EA025296B1 - Устойчивые против насекомых растения хлопчатника и способы их идентификации - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к специфическим растениям хлопчатника, растительному материалу и семенам, отличающимся тем, что они включают специфическую маркерную последовательность в определенном локусе генома хлопчатника. Предложены также способы быстрой и недвусмысленной идентификации указанной последовательности в биологических образцах.

Description

Изобретение относится к трансгенным растениям хлопчатника, растительному материалу и семенам, характеризующимся наличием специфического трансформационного события, в особенности наличием гена, кодирующего белок, который придает стойкость против насекомых, при специфическом местоположении в геноме хлопчатника. Растения хлопчатника по изобретению объединяют стойкий против насекомых фенотип с агрономической продуктивностью, генетической стабильностью и приспособляемостью к различным генетическим средам, которые эквивалентны ^трансформированной линии хлопчатника в отсутствие насекомых. Данное изобретение дополнительно относится к способам и наборам для идентификации наличия растительного материала, содержащего специфически трансформационное событие ЕЕ-СН5 в биологических образцах.

Уровень техники

Фенотипическая экспрессия трансгена в растении определяется как структурой гена самого по себе, так и его местоположением в геноме растения. В то же время наличие трансгена (в чужеродной ДНК) при разных местоположениях в геноме растения будет влиять на весь фенотип растения различными путями. Агрономически или индустриально успешное придание представляющей коммерческий интерес характерной черты растению путем генетической манипуляции может быть очень длинной процедурой, зависимой от различных факторов. Фактическая трансформация и регенерация генетически трансформированных растений - это только первый шаг в ряду стадий селекции, которые включают широкое описание генетических характеристик, размножение и эволюцию в полевых испытаниях, со временем приводящие к селекции элитного события.

Хлопковое волокно является единым всемирным наиболее важным текстилем. Приблизительно с 80 млн акров хлопчатника собирают урожай ежегодно на земном шаре. Хлопчатник является пятой наибольшей культурой в США по продуктивности земельной площади, посевная площадь свыше 15 млн акров в 2000.

Наиболее вредоносными видами насекомых, кормящихся на хлопке, являются НсПсоусгра /са (коробочный червь или совка хлопковая), НсПсоусгра агш1дега (американская совка хлопковая), ΗοΙίοίΠίδ У1ге8сеи8 (листовертка) и НеПсоуегра риисйдега.

Четкая идентификация элитного события становится возрастающе важной ввиду дискуссий по поводу новых пищевых продуктов и кормов, сегрегации ΟΜΘ и не-СМО продуктов и идентификации патентованного материала. В идеале, метод такой идентификации является и быстрым, и простым без необходимости всесторонней лабораторной системы. Более того, метод должен предоставлять результаты, которые делали бы возможным четкое определение элитного события без экспертной интерпретации, но которые находились бы под контролем эксперта, если необходимо. Специфические инструменты для применения для идентификации элитного события ЕЕ-СН5 в биологических образцах описаны здесь.

ЕЕ-СН5 идентифицировано как элитное событие в популяции трансгенных растений хлопчатника в процессе разработки стойкого против насекомых хлопчатника (Соккуршш ЫгкШит), содержащего ген, кодирующий инсектицидный кристаллический белок от ВасШик Шиг1п§1еп515. Трансгенные растения хлопчатника содержат химерный ген, кодирующий инсектицидный кристаллический белок В1 (который описан в АО 03/093484) под контролем экспрессируемого растением промотора.

Растения хлопчатника, содержащие стойкий против насекомых ген, раскрыты в технической литературе. Однако ни одно из предшествующих раскрытий не информировало или не наводило на мысль о данном изобретении.

Сущность изобретения

Данное изобретение относится к трансгенному растению хлопчатника или его семенам, клеткам или тканям, содержащим стабильно интегрированную в их геном экспрессионную кассету, которая содержит стойкий против насекомых ген, содержащий кодирующую последовательность гена сгу1АЬ (которая описана в примере 1.1 здесь), растение является стойким против насекомых и в отсутствие прессинга со стороны насекомых имеет агрономическую производительность, которая, по существу, эквивалентна нетрансгенной изогенной линии. Под прессингом насекомых растение будет иметь превосходный агрономический фенотип по сравнению с нетрансгенным растением.

Согласно данному изобретению растение хлопчатника или его семена, клетки или ткани содержат элитное событие ЕЕ-СН5.

Более конкретно, данное изобретение относится к трансгенному растению хлопчатника, его семенам, клеткам или тканям, геномная ДНК которых характеризуется тем фактом, что при анализе по протоколу идентификации РСК, как описано здесь, с использованием двух праймеров, нацеленных на 5' или 3' фланкирующий регион ЕЕ-СН5 и чужеродную ДНК, соответственно, приводит к фрагменту, который является специфическим для ЕЕ-СН5. Праймеры могут быть направлены против 5' фланкирующего региона внутри 8ЕО ГО Νο. 1 и чужеродной ДНК, соответственно, такие как праймеры, содержащие или состоящие из нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 7 и 8ЕО ГО Νο. 8, соответственно, и могут приводить к фрагменту ДНК из между 100 и 700 п.о., предпочтительно около 129 п.о. Праймеры могут быть также направлены против 3' фланкирующего региона внутри 8ЕО ГО Νο. 2 и чужеродной ДНК, соответственно, такие как праймеры, содержащие или состоящие из нуклеотидной последовательности

- 1 025296

8ΕΟ ΙΌ Νο. 3 и 8ΕΟ ΙΌ Νο. 6, соответственно, и могут приводить к фрагменту ДНК из между 300 и 700 п.о., предпочтительно около 369 п.о.

Эталонные семена, содержащие элитное событие по изобретению депонированы в АТСС под инвентарным номером РТА-8171. Одним вариантом осуществления изобретения являются семена, содержащие элитное событие ΕΕ-ΟΗ5, депонированные в АТСС под инвентарным номером РТА-8171, из которых вырастают растения хлопчатника стойкие против насекомых, особенно против НсПсоусгра 8р. или ΗβΙίοΐΗδ 8р. Семена с номером депозита в АТСС РТА-8171 являются лотом семян, состоящим по меньшей мере на 95% из трансгенных зерен гомозиготных для трансгена, содержащих элитное событие по изобретению, из которых будут вырастать стойкие против насекомых растения, которые в соответствии с этим являются также толерантными к глуфозинату растениями. Семена могут быть высеяны и выросшие растения могут быть обработаны глуфозинатом, как описано здесь, чтобы получить 100% толерантные к глуфозинату растения, содержащие элитное событие по изобретению. Изобретение дополнительно относится к клеткам, тканям, потомству и отпрыскам растения, содержащего элитное событие по изобретению, выращенного из семени, депонированного в АТСС, имеющего инвентарный номер РТА-8171. Изобретение дополнительно относится к растениям, достижимым путем воспроизведения и/или размножения растения хлопчатника, содержащего элитное событие по изобретению, выращенного из семени, депонированного в АТСС и имеющего инвентарный номер РТА-8171. Изобретение также относится к растениям хлопчатника, содержащим элитное событие ΕΕ-ΟΗ5.

Изобретение дополнительно относится к методу идентификации трансгенного растения или его клеток, или тканей, содержащих элитное событие ΕΕ-ΟΗ5, этот метод основан на идентификации наличия характерных последовательностей ДНК или аминокислот, кодируемых такими последовательностями ДНК, в трансгенном растении, клетках или тканях. Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения, такие характерные последовательности ДНК являются последовательностями из 15 п.о., предпочтительно 20 п.о., наиболее предпочтительно 30 п.о. или более, которые содержат инсерционный сайт события, т.е. и часть чужеродной ДНК, и часть генома хлопчатника (один из двух 5' или 3' фланкирующий регион), смежную с ней, дающие возможность специфической идентификации элитного события.

Данное изобретение дополнительно относится к методам идентификации элитного события ΕΕΟΗ5 в биологических образцах, эти методы основаны на праймерах или зондах, которые специфически распознают 5' и/или 3' фланкирующую последовательность ΕΕ-ΟΗ5.

Более конкретно, изобретение относится к методу, содержащему амплифицирование последовательности нуклеиновой кислоты, присутствующей в биологических образцах, с использованием полимеразной цепной реакции по меньшей мере с двумя праймерами, один из которых распознает 5' или 3¹ фланкирующий регион ΕΕ-ΟΗ5, а другой распознает последовательность в чужеродной ДНК, предпочтительно для получения фрагмента ДНК из между 100 и 500 п.о. Праймеры могут распознавать последовательность в 5' фланкирующем регионе ΕΕ-ΟΗ5 (8ΕΟ ΙΌ Νο. 1, от положения 1 до положения 98 или 8ΕΟ ГО Νο. 16 от положения 1 до 5 63) или в 3' фланкирующем регионе ΕΕ-ΟΗ5 (комплемент 8ΕΟ ГО Νο. 2 от положения 41 до положения 452) и последовательность в чужеродной ДНК (комплемент 8ΕΟ ГО Νο. I от положения 99 до 334 или 8ΕΟ ГО Νο. 2 от положения 1 до положения 40), соответственно. Праймер, распознающий 5' фланкирующий регион, может содержать нуклеотидную последовательность 8ΕΟ ГО Νο. 7 или 8ΕΟ ГО Νο. 17, и праймер, распознающий последовательность в чужеродной ДНК, может содержать нуклеотидную последовательность 8ΕΟ ГО Νο 8, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 18 или 8ΕΟ ΙΌ Νο. 19, описанные здесь. Праймер, распознающий 3' фланкирующий регион, может содержать нуклеотидную последовательность 8ΕΟ ГО Νο. 6, и праймер, распознающий последовательность в чужеродной ДНК, может содержать нуклеотидную последовательность 8ΕΟ ГО Νο. 3, описанные здесь.

Данное изобретение, более конкретно, относится к методу идентификации элитного события ΕΕΟΗ5 в биологических образцах, этот метод содержит амплифицирование последовательности нуклеиновой кислоты, присутствующей в биологическом образце, с использованием полимеразной цепной реакции с двумя праймерами, имеющими нуклеотидную последовательность 8ΕΟ ГО Νο. 3 и 8ΕΟ ГО Νο. 6, соответственно, для получения фрагмента ДНК приблизительно из 369 п.о.

Рассматриваемое элитное событие содержит последовательность чужеродной ДНК, в которой произошла небольшая перегруппировка по сравнению с ДНК, первоначально используемой для процедуры трансформации, перегруппировка является уникальной для элитного события ΕΕ-ΟΗ5.

Соответственно, изобретение также относится к методу идентификации элитного события ΕΕ-ΟΗ5 в биологических образцах, этот метод содержит амплифицирование последовательности нуклеиновой кислоты, присутствующей в биологическом образце, с использованием полимеразной цепной реакции с двумя праймерами, фланкирующими уникальную перегруппировку чужеродной ДНК в ΕΕ-ΟΗ5, такие праймеры содержат или имеют нуклеотидную последовательность 8ΕΟ ГО Νο. 10 и 8ΕΟ ГО Νο. 11, для получения фрагмента ДНК приблизительно из 262 п.о.

Данное изобретение дополнительно относится к специфическим фланкирующим последовательностям ΕΕ-ΟΗ5, описанным здесь, которые могут быть использованы для разработки специфических методов идентификации ΕΕ-ΟΗ5 в биологических образцах. Такие специфические фланкирующие последо- 2 025296 вательности могут быть также использованы в качестве эталонного контрольного материала в идентификационных анализах. Более конкретно, изобретение относится к 5' и/или 3' фланкирующим регионам ЕЕОН5, которые могут быть использованы для разработки специфических праймеров и зондов, как описано здесь далее. Изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, связывающим специфические перегруппировки в чужеродной ДНК ЕЕ-ОН5, такая молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность 8ЕО ГО Νο. 12 от нуклеотидного положения 52 до нуклеотидного положения 88 или содержит последовательность 8ЕС ГО Νο. 12. В качестве эталонного материала пригодны также молекулы нуклеиновой кислоты, предпочтительно из около 369 п.о., содержащие последовательность, которая может быть амплифицирована праймерами, имеющими нуклеотидную последовательность 8ЕО ГО Νο. 3 и 8ЕС ГО Νο. 6.

Данное изобретение дополнительно относится к методам идентификации наличия ЕЕ-ОН5 в биологических образцах, основанным на применении таких специфических праймеров или зондов. Праймеры могут состоять из нуклеотидной последовательности из от 17 до около 200 упорядоченно следующих друг за другом нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 98, из нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 16 от нуклеотида 1 до нуклеотида 563 или комплемента нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 41 до нуклеотида 452, объединенных с праймерами, состоящими из нуклеотидной последовательности из от 17 до около 200 упорядоченно следующих друг за другом нуклеотидов, выбранной из комплемента нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 1 от нуклеотида 99 до нуклеотида 334 или нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 1 до нуклеотида 40. Праймеры могут также содержать указанные нуклеотидные последовательности, расположенные на их экстремальном 3' конце, и дополнительно содержать неродственные последовательности или последовательности, производные от указанных нуклеотидных последовательностей, но содержащие несоответствия.

Изобретение дополнительно относится к наборам для идентификации элитного события ЕЕ-ОН5 в биологических образцах, указанные наборы содержат по меньшей мере один праймер или зонд, который специфически распознает 5' или 3' фланкирующий регион ЕЕ-ОН5 или специфическую перегруппировку в последовательности чужеродной ДНК в ЕЕ-ОН5.

Набор по изобретению может содержать в дополнение к праймеру, который специфически распознает 5' или 3' фланкирующий регион ЕЕ-ОН5, второй праймер, который специфически распознает последовательность в чужеродной ДНК ЕЕ-ОН5, для применения в РСК идентификационном протоколе. Наборы по изобретению могут содержать по меньшей мере два специфических праймера, один из которых распознает последовательность в 5' фланкирующем регионе ЕЕ-СН5, а другой распознает последовательность в чужеродной ДНК. Праймер, распознающий 5' фланкирующий регион, может содержать нуклеотидную последовательность 8ЕС ГО Νο. 3, и праймер, распознающий трансген, может содержать нуклеотидную последовательность 8ЕС ГО Νο. 6 или какой-либо другой праймер, как описано здесь.

Изобретение дополнительно относится к набору для идентификации элитного события ЕЕ-СН5 в биологических образцах, указанный набор содержит РСК праймеры, имеющие нуклеотидную последовательность 8ЕС ГО Νο. 3 и 8ЕС ГО Νο. 6 для применения в РСК протоколе для идентификации ЕЕ-СН5, описанном здесь. Изобретение дополнительно относится к набору для идентификации элитного события ЕЕ-СН5 в биологических образцах, указанный набор содержит РСК праймеры, имеющие нуклеотидную последовательность 8ЕС ГО Νο. 10 и 8ЕС ГО Νο. 11.

Изобретение также относится к набору для идентификации элитного события ЕЕ-СН5 в биологических образцах, указанный набор содержит специфический зонд, имеющий последовательность, которая соответствует (или комплементарна к) последовательности, имеющей идентичность последовательности между 80 и 100% со специфическим регионом ЕЕ-СН5. Предпочтительно последовательность зонда соответствует специфическому региону, содержащему часть 5' или 3' фланкирующего региона ЕЕ-СН5, или региону, соответствующему перегруппировке чужеродной ДНК специфической для ЕЕ-СН5. Наиболее предпочтительно специфический зонд имеет последовательность (или является комплементарным к ней), имеющую идентичность последовательности между 80 и 100% к последовательности между нуклеотидами 78-119 8ЕС ГО Νο. 1, или 8ЕС ГО Νο. 2 от нуклеотида 20 до 61, или 8ЕС ГО Νο. 12 от нуклеотида 52 до нуклеотида 88.

Согласно другому аспекту изобретения раскрыты последовательности ДНК, содержащие инсерционный сайт события и имеющие достаточную длину полинуклеотидов как геномной ДНК хлопчатника, так и чужеродной ДНК (трансгена), так чтобы быть применимыми в качестве праймера или зонда для выявления ЕЕ-СН5. Такие последовательности могут содержать по меньшей мере 9 нуклеотидов геномной ДНК хлопчатника и подобное число нуклеотидов чужеродной ДНК (трансгена) ЕЕ-СН5 к тому же на каждой стороне инсерционного сайта, соответственно. Наиболее предпочтительно указанные последовательности ДНК содержат по меньшей мере 9 нуклеотидов геномной ДНК хлопчатника и подобное число нуклеотидов чужеродной ДНК, смежные с инсерционным сайтом в 8ЕС ГО Νο. 1 или 8ЕС ГО Νο. 2.

Методы и наборы, охватываемые данным изобретением, могут быть использованы для различных целей, таких как следующие, но без ограничения перечисленными: для идентификации наличия или отсутствия ЕЕ-СН5 в растениях, растительном материале или в продуктах, таких как, но без ограничения

- 3 025296 перечисленными, пищевые или кормовые продукты (свежие или переработанные), содержащие растительный материал или произведенные из растительного материала; дополнительно или в качестве варианта, методы и наборы по данному изобретению могут быть использованы для идентификации трансгенного материала в целях сегрегации между трансгенным и нетрансгенным материалом; дополнительно или в качестве варианта, методы и наборы по данному изобретению могут быть использованы для определения качества (т.е. процентной доли чистого материала) растительного материала, содержащего ЕЕОН5.

Изобретение дополнительно относится к 5' и/или 3' фланкирующим регионам ЕЕ-ОН5, а также к специфическим праймерам и зондам, созданным из 5' и/или 3' фланкирующих последовательностей ЕЕОН5. Изобретение также относится к специфическому для ЕЕ-ОН5 региону перегруппировки, а также к специфическим праймерам или зондам, созданным из указанного региона.

Изобретение также относится к геномной ДНК, полученной из растений, содержащих элитное событие ЕЕ-ОН5. Такая геномная ДНК может быть использована в качестве эталонного контрольного материала в идентификационных анализах, описанных здесь.

Краткое описание чертежей

Следующие примеры, не предназначенные для ограничения изобретения конкретными описанными вариантами осуществления, могут быть понятны в связи с сопровождающей иллюстрацией, приобщенной к нему ссылкой, где фиг. 1 схематически представляет взаимосвязь между указанными нуклеотидными последовательностями и праймерами.

Черная полоса: чужеродная ДНК; полосатая черная полоса: перегруппировка в чужеродной ДНК специфическая для ЕЕ-СН5; светлая полоса: ДНК растительного происхождения; полосатая светлая полоса: пред-инсерционная мишенная делеция; стрелки: олигонуклеотидные праймеры, цифры под полосами означают нуклеотидные положения; (с) относится к комплементу указанной нуклеотидной последовательности.

Фиг. 2 представляет результаты, полученные по идентификационному протоколу РСК, разработанному для ЕЕ-СН5. Последовательный ряд нанесения геля: дорожка 1: молекулярномассовый маркер (шаг из 100 п.о.); дорожки 2 и 3: образцы ДНК из растений хлопчатника, содержащих трансгенное событие ЕЕ-СН5; дорожки 4-10: образцы ДНК из трансгенных растений хлопчатника, не содержащих элитного события ЕЕ-СН5, но содержащих подобный ген стойкости против насекомых; дорожка 11: контроль без матричной ДНК; дорожка 12: молекулярномассовый маркер.

Фиг. 3 представляет результаты, полученные по протоколу РСК оценки зиготности, разработанному для ЕЕ-СН5.

Последовательный ряд нанесения геля:

Дорожка 1: молекулярномассовый маркер (шаг из 100 п.о.); дорожки 2 и 3: образцы ДНК из растений хлопчатника, содержащих трансгенное событие ЕЕ-СН5 в гетерозиготной форме; дорожка 4: неудача, дорожка 5: контрольный образец ДНК из растения хлопчатника дикого типа; дорожки 6-7: образец ДНК из растений хлопчатника, содержащих трансгенное событие ЕЕ-СН5 в гомозиготной форме; дорожка 8: контроль без матричной ДНК; дорожка 9: молекулярномассовый маркер.

Подробное описание изобретения

Вхождение молекулы рекомбинантной ДНК в геном растения происходит в результате трансформации клетки или ткани. Конкретное место вхождения обычно является следствием произвольной интеграции.

ДНК, введенная в геном растения как результат трансформации клетки или ткани растения рекомбинантной ДНК или трансформирующей ДНК и происходящая из такой трансформирующей ДНК, упоминается здесь далее как чужеродная ДНК, содержащая один или несколько трансгенов. Растительная ДНК в контексте данного изобретения будет иметь отношение к ДНК, происходящей из растения, которое трансформируют. Растительную ДНК обычно можно обнаружить в том же генетическом локусе в соответствующем растении дикого типа. Чужеродная ДНК может быть охарактеризована местоположением и конфигурацией при сайте включения молекулы рекомбинантной ДНК в геном растения. Сайт в геноме растения, где вставлена рекомбинантная ДНК, называют также как инсерционный сайт или сайт-мишень. Инсерция рекомбинантной ДНК в регион генома растения упоминается как делеция сайта-мишени. Используемые здесь фланкирующий регион или фланкирующая последовательность относятся к последовательности по меньшей мере из 20 п.о., предпочтительно по меньшей мере 50 п.о. и вплоть до 5000 п.о., ДНК отличной от интродуцированной ДНК, предпочтительно ДНК из генома растения, которая располагается или непосредственно выше, или ниже и по соседству с чужеродной ДНК. Процедуры трансформации, приводящие к произвольной интеграции чужеродной ДНК, будут иметь результатом трансформанты с различными фланкирующими регионами, которые являются характерными и уникальными для каждого трансформанта. Когда рекомбинантную ДНК интродуцируют в растение традиционным скрещиванием, ее инсерционный сайт в геноме растения или ее фланкирующие регионы, как правило, не могут быть заменены. Используемый здесь инсерционный регион относится к региону, соответствующему региону по меньшей мере из 40 п.о., предпочтительно по меньшей мере 100

- 4 025296

п.о. и вплоть до 10000 п.о., охваченному последовательностью, которая содержит расположенный выше и/или ниже фланкирующий регион чужеродной ДНК в геноме растения. Принимая во внимание незначительные различия из-за мутаций в разновидностях, инсерционный регион будет сохранять при скрещивании в растениях той же разновидности по меньшей мере 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% и наиболее предпочтительно 100% идентичность последовательности с последовательностью, содержащей верхний и нижний фланкирующие регионы чужеродной ДНК в растении, первоначально полученном в результате трансформации.

Событие определяют как генетический локус(искусственный), который как результат генной инженерии несет трансген, содержащий по меньшей мере одну копию гена, представляющего интерес. Типичные аллельные состояния характеризуются наличием или отсутствием чужеродной ДНК. Фенотипически событие характеризуется экспрессией трансгена. На генетическом уровне событие является частью генетической структуры растения. На молекулярном уровне событие может быть охарактеризовано рестрикционной картой (например, которую определяют саузерн-блоттингом), верхней и/или нижней фланкирующими последовательностями трансгена, местоположением молекулярных маркеров и/или молекулярной конфигурацией трансгена. Обычно трансформация растения трансформирующей ДНК, содержащей по меньшей мере один представляющий интерес ген, ведет к популяции трансформантов, содержащих множество отдельных событий, каждое из которых является уникальным.

Используемое здесь элитное событие - это событие, которое выбрано из группы событий, полученных путем трансформации той же самой трансформирующей ДНК или обратным скрещиванием с растениями, полученными такой трансформацией, на основе экспрессии и стабильности трансгена (трансгенов) и его совместимости с оптимальными агрономическими характеристиками растения, содержащего его. Так критерием для выбора элитного события являются один или несколько, предпочтительно два или более, преимущественно все из следующих:

a) то, что присутствие чужеродной ДНК не подрывает другие желательные характеристики растения, такие как те, которые имеют отношение к агрономической продуктивности или коммерческой ценности;

b) то, что событие характеризуется четко определенной молекулярной конфигурацией, которая устойчиво наследуется и для которой соответствующие инструменты для контроля идентичности могут быть разработаны;

c) то, что представляющий интерес ген(ы) показывает правильную свойственную ему и стабильную пространственную и скоротечную фенотипическую экспрессию как в гетерозиготном, так и гомозизотном состоянии события, при коммерчески приемлемом уровне, в диапазоне условий окружающей среды, которым растения, несущие событие, возможно будут подвергаться при обычном агрономическом использовании.

Предпочтительно, что чужеродная ДНК ассоциируется с положением в геноме растения, которое дает возможность легкой интрогрессии в желательные коммерческие генетические среды.

Статус события как элитного события подтверждают интрогрессией элитного события в различные релевантные генетические среды и наблюдением согласования с одним, двумя или всеми критериями, например, а), Ь) и с), выше.

Элитное событие, таким образом, относится к генетическому локусу, содержащему чужеродную ДНК, который отвечает указанным критериям. Растение, растительный материал или потомство, такое как семена, могут содержать одно или несколько элитных событий в геноме.

Инструменты, разработанные для идентификации элитного события или растения, растительного материала, содержащего элитное событие, или продуктов, которые содержат растительный материал, содержащий элитное событие, основаны на специфических геномных характеристиках элитного события, таких как специфическая рестрикционная карта геномного региона, содержащего чужеродную ДНК, молекулярные маркеры или последовательность фланкирующего региона (регионов) чужеродной ДНК.

Как только один или оба фланкирующих региона чужеродной ДНК упорядочены, могут быть разработаны праймеры и зонды, которые специфически распознают эту (эти) последовательность (последовательности) в нуклеиновой кислоте (ДНК или РНК) образца путем молекулярной биологической технологии. Например, метод РСК может быть усовершенствован для идентификации элитного события в биологических образцах (таких как образцы растений, растительного материала или продуктов, содержащих растительный материал). Такая РСК основана по меньшей мере на двух специфических праймерах, один из которых распознает последовательность в 5' или 3' фланкирующем регионе элитного события, а другой распознает последовательность в чужеродной ДНК. Праймеры предпочтительно имеют последовательность из между 15 и 35 нуклеотидами, которая в оптимизированных условиях РСК специфически распознает последовательность в 5' или 3' фланкирующем регионе элитного события и чужеродной ДНК элитного события, соответственно, так что специфический фрагмент (интеграционный фрагмент или дискриминирующий ампликон) амплифицируется из образца нуклеиновой кислоты, содержащего элитное событие. Это означает, что только целевой интеграционный фрагмент, а никакая другая последовательность в геноме растения или чужеродной ДНК, амплифицируется в оптимизированных условиях РСК.

- 5 025296

Праймерами РСК, подходящими для изобретения, могут быть следующие:

олигонуклеотиды в диапазоне длины от 17 нуклеотидов до около 100 нуклеотидов, содержащие нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 17 следующих друг за другом нуклеотидов, предпочтительно 20 следующих друг за другом нуклеотидов, выбранных из 5' фланкирующей последовательности (5>ЕО ГО Νο. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 98 или 5>ЕО ГО Νο. 16 от нуклеотида 1 до 563) при их 3' конце (праймеры, распознающие 5' фланкирующие последовательности); или олигонуклеотиды в диапазоне длины от 17 нуклеотидов до около 200 нуклеотидов, содержащие нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 17 следующих друг за другом нуклеотидов, предпочтительно 20 следующих друг за другом нуклеотидов, выбранных из 3' фланкирующей последовательности (комплемент 5>ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 41 до нуклеотида 452) при их 3' конце (праймеры, распознающие 3' фланкирующие последовательности); или олигонуклеотиды в диапазоне длины от 17 нуклеотидов до около 200 нуклеотидов, содержащие нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 17 следующих друг за другом нуклеотидов, предпочтительно 20 нуклеотидов, выбранных из последовательностей вставленной ДНК (комплемент 5>ЕС ГО Νο. 1 от нуклеотида 99 до нуклеотида 334) при их 3' конце (праймеры, распознающие чужеродную ДНК); или олигонуклеотиды в диапазоне длины от 17 нуклеотидов до около 40 нуклеотидов, содержащие нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 17 следующих друг за другом нуклеотидов, предпочтительно 20 нуклеотидов, выбранных из последовательностей вставленной ДНК (5>ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 1 до нуклеотида 40).

Праймеры, конечно, могут быть более длинными, чем указанные 17 следующих друг за другом нуклеотидов, и могут быть, например, длиной 20, 21, 30, 35, 50, 75, 100, 150, 200 нуклеотидов или даже длиннее. Праймеры могут полностью состоять из нуклеотидной последовательности, выбранной из указанных нуклеотидных последовательностей фланкирующих последовательностей и последовательностей чужеродной ДНК. Однако нуклеотидная последовательность праймеров на их 5' конце (т.е. наружу от 3'размещенных 17 следующих друг за другом нуклеотидов) является менее критической. Так, 5' последовательность праймеров может состоять из нуклеотидной последовательности, выбранной из фланкирующих последовательностей или чужеродной ДНК, как свойственно, но может содержать несколько (например, 1, 2, 5, 10 несоответствий). 5' Последовательность праймеров может даже полностью состоять из нуклеотидной последовательности, неродственной фланкирующим последовательностям или чужеродной ДНК, такой как нуклеотидная последовательность, представляющая рестрикционные сайты распознавания фермента. Такие неродственные последовательности или фланкирующие ДНК последовательности с несоответствиями должны быть предпочтительно не длиннее чем 100, более предпочтительно не длинее чем 50 или даже 25 нуклеотидов.

Кроме того, подходящие праймеры могут содержать или состоять из нуклеотидной последовательности на их 3' конце, охватывающей соединительный регион между последовательностями, производными от растительной ДНК, и последовательностями чужеродной ДНК (размещенной при нуклеотидах 98-99 в 5>ЕО ГО Νο. 1 и нуклеотидах 40-41 в 5>ЕО ГО Νο. 2), при условии, что указанные 3'-размещенные 17 следующих друг за другом нуклеотидов не являются производными исключительно или чужеродной ДНК, или последовательностей производных растения в 5>ЕО ГО Νο. 1 или 2.

Специалисту также сразу должно быть ясно, что надлежащим образом выбранные пары праймеров РСК не должны также содержать последовательности комплементарные друг другу.

Для целей изобретения комплемент нуклеотидной последовательности, представленной в 5>ЕО ГО Νο. X - это нуклеотидная последовательность, которая может быть произведена от представленной нуклеотидной последовательности замещением нуклеотидов через комплементарный им нуклеотид согласно правилам СНагдаГГ (А Т; С » С) и прочтения последовательности в направлении от 5' к 3', т.е. в направлении противоположном представленной нуклеотидной последовательности.

Примерами подходящих праймеров являются олигонуклеотидные последовательности 5>ЕО ГО Νο. 7 или 5>ЕО ГО Νο. 17 (праймеры, распознающие 5' фланкирующую последовательность), 5>ЕО ГО Νο. 8, 5>ЕО ГО Νο. 18 или 5>ЕО ГО Νο. 19 (праймеры, распознающие чужеродную ДНК для применения с праймерами, распознающими 5' фланкирующую последовательность), 5>ЕО ГО Νο. 3 (праймеры, распознающие чужеродную ДНК для применения с праймерами, распознающими 3' фланкирующую последовательность), 5>ЕО ГО Νο. 4, 5>ЕО ГО Νο. 5, 5>ЕО ГО Νο. 6 (праймеры, распознающие 3' фланкирующую последовательность) и 5>ЕО ГО Νο. 10 и 11 (праймеры, распознающие специфическую перегруппировку чужеродной ДНК в ЕЕ-СН5).

Другие примеры подходящих олигонуклеотидных праймеров содержат на их 3' конце следующие последовательности или состоят из таких последовательностей:

а) Праймеры, распознающие 5' фланкирующую последовательность: нуклеотидная последовательность 5>ЕО ГО Νο. 1 от нуклеотида 58 до нуклеотида 77, нуклеотидная последовательность 5>ЕО ГО Νο. 16 от нуклеотида 85 до нуклеотида 104, нуклеотидная последовательность 5>ЕО ГО Νο. 16 от нуклеотида 150 до нуклеотида 166, нуклеотидная последовательность 5>ЕО ГО Νο. 16 от нуклеотида 150 до нуклеотида 171, нуклеотидная последовательность 8ЕО ГО Νο. 16 от нуклеотида 154 до нуклеотида 171, нуклеотидная последовательность 8ЕО ГО Νο. 16 от нуклеотида 87 до нуклеотида 104, нуклеотидная последовательность 8ЕО ГО Νο. 16 от нуклеотида 189 до нуклеотида 206.

b) Праймеры, распознающие последовательность чужеродной ДНК для применения с праймерами, распознающими 5' фланкирующую последовательность:

комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 1 от нуклеотида 149 до нуклеотида 170, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 1 от нуклеотида 169 до нуклеотида 186, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 1 от нуклеотида 193 до нуклеотида 212, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 1 от нуклеотида 161 до нуклеотида 178, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 1 от нуклеотида 194 до нуклеотида 211, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 1 от нуклеотида 193 до нуклеотида 211, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 1 от нуклеотида 163 до нуклеотида 185, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 1 от нуклеотида 194 до нуклеотида 210, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 1 от нуклеотида 193 до нуклеотида 210, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 1 от нуклеотида 193 до нуклеотида 209.

c) праймеры, распознающие 3' фланкирующую последовательность:

комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 149 до нуклеотида 168, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 154 до нуклеотида 173, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 140 до нуклеотида 15 9, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 141 до нуклеотида 160, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 147 до нуклеотида 166, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 148 до нуклеотида 167, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 149 до нуклеотида 167, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 153 до нуклеотида 172, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 154 до нуклеотида 174, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 160 до нуклеотида 177, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 232 до нуклеотида 251, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 140 до нуклеотида 160, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 141 до нуклеотида 161, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 147 до нуклеотида 165, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 149 до нуклеотида 166, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 148 до нуклеотида 166, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 147 до нуклеотида 167, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 148 до нуклеотида 168, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 153 до нуклеотида 173, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 154 до нуклеотида 175, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 156 до нуклеотида 175, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 232 до нуклеотида 250, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 140 до нуклеотида 157, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 140 до нуклеотида 161, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 141 до нуклеотида 162, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 148 до нуклеотида 165, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 149 до нуклеотида 165, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 147 до нуклеотида 168, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 148 до нуклеотида 169, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 156 до нуклеотида 17 4, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 153 до нуклеотида 174, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 232 до нуклеотида 24 9, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 234 до нуклеотида 251, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 141 до нуклеотида 163, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 148 до нуклеотида 164, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 147 до нуклеотида 169, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 153 до нуклеотида 175, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 156 до нуклеотида 177, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 181 до нуклеотида 198, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 181 до нуклеотида 202, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 234 до нуклеотида 250 комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 140 до нуклеотида 162, комплемент нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 181 до нуклеотида 203. б) Праймеры, распознающие последовательность чужеродной ДНК, для применения с праймерами, распознающими 3' фланкирующую последовательность:

- 7 025296 нуклеотидная последовательность 8ЕС ГО Νο. 2 от нуклеотида 30 до нуклеотида 49, нуклеотидная последовательность 8ЕС ГО Νο. 2 от нуклеотида 30 до нуклеотида 48, нуклеотидная последовательность 8ЕС ГО Νο. 2 от нуклеотида 32 до нуклеотида 48, нуклеотидная последовательность 8ЕС ГО Νο. 2 от нуклеотида 32 до нуклеотида 49, нуклеотидная последовательность 8ЕС ГО Νο. 2 от нуклеотида 31 до нуклеотида 49, нуклеотидная последовательность 8ЕС ГО Νο. 2 от нуклеотида 31 до нуклеотида 48, нуклеотидная последовательность 8ЕС ГО Νο. 2 от нуклеотида 30 до нуклеотида 46.

Используемое здесь выражение нуклеотидная последовательность 8ЕС ГО Νο. Ζ от положения X до положения Υ указывает, что нуклеотидная последовательность включает оба конечных нуклеотида. Предпочтительно амплифицированный фрагмент имеет длину между 50 и 500 нуклеотидами, наиболее предпочтительно между 100 и 350 нуклеотидами. Специфические праймеры могут иметь последовательность, которая на 80-100% идентична последовательности в 5' или 3' фланкирующем регионе элитного события и чужеродной ДНК элитного события, соответственно, при условии что несоответствия все еще позволяют проводить специфическую идентификацию элитного события с указанными праймерами в оптимизированных условиях РСК. Предел допустимых несоответствий, однако, легко может быть определен экспериментально и известен специалисту в этой области.

В следующей таблице приведены примеры размеров вероятных ампликонов ДНК (или интеграционных фрагментов) с выбранными парами праймеров РСК.

Праймер	от	Праймер	ДО	Длина
1	положения	2	положения	ампликона
НУН024	58	ОРА312	186	128
СН1057	1	МАЕ115	175	175
СН1057	1	НУН022	251	251
СН1057	1	СН1065	369	369

Выявление интеграционных фрагментов может происходить различными путями, например, через оценку размера после гель-анализа. Интеграционные фрагменты могут быть также непосредственно упорядочены. Другие специфические в отношении последовательности методы выявления амплифицированных фрагментов ДНК также известны в технике.

Так как последовательность праймеров и их относительное местоположение в геноме являются уникальными для элитного события, амплификация интеграционного фрагмента будет происходить только в биологических образцах, содержащих элитное событие (его нуклеиновую кислоту). Предпочтительно, когда осуществляют РСК, чтобы идентифицировать наличие ЕЕ-СН5 в неизвестных образцах, применяют контроль из набора праймеров, с которым фрагмент в конститутивном гене разновидностей растения события может быть амплифицирован. Конститутивные гены - это гены, которые экспрессированы в большинстве типов клеток и которые имеют отношение к основным метаболическим активностям, общим для всех клеток. Предпочтительно фрагмент, амплифицированный из конститутивного гена, является фрагментом, который больше, чем амплифицированный интеграционный фрагмент. В зависимости от образцов, которые должны быть проанализированы, могут быть включены другие контроли.

Стандартные протоколы РСК описаны в научно-технической литературе, например в РСК ЛррНсаΐίοη Мапиа1 (Ροαίιο ΜοΙοοιιΕίΓ ВюсйешюаН, 2ηά Εάίίίοη, 1999) и других источниках. Оптимальные условия для РСК, включая ряд специфических праймеров, подробно оговорены в РСК ίάοηΙίΓΚαΙίοη ρτοίο^ί для каждого элитного события. Понятно, однако, что некоторые параметры протокола идентификации РСК могут нуждаться в приспособлении к конкретным лабораторным условиям и могут быть слегка модифицированы для достижения подобных результатов. Например, применение отличного метода получения ДНК может требовать, например, регулирования количества праймеров, полимеразы и применяемых условий гибридизации. Подобным образом, выбор других праймеров может диктовать другие оптимальные условия для протокола идентификации РСК. Такие регулирования, однако, должны быть очевидны для специалиста в этой области и, кроме того, они подробно раскрыты в современных руководствах по применению РСК, таких как указанное выше.

В качестве варианта, специфические праймеры могут быть использованы для амплификации интеграционного фрагмента, который может быть использован в качестве специфического зонда для идентификации ЕЕ-СН5 в биологических образцах. Контактирование нуклеиновой кислоты биологического образца с зондом в условиях, которые делают возможной гибридизацию зонда с соответствующим ему фрагментом в нуклеиновой кислоте, имеет результатом образование гибрида нуклеиновая кислота/зонд. Образование этого гибрида может быть выявлено (например, маркированием нуклеиновой кислоты или зонда), в результате, образование этого гибрида указывает на наличие ЕЕ-СН5. Такие методы идентификации на основе гибридизации со специфическим зондом (или на твердофазном носителе, или в растворе) описаны в технической литературе. Специфическим зондом предпочтительно является последовательность, которая в оптимизированных условиях подвергается специфической гибридизации с регионом в 5' или 3' фланкирующем регионе элитного события и предпочтительно также содержащем смежную с

- 8 025296 ним часть чужеродной ДНК (называемым здесь далее как специфический регион). Предпочтительно специфический зонд содержит последовательность из 50-500 п.о., более предпочтительно 100-350 п.о., которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 80-85%, более предпочтительно на 85-90%, особенно предпочтительно на 90-95%, наиболее предпочтительно на 95-100% идентична (или комплементарна) нуклеотидной последовательности специфического региона. Предпочтительно, специфический зонд должен содержать последовательность из около 15 до около 100 следующих друг за другом нуклеотидов, идентичную (или комплементарную) специфическому региону элитного события.

Олигонуклеотиды, подходящие в качестве праймеров РСК для выявления элитного события ЕЕОН5, могут быть также использованы для разработки основанного на РСК протокола для выявления статуса зиготности элитного события. С этой целью два праймера, распознающие локус дикого типа, созданы таким образом, что они направлены друг к другу и имеют инсерционный сайт, расположенный между праймерами. Эти праймеры могут быть праймерами, специфически распознающими 5' и 3' фланкирующие последовательности, заключенные в 8ЕО ГО Νο. 1 или 2, соответственно. Эти праймеры могут быть также праймерами, специфически распознающими 5' или 3' фланкирующую последовательность (такими как праймер, имеющий нуклеотидную последовательность 8ЕО ГО Νο. 7 или 8ЕО ГО Νο. 4-6), а также праймером, распознающим регион, удаленный во время инсерции ЕЕ-ОН5 в пред-инсерционную ДНК растения). Этот набор праймеров вместе с третьим праймером, комплементарным к последовательностям трансформирующей ДНК, (таким как праймер имеющий нуклеотидную последовательность 8ЕО ГО Νο. 3) дает возможность для диагностической РСК амплификации специфического локуса ЕЕ-ОН5, а также \\1 локуса. Если растение является гомозиготным для трансгенного локуса или соответствующего \\1 локуса, диагностическая РСК будет давать начало единственному продукту РСК типичному, предпочтительно типичному по длине, или для трансгенного, или для \\1 локуса. Если растение является гемизиготным для трансгенного локуса, будут появляться два локус-специфических продукта РСК, отражающих амплификацию как трансгенного, так и \\1 локуса.

Кроме того, методы детектирования, специфические для элитного события ЕЕ-ОН5, которые отличаются от методов амплификации на основе РСК, могут быть также разработаны с использованием представленной здесь информации о специфической последовательности элитного события. Такие альтернативные методы детектирования включают методы линейного сигнального амплификационного детектирования на основе инвазивного расщепления конкретных структур нуклеиновой кислоты, известные также как технология 1иуабет™ (которые описаны в патенте США 5985557 1иуа81уе С1еауаде οί Νυοίοίο Ααάδ, 6001567 Ие1ес1юп οί ΝιιοΚίο Λαίύ зесщепсез Ьу 1иуабет Опес1ей С1еауаде, приобщенных к сему ссылкой). С этой целью необходимая последовательность может быть гибридизована с меченым первым олигонуклеотидом нуклеиновой кислоты, содержащим нуклеотидную последовательность 8ЕО ГО Νο. 1 от нуклеотида 99 до нуклеотида 116 или ее комплемент, или с указанным меченым нуклеиновокислотным зондом, содержащим нуклеотидную последовательность 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 23 до нуклеотида 40 или ее комплемент, и дополнительно гибридизирована со вторым олигонуклеотидом нуклеиновой кислоты, содержащим нуклеотидную последовательность 8ЕО ГО Νο. 1 от нуклеотида 81 до нуклеотида 98 или ее комплемент, или с указанным меченым нуклеиновокислотным зондом, содержащим нуклеотидную последовательность 8ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 41 до нуклеотида 58 или ее комплемент, где первый и второй олигонуклеотиды перекрываются по меньшей мере одним нуклеотидом. Дуплексная или триплексная структура, которая образуется путем этой гибридизации, делает возможным селективное отщепление зонда ферментом (С1еауазе®), оставляющее целевую последовательность интактной. Отщепленный меченый зонд впоследствии выявляют, возможно, через промежуточную стадию, имеющую следствием дополнительную сигнальную амплификацию.

Используемый здесь набор относится к набору реагентов для целей осуществления метода по изобретению, более конкретно для идентификации элитного события ЕЕ-ОН5 в биологических образцах или определения статуса зиготности растительного материала, содержащего ЕЕ-ОН5. Более конкретно, предпочтительный вариант осуществления набора по изобретению содержит по меньшей мере один или два специфических праймера, которые описаны выше, для идентификации элитного события, или три специфических праймера для определения статуса зиготности. Необязательно, набор может дополнительно содержать какой-либо другой реагент, описанный здесь в протоколе идентификации РСК. Альтернативно, согласно другому варианту осуществления данного изобретения, набор может содержать специфический зонд, который описан выше, который вступает в специфическую гибридизацию с нуклеиновой кислотой биологических образцов, чтобы идентифицировать наличие в ней ЕЕ-ОН5. Необязательно, набор может дополнительно содержать какой-либо другой реагент (такой как, но без ограничения, гибридизирующий буфер, метка) для идентификации ЕЕ-ОН5 в биологических образцах с использованием специфического зонда.

Набор по изобретению может быть использован и его компоненты могут быть специфически приспособлены для целей контроля качества (например, чистоты партий семян), выявления наличия или отсутствия элитного события в растительном материале или материале, содержащем растительный материал или выделенном из него, таком как, но без ограничения, пищевые или кормовые продукты.

- 9 025296

Используемый здесь термин идентичность последовательности по отношению к нуклеотидным последовательностям (ДНК или РНК) относится к числу положений с идентичными нуклеотидами, деленному на число нуклеотидов, в более короткой из двух последовательностей. Выверку двух нуклеотидных последовательностей осуществляют по алгоритму Вильбура и Липманна (\УПЬиг аий Ыртаии, 1983, Ргос. ΝαΙ. Асай. §сг ИЗА 80:726), используя размер окна 20 нуклеотидов, длину слова 4 нуклеотида и гэп-пенальти 4. Компьютерный анализ и интерпретация данных последовательности, включая указанную выверку последовательности, могут быть, например, удобно осуществлены с применением программного обеспечения для анализа последовательности Оепейск Сотри1ег Огоир (ОСО, Ишуегейу о! ХХйсопмп Вю1есЬио1оду сеи!ег). Последовательности обозначают как по существу подобные, когда такие последовательности имеют идентичность последовательности по меньшей мере около 75%, конкретно по меньшей мере около 80%, более конкретно по меньшей мере около 85%, совершенно конкретно около 90%, особенно около 95%, более особенно около 100%. Ясно, что тогда, когда последовательности РНК названы, по существу, подобными или имеют конкретную степень идентичности последовательности с последовательностями ДНК, тимидин (Т) в последовательности ДНК считается равным урацилу (И) в последовательности РНК.

Используемый здесь термин праймер охватывает какую-либо нуклеиновую кислоту, которая способна инициировать синтез возникающей нуклеиновой кислоты в зависимом от матрицы процессе, таком как РСК. Обычно праймерами являются олигонуклеотиды из от 10 до 30 нуклеотидов, но могут быть использованы более длинные последовательности. Праймеры могут быть предоставлены в двухцепочечной форме, хотя одноцепочечная форма предпочтительна. Зонды могут быть использованы в качестве праймеров, но предназначены для того, чтобы связываться с целевой ДНК или РНК, и нет необходимости использовать их в процессе амплификации.

Используемый здесь термин распознающий по отношению к специфическим праймерам относится к тому факту, что специфические праймеры специфически гибридизуются с последовательностью нуклеиновой кислоты в элитном событии в условиях, изложенных в методике (таких как условия протокола идентификации РСК), посредством чего выявляют специфичность при наличии положительного и отрицательного контролей.

Используемый здесь термин гибридизующий по отношению к специфическим зондам относится к тому факту, что зонд связывается со специфическим регионом в последовательности нуклеиновой кислоты элитного события при условиях стандартной обоснованности. Используемый здесь термин условия стандартной обоснованности относится к условиям гибридизации, которые описаны ЗатЬгоок и др. в 1989 (Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1, Зесопй Еййюп. Со1й Зргшд НагЬог ЬаЬога1огу Рге88, ΝΥ), которые, например, могут содержать следующие стадии: 1) иммобилизацию фрагментов растительной геномной ДНК на фильтре, 2) предварительную гибридизацию на фильтре в течение 1-2 ч при 42°С в 50% формамиде, 5 х ЗЗРЕ, 2 х реагенте Денхарта и 0,1% 3Ό3 или в течение 1-2 ч при 68°С в 6 х ЗЗС, 2 х реагенте Денхарта и 0,1% 3Ό3, 3) добавление зонда гибридизации, который был помечен, 4) инкубирование в течение 16-24 ч, 5) промывание фильтра в течение 20 мин при комнатной температуре в 1 х ЗЗС, 0,1% 3Ό3, 6) промывание фильтра три раза в течение 20 мин каждый при 68°С в 0,2 х ЗЗС, 0,1% 3Ό3 и 7) экспозицию фильтра в течение 24-48 ч на рентгеновской пленке при -70°С с идентифицирующим экраном.

Используемые здесь биологические образцы - это образцы растения, растительного материала или продуктов, содержащих растительный материал. Термин растение предназначается для охвата тканей растения хлопчатника (Ооккуршт Ыгейит) на любой стадии зрелости, а также каких-либо клеток, тканей или органов, взятых или полученных от какого-либо такого растения, включая, но без ограничения, какие-либо семена, листья, стебли, цветы, корни, отдельные клетки, гаметы, клеточные культуры, тканевые культуры или протопласты. Используемый здесь термин растительный материал относится к материалу, который получают или выделяют из растения. Продукты, содержащие растительный материал, относятся к пищевым, кормовым или другим продуктам, которые получают, используя растительный материал, или которые могут иметь примесь растительного материала. Понятно, что в контексте данного изобретения такие биологические образцы испытывают на наличие нуклеиновых кислот специфических для ЕЕ-ОН5, предполагая наличие нуклеиновых кислот в образцах. Таким образом, упоминаемые здесь методы идентификации элитного события ЕЕ-ОН5 в биологических образцах относятся к идентификации в биологических образцах нуклеиновых кислот, которые содержат элитное событие.

Используемый здесь термин содержащий следует интерпретировать как точно определяющий наличие установленных характерных признаков, целостностей, стадий, реагентов или компонентов, как относящихся к, но не устраняющих наличие или добавление одного или нескольких характерных признаков, целостностей, стадий или компонентов, или их групп. Так, например, нуклеиновая кислота или белок, содержащие последовательность нуклеотидов или аминокислот, могут содержать больше нуклеотидов или аминокислот, чем фактически указанные, т.е. могут быть вставлены в более высокомолекулярную нуклеиновую кислоту или белок. Химерный ген, содержащий последовательность ДНК, которая функционально или структурно определена, может содержать дополнительные последовательности ДНК и т.д.

- 10 025296

Данное изобретение также относится к распространению элитного события ЕЕ-ОН5 в хлопчатнике в растениях, содержащих это событие, потомстве, полученном из указанных растений, и в клетках растения или растительном материале, производном от этого события. Растения, содержащие элитное событие ЕЕ-ОН5, получали, как описано в примере 1.

Растения хлопчатника или растительный материал, содержащие ЕЕ-ОН5, могут быть идентифицированы согласно протоколу идентификации РСК, описанному для ЕЕ-ОН5 в примере 2. Кратко, геномную ДНК хлопчатника, присутствующую в биологическом образце, амплифицируют путем РСК, используя праймер, который распознает последовательность в 5' или 3' фланкирующей последовательности ЕЕОН5, такой как праймер с последовательностью ЗЕО ΙΌ Νο. 6, и праймер, который распознает последовательность в чужеродной ДНК, такой как праймер с последовательностью ЗЕО ГО Νο. 3. ДНК праймеры, которые амплифицируют часть эндогенной хлопковой последовательности, используют в качестве положительного контроля для РСК амплификации. Если при РСК амплификации материал дает фрагмент ожидаемого размера, материал содержит растительный материал из растения хлопчатника, укрывающего элитное событие ЕЕ-ОН5.

Растения, укрывающие ЕЕ-ОН5, характеризуются своей стойкостью против насекомых, а также толерантностью к глуфозинату. Растения, укрывающие ЕЕ-ОН5, характеризуются также тем, что имеют агрономические характеристики, которые сравнимы с коммерчески доступными разновидностями хлопчатника в США в отсутствие прессинга насекомых. Обнаружено, что присутствие чужеродной ДНК в инсерционном регионе генома растения хлопчатника, описанного здесь, придает чрезвычайно интересные фенотипические и молекулярные характеристики растениям, содержащим указанное событие.

Следующие примеры описывают идентификацию элитного события ЕЕ-СН5 и разработку инструментов для специфической идентификации элитного события ЕЕ-СН5 в биологических образцах.

Если не обусловлено иное в примерах, все рекомбинантные технические мероприятия проводят согласно стандартным протоколам, как описано в ЗатЬгоок 1. апб Кикке1 ЭХУ (ебк) (2001) (Мо1еси1аг С1оп1пд: А ЬаЬога&гу Мапиа1, 3гб Ебйюп, Со1б Зрппд НагЬог ЬаЬога&гу Ргекк, №\у Уогк и в АикиЬе1 РА, Вгей К, Кшдйоп КЕ, Мооге ИИ, Зе1бтап 1С. ЗтйЬ 1А апб З1гиЫ К (ебк) (2006) Сиггей РгоЮсок т Мо1еси1аг Вю1оду. 1оЬп ХУПеу & Зопк, №ν Уогк.

Стандартные материалы и рекомендации описаны в Сгоу КИИ (еб.) (1993) Р1ай Мо1еси1аг Вю1оду ЬаЬРах, В10З Заепбйс РиЬЬкЬегк Ыб., ОхГогб апб В1аск\\с11 Заепййс РиЬЬсайопк, ОхГогб и в Вго\\п ТА, (1998) Мо1еси1аг Вю1оду ЬаЬРах, 2пб ЕбГОоп, Асабетю Ргекк, Зап И1едо. Стандартные материалы и методы для полимеразных цепных реакций (РСК) могут быть найдены в МсРЬегкоп М1 апб Ме11ег ЗС (2000) РСК (ТЬе Вакюк), В10З Заепййс РиЬЬкЬегк Ыб., ОхГогб и в РСК АррЬсайопк Мапиа1, 3^гб Ебйюп (2006), КосЬе И1адткЬск СтЬН, МаппЬеип ог \у\у\у.госЬе-аррЬеб-каепсе.сот.

В описании и примерах дана ссылка на следующие последовательности:

ЗЕО ГО №. 1 нуклеотидная последовательность, содержащая 5' фланкирующий регион ЕЕ-СН5,

ЗЕО ГО №. 2 нуклеотидная последовательность, содержащая 3' фланкирующий регион ЕЕ-СН5,

ЗЕО ГО №. 3 праймер СН1057,

ЗЕО ГО №. 4 праймер МАЕ115,

ЗЕО ГО №. 5 праймер НУН022,

ЗЕО ГО №. 6 праймер СН1065,

ЗЕО ГО №. 7 праймер НУН024,

ЗЕО ГО №. 8 праймер ЭРА312,

ЗЕО ГО №. 9 праймер СН1066,

ЗЕО ГО №. 10 праймер СН1047,

ЗЕО ГО №. 11 праймер СН1048,

ЗЕО ГО №. 12 нуклеотидная последовательность фрагмента, амплифицированного из ДНК хлопчатника, содержащего ЕЕ-СН5, с использованием СН1047 и СН1048,

ЗЕО ГО №. 13 праймер 1 для амплификации контрольного фрагмента,

ЗЕО ГО №. 14 праймер 2 для амплификации контрольного фрагмента,

ЗЕО ГО №. 15 нуклеотидная последовательность растительной геномной целевой последовательности перед инсерцией ЕЕ-СН5,

ЗЕО ГО №. 16 нуклеотидная последовательность, содержащая 5' фланкирующий регион ЕЕ-СН5 (длинная),

ЗЕО ГО №. 17 праймер НУН036,

ЗЕО ГО №. 18 праймер ЗНА028,

ЗЕО ГО №. 19 праймер МАЕ067.

Примеры

1. Идентификация элитного события ЕЕ-СН5

Стойкий против насекомых хлопчатник выведен путем трансформации хлопчатника вектором, содержащим кодирующую последовательность модифицированного гена сгу1аЬ под контролем промотора на основе остановленного в росте вируса З7 клевера подземного.

Элитное событие ЕЕ-СН5 выбирали на основе всесторонней селекционной процедуры на основе

- 11 025296 хорошей экспрессии и стабильности гена стойкости против насекомых и оценивали его совместимость с оптимальными агрономическими характеристиками, такими как высота растения, высота к утолщению, удерживание коробочки, травостой, мощность, длина волокна, прочность волокна и урожай волокна.

Выбранное событие вставляли в различные коммерческие генетические среды и сравнивали результаты полевых испытаний в различных местностях. Растения проверяли на сопротивляемость насекомым вредителям, используя различные обработки. Растения хорошо противостояли насекомым.

Кроме того, событие имело нормальную морфологию листьев, цветков и коробочек, превосходную плодовитость и показало невосприимчивость к болезни и отсутствие отклоняющейся от нормы уязвимости со стороны насекомых в многочисленных генетических средах. Во время интрогрессии во многие генетические среды никаких проблем отклонения от нормы или аномальностей не наблюдалось.

2. Идентификация фланкирующих регионов элитного события ЕЕ-6Н5

Последовательность регионов, фланкирующих чужеродную ДНК в элитном событии ЕЕ-ОН5 определяли, используя термический асимметричный чересстрочный (ТА1Ь-)РСК метод, описанный Ьш и др. (1995, Р1аШ 1. 8(3):457-463), где возможно. Этот метод использует три вставленных праймера в последовательных реакциях вместе с более коротким произвольно деградированным праймером, так что относительные эффективности амплификации специфических и неспецифических продуктов могут быть термически контролируемыми. Специфические праймеры выбирали для гибридизации с обрамлением чужеродной ДНК и на основе условий их гибридизации. Небольшое количество (5 мкл) неочищенных вторичных и третичных продуктов РСК анализировали на 1% агарозном геле. Третичный продукт РСК очищали и секвенировали.

2.1. Правый (5') фланкирующий регион

Фрагмент, идентифицированный как содержащий 5' фланкирующий регион, был секвенирован (8ЕЦ ГО Νο. 1). Последовательность между нуклеотидами 1 и 98 соответствует ДНК растения, тогда как последовательность между нуклеотидами 99 и 334 соответствует чужеродной ДНК. Более длинный фрагмент, содержащий 5' фланкирующий регион, также был секвенирован (8ЕЦ ГО Νο. 16). Последовательность между нуклеотидами 1 и 563 соответствует ДНК растения, тогда как последовательность между нуклеотидами 5 64 и 7 99 соответствует чужеродной ДНК.

2.2. Левый (3') фланкирующий регион

Фрагмент, идентифицированный как содержащий 3' фланкирующий регион, полученный по методу ТЛГО-РСК, был секвенирован (8ЕЦ ГО Νο. 2). Последовательность между нуклеотидами 1 и 40 соответствует чужеродной ДНК, тогда как последовательность между нуклеотидами 41 и 452 соответствует ДНК растения.

2.3. Регион, содержащий специфическую перегруппировку ЕЕ-ОН5 в чужеродной ДНК

Нуклеотидная последовательность региона, содержащего специфическую перегруппировку ЕЕОН5 в чужеродной ДНК была идентифицирована (8ЕЦ ГО Νο. 12). Регион между нуклеотидными положениями 52 и 88 был идентифицирован как перегруппированный по сравнению с чужеродной ДНК, использованной для получения трансформантов, из которых было выбрано элитное событие ЕЕ-ОН5.

3. Разработка протоколов полимеразной цепной реакции для идентификации ЕЕ-ОН5

3.1. Праймеры

Были разработаны специфические праймеры, которые распознают последовательности в элитном событии. Более конкретно, разработаны два праймера, которые распознают последовательности, фланкирующие специфическую перегруппировку ЕЕ-ОН5 в чужеродной ДНК. Праймеры охватывают последовательность из около 262 п.о. Следующие праймеры, как было найдено, дают особенно четкие и воспроизводимые результаты в реакции РСК на ДНК ЕЕ-ОН5:

ОН1047: 5'-Т§С.СТС.ТТ§.ЛЛС.Т§Т.Л§С-3' (§ЕЦ ГО Νο. 10)

ОН1048: 5'-АСТ.ТуС. АуТ.ТуС.ТуА.ТуА.Ту-3' (3ΙΤ) ГО Νο. 11)

В качестве варианта был разработан праймер, который распознает последовательность в 5' фланкирующем регионе ЕЕ-ОН5. Второй праймер был затем выбран в последовательности чужеродной ДНК, так что праймеры охватывают последовательность из около 369 нуклеотидов. Следующие праймеры, как было выявлено, дают особенно четкие и воспроизводимые результаты в реакции РСК на ДНК ЕЕ-ОН5:

ОН1065: 5'-ддд.ССд.дАТ.ААА.АТТ.АдС.СТ-3' (§ЕЦ ГО Νο. 6) (мишень: ДНК растения)

ОН1057: 5'-АТА.дСд.СдС.ААА.СТА.ддА-3' (§ЕЦ ГО Νο. 3) (мишень: инсерционная ДНК)

Праймеры, нацеленные на эндогенную последовательность, предпочтительно включают в коктейль РСК. Эти праймеры служат в качестве внутреннего контроля в неизвестных образцах и в ДНК положительном контроле. Положительный результат с парой эндогенных праймеров демонстрирует, что имеется достаточная ДНК адекватного качества в препарате геномной ДНК для продукта РСК, который должен быть создан. Эндогенные праймеры выбраны, чтобы распознавать конститутивный ген в хлопке:

ОН1001: 5'-ЛЛС.СТА.§§С.Т§С.Т§Л.Л§§.Л§С-3' (§ЕЦ ГО Νο. 13)

ОН1002: 5'-СЛЛ.СТС.СТС.САд.ТСА.ТСТ.ССд-3' (§ЕЦ ГО Νο. 14)

- 12 025296

3.2. Амплифицированные фрагменты

Вероятными амплифицированными фрагментами в реакции РСК являются:

Для пары праймеров СН1001-ОН1002: 445 п.о. (эндогенный контроль).

Для пары праймеров 0ΗΙ047-0ΗΙ048: 262 п.о. (элитное событие ЕЕ-СН5).

Для пары праймеров 0ΗΙ057-0ΗΙ065: 369 п.о. (элитное событие ЕЕ-СН5).

3.3. Матричная ДНК

Матричную ДНК получали из листьев согласно Еб\уагб5 и др. (ШсЮс Ашб РекеатсЬ, 19, р.1349, 1991). Когда использовали ДНК, полученную другими методами, следовало сделать испытательный прогон с использованием различных количеств матрицы. Обычно 50 нг геномной матричной ДНК дают наилучшие результаты.

3.4. Заданные положительный и отрицательный контроли

Чтобы избежать неправильных позитивов или негативов, было оговорено, что следующие положительные и отрицательные контроли должны быть включены в прогон РСР:

контроль МаЧег Μίχ (ДНК отрицательный контроль). То есть РСР, в которой никакой ДНК не добавляют к реакции. Когда наблюдается ожидаемый результат, а именно отсутствие продуктов РСР, это указывает не то, что коктейль РСР не был загрязнен целевой ДНК.

ДНК положительный контроль (образец геномной ДНК, о котором известно, что он содержит трансгенные последовательности). Успешная амплификация этого положительного контроля демонстрирует, что РСР происходила в условиях, обеспечивающих возможность амплификации целевых последовательностей.

Контроль ДНК дикого типа. То есть РСР, в которой представленная матричная ДНК является геномной ДНК, полученной из нетрансгенного растения. Когда наблюдается ожидаемый результат, а именно никакой амплификации трансгенного продукта РСР, но амплификация эндогенного продукта РСР, это показывает, что нет поддающейся обнаружению трансгенной фоновой амплификации в образце геномной ДНК.

3.5. Условия РСР

Оптимальные результаты получали при следующих условиях: смесь РСР для 25 мкл реакций содержит

2,5 мкл матричной ДНК,

2,5 мкл 10х амплификационного буфера (поставляемого производителем с Тас| полимеразой),

0,5 мкл 10 мМ άΝΤΡ'δ,

0,4 мкл ОН1001 (10 пмоль/мкл),

0,4 мкл ОН1002 (10 пмоль/мкл),

0,7 мкл ОН1047 (10 пмоль/мкл) или ОН1057 (РСР протокол 2),

0,7 мкл ОН1048 (10 пмоль/мкл) или ОН1065 (РСР протокол 2),

0,1 мкл Тас| ДНК полимеразы (5 единиц/мкл), воду до 25 мкл, профиль термоциклирования для достижения оптимальных результатов является следующим:

мин при 95°С с последующим 1 мин при 95°С мин при 57°С мин при 72°С для 5 циклов с последующим с при 92°С с при 57°С 1 мин при 72°С для 25 циклов с последующим 10 мин при 72°С

3.6. Анализ на агарозном геле

Для оптимальной визуализации результатов РСР, как было установлено, между 10 и 20 мкл образцы для РСР должны быть нанесены на 1,5% агарозный гель (Трис-боратный буфер) с соответствующим молекулярномассовым маркером (например, шаг 100 п.о. РНАРМАС1А).

3.7. Достоверность результатов

Установлено, что данные от образцов трансгенной растительной ДНК в единственном прогоне РСР и единственном коктейле РСР не могут быть приемлемыми, если не соблюдены следующие условия:

1) ДНК положительный контроль показывает ожидаемые продукты РСР (трансгенные и эндогенные фрагменты),

2) ДНК отрицательный контроль является отрицательным для РСР амплификации (нет фрагментов) и

3) контроль ДНК дикого типа показывает ожидаемый результат (амплификация эндогенного фрагмента).

- 13 025296

Когда придерживаются протокола идентификации РСК для ЕЕ-СН5, как описано выше, дорожки, показывающие видимые количества трансгенных и эндогенных продуктов РСК ожидаемых размеров, указывают на то, что соответствующее растение, из которого была получена геномная матричная ДНК, унаследовало элитное событие ЕЕ-СН5. Дорожки, не показывающие видимых количеств тех или иных трансгенных продуктов РСК и показывающие видимые количества эндогенного продукта РСК, указывают на то, что соответствующее растение, из которого была получена геномная матричная ДНК, не содержит элитного события. Дорожки, не показывающие видимых количеств эндогенных и трансгенных продуктов РСК, указывают на то, что качество и/или количество геномной ДНК не дает возможности образования продукта РСК. Такие растения не следует учитывать. Приготовление геномной ДНК следует повторить и провести новый прогон РСК с соответствующими контролями.

3.8. Применение дискриминационного РСК протокола для идентификации ЕЕ-СН5

Прежде чем пытаться сортировать неизвестное, должен быть проведен опытный прогон со всеми соответствующими контролями. Разработанный протокол может требовать оптимизации по компонентам, которые могут различаться в разных лабораториях (препарат матричной ДНК, Тад ДНК полимераза, качество праймеров, бЫТК'к, устройство для термоциклирования и т.д.).

Амплификация эндогенной последовательности играет ключевую роль в протоколе. Необходимо добиться условий РСК и термоциклирования, при которых происходит амплификация эквимолярных количеств как эндогенной, так и трансгенной последовательности на известной трансгенной геномной ДНК матрице. Когда же целевой эндогенный фрагмент не амплифицируется или когда целевые последовательности не амплифицируются с теми же интенсивностями окрашивания бромидом этидия, как полагается для электрофореза на агарозном геле, может потребоваться оптимизация условий РСК.

Листовой материал из нескольких растений хлопчатника, некоторые из которых содержали ЕЕСН5, испытывали согласно указанному протоколу. Образцы из элитного события ЕЕ-СН5 и из хлопчатника дикого типа отбирали в качестве положительных и отрицательных контролей, соответственно.

Фиг. 2 иллюстрирует результат, полученный с протоколом 1 РСК идентификации элитного события для ЕЕ-СН5 на нескольких образцах хлопчатника. Образцы на дорожках 2-3, как было обнаружено, содержат элитное событие, которое выявлено полосой 305 п.о., тогда как образцы на дорожках 4 и 10 не содержат ЕЕ-СН5. Дорожки 4 и 10 содержат другие элитные события хлопчатника (включая растения, содержащие различные химерные гены толерантности к насекомым); дорожка 11 представляет отрицательный контрольный образец (вода), и дорожки 1 и 12 представляют молекулярномассовый маркер (шаг 100 п.о.).

4. Применение специфического интеграционного фрагмента в качестве зонда для выявления материала, содержащего ЕЕ-СН5

Специфический интеграционный фрагмент ЕЕ-СН5 получают РСК амплификацией с использованием специфических праймеров СН1047 (8ЕС ГО Νο. 10) и СН1048 (8ЕС ГО Νο. 11) или химическим синтезом и наносят метку. Этот интеграционный фрагмент используют в качестве специфического зонда для выявления ЕЕ-СН5 в биологических образцах. Нуклеиновую кислоту извлекают из образцов согласно стандартным процедурам. Эту нуклеиновую кислоту затем приводят в контакт со специфическим зондом в условиях гибридизации, которые оптимизируют, чтобы обеспечить возможность образования гибрида. Образование гибрида затем выявляют, чтобы показать присутствие нуклеиновой кислоты ЕЕ-СН5 в образце. Необязательно, нуклеиновую кислоту в образцах амплифицируют, используя специфические праймеры, перед контактом со специфическим зондом. В качестве варианта нуклеиновую кислоту метят перед контактом со специфическим зондом вместо интеграционнного фрагмента. Необязательно, специфический зонд прикрепляют к твердому носителю (такому как, но без ограничения, фильтр, полоска или шарики) перед контактом с образцами.

5. Протокол на основе РСК определения статуса зиготности ЕЕ-СН5 материала хлопчатника

5.1. Праймеры

Два праймера, распознающие нуклеотидные последовательности локуса дикого типа перед инсерцией элитного события, были созданы таким образом, что они направлены друг к другу и имеют в промежутке инсерционный сайт. Такой набор праймеров вместе с третьим праймером, комплементарным последовательностям чужеродной ДНК и направленным на фланкирующую ДНК, предоставляет возможность одновременной РСК амплификации локуса ЕЕ-СН5, а также \\1 локуса.

Следующие праймеры, как было найдено, дают особенно четкие и воспроизводимые результаты в РСК реакции для определения зиготности на ДНК события ЕЕ-СН5:

СН1066: 5'-А§А.ТАА.ААТ.СдТ.САд.Т§С.Т§-3' (81Т) ГО Νο. 9) (мишень: растительная ДНК выше 5' фланкирующей последовательности),

СН1057: 5'-АТА.дСд.СдС.ААА.СТА.ддА-3' (81Т) ГО Νο. 3) (мишень: инсерционная ДНК),

СН1065: 5'-ддд.ССд.дАТ.ААА.АТТ.АдС.СТ-3' (81Т) ГО Νο. 6) (мишень: растительная ДНК 3' фланкирующей последовательности).

5.2. Амплифицированные фрагменты

Вероятными амплифицированными фрагментами в реакции РСК являются

- 14 025296 для пары праймеров 0ΗΙ065-0ΗΙ066: 517 п.о. (локус дикого типа), для пары праймеров 0ΗΙ057-0ΗΙ065: 369 п.о. (локус ΕΕ-ΟΗ5).

5.3. Матричная ДНК

Матричную ДНК получали из листьев согласно Ей\\нгйв и др. (Νιιοίοίο Ас1Й КекеагсЬ, 19, р.1349, 1991). Когда использовали ДНК, полученную другими методами, следовало сделать испытательный прогон с использованием различных количеств матрицы. Обычно 50 нг геномной матричной ДНК дают наилучшие результаты.

5.4. Заданные положительный и отрицательный контроли

Чтобы избежать неправильных позитивов или негативов, было оговорено, что следующие положительные и отрицательные контроли должны быть включены в прогон РСК:

контроль Мав1ег Μίχ (ДНК отрицательный контроль). То есть РСК, в которой никакой ДНК не добавляют к реакции. Когда наблюдается ожидаемый результат, а именно отсутствие продуктов РСК, это указывает на то, что коктейль РСК не был загрязнен целевой ДНК.

ДНК положительный контроль (образец геномной ДНК, о котором известно, что он содержит трансгенные последовательности). Успешная амплификация этого положительного контроля демонстрирует, что РСК происходила в условиях, обеспечивающих возможность амплификации целевых последовательностей.

Контроль ДНК дикого типа. То есть РСК, в которой представленная матричная ДНК является геномной ДНК, полученной из нетрансгенного растения. Когда наблюдается ожидаемый результат, а именно никакой амплификации трансгенного продукта РСК, но амплификация эндогенного продукта РСК, это показывает, что нет поддающейся обнаружению трансгенной фоновой амплификации в образце геномной ДНК.

5.5. Условия РСК

Оптимальные результаты получали при следующих условиях: смесь РСК для 25 мкл реакций содержит: х мкл матричной ДНК (150 нг),

2.5 мкл 10х амплификационного буфера (поставляемого производителем с Тад полимеразой),

0,5 мкл 10 мМ ЙЭТК'5,

1.5 мкл ΟΗΙ053 (10 пмоль/мкл),

1,0 мкл ΟΗΙ054 (10 пмоль/мкл),

0,5 мкл ΟΗΙ041 (10 пмоль/мкл),

0,1 мкл Тад ДНК полимеразы (5 единиц/мкл), воду до 25 мкл, профиль термоциклирования для достижения оптимальных результатов является следующим:

мин при 95°С с последующим:

мин при 95°С мин при 57°С мин при 72°С для 5 циклов с последующим:

с при 92°С с при 57°С 1 мин при 72°С для 25 циклов с последующим: 10 мин при 72°С

5.6. Анализ на агарозном геле

Для оптимальной визуализации результатов РСК, как было установлено, между 10 и 20 мкл образцы для РСК должны быть нанесены на 1,5% агарозный гель (Трис-боратный буфер) с соответствующим молекулярномассовым маркером (например, шаг 100 п.о. РΗΑКΜΑСIΑ).

5.7. Достоверность результатов

Данные от образцов трансгенной растительной ДНК в единственном прогоне РСК и единственном коктейле РСК Мав1ег Μίχ не могут быть приемлемыми, если не соблюдены следующие условия:

положительный контроль показывает ожидаемые продукты РСК (трансгенная целевая амплификация), положительный контроль ДНК дикого типа показывает ожидаемый результат (целевая амплификация дикого типа), отрицательный контроль является отрицательным для РСК амплификации (нет фрагментов).

Дорожки, показывающие видимые количества трансгенного продукта РСК ожидаемого размера и не показывающие видимых количеств продукта РСК дикого типа, указывают на то, что соответствующее растение, из которого была получена геномная ДНК матрица, является гомозиготным для трансгенной генной кассеты.

Дорожки, показывающие видимые количества трансгенного и дикого типа продуктов ожидаемых размеров указывают на то, что соответствующее растение, из которого была получена геномная матричная ДНК, является гемизиготным для трансгенной генной кассеты. Дорожки, не показывающие видимых

- 15 025296 количеств трансгенного продукта РСК и показывающие видимые количества продукта РСК дикого типа, указывают на то, что соответствующее растение, из которого была получена геномная матричная ДНК, не приобрело трансгенной испытуемой последовательности и, следовательно, является гомозиготным для локуса дикого типа.

Дорожки, не показывающие видимых количеств трансгенных и дикого типа продуктов РСК, указывают на то, что качество и/или количество геномной ДНК не дает возможности образования продукта РСК. Такие растения не следует учитывать. Приготовление геномной ДНК следует повторить и провести новый прогон РСК с соответствующими контролями.

5.8. Применение протокола определения зиготности для идентификации статуса зиготности в содержащих ЕЕ-СН5 растениях

Фиг. 3 иллюстрирует результат, полученный с РСК, определяющей зиготность, для ЕЕ-ОН5 на нескольких образцах хлопчатника. Образцы на дорожках 2-3 и 6-7, как было обнаружено, содержат фрагмент РСК (369 п.о.), характерный для элитного события ЕЕ-ОН5, тогда как образцы на дорожках 2, 3 и 5 содержат фрагмент, характерный для наличия \\1 локуса. Дорожки 6 и 7, следовательно, содержат ЕЕОН5 в гемизиготной форме, дорожки 2 и 3 содержат ЕЕ-ОН5 в гемизиготной форме и дорожка 5 содержит \\1 локус в гомозиготной форме (азиготной для ЕЕ-ОН5). Дорожка 8 представляет отрицательный контрольный образец (вода) и дорожки 1 и 9 представляют молекулярномассовый маркер (шаг 100 п.о.).

6. Интрогрессия ЕЕ-ОН5 в предпочтительные культурные сорта растений

Элитное событие ЕЕ-ОН5 интродуцируют путем повторения обратного скрещивания в коммерческие культурные сорта хлопчатника, такие как, но без ограничения, РМ5013, РМ5015, РМ5017, РМ989, РМ832, РМ966 и РМ958, РМ989, РМ958, РМ832, ЕМ991, РМ819, РМ800, РМ960, РМ966, РМ981, РМ5035, РМ5044, РМ5045, РМ5013, РМ5015, РМ5017 или РМ5024.

Обнаружено, что интрогрессия элитного события в эти культурные сорта не оказывает заметного влияния на какие-либо желательные или агрономические характеристики указанных культурных сортов (никакой связанной с этим помехи), хотя экспрессия трансгена, как определено по толерантности к глуфозинату, отвечает коммерчески приемлемым уровням. Это подтверждает статус события ЕЕ-ОН5 как элитного события.

С целью регулирования стойкости против насекомых элитное событие может быть с выгодой объединено с другими элитными событиями доступными на рынке, в частности с элитным событием с участием другого гена стойкости против насекомых, таким как, но без ограничения, событие 3006-210-23 (υδΌΆ арйк ροϊίΐίοη 03-36-02р); событие 281-24-236 (υδΌΆ арЫк ροϊίΐίοη 03-036-01р); событие МОЫ158985 (υδΌΆ арйк ροϊίΐίοη 00-342-01р); событие МОЫ531 (υδΌΆ арЫк ροϊίΐίοη 94-308-01р) или событие СОТ102 (=δνη§οηΙ;·ι у1р3Л) υδΌΆ арЫк реШюп 03-155-01р. Элитное событие ЕЕ-ОН5 может быть также объединено с гербициднотолерантными элитными событиями, такими как событие МОЫ1445 (υδΌΆ арЫк ρеι^ι^οη 95-045-01р) или событие МОЫ88913 (υδΌΆ арЫк реШюп 04-086-01р).

Используемый в формуле изобретения ниже термин растение, если не обусловлено иное, предназначается для охвата растительных тканей на любой стадии зрелости, а также клеток, тканей или органов, взятых или произведенных от какого-либо такого растения, включая, но без ограничения, какиелибо семена, листья, стебли, цветки, корни, отдельные клетки, гаметы, клеточные культуры, тканевые культуры или протопласты.

Эталонные семена, содержащие элитное событие ЕЕ-ОН5 депонированы как ЕЕ-ОН5 в АТСС (10801 υηί\ΌΓκίΙν Βίνά., Мапаккак, УА 20110-2209) 22 января 2007 под инвентарным номером РТА-8171. Альтернативное наименование для ЕЕ-ОН5 - Т304-40.

Используемый в формуле изобретения ниже термин растение, если не обусловлено иное, предназначается для охвата растительных тканей на любой стадии зрелости, а также клеток, тканей или органов, взятых или произведенных от какого-либо такого растения, включая, но без ограничения, какиелибо семена, листья, стебли, цветки, корни, отдельные клетки, гаметы, клеточные культуры, тканевые культуры или протопласты.

Приведенное выше описание изобретения предназначено быть иллюстративным, но не ограничительным.

Различные изменения или модификации описанных вариантов осуществления могут приходить на ум специалистам в этой области. Они могут быть осуществлены, не выходя за пределы сущности и объема изобретения.

- 16 025296

Список последовательностей <]10> Вауег В1оЗс1епсе Ν.ν.

ТгоИпЦег, Ьтс1а Моепг, Ξοίίβ РаеЫпск, ΟιπύϊΓί НаЬех, Уеег1е Уап Негск, Напз <120> Стойкие против насекомых растения хлопчатника и способы их идентификации <130> БС306-2011 <150> ЕР07075263.9 <151> 2007-04-05 <150> ЕР07075299.3 <151> 2007-04-23 <150> 0550/923142 <151> 2007-04-12 <160> 19 <170> РаЬепЫп чегзьоп 3,3 <210> 1 <211> 334 <212> ДНК <213> искусственная <220>

<223> Нуклеотидная последовательность, содержащая 5’ фланкирующую последовательность ЕЕ-СН5 <220>

<221> пи;-:_/=а:иге <222> (1>..(98) <223> растительная ДНК <220>

- 17 025296 <221> т15С_СеаХ.иге <222> (99)..(334) <223> инсериионная ДНК

<400> 1 сЬЪ^Ьайсас.	аЪаадИдссЪ	а^а(:ааа&аа	ад£Ъ£ад£.са	д£сааа1: Сад	ададаШдСс	60
аЫдИаддда	д£ СЛдЪссаа	ЪЬа^ЪддИдГ:	С^ЬЬааСссс	адСасъсддс	сдЬсдассдс	120
дд1ассссдд	ааСРдаааас	ада£11дадд	СЪСсааадЪд	дЕд!; СдСддс	Гасад^Ссаа	100
даддсабРаа	аадсГда£££	ддссдда£с£	СϋСдаадсЪЬ	Исааасасаа	ддааа£са£с	240
са£саасс£с	саарсдаз^д	дсЪегЛЪдсЪ	ЬддсасааЬа	а££сссс£ас	ЬЪИсдасЪРд	300
аддасаад£с	даСИПссдд	дссддаЬдЬа	СЪда			334
<2Ю> 2 <211> 452 <212> ДНК <213> искусственная

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность, содержащая 3’ фланкирующую последовательность ЕЕ-СН5 <220>

<221> ιηίδο £еаЪиге <222> {1),,140) <223> инсерционная ДНК <220>

<221 > тп15С_ГеаЕиге <222> 141)..[452) <223> растительная ДНК <400> 2 аС-адсдсдса аасЬадда1:а ааЪТаЬсдсд сдсдд£д£са Ьсба£с1;ссб 60 аадЬСа^ссс аада^с^адд дд£а£Ъ££дс а£саг£аада даааасСЕИд ъхлааъсада 120

- 18 025296

сриссаарса	ссадРсЬРад	дсасааддда	аддс£да£.дс	сдаЪаасаСС.	дссдаасааа	180
ссабсааддс	аасСададаР	дссСЪдаЪдс	аааададсьс	СССГШадас	ссЪсаааЪдс	240
саадсадЁдд	аУадааадаа	дсСсааЪдЪЪ	аад£дсааас	ааааЬСсдаа	аддсЪаааад	300
1. ί 1. аТ-сдада	ЫсдааРсЕс	£ааа£саа£д	ЪсаСЪаасаа	с£а£а£ааса	ддсСааСНЬ^	360
а1ссддссса	аСаааСаааа	сааааСаааа	асаанаааСс	ааддЬсааЫ	Сасааааъад	420
аЕЬддсссаа	асаааааада	дсссааЪаас	СС			452
<210> 3 <211> 18 <212> ДНК <213> искусственная

<220>

<223> Олигонуклеотндный праймер ΞΗΙ057 <400> 3 а£адсдсдса аасСадда 18 <210> 4 <211> 20 <212> ДНК <213> искусственная <220>

<223> Олчгонуклеотидньгй праймер МАЕ115 <400> 4

СсддсааСд^. СаЪсддсаЬс 20

<210>	5
<211>	19
<212>	ДНК
<213>	искусственная

<220>

- 19 025296

<22 3>	Олигонуклеотидный	праймер	НУН022
<400>	5
ссас^дсСГд дсаЬСГдад
<210>	6
<211>	20
<212>	ДНК
<213>	искусственная
<220>
<223>	Олигонуклеотидный	праймер	СН1065

<400> б дддссддаЬа аааФСадссб 20 <210> 7 <211> 20 <212> ДНК <213> искусственная <220>

<22 3> Олигонуклеотидный праймер НУН024 <400> 7 дСсаЬРдРад ддадЫЪдСс 20 <210> е <211> 18 <212> ДНК <213> искусственная <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер 0ΕΑ312 <400> 6 гдссЬссбда ассдбадс 18 <210> 9

- 20 025296 <211> 20 <212> ДНК <213> искусственная <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер СН1066 <400> 9 адаНааааЪс дИсад^дсЪд 20

<210> 11 <21ί> 20 <212> ДНК <213> искусственная <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер СН1048 <400> 11 асЬСдсадСЬ дсСдаСдагд 20

<210>	12
<211>	262
<212>	ДНК
<213>	искусственная

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность фрагмента, амплифицированного от

ДНК хлопчатника, содержащей ЕЕ-СН5, с использованием СН1047 и СНЮ48

- 21 025296 <220>

<221>

лиде Теабиге <222>

<223>

(1)..(51)

Последовательность, выделенная из 3' ше1 <220>

<221> га1зс_£еаЬиге <222> (36)..(88) <223> Последовательность, выделенная из правого края Т-ДНК <220>

<221> т1зс__£еаЬсге <222> (89)..(262) <223> Последовательность, выделенная из 3' те!

<400> 12 £дсс£с££да ас£д£адсса саасассасЬ ££дааасс£с ааа£с£д£££. £саа£Ьссдд 60 дд£ассдсдд Ьсдасддссд ад£асКддсс аааЫбадбЬ ЬЫддаЬааа дЬассадаИ 120

СадддсааСа ааасГаГааа сддссадс£Е ££адс£аса£ асааСдадса осссДдаГаа 180 асааадаасс саассддОаб ££д£аад£да абааасаааа дЬадСаССаа дс£££аад££ 240 юсабсаОса дсаасбдсаа дс 262 <210> 13 <211 > 21 <212> ДНК <213> искусственная <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер СН1001 <400>

аассСаддсГ дс£дааддад с <210> 14

- 22 025296 <211> 21 <212> ДНК <213> искусственная <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ΞΗΙ002 <4 00> 14 саасбссСсс адРсаСсбсс д 21 <210> 15 <211> 558 <212> ДНК <213> искусственная <220>

<223> Нуклеотидная последовательность растительной геномной целевой последовательности перед инсерцией ЕЕ-СН5 <220>

<221> тгас_£еа(:иге <222> (1)..1113) <223> Последовательность, соответствующая 5' фланкирующей последовательности <220>

<221> ш15с_£еаСиге <222> (114)..(145) <223> Прединсерционная деления в слитном событии ЕЕ-СН5 <220>

<221> птзсссаЬиге <222> (146)..(558) <223> Последовательность, соответствующая 3’ фланкирующей последовательности <220>

<221> тгчгсЕеагиге <222> (457)..(475) <223> Последовательность, соответствующая комплементу олигонуклеотида СН1065

- 23 025296 <400> 15

сасъ	ί: с С Пас	а1саЪагаад	Хдсс1а£а£а	аа^ааадъъс	ад£сад£саа	60
аСЬададада	ьедисаиде	адддад££1:д	£ссаа£	ддидтига	а^сасаадСС	120
дццьааддаЪ	ЪссааассаС	аса££аСс£а		сС11_ксаадЪ	СаЬсссаада	180
1с£аддддСа	СЛССдсаЪса	СТаададааа	асСССдИШга	аСЪадас^Ис	сааЬсассад	24 0
ИсИЦаддСаИ	аадддааддс	ИдаТдссдаИ	аасаИдссд	аасааассаЬ	сааддсаасЪ	300
ададаЪдссЪ	1;да£дсаааа	дадс£с£1ЛЬ	ΐΐ-адасссЪс	ааакдссаад	сад^ддаЪад	360
ааадаадс^с	ааИдС^аадИ	дсааасаааа	ССсдаааддс	ЬаааадСЪЬа	ИсдадаЬИсд	420
ааГс1:сЪааа	СсааЪдСсаЦ	ЪаасаасЬаЬ	аТаасаддс!;	ааииа1сс	ддсссааЪаа	480
аЬааэасааа	аЬааааа^аа	ίаааЬсаадд	£саа££Ъаса	ааа1ада1:Ьд	дсссааасаа	540

аааададссс аа^аассс 558 <210> 16 <211> 799 <212> ДНК <213> искусственная <220>

<223> Нуклеотидная последовательность, содержащая 5’ фланкирующую последовательность ЕЕ-СН5 (длинная) <220>

<221> пи 5с_±еаСиге <222> (1)..(563) <223> растительная ДНК <220>

<221> т15С_£еа1:иге <222> (564)..(799) <223> инсерционная ДНК

- 24 025296

<400> 16 аасаааСаад	ссааССссаа	адададдаСа	дсСдаСсССС	СсасСааСса	СаасССдааТ:	60
ГСГСССадСд	дСдсССаЪсС	дСНсаддСд	ССаддадсас	ааСсаСасса	ССсссСдсаС	120
ааССС^сада	сСсСаддаСд	ааЪссИИс	даададдадд	СдааЬдаСас	даасСсадаа	180
адддСаааЫ:	саС СЬдадСС	саадПСдда	асасСдасса	ассСдсааСд	ааПСПддд	240
ГГаааССаГГ	ССсССГаСдд	аСсаСдаааС	даСаСаПаС	ССааааСССС	аадасдспа	300
сссассеасс	нааССаСадС	ИдаИаСаС	асагндсаа	ааИдааСаС	ссагссддсс	360
ссаааадССа	СГааСССсСС	дИГаНсаС	СаааСааадС.	СсааИаСад	аСааааСсдС	420
садСдсСдаа	СССБасаСЛа	ССССаССада	адСССаСаСС	СсссасБССБ	аСсасаСаад	480
СдссСаСаСа	аасааадссс	адСсадСсаа	аНададада	НдСсаНдС	адддадПСд	540
СссааССаСС	ддСдСССССа	аСсссэдСас	ссддссдСсд	ассдсддСас	сссддаасСд	600
аааасада&И	СдаддСисса	аадСддСдИ	дСддссасад	Исаададдс	ассаааадсс	660
даС СЛддссд	даСсСС Ида	адсСССсааа	сасааддааа	СсаСссаСса	ассСссааСс	720
дааСддсССС	Идее Сддса	сааСааССсс	сдСасСПсд	асндаддас	аадСсдаесс	780
Сссдддссдд	аСдСаНда					799

<210> 17 <211> 20 <212> ДНК <213> искусственная

<220> <223> Олигонуклеотидный праймер НУН036 <400> 17 саддСдссад дадсасааСс	20
<210> 18

- 25 025296 <211> 24 <212> ДНК <213> искусственная <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер 5НА028 <400> 18 сасаасасса с£ггдааасс ссаа 24 <210> 19 <211> 19 <212> ДНК <213> искусственная <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер МАЕ067 <400> 19 ссаРРсда£1; ддаддррда 19

Claims (21)

1. Устойчивое против насекомых трансгенное растение хлопчатника или его клетки, ткани или семена, содержащие в своем геноме чужеродную ДНК, включающую последовательность модифицированного гена сгу1аЬ, кодирующего инсектицидный кристаллический белок ВасШик ШигтщегМк под контролем §7 промотора из вируса карликовости клевера подземного, причем указанная чужеродная ДНК фланкирована 5'-регионом, расположенным непосредственно выше от нее, где указанный 5'фланкирующий регион соответствует ДНК растения, имеющей нуклеотидную последовательность от нуклеотида 1 до нуклеотида 98 последовательности §ЕЦ ГО N0:1, и где последовательность между нуклеотидами 99 и 334 последовательности §ЕЦ ГО N0:1 соответствует чужеродной ДНК, или указанный 5'фланкирующий регион соответствует ДНК растения, имеющей нуклеотидную последовательность от нуклеотида 1 до нуклеотида 563 последовательности §ЕЦ ГО N0:16, и где последовательность между нуклеотидами 564 и 799 последовательности §ЕЦ ГО N0:16 соответствует чужеродной ДНК, и указанная чужеродная ДНК также фланкирована 3'-регионом, расположенным непосредственно ниже от нее, где указанный 3'-фланкирующий регион соответствует ДНК растения, имеющей нуклеотидную последовательность от нуклеотида 41 до нуклеотида 452 последовательности §ЕЦ ГО N0:2, и где последовательность между нуклеотидами 1 и 40 соответствует чужеродной ДНК, и где указанная чужеродная ДНК, фланкированная указанными 5'- и 3'-регионами, содержится в геноме эталонных семян, депонированных в АТСС под номером РТА-8171, геномная ДНК которых при анализе с применением полимеразной цепной реакции с двумя праймерами, содержащими нуклеотидные последовательности §ЕЦ ГО N0: 10 и 11, образует фрагмент ДНК из 262 п.о., имеющий последовательность §ЕЦ ГО N0:12, или при анализе с применением полимеразной цепной реакции с двумя праймерами, содержащими нуклеотидные последовательности §ЕЦ ГО N0: 3 и 6, образует фрагмент ДНК из 369 п.о, имеющий последовательность от нуклеотида 1 до 369 последовательности §ЕЦ ГО N0:2.

2. Трансгенное растение хлопчатника или его семена, клетки или ткани, содержащее в своем геноме чужеродную ДНК, фланкированную 5'- и 3'- регионами, как указано в п.1, полученное путем скрещивания первого растения хлопчатника со вторым растением хлопчатника, выращенным из семян, депонированных в АТСС под номером депозита РТА-8171.

3. Способ получения устойчивых против насекомых растений хлопчатника, содержащих чужеродную ДНК, фланкированную 5'- и 3'-регионами, и геномную ДНК, как указано в п.1, включающий скрещивание первого растения хлопчатника по п.1 или 2 со вторым растением хлопчатника, посев семян, полученных от указанного скрещивания, и обработку растущих растений глюфосинатом для получения устойчивых к глюфосинату и к насекомым растений, содержащих чужеродную ДНК, фланкированную 5'- и 3'-регионами, как указано в п.1.

4. Геномная ДНК растения хлопчатника, содержащая чужеродную ДНК, фланкированную 5'- и 3'регионами, как указанно в п.1, которая при анализе с применением полимеразной цепной реакции с двумя праймерами, содержащими нуклеотидные последовательности §ЕЦ ГО N0: 10 и 11, образует фрагмент ДНК из 262 п.о., имеющий последовательность §ЕЦ ГО N0:12, или при анализе с применением полимеразной цепной реакции с двумя праймерами, содержащими нуклеотидные последовательности §ЕЦ ГО N0: 3 и 6, образует фрагмент ДНК из 369 п.о, имеющий последовательность от нуклеотида 1 до нук- 26 025296 леотида 369 последовательности §ЕЦ ГО ΝΟ:2.

5. Способ выявления в биологических образцах наличия чужеродной ДНК, фланкированной 5'- и 3'регионами, как указано в п.1, включающий выявление региона, характерного для указанной чужеродной ДНК, фланкированной указанными 5'- и 3'-регионами, с помощью специфического праймера, который распознает указанный 5' или 3'-фланкирующий регион, где способ включает амплификацию фрагмента ДНК из 100-500 п.о. из нуклеиновой кислоты, содержащейся в указанных образцах, с использованием полимеразной цепной реакции с двумя праймерами, где один из указанных праймеров распознает указанный 5'-фланкирующий регион, имеющий нуклеотидную последовательность от нуклеотида 1 до нуклеотида 98 последовательности §ЕЦ ГО Νο. 1 или от нуклеотида 1 до нуклеотида 563 последовательности §ЕЦ ГО Νο. 16, или указанный 3'-фланкирующий регион, имеющий нуклеотидную последовательность от нуклеотида 41 до нуклеотида 452 последовательности §ЕЦ ГО Νο. 2, и другой из указанных праймеров распознает последовательность в указанной чужеродной ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность от нуклеотида 99 до нуклеотида 334 последовательности §ЕЦ ГО Νο. 1 или от нуклеотида 1 до нуклеотида 40 последовательности §ЕЦ ГО Νο 2.

6. Способ выявления в биологических образцах наличия чужеродной ДНК, фланкированной 5'- и 3'регионами, как указано в п.1, включающий выявление региона, характерного для указанной чужеродной ДНК, фланкированной указанными 5'- и 3'-регионами, с помощью специфического зонда, который распознает указанный 5' или 3'-фланкирующий регион, где способ включает гибридизацию нуклеиновой кислоты из указанных биологических образцов с зондом, который специфичен для указанной чужеродной ДНК, фланкированной указанными 5'- и 3'-регионами, где последовательность указанного специфического зонда идентична по меньшей мере на 80% последовательности, содержащей часть указанного 5¹фланкирующего региона или указанного 3'-фланкирующего региона, и последовательности чужеродной ДНК, смежной с ними, причем последовательность указанного зонда по меньшей мере на 80% идентична последовательности от нуклеотида 78 до 119 последовательности §ЕЦ ГО ΝΟ: 1, или от нуклеотида 20 до 61 последовательности §ЕЦ ГО ΝΟ: 2, или последовательностям комплементарным указанным.

7. Способ по п.5, где указанный праймер, распознающий 5'-фланкирующий регион, состоит из нуклеотидной последовательности, включающей 17-200 нуклеотидов, и содержит на своем 3'-концевом участке нуклеотидную последовательность, состоящую по крайней мере из 17 последовательно расположенных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности от нуклеотида 1 до нуклеотида 98 последовательности §ЕЦ ГО Νο. 1 или нуклеотидной последовательности от нуклеотида 1 до нуклеотида 563 последовательности §ЕЦ ГО Νο. 16, указанный праймер, распознающий 3'-фланкирующий регион, состоит из 17-200 нуклеотидов и содержит на своем 3'-концевом участке нуклеотидную последовательность, состоящую по крайней мере из 17 последовательно расположенных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности, комплементарной последовательности §ЕЦ ГО Νο. 2 от нуклеотида 41 до нуклеотида 452, и указанный праймер, распознающий последовательность внутри указанной чужеродной ДНК, состоит из 17-200 нуклеотидов и содержит на своем 3'-концевом участке нуклеотидную последовательность, состоящую по крайней мере из 17 последовательно расположенных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности, комплементарной последовательности §ЕЦ ГО Νο. 1 от нуклеотида 99 до нуклеотида 334 или нуклеотидной последовательности от нуклеотида 1 до нуклеотида 40 последовательности §ЕЦ ГО Νο. 2.

8. Способ по п.7, где праймер, распознающий последовательность внутри указанной чужеродной ДНК, содержит последовательность §ЕЦ ГО Νο. 3, и где один из указанных праймеров, распознающих 3'фланкирующий регион, содержит последовательность §ЕЦ ГО Νο. 6.

9. Способ по п.8, включающий амплификацию фрагмента из 369 п.о, имеющего последовательность от нуклеотида 1 до нуклеотида 369 последовательности §ЕЦ ГО Νο. 2.

10. Способ выявления в биологических образцах наличия чужеродной ДНК, фланкированной 5'- и 3'-регионами, как указано в п.1, включающий амплификацию фрагмента ДНК из 262 п.о., имеющего последовательность §ЕЦ ГО Νο. 12, с использованием праймеров, содержащих нуклеотидные последовательности §ЕЦ ГО Νο. 10 и §ЕЦ ГО Νο. 11.

11. Набор для выявления в биологических образцах наличия чужеродной ДНК, фланкированной 5'и 3'-регионами, как указано в п.1, где указанный набор содержит праймер, распознающий указанный 5'фланкирующий регион, имеющий нуклеотидную последовательность от нуклеотида 1 до нуклеотида 98 последовательности §ЕЦ ГО Νο. 1 или нуклеотидную последовательность от нуклеотида 1 до нуклеотида 563 последовательности §ЕЦ ГО Νο. 16, или праймер, распознающий указанный 3'-фланкирующий регион, имеющий нуклеотидную последовательность от нуклеотида 41 до нуклеотида 452 последовательности §ЕЦ ГО Νο. 2, и второй праймер, распознающий последовательность внутри указанной чужеродной ДНК, причем указанная чужеродная ДНК имеет нуклеотидную последовательность от нуклеотида 99 до нуклеотида 334 последовательности §ЕЦ ГО Νο. 1 или нуклеотидную последовательность от нуклеотида 1 до нуклеотида 40 последовательности §ЕЦ ГО Νο. 2.

12. Набор по п.11, где указанный праймер, распознающий указанный 5'-фланкирующий регион, состоит из 17-200 нуклеотидов и содержит на своем 3'-концевом участке нуклеотидную последовательность, состоящую по крайней мере из 17 последовательно расположенных нуклеотидов, выбранных из

- 27 025296 нуклеотидной последовательности от нуклеотида 1 до нуклеотида 98 последовательности 5>ЕО ГО Νο. 1 или нуклеотидной последовательности от нуклеотида 1 до нуклеотида 563 последовательности 5>Е0 ГО Νο. 16, указанный праймер, распознающий 3'-фланкирующий регион, состоит из 17-200 нуклеотидов и содержит на своем 3'-концевом участке нуклеотидную последовательность, состоящую по крайней мере из 17 последовательно расположенных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности, комплементарной последовательности 5>ЕО ГО Νο. 2 от нуклеотида 41 до нуклеотида 452, и указанный праймер, распознающий последовательность внутри указанной чужеродной ДНК, состоит из 17-200 нуклеотидов и содержит на своем 3'-концевом участке нуклеотидную последовательность, состоящую по крайней мере из 17 последовательно расположенных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности, комплементарной последовательности δΕΟ ГО Νο. 1 от нуклеотида 99 до нуклеотида 334 или нуклеотидной последовательности от нуклеотида 1 до нуклеотида 40 последовательности δΕΟ ГО Νο. 2.

13. Набор по п.11, в котором праймер, распознающий последовательность внутри чужеродной ДНК, состоит из последовательности δΕΟ ГО Νο. 3, а праймер, распознающий последовательность внутри 3'фланкирующего региона, состоит из последовательности δΕΟ ГО Νο. 6.

14. Праймер, используемый для выявления в биологических образцах чужеродной ДНК, фланкированной 5'- и 3'-регионами, как указано в п.1, состоящий из 17-200 нуклеотидов и содержащий на своем 3'концевом участке нуклеотидную последовательность по крайней мере из 17 последовательно расположенных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности, расположенной в пределах указанного 5'- или 3'-фланкирующего региона, при этом указанный 5'-фланкирующий регион содержит нуклеотидную последовательность от нуклеотида 1 до нуклеотида 98 последовательности δΕΟ ГО Νο. 1 или нуклеотидную последовательность от нуклеотида 1 до нуклеотида 563 последовательности δΕΟ ГО Νο. 16, и указанный 3'-фланкирующий регион содержит нуклеотидную последовательность от нуклеотида 41 до нуклеотида 452 последовательности δΕΟ ГО Νο. 2.

15. Специфический зонд для выявления в биологических образцах чужеродной ДНК, фланкированной 5'- и 3'-регионами, как указано в п.1, где указанный зонд выбран из группы, состоящей из:

(a) зонда, содержащего последовательность из 50-500 п.о., по крайней мере на 80% идентичную последовательности, соответствующей части указанного 5'-фланкирующего региона и части чужеродной ДНК, смежной с ним, причем указанный 5'-фланкирующий регион имеет последовательность от нуклеотида 1 до 98 последовательности δΕΟ ГО Νο. 1, и указанная чужеродная ДНК имеет последовательность от нуклеотида 99 до 334 последовательности δΕΟ ГО Νο. 1;

(b) зонда, содержащего последовательность из 50-500 п.о., по крайней мере на 80% идентичную последовательности, соответствующей части указанного 5'-фланкирующего региона и части чужеродной ДНК, смежной с ним, причем указанный 5'-фланкирующий регион имеет последовательность от нуклеотида 1 до 563 последовательности δΕΟ ГО Νο. 16, и указанная чужеродная ДНК имеет последовательность от нуклеотида 564 до 799 последовательности δΕΟ ГО Νο. 16; и (c) зонда, содержащего последовательность из 50-500 п.о., по крайней мере на 80% идентичную последовательности, соответствующей части 3'-фланкирующего региона и части чужеродной ДНК, смежной с ним, причем указанный 3'-фланкирующий регион имеет последовательность от нуклеотида 41 до 452 последовательности δΕΟ ГО Νο. 2, и указанная чужеродная ДНК имеет последовательность от нуклеотида 1 до 40 последовательности δΕΟ ГО Νο. 2, (б) или зонда, имеющего последовательность, комплементарную указанным зондам (а)-(с).

16. Способ скрининга семян на наличие чужеродной ДНК, фланкированной 5'- и 3'-регионами, как указано в п.1, включающий выявление региона, характерного для указанной чужеродной ДНК, с помощью специфического праймера или зонда, который специфически распознает указанный 5'- или 3'фланкирующий регион в образцах партий семян, где последовательность указанного зонда идентична по меньшей мере на 80% последовательности от нуклеотида 78 до нуклеотида 119 последовательности δΕΟ ГО Νο. 1 или от нуклеотида 20 до нуклеотида 61 последовательности δΕΟ ГО Νο. 2, или последовательностям, комплементарным указанным последовательностям, и где указанный праймер, распознающий 5'фланкирующий регион, состоит из 17-200 последовательно расположенных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности от нуклеотида 1 до нуклеотида 98 последовательности δΕΟ ГО Νο. 1 или нуклеотидной последовательности от нуклеотида 1 до нуклеотида 563 последовательности δΕΟ ГО Νο. 16, а указанный праймер, распознающий 3'-фланкирующий регион, состоит из 17-200 последовательно расположенных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности, комплементарной последовательности δΕΟ ГО Νο. 2 от нуклеотида 41 до нуклеотида 452, и указанный праймер, распознающий последовательность внутри чужеродной ДНК, состоит из 17-200 последовательно расположенных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности, комплементарной последовательности δΕΟ ГО Νο. 1 от нуклеотида 99 до нуклеотида 334, или нуклеотидной последовательности от нуклеотида 1 до нуклеотида 40 последовательности δΕΟ ГО Νο. 2.

17. Способ определения статуса зиготности растения, растительного материала или семян, содержащих чужеродную ДНК, фланкированную 5'- и 3'-регионами, как указано в п.1, включающий амплификацию фрагментов ДНК размером 100-500 п.о. из нуклеиновой кислоты, присутствующей в указанных

- 28 025296 биологических образцах, с использованием полимеразной цепной реакции по меньшей мере с тремя праймерами, где один из указанных праймеров специфически распознает последовательность в указанном 5'-фланкирующем регионе, соответствующую ДНК растения от нуклеотида 1 до нуклеотида 98 последовательности 8ЕО ГО Νο. 1, или нуклеотидную последовательность, соответствующую ДНК растения от нуклеотида 1 до нуклеотида 563 последовательности 8ЕС ГО Νο. 16, и где один из указанных праймеров специфически распознает нуклеотидную последовательность в указанном 3'-фланкирующем регионе, соответствующую ДНК растения от нуклеотида 41 до нуклеотида 452 последовательности 8ЕС ГО Νο. 2, или последовательности, комплементарные указанным последовательностям, где указанные два праймера амплифицируют локус дикого типа для образования соответствующего продукта ПЦР локуса дикого типа, а третий из указанных праймеров распознает последовательность внутри указанной чужеродной ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность от нуклеотида 99 до нуклеотида 334 последовательности 8Е0 ГО Νο. 1, или от нуклеотида 1 до нуклеотида 40 последовательности 8ЕС ГО Νο. 2, причем указанный третий праймер позволяет осуществить амплификацию локуса, содержащего указанную чужеродную ДНК, фланкированную 5'- и 3'-регионами, как указано в п.1, с образованием продукта ПЦР трансгеннного локуса, и определение присутствия продукта ПЦР локуса дикого типа и/или продукта ПЦР трансгеннного локуса, где присутствие только продукта ПЦР трансгеннного локуса указывает на гомозиготность растения по трансгенному локусу, и где присутствие как продукта ПЦР трансгеннного локуса, так и продукта ПЦР локуса дикого типа указывает на гемизиготность растения по трансгенному локусу.

18. Способ по п.17, где первый праймер содержит нуклеотидную последовательность 8ЕС ГО Νο. 6, второй праймер содержит последовательность 8ЕС ГО Νο. 9 и третий праймер содержит последовательность 8ЕС ГО Νο. 3.

19. Способ выявления наличия чужеродной ДНК, фланкированной 5'- и 3'-регионами, как указано в п.1, в биологических образцах путем гибридизации нуклеиновой кислоты, присутствующей в указанных биологических образцах, с нуклеотидным зондом, где указанный способ включает:

a) гибридизацию указанной нуклеиновой кислоты с первым зондом, содержащим нуклеотидную последовательность от нуклеотида 99 до нуклеотида 116 последовательности 8ЕС ГО Νο. 1 или комплементарную ей последовательность, или последовательность от нуклеотида 23 до нуклеотида 40 последовательности 8ЕС ГО Νο. 2 или комплементарную ей последовательность;

b) гибридизацию указанной нуклеиновой кислоты со вторым зондом, содержащим нуклеотидную последовательность от нуклеотида 81 до нуклеотида 98 последовательности 8ЕС ГО Νο. 1 или комплементарную ей последовательность, или последовательность от нуклеотида 41 до нуклеотида 58 последовательности 8ЕС ГО Νο. 2 или комплементарную ей последовательность, где указанный первый и второй зонд перекрываются по меньшей мере одним нуклеотидом, и где либо первый зонд, либо второй зонд маркируют, чтобы получить указанный меченный нуклеотидный зонд;

c) отщепление меченого зонда от дуплекса зонд:указанная нуклеиновая кислота ферментом, который вызывает селективное отщепление указанного зонда, приводя к разъединению дуплекса и оставляя указанную нуклеиновую кислоту интактной;

б) повторение стадий от (а) до (с) и

е) выявление отщепленного меченого зонда, тем самым определяя наличие указанной чужеродной ДНК, фланкированной 5'- и 3'-регионами, как указано в п.1, в биологическом образце.

20. Набор для идентификации растения, клетки, ткани растения или семян, содержащих чужеродную ДНК, фланкированную 5'- и 3'-регионами, как указано в п.1, содержащий два олигонуклеотидных праймера, содержащих нуклеотидные последовательности 8ЕС ГО Νο. 10 и 8ЕС ГО Νο. 11.

21. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, являющаяся маркерным признаком растения по любому из пп.1, 2, содержащая как часть чужеродной ДНК, так и часть либо 5'-, либо 3'-фланкирующего региона, смежного с ней, причем указанная чужеродная ДНК и фланкирующие последовательности раскрыты в п.1, где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность 8ЕС ГО ΝΟ: 1 от нуклеотида 78 до нуклеотида 119, или 8ЕС ГО ΝΟ: 2 от нуклеотида 20 до нуклеотида 60, или последовательности, комплементарные указанным последовательностям.

- 29 025296

Фиг. 1

Фиг. 2

Фиг. 3