C3-H3 ANS6S (-G) 72.47 3.66
Cl-Hl Gal 104.30 4.54 C3-H3 ANS6S red 72.29 3.77
Cl-Hl 1.6-an.A 104.22 5.61 C5-H5 I2S 72.01 4.83
Cl-Hl G (-ANS3S) 103.91 4.61 C3-H3 I2S 71.87 4.21
Cl-Hl 1.6-an.M 103.91 5.57 C5-H5 ANS6S(-G) 71.72 4.09
Cl-Hl AU 103.88 5.16 C5-H5 MNS6S red 70.98 4.15
Cl-Hl G2S 102.99 4.75 C5-H5 ANS6S red 70.64 4.12
C1-H1_I2S 102.09 5.22 C6-H6 1,6-an.A// 1,6-an.M 67.53 3.77
Cl-Hl I2S(-1,6an.M) 101.59 5.36 C5-H5 Xyl 65.89 4.12
Cl-Hl ANS(-G) 100.50 5.58 C5-H5 Xyl 65.86 3.40
Cl-Hl AN Ac 100.23 5.31 C3-H3 AU2S 65.75 4.32
Cl-Hl AU2S 100.18 5.51 C6-H6 Gal 63.90 3.74
Cl-Hl ANS(-I2S) 99.78 5.40 C2-H2 ANS6S red// ANS(-I2S) 60.82 3.28
Cl-Hl ANS6S 99.43 5.43 C2-H2 ANS6S(-G) 60.52 3.29
Cl-Hl ANS,3S 99.06 5.51 C2-H2 MNS6S red 60.38 3.60
Cl-Hl ANS Pred 98.73 4.71 C2-H2 1.6-an.A 58.50 3.21
Cl-Hl ANS(-I) 98.42 5.34 C2-H2 ANAc 56.68 3.92
Cl-Hl M ared 95.74 5.39 C2-H2 1.6-an.M 55.09 3.47
Cl-Hl I2S ared 95.70 5.42 DMMA 26.73 1.32
Cl-Hl I2S Pred 94.76 4.97 NAc 24.87 2.05
Cl-Hl ANS ared// 93.97 5.45
ANS6S red
Эти сигналы могут быть ассоциированы с моносахаридными компонентами молекулы, так что количественное определение сигналов позволяет определить ее моносахаридный состав.
Интегралы каждого из этих сигналов были нормализованы, начиная со значения, установленного для интеграла DMMA, используя ту же процедуру, которая была описана для экспериментов с использованием 1H ЯМР. Количественное определение характеристики сигналов бемипарин натрия показано в следующей таблице:
Сигнал Относительная доля
Cl-Hl 7XNS-I2S 26, 5-30, 6
Cl-Hl ANS-I 1,7-5,3
Cl-Hl ANS-G 2,1-3,8
Cl-Hl ANS.3S 0,6-2,5
Cl-Hl ANAc 1,7-3,0
Cl-Hl ANAc-ared < LC
Cl-Hl ANS-red 2,6-5,4
Cl-Hl 1,6-an.A <1,1
Cl-Hl 1,6-an.M <1,0
Cl-Hl MNS-ared 0,9-2,3
Cl-Hl I2S 30,4-34,9
Cl-Hl I-A6S 1,4-2,6
Cl-Hl I-A6OH < 0,2
Cl-Hl G-ANS.3S <2,5
Cl-Hl G-ANS 1,9-3,6
Cl-Hl G-ANAc 0,4-1,4
Cl-Hl G2S < 0,5
Cl-Hl AU2S 10,9-14,9
Cl-Hl Δυ 0,6-1,6
Cl-Hl I2S-red <0,5
C5-H5 Gal-A < 0,3
Пример 5. Исследование дальтепарин натрия методом 1H ЯМР.
- 13 037102
Основные идентифицированные сигналы:
Сигнал Химический сдвиг, м.д. Сигнал Химический сдвиг, м.д.
Hl ANS(-G) 5.585 Н6’ ANS6S 4.210
Hl ANS6S 5.405 НЗ ANS 3.670
Hl I2S 5.228 Н2 ANS3S 3.395
Hl I2S-(AM.O1) 5.178 Н2 ANS 3.293
Hl I 5.012 NAc 2.047
H5 I2S 4.836 DMMA 1.320
Hl G 4.628 TSP 0.069
H6 ANS6S 4.344
Количественное определение характерных и хорошо дифференцированных сигналов дальтепарин натрия (как правило, соответствующих аномерным протонам, H1) показано в следующей таблице с наблюдаемыми значениями относительной долевой пропорции для серии из шести образцов.
Сигнал Химический сдвиг, м.д. Относительная доля, %
Hl ANS6S 5.40 25.5-25.8
Hl I2S 5.23 19.2-20.8
Hl I2S-(AM.ol) 5.18 9.5-9.8
Н2 ANS 3.29 28.0-30.0
NAc 2.05 15.4-20.0
Пример 6.
Такое же решение, используемое в примере 5, используется для проведения исследования с использованием 1Н-13С HSQC. Основные идентифицированные сигналы:
Сигнал δ 13C, м.д. δ ‘H, м.д. Сигнал δ 13/-1 С, м.д. δ lH, м.д.
Cl-Hl G//Gal 106.62 4.66 C4-H4 ANS6S(-G) 80.94 3.84
Cl-Hl Xyl 105.79 4.45 C2-H2 I2S 78.53 4.34
Cl-Hl G(-ANAc) 105.13 4.50 C3-H3 Xyl 77.82 3.72
Cl-Hl I(-A6S) 104.94 5.01 C2-H2 G(-AN6S) 75.70 3.40
Cl-Hl G(-ANS) 104.77 4.60 C3-H3 ANS6S (-G) 72.47 3.66
Cl-Hl I(-A6OH) 104.67 4.94 C5-H5 I2S 72.01 4.83
Cl-Hl G(-ANS3S) 103.91 4.61 C3-H3 I2S 71.87 4.21
Cl-Hl G2S 102.99 4.75 C5-H5 ANS6S(-G) 71.72 4.09
Cl-Hl I2S 102.09 5.22 C5-H5 Xyl 65.89 4.12
Cl-Hl ANS(-G) 100.50 5.58 C5-H5 Xyl 65.86 3.40
Cl-Hl AN Ac 100.23 5.31 C6-H6 Gal 63.90 3.74
Cl-Hl ANS(-I2S) 99.78 5.40 AM.O1-6S 63.8/63.7 3.70/3.74
Cl-Hl ANS6S 99.43 5.43 C2-H2 ANS(-I2S) 60.82 3.28
Cl-Hl ANS,3S 99.06 5.51 C2-H2 ANS6S(-G) 60.52 3.29
Cl-Hl ANS(-I) 98.42 5.34 C2-H2 ANAc 56.68 3.92
C3-H3 Gal 85.45 3.78 DMMA 26.73 1.32
C3-H3 Gal 84.85 3.83 NAc 24.87 2.05
Эти сигналы могут быть ассоциированы с моносахаридными компонентами молекулы, так что количественное определение сигналов позволяет определить их моносахаридный состав.
Интегралы каждого из этих сигналов были нормализованы, начиная со значения, установленного для интеграла DMMA, используя ту же процедуру, которая была описана для экспериментов с использованием 1H ЯМР. Количественное определение характеристики сигналов дельтепарин натрия показано в следующей таблице:
Сигнал Относительная доля, %
Cl-Hl ANS-I2S 22.2-23.3
Cl-Hl ANS-I 3.0-3.2
Cl-Hl ANS-G 2.3-2.6
Cl-Hl ANS,3S 2.1-2.9
Cl-Hl ANAc 2.4-3.1
Cl-Hl I2S 24.5-27.5
Cl-Hl I-A6S 3.6-4.0
Cl-Hl G-ANS,3S 1.8-2.3
Cl-Hl G-ANS 2.5-3.5
Cl-Hl. C6-H6 AM.O1-6S 20.8-21.7
Пример 7. Исследование тинзапарин натрия методом 1Н ЯМР.
- 14 037102
Основные идентифицированные сигналы:
Сигнал Химический сдвиг, м.д. Сигнал Химический сдвиг, м.д.
Н4 AU2S 5.992 Н6 ANS6S 4.344
Н4 AU 5.825 Н6’ ANS6S 4.210
Hl ANS(-G) 5.585 НЗ ANS 3.670
Hl AU2S 5.509 Н2 ANS3S 3.395
Hl ANS6S 5.405 Н2 ANS 3.293
Hl I2S 5.228 NAc 2.047
Hl I 5.012 DMMA 1.320
H5 I2S 4.836 TSP 0.069
Hl G 4.628
Количественное определение характерных и хорошо дифференцированных сигналов тинзапарин натрия (как правило, соответствующих аномерным протонам, H1) показано в следующей таблице с наблюдаемыми значениями относительной долевой пропорции для серии из шести образцов.
Сигнал Химический сдвиг, м.д. Относительная доля,
Н4 AU2S 5.99 2.7
Hl AU2S 5.51 5.3
Hl ANS6S 5.40 23.6
Hl I2S 5.23 21.0
Н2 ANS 3.29 30.0
NAc 2.05 16.1
Пример 8.
Такое же решение, используемое в примере 7, используется для проведения исследования с использованием 1Н-13С HSQC. Основные идентифицированные сигналы:
Сигнал δ !3C, м.д. δ ‘H, м.д. Сигнал δ 1 5C, м.д. δ Я, м.д.
С4-Н4 AU 110.71 5.82 C3-H3 Gal 85.45 3.78
С4-Н4 AU2S 108.97 5.99 C3-H3 Gal 84.85 3.83
Cl-Hl G//Gal 106.62 4.66 C4-H4 ANS6S(-G)// ANS6S red 80.94 3.84
Cl-Hl Xyl 105.79 4.45 C2-H2 I2S 78.53 4.34
Cl-Hl G(-ANAc) 105.13 4.50 C3-H3 Xyl 77.82 3.72
Cl-Hl I(-A6S) 104.94 5.01 C2-H2 AU2S 77.42 4.62
Cl-Hl G(-ANS) 104.77 4.60 C2-H2 G(-AN6S) 75.70 3.40
Cl-Hl I(-A6OH) 104.67 4.94 C3-H3 ANS6S (-G) 72.47 3.66
Cl-Hl Gal 104.30 4.54 C3-H3 ANS6S red 72.29 3.77
Cl-Hl G(-ANS3S) 103.91 4.61 C5-H5 I2S 72.01 4.83
Cl-Hl AU 103.88 5.16 C3-H3 I2S 71.87 4.21
Cl-Hl G2S 102.99 4.75 C5-H5 ANS6S(-G) 71.72 4.09
Cl-Hl I2S 102.09 5.22 C5-H5 ANS6S red 70.64 4.12
Cl-Hl ANS(-G) 100.50 5.58 C5-H5 Xyl 65.89 4.12
Cl-Hl AN Ac 100.23 5.31 C5-H5 Xyl 65.86 3.40
Cl-Hl AU2S 100.18 5.51 C3-H3 AU2S 65.75 4.32
Cl-Hl ANS(-I2S) 99.78 5.40 C6-H6 Gal 63.90 3.74
Cl-Hl ANS6S 99.43 5.43 C2-H2 ANS6S red// ANS(-I2S) 60.82 3.28
Cl-Hl ANS,3S 99.06 5.51 C2-H2 ANS6S(-G) 60.52 3.29
Cl-Hl ANS Pred 98.73 4.71 C2-H2 MNS6S red 60.38 3.60
Cl-Hl ANS(-I) 98.42 5.34 C2-H2 ANAc 56.68 3.92
Cl-Hl I2S ared 95.70 5.42 DMMA 26.73 1.32
Cl-Hl I2S Pred Cl-Hl ANS ared// ANS6S red 94.76 93.97 4.97 5.45 NAc 24.87 2.05
Эти сигналы могут быть ассоциированы с моносахаридными компонентами молекулы, так что количественное определение сигналов позволяет определить их моносахаридный состав.
Интегралы каждого из этих сигналов были нормализованы, начиная со значения, установленного для интеграла DMMA, используя ту же процедуру, которая была описана для экспериментов с использованием 1Н ЯМР. Количественное определение характеристики сигналов тинзапарин натрия показано в следующей таблице:
- 15 037102
Сигнал Относительная доля, %
Cl-Hl ANS-I2S 27.2
Cl-Hl ANS-1 3.2
Cl-Hl ANS-G 3.4
Cl-Hl ANS.3S 1.2
Cl-Hl ANAc 3.7
Cl-Hl ANAc-ared < LC
Cl-Hl ANS-red 6.5
Cl-Hl I2S 35.1
Cl-Hl I-A6S 3.1
Cl-Hl I-A6OH 0.8
Cl-Hl G-ANS,3S 1.5
Cl-Hl G-ANS 3.4
Cl-Hl G-ANAc 2.2
Cl-Hl AU2S 8.6
Cl-Hl I2S-red <0.1
Эти эксперименты показывают, что используя описанные выше экспериментальные условия, с помощью ядерного магнитного резонанса (1Н ЯМР и 1Н-13С HSQC) можно создать способ анализа гликозаминогликанов в целом и гепаринов и низкомолекулярных гепаринов, а также их производных, в частности, что позволяет проводить их количественный анализ.

Claims (17)

1. Способ анализа состава, содержащего моносахаридные остатки, присутствующие в цепях гепарина, с помощью одномерного ядерного магнитного резонанса 1H ЯМР и/или двумерного ядерного магнитного резонанса 1Н-13С HSQC, включающий следующие этапы:
a) получение состава, включающего по меньшей мере один моносахаридный остаток, присутствующий в цепях гепарина, и получение его спектра путем одномерного ядерного магнитного резонанса 1H ЯМР и/или двумерного ядерного магнитного резонанса 1Н-13С HSQC с использованием диметилмалоновой кислоты (DMMA) в качестве внутреннего эталона, и затем
b) выявление в спектре ЯМР факта присутствия или отсутствия как минимум одного сигнала как минимум одного остатка, выбранного из группы, состоящей из 4,5-ненасыщенной 2-О-сульфоуроновой кислоты (AU2S), 4,5-ненасыщенной уроновой кислоты (AU), 2-N-сульфо-1,6-ангидроглюкозамина (1,6an.A), 2-N-сульфо-1,6-ангидроманнозамина (1,6-an.M), 2-N-сульфо-6-O-сульфоглюкозамина (ANS6S), 2, 5-ангидроманнита, N-сульфоглюкозамина, глюкуроновой кислоты, N-сульфо-6-O-сульфоглюкозамина, 2-О-сульфоидуроновой кислоты, идуроновой кислоты, N-сульфо-3-О-сульфоглюкозамина, N-сульфо-3,6ди-О-сульфоглюкозамина, галактуроновой кислоты, ксилозы, N-ацетилглюкозамина и N-ацетил-6-Oсульфоглюкозамина, отличающийся тем, что наличие указанных ЯМР-сигналов в определенной относительной пропорции ее нормализованных интегралов по отношению к DMMA или их отсутствие составляет образец, который позволяет идентифицировать гепарин, который представляет собой моносахаридный остаток, путем сравнения модели, полученной в анализе, с эталоном, ранее полученным для разных гепаринов при тех же условиях.
2. Способ по п.1, где в спектре 1H ЯМР идентифицируют следующую структуру:
Сигнал Химический сдвиг, м.д. Относительная доля, % H4 AU2S 5,99 4,3-4,7 H4 AU 5,82 0,2 Hl 1,6-an.A 5,62 0,7-0,9 Hl 1,6-an.M 5,57 4,1-4,4 Hl AU2S 5,51 5,7-6,0 Hl ANS6S 5,40 16,1-16,7 Hl I2S 5,23 13,1-14,4 H5 I2S 4,84 14,3-16,3 H2 ANS 3,29 24,3-26,6 NAc 2,05 12,0-15,3 тем самым определяя, что моносахаридные остатки происходят из эноксапарин натрия.
3. Способ по п.1, где в спектре 1Н-13С HSQC ЯМР идентифицируют следующую структуру:
- 16 037102 Сигнал Относительная доля, % Cl-Hl ANS-I2S 25,6-26,9 Cl-Hl ANS-I 2,6-3,0 Cl-Hl ANS-G 5,1-5,5 Cl-Hl ANS.3S 1,5-1,7 Cl-Hl ANAc 2,7-3,5 Cl-Hl ANAc-ared <LC Cl-Hl ANS-red 3,8-4,9 Cl-Hl 1,6-an.A 1,2-1,5 Cl-Hl 1,6-an.M 1,6-1,9 Cl-Hl MNS-ared 1,0-1,3 Cl-Hl I2S 24,5-27,5 Cl-Hl I-A6S 2,4-2,7 Cl-Hl I-A6OH 0,3-0,4 Cl-Hl G-ANS.3S 1,4-1,6 Cl-Hl G-ANS 4,2-4,4 Cl-Hl G-ANAc 1,9-2,6 Cl-Hl G2S 1,1-1,6 Cl-Hl AU2S 11,5-12,4 Cl-Hl AU 0,3-0,5 Cl-Hl I2S-red 1,0-1,4 C5-H5 Gal-A < LC-0,5 Epox < LC-0,4 где LC является пределом количественной оценки, тем самым определяя, что моносахаридные остатки происходят из эноксапарин натрия.
4. Способ по п.1, где в спектре 1Н ЯМР идентифицируют следующую структуру:
Сигнал Химический сдвиг, м.д. Относительная доля, H4 AU2S 5,99 3,7-5,7 H4 AU 5,82 0,2-2,5 Hl 1,6-an.A 5,62 0,5-2,5 Hl 1,6-an.M 5,57 2,5-6,0 Hl AU2S 5,51 7,0-10,7 Hl ANS6S 5,40 19,0-21,3 Hl I2S 5,23 13,8-18,5 H2 ANS 3,29 18,7-26,3 NAc 2,05 9,4-14 тем самым определяя, что моносахаридные остатки происходят из бемипарин натрия.
5. Способ по п.1, где в спектре 1Н-13С HSQC ЯМР идентифицируют следующую структуру:
Сигнал Относительная доля, % Cl-Hl ANS-I2S 26,5-30,6 Cl-Hl ANS-I 1,7-5,3 Cl-Hl ANS-G 2,1-3,8 Cl-Hl ANS.3S 0,6-2,5 Cl-Hl ANAc 1,7-3,0 Cl-Hl ANAc-ared < LC Cl-Hl ANS-red 2,6-5,4 Cl-Hl 1,6-an.A < i,i Cl-Hl 1,6-an.M < ι,ο Cl-Hl MNS-ared 0,9-2,3 Cl-Hl I2S 30,4-34,9 Cl-Hl I-A6S 1,4-2,6 Cl-Hl I-A6OH <0,2 Cl-Hl G-ANS.3S <2,5 Cl-Hl G-ANS 1,9-3,6 Cl-Hl G-ANAc 0,4-1,4 Cl-Hl G2S <0,5 Cl-Hl AU2S 10,9-14,9 Cl-Hl AU 0,6-1,6 Cl-Hl I2S-red <0,5 C5-H5 Gal-A <0,3
- 17 037102 тем самым определяя, что моносахаридные остатки происходят из бемипарин натрия.
6. Способ по п.1, где в спектре 1H ЯМР идентифицируют следующую структуру:
Сигнал Химический сдвиг, м.д. Относительная доля,% Hl ANS6S 5,40 25,5-25,8 Hl I2S 5,23 19,2-20,8 Hl I2S-(AM.ol) 5,18 9,5-9,8 Н2 ANS 3,29 28,0-30,0 NAc 2,05 15,4-20,0 тем самым определяя, что моносахаридные остатки происходят из дальтепарин натрия.
7. Способ по п.1, где в спектре 1Н-13С HSQC ЯМР идентифицируют следующую структуру:
Сигнал Относительная доля, °A Cl-Hl ANS-I2S 22,2-23,3 Cl-Hl ANS-I 3,0-3,2 Cl-Hl ANS-G 2,3-2,6 Cl-Hl ANS.3S 2,1-2,9 Cl-Hl ANAc 2,4-3,1 Cl-Hl I2S 24,5-27,5 Cl-Hl I-A6S 3,6-4,0 Cl-Hl G-ANS.3S 1,8-2,3 Cl-Hl G-ANS 2,5-3,5 Cl-Hl. C6-H6 AM.0I-6S 20,8-21,7 тем самым определяя, что моносахаридные остатки происходят из дальтепарин натрия.
8. Способ по п.1, где в спектре 1H ЯМР идентифицируют следующую структуру: тем самым определяя, что моносахаридные остатки происходят из тинзапарин натрия Сигнал Химический сдвиг, м.д. Относительная доля, % H4 AU2S 5,99 2,7 Hl AU2S 5,51 5,3 Hl ANS6S 5,40 23,6 Hl I2S 5,23 21,0 H2 ANS 3,29 30,0 NAc 2,05 16,1
9. Способ по п.1, где в спектре 1Н-13С HSQC ЯМР идентифицируют следующую структуру Сигнал Относительная доля, % Cl-Hl ANS-I2S 27,2 Cl-Hl ANS-I 3,2 Cl-Hl ANS-G 3,4 Cl-Hl ANS.3S 1,2 Cl-Hl ANAc 3,7 Cl-Hl ANAc-ared < LC Cl-Hl ANS-red 6,5 Cl-Hl I2S 35,1 Cl-Hl I-A6S 3,1 Cl-Hl I-A6OH 0,8 Cl-Hl G-ANS.3S 1,5 Cl-Hl G-ANS 3,4 Cl-Hl G-ANAc 2,2 Cl-Hl AU2S 8,6 Cl-Hl I2S-red <0,1 тем самым определяя, что моносахаридные остатки происходят из тинзапарин натрия.
10. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором сигналы, соответствующие Nацетильным группам, присутствуют в области от 1,8 до 2,1 м.д. в 1H ЯМР-спектроскопии.
11. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором сигналы, соответствующие сахаридному кольцу указанных остатков, проявляются в области от 2,8 до 6,0 м.д. в 1Н ЯМР-спектроскопии.
12. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором сигналы, соответствующие аномерным протонам H1 и протонам Н4 невосстанавливающих концов одного из указанных остатков, находятся в области между 4,6 и 6,0 м.д. в 1Н ЯМР-спектроскопии.
13. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором в 1Н ЯМР-спектроскопии сигналы 4,5-ненасыщенной 2-О-сульфоуроновой кислоты (ΔU2S) появляются в области между 5,99 и 5,51 м.д. для Н4 и аномерных протонов соответственно, а сигнал 4,5-ненасыщенной уроновой кислоты (AU) появляется в области 5,82 м.д. для протона Н4, сигнал 2-N-сульфо-1,6-ангидроглюкозамина (1,6-an.A) появ-
- 18 037102 ляется в области 5,62 м.д. для аномерного протона, сигнал 2-Ы-сульфо-1,6-ангидроманнозамина (1,6an.M) появляется в области 5,57 м.д. для аномерного протона, а сигналы 2-Ы-сульфо-6-Осульфоглюкозамина появляются в области между 5,41 и 4,21-4,34 м.д. для протонов H1 и Н6 и Н6' соответственно.
14. Способ по любому из предшествующих пунктов, где в 1Н-13С HSQC ЯМР-спектроскопии сигналы 4,5-ненасыщенной 2-О-сульфоуроновой кислоты (ΔU2S) появляются при 6,0-109,0 м.д. (Н4-С4), 5,5100,2 м.д. (Н1-С1), 4,6-77,4 м.д. (Н2-С2) или 4,3-66,8 м.д. (Н3-С3), сигналы 4,5-ненасыщенной уроновой кислоты (ΔU) появляются при 5,8-110,7 м.д. (Н4-С4) или 5,2-103,9 м.д. (Н1-С1), сигналы 2-Ы-сульфо-1,6ангидроглюкозамина (1,6-an.A) появляются при 5,6-104,2 м.д. (Н1-С1), 3,2-58,5 м.д. (Н2-С2) или 3,8-67,5 м.д. (Н6-С6), сигналы 2-Ы-сульфо-1,6-ангидроманнозамина (1,6-ап.М) появляются при 5,6-103,9 м.д. (Н1С1), 3,5-55,1 (Н2-С2) или 3,8-67,5 м.д. (Н6-С6), а сигналы 2-N-сульфо-6-O-сульфоглюкозамина появляются при 5,4-99,4 м.д. (Н1-С1), 3,8-80,9 м.д. (Н4-С4), от 3,7 до 3,8- от 42,3 до 72,5 м.д. (Н3-С3), 4,1- от 70,6 до 71,7 м.д. (Н5-С5) или от 3,3 до 60,5-60,8 м.д. (Н2-С2.)
15. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором модель, полученная в результате анализа, является таковой, которая определяет, что моносахаридные остатки происходят из нефракционированного гепарина.
16. Способ по любому из пп.1-8, в котором модель, полученная при анализе, является таковой, которая определяет, что моносахаридные остатки происходят из низкомолекулярного гепарина (LMWH).
17. Способ по любому из пп.1-8, в котором модель, полученная при анализе, является таковой, которая определяет, что остатки моносахаридов происходят из ультранизкомолекулярного гепарина (ULMWH).
EA201990005A 2016-07-19 2017-07-19 Способ анализа гликозаминогликанов, гепаринов и их производных методом ямр (ядерного магнитного резонанса) EA037102B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16382350.3A EP3273239A1 (en) 2016-07-19 2016-07-19 Procedure of analysis of glycosaminoglycans, heparins and their derivatives by nuclear magnetic resonance
PCT/EP2017/068285 WO2018015463A1 (en) 2016-07-19 2017-07-19 Method for the analysis of glycosaminoglycans, heparins and their derivatives by nuclear magnetic resonance

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201990005A1 EA201990005A1 (ru) 2019-06-28
EA037102B1 true EA037102B1 (ru) 2021-02-05

Family

ID=56682072

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201990005A EA037102B1 (ru) 2016-07-19 2017-07-19 Способ анализа гликозаминогликанов, гепаринов и их производных методом ямр (ядерного магнитного резонанса)

Country Status (27)

Country Link
US (2) US10705037B2 (ru)
EP (2) EP3273239A1 (ru)
JP (1) JP7035007B2 (ru)
CN (1) CN109477829B (ru)
AR (1) AR109099A1 (ru)
AU (1) AU2017299186C1 (ru)
BR (1) BR112019000437A2 (ru)
CA (1) CA3029924A1 (ru)
CL (1) CL2019000038A1 (ru)
CO (1) CO2019000087A2 (ru)
CR (1) CR20190016A (ru)
CY (1) CY1124817T1 (ru)
DK (1) DK3452827T3 (ru)
DO (1) DOP2019000003A (ru)
EA (1) EA037102B1 (ru)
ES (1) ES2894898T3 (ru)
HR (1) HRP20211649T1 (ru)
HU (1) HUE056604T2 (ru)
LT (1) LT3452827T (ru)
MA (1) MA44876A (ru)
PL (1) PL3452827T3 (ru)
PT (1) PT3452827T (ru)
SI (1) SI3452827T1 (ru)
UA (1) UA124466C2 (ru)
UY (1) UY37337A (ru)
WO (1) WO2018015463A1 (ru)
ZA (1) ZA201900143B (ru)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102018203434B4 (de) * 2018-03-07 2019-12-05 Bernd Willi Karl-Heinz Diehl Verfahren zur heteronuklearen quantitativen Bestimmung mittels NMR-Spektroskopie, Referenzsubstanzen hierfür und Verfahren zur Bestimmung des Deuterierungsgrades einer deuterierten Verbindung
CN112816566A (zh) * 2019-11-17 2021-05-18 烟台东诚药业集团股份有限公司 一种那屈肝素钙末端结构确认方法
CN111337529B (zh) * 2020-03-12 2023-06-16 青岛科技大学 一种降低粘度、使水峰偏移的多糖样品制备和测试方法
JP7377937B2 (ja) * 2021-10-20 2023-11-10 シオノギヘルスケア株式会社 オリゴ糖の還元末端糖の定量的分析方法
CN114018965A (zh) * 2021-11-04 2022-02-08 五源本草(山东)健康科技有限公司 一种多糖核磁共振氢谱法定量检测技术
CN117990732B (zh) * 2024-04-02 2024-06-25 浙江大学 一种基于分离的分段同源多糖组的多糖结构解析方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7968082B1 (en) * 2007-01-26 2011-06-28 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Evaluating mixtures of low molecular weight heparins by NMR

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20020071931A (ko) 2000-01-07 2002-09-13 트렌스폼 파마수티컬스 인코퍼레이티드 다양한 고체-형태들의 고도의 자료 처리 편성, 확인 및분석
CA2486456C (en) 2002-05-20 2012-07-17 Massachusetts Institute Of Technology Method for sequence determination using nmr
JP2004339083A (ja) 2003-05-13 2004-12-02 Bioserentack Co Ltd ムコ多糖類製剤
JP2005337958A (ja) 2004-05-28 2005-12-08 Kao Corp 水溶性の糖骨格を有する化合物の分析法
JP2005345193A (ja) 2004-06-01 2005-12-15 Shiseido Co Ltd 核磁気共鳴法及び／又は核磁気共鳴による拡散係数測定法を用いた定量方法
JP2006291028A (ja) 2005-04-11 2006-10-26 Q P Corp 低分子ヘパリンまたはその塩、ならびにその製造方法
EP2213282A1 (en) 2009-01-30 2010-08-04 Laboratorios Farmaceuticos Rovi, S.A. Pharmaceutical forms for the release of active compounds
US8802156B2 (en) 2007-11-14 2014-08-12 Laboratorios Farmacéuticos Rovi, S.A. Pharmaceutical forms for the release of active compounds
ES2340902B1 (es) 2008-07-01 2011-05-03 Laboratorios Farmaceuticos Rovi, S.A. Composicion farmaceutica con glicosaminoglicanos y su uso en tratamiento de ulceras cronicas.
ES2336297B1 (es) 2008-10-08 2011-01-24 Laboratorios Farmaceuticos Rovi, S.A. Procedimiento de sintesis de pentasacaridos desprotegidos a partir deun pentasacarido precursos protegido.
JP5372696B2 (ja) 2009-10-20 2013-12-18 杏林製薬株式会社 ジメチルアミノエチルメタクリレート含有共重合体の定量法
CN105452479B (zh) 2013-06-17 2021-05-18 北卡罗来纳大学查珀尔希尔分校 可逆肝素分子

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7968082B1 (en) * 2007-01-26 2011-06-28 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Evaluating mixtures of low molecular weight heparins by NMR

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FELISA REYES-ORTEGA, FRANCISCO J. PARRA-RUIZ, SAADYAH E. AVERICK, GEMA RODR�GUEZ, MAR�A ROSA AGUILAR, KRZYSZTOF MATYJASZEWSKI, JUL: "Smart heparin-based bioconjugates synthesized by a combination of ATRP and click chemistry", POLYMER CHEMISTRY, vol. 4, no. 9, 1 January 2013 (2013-01-01), pages 2800, XP055418249, ISSN: 1759-9954, DOI: 10.1039/c3py00055a *
M. A. LIMA, C. VISKOV, F. HERMAN, A. L. GRAY, E. H. C. DE FARIAS, R. P. CAVALHEIRO, G. L. SASSAKI, D. HOPPENSTEADT, J. FAREED, H. : "Ultra-low-molecular-weight heparins: Precise structural features impacting specific anticoagulant activities :", THROMBOSIS AND HAEMOSTASIS, SCHATTAUER GMBH, DE, vol. 109, no. 3, DE, pages 471 - 478, XP055418248, ISSN: 0340-6245, DOI: 10.1160/TH12-11-0795 *
MASSIMO FRANCHINI, LIUMBRUNO GIANCARLO M, BONFANTI CARLO, LIPPI GIUSEPPE: "The evolution of anticoagulant therapy", BLOOD TRANSFUSION, S I M T I SERVIZI SRL, ITALY, vol. 14, no. 2, 1 March 2016 (2016-03-01), Italy, pages 175 - 84, XP055404540, ISSN: 1723-2007, DOI: 10.2450/2015.0096-15 *
MICHAEL WEBER, CHRISTINE HELLRIEGEL, ALEX R�CK, ROBERT SAUERMOSER, J�RG W�THRICH: "Using high-performance quantitative NMR (HP-qNMR�) for certifying traceable and highly accurate purity values of organic reference materials with uncertainties <0.1�%", ACCREDITATION AND QUALITY ASSURANCE, SPRINGER BERLIN HEIDELBERG, BERLIN/HEIDELBERG, vol. 18, no. 2, 1 April 2013 (2013-04-01), Berlin/Heidelberg, pages 91 - 98, XP055312811, ISSN: 0949-1775, DOI: 10.1007/s00769-012-0944-9 *
MOURIER PIERRE A.J.; AGUT CHRISTOPHE; SOUAIFI-AMARA HAJER; HERMAN FR�DERIC; VISKOV CHRISTIAN: "Analytical and statistical comparability of generic enoxaparins from the US market with the originator product", JOURNAL OF PHARMACEUTICAL AND BIOMEDICAL ANALYSIS, ELSEVIER B.V., AMSTERDAM, NL, vol. 115, 29 July 2015 (2015-07-29), AMSTERDAM, NL, pages 431 - 442, XP029272868, ISSN: 0731-7085, DOI: 10.1016/j.jpba.2015.07.038 *
S.-N. M. C. G. OLIVEIRA, G. R. C. SANTOS, B. F. GLAUSER, N. V. M. CAPILL�, I. N. L. QUEIROZ, M. S. PEREIRA, V. H. POMIN, P. A. S. : "Structural and functional analyses of biosimilar enoxaparins available in Brazil", THROMBOSIS AND HAEMOSTASIS, SCHATTAUER GMBH, DE, vol. 113, no. 1, DE, pages 53 - 65, XP055312810, ISSN: 0340-6245, DOI: 10.1160/TH14-05-0411 *
YONGMEI XU, CAI CHAO, CHANDARAJOTI KASEMSIRI, HSIEH PO-HUNG, LI LINGYUN, PHAM TRUONG Q, SPARKENBAUGH ERICA M, SHENG JUZHENG, KEY N: "Homogeneous low-molecular-weight heparins with reversible anticoagulant activity", NATURE CHEMICAL BIOLOGY, NATURE PUB. GROUP, NEW YORK, vol. 10, no. 4, 1 April 2014 (2014-04-01), New York, pages 248 - 250, XP055306990, ISSN: 1552-4450, DOI: 10.1038/nchembio.1459 *

Also Published As

Publication number Publication date
BR112019000437A2 (pt) 2019-04-30
US20200271601A1 (en) 2020-08-27
WO2018015463A1 (en) 2018-01-25
DK3452827T3 (da) 2021-10-11
ES2894898T3 (es) 2022-02-16
MA44876A (fr) 2021-04-21
US20190154601A1 (en) 2019-05-23
JP7035007B2 (ja) 2022-03-14
UA124466C2 (uk) 2021-09-22
AU2017299186C1 (en) 2023-07-06
WO2018015463A9 (en) 2018-05-11
EA201990005A1 (ru) 2019-06-28
DOP2019000003A (es) 2019-06-30
CR20190016A (es) 2019-05-17
SI3452827T1 (sl) 2022-01-31
HRP20211649T1 (hr) 2022-02-04
AU2017299186A1 (en) 2019-01-24
CA3029924A1 (en) 2018-01-25
CL2019000038A1 (es) 2019-05-10
CN109477829A (zh) 2019-03-15
JP2019525166A (ja) 2019-09-05
CO2019000087A2 (es) 2019-04-30
US10705037B2 (en) 2020-07-07
PL3452827T3 (pl) 2022-02-14
EP3452827A1 (en) 2019-03-13
ZA201900143B (en) 2019-09-25
UY37337A (es) 2018-01-31
CN109477829B (zh) 2022-06-21
HUE056604T2 (hu) 2022-02-28
CY1124817T1 (el) 2022-11-25
AR109099A1 (es) 2018-10-31
EP3452827B1 (en) 2021-08-25
LT3452827T (lt) 2021-11-25
EP3273239A1 (en) 2018-01-24
US10809212B2 (en) 2020-10-20
AU2017299186B2 (en) 2023-04-13
PT3452827T (pt) 2021-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3452827B1 (en) Method for the analysis of glycosaminoglycans, heparins and their derivatives by nuclear magnetic resonance
Mauri et al. Qualification of HSQC methods for quantitative composition of heparin and low molecular weight heparins
Linhardt et al. Production and chemical processing of low molecular weight heparins
US7968082B1 (en) Evaluating mixtures of low molecular weight heparins by NMR
Li et al. Mapping of low molecular weight heparins using reversed phase ion pair liquid chromatography–mass spectrometry
Bednarek et al. An assessment of polydispersed species in unfractionated and low molecular weight heparins by diffusion ordered nuclear magnetic resonance spectroscopy method
US8273580B2 (en) Method of measuring the concentration of a glycosaminoglycan anticoagulant
Monakhova et al. Nuclear magnetic resonance spectroscopy as a tool for the quantitative analysis of water and ions in pharmaceuticals: example of heparin
Desai et al. Molecular weight of heparin using 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy
Kasaai The use of various types of NMR and IR spectroscopy for structural characterization of chitin and chitosan
EP2697265A1 (en) Polysaccharides comprising two antithrombin iii-binding sites, preparation thereof and use thereof as antithrombotic medicaments
EP2642288A1 (en) Profiling oligosaccharides associated with biological activities of heparin or heparin derivatives
Rudd et al. Multivariate analysis applied to complex biological medicines
Ruiz-Calero et al. Potentiality of proton nuclear magnetic resonance and multivariate calibration methods for the determination of dermatan sulfate contamination in heparin samples
DK2881404T3 (en) Process for obtaining low molecular weight and very low molecular weight heparin
Yi et al. Qualitative and quantitative analysis of 2, 5-anhydro-d-mannitol in low molecular weight heparins with high performance anion exchange chromatography hyphenated quadrupole time of flight mass spectrometry
Gardini et al. Saturated tetrasaccharide profile of enoxaparin. An additional piece to the heparin biosynthesis puzzle
Guerrini et al. NMR in the Characterization of Complex Mixture Drugs
Rudd et al. New Methods for the Analysis of Heterogeneous Polysaccharides–Lessons Learned from the Heparin Crisis
Alekseeva COMBINED NMR/LC-MS APPROACH FOR STRUCTURAL CHARACTERIZATION OF HEPARINS AND NON-ANTICOAGULANT GLYCOL-SPLIT HEPARINS
Kasaai 12 The Use of Various Types
ŞEN et al. 6. Determination of chitosan degree of deacetylation using various techniques
Langeslay Advancing Analytical Methods for Characterization of Anionic Carbohydrate Biopolymers