ES2894898T3

ES2894898T3 - Método de análisis de glicosaminoglicanos, heparinas y sus derivados por resonancia magnética nuclear

Info

Publication number: ES2894898T3
Application number: ES17749132T
Authority: ES
Inventors: Guillermo Franco; Ibon Gutierro
Original assignee: Laboratorios Farmaceuticos Rovi SA
Current assignee: Laboratorios Farmaceuticos Rovi SA
Priority date: 2016-07-19
Filing date: 2017-07-19
Publication date: 2022-02-16
Anticipated expiration: 2037-07-19
Also published as: EP3452827A1; HRP20211649T1; EA037102B1; US10705037B2; PT3452827T; PL3452827T3; EA201990005A1; CO2019000087A2; BR112019000437A2; US20190154601A1; WO2018015463A1; AU2017299186C1; AU2017299186A1; HUE056604T2; UY37337A; US10809212B2; AU2017299186B2; CA3029924A1; SI3452827T1; JP2019525166A

Abstract

Método de análisis de una composición que contiene residuos monosacarídicos presentes en cadenas de hepa- rinas mediante resonancia magnética nuclear monodimensional de 1H-RMN y/o resonancia magnética nuclear bidimensional de 1H-13C HSQC que comprende las etapas de: a. proporcionar una composición que incluye al menos un residuo monosacarídico presente en cadenas de heparinas y obtener su espectro de resonancia magnética nuclear monodimensional de 1H-RMN y/o resonancia magnética nuclear bidimensional de 1H-13C HSQC utilizando ácido dimetilmalónico (DMMA) como referencia interna y D2O como disolvente, e b. identificar en el espectro RMN la presencia o la ausencia de al menos una señal de al menos un residuo seleccionado del grupo que consiste en: ácido 4,5-insaturado 2-O-sulfo urónico (ΔU2S), ácido 4,5-insaturado urónico (ΔU), 2-N-sulfo-1,6-anhidroglucosamina (1,6-an.A), 2-N-sulfo-1,6-anhidroma- nosamina (1,6-an.M), 2-N-sulfo-6-O-sulfoglucosamina (ANS6S), 2,5-anhidro manitol, N-sulfogluco- samina, ácido glucurónico, N-sulfo-6-O-sulfoglucosamina, ácido 2-O-sulfoidurónico, ácido idurónico, N-sulfo-3-O-sulfoglucosamina, N-sulfo-3,6-di-O-sulfoglucosamina, ácido galacturónico, Xilosa, N- acetilglucosamina y N-acetil-6-O-sulfoglucosamina, caracterizado porque la presencia de dichas señales de RMN en una determinada proporción relativa de sus integrales normalizadas con respecto a DMMA, o la ausencia de las mismas, conforma un patrón que permite identificar la heparina de la que procede el residuo monosacarídico comparando el patrón obtenido en el análisis con un patrón estándar previamente obtenido para diversas heparinas en las mismas condiciones.

Description

DESCRIPCIÓN

Método de análisis de glicosaminoglicanos, heparinas y sus derivados por resonancia magnética nuclear

Campo de la invención

La presente invención describe un método analítico mediante resonancia magnética nuclear (1H-RMN y 1H-13C HSQC) para la caracterización de glicosaminoglicanos en general, y de heparinas y heparinas de bajo peso molecular y sus derivados en particular, que permite su análisis cuantitativo.

Antecedentes de la invención

La espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) es una de las más importantes y extendidas técnicas analí ticas utilizadas en la caracterización de glicosaminoglicanos en general, y heparinas y heparinas de bajo peso molecular y sus derivados en particular.

La posibilidad de realizar tanto experimentos monodimensionales como bidimensionales hace a esta técnica altamente sensible para determinar pequeñas variaciones de la estructura molecular, haciéndola muy ventajosa para una adecuada caracterización de estos compuestos.

Los glicosaminoglicanos (GAGs) son polisacáridos lineales y cargados negativamente con un peso molecular medio entre 10 -100 KDa (The Structure of Glycosaminoglycans and their Interactions with Proteins. Gandhi NS y Mancera RL. Chem Biol Drug Des 2008; 72:455-482). Hay dos grandes grupos de glicosaminoglicanos: los no sulfatados (como ácido hialurónico) y los sulfatados (como condroitín sulfato, dermatán sulfato, keratán sulfato, heparina y heparán sulfato). Las ca denas de glicosaminoglicanos están formadas por unidades disacarídicas o disacáridos compuestos por un ácido urónico (ácido D-glucurónico o L-idurónico) y un amino azúcar (D-galactosamina o D-glucosamina).

Ácido hialurónico: Condroitín sulfato:

Dermatán sulfato Heparina

Heparán sulfato: Keratán sulfato:

Fórmula 1: Estructura general de la unidad disacarídica para los diferentes tipos de glicosaminoglicanos

La heparina es un polisacárido de la familia de los glicosaminoglicanos, formado por ácido urónico (ácido L-idurónico o D-glucurónico) y D-glucosamina, unidos de forma alternada. El ácido L-idurónico puede estar 2-O-sulfatado y la D-glucosamina, puede estar W-sulfatada y/o 6-O-sulfatada, y en menor extensión W-acetilada ó 3-O-sulfatada (Mapping and quantification of the major oligosaccharides component of heparin. Linhardt RJ, Rice KG, Kim YS et al. Biochem J 1988; 254:781-787). La unidad disacarídica de repetición mayoritaria corresponde al disacárido trisulfatado, ácido 2-O-sulfo L-idurónico (1^4 ) 2-N-sulfo-6-O-sulfo D-glucosamina.

El origen de esta variabilidad estructural presente en las cadenas oligosacarídicas de heparina se encuentra en su biosíntesis y en el mecanismo que lo regula. Así, en la primera etapa de biosíntesis, un fragmento tetrasacarídico formado por glucosa-galactosa-galactosa-xilosa se une a un núcleo proteico, comenzando la biosíntesis de la cadena glicoproteica. A continuación, se van incorporando alternativamente residuos de ácido glucurónico (GlcA) y residuos de N-acetil glucosamina (GlcNAc) formando una cadena polisacarídica de aproximadamente 300 unidades. A la vez que se produce este alargamiento de la cadena y debido a la intervención de diversas enzimas, otras modificaciones se producen en ella. Así la acción de enzimas N-deacetilasa/N-sulfotransferasa produce la N-deacetilación y N-sulfatación de las unidades de GlcNAc, convirtiéndolas en N-sulfoglucosamina (GlcNS). Una C5 epimerasa cataliza la transformación de ciertas unida des de GlcA en ácido idurónico (IdoA), seguido de una 2-O-sulfatación por la acción de una 2-O-sulfotransferasa. A continuación una 6-O-sulfotransferasa, transfiere un grupo 6-O-sulfo a unidades de GlcNS y GlcNAc. Finalmente una 3-O-sulfotransferasa actúa sobre ciertas unidades de N-sulfo-6-O-sulfo glucosamina (GlcNS6S) generando residuos de N-sulfo-3,6-di-O-sulfo glucosamina (GlcNS3S6S).

La naturaleza aparentemente aleatoria e incompleta de la N-desacetilación inicial, es la principal responsable de la intro ducción de la heterogeneidad estructural en heparina en la primera fase de su biosíntesis. La variabilidad estructural en cuanto al grado y posiciones de sulfatación es el resultado de la naturaleza incompleta de modificaciones realizadas por las enzimas biosintéticas que conducen a la obtención de moléculas de heparina de sodio con un patrón de sustitución disacarídico variable.

La heparina se usa preferentemente como sal sódica, pero también puede usarse como sal de otros metales alcalinos o alcalinotérreos y se utiliza principalmente como medicamento antitrombótico y anticoagulante (Anticoagulant therapy for major arterial and venous thromboembolism. Tran HAM, Ginsberg JS. Basic principles and clinical practice. Colman RW, Marder VJ, Clowes AW, George JN, Goldhaber SZ (Ed). Lippincott Williams y Wilkins; 2006:1673-1688).

Las heparinas se pueden clasificar en función de su peso molecular en: heparina no fraccionada (HNF), heparina de bajo peso molecular (HBPM) con un peso molecular medio inferior a 8000 Da y heparina de muy bajo peso molecular (HMBPM) con un peso molecular medio inferior a 3000 Da (Chemoenzymatic synthesis of homogenous ultra low molecular weight heparins. Xu Y. et al. Science 2011; 334: 498-501). Las HBPM y HMBPM provienen de la despolimerización de la molécula original de HNF y su procedimiento de fabricación puede introducir ciertas características del mismo en la estructura de la molécula. Así, la estructura de la molécula resultante deriva por un lado de la estructura de la heparina utilizada como material de partida y de otra parte de los residuos característicos generados y característicos al método de fabricación usado.

El proceso de fabricación de enoxaparina sódica (p-eliminación por tratamiento alcalino sobre éster bencílico de heparina en medio acuoso) y bemiparina sódica (p-eliminación por tratamiento alcalino en medio no acuoso) genera como especies mayoritarias en los terminales el ácido 4,5-insaturado 2-O-sulfo urónico (AU2S), en el terminal no reductor, y 2-N-sulfo-6-O-sulfoglucosamina, en el terminal reductor de la molécula. Adicionalmente, el terminal no reductor puede presentar estructuras de ácido 4,5-insaturado 2-O urónico (AU). En el terminal reductor del residuo anteriormente indicado, se puede encontrar 2-N-sulfo-6-O-sulfomanosamina (el tratamiento alcalino cataliza la epimerización en C2), además de otras dos especies de 1,6-anhidro derivados: 2-N-sulfo-1,6-anhidroglucosamina (1,6-an.A) y 2-N-sulfo-1,6-anhidromanosamina (1,6-an.M).

Fórmula 2: Estructuras presentes en el terminal reductor y no reductor en enoxaparina y bemiparina sódica

En otras heparinas de bajo peso molecular también se generan residuos relacionados con su proceso de fabricación. Por ejemplo, la tinzaparina sódica, que se obtiene por un método de p-eliminación por tratamiento con heparinasas, presenta en su terminal no reductor la presencia de ácido 4,5-insaturado 2-O-sulfo urónico (AU2S).

Fórmula 3: Estructuras presentes en el terminal reductor y no reductor en tinzaparina sódica

La dalteparina sódica se obtiene por tratamiento con ácido nitroso que genera en el terminal reductor de la molécula un residuo 2,5-anhidro manitol.

Fórmula 4: Estructuras presentes en el terminal reductor y no reductor en dalteparina sódica

En la presente memoria descriptiva, por “residuo monosacarídico presente en cadenas de heparinas” se identifican aquellos residuos o componentes monosacarídicos que se encuentran típicamente presentes en cadenas de HBPM/HNF/GAG. El listado de estos residuos cubre ácido 4,5-insaturado 2-O-sulfo urónico (AU2S), ácido 4,5-insaturado urónico (AU), 2-N-sulfo-1,6-anhidroglucosamina (1,6-an.A), 2-N-sulfo-1,6-anhidromanosamina (1,6-an.M), 2-N-sulfo-6-O-sulfoglucosamina (ANS6S), 2,5-anhidro manitol, N-sulfoglucosamina, ácido glucurónico, N-sulfo-6-O-sulfoglucosamina, ácido 2-O-sulfoidurónico, ácido idurónico, N-sulfo-3-O-sulfoglucosamina, N-sulfo-3,6-di-O-sulfoglucosamina, ácido galacturónico, Xilosa, N-acetilglucosamina y N-acetil-6-O-sulfoglucosamina.

La espectroscopia RMN permite la identificación de los residuos que son propios de los procesos de fabricación de heparinas y de heparinas de bajo peso molecular.

Una de las ventajas asociadas al uso de la RMN para la caracterización estructural es que, para su análisis, las muestras no requieren derivatizaciones o fraccionamientos cromatográficos previos. Es decir, la muestra se analiza por RMN de forma directa, sin necesidad de tratamientos intermedios.

La espectroscopia de resonancia magnética nuclear se usa para la determinación de la secuencia de los residuos mo nosacarídicos presentes en estos compuestos y determina inequívocamente los puntos de N-acetilación y N- y O-sulfatación a lo largo de la cadena oligosacarídica. Adicionalmente, esta técnica permite determinar de forma específica la orientación de los enlaces anoméricos así como distinguir entre los epímeros ácido idurónico de ácido glucurónico. (Advancing Analytical Methods for Characterization of Anionic Carbohydrate Biopolymers. Langeslay D.J. PhD Thesis UC Riverside 2013). Sin embargo, dado el alto grado de microheterogeneidad y polidispersidad de estos compuestos, la completa caracterización de heparinas y heparinas de bajo peso molecular todavía permanece como un reto en la actua lidad.

Adicionalmente, esta técnica se puede utilizar para obtener información de aquellos residuos estructurales asociados a los procesos de obtención de heparinas y de heparinas de bajo peso molecular, tales como el estado de epimerización de los ácidos urónicos (ácido idurónico vs. ácido glucurónico), ratio de residuos de 4,5-uronato sulfatados y no sulfatados en el terminal no reductor (para heparinas de bajo peso molecular obtenidas por un método de p-eliminación o tratamiento con heparinasas).

Asimismo, y debido a su alta sensibilidad, esta técnica se ha usado como técnica de screening para determinar impurezas presentes en glicosaminoglicanos (Analysis and characterization of heparin impurities. Beni S. et al. Anal Bioanal Chem 2011, 399:527-539).

En el estado de la técnica se han descrito varios métodos y experimentos de RMN para la caracterización estructural de glicosaminoglicanos en general y heparinas y heparinas de bajo peso molecular en particular. Así, por ejemplo, se ha utilizado la espectroscopía de 13C-RMN para la determinación del grado de sulfatación en heparina sódica de diferente origen animal (Characterization of Sulfation Patterns of Beef and Pig Mucosa1Heparins by Nuclear Magnetic Resonance. Casu B. et al. Arzneim.-Forsch./Drug Res. 1996,46:472-477).

La espectroscopía de 1H-RMN ha sido la técnica más ampliamente usada para el estudio de estos compuestos dado que se trata de un núcleo abundante y con una alta relación giromagnética. La región entre 1,8 - 2,1 ppm comprende las señales correspondientes a los grupos N-acetilo o los grupos metilos de los terminales reductores que pueden ser incluidos sintéticamente. La región entre 2,8 - 4,6 ppm, comprende la mayoría de las señales del anillo sacarídico y presentan un alto grado de solapamiento entre ellas, lo que hace que sea dificultoso extraer información estructural directamente de esta zona. Entre 4,6 - 6,0 ppm se encuentran las señales correspondientes a los protones anoméricos. Dada que es una zona mucho menos poblada de señales, es posible extraer una gran información de ella. Además en el caso de HBPMs obtenidas por mecanismo de p-eliminación, también contienen las señales correspondientes a los H4 de los terminales no reductores de la molécula.

Los experimentos bidimensionales (2D RMN) permiten superar los problemas presentes en los experimentos monodimensionales, básicamente debido al solapamiento de señales, y que además los espectros tienen dos dimensiones de frecuencia y otra intensidad de señal lo que les permite convertirse en una poderosa herramienta para la asignación de estructuras de oligosacáridos derivados de heparina (Characterization of currently marketed heparin products: composition analysis by 2D-NMR. Keire D.A. et al. Anal. Methods 2013,5:2984-2994).

Los espectros TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY), suponen un excelente punto de partida para el análisis es tructural de oligosacáridos ya que la información obtenida en este, permite correlacionar núcleos que se encuentran en el mismo sistema de espín, en este caso todos los protones dentro de un mismo monosacárido.

Otro experimento bidimensional de particular importancia para la caracterización estructural de este tipo de compues tos, es el 1H-13C HSQC (Heteronuclear Single-Quantum Correlation), que correlaciona desplazamientos químicos de protón con desplazamientos químicos de carbono 13, y permite asignar las estructuras primarias de oligosacáridos derivados de GAGs y la composición monosacarídica (Structural elucidation of the tetrasaccharide pool in enoxaparin sodium. Ozug J. et al. Anal. Bioanal. Chem. 2002,403:2733-2744; Structural features of low molecular weight heparins affecting their affinity to antithrombin. Bisio A. et al. Thromb. Hemost. 2009,102:865-873).

El incremento de dispersión espectral conseguida con esta técnica bidimensional, permite la cuantificación de las integrales de las señales que se superponen en los correspondientes espectros monodimensionales (Low-molecularweight heparins: structural differentiation by bidimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy. Guerrini M. et al. Semin Thromb Hemost 2007,33:478-487).

La resonancia magnética nuclear es por definición una técnica espectroscópica cuantitativa ya que la intensidad de las líneas de resonancia es directamente proporcional al número de núcleos resonantes (espín). Esto hace que en principio sea posible una precisa determinación de la cantidad de estructuras moleculares.

El incremento de la intensidad de los campos magnéticos empleados en RMN ha permitido reducir de forma significativa los límites de detección. Sin embargo, la ausencia de métodos precisos que consideren y controlen tanto los métodos experimentales como el procesado y evaluación de los espectros hace que medidas realizadas sobre muestras idénticas en varios laboratorios puedan diferir significativamente (Validation of quantitative NMR. Malz F. y Jancke H. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2005,38:813-823).

La complejidad de los espectros de resonancia magnética nuclear de glicosaminoglicanos en general, y de heparinas y heparinas de bajo peso molecular y sus derivados en particular, ha hecho que hasta la fecha no se hayan desarrollado métodos específicos de validación que permitan la cuantificación de sus señales características, y por tanto la adecuada caracterización y diferenciación de estos compuestos.

De ahí que los inventores de la presente invención, han conseguido superar este obstáculo en el estado de la técnica, consiguiendo desarrollar un método que permite diferenciar de forma inequívoca unas heparinas de otras. Gracias al método desarrollado en la presente invención, los valores porcentuales de composición monosacarídica que se obtie nen permiten diferenciar entre sí heparinas de bajo peso molecular obtenidas por diferentes procedimientos de fabri cación, así como también heparina sódica y otros glicosaminoglicanos.

El documento US 7968082 B1 describe un método de análisis de heparinas, tal como enoxaparina, mediante RMN. En este método, se utilizan como referencia picos característicos de la molécula a analizar.

Oliveira et al. (“Structural and functional analyses of biosimilar enoxaparins available in Brazil”, Thrombosis and Haemostasis 2014, 113(1), 53-65) divulga métodos 1D 1H RMN y 2D 1H-1H z-TOCSY para analizar enoxaparina.

Mourier et al. (“Analytical and statistical comparability of generic enoxaparins from the US market with the originator product”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2015, 115, 431-442) divulga el análisis de muestras de varios lotes de enoxaparinas genéricas del mercado de EEUU mediante 1H RMN y 1H-13C HSQC.

Weber et al. (“Using high.-performance quantitative NMR (HP-qNMR) for certifying traceable and highly accurate purity values of organic reference materials with uncertainties <0.1%”, Accreditation and Quality Assurance 2013, 18(2), 91 98) hace referencia al uso de RMN cuantitativo (qRMN) para certificar la pureza de materiales de referencia orgánicos. Este document divulga doce compuestos químicos diferentes como referencia interna para 1H-qRMN.

Franchini et al. (“The evolution of anticoagulant therapy”, Blood Transfusión 2016, 14(2), 175-184) divulga los produc tos farmacéuticos enoxaparina, bemiparina, dalteparina y tinzaparina.

Lima et al. (“Ultra-low-molecular-weight heparins: Precise structural features impacting specific anticoagulant activities”, Thrombosis and Haemostasis 2013, 109(3), 471-478) divulga el uso de 1H RMN y 1H-13C HSQC RMN para caracterizar algunas heparinas de bajo peso molecular.

Sumario de la invención

Los inventores de la presente invención han desarrollado un método que permite la cuantificación de las señales características de glicosaminoglicanos en general, y heparinas y heparinas de bajo peso molecular y sus derivados en particular, a través de la utilización de resonancia magnética nuclear monodimensional de 1H-RMN y/o bidimensional de 1H-13C HSQC. La cuantificación de estas señales permite determinar la composición monosacarídica de las cadenas oligosacarídicas de cada uno de estos compuestos, que es característica del compuesto.

En consecuencia, en un primer aspecto la invención proporciona un método de análisis de una composición que contiene residuos monosacarídicos presentes en, o provenientes de, cadenas de heparinas mediante Resonancia Magnética Nu clear monodimensional de 1H-RMN y/o bidimensional de 1H-13C HSQC que comprende las etapas de:

a. Proporcionar una composición que incluye al menos un residuo monosacarídico presente en cadenas de hepari nas y obtener su espectro de Resonancia Magnética Nuclear monodimensional de 1H-RMN y/o bidimensional de 1H-13C HSQC utilizando ácido dimetilmalónico (DMMA)como referencia interna y D²O como disolvente, e b. Identificar en el espectro RMN la presencia o la ausencia de al menos una señal de al menos un residuo seleccionado del grupo que consiste en: ácido 4,5-insaturado 2-O-sulfo urónico (AU2S), ácido 4,5-insaturado urónico (AU), 2-N-sulfo-1,6-anhidroglucosamina (1,6-an.A), 2-N-sulfo-1,6-anhidromanosamina (1,6-an.M), 2-N-sulfo-6-O-sulfoglucosamina (ANS6S), 2,5-anhidro manitol, N-sulfoglucosamina, ácido glucurónico, N-sulfo-6-O-sulfoglucosamina, ácido 2-O-sulfoidurónico, ácido idurónico, N-sulfo-3-O-sulfoglucosamina, N-sulfo-3,6-di-O-sulfoglucosamina, ácido galacturónico, Xilosa, N-acetilglucosamina y N-acetil-6-O-sulfoglucosamina,

caracterizado porque la presencia de dichas señales en una determinada proporción relativa de sus integrales norma lizadas con respecto a DMMA, o la ausencia de las mismas, conforma un patrón que permite identificar la heparina de la que procede el residuo monosacarídico comparando el patrón obtenido en el análisis con un patrón estándar pre viamente obtenido para diferentes heparinas en las mismas condiciones.

La cuantificación adecuada de las señales características de estos productos así como de su composición monosacarídica o residuos característicos, permite diferenciar adecuadamente unos polisacáridos de otros así como su procedencia, y en el caso de las heparinas de bajo peso molecular, confirmar que los productos se han fabricado de acuerdo al método declarado.

Esta cuantificación de los residuos se obtiene en valores porcentuales y de forma relativa a la estructura completa de cada heparina. Obteniendo una “foto” característica de cada una de las estructuras, lo que permite una deducción e identificación inequívoca tanto de la heparina analizada como del procedimiento por el que se ha obtenido. De este modo, el procedimiento de la presente invención se puede utilizar tanto como método o sistema de calidad (para valorar si las heparinas analizadas corresponden con un estándar identificado o bien están siendo adulteradas) y como método de análisis y determinación de señales características de nuevas estructuras de heparinas, de las que posteriormente se podrá utilizar el método de la invención como método o sistema de calidad.

Además, la aprobación ante las autoridades sanitarias de biosimilares y/o genéricos de ciertas heparinas de bajo peso molecular, como es el caso de Enoxaparina Sódica, se produce tras un adecuado ejercicio de comparabilidad entre el biosimilar/genérico y la molécula de referencia, que debe demostrar entre otros aspectos, el adecuado grado de similitud estructural entre ambos productos. Uno de los aspectos básicos a nivel estructural que es necesario demostrar, es que la proporción relativa de los monosacáridos que forman sus cadenas oligosacarídicas y tras evaluación estadística, cumplan criterios de biosimilitud. Para ellos, el método de la presente invención es especialmente selectivo.

Los inventores de la presente invención han comprobado que, aunque la caracterización estructural por resonancia magnética nuclear ha sido ampliamente utilizada para la caracterización de estos compuestos, sin embargo no hay disponibles en la literatura métodos cuantitativos de análisis de glicosaminoglicanos mediante RMN. La ausencia de estos métodos impide la adecuada comparabilidad entre muestras idénticas estudiadas y evaluadas bajo condiciones experimentales no adecuadamente fijadas.

Así, se pueden encontrar en la literatura publicaciones en las que los valores de proporción relativa que se aportan para los diversos residuos componentes de estos compuestos difieren significativamente unas de otras, lo que indica claramente que son métodos inadecuados (Generics versions of enoxaparin available for clinical use in Brazil are similar to the original drug. Glauser B.F., Vairo B.C., Oliveira C.P.M., Cinelli L.P., Pereira M.S. y Mourao P.A.S. J Thromb Haemost 2011,9;1419-1422).

Con el objetivo de establecer un método cuantitativo selectivo para la determinación de la proporción de las señales correspondientes a estos residuos presentes en la estructura de estos compuestos, que permita la adecuada compa ración entre resultados y que permita soslayar el error asociado a las condiciones en que se realicen los experimentos de RMN, los inventores han encontrado que la utilización del ácido dimetilmalónico (DMMA) como patrón interno en experimentos de 1H RMN y HSQC para la cuantificación relativa de las señales correspondientes a los diferentes monosacáridos componentes, es adecuada ya que entre otros aspectos presenta un tiempo de relajación longitudinal (T1), de menos de 1 segundo análogo a los T1 de los protones y carbonos anoméricos (Molecular Weight of Heparin using 13C Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. Desai U.R. y Linhardt R.J., J Pharm Sci 1995,84(2);212-215), lo cual permite una buena transferencia de polarización y, por tanto, un aumento de la intensidad de las señales, lo que lo hace adecuado para este propósito.

Así el procedimiento para el análisis por RMN de estos compuestos se caracteriza, en primer lugar, por la utilización de ácido dimetilmalónico como estándar interno para la cuantificación de las señales características de estos productos, tanto utilizando 1H-RMN como 1H-13C HSQC.

Sorprendentemente, se ha encontrado que la selección del ácido dimetilmalónico (DMMA) como estándar interno en su aplicación tanto a 1H-RMN como a 1H-13C HSQC permite la determinación cuantitativa de forma porcentual de las señales características en glicosaminoglicanos típicamente relacionados con heparinas con una elevada selectividad, exactitud, repetitividad y linealidad entre la señal del espectro RMN y la concentración de los residuos característicos del glicosaminoglicano analizado lo que posibilita el desarrollo de un método de análisis cuantitativo de dichos glicosaminoglicanos inexistente hasta la fecha.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Esquema del proceso de biosíntesis de heparina

Figura 2: Selectividad. Espectros de 1H-RMN

Figura 3: Selectividad. Espectros de 1H-13C HSQC

Figura 4: Linealidad 1H-RMN

Figura 5: Linealidad 1H-13C HSQC

Figura 6: Espectro de 1H-RMN de enoxaparina sódica

Figura 7: Espectro de 1H-13C HSQC de enoxaparina sódica

Abreviaturas y acrónimos

En la presente memoria descriptiva se utilizan las siguientes abreviaturas y acrónimos:

RMN: Resonancia Magnética Nuclear

HSQC: Correlación heteronuclear de único cuanto (Heteronuclear Single-Quantum Correlation)

GAG: Glicosaminoglicano

HNF: Heparina No Fraccionada

HBPM: Heparina de Bajo Peso Molecular

HMBPM: Heparina de Muy Bajo Peso Molecular

Da: Dalton

AU2S: Ácido 4,5-insaturado 2-O-sulfo urónico

AU: Ácido 4,5-insaturado urónico

1.6- an.A: 2-N-sulfo-1,6-anhidroglucosamina

1.6- an.M: 2-N-sulfo-1,6-anhidromanosamina

TOCSY: Espectroscopía de correlación total (TOtal Correlation SpectroscopY)

TSP: Sal sódica del ácido 3-(Trimetilsilil)-Propiónico-D4

DMMA: Ácido dimetilmalónico

MHz: Megahercio

ppm: parte por millón

6: desplazamiento químico

SW: Ancho espectral

TD: Dominio temporal

T1: Tiempo de relajación longitudinal

ANS: N-sulfoglucosamina

G: Ácido glucurónico

ANS6S: N-sulfo-6-O-sulfoglucosamina

I2S: Ácido 2-O-sulfoidurónico

I: Ácido idurónico

ANS3S: N-sulfo-3-O-sulfoglucosamina

Gal: Ácido galacturónico

Xyl: Xilosa

ANAc: N-acetilglucosamina

A6S: 6-O-sulfoglucosamina

A6OH: Glucosamina

G2S: Ácido 2-O-sulfoglucurónico

M: Manosamina

MNS6S: N-sulfo-6-O-sulfomanosamina

Epox: Epóxido

ared: anómero a

pred: anómero p

Descripción detallada de la invención

Ensayos experimentales

Los ensayos de RMN cuantitativo se han realizado usando un espectrómetro de resonancia magnética nuclear (RMN) Bruker AVlII-600 ó AVIII-800. Como reactivos se ha utilizado óxido de deuterio (D²O) 99,9%, sal sódica del ácido 3-(Trimetilsilil)-Propiónico-D4 (TSP) y ácido Dimetil Malónico (DMMA, standard for quantitative NMR, TraceCERT grade) como patrón interno.

a) Condiciones del equipo

- Frecuencia: 1H: 600 / 800 MHz, 13C: 150,9 / 201,2 MHz

- Temperatura: 298 K (25°C)

b) Parámetros de adquisición (1H RMN cuantitativo)

- Pulso de 90°: a determinar en el espectro de 1H cualitativo

- Ventana de adquisición: SW=10-12 ppm/TD=64-128k

- Tiempo entre pulsos d1, que cumpla dl+AQ>20s

- N° de escanes: 12

c) Parámetros de adquisición (HSQC)

- Pulso de 90°: a determinar en el espectro de 1H cualitativo

- Ventana de adquisición: SW²(1H)=6 ppm / TD(F2)=1k

SW1 (13C)= 120 ppm / TD(F1)=256-384

- Tiempo entre pulsos d1 =1,8-2 s

- N° de escanes:12

d) Parámetros de procesado (1H)

- Ventana de procesado: SI=64-256K

- Función de procesado: Ninguna

- Ajuste de fase: manual

- Ajuste de línea base: automático (abs)

e) Parámetros de procesado (HSQC)

- Ventana de procesado: SI(F2)=2k

- Función de procesado: QSIn E, SSB=2

- Ajuste de fase: manual

- Ajuste de línea base: automático

f) Preparación de la muestra se prepararon las siguientes disoluciones:

- Disolución A [TSP] 1mg/ mL

- Disolución B [D2O-TSP] 0,002 mg/mL: 40 pL A [TSP] 19,96 mL D2O, Volumen total = 20 mL

- Disolución C [DMMA] 1,2 mg/ mL

- Muestra problema: 50 mg de producto a estudiar en 500 pL de la disolución B [D2O-TSP] y añadir 100 pL de la disolución C [DMMA] de ácido dimetilmalónico y poner en tubo de RMN de 5 mm de diámetro.

g) Procedimiento

El tubo de RMN que contiene la muestra se introduce en el espectrómetro. A continuación se ajusta la homogeneidad del campo magnético y se optimiza la sintonía de la sonda para los núcleos de 1H y 13C. Se realiza entonces un espectro de 1H cualitativo, con parámetros similares a los descritos anteriormente, excepto los siguientes:

Tiempo entre pulsos d1 =1-2s

N° de escanes: 1-4

Se determina entonces el valor del pulso de 90° con el programa automático pulsecal (TOPSPIN). A continuación se realiza el espectro de 1H cuantitativo, con los parámetros indicados en el método analítico y el valor del pulso de 90° (P1) determinado previamente. Después se obtiene el espectro HSQC con los parámetros indicados anteriormente. Los espectros obtenidos se procesan entonces según los parámetros indicados anteriormente, tomando como referencia de desplazamiento químico la señal de TSP-d4 a 0 ppm.

La señal del ácido dimetilmalónico aparece a los siguientes desplazamientos químicos:

- 1H RMN: singlete que aparece a 1,2-1,4 ppm

- HSQC: señal a 1,2-1,4 y 26-27 ppm

Los parámetros evaluados para determinar la validación del método para RMN cuantitativo han sido los siguientes:

Selectividad

Determina la capacidad del método analítico para medir y/o identificar simultánea o separadamente los analitos de interés, de forma inequívoca, en presencia de otras sustancias químicas que pueden estar presentes en la muestra.

Los datos obtenidos en los espectros de 1H RMN en estos experimentos, fueron:

Muestra Composición Desplazamiento químico, ppm

I, disolvente D²O 4,79

II, referencia desplazamiento

químico D2O-TSP 0,00

III, patrón interno D²O-DMMA 1,42

IV, muestra GAG D²O-TSP-DMMA-GAG 1,8-8,0

Y en los espectros de 1H 13C-HSQC:

Muestra Composición Desplazamiento Desplazamiento

químico 1H, ppm químico 13C, ppm

III, patrón interno D²O-DMMA 1,42 25,42

IV, muestra GAG D²O-TSP-DMMA-GAG 1,8-8,0 24-112

Se comprueba que no hay interferencia entre señales tanto en los espectros de 1H RMN como en los de 1H 13C-HSQC (Figuras 2 y 3). Esto demuestra que el método es capaz de discriminar sin interferencias las señales que componen la estructura del compuesto a estudiar, de las de otros productos presentes en la muestra tales como el disolvente (óxido de deuterio, D²O), el patrón interno (ácido dimetilmalónico, DMMA) y la referencia de desplazamiento químico (TSP-d4).

Límite de cuantificación y linealidad

Bajo estos parámetros se determina, por un lado, la cantidad mínima de analito que puede ser adecuadamente cuantificado de forma precisa y exacta y, de otra parte, la capacidad del método de obtener resultados directamente (o por medio de transformaciones matemáticas) proporcionales a la concentración del analito en la muestra, dentro de un intervalo establecido.

Para la evaluación del límite de cuantificación y la linealidad se cuantificaron las integrales de las señales RMN del DMMA (es decir, la integral del área de la señal de RMN correspondiente al DMMA) sobre enoxaparina sódica dopada a 7 niveles de concentración del patrón interno, a partir de pesadas independientes y por triplicado. Estos niveles corresponden a las siguientes concentraciones de trabajo:

- 0,2 mM: 13,5 % de la concentración de trabajo

- 0,3 mM: 20,3 % de la concentración de trabajo

- 0,76 mM: 50 % de la concentración de trabajo

- 1,2 mM: 80,1 % de la concentración de trabajo

- 1,5 mM: 100 % de la concentración de trabajo

- 1,8 mM: 120 % de la concentración de trabajo

- 2,27 mM: 150,2 % de la concentración de trabajo

El criterio de aceptación establecido para cumplir este criterio de linealidad es que en la recta obtenida el coeficiente de correlación para ambos experimentos sea > 0,99. En las Figuras 4 y 5 se representa la gráfica que representa los valores de integral de la señal del DMMA vs concentración de DMMA (mM), para los espectros de 1H RMN y 1H 13C-HSQC. El criterio de aceptación se cumple ampliamente tanto para uno como para otro.

El límite de cuantificación se establece para una concentración de DMMA de 0,20 mM. Así las señales de la muestra estudiada cuya intensidad sea menor a la intensidad de la señal del DMMA correspondiente a esta concentración, no pueden ser adecuadamente cuantificadas y por tanto no pueden tomarse para la determinación de la proporción relativa de los residuos presentes en la molécula.

Exactitud

Expresa la proximidad entre el valor que es aceptado convencionalmente como valor verdadero o de referencia y el valor experimental encontrado. Para el cálculo del valor experimental en la concentración de las muestras a evaluar se tiene en cuenta las ecuaciones de la recta obtenidas en el apartado anterior de linealidad.

La exactitud se expresa como porcentaje de recuperación en la valoración de una cantidad conocida de patrón interno:

Xm

Porcentaje de recuperación (R) = ----------------x 100

M

donde:

Xm: valor medio hallado

M: valor aceptado como verdadero

El criterio de aceptación establecido es que los valores de recuperación estén comprendidos entre el 70,0-130,0 % para la concentración correspondiente al límite de concentración y del 80,0-120,0 % para el resto de niveles.

Los datos obtenidos para los experimentos de 1H RMN y HSQC, fueron los siguientes:

a) 1H RMN

Concentración, mM Conc. Calculada, mM Recuperación, 1H RMN

0,204 0,228 111,77

0,307 0,330 107,31

0,758 0,737 97,26

1,212 1,175 96,90

1,514 1,488 98,29

1,817 1,810 99,65

2,274 2,318 101,94

b) HSQC

Concentración, mM Conc. Calculada, mM Recuperación, HSQC

0,204 0,243 119,17

0,307 0,337 109,81

0,758 0,727 95,96

1,212 1,140 94,03

1,514 1,488 98,29

1,817 1,823 100,32

2,274 2,328 102,37

La conclusión extraída de este ensayo tanto para el experimento de 1H RMN como de HSQC es la idoneidad en el cumplimiento de los criterios de aceptación para el parámetro exactitud para aquellas señales correspondientes a la muestra, con intensidad superior a la del límite de cuantificación.

Precisión - Repetibilidad

Estudia la variabilidad del método efectuando una serie de análisis sobre la misma muestra en las mismas condiciones operativas en un mismo laboratorio y en un periodo de tiempo corto.

Para ello, se realizaron tres análisis consecutivos para cada concentración. La repetibilidad de un método se expresa como el coeficiente de variación (CV) de una serie de medidas y se calcula matemáticamente de la siguiente manera:

s

CV (%) = --------------x 100

X

donde:

s: desviación estándar

X: media aritmética de los resultados.

El criterio de aceptación establecido para cumplir este criterio de exactitud es que el coeficiente de variación para todos los niveles sea < 7%.

Los datos obtenidos para ambos experimentos fueron los siguientes:

ración, mM CV, % 1H RMN CV, %HS(

0,204 5,55 3,40

0,307 0,09 2,29

0,758 1,62 1,45

1,212 1,74 2,52

1,514 1,41 1,01

1,817 2,16 3,99

2,274 2,30 2,73

La conclusión extraída de este ensayo tanto para el experimento de 1H RMN como de HSQC; es la idoneidad en el cumplimiento de los criterios de aceptación para el parámetro exactitud para aquellas señales correspondientes a la muestra, con intensidad superior a la del límite de cuantificación.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan a continuación sirven para ilustrar la naturaleza de la pre sente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limi taciones a la invención que aquí se reivindica.

EJEMPLO 1

Estudio por 1H RMN de enoxaparina sódica.

Se disuelven 50 mg de enoxaparina Sódica en 500 pL de una solución de D²O-TSP (solución B) y se añaden 100 pL de solución de DMMA (solución C). La disolución resultante se introduce en un tubo de 5 mm de diámetro.

La concentración resultante de DMMA en la disolución a analizar es de 1,5 mM.

Los experimentos se realizan en un espectrómetro de resonancia magnética nuclear Bruker AVIII-800.

Las principales señales identificadas son las siguientes:

Señal Desplazamiento Señal Desplazamiento

químico, ppm químico, ppm

H4 AU2S 5,992 H1 G 4,628

H4 AU2 5,825 H6 ANS6S 4,344

H1 1,6-AnA 5,616 H6' ANS6S 4,210

H1 ANS(-G) 5,585 H3 ANS 3,670

H1 1,6-AnM 5,569 H2 ANS3S 3,395

H1 AU2S 5,509 H2 ANS 3,293

H1 ANS6S 5,405 NAc 2,047

H1 I2S 5,228 DMMA 1,320

H1 I 5,012 TSP 0,069

H5 I2S 4,836

Una vez obtenidos los valores de las integrales de las señales tanto del DMMA como del resto de los residuos, se procede a obtener los valores normalizados de dichos residuos dividiendo el valor de sus integrales por el valor de la integral correspondiente a la señal del DMMA. Se puede realizar esta normalización ya que la concentración de patrón interno se mantiene constante con respecto a la concentración de residuo para todos los experimentos, obviando así la variabilidad inter-experimental que pueda darse en el análisis de una serie de varios lotes de producto.

Una vez obtenidos los valores normalizados de los residuos, se calcula el porcentaje relativo de cada uno de ellos de acuerdo a la siguiente fórmula:

valor normalizado señal X

% señal X = --------------------------------------------------------- x 100

I valor normalizado todas las señales

Para clarificar los pasos realizados, se muestran los resultados obtenidos para una serie de cuatro muestras M1, M2, M3 y M4 de enoxaparina sódica:

En los experimentos realizados, se obtuvieron los siguientes valores de integral de cada una de las señales seleccio nadas:

Señal Integral

M 1 M 2 M 3 M 4

H4 AU2S 2767732,83 2988384,02 3075705,31 2332763,55

H4 AU 114294,94 135658,19 143037,09 94201,86

H1 1,6-an.A 404060,73 472871,53 509930,86 351978,17

H1 1,6-an.M 2535227,20 2700027,94 2844751,53 2160178,72

H1 AU2S 3541377,06 3818336,16 3951288,34 2999870,34

H1 ANS6S 10350026,69 10716882,48 10780945,33 8442504,14

H1 I2S 8922576,12 9202191,38 9486264,66 7346708,47

H5 I2S 8924825,12 9540022,53 10041127,64 7751650,03

H2 ANS 16351247,22 16802874,61 17051664,14 13189968,22

NAc 8054931,36 7973188,48 8124533,56 6388424,34

DMMA 1464255,27 1415020,17 1485242,95 1279612,94

donde M corresponde a muestra.

Para obtener los valores normalizados de las integrales de las señales a estudio, se dividen estas por el valor de la integral del DMMA:

Señal Integral normalizada

M 1 M 2 M 3 M 4

H4 AU2S 1,890 2,112 2,071 1,823

H4 AU 0,078 0,096 0,096 0,074

H1 1,6-an.A 0,276 0,334 0,343 0,275

H1 1,6-an.M 1,731 1,908 1,915 1,688

H1 AU2S 2,419 2,698 2,660 2,344

H1 ANS6S 7,068 7,574 7,259 6,598

H1 I2S 6,094 6,503 6,387 5,741

H5 I2S 6,095 6,742 6,761 6,058

H2 ANS 11,167 11,875 11,481 10,308

NAc 5,501 5,635 5,470 4,992

DMMA 1,000 1,000 1,000 1,000

Y finalmente, a partir de estos valores normalizados, se calcula la proporción relativa de cada una de estas señales con respecto al conjunto de todas las señales:

Señal Proporción relativa, %

M 1 M 2 M 3 M 4

H4 AU2S 4,47 4,64 4,66 4,57

H4 AU 0,18 0,21 0,22 0,18

H1 1,6-an.A 0,65 0,73 0,77 0,69

H1 1,6-an.M 4,09 4,20 4,31 4,23

H1 AU2S 5,72 5,93 5,99 5,88

H1 ANS6S 16,70 16,65 16,33 16,54

H1 I2S 14,40 14,30 14,37 14,39

H5 I2S 14,40 14,83 15,21 15,18

H2 ANS 26,39 26,11 25,83 25,83

NAc 13,00 12,39 12,31 12,51

La cuantificación de las señales características y bien diferenciadas de enoxaparina sódica (generalmente aquellas correspondientes a los protones anoméricos, H1) se muestran en la siguiente tabla con los valores de proporción relativa observados:

Señal Desplazamiento químico, ppm Proporción relativa, %

H4 AU2S 5,99 4,3-4,7

H4 AU 5,82 0,2

H1 1,6-an.A 5,62 0,7-0,9

H1 1,6-an.M 5,57 4,1-4,4

H1 AU2S 5,51 5,7-6,0

H1 ANS6S 5,40 16,1-16,7

H1 I2S 5,23 13,1-14,4

H5 I2S 4,84 14,3-16,3

H2 ANS 3,29 24,3-26,6

NAc 2,05 12,0-15,3

El conjunto de las señales correspondientes a los picos encontrados en un espectro RMN determinado, ya sea 1H-RMN monodimensional y/o 1H-13C HSQC bidimensional, o la ausencia de las mismas, en las proporciones relativas de sus integrales nomalizadas indicadas por el parámetro “proporción relativa (%)” es lo que en la presente memoria descriptiva se denomina “patrón de señales” o simplemente “patrón”.

EJEMPLO 2

La misma solución empleada en el ejemplo 1, se utiliza para la realización del estudio por 1H-13C HSQC. Las principa les señales identificadas son las siguientes:

Señal 5 13C, ppm 5 1H, ppm Señal 5 13C, ppm 5 1H, ppm

C4-H4 AU 110,71 5,82 C3-H3 Gal 85,45 3,78

C4-H4 AU2S 108,97 5,99 C3-H3 Gal 84,85 3,83

C1-H1 G // Gal 106,62 4,66 C4-H4 ANS6S(-G)// 80,94 3,84

ANS6S red

C1-H1 Xyl 105,79 4,45 C2-H2 I2S 78,53 4,34

C1-H1 G(-ANAc) 105,13 4,50 C3-H3 Xyl 77,82 3,72

C1-H1 I(-A6S) 104,94 5,01 C2-H2 AU2S 77,42 4,62

C1-H1 G(-ANS) 104,77 4,60 C2-H2 G(-AN6S) 75,70 3,40

C1-H1 I(-A6OH) 104,67 4,94 C3-H3 ANS6S (-G) 72,47 3,66

C1-H1 Gal 104,30 4,54 C3-H3 ANS6S red 72,29 3,77

C1-H1 1,6-an.A 104,22 5,61 C5-H5 I2S 72,01 4,83

C1-H1 G (-ANS3S) 103,91 4,61 C3-H3 I2S 71,87 4,21

C1-H1 1,6-an.M 103,91 5,57 C5-H5 ANS6S(-G) 71,72 4,09

C1-H1 AU 103,88 5,16 C5-H5 MNS6S red 70,98 4,15

C1-H1 G2S 102,99 4,75 C5-H5 ANS6S red 70,64 4,12

C1-H1 ,I2S 102,09 5,22 C6-H6 1,6-an.A// 67,53 3,77

1,6-an.M

C1-H1 I2S(-1,6- 101,59 5,36 C5-H5 Xyl 65,89 4,12

an.M)

C1-H1 ANS(-G) 100,50 5,58 C5-H5 Xyl 65,86 3,40

C1-H1 ANAc 100,23 5,31 C3-H3 AU2S 65,75 4,32

C1-H1 AU2S 100,18 5,51 C6-H6 Gal 63,90 3,74

C1-H1 ANS(-I2S) 99,78 5,40 C2-H2 ANS6S red// 60,82 3,28

ANS(-I2S)

C1-H1 ANS6S 99,43 5,43 C2-H2 ANS6S(-G) 60,52 3,29

C1-H1 ANS,3S 99,06 5,51 C2-H2 MNS6S red 60,38 3,60

C1-H1 ANS pred 98,73 4,71 C2-H2 1,6-an.A 58,50 3,21

C1-H1 ANS(-I) 98,42 5,34 C2-H2 ANAc 56,68 3,92

C1-H1 M ared 95,74 5,39 C2-H2 1,6-an.M 55,09 3,47

C1-H1 I2S ared 95,70 5,42 DMMA 26,73 1,32

C1-H1 I2S pred 94,76 4,97 NAc 24,87 2,05

C1-H1 ANS ared// 93,97 5,45

ANS6S red

Estas señales se pueden asociar a componentes monosacarídicos de la molécula, de modo que la cuantificación de estas permite la determinación de su composición monosacarídica.

Las integrales para cada una de estas señales fueron normalizadas a partir del valor fijado para la integral del DMMA, usando el mismo procedimiento explicado para los experimentos 1H RMN. La cuantificación de las señales caracte rísticas de enoxaparina sódica se muestra en la siguiente tabla:

Señal Proporción relativa, %

C1-H1 ANS-I2S 25.6- 26,9

C1-H1 ANS-I 2.6- 3,0

C1-H1 ANS-G 5.1- 5,5

C1-H1 ANS.3S 1.5- 1,7

C1-H1 ANAc 2.7- 3,5

C1-H1 ANAc-ared < LC

C1-H1 ANS-red 3.8- 4,9

C1-H1 1.6-an.A 1.2- 1,5

C1-H1 1.6-an.M 1.6- 1,9

C1-H1 MNS-ared 1,0-1,3

C1-H1 I2S 24,5-27,5

C1-H1 I-A6S 2,4-2,7

C1-H1 I-A6OH 0,3-0,4

C1-H1 G-ANS,3S 1,4-1,6

C1-H1 G-ANS 4,2-4,4

C1-H1 G-ANAc 1,9-2,6

C1-H1 G2S 1,1-1,6

C1-H1 AU2S 11,5-12,4

C1-H1 AU 0,3-0,5

C1-H1 I2S-red 1,0-1,4

C5-H5 Gal-A <LC-0,5

Epox <LC-0,4

Estos experimentos demuestran que, utilizando las condiciones experimentales descritas anteriormente, es posible obtener un método de análisis por resonancia magnética nuclear (1H-RMN y 1H-13C HSQC) de glicosaminoglicanos en general, y de heparinas y heparinas de bajo peso molecular y sus derivados en particular, que permite su análisis cuantitativo.

EJEMPLO 3

Estudio por 1H RMN de bemiparina sódica.

Las principales señales identificadas son las siguientes:

Señal Desplazamiento Señal Desplazamiento

químico, ppm químico, ppm

H4 AU2S 5,992 H1 G 4,628

H4 AU 5,825 H6 ANS6S 4,344

H1 1,6-AnA 5,616 H6' ANS6S 4,210

H1 ANS(-G) 5,585 H3 ANS 3,670

H1 1,6-AnM 5,569 H2 ANS3S 3,395

H1 AU2S 5,509 H2 ANS 3,293

H1 ANS6S 5,405 NAc 2,047

H1 I2S 5,228 DMMA 1,320

H1 I 5,012 TSP 0,069

H5 I2S 4,836

La cuantificación de las señales características y bien diferenciadas de bemiparina sódica (generalmente aquellas correspondientes a los protones anoméricos, H1) se muestran en la siguiente tabla con los valores de proporción relativa observados para una serie de seis muestras

Señal Desplazamiento químico, ppm Proporción relativa, %

H4 AU2S 5,99 3,7-5,7

H4 AU 5,82 0,2-2,5

H1 1,6-an.A 5,62 0,5-2,5

H1 1,6-an.M 5,57 2,5-6,0

H1 AU2S 5,51 7,0-10,7

H1 ANS6S 5,40 19,0-21,3

H1 I2S 5,23 13,8-18,5

H2 ANS 3,29 18,7-26,3

NAc 2,05 9,4-14,4

EJEMPLO 4

La misma solución empleada en el ejemplo 3, se utiliza para la realización del estudio por 1(H-13C HSQC. Las principales señales identificadas son las siguientes:

Señal 5 13C, ppm 5 1H, ppm Señal 5 13C, ppm 5 1H, ppm

C4-H4 AU 110,71 5,82 C3-H3 Gal 85,45 3,78

C4-H4 AU2S 108,97 5,99 C3-H3 Gal 84,85 3,83

C1-H1 G // Gal 106,62 4,66 C4-H4 ANS6S(-G)// 80,94 3,84

ANS6S red

C1-H1 Xyl 105,79 4,45 C2-H2 I2S 78,53 4,34

C1-H1 G(-ANAc) 105,13 4,50 C3-H3 Xyl 77,82 3,72

C1-H1 I(-A6S) 104,94 5,01 C2-H2 AU2S 77,42 4,62

C1-H1 G(-ANS) 104,77 4,60 C2-H2 G(-AN6S) 75,70 3,40

C1-H1 I(-A6OH) 104,67 4,94 C3-H3 ANS6S (-G) 72,47 3,66

C1-H1 Gal 104,30 4,54 C3-H3 ANS6S red 72,29 3,77

C1-H1 1,6-an.A 104,22 5,61 C5-H5 I2S 72,01 4,83

C1-H1 G (-ANS3S) 103,91 4,61 C3-H3 I2S 71,87 4,21

C1-H1 1,6-an.M 103,91 5,57 C5-H5 ANS6S(-G) 71,72 4,09

C1-H1 AU 103,88 5,16 C5-H5 MNS6S red 70,98 4,15

C1-H1 G2S 102,99 4,75 C5-H5 ANS6S red 70,64 4,12

C1-H1 J2S 102,09 5,22 C6-H6 1,6-an.A// 67,53 3,77

1,6-an.M

C1-H1 I2S(-1,6- 101,59 5,36 C5-H5 Xyl 65,89 4,12

an.M)

C1-H1 ANS(-G) 100,50 5,58 C5-H5 Xyl 65,86 3,40

C1-H1 ANAc 100,23 5,31 C3-H3 AU2S 65,75 4,32

C1-H1 AU2S 100,18 5,51 C6-H6 Gal 63,90 3,74

C1-H1 ANS(-I2S) 99,78 5,40 C2-H2 ANS6S red// 60,82 3,28

ANS(-I2S)

C1-H1 ANS6S 99,43 5,43 C2-H2 ANS6S(-G) 60,52 3,29

C1-H1 ANS,3S 99,06 5,51 C2-H2 MNS6S red 60,38 3,60

C1-H1 ANS pred 98,73 4,71 C2-H2 1,6-an.A 58,50 3,21

C1-H1 ANS(-I) 98,42 5,34 C2-H2 ANAc 56,68 3,92

C1-H1 M ared 95,74 5,39 C2-H2 1,6-an.M 55,09 3,47

C1-H1 I2S ared 95,70 5,42 DMMA 26,73 1,32

C1-H1 I2S pred 94,76 4,97 NAc 24,87 2,05

C1-H1 ANS ared// 93,97 5,45

ANS6S red

Las integrales para cada una de estas señales fueron normalizadas a partir del valor fijado para la integral del DMMA, usando el mismo procedimiento explicado para los experimentos 1H RMN. La cuantificación de las señales caracte rísticas de bemiparina sódica se muestra en la siguiente tabla:

Señal Proporción relativa,

C1-H1 ANS-I2S 26,5-30,6

C1-H1 ANS-I 1,7-5,3

C1-H1 ANS-G 2,1-3,8

C1-H1 ANS.3S 0,6-2,5

C1-H1 ANAc 1,7-3,0

C1-H1 ANAc-ared < LC

C1-H1 ANS-red 2,6-5,4

C1-H1 1.6-an.A < 1,1

C1-H1 1.6-an.M <1,0

C1-H1 MNS-ared 0,9-2,3

C1-H1 I2S 30,4-34,9

C1-H1 I-A6S 1,4-2,6

C1-H1 I-A6OH <0,2

C1-H1 G-ANS,3S <2,5

C1-H1 G-ANS 1,9-3,6

C1-H1 G-ANAc 0,4-1,4

C1-H1 G2S <0,5

C1-H1 AU2S 10,9-14,9

C1-H1 AU 0,6-1,6

C1-H1 I2S-red <0,5

C5-H5 Gal-A <0,3

EJEMPLO 5

Estudio por 1H RMN de dalteparina sódica.

Las principales señales identificadas son las siguientes:

Señal Desplazamiento Señal Desplazamiento

químico, ppm químico, ppm

H1 ANS(-G) 5,585 H6' ANS6S 4,210

H1 ANS6S 5,405 H3 ANS 3,670

H1 I2S 5,228 H2 ANS3S 3,395

H1 I2S-(AM.ol) 5,178 H2 ANS 3,293

H1 I 5,012 NAc 2,047

H5 I2S 4,836 DMMA 1,320

H1 G 4,628 TSP 0,069

H6 ANS6S 4,344

La cuantificación de las señales características y bien diferenciadas de dalteparina sódica (generalmente aquellas correspondientes a los protones anoméricos, H1) se muestran en la siguiente tabla con los valores de proporción relativa observados para una serie de seis muestras:

Señal Desplazamiento químico, ppm Proporción relativa, %

H1 ANS6S 5,40 25,5-25,8

H1 I2S 5,23 19,2-20,8

H1 I2S-(AM.ol) 5,18 9,5-9,8

H2 ANS 3,29 28,0-30,0

NAc 2,05 15,4-20,0

EJEMPLO 6

La misma solución empleada en el ejemplo 5, se utiliza para la realización del estudio por 1H-13C HSQC. Las principa les señales identificadas son las siguientes:

Señal 5 13C, ppm 5 1H, ppm Señal 5 13C, ppm 5 1H, ppm

C1-H1 G // Gal 106,62 4,66 C4-H4 ANS6S(-G) 80,94 3,84

C1-H1 Xyl 105,79 4,45 C2-H2 I2S 78,53 4,34

C1-H1 G(-ANAc) 105,13 4,50 C3-H3 Xyl 77,82 3,72

C1-H1 I(-A6S) 104,94 5,01 C2-H2 G(-AN6S) 75,70 3,40

C1-H1 G(-ANS) 104,77 4,60 C3-H3 ANS6S (-G) 72,47 3,66

C1-H1 I(-A6OH) 104,67 4,94 C5-H5 I2S 72,01 4,83

C1-H1 G (-ANS3S) 103,91 4,61 C3-H3 I2S 71,87 4,21

C1-H1 G2S 102,99 4,75 C5-H5 ANS6S(-G) 71,72 4,09

C1-H1 I2S 102,09 5,22 C5-H5 Xyl 65,89 4,12

C1-H1 ANS(-G) 100,50 5,58 C5-H5 Xyl 65,86 3,40

C1-H1 ANAc 100,23 5,31 C6-H6 Gal 63,90 3,74

C1-H1 ANS(-I2S) 99,78 5,40 AM.ol-6S 63,8/63,7 3,70/3,74

C1-H1 ANS6S 99,43 5,43 C2-H2 ANS(-I2S) 60,82 3,28

C1-H1 ANS,3S 99,06 5,51 C2-H2 ANS6S(-G) 60,52 3,29

C1-H1 ANS(-I) 98,42 5,34 C2-H2 ANAc 56,68 3,92

C3-H3 Gal 85,45 3,78 DMMA 26,73 1,32

C3-H3 Gal 84,85 3,83 NAc 24,87 2,05

Las integrales para cada una de estas señales fueron normalizadas a partir del valor fijado para la integral del DMMA, usando el mismo procedimiento explicado para los experimentos 1H RMN. La cuantificación de las señales caracte rísticas de dalteparina sódica se muestra en la siguiente tabla:

Señal Proporción relativa,

C1-H1 ANS-I2S 22,2-23,3

C1-H1 ANS-I 3,0-3,2

C1-H1 ANS-G 2,3-2,6

C1-H1 ANS.3S 2,1-2,9

C1-H1 ANAc 2,4-3,1

C1-H1 I2S 24,5-27,5

C1-H1 I-A6S 3,6-4,0

C1-H1 G-ANS,3S 1,8-2,3

C1-H1 G-ANS 2,5-3,5

C1-H1 , C6-H6 AM.ol-6S 20,8-21,7

EJEMPLO 7

Estudio por 1H RMN de tinzaparina sódica.

Las principales señales identificadas son las siguientes:

Señal Desplazamiento Señal Desplazamiento

químico, ppm químico, ppm

H4 AU2S 5,992 H6 ANS6S 4,344

H4 AU 5,825 H6' ANS6S 4,210

H1 ANS(-G) 5,585 H3 ANS 3,670

H1 AU2S 5,509 H2 ANS3S 3,395

H1 ANS6S 5,405 H2 ANS 3,293

H1 I2S 5,228 NAc 2,047

H1 I 5,012 DMMA 1,320

H5 I2S 4,836 TSP 0,069

H1 G 4,628

La cuantificación de las señales características y bien diferenciadas de tinzaparina sódica (generalmente aquellas correspondientes a los protones anoméricos, H1) se muestran en la siguiente tabla con los valores de proporción relativa observados para una muestra de tinzaparina sódica:

Señal Desplazamiento químico, ppm Proporción relativa, %

H4 AU2S 5,99 2,7

H1 AU2S 5,51 5,3

H1 ANS6S 5,40 23,6

H1 I2S 5,23 21,0

H2 ANS 3,29 30,0

NAc 2,05 16,1

EJEMPLO 8

La misma solución empleada en el ejemplo 7, se utiliza para la realización del estudio por 1H-13C HSQC. Las principa les señales identificadas son las siguientes:

Señal 5 13C, ppm 5 1H, ppm Señal 5 13C, ppm 5 1H, ppm

C4-H4 AU 110,71 5,82 C3-H3 Gal 85,45 3,78

C4-H4 AU2S 108,97 5,99 C3-H3 Gal 84,85 3,83

C1-H1 G // Gal 106,62 4,66 C4-H4 ANS6S(-G)// 80,94 3,84

ANS6S red

C1-H1 Xyl 105,79 4,45 C2-H2 I2S 78,53 4,34

C1-H1 G(-ANAc) 105,13 4,50 C3-H3 Xyl 77,82 3,72

C1-H1 I(-A6S) 104,94 5,01 C2-H2 AU2S 77,42 4,62

C1-H1 G(-ANS) 104,77 4,60 C2-H2 G(-AN6S) 75,70 3,40

C1-H1 I(-A6OH) 104,67 4,94 C3-H3 ANS6S (-G) 72,47 3,66

C1-H1 Gal 104,30 4,54 C3-H3 ANS6S red 72,29 3,77

C1-H1 G (-ANS3S) 103,91 4,61 C5-H5 I2S 72,01 4,83

C1-H1 AU 103,88 5,16 C3-H3 I2S 71,87 4,21

C1-H1 G2S 102,99 4,75 C5-H5 ANS6S(-G) 71,72 4,09

C1-H1 I2S 102,09 5,22 C5-H5 ANS6S red 70,64 4,12

C1-H1 ANS(-G) 100,50 5,58 C5-H5 Xyl 65,89 4,12

C1-H1 ANAc 100,23 5,31 C5-H5 Xyl 65,86 3,40

C1-H1 AU2S 100,18 5,51 C3-H3 AU2S 65,75 4,32

C1-H1 ANS(-I2S) 99,78 5,40 C6-H6 Gal 63,90 3,74

C1-H1 ANS6S 99,43 5,43 C2-H2 ANS6S red// 60,82 3,28

ANS(-I2S)

C1-H1 ANS,3S 99,06 5,51 C2-H2 ANS6S(-G) 60,52 3,29

C1-H1 ANS pred 98,73 4,71 C2-H2 MNS6S red 60,38 3,60

C1-H1 ANS(-I) 98,42 5,34 C2-H2 ANAc 56,68 3,92

C1-H1 I2S ared 95,70 5,42 DMMA 26,73 1,32

C1-H1 I2S pred 94,76 4,97 NAc 24,87 2,05

C1-H1 ANS ared// 93,97 5,45

ANS6S red

Las integrales para cada una de estas señales fueron normalizadas a partir del valor fijado para la integral del DMMA, usando el mismo procedimiento explicado para los experimentos 1H RMN. La cuantificación de las señales caracte rísticas de tinzaparina sódica se muestra en la siguiente tabla:

Señal Proporción relativa, %

C1-H1 ANS-I2S 27.2

C1-H1 ANS-I 3.2

C1-H1 ANS-G 3.4

C1-H1 ANS.3S 1.2

C1-H1 ANAc 3,7

C1-H1 ANAc-ared < LC

C1-H1 ANS-red 6.5

C1-H1 I2S 35.1

C1-H1 I-A6S 3.1

C1-H1 I-A6OH 0,8

C1-H1 G-ANS,3S 1.5

C1-H1 G-ANS 3,4

C1-H1 G-ANAc 2.2

C1-H1 AU2S 8.6

C1-H1 I2S-red <0,1

Estos experimentos demuestran que, utilizando las condiciones experimentales descritas en lo que antecede, es posible obtener un método de análisis por resonancia magnética nuclear (1H-RMN y 1H-13C HSQC) de glicosaminoglicanos en general, y de heparinas y heparinas de bajo peso molecular y sus derivados en particular, que permite su análisis cuantitativo.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método de análisis de una composición que contiene residuos monosacarídicos presentes en cadenas de heparinas mediante resonancia magnética nuclear monodimensional de 1H-RMN y/o resonancia magnética nuclear bidimensional de 1H-13C HSQC que comprende las etapas de:

a. proporcionar una composición que incluye al menos un residuo monosacarídico presente en cadenas de heparinas y obtener su espectro de resonancia magnética nuclear monodimensional de 1H-RMN y/o resonancia magnética nuclear bidimensional de 1H-13C HSQC utilizando ácido dimetilmalónico (DMMA) como referencia interna y D²O como disolvente, e

b. identificar en el espectro RMN la presencia o la ausencia de al menos una señal de al menos un residuo seleccionado del grupo que consiste en: ácido 4,5-insaturado 2-O-sulfo urónico (AU2S), ácido 4,5-insaturado urónico (AU), 2-N-sulfo-1,6-anhidroglucosamina (1,6-an.A), 2-N-sulfo-1,6-anhidromanosamina (1,6-an.M), 2-N-sulfo-6-O-sulfoglucosamina (ANS6S), 2,5-anhidro manitol, N-sulfoglucosamina, ácido glucurónico, N-sulfo-6-O-sulfoglucosamina, ácido 2-O-sulfoidurónico, ácido idurónico, N-sulfo-3-O-sulfoglucosamina, N-sulfo-3,6-di-O-sulfoglucosamina, ácido galacturónico, Xilosa, N-acetilglucosamina y N-acetil-6-O-sulfoglucosamina,

caracterizado porque la presencia de dichas señales de RMN en una determinada proporción relativa de sus integrales normalizadas con respecto a DMMA, o la ausencia de las mismas, conforma un patrón que permite identificar la heparina de la que procede el residuo monosacarídico comparando el patrón obtenido en el análisis con un patrón estándar previamente obtenido para diversas heparinas en las mismas condiciones.

2. Método según la reivindicación 1, que comprende además:

c. obtener el valor normalizado de la integral de la señal de cada uno de los residuos dividiendo el valor de la integral de la señal de cada residuo por el valor de la integral de la señal del DMMA, y

d. calcular el porcentaje relativo de cada uno de los residuos de acuerdo a la siguiente fórmula:

valor normalizado señal residuo X

% señal residuo X = ■ x 100

I valor normalizado todas las señales

3. Método según la reivindicación 1 o 2, en el que en el espectro 1H RMN se identifica el siguiente patrón:

Señal Desplazamiento químico, ppm Porcentaje relativo, %

H4 AU2S 5,99 4,3-4,7

H4 AU 5,82 0,2

H1 1,6-an.A 5,62 0,7-0,9

H1 1,6-an.M 5,57 4,1-4,4

H1 AU2S 5,51 5,7-6,0

H1 ANS6S 5,40 16,1-16,7

H1 I2S 5,23 13,1-14,4

H5 I2S 4,84 14,3-16,3

H2 ANS 3,29 24,3-26,6

NAc 2,05 12,0-15,3

con lo que se determina que los residuos monosacarídicos proceden de enoxaparina sódica.

4. Método según la reivindicación 1 o 2, en el que en el espectro 1H-13C HSQC RMN, se identifica el siguiente patrón:

Señal Porcentaje relativo. %

C1-H1 ANS-I2S 25,6-26,9

C1-H1 ANS-I 2,6-3,0

C1-H1 ANS-G 5,1-5,5

C1-H1 ANS.3S 1,5-1,7

C1-H1 ANAc 2,7-3,5

C1-H1 ANAc-ared < LC

C1-H1 ANS-red 3,8-4,9

C1-H1 1.6-an.A 1,2-1,5

C1-H1 1.6-an.M 1,6-1,9

C1-H1 MNS-ared 1,0-1,3

C1-H1 I2S 24,5-27,5

C1-H1 I-A6S 2,4-2,7

C1-H1 I-A6OH 0,3-0,4

C1-H1 G-ANS,3S 1,4-1,6

C1-H1 G-ANS 4,2-4,4

C1-H1 G-ANAc 1,9-2,6

C1-H1 G2S 1,1-1,6

C1-H1 AU2S 11,5-12,4

C1-H1 AU 0,3-0,5

C1-H1 I2S-red 1,0-1,4

C5-H5 Gal-A <LC-0,5

Epox <LC-0,4

donde “LC” es “limite de cuantificación”,

5. Método según la reivindicación 1 o 2, en el que en el espectro 1H-RMN, se identifica el siguiente patrón:

Señal Desplazamiento químico, ppm Porcentaje relativo, %

H4 AU2S 5,99 3,7-5,7

H4 AU 5,82 0,2-2,5

H1 1,6-an.A 5,62 0,5-2,5

H1 1,6-an.M 5,57 2,5-6,0

H1 AU2S 5,51 7,0-10,7

H1 ANS6S 5,40 19,0-21,3

H1 I2S 5,23 13,8-18,5

H2 ANS 3,29 18,7-26,3

NAc 2,05 9,4-14

con lo que se determina que los residuos monosacarídicos proceden de bemiparina sódica.

6. Método según la reivindicación 1o 2, en el que en el espectro 1H-13C HSQC RMN, se identifica el siguiente patrón:

Señal Porcentaje relativo, %

C1-H1 ANS-I2S 26,5-30,6

C1-H1 ANS-I 1,7-5,3

C1-H1 ANS-G 2,1-3,8

C1-H1 ANS.3S 0,6-2,5

C1-H1 ANAc 1,7-3,0

C1-H1 ANAc-ared < LC

C1-H1 ANS-red 2,6-5,4

C1-H1 1.6-an.A < 1,1

C1-H1 1.6-an.M <1,0

C1-H1 MNS-ared 0,9-2,3

C1-H1 I2S 30,4-34,9

C1-H1 I-A6S 1,4-2,6

C1-H1 I-A6OH <0,2

C1-H1 G-ANS,3S <2,5

C1-H1 G-ANS 1,9-3,6

C1-H1 G-ANAc 0,4-1,4

C1-H1 G2S <0,5

C1-H1 AU2S 10,9-14,9

C1-H1 AU 0,6-1,6

C1-H1 I2S-red <0,5

C5-H5 Gal-A <0,3

7. Método según la reivindicación 1o 2, en el que en el espectro 1H-RMN, se identifica el siguiente patrón:

Señal Desplazamiento químico, ppm Porcentaje relativo, %

H1 ANS6S 5,40 25.5- 25,8

H1 I2S 5,23 19,2-20,8

H1 I2S-(AM.ol) 5,18 9.5- 9,8

H2 ANS 3,29 28,0-30,0

NAc 2,05 15,4-20,0

con lo que se determina que los residuos monosacarídicos proceden de dalteparina sódica.

8. Método según la reivindicación 1 o 2, en el que en el espectro 1H-13C HSQC RMN, se identifica el siguiente patrón:

Señal Porcentaje relativo

C1-H1 ANS-I2S 22,2-23,3

C1-H1 ANS-I 3,0-3,2

C1-H1 ANS-G 2,3-2,6

C1-H1 ANS.3S 2,1-2,9

C1-H1 ANAc 2,4-3,1

C1-H1 I2S 24,5-27,5

C1-H1 I-A6S 3,6-4,0

C1-H1 G-ANS,3S 1,8-2,3

C1-H1 G-ANS 2,5-3,5

C1-H1, C6-H6 AM.ol-6S 20,8-21,7

9. Método según la reivindicación 1 o 2, en el que en el espectro 1H-RMN, se identifica el siguiente patrón:

Señal Desplazamiento químico, ppm Porcentaje relativo, %

H4 AU2S 5,99 2,7

H1 AU2S 5,51 5,3

H1 ANS6S 5,40 23,6

H1 I2S 5,23 21,0

H2 ANS 3,29 30,0

NAc 2,05 16,1

con lo que se determina que los residuos monosacarídicos proceden de tinzaparina sódica,

o en el que en el espectro 1H-13C HSQC RMN, se identifica el siguiente patrón:

Señal Porcentaje relativo, %

C1-H1 ANS-I2S 27,2

C1-H1 ANS-I 3,2

C1-H1 ANS-G 3,4

C1-H1 ANS.3S 1,2

C1-H1 ANAc 3,7

C1-H1 ANAc-ared < LC

C1-H1 ANS-red 6,5

C1-H1 I2S 35,1

C1-H1 I-A6S 3,1

C1-H1 I-A6OH 0,8

C1-H1 G-ANS,3S 1,5

C1-H1 G-ANS 3,4

C1-H1 G-ANAc 2,2

C1-H1 AU2S 8,6

C1-H1 I2S-red <0,1

con lo que se determina que los residuos monosacarídicos proceden de tinzaparina sódica.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las señales correspondientes a los grupos N-acetilo aparecen en la región entre 1,8 a 2,1 ppm en espectroscopía de 1H-RMN.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las señales correspondientes al anillo sacarídico de los residuos citados aparecen en la región entre 2,8 a 6,0 ppm en espectroscopía de 1H-RMN.

12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las señales correspondientes a los protones anoméricos H1, así como las de los protones H4 de los terminales no reductores de alguno de los residuos citados, aparecen en la región entre 4,6 a 6,0 ppm en espectroscopía de 1H-RMN.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que, en espectroscopía 1H RMN, las señales del ácido 4,5-insaturado 2-O-sulfo urónico (AU2S) aparecen a 5,99 y 5,51 ppm, para los protones H4 y anomérico respectivamente, la señal del ácido 4,5-insaturado urónico (AU) aparece a 5,82 ppm para el protón H4, la señal del 2-N-sulfo-1,6-anhidroglucosamina (1,6-an.A) aparece a 5,62 ppm para el protón anomérico, la señal del 2-N-sulfo-1,6-anhidromanosamina (1,6-an.M) aparece a 5,57 ppm para el protón anomérico, y las señales del 2-N-sulfo-6-O-sulfoglucosamina aparecen a 5,41 y 4,21-4,34 ppm para los protones H1 y H6 y H6' respecti vamente.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que, en espectroscopia 1H-13C HSQC RMN, las señales del ácido 4,5-insaturado 2-O-sulfo urónico (AU2S) aparecen a 6,0-109,0 ppm (H4-C4), 5,5-100,2 ppm (H1-C1), 4,6-77,4 ppm (H2-C2) ó 4,3-66,8 ppm (H3-C3), las señales del ácido 4,5-insaturado urónico (AU) aparecen a 5,8-110,7 ppm (H4-C4) ó 5,2-103,9 ppm (H1-C1), las señales del 2-N-sulfo-1,6-anhidroglucosamina (1,6-an.A) aparecen a 5,6-104,2 ppm (H1-C1), 3,2-58,5 ppm (H2-C2) ó 3,8-67,5 ppm (H6-C6), las señales del 2-N-sulfo-1,6-anhidromanosamina (1,6-an.M) aparecen a 5,6-103,9 ppm (H1-C1), 3,5-55,1 (H2-C2) o 3,8-67,5 ppm (H6-C6), y las señales del 2-N-sulfo-6-O-sulfoglucosamina aparecen a 5,4-99,4 ppm (H1-C1), 3,8-80,9 ppm (H4-C4), 3,7 a 3,8-42,3 a 72,5 ppm (H3-C3), 4,1-70,6 a 71,7 ppm (H5-C5) ó 3,3-60,5-60,8 ppm (H2-C2).

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el patrón obtenido en el análisis deter mina que los residuos monosacarídicos proceden de una heparina no fraccionada, de una Heparina de Bajo Peso Molecular (HBPM) o de una Heparina de Muy Bajo Peso Molecular (HMBPM).