EA024465B1

EA024465B1 - ПРИМЕНЕНИЕ ЛЕВОСИМЕНДАНА ИЛИ ЕГО СОЛЕЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ МЕДИКАМЕНТА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА И РОДСТВЕННЫХ РАССТРОЙСТВ ИЛИ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ И/ИЛИ НЕРВНЫХ КЛЕТОК ОТ Аβ ТОКСИЧНОСТИ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ УКАЗАННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Info

Publication number: EA024465B1
Application number: EA201200686A
Authority: EA
Inventors: Даниель Коэн; Илья Чумаков; Сергей Набирочкин
Original assignee: Фарнекст
Priority date: 2009-11-03
Filing date: 2010-10-29
Publication date: 2016-09-30
Also published as: EP2496226A1; AR078846A1; CA2779070A1; CN102834095A; WO2011054759A1; CA2779070C; CN107261144A; IL219412A; EP3650021A1; EP2496226B1; ES2800311T3; MX2012005131A; US20120270836A1; CA3065614A1; EP2322163A1; EA201200686A1; IL219412A0; JP2013510114A; JP2015157841A; EP3797767A1

Abstract

Изобретение имеет отношение к применению левосимендана или его солей для приготовления медикамента для лечения болезни Альцгеймера и родственных расстройств или для защиты эндотелиальных и/или нервных клеток от Аβ токсичности, а также к способу лечения указанных заболеваний. В частности, изобретение касается использования левосимендана или его солей, которые отдельно или в комбинации(ях) могут эффективно модулировать функцию синапса и/или ангиогенез и/или ответ клетки на стресс.

Description

Изобретение имеет отношение к применению левосимендана или его солей для приготовления медикамента для лечения болезни Альцгеймера (БА) и родственных расстройств. В частности, настоящее изобретение касается использования указанных соединений, которые, отдельно или в комбинации(ях), могут эффективно модулировать функцию синапса, и/или ангиогенез, и/или реакцию (ответ) клетки на стресс.

Предшествующий уровень техники

БА представляет собой прототипную кортикальную деменцию (слабоумие), характеризующуюся нарушением памяти в сочетании с дисфазией (речевое нарушение, при котором наблюдается расстройство речи и способности понимать речь), диспраксией (затруднение координации и выполнения определенных целенаправленных движений и жестов при отсутствии моторных или сенсорных нарушений) и агнозией (способность узнавать предметы, людей, звуки, формы или запахи), связанными с поражением кортикальных ассоциативных зон. Кроме того, могут наблюдаться особенные симптомы, такие как спастический парапарез (слабость, затрагивающая нижние конечности) (1-4).

Частота заболевания болезнью Альцгеймера значительно увеличивается с возрастом. В настоящее время БА является наиболее частой причиной деменции (слабоумия). Клинически она характеризуется общим упадком когнитивной функции, который развивается медленно и на терминальной стадии приковывает пациентов к постели, приводит к недержанию и зависимости от опекунского ухода. Смерть наступает в среднем через 9 лет после постановки диагноза (5).

Рост заболеваемости болезнью Альцгеймера резко увеличивается с возрастом. Демографический прогноз, проведенный Организацией Объединенных Наций, полагает, что к 2050 году количество людей в возрасте старше 80 лет достигнет 370 млн. По имеющимся оценкам в настоящее время 50% людей старше 85 лет страдает БА. Следовательно, более чем 100 млн человек во всем мире будет страдать слабоумием через 50 лет. Огромное количество людей, нуждающихся в постоянном уходе и другом обслуживании, будет существенно затрагивать медицинские, денежные и человеческие ресурсы (6).

Нарушение памяти является ранним признаком болезни и касается эпизодической памяти (память для ежедневных событий). Позднее болезнь затрагивает семантическую память (память для хранения значения слов и зрительных образов). В противоположность этому, оперативная память (кратковременная память, вовлекающая структуры и процессы, используемые для временного хранения и управления информацией) и процедурная память (бессознательная память, а именно долговременная память навыков и приемов) сохраняются долгое время. По мере прогрессирования болезни появляются дополнительные признаки нарушения речи, визуального восприятия и недостатка восприятия пространства, агнозии (нарушения процессов узнавания) и апраксии (нарушения целенаправленных движений).

Классическая картина болезни Альцгеймера является достаточно характерной для установления болезни приблизительно в 80% случаев (7). Тем не менее, встречается клиническая разнородность, и это является важным не только для тактики клинического ведения, но требует привлечения дополнительных специальных методов лекарственного лечения функционально различающихся форм (8).

Патологические признаки БА включают амилоидные бляшки, содержащие бета-амилоид (Абета), нейрофибриллярные клубки (ΝΡΤ), содержащие тау-белок, и нарушение функций нейронов и синапсов и их утрату (9-11). В течение последнего десятилетия были предложены две основные гипотезы, касающиеся причин возникновения БА: гипотеза амилоидного каскада, которая считает, что нейродегенеративный процесс представляет собой ряд событий, запускаемых неправильным преобразованием предшественника амилоидного белка (АРР) (12), и гипотеза дегенерации цитоскелета нейронов (13), которая предполагает, что запускающими событиями являются изменения цитоскелета. Самое широкое признание получила гипотеза амилоидного каскада развития БА (14-16) и исследователи главным образом сосредоточивают внимание на установлении механизмов, лежащих в основе токсичности, связанной с белками Абета. С другой стороны, Фарминдустрия уделяет намного меньше внимания тау-белку, чем амилоиду, вследствие и фундаментальных и практических соображений. Кроме того, изменение плотности синапсов является патологическим нарушением, которое лучше всего коррелирует с когнитивным нарушением, чем два других. Исследования показали, что, по-видимому, амилоидная патология прогрессирует особым, связанным с нейромедиатором образом, когда наиболее уязвимыми оказываются холинэргические окончания, затем глутаматергические окончания и, наконец, САВА-ергические окончания (11).

Сущность изобретения

Цель настоящего изобретения - предоставить новые терапевтические подходы для лечения БА и родственных нарушений.

Изобретатели установили несколько лекарственных средств, которые, отдельно или в комбинации(ях), могут эффективно влиять на метаболические пути, связанные с БА, и представляют собой новые и эффективные методы лечения БА и родственных нарушений.

Конкретно, изобретение имеет отношение к применению левосимендана или его соли для приготовления медикамента для лечения болезни Альцгеймера (БА) или родственного нарушения, выбираемого из сенильного (старческого) слабоумия типа Альцгеймера (8ΌΑΤ), болезни Паркинсона, деменции с тельцами Леви, сосудистой (микроинфарктной) деменции, умеренных когнитивных нарушений (МС1),

- 1 024465 возрастного нарушения памяти (ΑΑΜΙ) и проблем, связанных со старением, постцеребрального Паркинсонизма, бокового амиотрофического склероза (АЬ§), рассеянного склероза (Μδ) и синдрома Дауна.

В частном случае изобретения левосимендан или его соль используется в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным агентом, выбранным из аминокапроновой кислоты, акампросата, амлодипина, баклофена, цинакалцета, фенолдопама, лефлуномида, фенформина, прилокаина, сульфизоксазола, тадалафила, тербинафина, циннаризина, эплеренона, карбеноксолона, сулодексида, карбамазина, этомидата и зонисамида или их солей, которые вводятся совместно, отдельно или последовательно.

В другом частном случае указанный по меньшей мере один дополнительный агент выбран из аминокапроновой кислоты, баклофена, сульфизоксазола, тербинафина и зонисамида или их соли.

Предпочтительно левосимендан или его соль составлены в композицию, содержащую фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.

Левосимендан или его соль вводятся пациенту многократно или левосимендан или его соль, дополнительный агент или его соль вводятся пациенту многократно.

В одном из вариантов изобретения дополнительный агент или его соль составлены в композицию, содержащую фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.

В другом варианте левосимендан или его соль, по меньшей мере один дополнительный агент или его соль составлены в одну и ту же композицию, содержащую фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.

В его одном варианте изобретения предлагается применение композиции, содержащей левосимендан или его соль для приготовления медикамента защиты эндотелиальных и/или нервных клеток от Αβтоксичности.

И наконец, изобретение касается способа лечения болезни Альцгеймера у млекопитающего, включающего введение указанному субъекту эффективного количества левосимендана, его соли(ей) или его состава(ов) с замедленным высвобождением.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Влияние отобранных лекарственных средств на рост нейритов в первичной культуре корковых нейронов крыс при интоксикации бета-амилоидом. ФФ: р<0.01; ФФФФ: р<0.00001: значимое различие с носителем. *: р<0.05; ****: р<0.0001: значимое отличие от Абета₂5_-35. Двухсторонний критерий Стьюдента. Αβ_25-35 20 мкМ дает значительную интоксикацию, больше 25%, по сравнению с нейронами, обработанными носителем. Такая интоксикация значимо предотвращается или с помощью акампросата (фиг. 1А) или зонисамида (фиг. 1В).

Фиг. 2. Влияние фенформина на прорастание нейритов в первичной культуре корковых нейронов крыс при интоксикации бета-амилоидом. ФФ: р<0.01: значимое различие с носителем. **: р<0.001: значимое отличие от Αβ_25-35. Двухсторонний критерий Стьюдента. Αβ_25-35 20 мкМ дает значительную интоксикацию, больше 25%, по сравнению с нейронами, обработанными носителем. Такая интоксикация значимо предотвращается фенформином.

Фиг. 3. Защитное действие отобранных лекарственных средств от токсичности бета-амилоидного пептида на высвобождение ЬЭН из эндотелиальных клеток мозга крыс. Ф: р<0.05: достоверное отличие от носителя. **: р<0.01; ***: р<0.0001; ****: р<0.00001: достоверное различие с Αβ_25-35. Двухсторонний критерий Стьюдента. Αβ_25-35 3 0 мкМ дает умеренную, значимую интоксикацию (фиг. 3Α-Ό). Эта интоксикация значимо предотвращается лефлуномидом (фиг. 3Α), тербинафином (фиг. 3В), сульфизоксазолом (фиг. 3С) или баклофеном (-) (фиг. 3Ό). Кроме того, лефлуномид и тербинафин не только предотвращают вредное воздействие амилоида, но также уменьшают самопроизвольную гибель клеток в культуральной среде.

Фиг. 4. Влияние отобранных лекарственных средств на жизнеспособность ΝΟΡдифференцированных РС12 после интоксикации бета-амилоидом. ФФФФ: р<0.00001: значимое отличие от носителя. **: р<0.01; ***: р<0.0001: значимое отличие от Αβ_25-35. Двухсторонний критерий Стьюдента. Αβ25-35 10 мкМ вызывает существенную интоксикацию, больше 25%, по сравнению с нейронами, обработанными носителем (фиг. 4Α и 4В). Эта интоксикация значимо предотвращается прилокаином (фиг. 4Α) или амлодипином (фиг. 4В).

Фиг. 5. Влияние отобранных лекарственных средств на высвобождение ЬЭН в первичной культуре корковых нейронов крыс, подвергнутых интоксикации бета-амилоидом. р<0.000001: значимое отличие от носителя. *: р<0.05; ***: р<0.001: значимое отличие от Αβ_25-35. Двухсторонний критерий Стьюдента. Αβ_25-35 20 мкМ вызывает существенную интоксикацию, больше 25%, по сравнению с нейронами, обработанными носителем (фиг. 5Α и В). Эту интоксикацию значимо предотвращал или зонисамид (фиг. 5Α), или сульфизоксазол (фиг. 5В), или лефлуномид (фиг. 5С).

Фиг. 6. Влияние предварительной обработки отобранных лекарственных средств против повреждения человеческим Αβι_-42 в НВМЕС. Α) Подтверждение соответствия экспериментальной модели, использованной для скрининга лекарственных средств: 1 ч предварительной обработки ΥΕΟΡ при концентрации 10 нМ достоверно защищает капиллярную сеть от амилоидного повреждения (+78% капиллярной сети по сравнению с амилоидной интоксикацией). *: р<0.05: значимое отличие от контроля (нет инток- 2 024465 сикации) Ф: р<0.05: значимое отличие от амилоидной интоксикации (ΑΝΟνΑ + тест Эипей Ροδί-Нос). Интоксикация значимо предотвращается сульфизоксазолом, левосименданом, тербинафином, баклофеном, аминокапроновой кислотой, сулодексидом или фенолдопамом, как показано в дозозависимых экспериментах, соответственно на фиг. 6В, 6С, 6Ό, 6Е, 6Р, 60, 6Н. Ф: р<0.05: значимое отличие от следующей дозы *: р<0.05: значимое отличие от амилоидной интоксикации (ΑΝΟνΑ + тест Эипей Ροδί-Нос).

Фиг. 7. Влияние предварительной обработки отобранных лекарственных средств на высвобождение ЬИН при токсичности человеческого Αβ_1-42 на первичной культуре корковых клеток крыс. А) Подтверждение соответствия экспериментальной модели, использованной для скрининга лекарственных средств: предварительная обработка 1 ч ΒΌΝΡ (50 нг/мл) достоверно защищает нейроны от амилоидного повреждения (-62%), что считается положительным контролем для нейропротекции.*: р<0.05: достоверное различие с контролем (нет интоксикации) Ф: р<0.05: достоверное отличие от амилоидной интоксикации (ΑΝΟνΑ + тест Эипей Ροδί-Нос). Во всех экспериментах Αβ_1-42 вызывает значительную интоксикацию по сравнению с нейронами, обработанными носителем. Интоксикация значительно предотвращается баклофеном (-86%) (В), сульфизоксазолом (-42%) (С), левосименданом (-133%) (Ό), этомидатом (-50%) (Е), карбеноксолоном (-39%) (Р) и циннаризином (-50%) (0), для всех экспериментов, Ф: р<0.05: значимо отличается от Αβ_1-42 интоксикации (ΑΝΟνΑ + тест Эипей Ροδί-Нос).

Фиг. 8. Влияние комбинированного лечения сульфизоксазолом и левосименданом на общую длину капиллярной сети в культурах НВМЕС, подвергнутых токсическому действию бета-амилоида. Ф: р<0.05, значимое различие с Αβ_1-42. *: р<0.05, значимое отличие от носителя. ΑΝΟνΑ + тест Випей ΡοδίΉο^ Агрегированный человеческий амилоидный пептид (Αβ_1-42 2,5 мкМ) оказывает значимую интоксикацию, больше 40%, по сравнению с нейронами, обработанными носителем. Эта интоксикация значимо предотвращается комбинацией сульфизоксазола и левосимендана (А) тогда как, в тех же самых концентрациях, левосимендан (В) и сульфизоксазол (С) по отдельности не оказывают существенного влияния на интоксикацию.

Фиг. 9. Эффект комбинированного лечения сульфизоксазолом и тербинафином на общую длину капиллярной сети в НВМЕС культурах, подвергнутых токсическому действию бета-амилоида. Ф: р<0.05, значимое отличие от Αβ_1-42. *: р<0.05, значимое различие с носителем. ΑΝΟνΑ + тест Виией ΡοδίΉο^ Агрегированный человеческий амилоидный пептид (Αβ_1-42 2,5 мкМ) вызывает значительную интоксикацию, больше 40%, по сравнению с нейронами, обработанными носителем. Такую интоксикацию значимо предотвращает комбинация сульфизоксазола и левосимендана (А), в то время как при тех же концентрациях сульфизоксазол (В) и тербинафин (С) отдельно не оказывают значимого влияния на интоксикацию.

Фиг. 10. Эффект комбинированного лечения баклофеном и левосименданом на общую длину капиллярной сети в культурах НВМЕС, подвергнутых токсическому действию бета-амилоида. Ф: р<0.05, достоверное отличие от Αβ_1-42. *: р<0.05, достоверное отличие от носителя. ΑΝΟνΑ + тест Виией ΡοδίН()с. Агрегированный человеческий амилоидный пептид (Αβ_1-42 2.5 мкМ) вызывает значительную интоксикацию, больше 40%, по сравнению с нейронами, обработанными носителем. Эту интоксикацию значимо предотвращает комбинация баклофена и левосимендана (А), в то время как в тех же концентрациях левосимендан (В) и баклофен (С) по отдельности не оказывают значимого влияния на интоксикацию.

Фиг. 11. Эффект комбинированного лечения тербинафином и аминокапроновой кислотой на общую длину капиллярной сети в культурах НВМЕС, подвергнутых токсическому действию бета-амилоида. Ф: р<0.05, достоверное отличие от Αβ_1-42. *: р<0.05, достоверное отличие от носителя. ΑΝΟνΑ + тест Виией Ροδί-Πο^ Агрегированный человеческий амилоидный пептид (Αβ_1-42 2,5 мкМ) вызывает значительную интоксикацию, больше 40%, по сравнению с нейронами, обработанными носителем. Эту интоксикацию значимо предотвращает комбинация тербинафина и аминокапроновой кислоты (А), в то время как в тех же концентрациях аминокапроновая кислота (В) и тербинафин (С) по отдельности не оказывают значимого влияния на интоксикацию.

Фиг. 12. Влияние комбинации аминокапроновой кислоты и левосимендана на общую длину капиллярной сети в культурах НВМЕС, подвергнутых токсическому действию бета-амилоида. Ф: р<0.05, значимое отличие от Αβ_1-42. *: р<0.05, значимое отличие от носителя. ΑΝΟνΑ + тест Виией ΡοδίΉο^ Агрегированный человеческий амилоидный пептид (Αβ_1-42 2.5 мкМ) вызывает значительную интоксикацию, больше 40%, по сравнению с нейронами, обработанными носителем. Эту интоксикацию значимо предотвращает комбинация левосимендана и аминокапроновой кислоты (А), в то время как в тех же концентрациях аминокапроновая кислота (В) и левосимендан (С) по отдельности не оказывают значимого влияния на интоксикацию.

Фиг. 13. Влияние комбинации тербинафина и левосимендана на общую длину капиллярной сети в культурах НВМЕС, подвергнутых токсическому действию бета-амилоида. Ф: р<0.05, достоверное отличие Αβ_1-42. *: р<0.05, достоверное отличие от носителя. ΑΝΟνΑ + тест Випей ΡοδίΉο^ Агрегированный человеческий амилоидный пептид (Αβ_1-42 2,5 мкМ) вызывает значительную интоксикацию, больше 40%, по сравнению с нейронами, обработанными носителем. Эту интоксикацию достоверно предотвращает комбинация тербинафина и левосимендана (А) в то время как в тех же концентрациях тербинафин (В) и

- 3 024465 левосимендан (С) по отдельности не оказывают значимого влияния на интоксикацию.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение предоставляет новые терапевтические подходы для лечения БА или родственных нарушений. Изобретение раскрывает новое применение лекарственных средств или комбинаций лекарственных средств, которое обеспечивает эффективную коррекцию таких болезней и может использоваться для лечения пациентов.

Термин нарушения, родственные с БА, включает сенильное (старческое) слабоумие типа Альцгеймера (8ИАТ), болезнь Паркинсона, деменцию с тельцами Леви, сосудистую (микроинфарктную) деменцию, умеренные когнитивные нарушения (МС1), возрастное нарушение памяти (ААМ1) и проблемы, связанные со старением, постцеребральный Паркинсонизм, боковой амиотрофический склероз (АЬ8), рассеянный склероз (М8) и синдром Дауна.

При использовании в описании лечение нарушения включает терапию, предотвращение, профилактику, задержку или уменьшение симптомов, вызванных нарушением. Термин лечение включает, в частности, контроль за развитием болезни и связанных с этим симптомов.

Термин улучшать, когда он относится к функции синапса, включает любое увеличение синаптической функции по сравнению с функцией, существующей у субъекта.

Такое улучшение может включать восстановление, т.е. до нормальных уровней, или более низкое увеличение, которое все же является достаточным, чтобы улучшить состояние пациента. Такое улучшение можно оценить и проверить с помощью известных биологических тестов, например, описанных в экспериментальной части.

Термин увеличить, когда он относится к ангиогенезу, включает любое увеличение ангиогенеза по сравнению с уровнем, существующим у субъекта. Такое улучшение может включать восстановление, т.е. до нормальных уровней, или более низкое увеличение, которое все же является достаточным, чтобы улучшить состояние пациента. Такое улучшение можно оценить и проверить с помощью известных биологических тестов, например, описанных в экспериментальной части.

Термин ингибировать, когда он относится к реакции (ответу) клетки на стресс (С8К), включает любое уменьшение С8К по сравнению с существующей активностью у субъекта. Такое уменьшение может включать частичное уменьшение, например от 5 до 20%, которое является достаточным для того, чтобы улучшить состояние пациента, а также более значительные уменьшения, например от 20 до 50% или более полное ингибирование, например выше 50%. Ингибирование можно оценить и проверить с помощью известных биологических тестов, например тестов, описанных в экспериментальной части.

При этом обозначение специальных соединений в контексте этого изобретения предназначается для того, чтобы включать не только специально названные молекулы, но также любую фармацевтически приемлемую соль, гидрат, эфир, сложный эфир, изомеры, рацемат, конъюгаты или их пролекарства любой степени очистки.

Термин комбинация или комбинированное лечение/терапия означает лечение, при котором по меньшей мере два или более лекарственных препаратов вводятся субъекту совместно, чтобы вызвать биологический эффект. При комбинированном лечении согласно этому изобретению по меньшей мере два лекарственных средства могут вводиться вместе или отдельно, в одно и то же время или последовательно. Кроме того, по меньшей мере два лекарственных средства могут вводиться разными путями или по разным протоколам. В результате, несмотря на то, что лекарственные средства комбинации могут заключаться в состав вместе, они также могут заключаться в состав по отдельности.

Как обсуждалось выше, изобретение имеет отношение к композициям и способам лечения болезни Альцгеймера или родственного нарушения у субъекта, нуждающегося в этом, с помощью лекарственных средств или комбинации лекарственных средств, которые улучшают функцию синапса, и/или увеличивают ангиогенез, и/или ингибируют реакцию клетки на стресс.

Путем сведения в единое целое полных экспериментальных данных, охватывающих результаты исследований биологии клетки, экспериментов по определению профиля экспрессии и исследований генетической связи, описания различных аспектов болезни Альцгеймера и связей, существующих в клеточных сигнальных и функциональных путях, изобретатели обнаружили, что функция синапса, ангиогенез и реакция клетки на стресс представляют собой важные механизмы, которые изменяются у субъектов с БА. С помощью дополнительных экспериментальных исследований, изобретатели отобрали лекарственные средства или комбинации лекарственных средств, которые эффективно изменяют эти пути и эффективно улучшают БА, как проиллюстрировано в примерах. Таким образом, эти лекарственные средства и комбинации представляют собой новые подходы для лечения БА и родственных нарушений.

Гены, расположенные в указанных функциональных сетях и вовлеченные в болезнь Альцгеймера, были отобраны по следующим критериям:

(1) прямое взаимодействие с генами, которые являются причиной и несут ответственность за семейные случаи болезни Альцгеймера (АРР, АроЕ, пресенелины, тау-белок);

(2) функциональные партнеры генов, отобранных по критерию (1);

(3) ближайшие функциональные партнеры генов, отобранных по критерию (2).

Благодаря этому изобретатели установили, что сети, несущие ответственность за функцию синапса,

- 4 024465 ангиогенез и реакцию клетки на стресс, являются основными функциональными сетями, пораженными при болезни Альцгеймера.

Конкретнее, изобретатели установили, что потеря синапсов является функционально значимым признаком болезни Альцгеймера, что, в конечном счете, приводит к прогрессирующему снижению когнитивных способностей, потере памяти и слабоумию. Важно отметить, что потеря синапсов лучше коррелирует с когнитивным расстройством, характеризующим патологию Альцгеймера, по сравнению с другими специфическими для БА маркерами повреждения клеток, обнаруженными при развитии нейрофибриллярных клубков или отложении амилоидных бляшек. Поэтому формирование синапса и синаптическая пластичность представляет важную мишень для терапевтического вмешательства в контексте болезни Альцгеймера.

АРР-белок транпортируется по аксонам и подвергается обработке в пресинаптических окончаниях, что приводит к высокому накоплению Абета в синапсах. Олигомеры Абета42, а также и сами амилоидные бляшки являются важными для ингибирования долговременной потенциации и несут основную ответственность за ухудшение памяти у пациентов с БА.

С помощью нашего метода интеграции данных была обнаружена группа генов, вовлеченных в нарушение синапса при БА, которую формально можно разделить на три основные функциональные группы: белки, участвующие в формировании постсинаптического уплотнения (Ρ8Ό) и в правильной передаче нервного сигнала на постсинаптическую мембрану; белки, обеспечивающие высвобождение нейромедиатора; и белки, участвующие в росте аксона и развитии синаптического аппарата до созревания.

В отдельном варианте осуществления настоящее изобретение, таким образом, принимает во внимание, что для эффективного лечения БА является важным улучшить активность белков, связанных с постсинаптическим уплотнением.

В числе генов, установленных с помощью нашего исследования, особый интерес представляет ген ОБС2. который кодирует семейство белков МАОИК и создает границу раздела между сгруппированными (собранными в кластеры) мембраносвязанными рецепторами, молекулами клеточной адгезии и цитоскелетом на основе актина (17-18). Изобретатели определили большую группу глутаматных ионотрофических/метаботрофических рецепторов и рецепторов фактора роста, которые непосредственно взаимодействуют с белком ЭЬО2 или ΌΕΟ2/Ρ8Ό95 белковым комплексом в деполяризующих синапсах и которые, следовательно, можно считать терапевтическими мишенями для лечения болезни Альцгеймера.

Таким образом, в другом отдельном варианте осуществления настоящее изобретение принимает во внимание, что для эффективного лечения БА также является важным улучшить активность белков, участвующих в регуляции высвобождения нейромедиатора на пресинаптической мембране.

Высвобождение нейромедиаторов на ограниченной и узкоспециализированной активной зоне пресинаптической плазматической мембраны запускается потенциалом действия и контролируется совместным действием потенциалозависимых кальциевых Са,, каналов, Мах1К/ВК каналов (калиевые кальцийактивируемые каналы с высокой проводимостью) и сОМР-зависимыми РРКО протеинкиназами, все они являются тесно связанными, как продемонстрировано нашим исследованием, при развитии болезни Альцгеймера. В дополнение к этим функциональным модулям, вовлеченным в высвобождение нейромедиатора, изобретатели установили другую группу белков, связанных с дисрегуляцией синаптической нейропередачи в ходе болезни Альцгеймера, которые являются ответственными за созревание, стыковку и слияние синаптических пузырьков (например, 8ТХ2, 8ТХВР6, ΒΙΝ1, КАВ3В, иИС13С и К1М8 1/2 поддерживающие белки). Поэтому эти функциональные пути были определены как подходящие терапевтические мишени для лечения болезни Альцгеймера.

Кроме того, в другом отдельном варианте осуществления настоящее изобретение принимает во внимание, что для эффективного лечения БА важно улучшить активность белков, участвующих в регуляции и направлении роста аксонов.

Белки, участвующие в регуляции направления и роста аксонов, дают возможность клеткампредшественникам нейронов и аксонам мигрировать в надлежащее место назначения, чтобы обеспечить правильное местоположение и возможность взаимодействия; кроме того, они вовлечены в созревание вновь создаваемых синапсов, а также деградацию аксонов и синапсов при БА. Эти процессы играют существенную роль при осуществлении когнитивных функций и, по-видимому, являются чрезвычайно подверженными токсичному влиянию отложений Абета.

Последовательные стадии направления и роста аксона плотно контролируются совместным действием внеклеточных или мебраносвязанных нетринов, семафоринов, эфринов, ЭБЕ и δΐίΐβ молекул и их соответствующих функциональных рецепторов, большинство из которых были обнаружены с помощью нашего метода сбора данных. Функциональные результаты активации большинства рецепторов, связанных с ростом аксонов, являются тесно связанными с их способностью избирательно модулировать активность небольших ГТФ-аз КйоА, Кас1 и Сбс42, вместе с Р1юА ГТФ-азой, несущей главную ответственность за сокращения нейрита и разрушение конуса роста (19). Эти сигнальные пути расцениваются как подходящие терапевтические мишени для лечения болезни Альцгеймера.

Таким образом, настоящее изобретение принимает во внимание, что для эффективного лечения БА важно улучшить синаптическую функцию, измененную при болезни Альцгеймера и других нейродеге- 5 024465 неративных нарушениях, путем модулирования генов-мишеней и белков, описанных выше.

Благодаря нашему способу получения данных изобретатели также установили, что сеть, несущая ответственность за ангиогенез, представляет собой другую основную функциональную сеть, поврежденную при болезни Альцгеймера.

Ангиогенез играет существенную роль в обеспечении гомеостаза ткани и адаптивных ответов на физиологические требования и требования окружающей среды, такие как гипоксия или заживление ран; его дисфункция способствует развитию многочисленных и разнородных патологий, начиная от сердечно-сосудистых осложнений до роста опухоли и метастазирования.

Хотя болезнь Альцгеймера традиционно считается нейродегенеративным состоянием, сопровождаемым второстепенной патологией сосудов, наше исследование дало возможность переоценить патогенное влияние отмены сосудистого регулирования (контроля за сосудами) и признать важную и возможно причинную роль путей, связанных с ангиогенезом, в этиологии этой болезни. Изобретатели обнаружили, что сигнальные пути, вовлеченные в развитие болезни Альцгеймера, крайне богаты генами, регулирующими ангиогенез. Этот вывод имеет глубокие последствия для предотвращения и излечения болезни Альцгеймера и определяет новые рекомендации в отношении комбинированного лечения этого сложного нейродегенеративного нарушения.

Среди сигнальных путей, тесно вовлеченных в ремоделирование сосудов, связанное с болезнью Альцгеймера, установлено несколько функциональных модулей, опосредованных УЕСРК1, ЕгЬВ4, Νοίεΐι. ИСС, СИ44, эфриновыми рецепторами и кадхеринами.

При анализе наших данных было обнаружено, что другие белки-мишени, возможно участвующие в развитии сосудистых дефектов, проявляющихся в ходе болезни Альцгеймера, включают 1Б20Ка, БЕРТК, ΝΚΡ1, ΝΚΡ2 и эндотелиновые ΕΌΝΚΑ рецепторы, белки, принимающие участие в организации и ремоделировании внеклеточного матрикса (ТНВ82, БАМА1, СОЬ4А2, АИАМТ812 и ΑΌΑΜ10), или белки (например, ТББ2), играющие важную роль в функциональном процессинге хорошо известных модуляторов ангиогенеза, таких как пролактин, гормон роста и плацентарный лактоген (20).

Более того, авторы обнаружили, что некоторые гены, связанные с болезнью Альцгеймера, представляют расположенные выше модуляторы и расположенные ниже эффекторные молекулы АМРактивируемых киназ, важных регуляторов сосудистой системы (например, лептин и С№ГР рецепторы, сигнальный путь тромбина, киназы САМКК23 и БКВ1) (21-24). Это открытие дало возможность определить АМРК-опосредованную сигнальную сеть как обоснованную терапевтическую мишень для лечения болезни Альцгеймера.

Фосфатидная кислота (РА), лизофосфатидиловая кислота (БРА) и сфингозин 1-фосфат (81Р) являются природными фосфолипидами, обладающими сильными сигнальными свойствами (передачи сигнала). В частности, эти фосфолипидные факторы роста проявляют неоднородные действия на ангиогенный потенциал эндотелиальных клеток (25). Используя собственный способ получения данных, авторы изобретения установили большое число генов, участвующих в метаболизме БРА или модулируемых сигнальным путем БРА и вероятно связанных с прогрессированием болезни Альцгеймера (МТК, МАТ2В, СИВН АТР10А, ТНЕМ2, РГГРКС1, ΕΝΙΨΟ 8СРР2, АСРАТ, ИСКН, ИСКВ, МС8Т2, РБИ2 и ИКИ2). Поэтому, изобретатели сделали вывод, что эта сигнальная сеть представляет собой подходящую терапевтическую мишень для лечения болезни Альцгеймера.

Кроме того, настоящее изобретение подчеркивает важность увеличения ангиогенеза, измененного при болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных нарушениях, при помощи модулирования генов-мишеней и белков, описанных выше.

Наконец, авторы установили, что сеть, несущая ответственность за ответ клетки на стресс, является третьей основной функциональной сетью, затронутой при болезни Альцгеймера.

Конкретнее, авторы установили, что ответ клетки на стресс является функциональным признаком болезни Альцгеймера. Как обсуждалось выше, изобретатели установили три семейства белков в пределах сети, отвечающей за ответ клетки на стресс, которые с функциональной точки зрения относятся к возникновению и контролю за болезнью Альцгеймера, и представляют собой полезные мишени для комбинированных видов терапии. Конкретнее, эти группы белков представляют собой белки, принимающие участие в гомеостазе кальция, в сворачивании белка и в осуществлении апоптоза.

В отдельном варианте осуществления настоящее изобретение имеет отношение к композициям и способам, использующим комбинацию лекарственных средств, которые модулируют активность белка, принимающего участие в гомеостазе кальция.

Кальций, один из наиболее важных внутриклеточных мессенджеров (посредников), опосредует множество клеточных процессов и в нейронах и в эндотелиальных клетках, включая синаптическую пластичность, ангиогенез и апоптоз.

Внутриклеточный уровень кальция строго регулируется совместным действием серии проницаемых для кальция каналов, кальциевых насосов и кальциевых обменников в плазматической мембране и эндоплазматическом ретикулуме (26-27). Авторы изобретения установили сеть генов, вовлеченных в гомеостаз кальция, функция которых может модифицироваться мутантными белками пресенелинами или ток- 6 024465 сичным р-амилоидом в ходе болезни Альцгеймера. Среди них ΙΡ3Κ (ΙΤΡΚ1) и ΚΥΚ3 рецепторы, АТР2А3 (8ЕКСА3 Са2+ АТФаза), регулирующая гомеостаз кальция на уровне ЕК, АТФаза цитоплазматической мембраны АТР2В1, выталкивающая ионы кальция из эукариотических клеток против градиента концентрации, и потенциалозависимые Να+ каналы представляют особый интерес как терапевтические мишени для лечения болезни Альцгеймера.

В другом отдельном варианте осуществления настоящее изобретение имеет отношение к композициям и способам, использующим лекарственную комбинацию, которая модулирует активность белка, вовлеченного в свертывание или агрегацию белка.

Агрегация белка представляет собой главное цитопатологическое явление при БА.

Два основных клеточных признака болезни Альцгеймера проявляются в развитии нейрофибриллярных клубков (ΝΡΤ) и отложении амилоидных бляшек, состоящих из агрегированного гиперфосфорилированного тау-белка и Λβ-фрагментов АРР-белка соответственно. Другой белок, склонный к агрегации α-синуклеин, признанный скорее специфическим признаком болезни Паркинсона, тем не менее, может обнаруживаться в амилоидных бляшках в большинстве случаев спорадических и семейных форм болезни Альцгеймера.

Авторы изобретения определили несколько генов, вовлеченных в изменение сворачивания, посттрансляционную модификацию и процессинг каждого основного компонента белковых агрегатов, связанных с болезнью Альцгеймера, как подходящие терапевтические мишени для лечения болезни Альцгеймера, например, белки АРВА1 и АРВА2ВР, которые взаимодействуют с АРР и регулирует его стабильность и функции, или РАКК2 убиквитин-протеин лигаза, которая вовлечена в клиренс α-синуклеина (28). Точно так же ΟδΚ-3β киназа может играть чрезвычайно важную роль в патогенезе неправильного сворачивания белка в ходе болезни Альцгеймера. Этот вывод подкрепляется нашим открытием, что некоторые сигнальные модули, регулирующие активность ΟδΚ-3β киназы, и их взаимодействие с таубелком - \У\УОХ (29), гиалуроновым СЭ44 рецептором, \Уп1 рецепторами Ρζ2/ΚΟΚ2 и комплексом инсулиновый рецептор/РТРКС фосфатаза (30) - являются связанными с развитием болезни Альцгеймера.

В следующем варианте осуществления настоящее изобретение имеет отношение к композициям и способам, использующим лекарственную комбинацию, ингибирующую апоптоз, который считается основным клеточным механизмом, несущим ответственность за потерю клеток при болезни Альцгеймера.

Как установлено нашим исследованием, апоптоз в случае болезни Альцгеймера, наиболее вероятно осуществляется через канонические р53-зависимые пути.

Белок р53 может регулироваться через посттрансляционные модификации и благодаря взаимодействиям с положительными и отрицательными регуляторными факторами. Авторы изобретения установили несколько таких регуляторных белков, \У\УОХ. ΜΌΜ1, ΗΙΡΚ2 и РМЬ, подтверждая предположение о ключевой роли белка р53 в осуществлении клеточной смерти при болезни Альцгеймера (31-33).

Среди рецепторных систем, которые могут быть непосредственно и специфически вовлечены в индукцию апоптоза в контексте болезни Альцгеймера, особый интерес представляют υNС5С (Ипс-5 гомолог С) и ЭСС (отсутствующие при колоректальной карциноме) нетриновые рецепторы, участвующие в аксональном поиске пути и ангиогенезе. Эти рецепторы определяются как предполагаемые условные опухолевые супрессоры, так как они ведут себя как нетрин-зависимые рецепторы, индуцирующие апоптоз при отсутствии лигандов (34). Связывание нетрина-1 с этими рецепторами ингибирует р53зависимый апоптоз, в то время как р53 непосредственно участвует в регуляции транскрипции нетрина-1 и его рецепторов (33). Кроме того, известно, что рецептор ЭСС возбуждается пресенелином, указывая на его важную роль в развитии болезни Альцгеймера (35). Таким образом, полученные нами данные говорят о том, что зависимая от рецепторов нетрина и р53-опосредованная клеточная смерть может быть одним из специфических проапоптотических путей, вовлеченных в патологическую потерю клеток при болезни Альцгеймера, в дополнение к скорее неспецифическим проапоптотическим программам, индуцированным нарушенным гомеостазом кальция и чрезмерной выработкой КО8.

В отдельном варианте осуществления настоящее изобретение имеет отношение к композициям и способам, использующим лекарственную комбинацию, которая ингибирует активность по меньшей мередвух разных белков, вовлеченных в гомеостаз кальция, сворачивание белков и осуществление апоптоза.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предлагает новые композиции, которые могут использоваться для ингибирования ответа клетки на стресс, вызванный при болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных нарушениях, при помощи регулирования (модулирования) генов-мишеней и белков, описанных выше.

Как обсуждалось выше, изобретение имеет отношение к композициям и способам для лечения болезни Альцгеймера или родственного нарушения у субъекта, нуждающегося в этом, с помощью комбинации лекарственных средств, улучшающей функцию синапса и/или увеличивающей ангиогенез и/или ингибирующей ответ клетки на стресс.

Изобретатели отобрали и протестировали целый ряд лекарственных средств и комбинаций лекарственных средств, которые изменяют один или, предпочтительно, все из описанных выше путей. Как рас- 7 024465 крывается в примерах, эти лекарственные комбинации оказывают сильное действие на болезнь Альцгеймера и представляют собой новые терапевтические подходы к лечению этой патологии. Эти лекарственные комбинации являются чрезвычайно полезными, так как они оказывают воздействие разными путями и таким образом являются более эффективными. Кроме того, вследствие их эффективности и механизма действия, лекарственные комбинации могут использоваться в низких дозах, что является дополнительным очень существенным преимуществом.

Наиболее предпочтительные лекарственные средства перечислены в табл. 1 ниже.

Таблица 1

Название лекарственного средства	СА8-иомер
Акампросат	77337-76-9
Амбрисентан	177036-94-1
Аминокапроновая кислота	60-32-2
Амлодипин	88150-42-9
Амобарбитал	57-43-2
Априндин	37640-71-4
Агратробан	74863-84-6
Баклофен	1134-47-0
Бенидипин	105979-17-7
Карбамазепин	298-46-4
Карбамазин	90-89-1
Карбеноксолон	5697-56-3
Цефменоксим	65085-01-0
Цефотетан	69712-56-7
Циклопирокс	29342-05-0
Цилостазол	73963-72-1
Цинакалцет	226256-56-0
Циннаризин	298-57-7
Клопидогрел	113665-84-2
Дифиллин	479-18-5
Энпрофиллин	41078-02-8
Эплеренон	107724-20-9
Эпросартан	133040-01-4
Эритритила тетранитрат	7297-25-8
Этомидат	33125-97-2
Фенолдопам	67227-57-0
Лефлуномид	75706-12-6
Лерканидияин	100427-26-7
Левосимендан	141505-33-1
Мепакрин	83-89-6
Метимазол	60-56-0
Метиклотиазид	135-07-9
Митиглинид	145375-43-5
Моксифлоксацин	354812-41-2
Окстрифиллин	4499-40-5
Парам етадион	115-67-3
Фенформин	114-86-3
Прилокаин	721-50-6
Рифабутин	72559-06-9
Ризедронат	105462-24-6
Сульфизоксазол	127-69-5
Сулодексид	57821-29-1
Тадалафил	171596-29-5
Тербинафин	91161-71-6
Зонисамид	68291-97-4

В этой связи предпочтительная цель этого изобретения имеет отношение к композициям, содержащим комбинацию по меньшей мере двух соединений, выбранных из группы, состоящей из аминокапро- 8 024465 новой кислоты, акампросата, амлодипина, агратробана, баклофена, цилостазола, цинакалцета, клопидогрела, дифиллина, фенолдопама, лефлуномида, мепакрина, метимазола, фенформина, прилокаина, рифабутина, сульфизоксазола, тадалафила, тербинафина, циннаризина, циклопирокса, эплеренона, карбеноксолона, сулодексида, карбамазина, амобарбитала, цефотетана, эритритила тетранитрата, метиклотиазида, ризедроната, энпрофиллина, окстрифиллина, параметадиона, цефменоксима, априндина, этомидата, митиглинида, бенидипина, левосимендана и зонисамида или солей или пролекарств или производных любой степени чистоты или их композиций с замедленным высвобождением для одновременного, отдельного или последовательного введения.

В отдельном варианте осуществления изобретение имеет отношение к композициям, содержащим по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из аминокапроновой кислоты, циннаризина, циклопирокса, эплеренона, карбеноксолона, сулодексида, карбамазина, амобарбитала, цефотетана, эритритила тетранитрата, метиклотиазида, ризедроната, энпрофиллина, окстрифиллина, параметадиона, цефменоксима, априндина, этомидата, митиглинида, бенидипина и левосимендана, или их соли(ей), или пролекарства(в), или производного(ых), или композиции(ий) с замедленным высвобождением, в комбинации по меньшей мере с одним соединением, выбранным из группы, состоящей из акампросата, амлодипина, агратробана, баклофена, цилостазола, цинакалцета, клопидогрела, дифиллина, фенолдопама, лефлуномида, мепакрина, метимазола, фенформина, прилокаина, рифабутина, сульфизоксазола, тадалафила, тербинафина и зонисамида, или соли(ей), или пролекарста(в), или производного(ых), или их композиции(й) с замедленным высвобождением для одновременного, отдельного или последовательного введения.

Как описано в примерах, комбинированные способы лечения с использованием по меньшей мере 2 из перечисленных выше лекарственных средств приводят к эффективной коррекции болезни Альцгеймера.

Лечение согласно изобретению может осуществляться само по себе (отдельно) или в виде лекарственной комбинации.

В предпочтительном варианте осуществления лекарственные средства изобретения используются в комбинации(ях) для совместного, отдельного или последовательного введения в целях обеспечения наиболее эффективного результата. В этом отношении композиции для лечения болезни Альцгеймера согласно изобретению используют лекарственное средство(а), улучшающее функцию синапсов, и лекарственное средство(а), ослабляющее дисрегуляцию ангиогенеза, и/или лекарственное средство(а), ингибирующее ответ клетки на стресс.

Конкретнее, композиции согласно изобретению для применения при лечении болезни Альцгеймера или родственного нарушения можно выбрать из композиций, содержащих по меньшей мере одну из следующих комбинаций лекарственных средств:

модулятор АМРК (предпочтительно фенформин) и ингибитор натриевого канала 8ΟΝ1Α и активатор ВК-каналов (предпочтительно зонисамид) или модулятор ВК-каналов (предпочтительно метиклотиазид);

модулятор АМРК (предпочтительно фенформин) и модулятор активности ОАВА-ергических и глутаматергических рецепторов (предпочтительно выбирают из акампросата, этомидата и априндина);

модулятор АМРК (предпочтительно фенформин) и антагонист рецептора эндотелина Е^NКΑ (предпочтительно сульфизоксазол);

ингибитор натриевого канала 8США и активатор ВК-каналов (предпочтительно зонисамид) или модулятор ВК-каналов (предпочтительно метиклотиазид) и модулятор рианодинового рецептора ΚΥΚ3 (предпочтительно прилокаин);

модулятор ОАВВК2 рецептора (предпочтительно баклофен) и модулятор КНОА (предпочтительно выбирают из тербинафина и ризедроната);

модулятор ОАВВК2 рецептора (предпочтительно баклофен) и антагонист рецептора эндотелина ΕΌΝ^ а (предпочтительно сульфизоксазол);

модулятор ОАВВК2 рецептора (предпочтительно баклофен) и ингибитор натриевого канала 8США и активатор ВК-каналов (предпочтительно зонисамид) или модулятор ВК-каналов (предпочтительно метиклотиазид);

модулятор ОАВВК2 рецептора (предпочтительно баклофен) и модулятор гиаулоран-синтаз НА81 -3 (предпочтительно лефлуномид);

ингибитор натриевого канала 8США и активатор ВК-каналов (предпочтительно зонисамид) или модулятор ВК-каналов (предпочтительно метиклотиазид) и модулятор аденозиновых рецепторов АЭОКА1/2/3 (предпочтительно дифиллин);

ингибитор натриевого канала 8США и активатор ВК-каналов (предпочтительно зонисамид) или модулятор ВК-каналов (предпочтительно метиклотиазид) и антагонист рецептора эндотелина Е^NКΑ (предпочтительно сульфизоксазол);

модулятор КНОА (предпочтительно выбирают из тербинафина и ризедроната) и антагонист рецептора эндотелина ЕОИКА (предпочтительно сульфизоксазол);

модулятор КНОА (предпочтительно выбирают из тербинафина и ризедроната) и ингибитор фосфо- 9 024465 липаз РЬЛ1Л и РЬЛ2 (предпочтительно мепакрин);

модулятор ΚΗΟΆ (предпочтительно выбирают из тербинафина и ризедроната) и модулятор активности ОЛБЛ-ергических и глутаматергических рецепторов (предпочтительно выбирают из акампросата, этомидата и априндина);

модулятор ΚΗΟΆ (предпочтительно выбирают из тербинафина и ризедроната) и химический шаперон (предпочтительно рифабутин);

модулятор АМРК (предпочтительно фенформин) и ингибитор ΡΌΕ11Ά и ΡΌΕ4Ά, ΡΌΕ5Ά фосфодиэстераз (предпочтительно выбирают из тадалафила, энпрофиллина и окстрифиллина);

ингибитор натриевого канала 8ΟΝ1Ά и активатор ВК-каналов (предпочтительно зонисамид) или модулятор ВК-каналов (предпочтительно метиклотиазид) и модулятор сигнального пути рецептора тромбина Ρ2Κ (предпочтительно агратробан и цефменоксим);

модулятор АМРК (предпочтительно фенформин) и модулятор пуринергических рецепторов Ρ2ΚΥ1 и Ρ2ΚΥ12 (предпочтительно клопидогрел);

модулятор активности ОАВА-ергических и глутаматергических рецепторов (предпочтительно выбирают из акампросата, этомидата и априндина) и модулятор СА8К (предпочтительно цинакалцет);

антагонист рецептора эндотелина ΕΌΝΚΆ (предпочтительно сульфизоксазол) и модулятор СА8К (предпочтительно цинакалцет);

модулятор ΚΉΘΆ (предпочтительно выбирают из тербинафина и ризедроната) и модулятор сигнального пути рецептора тромбина Ρ2Κ (предпочтительно выбирают из агратробан и цефменоксим);

модулятор рецептора ΟΆΒΒΚ2 (предпочтительно баклофен) и модулятор пуринергических рецепторов Ρ2ΚΥ1 и Ρ2ΚΥ12 (предпочтительно клопидогрел);

модулятор ΚΗΟΆ (предпочтительно выбирают из тербинафина и ризедроната) и модулятор пуринергических рецепторов Ρ2ΚΥ1 и Ρ2ΚΥ12 (предпочтительно клопидогрел);

ингибитор натриевого канала δСN1Ά и активатор ВК-каналов (предпочтительно зонисамид) или модулятор ВК-каналов (предпочтительно метиклотиазид) и антагонист потенциалозависимых кальциевых каналов СΆСNΆ (предпочтительно выбирают из циннаризина, бенидипина, параметадиона и амлодипина);

модулятор активности ОАΒΆ-ергических и глутаматергических рецепторов (предпочтительно выбирают из акампросата, этомидата и априндина) и антагонист потенциалозависимых кальциевых каналов СΆСNΆ (предпочтительно выбирают из циннаризина, бенидипина, параметадиона и амлодипина);

ингибитор натриевого канала δСN1Ά и активатор ВК-каналов (предпочтительно зонисамид) или модулятор ВК-каналов (предпочтительно метиклотиазид) и модулятор сигнального пути ΗΙΡ1Ά (предпочтительно циклопирокс);

модулятор ОАΒΆ-ергических и глутаматергических рецепторов (предпочтительно выбирают из акампросата, этомидата и априндина) и модулятор сигнального пути ΗΙΡ1Ά (предпочтительно циклопирокс);

антагонист рецептора эндотелина ΕΌΝΚΆ (предпочтительно сульфизоксазол) и модулятор окислительного фосфорилирования (предпочтительно выбирают из амобарбитала и метимазола);

ингибитор натриевого канала δСN1Ά и активатор ВК-каналов (предпочтительно зонисамид) или модулятор ВК-каналов (предпочтительно метиклотиазид) и модулятор окислительного фосфорилирования (предпочтительно выбирают из амобарбитала и метимазола);

антагонист рецептора эндотелина ΕΌΝΚΆ (предпочтительно сульфизоксазол) и модулятор метаболизма витамина К (предпочтительно цефотетан);

ингибитор натриевого канала δСN1Ά и активатор ВК-каналов (предпочтительно зонисамид) или модулятор ВК-каналов (предпочтительно метиклотиазид) и модулятор метаболизма витамина К (предпочтительно цефотетан);

модулятор активности ОАΒΆ-ергических и глутаматергических рецепторов (предпочтительно выбирают из акампросата, этомидата и априндина) и модулятор РККО1 (предпочтительно эритритила тетранитрат);

ингибитор натриевого канала δСN1Ά и активатор ВК-каналов (предпочтительно зонисамид) или модулятор ВК-каналов (предпочтительно метиклотиазид) и модулятор РККО1 (предпочтительно эритритила тетранитрат);

антагонист рецептора эндотелина ΕΌΝΚΆ (предпочтительно сульфизоксазол) и модулятор РККО1 (предпочтительно эритритила тетранитрат);

модулятор КСШ11 (предпочтительно выбирают из митиглинида и левосимендана) и модулятор РККО1 (предпочтительно эритритила тетранитрат);

модулятор КСШ11 (предпочтительно выбирают из митиглинида и левосимендана) и ингибитор натриевого канала δСN1Ά и активатор ВК-каналов (предпочтительно зонисамид) или модулятор ВК-каналов (предпочтительно метиклотиазид);

модулятор КСШ11 (предпочтительно выбирают из митиглинида и левосимендана) и модулятор ΚΗΟΆ (предпочтительно выбирают из тербинафина и ризедроната).

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретение имеет отношение к комбина- 10 024465 ции соединений, выбранных из аминокапроновой кислоты, акампросата, амлодипина, агратробана, баклофена, цилостазола, цинакалцета, клопидогрела, дифиллина, фенолдопама, лефлуномида, мепакрина, метимазола, фенформина, прилокаина, рифабутина, сульфизоксазола, тадалафила, тербинафина, циннаризина, циклопирокса, эплеренона, карбеноксолона, сулодексида, карбамазина, амобарбитала, цефотетана, эритритила тетранитрата, метиклотиазида, ризедроната, энпрофиллина, окстрифиллина, параметадиона, цефменоксима, априндина, этомидата, митиглинида, беиидипина, левосимендана и зонисамида или их солей или пролекарств или производных или композиций с замедленным высвобождением для применения при лечении болезни Альцгеймера или родственного нарушения.

В отдельном варианте осуществления композиция изобретения для применения при лечении болезни Альцгеймера или родственного нарушения содержит по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из аминокапроновой кислоты, циннаризина, циклопирокса, эплеренона, карбеноксолона, сулодексида, карбамазина, амобарбитала, цефотетана, эритритила тетранитрата, метиклотиазида, ризедроната, энпрофиллина, окстрифиллина, параметадиона, цефменоксима, априндина, этомидата, митиглинида, бенидипина и левосимендана или их соли(ей) или пролекарства(в) или производного(ых) или композиции(й) с замедленным высвобождением в комбинации по меньшей мере с одним соединением, выбранным из группы, состоящей из акампросата, амлодипина, агратробана, баклофена, цилостазола, цинакалцета, клопидогрела, дифиллина, фенолдопама, лефлуномида, мепакрина, метимазола, фенформина, прилокаина, рифабутина, сульфизоксазола, тадалафила, тербинафина и зонисамида или их соли(ей) или пролекарства(в) или производного(ых) или композиции(й) с замедленным высвобождением.

В частности, другой предпочтительный вариант осуществления изобретения имеет отношение к композиции для лечения болезни Альцгеймера (БА) или родственного нарушения у субъекта, нуждающегося в этом, содержащей, по меньшей мере, аминокапроновую кислоту, или ее соль(и), или пролекарство(а), или производное(ые), или композицию(и) с замедленным высвобождением. В отдельном варианте осуществления аминокапроновая кислота используется в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным соединением, предпочтительно выбранным из акампросата, амлодипина, агратробана, баклофена, цилостазола, цинакалцета, клопидогрела, дифиллина, фенолдопама, лефлуномида, мепакрина, метимазола, фенформина, прилокаина, рифабутина, сульфизоксазола, тадалафила, тербинафина, циннаризина, циклопирокса, эплеренона, карбеноксолона, сулодексида, карбамазина, амобарбитала, цефотетана, эритритила тетранитрата, метиклотиазида, ризедроната, энпрофиллина, окстрифиллина, параметадиона, цефменоксима, априндина, этомидата, митиглинида, бенидипина, левосимендана и зонисамида или их солей или пролекарств или производных или композиций с замедленным высвобождением для совместного, отдельного или последовательного введения.

Предпочтительная композиция изобретения содержит аминокапроновую кислоту, или ее соль(и), или пролекарство(а), или производное(ые), или композицию(и) с замедленным высвобождением и по меньшей мере одно дополнительное соединение, выбранное из баклофена, сульфизоксазола, тербинафина и левосимендана, или их солей, или пролекарств, или производных, или композиций с замедленным высвобождением для совместного, отдельного или последовательного введения. Такая композиция сама по себе также представляет отдельную цель изобретения.

Кроме того, изобретение имеет отношение к способу лечения болезни Альцгеймера (БА) или родственного нарушения у субъекта, нуждающегося в этом, включающему введение субъекту эффективного количества аминокапроновой кислоты, или ее соли(ей), или пролекарства(в), или производного(ых), или композиции(ий) с замедленным высвобождением предпочтительно в комбинации, как раскрыто выше.

В частности, другой предпочтительный вариант осуществления изобретения имеет отношение к композиции для лечения болезни Альцгеймера (БА) или родственного нарушения у субъекта, нуждающегося в этом, содержащей, по меньшей мере, левосимендан или его соль(и) или пролекарство(а) или производное(ые) или композицию(ии) с замедленным высвобождением. В отдельном варианте осуществления левосимендан используется в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным соединением, предпочтительно выбранным из числа аминокапроновой кислоты, акампросата, амлодипина, агратробана, баклофена, цилостазола, цинакалцета, клопидогрела, дифиллина, фенолдопама, лефлуномида, мепакрина, метимазола, фенформина, прилокаина, рифабутина, сульфизоксазола, тадалафила, тербинафина, циннаризина, циклопирокса, эплеренона, карбеноксолона, сулодексида, карбамазина, амобарбитала, цефотетана, эритритила тетранитрата, метиклотиазида, ризедроната, энпрофиллина, окстрифиллина, параметадиона, цефменоксима, априндина, этомидата, митиглинида, бенидипина и зонисамида, или их солей или пролекарств или производных или композиций с замедленным высвобождением для совместного, отдельного или последовательного введения.

Предпочтительная композиция изобретения содержит левосимендан, или его соль(и), или пролекарство(а), или производное(ые), или композицию(ии) с замедленным высвобождением и по меньшей мере одно дополнительное соединение, выбранное из числа аминокапроновой кислоты, баклофена, сульфизоксазола и тербинафина, или их солей, или пролекарств, или производных, или композиций с замедленным высвобождением для совместного, отдельного или последовательного введения. Такая композиция сама по себе также представляет отдельную цель изобретения.

Кроме того, изобретение имеет отношение к способу лечения болезни Альцгеймера (БА) или род- 11 024465 ственного нарушения у субъекта, нуждающегося в этом, включающему введение субъекту эффективного количества левосимендана, его соли(ей), или пролекарства(в), или производного(ых), или композиции(ий) с замедленным высвобождением предпочтительно в комбинации, как раскрыто выше.

В частности, другой предпочтительный вариант осуществления изобретения имеет отношение к композиции для лечения болезни Альцгеймера или родственного нарушения у субъекта, нуждающегося в этом, причем композиция содержит, по меньшей мере, эплеренон, карбеноксолон, сулодексид, циннаризин или карбамазин, или их соль(и), или пролекарство(а), или производное(ые), или композицию(ии) с замедленным высвобождением.

В отдельном варианте осуществления эплеренон, карбеноксолон, сулодексид, циннаризин или карбамазин используются в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным соединением, предпочтительно выбранным из левосимендана, аминокапроновой кислоты, акампросата, амлодипина, агратробана, баклофена, цилостазола, цинакалцета, клопидогрела, дифиллина, фенолдопама, лефлуномида, мепакрина, метимазола, фенформина, прилокаина, рифабутина, сульфизоксазола, тадалафила, тербинафина, циннаризина, циклопирокса, эплеренона, карбеноксолона, сулодексида, карбамазина, амобарбитала, цефотетана, эритритила тетранитрата, метиклотиазида, ризедроната, энпрофиллина, окстрифиллина, параметадиона, цефменоксима, априндина, этомидата, митиглинида, бенидипина и зонисамида или их солей или пролекарств или производных или композиций с замедленным высвобождением для совместного, отдельного или последовательного введения.

Предпочтительная композиция изобретения содержит эплеренон, карбеноксолон, сулодексид, циннаризин или карбамазин или их соль(и) или пролекарство(а) или производное(ые) или композицию(ии) с замедленным высвобождением и по меньшей мере одно дополнительное соединение, выбранное из левосимендана, аминокапроновой кислоты, баклофена, сульфизоксазола и тербинафина или их солей или пролекарств или производных или композиций с замедленным высвобождением для совместного, отдельного или последовательного введения. Такая композиция сама по себе также представляет отдельную цель изобретения.

Кроме того, изобретение имеет отношение к способу лечения болезни Альцгеймера (БА) или родственного нарушения у субъекта, нуждающегося в этом, включающему введение субъекту эффективного количества эплеренона, карбеноксолона, сулодексида, циннаризина или карбамазина, или их соли(ей), или пролекарства(в), или производного(ых), или композиции(ий) с замедленным высвобождением предпочтительно в комбинации, как раскрыто выше.

Более предпочтительно композиция изобретения для комбинированного лечения болезни Альцгеймера (БА) или родственного нарушения у субъекта, нуждающегося в этом, содержит по меньшей мере одну из следующих лекарственных комбинаций для совместного, отдельного или последовательного введения:

фенформин и зонисамид;

фенформин и метиклотиазид;

феиформин и акампросат;

фенформин и сульфизоксазол;

баклофен и аминокапроновая кислота;

баклофен и левосимендан;

баклофен и тербинафин;

баклофен и ризедронат;

баклофен и сульфизоксазол;

баклофен и зонисамид;

баклофен и метиклотиазид;

баклофен и сульфизоксазол;

баклофен и лефлуномид;

амииокапроиовая кислота и сульфизоксазол;

аминокапроновая кислота и тербинафин;

аминокапроновая кислота и левосимендан;

левосимендан и сульфизоксазол;

левосимендан и тербинафин;

зонисамид и дифиллин;

метиклотиазид и дифиллин;

зонисамид и прилокаин;

метиклотиазид и прилокаин;

зонисамид и сульфизоксазол;

фенформин и клопидогрел;

акампросат и цинакалцет;

сульфизоксазол и цинакалцет;

тербинафин и агратробан;

тербинафин и цефменоксим;

- 12 024465 баклофен и клопидогрел;

тербинафин и клопидогрел;

ризедронат и клопидогрел;

зонисамид и циннаризин;

акампросат и эритритила тетранитрат;

сульфизоксазол и эритритила тетранитрат;

митиглинид или левосимендан и эритритила тетранитрат;

митиглинид или левосимендан и зонисамид;

митиглинид или левосимендан и тербинафин;

митиглинид или левосимендан и ризедронат;

митиглинид или левосимендан и метиклотиазид;

метиклотиазид или зонисамид и сульфизоксазол;

тербинафин или ризедронат и сульфизоксазол;

тербинафин или ризедронат и мепакрин;

тербинафин или ризедронат и акампросат;

тербинафин или ризедронат и рифабутин;

тадалафил или энпрофиллин или окстрифиллин и фенформин;

зонисамид или метиклотиазид и агратробан или цефменоксим;

ризедронат и агратробан или цефменоксим;

зонисамид или метиклотиазид и циннаризин или бенидипин или параметадион или амлодипин; акампросат и циннаризин или бенидипин или параметадион или амлодипин; зонисамид или метиклотиазид и циклопирокс;

сульфизоксазол и амобарбитал; зонисамид или метиклотиазид и амобарбитал; сульфизоксазол и цефотетан;

зонисамид или метиклотиазид и цефотетан; зонисамид или метиклотиазид и эритритила тетранитрат.

Конкретные примеры предпочтительных композиций изобретения включают одну из следующих лекарственных комбинаций для совместного, отдельного или последовательного введения:

баклофен и аминокапроновая кислота; баклофен и левосимендан; аминокапроновая кислота и сульфизоксазол; аминокапроновая кислота и тербинафин; аминокапроновая кислота и левосимендан; левосимендан и сульфизоксазол; левосимендан и тербинафин; эплеренон и левосимендан; эплеренон и сульфизоксазол; эплеренон и фенолдопам; сулодексид и левосимендан; сулодексид и сульфизоксазол; сулодексид и фенолдопам или эплеренон и сулодексид.

Как показано в экспериментальной части, композиции, содержащие, по меньшей мере, аминокапроновую кислоту или левосимендан обеспечивают значительный терапевтический или биологический эффект для того, чтобы улучшить состояние при болезни Альцгеймера у людей. Эти композиции эффективно предотвращают токсическое действие амилоидного Р-белка или пептида на человеческие клетки и представляют собой новые и эффективные способы лечения такого нарушения.

В другом предпочтительном варианте осуществления композиции согласно изобретению содержат комбинацию по меньшей мереиз трех соединений, или их солей, или пролекарств, или производных любой степени очистки, или композиций с замедленным высвобождением для совместного, отдельного или последовательного введения с целью комбинированного лечения болезни Альцгеймера (БА) или родственного нарушения у субъекта, нуждающегося в этом.

Терапевтические подходы согласно изобретению могут использовать лекарственные средства по отдельности или лекарственные комбинации в сочетании с любым другим видом лечения, нацеленным на тот же самый путь или имеющим особый механизм действия.

В отдельных вариантах осуществления композиции настоящего изобретения могут дополнительно содержать лекарственное средство или лекарственные средства, которые уже существуют или могут быть разработаны, связывающиеся с белком или модулирующие активность белка, кодируемого геном, выбранным из числа

- 13 024465

АВАТ, АВСА1, АВИ, АВЫ, АСАТ, АСС2, ΑΟΟΝΙ, АОАМТ312, ΑϋΟΥ2, ΑϋΙΡΟΟ,

ΑΟΙΡΟΕ1/Ε2, АООЕА1/2А/2В, ΑϋΚΑΙΛ/2, ΑϋΕΒΙ/2, АОРАТ5, АПЧ, АКАР2, АКЕ1С2,

АКТ, АЬОН2, АЬОХ12, АБОХ5, ΑΝΟ2, ΑΝΚ1, ΑΝΚΕΑ, ΑΝΧΑ1, АРВА1, АРВА2ВР,

АРОА1, АРОЕЕ2, АЕНОАР17, АЕНОАР26, АТО5/7/12, АТМ, АТР10А, АТР1А1,

АТР2АЗ, АТР2В1, АТР6У1С1, АТЕ, ΑϋΗ, ВАСВ1, ВАО, ΒΑΙ3, ΒΑ55ΟΟΝ, ВАХ, ВСАК.1,

ВСЕ2, ΒϋΝΡ, ВЕСЫЫ1, ΒΙΝ1, ВК-каналы (Κ0ΝΜΑ1, ΚΟΝΜΒΙ), ВМРЗА, ВЕСА1, СА10, САСНА1С/2ОЗ/2О4, САБР32, САЬМ1-5 (кальмодулин), САМКЮ, САМКК2, САЗК,

САЗЕ, САЗТ, СВЕ, СО36, СБ44, СБС2, СБС42, СОС42ВРВ, СОС42ЕРЗ, СОН1/2/13,

СОК5, ΟΟΚΝ1Α, СНАТ, СНК1, СНЕМ1-5, СНЕКА1-7/9/10, С1Т (цитрон), СК1, ΟΝΟΒ3,

СЯТРЕ, СОЬ4А2. СРТ, СЕАМ, СЕЕВ, СЕМР, С8Н1, 0ΤΝΝΑ2, ΟΤΝΝΒ1, СТТО (кортактин), СиВЫ, СШ,ЕШ1, СУР7В1, СУЗЕТЕ1/Е2, ϋΑΒΙ, ЭСС, ОЕРОС2, ΌΟΚΒ/Η/Ζ,

ОНСЕ7, ϋΗΡΚ, ϋΙΌ2/4, ΩΝΑ1Β9, ООСКЗ, ОЕО2/5, ϋΥΝΙ/3, ЕОС1-8, ΕΟΝ1/2,

ΕϋΝΕΑ/Β, ΕΡΝΑ 1/2/4/5/7 (эфрии Α), ΕΡΝΒ 1/2/3 (эфрин В), ΕΗΗΑϋΗ, ЕЬАУЬг, ΕΝΡΡ2 (аутотаксин), ΕΝΡΡ6, ЕРНАЗ, ЕРНВЕ1/2/3/4/6, ЕЕВВ2/4, ЕЕК1/2, ЕЗЕЕО, ΕΤΡΑ, ΕΖΕ, Р2,

Р2Е, РАЗ, ΡΌΡ3, РЕЗ, РОР1/2 , РКВР12/12.6, Р124А, РЬТ1 (УЕСРЕ1), РЬТ4, РОХ01/ЗА,

РЕАР (МТОЕ), РТО, ΡΥΝ, ΡΖ2, ОАВВЕ1/2, ОАВЕА2/О2, ΟΑϋΟ45, ОАТ1, ОАТАЗ, СН1,

О1РС1/2, ОЕЕА1, ОШО1, ΟΝΑ12/13, ΟΝΡΤΑΒ, ОРС5, ΟΡΗΝ (гефирин), ΟΕΙΑ2/3,

ОЕГО1/2, ΟΕΙΚ1/2, ΟΕΙΝ2Β/3Α, ОЕ1Р1/2, ОЕК2/5, ОЕМЗ/5/6/7/8, ОЕР170, ОЗКЗВ,

ΗΑΡΕΝ1, НА81-3, НСЕТЕ2, ΗΙΡ1Α, ΗΙΡΚ2, НК2, НМ0Х1, НОМЕЕ1/2/3, НЗО11В1,

Н8Р90В1, НЗРА5, НТЕ1А/1В/Ю, НУАЫ/2/3, ЮЕ, Ю20ЕА/В, Ю63Т, 1Ь8, ΙΜΡΟΗ1/2, ΙΝ3,

ΙΝ3Κ, ΙΕΡ1, ΙΤΒ1, ΙΤΟΑ1/6, ΙΤΟΒ1, ΙΤΡΕ1, ЛЕК1, ΚΑΕΕΝ (калирин), КСК'А2/О2, Κ0ΝΗ2,

ΚΟΝΙΡ1/2, КСШ11, КСРШ2, КСК’В, Κ0ΝΜΑ1, КСЫМВ1-4, КОЕ (УЕОРЕ2), ΚΤΝ1,

ΚΥΝυ, ЬАМА1, ЬОЬЕ, ЬЕР (ЬЕРТГЫ), ЬЕРЕ, ЫРЕ, ЫЮА/В/С (УЕЫ1/2/3), ЦР1-2,

ЬКВ1, ЬЕР1, ЕЕЕ2 (мегалии), ЕТВР2, ЬУЯ, ΜΑΟ1ΕΙ, МАМБЗ, МАОА/В, МАТ2В,

МСС1, ΜϋΜΙ, МЕ1, МЕТ, МОЗТ2, ΜΙΝΤ1, ΜΙΧΤ4 (афадин), ММР2, ММР9, Μ0Ε31Ν,

МТЕ, мис1, ΜυΝΟ13/18Α, ΜΥ06, ΜΥΟΕ, ΝΑϋΡΗ оксидаза, ΝΑνί, ΝΒΕΑ, Ν0ΑΜ1,

Ν0Κ1/2, ΝΕΟ 09, ΝΡ2 (мерлин), ΝΡΚΒ1, ΝΡΚΒΙΒ, ΝΟΕΡ (эфексин), ΝΟΡ, ΝΟΡΕ, ΝΗΕΕΡ,

ΝΠ16, ΝΟ3Ν1, N002, ΝΟ31/2Α/3, ΝΟΤΟΗ1/2/3, ΝΡ01/2, ΝΡΙ5Τ, ΝΕ1Ι2, ΝΕ301, ΝΕ3Ο2,

ΝΕ01/3, ΝΕΡ1/2, ΝΕΧ3, ΝΤΡ3/5, ΝΤΝ1 (нетрин 1), ΝΤΕΚ2 (ТЕКВ), ΝΨΑ3Ρ, ОРСМЬ,

0РЕК1, ОРЕМ, 0РЕ31, ОЗВРЬЗ/Ю, Ρ2ΕΥ1, Ρ2ΕΥ 12, РАБЬЕ, ΡΑΙ1/2, РАК1/6/7, РАЬЕО,

РАР1, РАЕК2, РС, РСАР, РСТР, ΡϋΕΙΙΑ, ΡϋΕΙΑ, РОЕЗА/ЗВ, ΡΟΕ4Α/4Β/4ϋ, ΡΏΕ5Α,

РБЕ60, ΡϋΟΡΑ/Β, ΡϋΟΡΕΑ/Β, ΡΙ3Κ, ΡΙΑ31, РЮАЬМ, Р1СК1, Р1КЗСЗ, ΡΙΡ5Κ, ΡΙΤΡΝ01,

РКСА, РКСО, РЬА1А/2, РЕАТ, ΡΕΑϋ, РЕСВ1, ΡΙΟ1/2, РЬЕХА1, РЬО, РЬК1, РЬХ0С2,

РМЬ, Р0Р2, РРАЕА, РРАКО, РРАЕО, РРАЕОС1В, ΡΡΡΙΒΡ1, РРР1СА, РРРЗСА (кальциневрин), РЕОХ5/6, РЕКАА (АМРК), РЕКАСА, РЕКО1, РЕЕ, РТОЕЕ1, РТОРЕ,

РТО82, ΡΤΝ, РТР1В, ΡΤΡΝ11, РТРЕР, РТРЕО, РТРЕМ, РУЕЫ, ΡΧΝ (паксиллин), ΡΥΚ2,

КАВЗВ, ЕАС1, ЕАСК1, ЕАР1, ЕАЗОЕР2, КВР/1, КОХ (радиксин), ЕЕЬХ, ΕΟΝΕΡ, ЕНЕВ,

ЕНОА, ЕНОС, ΚΙΜ2, ΒΙΜ51/2, Е0В02, Е0СК1/2, Е0Е2, ЕРНЗА (рабфилин), КРНЗАЬ,

КР56КА1, ЕР36КВ2, ΕΙΝ1, КХЕ/КАЕ, ΕΥΕ3, 8АСМ1Б, ЗАРАР, ЗАРКЗ, 8САЕВ1,

5СН1Р1, 80Ν1Α/1Β, 30ΝΝ1Ο/1Ο, ЗЕС24О, 5ЕМАЗА/ЗС/ЗЕ/4С, ЗОРР2, ЗНЗВР5, 8ΙΑΗ1Α,

81Ы, 8БС12А1/2/5, ЗЬС1А2, 5ЬС25А21, ЗЬС6А1/А18, ЗЕС8А1/А2/АЗ, ЗЬС9А1, ЗЫТ1,

ЗЕК, ЗМАйЗ/4, 3ΝΑΡ25, 5Ν0Α, 3Ν0ΑΙΡ, 30ЕВ32, 30ЕС32, ЙРЕД2, ЗР0СК1, ЗРР1 (остеопонтин), ЗЕС, ЗЕО5А1, ЗЕЕВР1/Р2, 8ЕОАРЗ, ЗТАТЗ, ЗТХ1А/2 (синтаксины),

ЗТХВР6, ЗиМ1, 5У2С, 3ΥΝ1, 5ΥΝΠ/2 (синаптоянин), 8ΥΤ12, ЗУТЬ4 (грануфилин),

ТАСЕ, ТАСЕ1, ТВЕ1, ТВХА2Е, ТОРВЕ1/Е2/КЗ, ТНВ81/2, ТНЕМ2, ТНЕА/В, ΤΙΑΜ1,

Т1МР2, ТЫД Т0Р2А, ТР53, ТР63, ТЕЮ, ТЕРСЗ/4/5, ТЗС1/2, ТЗРО, иВЕ2А, иЬК4,

ШС13С, ЦМС5С, УАМР2/5, УСЕ (УПЕСиЫМ), УОАС1, УЕОРА/С, УЕСРЕ1, УМАТ,

УР315,1УАЗР1Р, У/АУЕ, ΨΝΤ1Α/5Α, ΨΨΟΧ, ΧΑΝΤΗΙΝΕ ОХГОАЗЕ, ΥΑΡ и ΥΕ31.

Последовательности всех вышеперечисленных генов и белков имеются в библиотеках генов и могут быть выделены с помощью известных в данной области техники методов. Αктивность этих генов и

- 14 024465 белков также можно оценить с помощью методов, известных в данной области техники.

Изобретение также описывает дополнительные лекарственные средства, которые могут использоваться для модулирования генов-мишеней и белков. Авторы изобретения установили конкретные лекарственные средства, которые по отдельности или в комбинации(ях) модулируют описанные выше пути и могут использоваться для лечения болезни Альцгеймера или родственных нарушений.

В предпочтительном варианте осуществления композиции изобретения могут дополнительно содержать по меньшей мере одно лекарственное средство, выбранное из числа ингибитора АВАТ, (предпочтительно вигабатрин), и/или ингибитора АВЬ1 (предпочтительно иматиниб), и/или ингибитора АСАТ (предпочтительно гесперитин), и/или модулятора АОСУ2 (предпочтительно видарабин), и/или модулятора аденозиновых рецепторов ΑΌΘΚΑ1/2Α/3 (предпочтительно выбирают из клофарабина и дефибротида), и/или модулятора адренергических рецепторов ΑΌΚΑ (предпочтительно выбирают из проперизиазина, метотримепразина, мефентермина и дипивефрина), и/или модулятора адренергических АЭКВ рецепторов (предпочтительно выбирают из гуанетидина, бетанидина, битолтерола и прокатерола), и/или ингибитора АБОХ5/12 (предпочтительно выбирают из диэтилкарбамазина и мазопросола), и/или ингибитора АТР1А1 (предпочтительно десланозид и омепразол), и/или активатора аутофагии (предпочтительно трегалоза), и/или ингибитора СА10 (предпочтительно метазоламид), и/или модулятора кальцификации (предпочтительно выбирают из фоскарнета, нитрата галлия, кальцифедиола, кальцитонина, кальцитриола, клодроновой кислоты, дигидротахистерола, элкатонина, этидроновой кислоты, иприфлавона и терипаратида ацетата), и/или модулятора САЬМ1 (кальмодулин) (предпочтительно априндин), и/или модулятора СЭ44 (предпочтительно выбирают из эфлорнитина и бензбромарона), и/или химического шаперона (предпочтительно выбирают из арабитола и маннитола), и/или модулятора мускариновых рецепторе СНРМ (предпочтительно выбирают из циклопентолата, оксифенциклимина, троспия и изофлурофата), и/или антагониста никотиновых ацетилхолиновых СНКЫА рецепторов, который не способен проникать через гемато-энцефалический барьер, (предпочтительно выбирают из панкурония, пипекурония, рапакурония, рокурония, сукцинилхолина, векурония, атракурия, цисатракурия, доксакурия, мекамиламина, метокурина, мивакурия и неомицина), и/или ингибитора СЫСВ3 (предпочтительно амилорид), и/или модулятора СУ8ЬТК1/2, РТСЕК1, РТСРК и ТВХА2К эйкозаноидных рецепторов (предпочтительно выбирают из травопроста, монтелукаста, циналукаста, амлексанокса, карбопроста трометамина, биматопроста и ридогрела), и/или ингибитора ΌΗΡΚ (предпочтительно пириметамин и триамтерен), и/или модулятора допаминового рецептора ΌΚΌ2 (предпочтительно выбирают из дигидроэрготамина и каберголина), и/или агониста допаминового рецептора ΌΡΌ5 (предпочтительно фенолдопам), и/или ингибитора ЕОИКА (предпочтительно выбирают из сульфаметоксазола и гентамицина), и/или модулятора ΕΝΡΡ2 (аутотаксин) (предпочтительно Ь-гистидин), и/или ингибитора ЕКВВ2 (предпочтительно лапатиниб), и/или модулятора тромбина Ρ2 (предпочтительно выбирают из сулодексида, ксимелагатрана, варфарина, фенпрокоумона, эноксапарина, ардепарина, фондапаринукса, латамоксефа, бацитрацина, тиклопидина и эрдостеииа), и/или ингибитора ΡΌΡδ (предпочтительно алендронат), и/или модулятора САВКА2 (предпочтительно выбирают из фенобарбитала, метогекситала, цефотиама, клометиазола, тиопентала, лубипростона и азтреонама), и/или антагониста СК1К1 (предпочтительно топирамат), и/или модулятора С8К3В активности (предпочтительно выбирают из альбутерола и метараминола), и/или модулятора сигнального пути Н1Р1А (предпочтительно выбирают из мелоксикама, топотекана, дефероксамина, усниновой кислоты, гидралазина, деферипрона, дибензоилметана, авобензона, динопростона, эпопростенола, 2-оксоглутарата и мимозина), и/или ингибитора НК2 (гексокиназа II) (предпочтительно выбирают из хинина, габексата, бифоназола и клотримазола), и/или модулятора НМОХ1 (предпочтительно выбирают из ауранофина, гематина/гемина и гем аргината), и/или модулятора рецепторов ΗΤΚ.1Β/1Ό (предпочтительно выбирают из эрготамина и элетрипана), и/или ингибитора ΙΜΡΌΗ1 и ΙΜΡΌΗ2 (предпочтительно тиогуанина), и/или модулятора интегринов 1ТСА/В (предпочтительно рабепразол), и/или ингибитора Κί'.'ΝΌ2 калиевого канала (предпочтительно лидокаин), и/или ингибитора КСNΗ2 калиевого канала (предпочтительно ибутилид), и/или модулятора КСNΜΑ1 (предпочтительно выбирают из кромогликата, этинамата, кетоконазола, хлорзоксазона, унопростона, гесперитина, бендрофлуметиазида, бензтиазида, хлортиазида, циклотиазида, диазоксида, гидрофлуметиазида, квинетазона и тризлорметиазида), и/или модулятора МС8Т2 (предпочтительно балсалазид), и/или модулятора ММР2 и ММР9 (предпочтительно кандоксатрил), и/или модулятора изменения проницаемости митохондриальных пор (предпочтительно выбирают из карбеноксолона и ципрофлоксацина), и/или ингибитора МТОК (предпочтительно рапамицин), и/или модулятора ЫО81/2А/3 (предпочтительно выбирают из пропилтиоурацила, тиэтилперазина и кетотифена), и/или модулятора сигнального пути рецептора ΝΡ3ί'.Ί (предпочтительно выбирают из метирапона и мометазона), и/или модулятора рецептора МК3С2 (предпочтительно выбирают из эплеренона и флудрокотизона), и/или ингибитора ΝΡΡ2 (предпочтительно пегаптаниб), и/или модулятора ОРСМЬ (предпочтительно алфентанил), и/или модулятора ΟΡΚΚ1 и ΟΡΚΞ1 (предпочтительно выбирают из бупренорфина и пентазоцина), и/или ΟΡΚΜ (предпочтительно леваллорфан), и/или модулятора окислительного фосфорилирования (предпочтительно выбирают из алмитрина, эритромицина, канамицина и церуленина), и/или ингибитора рецепторов Ρ2ΚΥ1 и/или Ρ2ΚΥ12 (предпочтительно тирофибан), и/или ингибитора Ρ^Ε11Α, Ρ^Ε4Α и ΡΌΕ.^ фосфодиэстераз (предпочтительно выбирают из ме- 15 024465 зембрина, милринона и анагрелида), и/или ингибитора ΡΌΕ3Ά/3Β и ΡΌΕ4Ά/4Β фосфодиэстераз и активатора ΒΚ-каналов (предпочтительно цилостазол), и/или модулятора рецепторов ΡΌΟΡΚΛ/Β (предпочтительно выбирают из бекаплермина, стрептомицина, делфинидина, цианидина и фумагиллина), и/или модулятора РЬЛ2 (предпочтительно выбирают из нифлумовой кислоты, гидрокортамата и нетилмицина), и/или модулятора РЬЛТ (предпочтительно натрий фенилбутират), и/или модулятора ΡΕΌ2 (предпочтительно амбрисентан), и/или ингибитора ΡΕΟ (предпочтительно аминокапроновая кислота), и/или модулятора ΡΡΆΚΌ (предпочтительно икозапент), и/или модулятора ΡΡΛΚΟ (предпочтительно фенилбутират), и/или модулятора ΡΚΚΟ1 (предпочтительно выбирают из нитропруссида, нитроглицерина и парикальцитола), и/или ингибитора РТР1В (предпочтительно тилудронат), и/или модулятора ВНОЛ/РЛС (предпочтительно выбирают из хлорталидона, гидрохлортиазида, кломоциклина, лимециклина, натамицин, амфотерицина В, цефалексина, цефалоридина, цефуроксима, диклоксациллина), и/или модулятора ВХВ/ВАВ (предпочтительно тазаротен), и/или антагониста δί'.'Ν1Λ/Β натриевых каналов (предпочтительно фосфенитоин), и/или ингибитора §ЬС12Л1 (предпочтительно буметанид), и/или ингибитора §ЬС6Л1 (предпочтительно тиагабин), и/или модулятора §ЬС9Л1 (предпочтительно буклизин), и/или ингибитора §ВЭ5Л1 (предпочтительно дутастерид), и/или антагониста ТАСВ1 (предпочтительно выбирают из апрепитанта и вапреотида), и/или модулятора ΤΟΡΒ сигнального пути (предпочтительно алискирен), и/или модулятора ТНВА/Β (предпочтительно выбирают из лиотеронина), и/или ингибитора ТОР2А (предпочтительно люкантон), и/или модулятора ΤδΡΟ (предпочтительно выбирают из флунитразепама и темазепама), и/или модулятора УЭАС1 (предпочтительно дигидроксиалюминий), и/или ингибитора УЕСРК1 (предпочтительно сунитиниб), и/или модулятора метаболизма витамина Κ (предпочтительно выбирают из цефметазола, цефамандола и цефоперазона), и/или ингибитора УМАТ (предпочтительно выбирают из тетрабеназина, десерпидина и нитисинона), и/или ингибитора потенциалозависимых кальциевых каналов (САСNА) (предпочтительно выбирают из лерканидипина, прегабалина, мибефрадила, аранидипина, бамидипина, бенциклана, бепридила, клентиазема, эфонидипина, элгодипина, этафенона, фендилина, флунаризина, галлопамила, исрадипина, лацидипина, лидофлазина, ломеризина, манидипина, никардипина, нилвадипина, нимодипина, низолдипина, нитрендипина, пергексилина, прениламина, семотиадила и теродилина), и/или ингибитора ΥΕδ1, §ВС и ЕРНА3 (предпочтительно дазатиниб).

Другие методы лечения, используемые в сочетании с лекарственным средством(ами) или лекарственной комбинацией(ями) согласно настоящему изобретению, могут включать одно или более лекарственных средств, улучшающих симптомы болезни Альцгеймера или лекарственное средство(а), которое может использоваться для паллиативного лечения болезни Альцгеймера. Предпочтительно указанное одно или более лекарственных средств выбирают из 3ΛΡ8. ААВ-001, АВТ-089, АВТ-126, АС-3933, АСС001, ацетаминофена, АΡΡIΤΟΡΕ ΛΌ01, АΡΡIΤΟΡΕ ΛΌ02, альфа-липоевой кислоты, альфа-токоферола, ΛΝ1792, анти-Абета, ЛС\У051, арипипразола, атомоксетина, аторвастатина, АУЕ1625, ΛνΡ-923, ΛΖΌ0328, А2О3480, бапинеузумаба, ΒАΥ94-9172 (ΖΚ 6013443), бифепрунокса, биоперин, ΒΜδ-708163, ΒΡΕ-049653, бриостатина, САП106, целекоксиба, СЕВЕ-110, церебролизина, СНЕ 5074, холина, циркадина, циталопрама, коэнзима С- меди (Соррег), СТ821166, куркумина, СХ516 (ампалекса), СХ717, циклофосфамата, 00^^01, декстроамфетамина, ОНА (докозагексаеновой кислоты), дигоксина, димебона (латрепирдина), дивалпроекса, ΌΜΧΒ-А, донепезила, доксициклина, ЕдЬ 761, ЕНТ 0202 тазолата, ΕΕΝΏ005 (сцилло-инозитола), ЕРАХ 1050ТС, эрголоид мезилата, эпигаллокатехин-галлата, эсциталопрама, эстрадиола, эстрогена, этанерцепта, ΕνΡ-6124, ЕУТ101, экселона, рыбьего жира, ЕК962, флорпирамина Е 18, фолат + витамин В6 + витамин В21, габапентина, галантамина, гемфиброзила, экстрактов Сткдо ЬЬоЬа (например, БСЬ 761 или СР401), улучшенных экстрактов Сткдо ЬЬоЬа (например, богатых активными ингредиентами, или экстрактов с уменьшенным количеством загрязняющих веществ) или лекарственных средств, содержащих экстракты Сткдо ЬЬоЬа (например, танакан или Гинкго Форте), глюкозы, Ь-глютамновой кислоты, С81 136, С81-953, С8К239512, С8К933776А, галоперидола, НЕ0220, хуперзина А, гидрокодон/АРАР, ибупрофена, 1Е^альфа2А, индометацина, инсулина, иммуноглобулина для внутривенного введения, кетасина, лекозотана, леупролида, леводопа, липоевой кислоты, лития, лоразепама, ловостатина, лютеина, ΕΥ2062430 (соланезумаба), ΕΥ2811376, ΕΥ450139, ΕΥ451395, МАВТ5102А, малата, мазитиниба (АВ1010), медроксипрогестерона, мелатонина, ΜΕΜ 1003, ΜΕΜ 3454, мемантина, метиленового синего, метилфенидата, мифепристона, МК0249, МК0677, МК0952, МК0952, МК3328, модафинила, МРС-7869, NΛ^Н. напроксена, нефирацетама, №р(иие КгЪ1 ОЬ (Нептун Криль масло), нерамексана, МС5-15, пластырей №собегт Ραΐαΐι, никотинамида (витамина ВЗ), Шуавоу, ΝΡ031112, Νδ 2330, №А-789, ЖАЮв, оланзапина, омега-3 полиненасыщенных жирных кислот (ΕΡА+^НА), ΟΝΟ-2506ΡΟ, оксибата, Ρаηаx Сиъепд (женьшень), ΡΛΖ-417, ΡΒΤ2, перфеназина, ΡΕ04360365, ΡΕ-04447943, ΡΕ-04494700, фенсерина, фосфатидилсерина, питавастатина, позифена, ΡΡΙ-1019 (ΛΡАN), правастатина, празосина, преднизона, прогестерона, ΡΒΧ-03140, ΡΥΜ50028, кветиапина, В1450, ралоксифена, рамиприла, разагилина, разадина, ресвератрола, рифампицина, рисперидона, ривастигмина, ΒΝ1219, ВО5313534, рофекоксиба, розиглитазона, δа1ν^а ойюшаЪв (шалфей), δΛМ-315, δΛМ-531, δΛМ760, δΒ-742457, селена, сертралина, δСδ-742, симвастатина, δΚ-ΡС-Β70М, соланезумаба, δΒ57667Β, δВА-333, δВА-444, δδΒ180711Θ δΉ01, Т-817МА, такрина, таренфлурбила, тестостерона, трамипросата (3ΛΡδ), тразодона, ТВх0014 (метилтиониний хлорид), триптофана, У950, вальпроата, варениклина, ви- 16 024465 тамина С, витамина Е, ΥΡ4896, ксалипродена, зеаксантин, золпидема и ΖΤ-1 (ΌΕΒΙΘ-9902 §К).

Изобретение также имеет отношение к способу лечения болезни Альцгеймера или родственного нарушения, включающему одновременное, отдельное или последовательное введение субъекту, нуждающемуся в этом, лекарственной комбинации, как описано выше.

Дополнительной целью изобретения является способ лечения болезни Альцгеймера или родственного нарушения, способ, включающий одновременное, отдельное или последовательное введение субъекту, нуждающемуся в этом, лекарственной комбинации, модулирующей функцию синапса, и/или лекарственного средства, модулирующего ангиогенез, и/или лекарственного средства, модулирующего ответ клетки на стресс.

Дополнительная цель изобретения заключается в способе отбора лекарственного средства для основанного на комбинировании лечения болезни Альцгеймера или родственного нарушения, способе, включающем стадию тестирования возможного лекарственного средства в отношении влияния на функцию синапса и/или ангиогенез и/или ответ клетки на стресс и отбора возможного лекарственного средства, улучшающего функцию синапса, уменьшающего дисрегуляцию ангиогенеза и модулирующего ответ клетки на стресс.

В другом варианте осуществления изобретение имеет отношение к способу отбора композиции для лечения болезни Альцгеймера или родственного нарушения, способу, включающему получение комбинации лекарственного средства, модулирующего функцию синапса, и/или лекарственного средства, уменьшающего дисрегуляцию ангиогенеза, и/или лекарственного средства, модулирующего ответ клетки на стресс, для одновременного, отдельного или последовательного введения субъекту, нуждающемуся в этом.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение имеет отношение к способу лечения болезни Альцгеймера или родственного нарушения, причем способ включает одновременное, отдельное или последовательное введение субъекту, нуждающемуся в этом, лекарственного средства, модулирующего функцию синапса, и/или лекарственного средства, уменьшающего дисрегуляцию ангиогенеза, и/или лекарственного средства, модулирующего ответ клетки на стресс.

Композиции изобретения можно вводить субъекту неоднократно.

Как правило, композиции изобретения содержат один или несколько фармацевтически приемлемых носителей или эксципиентов. Продолжительность лечения зависит от стадии болезни, которую нужно лечить, используемой композиции, возраста и состояния пациента, и того, как пациент отвечает на лечение. Дозировку, частоту и способ введения каждого компонента комбинации можно контролировать независимо. Например, одно лекарственное средство может быть введено перорально, тогда как второе лекарственное средство может быть введено внутримышечно. Комбинированное лечение можно проводить периодическими циклами, которые включают периоды отдыха, так что организм пациента имеет возможность восстановиться от каких-либо пока непредвиденных побочных действий. Лекарственные средства могут быть заключены в состав все вместе, так что одно введение доставляет все лекарственные средства.

Введение каждого лекарственного средства комбинации можно осуществить любыми подходящими способами, дающими в результате концентрацию лекарственного средства, которая в сочетании с другим компонентом способна исправить функционирование путей, связанных с БА.

Несмотря на то что возможно введение активных ингредиентов комбинации в виде чистого химического вещества, предпочтительным является предоставлять их в виде фармацевтической композиции, в этом контексте также называемой фармацевтическим составом. Возможные композиции включают композиции, пригодные для перорального ректального, местного (включая чрескожное, защечное и подъязычное) или парентерального (включая подкожное, внутримышечное, внутривенное и внутрикожное) введения.

В большинстве случаев эти фармацевтические композиции назначаются пациенту в виде упаковок для пациента, содержащих некоторое количество дозаторов или других приспособлений для введения отмеренных однократных доз для использования в течение отдельного периода лечения в единой упаковке, обычно в блистерной упаковке. Упаковка для пациента имеет преимущество по сравнению с традиционными назначениями, при которых фармацевт отделяет от крупной партии предназначенную для пациента долю фармацевтического препарата, заключающееся в том, что у пациента всегда есть доступ к листку-вкладышу, содержащемуся в упаковке для пациента, который обычно отсутствует при традиционных назначениях. Показано, что включение листка-вкладыша улучшает согласие пациента с инструкциями врача. Таким образом, изобретение дополнительно включает фармацевтическую композицию, как описано выше, в комбинации с упаковочным материалом, пригодным для указанных композиций. В таких упаковках о предусмотренном применении композиции для комбинированного лечения можно судить по инструкциям, приспособлениям, устройствам и/или другим средствам, помогающим использовать композицию наиболее соответствующим для лечения образом. В частности, такие меры делают упаковку подходящей и приспособленной для лечения с помощью комбинации настоящего изобретения.

Лекарственное средство может содержаться в любом подходящем количестве в любом пригодном носителе и может присутствовать в количестве 1-99% по весу от общего веса композиции. Композиция

- 17 024465 может быть предоставлена в лекарственной форме, пригодной для перорального, парентерального (например, внутривенного, внутримышечного), ректального, кожного, назального, вагинального, ингаляционного введения, введения с помощью накожных пластырей или окулярного способа введения. Таким образом, композиция может иметь форму таблеток, капсул, пилюль, порошков, гранул, суспензий, эмульсий, растворов, гелей, включая гидрогели, паст, мазей, кремов, пластырей, пропиток, осмотических средств доставки, суппозиториев, клизм, инъецируемых составов, имплантов, спреев или аэрозолей.

Фармацевтические композиции могут быть созданы в соответствии с обычной фармацевтической практикой (см., например, Кетт§1оп: ТНс 8с1еисе и РгасНсе о£ РНагтасу (20ΐΗ ей.), ей. А.К. Оеииаго, ЫрρίηοοΙΙ ^ННатк & ХУПкиъ, 2000 и Епсус1ореЙ1а о£ РНагтасеиНса1 ТесНпо1оду, еЙ8. 1. 8\\агЬпск и ЕС. Воу1ап, 1988-1999, Магсе1 Эеккег, Ыете Уогк).

Фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть созданы так, чтобы высвобождать активное лекарственное средство практически сразу же после введения или в заранее определенное время или период времени после введения.

Композиции с контролируемым высвобождением включают (ί) композиции, создающие практически постоянную концентрацию лекарственного средства в организме в течение продолжительного периода времени; (ίί) композиции, после определенного времени задержки создающие практически постоянную концентрацию лекарственного средства в организме в течение продолжительного периода времени; (ίίί) композиции, поддерживающие действие лекарственного средства в течение предопределенного периода времени путем сохранения относительно постоянного эффективного уровня лекарственного средства в организме с одновременным сведением к минимуму нежелательных побочных эффектов, связанных с изменениями уровня активного лекарственного средства в плазме; (ίν) композиции, пространственно ограничивающие действие лекарственного средства, например, путем размещения композиции с контролируемым высвобождением рядом с или в желательной ткани или органе; и (ν) композиции, нацеливающие действие лекарственного средства с помощью носителей или химических производных для доставки лекарственного средства в конкретный тип клеток-мишеней.

Введение лекарственных средств в виде композиции с контролируемым высвобождением является особенно предпочтительным в тех случаях, когда лекарственное средство (или отдельно или в комбинации) имеет (ί) низкий терапевтический индекс, то есть, различие между концентрацией в плазме, приводящей к вредным побочным действиям или токсическим реакциям, и концентрацией в плазме, дающей терапевтический эффект, является небольшим; в общем, терапевтический индекс, Т1, определяется как отношение средней летальной дозы (ΕΌ50) к средней эффективной дозе (ΕΌ50)); (ίί) узкое окно абсорбции (всасывания) в желудочно-кишечном тракте; или (ίίί) очень короткий биологический период полувыведения, при котором является необходимым частое дозирование в течение дня для поддержания концентрации в плазме на терапевтическом уровне.

Из целого ряда стратегий может быть осуществлена любая для того, чтобы получить контролируемое высвобождение, при котором скорость высвобождения превосходит скорость метаболизма рассматриваемого лекарственного средства. Контролируемое высвобождение можно получить с помощью правильного выбора различных характеристик композиции и ингредиентов, включая, например, разные типы композиций и покрытий с контролируемым высвобождением. Таким образом, лекарственное средство вместе с подходящими эксципиентами (вспомогательными веществами) заключается в состав фармацевтической композиции, которая после введения высвобождает лекарственное средство контролируемым образом (композиции для отдельных таблеток или групповых упаковок или композиции для капсул, масляные растворы, суспензии, эмульсии, микрокапсулы, микросферы, наночастицы, пластыри и липосомы).

Твердые лекарственные формы для перорального применения.

Композиции для перорального применения включают таблетки, содержащие активный ингредиент(ы) в смеси с нетоксичными фармацевтически приемлемыми эксципиентами. Эти эксципиенты, например, могут быть инертными разбавителями или наполнителями (например, сахароза, микрокристаллическая целлюлоза, крахмалы, включая картофельный крахмал, карбонат кальция, хлорид натрия, фосфат кальция, сульфат кальция или фосфат натрия); гранулирующими средствами и средствами для улучшения распадаемости таблеток (например, производные целлюлозы, включая микрокристаллическую целлюлозу, крахмалы, включая картофельный крахмал, кросскармелозу натрия, альгинаты или альгиновую кислоту); связывающие вещества (например, гуммиарабик, альгиновая кислота, альгинат натрия, желатин, крахмал, предварительно желатинизированный крахмал, микрокристаллическая целлюлоза, натрий карбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, гидроксипропил метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, поливинилпирролидон или полиэтиленгликоль) и смазывающие вещества, способствующие скольжению вещества и антиклеящие вещества (например, стеариновая кислота, диоксид кремния или тальк). Другие фармацевтически приемлемые эксципиенты могут быть красителями, ароматизирующими веществами, мягчителями, увлажняющими веществами, буферными веществами и т.п.

Таблетки могут быть непокрытыми или они могут быть покрыты с помощью известных методов, необязательно, чтобы задерживать распад и абсорбцию в желудочно-кишечном тракте, таким образом обеспечивая пролонгированное действие в течение более продолжительного периода. Покрытие может

- 18 024465 быть приспособлено для высвобождения активного лекарственного вещества по предопределенной схеме (например, для того, чтобы достичь контролируемого высвобождения композиции) или оно может быть приспособлено так, чтобы высвобождать активное лекарственное вещество только после прохождения желудка (энтеросолюбильное покрытие). Покрытие может представлять собой покрытие из сахара, пленочное покрытие (например, на основе гидроксипропил метилцеллюлозы, метилцеллюлозы, метилгидроксиэтилцеллюлозы, гидроксипропил-целлюлозы, карбоксиметилцеллюлозы, акрилатсополимеров, полиэтиленгликолей и/или поливинилпирролидона) или энтеросолюбильное покрытие (например, на основе сополимера метакриловой кислоты, ацетатфталатцеллюлозы, фталат гидроксипропил метилцеллюлозы, гидроксипропил метилцеллюлозы ацетат сукцината, поливинил ацетатфталата, шеллака и/или этилцеллюлозы). Может использоваться материал, вызывающий задержку высвобождения по времени такой как, например, глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат.

Твердые таблетированные композиции могут включать покрытие, приспособленное для защиты композиции от нежелательных химических изменений, (например, химической деградации до высвобождения активного лекарственного вещества). Подобным образом покрытие может быть нанесено на твердую лекарственную форму, как описано в Εηсус1ορеά^а ο£ ΡЬа^тасеиί^са1 ТесНгю^ду.

Несколько лекарственных средств может быть смешано вместе в таблетке или может быть разделено. Например, первое лекарственное средство содержится во внутренней части таблетки, а второе лекарственное средство - на внешней стороне, так что существенная часть второго лекарственного средства высвобождается до высвобождения первого лекарственного средства.

Рецептуры для перорального применения также можно приготовить в виде жевательных таблеток или твердых желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с инертным твердым разбавителем (например, картофельным крахмалом, микрокристаллической целлюлозой, карбонатом кальция, фосфатом кальция или каолином) или в виде мягких желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с водой или масляной средой, например, жидким парафином или оливковым маслом. Порошки и гранулы можно приготовить с использованием ингредиентов, упомянутых выше для таблеток и капсул, традиционным способом.

Например, композиции для перорального применения с контролируемым высвобождением могут быть созданы так, чтобы высвобождение активного лекарственного средства контролировалось растворением и/или диффузией активного лекарственного вещества.

Высвобождение, контролируемое растворением или диффузией, может быть достигнуто с помощью соответствующего покрытия композиций лекарственных средств в виде таблеток, капсул, пилюль или гранул, или путем включения лекарственного средства в подходящую матрицу. Покрытие с контролируемым высвобождением может включать одно или более из веществ для покрытия, упомянутых выше, и/или, например, шеллак, воск, гликосмолу, гидрированное касторовое масло, карнаубский воск, стеариловый спирт, глицерил моностеарат, глицерил дистеарат, глицерин пальмитостеарат, этилцеллюлозу, акриловые смолы, άΐ-полимолочную кислоту, ацетат бутират целлюлозу, поливинилхлорид, поливинилацетат, винилпирролидон, полиэтилен, полиметакрилат, метилметакрилат, 2-гидроксиметакрилат, метакрилатные гидрогели, 1,3 бутиленгликоль, этиленгликоль метакрилат и/или полиэтиленгликоли. В композиции с контролирующей высвобождение матрицей материал матрицы может также включать, например, гидратированную метилцеллюлозу, карнаубский воск и стеариловый спирт, карбопол 934, силикон, глицерил тристеарат, метилакрилат-метилметакрилат, поливинилхлорид, полиэтилен и/или галогенированный фторуглерод.

Композиции с контролируемым высвобождением, содержащие одно или более лекарственных средств из заявленных комбинаций также могут иметь форму плавучих таблеток или капсул (т.е. таблетки или капсулы, которая после перорального приема плавает сверху содержимого желудка в течение определенного периода времени). Плавучие таблетки из лекарственного средства(в) могут быть приготовлены с помощью гранулирования смеси лекарственного средства(в) с эксципиентами и 20-75% об./об. гидроколлоидов, таких как гидроксиэтилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза или гидроксипропилметилцеллюлоза. Затем полученные гранулы могут быть спрессованы в таблетки. При контакте с желудочным соком таблетка образует практически водонепроницаемый гелевый барьер вокруг своей поверхности. Этот гелевый барьер участвует в сохранении меньшей плотности, чем плотность желудочного сока, что дает возможность таблетке оставаться плавающей в нем.

Жидкости для перорального введения.

Порошки, диспергируемые порошки или гранулы, пригодные для приготовления водной суспензии путем добавления воды, являются удобными лекарственными формами для перорального применения. Композиции в виде суспензий предоставляют активный ингредиент в смеси с диспергирующим или увлажняющим веществом, суспендирующим веществом и одним или более консервирующими веществами. Подходящими суспендирующими веществами являются, например, натрий карбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, альгинат натрия и т.п.

Парентеральные композиции.

Фармацевтическая композиция также может быть введена парентерально с помощью инъекции, инфузии (вливания) или имплантации (внутривенной, внутримышечной, подкожной и т.п.) в виде лекар- 19 024465 ственных форм, композиций или с помощью подходящих устройств для доставки или имплантов, содержащих общепринятые, нетоксичные фармацевтически приемлемые носители и адъюванты. Состав и приготовление таких композиций хорошо известны специалистам в данной области техники.

Композиции для парентерального применения могут предоставляться в стандартных лекарственных формах (например, в ампулах с одной дозой) или во флаконах, содержащих несколько доз, в которые может быть добавлено подходящее консервирующее вещество (смотри ниже). Композиция может быть в виде раствора, суспензии, эмульсии, устройства для инфузии или имплантируемого устройства для доставки или она может быть представлена в виде сухого порошка, который необходимо разбавлять водой или другим подходящим носителем перед применением. Помимо активного лекарственного средства(средств) композиция может включать подходящие парентерально приемлемые носители и/или эксципиенты. Активное лекарственное средство(а) может быть заключено в микросферы, микрокапсулы, наночастицы, липосомы или т.п. для контролируемого высвобождения. Композиция может включать суспендирующие, повышающие растворимость, стабилизирующие вещества, средства, регулирующие рН, и/или диспергирующие вещества.

Фармацевтические композиции согласно изобретению могут иметь форму, пригодную для стерильных инъекций. Для приготовления такой композиции подходящее лекарственное средство(а) растворяют или суспендируют в парентерально приемлемом жидком разбавителе. К числу приемлемых разбавителей и растворителей, которые можно использовать, относятся вода, вода, отрегулированная до подходящего значения рН добавлением соответствующего количества соляной кислоты, гидроксида натрия или подходящего буфера, 1,3-бутандиол, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Водная композиция может содержать одно или более консервирующих веществ (например, метил, этил или нпропил р-гидроксибензоат). В тех случаях, когда одно из лекарственных средств является труднорастворимым или слаборастворимым в воде, можно добавить вещества, увеличивающие растворимость, или солюбилизирующие вещества, или растворитель может содержать 10-60% об./об. пропиленгликоля или т.п.

Парентеральные композиции с контролируемым высвобождением могут иметь форму водных суспензий, микросфер, микрокапсул, магнитных микросфер, масляных растворов, масляных суспензий или эмульсий. Альтернативно, активное лекарственное средство(а) может быть заключено в биосовместимые носители, липосомы, наночастицы, импланты или инфузионные устройства. Используемыми материалами для приготовления микросфер и/или микрокапсул являются, например, биодеградируемые/биоразлагаемые полимеры, такие как полигалактин, поли-(изобутилцианоакрилат), поли(2гидроксиэтил-Ь-глутамин). Биосовместимыми носителями, которые можно использовать при создании парентеральных композиций с контролируемым высвобождением, являются углеводороды (например, декстраны), белки (например, альбумин), липопротеины или антитела. В имплантатах могут использоваться небиодеградируемые материалы (например, полидиметилсилоксан) или биодеградируемые материалы (например, поли(капролактон), поли(гликолевая кислота) или поли(ортоэфиры)).

Ректальные композиции.

Подходящие лекарственные формы композиций для ректального применения включают суппозитории (типа эмульсий или суспензий) и ректальные желатиновые капсулы (растворы или суспензии). В типичных составах для суппозиториев активное лекарственное средство(а) объединяют с подходящей фармацевтически приемлемой основой, такой как масло какао, этерифицированные жирные кислоты, глицеринизированный желатин и различные водорастворимые или диспергируемые основы, подобные полиэтиленгликолям. В состав можно вводить различные добавки, усилители или поверхностноактивные вещества.

Композиции для подкожного и местного введения.

Фармацевтические композиции также могут применяться местно на коже для впитывания через кожу в лекарственных формах или составах, содержащих стандартные нетоксичные фармацевтически приемлемые носители и эксципиенты, включая микросферы и липосомы. Композиции включают кремы, мази, лосьоны, линименты, гели, гидрогели, растворы, суспензии, карандаши, спреи, пасты, пластыри и другие разновидности систем чрескожной доставки лекарственного средства. Фармацевтически приемлемые носители или эксципиенты могут включать эмульгирующие вещества, антиоксиданты, буферные вещества, консервирующие вещества, увлажняющие вещества, способствующие всасыванию вещества, хелатирующие агенты, гелеобразующие вещества, мазевые основы, ароматизирующие вещества и вещества, защищающие кожу.

Эмульгирующие вещества могут быть камедями природного происхождения (например, аравийской камедью или трагакантовой камедью).

Консервирующие вещества, увлажняющие и способствующие всасыванию вещества могут представлять собой парабены, такие как метил или пропил р-гидроксибензоат, и бензалконий хлорид, глицерин, пропиленгликоль, мочевину и т.д.

Описанные выше фармацевтические композиции для местного применения на коже также могут использоваться в случае местного введения в или близко к части организма, которую необходимо лечить. Композиции могут быть приспособлены для прямого нанесения или нанесения с помощью специальных

- 20 024465 устройств для доставки лекарственного средства, таких как перевязочный материал, или альтернативно в виде пластырей, прокладок, губок, полосок или других форм из подходящего эластичного материала.

Дозировки и продолжительность лечения.

Следует принимать во внимание, что лекарственные средства комбинации могут вводиться одновременно, в одной и той же или в другой фармацевтической композиции или последовательно, одно за другим. При последовательном введении задержка при введении второго (или дополнительного) активного ингредиента не должна быть такой, чтобы потерять полезный эффект комбинации активных ингредиентов. Минимальное требование в отношении комбинации согласно этому описанию заключается в том, что комбинация должна предназначаться для комбинированного использования, принимая во внимание преимущество эффективного действия комбинации активных ингредиентов. О предполагаемом использовании комбинации можно судить по оснащению, приспособлениям, устройствам и/или другим средствам, помогающим использовать комбинацию согласно изобретение.

Хотя активные лекарственные средства настоящего изобретения могут быть введены в разделенных на части дозах, например, два или три раза в день, предпочтительной является одна ежедневная доза каждого лекарственного средства в комбинации, при этом наиболее предпочтительной является одна ежедневная доза всех лекарственных средств в одной фармацевтической композиции (стандартная лекарственная форма).

Термин стандартная лекарственная форма относится к физически раздельным единицам (таким как, капсулы, таблетки или заполненные цилиндры шприцов), пригодным в качестве единичных дозировок для людей, при этом каждая единица содержит заранее определенное количество активного вещества или веществ, рассчитанное для получения желательного терапевтического эффекта, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем.

Введение может осуществляться от одного до нескольких раз в день, в течение от нескольких дней до нескольких лет, и может длиться даже в течение жизни пациента. В большинстве случаев будет требоваться постоянное или, по меньшей мере, периодически повторяющееся продолжительное введение.

Кроме того, на используемые дозировки могут влиять фармакогеномные сведения (влияние генотипа на фармакокинетику, фармакодинамику или профиль эффективности терапевтического средства) о конкретном пациенте.

За исключением случаев, когда в ответ на ухудшение болезни БА могут требоваться более высокие дозировки, предпочтительная дозировка каждого лекарственного средства в комбинации обычно заключается в пределах доз, не выше тех доз, которые обычно назначаются для продолжительного поддерживающего лечения, или безопасность которых подтверждена на 3 фазе клинических испытаний.

Одно выдающееся преимущество изобретения состоит в том, что каждое соединение может использоваться при низких дозах в комбинированной терапии и наряду с этим давать в комбинации существенную клиническую пользу пациенту. Комбинированная терапия действительно может быть эффективна при использовании доз, которые не дают существенного эффекта в случае применения соединений по отдельности. Соответственно, отдельное преимущество изобретения заключается в возможности использовать субоптимальные дозы каждого соединения, т.е. дозы более низкие, чем обычно назначаемые терапевтические дозы, предпочтительно 1/2 терапевтических доз, более предпочтительно 1/3, 1/4, 1/5, или даже более предпочтительно от 1/10 до 1/100 терапевтических доз. Как правило, при таких субоптимальных дозировках соединения по отдельности неактивны, тогда как в комбинации(ях) согласно изобретению являются вполне эффективными.

Предпочтительная дозировка соответствует количествам от 1 до 50% от количеств, обычно назначаемых для продолжительного поддерживающего лечения.

Наиболее предпочтительные дозировки могут соответствовать количествам от 1 до 10% от обычно назначаемых при продолжительном поддерживающем лечении.

Конкретные примеры дозировок, использованных в изобретении, предоставляются ниже: аминокапроновая кислота примерно от 0,05 до 15 г в день; левосимендан от 0,05 до 4 мг в день;

амлодипин перорально примерно от 0,05 до 1 мг в день; клопидогрел перорально примерно от 0,75 до 7,5 мг в день; тадалафил перорально примерно от 0,05 до 0,5 мг в день; цилостазол перорально примерно от 1 до 10 мг в день;

тербинафин перорально примерно от 2,5 до 25 мг один раз или два раза в день;

лефлуномид перорально примерно от 0,25 до 2,5 мг в день;

цинакалцет перорально примерно от 0,3 до 3 мг в день;

акампросат перорально примерно от 7 до 70 мг три раза в день;

метимазол перорально примерно от 0,05 до 1,5 мг в день;

мепакрин перорально примерно от 3 до 30 мг в день;

фенформин перорально примерно от 0,5 до 5 мг в день;

баклофен перорально примерно от 0,4 до 8 мг в день, введенные в два или три приема; рифабутин перорально примерно от 6 до 60 мг в день;

- 21 024465 амобарбитал перорально примерно от 0,06 до 15 мг в день; цефотетан перорально примерно от 0,01 до 0,4 мг в день;

дифиллин перорально примерно от 6 до 60 мг в день, разделенные на две или три дозы;

метиклотиазид перорально примерно от 0,025 до 1 мг в день;

ризедронат перорально примерно от 0,05 до 3 мг в день;

этомидат перорально примерно от 0,6 до 6 мг в день;

зонисамид перорально примерно от 1 до 40 мг в день.

Следует понимать, что количество вводимого лекарственного средства будет определяться врачом в свете соответствующих обстоятельств, включая состояние или состояния, которые необходимо лечить, конкретной вводимой композиции, возраст, вес и ответ отдельного пациента, тяжесть симптомов у пациента и выбранный способ введения. Поэтому вышеуказанные пределы дозировок даются в целях общего руководства и поддержки изложенных в описании идей, но не предназначаются для ограничения рамок изобретения.

Следующие примеры приводятся с целью иллюстрации, но не для ограничения.

Примеры

I. Соединения и их комбинации предотвращают токсичность пептида Ав_25-35.

В этой первой серии экспериментов соединения-кандидаты были проверены в отношении их способности предотвращать или уменьшать токсические эффекты пептида Ав_25-35. Сначала лекарственные средства проверили по отдельности, а затем исследовали их комбинированное действие. Действие проверяли на разных типах клеток для того, чтобы дополнительно проиллюстрировать активность соединений.

При болезни Альцгеймера АРР-белок образует агрегаты нерастворимых β-складчатых конформаций фибриллярного Абета-белка (амилоид). Конформационное изменение от растворимых до фибриллярных форм, по-видимому, является спонтанным явлением, которое увеличивается при более высоких концентрациях Абета, так что любая выработка больших, чем в норме, количеств Абета (или производство более крупных, менее растворимых форм Абета) будет приводить к увеличению образования бляшек. Как только бляшка Абета начинает формироваться, с ней могут взаимодействовать другие молекулы, что дает окончательно созревшую бляшку вместе с окружающей ее областью гибнущих нейронов. Принимая это во внимание, авторы уделили первостепенное значение исследованию действия лекарственных средств на выживаемость клеток, подвергнутых действию амилоидного β белка.

1.1. Исследование защиты от токсичности Ав_25-35 пептида на корковых нейронах.

Культура клеток.

Первичные корковые нейроны крыс культивировали, как описано в 8шдег с1 а1., 1999. Коротко, беременных самок крыс с 15-дневной беременностью забивали смещением шейных позвонков (крысы νίδ1аг; 1апу1сг) и извлекали плоды из матки. Кору удаляли и помещали в ледяную среду Ьс|Ьоу11/ (Ь15; Ιηνί1годсп). содержащую 1% пенициллина-стрептомицина (Р8; Шуйгодеи) и 1% бычьего сывороточного альбумина (В8А; 8щта). Кору трипсинизировали в течение 20 мин при 37°С (трипсин ЭДТА 1Х; ΙηνίίΓΟβοη) разводили в РВ8 без кальция и магния. Реакцию останавливали добавлением модифицированной по способу Дульбекко среды Игла (ΌΜΕΜ; ΙηνίίΓΟβοη), содержащей ДНКазу I степень очистки II (0,1 мг/мл; Косйе Όίαβηοδίίο) и 10% эмбриональной бычьей сыворотки (РС8; Шуйгодеи). Затем клетки механически разъединяли, пропустив три раза через 10-мл пипетку. Затем клетки центрифугировали при 180 х д в течение 10 мин при 10°С. Супернатант отбрасывали, а клетки из осадка ресуспендировали в определенной культуральной среде, состоящей из №игоЬа8а1 (Iηνй^οдеη) с добавлением В27 (2%; Шуйгодей), Ьглутамина (0,2 мМ; Шуйгодей), 1% Р8 раствора и 10 нг/мл полученного из мозга нейротрофического фактора (ΈΟΝΕ, Раη Вю1есН). Жизнеспособные клетки подсчитывали с помощью цитометра №иЬаиег, используя тест вытеснения трипанового синего. Клетки высевали при плотности 30000 клеток/лунку в 96-луночные планшеты (лунки предварительно покрывали поли-Ь-лизином (10 мкг/мл; 81дта)) и культивировали при 37°С во влажной воздушной (95%)/СО₂ (5%) атмосфере.

Через 6 дней культивирования клетки инкубировали с лекарственными средствами (5 концентраций). Через 1 ч клетки подвергали интоксикации с помощью 20 мкМ бета-амилоида (25-35; 81дта) в определенной среде без ВООТ¹, но вместе с лекарственными средствами. Корковые нейроны подвергали интоксикации в течение 2 дней. На одно условие эксперимента было взято две независимые культуры, 6 лунок на условие.

Количественная оценка длины нейритов.

Клетки фиксировали холодным раствором этанола (95%) и уксусной кислоты (5%) в течение 10 мин. После пермеабилизации с помощью 0,1% сапонина клетки блокировали в течение 2 ч с помощью РВ8, содержащего 10% козьей сыворотки. Затем клетки инкубировали с моноклональными антителами к связанному с микротрубочками белку 2 (МАР-2; 81дта). Эти антитела специфически обнаруживают клеточные тела (протопласты) и нейриты. В качестве вторичных антител использовали А1еха Р1иог 488 козьи анти-мышь ЦС (Мо1еси1аг ргоЬе). Ядра нейронов выявляли с помощью флуоресцентного красителя (раствор Хекста, 8ЮМА). Делали двадцать изображений на лунку, используя анализатор ШСеП Ашйу/егТМ

- 22 024465

1000 (СЕ НеаНЬсаге) при увеличении 20х. Все изображения были сделаны в одинаковых условиях. Длину нейритов измеряли с помощью программного обеспечения Иеуе1орег (СЕ НеаЬЬсаге).

Результаты.

Представленные на фиг. 1 результаты получены от двух независимых культур, 6 лунок на условие. Все значения выражены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Двусторонний ΐ-критерий Стьюдента проводился на первичных данных. Результаты выражены в процентах длины нейритов по сравнению с контролем (разбавитель).

Первичные корковые нейроны крыс инкубировали с лекарственными средствами 1 ч до интоксикации Абета_25-35 20 мкМ, которая продолжалась 2 дня (36).

Через два дня после инкубации измеряли длину сети нейритов, что отражало рост аксонов клетки. Результаты показали, что протестированные лекарственные средства явно оказывают нейропротекторное действие против интоксикации Абета25-35 (фиг. 1 и 2).

1.2. Исследование защиты от токсичности пептида Ав_25-35 на эндотелиальных клетках мозга.

Культура клеток.

Прежде всего, культуру эндотелиальных клеток мозга крыс (Уес1-Ногик 8А8, МагкеШе) культивировали с пассажа 0. После слияния эндотелиальные клетки обрабатывали трипсин-ЭДТА (Рап В|о1есН Ке£: Р10-023100). Клетки высевали при плотности 25000 клеток/лунку в 96-луночные планшеты (лунки предварительно покрывали 30 мкл крысиного коллагена I типа при 1,5 мг/мл, Уей-Ногик 8А8, МагкеШе) и культивировали в среде МСВИ 131 (М-131-500, 1пуйгодеп) с добавлением 1% среды для роста микрососудов (МУС8, 8-005-25, 1пу|(годеп). Клетки культивировали при 37°С во влажной воздушной (95%)/СО₂ (5%) атмосфере. Раз в двое суток половину среды заменяли свежей средой.

Через 4 дня к среде в культуры клеток добавили лекарственные средства в разных концентрациях, растворенные в ИМ8О 0,1% или воде. В течение 1 ч проводили предварительную инкубацию в культуральной среде, содержащей модифицированную по способу Дульбекко среду Игла (ИМЕМ, Рап ВЮесЬ Ке£: Р04-03600) с добавлением 2% эмбриональной бычьей сыворотки (РВ8; 1пуШодеп ге£: 16000-036), 1% Ь-глутамина (Рап Вю1есЬ ге£: Р04-80100), 1% пенициллина-стрептомицина (Р8; Рап ВЮесЬ ге£: Р0607100), 0,1 мг/мл гепарина (81дта), 10 нг/мл эпидермального фактора роста (ЕСР, 1пуЦгодеп) и 10 нг/мл фактора роста эндотелия сосудов (УЕСР, РНС0146, 1пуйгодеп).

Затем клетки подвергали интоксикации с помощью 30 мкМ β-амилоида (25-35; 81дта) вместе с лекарственными средствами в той же самой культуральной среде. Далее интоксикацию клеток проводили в течение 3 дней.

Метод исследования активности лактатдегидрогеназы (ЬИН).

Через 3 дня интоксикации в каждой культуре собирали супернатант и анализировали с помощью набора СуЮохсИу Ие1есйоп Кй (ЬИН, КосЬе Аррйеб 8с1епсек). Этот колориметрический анализ с целью определения количества клеточной смерти основывается на измерении активности лактатдегидрогеназы (ЬИН), высвобождаемой из поврежденных клеток в супернатант. Оптическую плотность (ИО) измеряли с помощью многорежимного спектрофотометра (ТЬегто, Ке£ АксеШ) при длине волны 492 нм.

Результаты.

Представленные на фиг. 3 результаты получены от двух независимых культур, 6 лунок на условие. Все значения выражены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Двусторонний ί-критерий Стьюдента проводился на первичных данных. Результаты выражены в процентах жизнеспособности клеток по сравнению с отрицательным контролем (разбавитель).

Первичные крысиные эндотелиальные клетки мозга инкубировали с лекарственными препаратами 1 ч до интоксикации Ав_25-35 3 0 мкМ, которая продолжалась 3 дня.

Через три дня после интоксикации измеряли высвобождение ЬИН в культуральную среду, что отражало уровень гибели клеток.

Полученные результаты явно показали, что протестированные соединения оказывают сильное защитное действие против интоксикации Λβ_25-35 (фиг. 3).

1.3. Исследование защиты от токсичности Ав_25-35 пептида на клетках феохромоцитомы.

Культура клеток РС12.

Клетки РС12 (феохромоцитома крыс, АТСС ге£: СКЬ-1721) от АТСС (АТСС СКЬ-1721) быстро размораживали в теплой воде 37°С. Супернатант сразу помещали в 9 мл среды для пролиферации РС12, содержащей модифицированную по способу Дульбекко среду Игла ИМЕМ-Р12 (Рап Вю1есЬ ге£: Р0441450) с 15% инактивированной нагреванием лошадиной сыворотки (1пуйгодеп ге£: 16050-130), 2,5% эмбриональной бычьей сыворотки (РВ8; 1пуйгодеп ге£: 16000-036), 1% пенициллина 10.000И/мл и стрептомицина 10 мг/мл (Р8; Рап Вю1есЬ ге£: Р06-07100) и 1% Ь-глутамина 200 мМ (Рап ВЮесЬ ге£: Р04-80100).

Клетки центрифугировали (800 об/мин, 4°С в течение 5 мин) и поместили в 5 мл среды для пролиферации РС12, жизнеспособные клетки подсчитывали вместе с клетками Малассе с помощью теста исключения нейтрального красного (81дта).

Затем клетки высевали с плотностью 3 -10⁴ клеток на 1 см² в среду для пролиферации РС12 в 75 см²пластиковые флаконы (Сгешег Ке£: 658175) предварительно покрытые поли-Ь-лизином (10 мкг/мл, 81дта

- 23 024465

КеГ: Р2636).

Среду меняли через день. Через 3 дня культивирования, когда клетки достигали 80% слияния, их промывали ΗΒδδ без кальция и магния (Рап Вю1есН КеГ: Р06-33500) и инкубировали в трипсин-ЭДТА (0,05%, Рап Вю1ес11 КеГ: Р10-023100). Ферментативную реакцию останавливали с помощью среды для пролиферации РС12 с добавлением 0,5 мг/мл ДНКазы 1 степени очистки 2 (Рап В|о1есН КеГ: Т6037780100). Затем РС12 центрифугировали (800 об/мин при 4°С в течение 10 мин) и рассевали клетки при плотности 2.9-10⁴ на 1 см² в 175 см² культуральные флаконы (Огешег КеГ: 661195), предварительно покрытые поли-Ь-лизином.

Интоксикация и МТТ тест на жизнеспособность.

Клетки РС12 (пассаж #2) высевали, исходя из плотности 3300 клеток на 1 см², в 96-луночные планшеты (Огешег КеГ: 655 180), предварительно покрытые поли-Ь-лизином (§1§та), в среде ИеигоЬа5а1 (ΙηνίРодеп, КеГ: 21103049), содержащей В27 (2%, Рл'Пгодеп, КеГ: 21103049), пенициллин (50 и/мл)стрептомицин (50 мкг/мл) и глутамин (1%) и 50 нг/мл ΝΟΡ (81дта КеГ: N1408). ΝΟΡ дает возможность РС12 дифференцироваться подобно симпатическим нейронам.

Через 5 дней культивирования среду заменяли на №игоЬа8а1 с добавлением ΝΟΡ (50 нг/мл), В27 без антиоксиданта, глютамина и антибиотиков. Через 24 ч клетки инкубировали в течение 1 ч с лекарственными средствами в 5 концентрациях, 6 лунок на условия. Через 1 ч предварительной инкубации клетки подвергали интоксикации 10 мкМ бета-амилоида (25-35; §1§та) вместе с лекарственными средствами в культуральной среде. Через 24 ч клетки один раз промывали РВ§ (Рап В|о1есН. КеГ: Р04-36100) и оценивали выживаемость РС12 клеток с помощью теста на выживаемость с использованием МТТ (3-[4,5диметилтиазол-2-ил]-2,5 дифенилтетразолий бромида).

Культура клеток нейронов мозга.

Первичные нейроны мозга крыс культивировали, как описано 8ш§ег е1 а1., 1999. Коротко, беременных самок крыс с 15-дневной беременностью забивали смещением шейных позвонков (крысы \УР1аг; Лапх-лег) и извлекали плоды из матки. Кору удаляли и помещали в ледяную среду ЬеФоуП/ (Ь15; ΙπνίίΓΟдеп), содержащую 1% пенициллина-стрептомицина (Р8; РлРгодеп) и 1% бычьего сывороточного альбумина (ΒδΆ; δίβΐηη). Кору трипсинизировали в течение 20 мин при 37°С (трипсин ЭДТА 1Х; 1пу|(годеп) разводили в РΒδ без кальция и магния. Реакцию останавливали добавлением модифицированной по способу Дульбекко среды Игла (ΌΜΕΜ; РгуПгодеп), содержащей ДНКазу I степень очистки II (0,1 мг/мл; КосЬе ИгадпокРс) и 10% эмбриональной бычьей сыворотки (ΡСδ; РщПгодеп). Затем клетки механически разъединяли, пропустив три раза через 10-мл пипетку. Затем клетки центрифугировали при 180 х д в течение 10 мин при 10°С. Супернатант отбрасывали, а клетки из осадка ресуспендировали в культуральной среде, состоящей из №игоЬа8а1 (1пургодеп) с добавлением В27 (2%; Рл'Пгодеп), Ь-глутамина (0,2 мМ; 1пуПгодеп), 1% Рδ раствора и 10 нг/мл полученного из мозга нейротрофического фактора (ΒΌΝΡ, Рап В|о1есН). Жизнеспособные клетки подсчитывали с помощью цитометра №иЬаиег, используя тест вытеснения трипанового синего. Клетки высевали при плотности 30000 клеток/лунку в 96-луночные планшеты (лунки предварительно покрывали поли-Ь-лизином (10 мкг/мл; δ^дта)) и культивировали при 37°С во влажной воздушной (95%)/СО₂ (5%) атмосфере.

Через 6 дней культивирования клетки инкубировали с лекарственными средствами (5 концентраций). Через 1 ч клетки подвергали интоксикации с помощью 20 мкМ бета-амилоида (25-35; δ^дта) в среде без ΒΌΝΡ, но вместе с лекарственными средствами. Корковые нейроны подвергали интоксикации в течение 2 дней.

Исследование активности лактатдегидрогеназы (ΌΌΗ).

Через 2 дня культивирования супернатант собирают и анализируют с помощью набора СуГоГохсйу Ое1есРоп Κίΐ (ΌΌΗ, КосЬе ЛррРеР δ^ι^5). Этот колориметрический анализ с целью количественного определения клеточной смерти основывается на измерении активности лактатдегидрогеназы (ΌΌΗ), высвобождаемой из поврежденных клеток в супернатант. Оптическую плотность (ΌΘ) измеряли с помощью многорежимного спектрофотометра (ТЬегто, КеГ Лксепр при длине волны 492 нм. Результаты выражены в процентах жизнеспособности клеток по сравнению с отрицательным контролем (разбавитель).

Результаты.

Результаты, представленные на фиг. 4 и 5, получены от двух независимых культур, 6 лунок на условие. Все значения выражены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Двусторонний ΐ-критерий Стьюдента проводился на первичных данных. Результаты выражены в процентах жизнеспособности клеток по сравнению с отрицательным контролем (разбавитель).

ΝΟΡ-дифференцированные клетки РС12 инкубировали с лекарственными средствами 1 ч перед проведением интоксикации Абета_25-35 1 0 мкМ, которая продолжалась 24 ч.

Через день после инкубации жизнеспособность дифференцированных с помощью ΝΟΡ- РС12клеток определяли с помощью МТТ-теста. Результаты явно показывают, что прилокаин и амлодипин проявляют сильное нейропротекторное действие против интоксикации Абета25-35 (фиг. 4).

Первичные нейроны мозга крыс также инкубировали с соединениями изобретения 1 ч перед интоксикацией Ав_25-35 20 мкМ, которая продолжалась 2 дня. Через 2 дня после этой инкубации измеряли вы- 24 024465 свобождение ЬЭН в культуральную среду, что отражало уровень гибели клеток. Полученные результаты показывают, что соединения проявляют сильное нейропротекторное действие против интоксикации Абета25-35 (фиг. 5).

Ι.4. Действие (активность) лекарственных комбинаций.

Кроме того, были проведены исследования ίη νίΐΓΟ нескольких комбинаций лекарственных средств, модулирующих функцию синапса и/или ангиогенез и/или ответ клетки на стресс.

Инкубацию с лекарственными средствами проводили в тех же самых экспериментальных условиях, как описано выше (смотри разделы Ι.1-Ι.3). Наиболее эффективно действующие на мишени лекарственные комбинации суммированы в табл. 2.

Таблица 2

Лекарственная комбинация	Нейропротекторное действие от ИНТОКСИКаЦИИ Ар25-35
Фенформин и зонисамид
Фенформин и метиклотиазид	+
Фенформин и акампросат	+
Фенформин и сульфизоксазол	+
баклофен и тербинафин	+
баклофен и ризедронат	+
баклофен и сульфизоксазол	+
баклофен и зонисамид	+
баклофен и метиклотиазид	+
баклофен и лефлуномид	+
зонисамид и дифиллин	+
метиклотиазид и дифиллин	+
зонисамид и прилокаин	+
метиклотиазид и прилокаин	+
зонисамид и сульфизоксазол	+
Тербинафин и сульфизоксазол	+
Тербинафин и мепакрин	+
Акампросат и тербинафин	+
Тербинафин и рифабутин	+
Фенформин и тадалафил	+
зонисамид и агратробан	+
Фенформин и клопидогрел	+
Акампросат и цинакалцет	+
сульфизоксазол и цинакалцет	+
Тербинафин и агратробан	+
Тербинафин и цефменоксим,
баклофен и клопидогрел	+
Тербинафин и клопидогрел	+
Ризедронат и клопидогрел	+
зонисамид и циннаризин	+
Акампросат и циннаризин
зонисамид и циклопирокс	+
Акампросат и циклопирокс	+
сульфизоксазол и амобарбитал	+
зонисамид и амобарбитал	+
сульфизоксазол и цефотетан	+
зонисамид и цефотетан	+
Акампросат и эритритила Тетранитрат	+
зонисамид и эритритила Тетранитрат	+
сульфизоксазол и эритритила Тетранитрат	+
митиглипид и эритритила Тетранитрат	+
левосимендан и эритритила	+

- 25 024465

Тетранитрат
митиглинид и зонисамид	+
левосимендан и зонисамид	+
митиглинид и тербинафин	+
левосимендан и тербинафин	+
митиглинид и ризедронат	+
левосимендан и ризедронат	+
митиглинид и метиклотиазид	+
левосимендан и метиклотиазид	+
метиклотиазид и сульфизоксазол	+
зонисамид и сульфизоксазол	+
Ризедронат и сульфизоксазол	+
Ризедронат и мепакрин	+
Ризедронат и акампросат	+
Ризедронат и рифабутин	....... + ..
энпрофиллин и фенформин	+
окстрифиллин и фенформин	+
зонисамид и цефменоксим	+
метиклотиазид и агратробан	+
метиклотиазид и цефменоксим	+
Ризедронат и агратробан	+
Ризедронат и цефменоксим	+
зонисамид и циннаризин
зонисамид и бенидипин	+
зонисамид и параметадион	+
зонисамид и амлодипин	+
метиклотиазид и циннаризин	+
метиклотиазид и бенидипин	+
метиклотиазид и параметадион	+
метиклотиазид и амлодипин	+
Акампросат и бенидипин	+
Акампросат и параметадион	+
Акампросат и амлодипин
метиклотиазид и циклопирокс	+
метиклотиазид и амобарбитал	+
метиклотиазид и цефотетан	+
метиклотиазид и эритритила Тетранитрат	+

+ Показывает положительное нейропротекторное действие от интоксикации Άβ_25-35.

II. Соединения предотвращают токсичность человеческого Άβ_1-42.

В этих дополнительных сериях экспериментов соединения-кандидаты были проверены в отношении их способности предотвращать или уменьшать токсические эффекты человеческого Άβ₁.₄₂. Άβ_1-42представляет собой полноразмерный пептид, который образует агрегаты, видимые в биопсийном материале людей-пациентов, пораженных болезнью Άльцгеймера. Сначала лекарственные средства протестировали по отдельности, а затем изучали их комбинированное действие. Эффект определяли на разных типах клеток, чтобы дополнительно подтвердить активность соединений.

11.1. Защита от токсичности Άβ_1-42 на модели эндотелиальных клеток микрососудов мозга человека.

Для исследования защитных возможностей упомянутых выше соединений-кандидатов от токсичности Άβ_1-42 использовали культуры эндотелиальных клеток микрососудов мозга человека.

Эндотелиальные клетки микрососудов мозга человека (НВМЕС, 8аепСе11 КеГ: 1000, замороженные на 10 пассаже) быстро разморозили в водяной бане при +37°С, Супернатант сразу поместили в 9 мл модифицированной по способу Дульбекко среды Игла (ΌΜΕΜ; Рап В|о1есН геГ: Р04-03600), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (РС8; О1ВСО геГ 10270-106). Суспензию клеток центрифугировали при 180 х д в течение 10 мин при +4°С, а осадки ресуспендировали в среде С8С без сыворотки (С8С без сыворотки, Се11 8ук1ет, КеГ: 8Ρ-4Ζ0-500-Κ, Ва1сН 51407-4) с 1,6% Коске1Рие1 без сыворотки (Се11 8ук1ет. КеГ: §Ρ-4Ζ0-500-Κ, Ва1ск 54102), 2% пенициллина 10.000 и/мл и стрептомицина 10 мг/мл (Р8; Рап Вю1есЬ геГ: Р06-07100 Ьа1ск 133080808) и высевали при плотности 20000 клеток на лунку в 96-луночные планшеты (система для ангиогенеза та1пде1 1ауег Ьюсоа! апд1одепек15 кук1ет, ВИ, КеГ 354150, Ва1ск Ά8662) в окончательном объеме 100 мкл. На та1пде1 (матричной гелевой) подложке эндотелиальные клетки мозга спонтанно начинали процесс морфогенеза капиллярной сети (47).

- 26 024465

На условие было взято три отдельных культуры, 6 лунок на условие.

Соединения-кандидаты и обработка человеческим амилоидом-в_1-42.

Коротко, Ав_1-42 пептид (ВасНст. ге£: Н1368 Ьа1сН 1010533) был восстановлен в определенной культуральной среде при 20 мкМ (материнский раствор), затем его медленно встряхивали при +37°С в течение 3 дней в темноте для агрегации. Контрольную среду приготавливали в тех же самых условиях.

Через 3 дня этот агрегированный человеческий амилоидный пептид, разведенный в контрольной среде до 2,5 мкМ, вносили к НВМЕС (оптимальное время инкубации). Пептид Λβι_-.₄₂ добавляли через 2 ч после высевания НВМЕС на матрицу ша1пде1 для инкубирования в течение 18 час.

Через один час после высевания НВМЕС на матрицу тайщек тестируемые соединения и УЕСР-165 растворили в культуральной среде (+0,1% ΌΜδΟ) и затем предварительно инкубировали с НВМЕС в течение 1 ч до внесения Λβι_-42 (в окончательном объеме 100 мкл на культуральную лунку). Через 1 ч инкубации с тестируемыми соединениями или УЕСР (через 2 ч после высевания клеток на матрицу тайг£е1), добавили 100 мкл разведенного в контрольной среде пептида Λβι_-.₁₂ до окончательной концентрации 2,5 мкМ в присутствии тестируемых соединений или УЕСР (в общем объеме 200 мкл на лунку), во избежание дополнительных разбавлений лекарственного средства.

Постановка культуры на планшетах.

В качестве контрольного соединения во всех экспериментах в данном исследовании использовали УЕСР-165, известный как проангиогенная изоформа УЕСР-А. УЕСР-165 является одной из наиболее распространенных изоформ УЕСР, участвующих в ангиогенезе. УЕСР использовали как контрольное соединение при концентрации 10 нМ.

Были оценены следующие условия:

Отрицательный контроль: только среда + 0,1% ΌΜδΟ;

Интоксикация: амилоид-в_4-42. (2,5 мкМ) в течение 18 ч;

Положительный контроль: УЕСР-165 (10 нМ) (1 контрольное соединение/культура) 1 ч до добавления Ав1_-42 (2,5 мкМ) на 18 ч инкубации;

Тестируемые соединения: тестируемое соединение за 1 ч до добавления Λβι^ι: (2.5 мкМ) (2,5 мкМ) на 18 ч инкубации.

Количественная оценка капиллярной сети.

Делали по 2 изображения на лунку, используя объектив с увеличением 4х, с помощью клеточного анализатора Ιη Се11 Апа1у/егТМ 1000 (СЕ НеаННсаге) при пропускании света. Все изображения были сделаны в одинаковых условиях. Анализ ангиогенеза проводили с помощью программного обеспечения Эеуе1орет (СЕ НеаННсаге). Была оценена общая длина капиллярной сети.

Обработка данных.

Все значения были выражены как среднее ± стандартная ошибка среднего от 3 культур (п = 6 на условие). Статистический анализ проводили при различных условиях, используя АЫОУА с последующим тестом Дуннетта, когда была возможность (§1а1\'1е\у койтате уегмоп 5.0). Значения (в виде %) наносили на графики, показывающие рост токсичности амилоида. Токсичность амилоида была принята за 100%, а эффект тестируемого соединения подсчитывали в виде % от токсичности амилоида.

Результаты.

Результаты показаны на фиг. 6 и в табл. 3. Как видно из представленных результатов, лекарственные средства по отдельности оказывают существенное защитное действие от токсичности, вызванной пептидом Λβι_-42:

аминокапроновая кислота, отдельно, в низкой дозе, например, 160 нМ, оказывает сильное защитное действие;

левосимендан в дозе до 8 нМ оказывает сильное защитное действие.

ΙΙ.2 Исследование защиты от токсичности Ав_4-42 на первичных корковых нейронах.

Тестируемые соединения и обработка человеческим амилоидом-βι^.

Первичные нейроны крыс культивировали, как описано ранее.

Коротко, петид Ав_4-42 восстанавливали в определенной культуральной среде при 40 мкМ (материнский раствор) и медленно встряхивали при +37°С в течение 3 дней в темноте для агрегации. Контрольную среду готовили в тех же самых условиях.

Через 3 дня раствор использовали на первичных корковых нейронах, как указано далее.

Через 10 дней культивирования нейронов лекарственное средство растворили в культуральной среде (+0,1 % ΌΜδΟ) и затем предварительно инкубировали с нейронами в течение 1 ч до внесения Ав_1-42 (в окончательном объеме 100 мкл на культуральную лунку). Через 1 ч инкубации с лекарственным средством добавили 100 мкл пептида Ав_1-42 до окончательной концентрации 10 мкМ в присутствии лекарственного средства, чтобы избежать дополнительного разбавления лекарственного средства. Коровые нейроны подвергали интоксикации в течение 24 ч. Три отдельные культуры брали на условие, 6 лунок на условие.

В качестве положительного контроля и эталонного соединения использовали ΒΌΝΤ (50 нг/мл) и эстрадиол-β (100 и 150 нМ) соответственно. Три отдельные культуры брали на условие, 12 лунок на усло- 27 024465 вие.

Постановка культуры на планшетах.

В качестве эталонного соединения использовали эстрадиол-β при 100 и 150 нМ, а в качестве положительного контроля использовали ВООТ¹ при 50 нг/мл.

Эстрадиол-β и ВООТ¹ растворяли в культуральной среде и предварительно инкубировали 1 ч до внесения агрегированного амилоида^_1-42.

Были оценены следующие условия:

- 1 контрольная бляшка: 12 лунок/условие;

Интоусикация: амилоид-Αβ_1-42 (10 мкМ) в течение 24 ч;

Положительный контроль: ВЭНР (50 нг/мл) 1 ч, а затем амилоид-βμ^ (10 мкМ) в течение 24 ч;

Контрольное соединение: эстрадиол (150 нМ) 1 ч, а затем амилоид-βι^ (10 мкМ) в течение 24 ч;

Планшет с лекарственным средством: 6 лунок/условие;

Интоусикация: амилоид-βμ^ (10 мкМ) в течение 24 ч;

Лекарственное средство 1: лекарственное средство 1 - 1 ч, а затем амилоид-βι^ (10 мкМ) в течение ч;

Лекарственное средство 2: лекарственное средство 2 - 1 ч, а затем амилоид-βι^ (10 мкМ) в течение

ч.

Исследование активности лактатдегидрогеназы (БОН).

Через 24 ч после интоксикации отбирали супернатант и проводили анализ с помощью набора СуЮФхсйу ^еίесί^οη Κίί (БОН, КцсБе ЛррПей δс^еηсе, те£: 11644793001, Ьа1с1т 11800300). Этот колориметрический анализ с целью определения токсичности на клетки основывается на измерении активности лактатдегидрогеназы (БОН), высвобождаемой из цитозоля погибших клеток в супернатант.

Обработка данных.

Все значения были выражены как среднее ± стандартная ошибка среднего от 3 культур (п = 6 на условие). Статистический анализ проводили при различных условиях (ΑΝΟνΑ с последующим тестом Дуннетта, когда была возможность, δίаίν^е№ δοΠ\ν;·ιΐΌ уегеюп 5.0).

Результаты.

В табл. 3 и на фиг. 7 представлены результаты, полученные для отдельных отобранных лекарственных средств при исследовании токсичности на первичные корковые нейроны.

Таблица 3

Название лекарственного средства	Защитное действие при интоксикации нейронов пептидом Αβΐ-42	Защитное действие при интоксикации НВМС пептидом Αβΐ-42
Аминокапроновая кислота		+
Баклофен (+/·)	+	+
Карбамазин	Ή
Карбеноксолон	+
Цинакалцет	+
Циннаризин	+
Эплеренон		+
Этомидат
Фенолдопам		+
Лефлуномид	+
Левосимендан	Η	+
Моксифлоксацин
Фенформин	+
Сульфизоксазол	+
Сулодексид		+
Тадалафил	+
Тербинафин		+
Зонисамид	+

- 28 024465

ΙΙ.3. Исследование эффекта комбинированного лечения на токсичность человеческого Ав_1-42 пептида на человеческих НВМЕС клетках.

Эффективность лекарственных комбинаций изобретения оценивали на клетках человека. В этих исследованиях использовали тот же самый протокол, как описано в разделе ΙΙ.1, выше.

Результаты.

Следующие лекарственные комбинации были протестированы на человеческих эндотелиальных клетках микрососудов мозга:

Все проверенные лекарственные комбинации оказывают защитное действие от токсичности человеческого Ав_1-42 пептида на модели НВМЕС, как показано в табл. 4 и проиллюстрировано на фиг. 8-13.

Таблица 4

Название лекарственного средства	Защитный эффект на клетках НВМЕС от интоксикации Αβ мг
баклофен и аминокапроновая кислота	+
баклофен и левосимендан	+
аминокапроновая кислота и сульфизоксазол	+
аминокапроновая кислота и тербинафин	+
аминокапроновая кислота и левосимендан	+
левосимендан и сульфизоксазол	+
левосимендан и тербинафин	+
эплеренон и левосимендан	+
эплеренон и сульфизоксазол	+
эплеренон и фенолдопам	+
сулодексид и левосимендан	+
сулодексид и сульфизоксазол	+
сулодексид и фенолдопам	+
эплеренон и сулодексид	+

ΙΙΙ. Комбинированная терапия левосименданом и сульфизоксазолом эффективно защищает нейроны от токсичности человеческого Ав_3-42.

В этом примере была оценена возможность с помощью комбинированной терапии левосименданом и сульфизоксазолом предотвращать или уменьшать токсические эффекты человеческого Ав_3-42.

Комбинированное лечение было проверено при экспериментальных условиях, описанных в примере ΙΙ.1. Использовали культуру человеческих эндотелиальных клеток микрососудов мозга, как раскрыто в ΙΙ.1, которую инкубировали одновременно или последовательно с лекарственной комбинацией.

Результаты представлены на фиг. 8. Как видно из результатов, агрегированный человеческий амилоидный пептид (Ав_3-42 2,5 мкМ) вызывает значительную интоксикацию, больше 40%, по сравнению с нейронами, обработанными носителем. Эту интоксикацию значимо предотвращала комбинация сульфи- 29 024465 зоксазола и левосимендана (фиг. 8А), тогда как в таких же концентрациях левосимендан (фиг. 8В) и сульфизоксазол (фиг. 8С) отдельно не оказывали значимого действия на интоксикацию.

IV. Комбинированная терапия тербинафином и сульфизоксазолом эффективно защищает нейроны от токсичности человеческого Ав₁_₄₂.

В этом примере была оценена возможность с помощью комбинированной терапии тербинафином и сульфизоксазолом предотвращать или уменьшать токсические эффекты человеческого пептида Ав₁_₄₂.

Комбинированное лечение было проверено при экспериментальных условиях, описанных в примере II. 1. Использовали культуру человеческих эндотелиальных клеток микрососудов мозга, как раскрыто в ΙΙ.1, которую инкубировали одновременно или последовательно с лекарственной комбинацией.

Результаты представлены на фиг. 9. Как видно из результатов, агрегированный человеческий амилоидный пептид (Ар₁_₄₂ 2,5 мкМ) вызывает значительную интоксикацию, больше 40%, по сравнению с нейронами, обработанными носителем. Эту интоксикацию значимо предотвращала комбинация тербинафина и сульфизоксазола (фиг. 9А), тогда как в таких же концентрациях сульфизоксазол (фиг. 9В) и тербинафин (фиг. 9С) отдельно не оказывали значимого действия на интоксикацию.

V. Комбинированная терапия левосименданом и баклофеном эффективно защищает нейроны от токсичности человеческого Ав_1-42.

В этом примере была оценена возможность с помощью комбинированной терапии левосименданом и баклофеном предотвращать или уменьшать токсические эффекты человеческого Ав_1-42.

Комбинированное лечение было проверено при экспериментальных условиях, описанных в примере II. 1. Использовали культуру человеческих эндотелиальных клеток микрососудов мозга, как раскрыто в П.1, которую инкубировали одновременно или последовательно с лекарственной комбинацией.

Результаты представлены на фиг. 10. Как видно из результатов, агрегированный человеческий амилоидный пептид (Ар₁_₄₂ 2,5 мкМ) вызывает значительную интоксикацию, больше 40%, по сравнению с нейронами, обработанными носителем. Эту интоксикацию значимо предотвращала комбинация левосимендана и баклофена (фиг. 10А), тогда как в таких же концентрациях левосимендан (фиг. 10В) и баклофен (фиг. 10С) отдельно не оказывали значимого действия на интоксикацию.

VI. Комбинированная терапия аминокапроновой кислотой и тербинафином эффективно защищает нейроны от токсичности человеческого Ар₁.₄2.

В этом примере была оценена возможность с помощью комбинированной терапии аминокапроновой кислотой и тербинафином предотвращать или уменьшать токсические эффекты человеческого Ар₁.₄2.

Комбинированное лечение было проверено при экспериментальных условиях, описанных в примере П.1. Использовали культуру человеческих эндотелиальных клеток микрососудов мозга, как раскрыто в П.1, которую инкубировали одновременно или последовательно с лекарственной комбинацией.

Результаты представлены на фиг. 11. Как видно из результатов, агрегированный человеческий амилоидный пептид (Ав_1-42 2,5 мкМ) вызывает значительную интоксикацию, больше 40%, по сравнению с нейронами, обработанными носителем. Эту интоксикацию значимо предотвращала комбинация аминокапроновой кислоты и тербинафина (фиг. 11А), тогда как в таких же концентрациях аминокапроновая кислота (фиг. 11В) и тербинафин (фиг. 11С) отдельно не оказывали значимого действия на интоксикацию.

VII. Комбинированная терапия аминокапроиовой кислотой и левосименданом эффективно защищает нейроны от токсичности человеческого Ав₁.₄₂.

В этом примере была оценена возможность с помощью комбинированной терапии аминокапроновой кислотой и левосименданом предотвращать или уменьшать токсические эффекты человеческого Λβτ

42.

Результаты представлены на фиг. 12. Как видно из результатов, агрегированный человеческий амилоидный пептид (Ав_1-42 2,5 мкМ) вызывает значительную интоксикацию, больше 40%, по сравнению с нейронами, обработанными носителем. Эту интоксикацию значимо предотвращала комбинация аминокапроновой кислоты и левосимендана (фиг. 12А), тогда как в таких же концентрациях аминокапроновая кислота (фиг. 12В) и левосимендан (фиг. 12С) отдельно не оказывали значимого действия на интоксикацию.

VIII. Комбинированная терапия тербинафином и левосименданом эффективно защищает нейроны от токсичности человеческого Ав_1-42.

В этом примере была оценена возможность с помощью комбинированной терапии тербинафииом и левосименданом предотвращать или уменьшать токсические эффекты человеческого Ав_1-42.

Результаты представлены на фиг. 13. Как видно из результатов, агрегированный человеческий ами- 30 024465 лоидный пептид (Αβ_1-42 2,5 мкМ) вызывает значительную интоксикацию, больше 40%, по сравнению с нейронами, обработанными носителем. Эту интоксикацию значимо предотвращала комбинация тербинафина и левосимендана (фиг. 13А), тогда как в таких же концентрациях тербинафин (фиг. 13В) и левосимендан (фиг. 13С) отдельно не оказывали значимого действия на интоксикацию.

IX. Активность ίη νίνο.

Соединения и их комбинации, проявившие активность в тестах ίη νίίτο, проверили на модели болезни Альцгеймера ίη νίνο. Сверхэкспрессия трансгенов мутантного человеческого предшественника бетаамилоидного белка (АРР), связанного с болезнью Альцгеймера, является наиболее надежным способом, стимулирующим отложение Абета в мозге трансгенных мышей, которые служили моделью БА в многочисленных исследованиях. С возрастом у этих АРР-мутантных мышей развивается сильная амилоидная патология и другие признаки, подобные БА, включая уменьшенную синаптическую плотность, реактивный глиоз и некоторое когнитивное расстройство. Многие мышиные модели мутантных АРР демонстрируют незначительную потерю нейронов и ΝΡΤ-патологию (образование нейрофибриллярных клубков). Мыши гемизиготные по трансгену ВВ1-АЪе1а42 являются жизнеспособными и фертильными с нормальной продолжительностью жизни. Трансгенная ВК1-Абета42 мРНК экспрессируется по образцу, характерному для мышиного промотора белка приона; самые высокие уровни экспрессии трансгена обнаруживаются в зернистых клетках (гепариноцитах) мозжечка и гиппокампе, а также в коре головного мозга, варолиевом мосту, таламусе и среднем мозге. В трансгенном гибридном белке Абета1-42 соединяется с С-концом белка ВК1 в фурин-подобном сайте ращепления, так что расщепление приводит к эффективной секреции Абета1-42 в просвете или внеклеточном пространстве. Следовательно, эти мыши специфически экспрессируют изоформу Абета1-42. С возрастом у гемизиготных ВК1-Абета42 мышей накапливается нерастворимый в детергенте амилоид-бета, а полые бляшки в мозжечке развиваются уже в 3 месячном возрасте. Развитие патологии переднего мозга происходит позднее, внеклеточные бляшки Абета не появляются в гиппокампе и энторинальной области/грушевидной коре до 12-месячного возраста. Отложения бета-амилоида (полые бляшки) могут наблюдаться уже в 3 месяца в молекулярном слое мозжечка трансгенных мышей и становятся более выраженными с возрастом; редкие внеклеточные бляшки видны в энторинальной области/грушевидной коре и гиппокампе в 6-месячном возрасте, но не обнаруживаются постоянно до более, чем 12-месячного возраста. У самых старых мышей видна широко распространенная патология в виде полых и рассеянных бляшек в мозжечке, коре, гиппокампе и обонятельной луковице. Во внеклеточных амилоидных бляшках видны плотные амилоидные сердцевины с радиальными фибриллами; на периферии этих бляшек наблюдается множество узлов дистрофических нейритов. Имеется связь между реактивным глиозом и бляшками.

Лекарственное лечение.

Трансгенных мышей Тд (Ргпр-1ТМ2В /АРР695*42) А12Е тс (37) получили из лаборатории 1асккоп (1Шр://)а\т1сс.)а.\.огд/51гат/007002.1ит1). Мышей с самыми высокими уровнями Абета42 в плазме, линия ВК1-АЪе1а42А (12е), поддерживали на смешанной В6С3 основе. Взрослые самцы трансгенных мышей имели свободный доступ в воде и пище. В соответствии с протоколом, одобренным Комитетом по содержанию и использованию лабораторных животных, мышей взвешивали и вводили им внутрибрюшинно или принудительно кормили их (один раз в день в течение от 10 до 20 последовательных недель) или контрольным раствором (плацебо) или лекарственными средствами настоящего изобретения или лекарственными комбинациями из табл. 2, приготовленными в разных дозах.

Анализ выживаемости.

Выживаемость анализировали с помощью метода Каплана-Мейера. Для всех тестов использовали метод попарного множественного сравнения Холма-Сидака. Гибель по причинам, не относящимся к эксперименту, цензурировали. Все сравнения проводили между однопометными животными, чтобы ограничить искажающие эффекты линейных различий.

Поведенческие тесты.

Поведенческие тесты были разработаны и проводились в соответствии с методами, предложенными некоторыми авторами (38-41).

Пространственное обучение и память в водном лабиринте Морриса (М\УМ).

Этот эксперимент проводили в круглом бассейне, 90 см в диаметре, сделанном из прозрачного пластика и наполненном водой, подкрашенной молоком. Платформа для спасения, 8 см в диаметре, сделанная из прозрачного пластика, была погружена на 0,5 см ниже уровня воды. Зрительные ориентиры представляли собой разные геометрические формы, напечатанные буквами размера А4 и размещенные на четырех окружающих стенах (дистанция от бассейна составляла от 50 до 70 см). Каждой мыши предоставлялось четыре попытки ежедневно (от 5- до 7-минутного интервала между попытками, всего 16 попыток) в течение 4 дней. Каждая попытка осуществлялась из одного из четырех разных исходных пунктов. Движение мыши отслеживали с помощью УШеоЧаск Зойтаге (У1е\у Ροίηΐ). Определяли время, необходимое для определения местонахождения платформы спасения (латентность спасения; до 60 с). После определения местонахождения платформы мыши разрешалось сидеть на ней в течение 15 с. Мышей, которые не могли найти платформу в пределах 60 с, направляли к ней и позволяли оставаться на ней в течение 15 с. Задержка 60 с вносили в протокол для такого рода случая. Для статистического ана- 31 024465 лиза все четыре попытки в день усреднялись, за исключением первой попытки в 1 день. На 9 день (5 дней после последней тренировки) проводили 60-секундную пробную попытку, при которой платформу убирали и позволяли мышам искать ее. Регистрировали время, проводимое каждым животным в каждом квадранте (время поиска квадранта). Некоторые группы самцов мышей использовали в течение 3, 7, 10 и 12 месяцев.

Несколько мышей демонстрировали замирание (например, неподвижное лежание в воде и отказ плыть), что сильно мешало тестированию, этих животных исключили из анализа данных. Все поведенческие тесты проводили в тишине и при уменьшенном освещении.

Тест на кратковременную (оперативную) память в водном лабиринте с радиальными рукавами.

Оперативную память определяли с помощью теста с использованием устройства, состоящего из наполненного водой бассейна диаметром 100 см (также использованного в водном лабиринте Морриса и задачах по узнаванию платформы), снабженного вставками из алюминия для монтирования шести радиально-расходящихся рукавов для плавания. В течение 9-12 последовательных дней проводилась ежедневная сессия, состоящая из пяти попыток по 1 мин. В начале каждой сессии на конце одного из шести рукавов для плавания размещали прозрачную погруженную платформу (положение выбирали случайно, положение ежедневно менялось). Для каждого из первых четырех испытаний животное помещали в один из рукавов, не содержащий платформу (случайное чередование) и давали возможность искать платформу. В течение 60-секундного испытания, каждый раз, когда животное проникало в рукав, не содержащий платформу, его осторожно возвращали в начальное положение, а ошибку регистрировали. После четвертой попытки животному давали отдохнуть в течение 30 мин, а затем следовала пятая (сохранение) попытка, которая происходила в рукаве без платформы. Число ошибок (неправильный выбор рукава) и латентность спасения (время до достижения платформы, максимум 60 сек) регистрировали в течение каждой попытки.

Изучение пространственного ориентирования и памяти в тесте с круглой платформой.

Этот тест на когнитивную задачу проводили с помощью устройства, состоящего из круглой платформы диаметром 69 см, имеющую 16 спасительных отверстий (отверстий для избегания), расположенных на равном расстоянии друг от друга по окружности. Спасительное убежище располагается ниже одного из отверстий, а платформу, на которой размещаются различные визуальные ориентиры, окружает черная занавеска. Животное помещают в центр платформы в начале одной, 5-минутной попытки, и подается раздражитель, вызывающий отрицательную реакцию (яркий свет, поток воздуха от вентилятора). Регистрируется общее число ошибок (толчки головой в отверстия, не ведущие в убежище) и латентность спасения (время достижения спасительного отверстия).

Способность узнавания в тесте на узнавание платформы.

С помощью этой когнитивной задачи, основанной на поиске, оценивают способность распознавать и узнавать объект. Целевой объект состоит из круглой платформы, диаметром 9 см, оснащенную 10 смх40 см черным знаком (еп81дп), которая располагается на 0,8 см выше поверхности воды в круглом бассейне диаметром 100 см. Тестирование состояло из четырех 60-секундных попыток в день в течение четырех последовательных дней. Каждый день целевой объект помещается в разные квадранты бассейна для каждой попытки, а животное выпускается в одном и том же месте вдоль окружности бассейна в течение всех четырех попыток. Во время каждой попытки регистрируется общая задержка (максимум 60 с).

Модифицированный тест Ирвина.

Модифицированный тест Ирвина использовали для комплексного отбора, чтобы определить, проявляла ли какая-либо из мышей физиологические, поведенческие или сенсорно-двигательные нарушения, связанные с генотипом. Чтобы проанализировать двигательные навыки, координацию и мышечную силу, мышей помещали на проволоку, которая была натянута между двумя столбиками высотой 30 см, и оценивали их способность балансировать на проволоке. В дополнение к этому, определяли их способность хвататься и висеть на проволоке с помощью всех четырех лап по меньшей мере 5 с и влезать обратно на проволоку.

Количественная оценка отложения амилоида в сосудах.

Для количественной оценки церебральной амилоидной ангиопатии (САА) парафиновые срезы (5 мкм), сделанные с интервалами 30 мкм через теменной или мозжечковый лептоменинкс, подвергали иммуноокрашиванию биотинилированными-АЪ9 антителами (анти-в1-16, 1:500) в течение ночи при 4°С (п = 5-7 мышей на генотип в каждой возрастной группе, η = 6 срезов на мышь). Положительно окрашенные кровеносные сосуды оценивали визуально с помощью модифицированной системы подсчета Уопка!1е1'5 ксойпд 5уЧет (42). Подсчет тяжести САА проводили, умножая число САА сосудов на степень тяжести САА.

Гистология: иммуногистохимия и иммунофлуоресценция.

Мышей Тд и ДОТ в возрасте от 3 до 12 месяцев обезболивали и проводили перфузию транскардиально, последовательно 0,9% ЫаС1 и 4% параформальдегидом в 0,1 моль/л фосфатно-буферном растворе (РВ8) (рН 7,4) или 10% формалине и 4% параформальдегиде в 0,1 моль/л РВ8 (рН 7.4). Мозг и спинной

- 32 024465 мозг извлекали и хранили в 4% параформальдегиде. Некоторые образцы вставляли в парафин и нарезали на санном микротоме с толщиной 10 мкм. Криосрезы (14 мкм) нарезали на криостате и помещали на слайды, покрытые хромовокалиевыми квасцами. Эндогенную пероксидазу гасили, обработав срез метанолом, содержащим 0,3% Н₂О₂, в течение 30 мин. Срезы фиксировали в 10% лошадиной сыворотке. Используют первичные антитела и инкубируют в течение ночи при 4°С в присутствии 1% лошадиной сыворотки. Все вторичные Все вторичные биотинилированные или флуоресцеин-, техасский красный- и АМСА-связанные антитела, флуорохромы, АВС-набор и 3,3'-диаминобензидин в качестве хромогена для выявления активности пероксидазы получали от Уес1ог ЬаЪога1опе8. Инкубацию с вторичными антителами проводили при комнатной температуре в течение 1 ч. Для всех стадий промывки (3-10 мин) и разведения антител использовали фосфатно-буферный раствор (0,1 моль/л РВ8; рН 7,4) или Трис-буферный раствор (0,01 моль/л Трис; 0,15 моль/л ЫаС1, рН 7,4). Инкубацию с АВС комплексом и обнаружение с помощью 3,3'-диаминобензидина проводили согласно инструкции производителя. Контрастное окрашивание гематоксилином проводили согласно стандартным методикам. Для каждого определения использовали минимум три мыши на генотип, возраст и пол (43).

Приготовление мозговых экстрактов.

Мозг быстро извлекают на льду в промежутке между 90 и 120 мин после завершающей инъекции и замораживают до -80°С. Правое полушарие головного мозга от каждой мыши взвешивают после замораживания. Анализ массы полушария с учетом среднего абсолютного отклонения дает возможность исключить образцы, которые выходят за пределы 4 средних абсолютных отклонений от остальной части множества. Полушария головного мозга гомогенизируют и приготавливают клеточный лизат, содержащий цельный белок, согласно инструкциям производителя, с помощью набора для ферментных исследований (Κ&Ό 8у51е1П5, 1пс.). Вкратце, корковый слой мозга гомогенизируют в 800 мкл 1х буфера для экстракции с низким содержанием соли (Κ&Ό набор) и инкубируют на льду в течение 10 мин. Затем гомогенаты центрифугируют при 13000д в течение 15 мин при 4°С. Концентрацию белка в каждом образце оценивают с помощью биуретового анализа (Ртегсе). Уровни АРР, Λβ40 и Λβ42 измеряют с помощью вестерн-иммуноблотинга и метода сэндвич-ЕЫ8А. Кроме того, активности α-, β- и γ-секретаз можно измерить, используя те же самые экстракты.

Исследование уровней общего АРР в экстрактах коры головного мозга мыши.

Равное по содержанию белка количество экстрактов мозга загружали в каждый гель, 30 мкг на дорожку на образец. Каждый гель содержал восемь вариантов лечения: контроль; лекарственное средство 1 в дозе 7,5 мг/кг; и лекарственное средство 2 в нескольких дозах. Чтобы свести к минимуму колебания внутри геля, каждый гель содержал три набора всех лечебных групп. Каждый блот зондировали 22С11 антителами. Каждый блот также зондировали антителами к β-актину для стандартизации относительно эффективности переноса. Интенсивность сигнала полосы АРР нормировали с помощью полосы β-актина. Два образца контроли загружали в каждый гель/блот, чтобы проверить колебание от блота к блоту. Анализ блотов проводили двумя способами: Ь1о1 \\35е (п = 3), чтобы проверить колебание от блота к блоту; и объединенные блоты (п = 9 или 10), как описано (38-39). Анализ Ыо1-\\35е при п = 3 показывает то же самое направление (тенденцию) как окончательный анализ при п = 9 или 10. Представлены результаты объединенных исследований.

Ар сэндвич-ЕЫ8А.

Уровни Ав в переднем мозге и заднем мозге определяли независимо с помощью иммуноферментного анализа ЕЫ8А, а обонятельную луковицу исключили из исследования. Для исследования Ав в плазме собирали кровь (путем сердечного прокола) в пробирки, покрытые ЭДТА. Образцы крови центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин при 4°С, плазму делили на аликвоты и хранили при -80°С до использования. Уровни Ав определяли с помощью конец-специфического анализа сэндвичЕЫ8А, используя АЪ9 (анти-Ав1-16 АЪ) как АЪ для захвата Ав40, 13.1.1-НКР (анти-Ав35-40 АЪ) как АЪ определения для Ав40, 2.1.3 (анти-Ав35-42 АЪ) как АЪ захвата для Ав42, и АЪ9-НКР как АЪ определения для Ав42 (п = 5-7 мышей на генотип на каждую возрастную группу). Уровни Ав нормализовали относительно предыдущих результатов, используя те же самые меножества мышей в качестве внутренних контролей, чтобы свести к минумуму возможную вариабельность ЕЫ8А, как описано (46).

Вестерн-блоттинг.

Быстрозамороженные образцы переднего мозга гомогенизировали в буфере (ВоЧоп ВюРгойисК ХУогсеЧег, МА) для радиоиммунопреципитационнго анализа (ИГРА) с 1% смеси для ингибирования протеаз (КосЬе). Гомогенат центрифугировали при 100,000 х д в течение 1 ч при 4°С. Концентрацию белка в супернатанте определяли с помощью метода ВСА (Ртегсе). Образцы белка (20 мкг) пропускали на В18Тг18 12% ХТ гелях или В18-Тг18 4-12% ХТ гелях (Вю-Кай, Негси1е8, СА) и переносили на нитроцеллюлозные мембраны 0,2 мкм. Блоты обрабатывали в микроволновой печи в течение 2 мин в 0,1 М РВ8 дважды и зондировали АЪ 82Е1 (анти-Ав 1-16, 1:1000; 1ВЬ, Оипта, 1арап) и анти-АРР С-концевыми 20 аминокислотами (1:1000), как описано (46). Блоты снимали (8£гтррей) и повторно зондировали с помощью анти вактина (1:1000; 81дта) как контроль нагрузки. Относительную интенсивность полос измеряли с помощью программы Гтаде!

- 33 024465

Определение количества отложения амилоида в паренхиме.

Полусферы мозга фиксировали погружением в 10% формалин и обрабатывали для заливки в парафин. Срезы ткани мозга (5 мкм) подвергали иммуноокрашиванию общими анти-Ав антителами (АЬ). Окрашивали срезы гематоксилином. Для количественного определения использовали шесть срезов на мозг через гиппокамп, грушевидную кору (брегма, -1.70 до -2.80 мм) или мозжечок (долька мозжечка, стик (ножка) апкГогт и простые дольки; брегма, -5.40 до -6.36 мм) (п = 5-7 мышей на генотип на каждую возрастную группу). Нагрузку бляшками Ав определяли с помощью программного обеспечения Мс1аМогрЬ (Мо1еси1аг Осзлсск, Ра1о АНо, СА). Для определения количества полых бляшек серийные срезы, которые анализируют на нагрузку Ав, окрашивали тиофлавином δ (ΤΗίοδ), и подсчитывали количество Τΐιίοδ-положительных бляшек в гиппокампе, эиторинальной области/грушевидной коре или мозжечке. Все вышеперечисленные исследования проводились слепым образом.

Статистический анализ данных, полученных ίη νίνο.

Результаты всех экспериментов анализировали с помощью программного обеспечения δΤАΤIδΤIСА 8.0 (δίαΙκοΓΐ). Уровни Ав, нагруженность амилоидными бляшками и тяжесть САА анализировали с помощью АNОVА в сочетании с ροδΐ-Ьос тестом множественного сравнения Холма-Сидака или ΐтестом Стьюдента на основе двойной выборки. Если множество не соответствовало ограничениям параметрического теста, проводился или тест Крускала-Уоллиса с последующим ροδΐ-Ьос множественным сравнением Данна или тест ранговой суммы Манна-Уитни. Чтобы проверить, находились ли уровни Ав у битрансгенных мышей в соответствии с аддитивной суммой уровней Ав у одиночных трансгенных однопомётных животных, использовали множественную линейную регрессию без теста отсечения (пЛегсеρΐ ΐеδΐ). Все сравнения были сделаны между однопометными животными. Моделирование реакции на лекарственное средство сделано, исключая контрольные образцы (0 мг/кг). ΕΌ50 соответствует дозе (мг/кг), необходимой для того, чтобы вызвать 50% максимального ответа, индуцированного лекарственным средством в экспериментах. Его вычисляют с помощью уравнения Хилла для логарифма ΕΌ50.

С представляющими интерес лекарственными комбинациями проводили эксперименты ίη νίνο. Положительные результаты обучения и пространственной памяти перечислены в табл. 5, ниже.

Таблица 5

Лекарственное средство	Результаты в эксперименте с водным лабиринтом Морриса
Тербинафин и Левосимендан
Тербинафин и Сульфизоксазол
Баклофен и Левосимендан	+
Сульфизоксазол и Левосимендан	+
Аминокапроновая кислота и Левосимендан	+
Аминокапроновая кислота и Тербинафин

- 34 024465

Список использованной литературы

1. Сгоок К.., Уегккошетш А., е/ я/. (1998). Α νειπαηΐ οί А^Ьеипег'з сЬзеазе ννίίΗ зразйс рагарагез13 и ипизиа1 р!адиез бие ίο йекйоп οί ехоп 9 οί ргезешНп 1. Ναι Ме4. 4(4·): 452-5.

2. НоикЗеп Н., Вакег М., е1 а1. (2000), Уапап1 А1гЬе1тег'з сЬзеазе \νίΐ!ι зразНс рагарагез15 и соИоп ννοοί рЬциез :з саизеб Ьу РЗ-1 гтЬаНопз 1Ьа( 1еа<3 ίο ехсерЬопаПу Ы§Ь ату1о]<1-Ье1а сопсепкаиопз. Апп №иго1. 48(5): 806-8.

3. Кдток ТВ., ТасИе1 К., е1 а1. (1997). Τ\νο ηονεί (М233Т и К278Т) ргезепШп-1 ти1а1юпз ίη еаг1у-опзе1 А1гНе1п1ег'з сЬзеазе реск§геез и ргеПттагу еуМепсе £ог аззоСаПоп о£ ргезетНп-Ι тшаЬопз ννίίΗ а ηονεί рЬепо!уре. ЫеигогероП. 8(6): 1537-42.

4. Уегккошет! А., КаНто Н„ е( а!. (2001), Уапат ΑΙζΗείτηετ сЬзеазе 'Х’НЬ зразНс рагарагез1з: пеигораЙ1о1о£1са1 рЬепо1уре../Νβια-οραίΚοΙЕхр Ыеиго1. 60(5): 483-92.

5. СЬгоп М, (2004). ЗггаЕе^ез Гог сЬзеазе тосИйсайоп ίη АкгЬетег'з сЬзеазе. Ναι Кеу Νβκηκοί. 5(9): 677-85.

6. ЗиЬ Υ.Η. и СЬес1ег Р. (2002). Ату1оИ ргесигзог рго1ет, пресенелинз, и а1рЬазупис1е1п: то1еси1аг ра1Ьоаепез13 и рЬагтасо1о£1са1 аррНсайопз ίη А1гЬе1тег'$ сЬзеазе. РНагтасо! Кеу. 54(3): 469-525.

7. В1аскег О., А1Ьеп М.8., е/ а1. (1994). ЯеПаЪИПу и саЬсЬгу οί ΝΙΝΟϋδ-ΑΟΚΟΑ сгЬепа Гог АЬЬеЬпег'з сЬзеазе. ТЬе №Попа11пз(Ьи1е оГМеп1а1 НеаНЬ ОепеЬсз Ιηίΐϊαίίνε. АгсН №иго1, 51(12): 1198-204.

8. Коззог Μ.Ν., Рох Ν-С., е! а1. (1996). С1ЬЬса1 Геа1игез оГ зрогасЬс и ГатШа1 А1гЬе1тег'з сЬзеазе. НеигоАе^епегаНоп. 5(4): 393-7.

9. О1еппег О.О., Ψοη§ С.5У., е1 а1. (1984). ТЬе агау1ок1 ЬерозЬз ίη А1гЬеЬпег'з сЬзеазе: 1ЬеЬ пашге и раОюеепез^з. ΑρρΙΡαιΗοΙ. 2(6): 357-69,

10. ВаПаЕоге С., Ьее ν.Μ., е1 а1. (2007). Таи-тесЬа1е<! пеигоНеоепегаНоп ίη А1гЬе1тег'з сЬзеазе и ге1а1ес! сЬзогЬегз. На1 Κ.βν Меигозсх. 8(9): 663-72.

11. ВеИ К.Р. и С1аиЫо Сие11о А. (2006), АЬегеб зупарйс ίύηοΐΐοη ΐη А1гЬе1тег'з (Ьзеазе. Еиг У РНагтасо}. 545(1): 11-21.

12. Нагбу ТА, и ЬЬд§тз С.А. (1992). А1гЬе1тег'з сЬзеазе: 1Ье атукцсЗ сазсаНе Ьуро1Ьез13. $с>епсе. 256(5054): 184-5.

13. Вгаак Н. и Вгаак Е. (1991). Иеигора!Но1оз1са1 зЕа^ет^ οί А1гЬе1тег-ге1а1ес1 сНап§ез. Лс1а ΝηνοραΐΗοΙ. 82(4): 239-59.

14. ОоИе Т.Е. (2005). ТЬе АЪеТа Ьуро1Ьез1з: ]еасПп§ из № габопаНу-ОезЬтпеЬ ТегнреиЬе анагенез Гог [Ье 1геа1теп1 или ргеуепПоп οί ΑΙζΠείηκτ сЬзеазе, Βι·αίη ΡαίΗοΙ. 15(1): 84-7.

- 35 024465

15. Нак1у ί. и 5е1кое ϋ.Ι (2002). ТЬе ату1о10 ЬуроЛез13 оГ АЫктег'а (йзеазе: ргодгезз и ргоЫетз опЛе гоас! ю Шегареийсз. Заепсе. 297(5580): 353-6.

16. 5е1кое Γ7Ι (2000). ТНе депейсз и то1еси1аг раЛокду о Г АЬЬетег'з сНзеазе: го1ез оГату1о1с1 и 1Не ргезешПпз. Сеиго! СПп. 18(4): 903-22,

17. Ниапд Υ.Ζ., Ψοη 5., ее а!. (2000). Е.е§и1айоп оГ пеиге§иНп з1§паИп§ Ьу Ρ5Ώ-95 1п1егасТт§ \νϊΐΗ ЕгЬВ4 а( СКЗ зупарзез. Сеигоп. 26(2): 443-55.

18. Ыатзе 5., ТЫпакагап О., ее а!. (1998). ЕГГесЕз οί Р81 беййепсу оп тетЬгапе ргоГет ЕгаГйсйпд ίη пеигопз. Неигоп. 21(5):1213-21.

19. Ьеешуеп Ρ.Ν., Каш Н.Е., ее а! (1997). ТНе диатпе пис!еой6е ехсЬапде ГасЮг Т1ат1 айес1з пеигопа1 тогрЬо1оду; оррозтд го!ез Гог (Не зтаП ОТРазез Кас и КНо. 7 СеП Βίοι. 139(3):797-807.

20. Ое О., Регпапбег С.А., е/ а!. (2007). Вопе тогрНоеепейс рго!ет 1 ргосеззез рго1асйп 1о а 17-кЭа апйапдюдетс Гас1ог. Ргос Ναι! Асск! 8ά и 8 А. 104(24): 10010-5.

21. НагсИе Э-О. (2007). АМР-асйуа1е6/5ИР1 ргоТет копазез: сопзегуеб диагсНапз οί се11и1аг епегду, Ναι Ββν Мо! Се!! ΒίοΙ. 8(10): 774-85.

22. Κβίΐιϋΐ ТА., Εν.’βΠ М.А., ее а1. (2007), АМР-асЕкаЕеб рго1ет ктазе тесНаСез УЕОР-зПти1асес1 еп6о1ЬеНа1 ΝΟ ргобисиоп. ВюсВет ΒίορΒγί Кее Соттип. 354(4):1084-8.

23. ОисЫ Ν., КоЬауазЫ Н., ее а! (2004). АсНропесйп зйти!а1ез апг!о§епез1з Ьу рготоНпд сгозз-1а1к Ъейуееп АМР-асЙуа1е<] рго!ет ктазе и АкЕ з1§паНп§ ίη еп4о1ЬеНа1 се11з. 1Вю1СВет. 279(2):1304-9.

24. Нид С., У/апд Т, ее а1. (2004). Т-сабЬегт 1з а гесерЕог Гог Ьехатепс и ЫдНтсЯесикг-у.'еЩи: Гогтз оГ АсгрЗО/аЫропесЕт. Ргос Να[!АсаВ8с! II8А. 101(28):10308-13.

25. ЕпдНзН О., Коуа1а А.Т., ее а!. (1999). 1п6исЕюп οί епбоЕНеНа! се11 сНетоЕах13 Ьу зрЫпдозте 1-рНозрЬаЕе и зСаЫНгапоп оГ еп6оЕНеНа1 топо1ауег Ьагпег ίυηοΐίοη Ьу 1узорЬозрНайЫс асИ, ро1епйа1 тесПаЕогз οί Ьета1оро1е(1с апдтдепез13. 7 НетаеоеВег 8еет СеИЛех. 8(6):627-34.

26. ОоНасЬ А., К1арра Р., ее а! (2006). ТНе еп<к>р1азгЫс гепси1ит: ГоЫтд, саЫит ЬотеозЕазЁз, з1дпаНпд, игебох соп1го1. ЛпеюхМЛес!ох 8г§па1. 8(9-10): 1391-418.

27. УегкЬгаЕзку А. (2004). Еп4ор1азт1с геНси1ит са1с!ит 31дпайпд ίη пег.’е се11з. Βίο! Лез. 37(4): 693-9.

28. Соокзоп М.К.. (2003). ЫеигойедепегаЕшп: Ьоеу 4оез рагкт ргеуепЕ Рагктзоп'з сИзеазе? Сигг ΒίοΙ. 13(13): К.522-4.

29. 8ге С.1., 5и М., ее а!. (2004). Оовдп-гедЫаЕюп οί ΨΨ (Зотат-сопЕаттд охЫогесЫсЕазе тйисез Таи рИозрНогу1аНоп 1η νί(Γο, А рохегЫа! го1е ίη АЫНетег’з сИзеазе. 7 Βίο! СЬет. 279(29): 30498-506.

- 36 024465

30. У/гИсЬН 3., СигсЬоЗ МХ., е! а1. (2000), Ыепййсайоп οί Хугозте рНозрЬаХазез [На! ЗерЬозрЪогукхе Ле тзиНп гесерЮг. А ЬгиХе Гогсе арргоасЬ ЬазеЗ оп зиЪзХгаХе-Хгаррт§ тиХапХз. 7ΒίοΙ Скет. 275(13):9792-6.

31. СЬап§ Ν.8., ОоЬегХу Т, е! а1. (2003), 3ΝΚ1 рЬузкаПу тХегасХз \νίχΗ 7/7/ ЗотатсопХатт^ ох13оге3исхазе (ΨΟΧ1) и 1пЫЬ1сз 7/ОХ1-теЗ|аХеЗ арорХоз13, 7 ΒίοΙ Скет. 278(11):9195-202,

32. О'Огаг! О., СессЫпеШ В., е! а!. (2002). НотеоЗотат-1п1егасйп§ ргоХет ктазе-2 рЬозрЬогукХез р53 а! Зег 46 и те31а(ез арорХозхз, Ναι Се11 ΒίοΙ. 4(1):11-9,

33. Ζΐιιι Η., 7/и Ь., е1 а1. (2003). ΜϋΜ2 и рготуе1осуйс 1еикет1а ап(а§ош:ге еасЬ оХЬег (Егои^Ь Лей ЗкесХ тХегасХкп χνίΐΕ р53.7ΒίοΙ Скет. 278(49):49286-92.

34. Е.оЗп§иез 8., ϋβ 7/еуег О., е! а1. (2007). Оррозхп§ гокз οί пехпп-1 и Ле ЗерепЗепсе гесерХог ЭСС ίη сапсег се11 тхазюп, Хитог §ΓοννΛ и теХазХаз1$. Опса%епе. 26(38):5615-25.

35. ТапщисЛ Υ., Кгт З.Н., е! а1. (2003). РгезепШп-ЗерепЗепХ §атта-зесгехазе ргосеззтц о£Зе1е1еЗ 1п со!огес1а1 сапсег ФСС), Л ΒίοΙ Скет. 278(33):30425-8.

36. Зтсег С., р1§иегоа-МазоХ X., ВаХсЬекг К.., и йогза О. М1(оцеп-ас6уа(е8 ρϊοΐείη ктазе раЛ\уау те31а!ез езхгореп пеигоргоХесхкп айег д1иХатахе 1ох1с1ху ίη рптагу согЗса! пеигопз. 114еигозс1епсе, 1999, 19(7):2455-2463.

37. МсОо'л'ап Е., ех а1. (2005) Αβ42 1з ЕззепХха! Гог РагепсЬута1 и Уазсикг Ату1о13 ОеройХкп ίη М1се. Меигоп 47: 191-199.

38. ЬеЦЬху Е..Е. ех а1. (2008) Нзе οί агЗйма1 пеига! пеХхуогкз 1о ЗеХегтте οο§ηίχίνβ ипрактеп! и Легареийс ейесХкепезз ίη АкЬехтег’з 1гапз§еп1с тке. Зоита1 οί Иеигозскпсе МеЛоЗз 167: 358-366

39. АзЬе КН (2001) Ьеагтп§ и тетогу ίη Хгапз§епк гтсе тоЗеШпц АкЬетег'з З^зеазе. Ееагтпа и Метогу 8: 301-308.

40. Сайзоп ОА, еХ а1. (1997) Оепейс то81йсайоп οί Ле рЬепоХурез ргоЗисеЗ Ьу ату1о!3 ргесигзог ргоГет оуегехргеззкп ίη Хгапз§епк тке. Нитап Мо1еси1аг ОепеХкз 6:1951-1959.

41. Нзхао К, ех а1. (1996) СоггекХке тетогу ЗейтХз, АЬеха екуаХкп, и атук13 р1адиез Л Хгапздепк тке. Зскпсе 274: 99-102.

42. ОгеепЬег§ 5.М. УопзаХХе1 ЕР, (1997) Ώί3§ηθ3ΐ3 οί сегеЪга! атукхЗ апЦораХЬу. Зепз1ХтХу и зресккпу о£согхка1 Ъкрзу. Зсгоке 28(7):1418-22

43. ЗсЬтЗо'ЛакЗ К. ех а1. (2006) АкЬетхег’з О15еазе-1лке Таи ИехиораХНокду ЬеаЗз хо Метогу ОеКсзХа и Ьозз οί РипсХкпа! Зупарзез ίη а Νονεί МиСаХеЗ Таи Тгапз^епк Моизе \νίΛοιι( Апу МоХог ОейтХз. Ат ί Рах1хо1. 169: 599-616.

44. ЕаЫп 1Ж. ех а!. (2004) ОкХагу зиррктепХаХкп \νίΐΗ те1аХопт геЗисез ΙενεΕ о£ атук13 бета-рерХ13ез ίη хЬе типпе сегеЬга1 согХех. Лоигпа1 о/ΡίηβαΙ Кезеагск 36:224-231.

45. ВазЬа МК, еХ а1. (2005) ТЬе ГеХа1 Ьаз13 οί ату1о!3оцепезк: ехрозиге Хо 1еаЗ и 1аХепХ оуегехргеззкп οί атукчЗ ргесигзог ргоХет и ЪеХа-ату1о13 ίη Ле адт§ Ъгат. ,1оита1 о/ ккмгоасмпсе 25: 823-829.

46. ЕаЬш О,К. ех а1. (2007) ЕхрептепХа! АкЬехтег’з Охзеазе ϋηχ^ Ροδίρΐιεη [(РЬепзеппе] Ьоч.’егз Ату1о13-ЪеХаРерХхЗе Ьеуек ίη Се11 СиИиге и Мке. Зоигпа! οί РЬагтасокцу и ехрептепха1 Легареихкз 320: 386-396.

47. Рапз ϋ, ех а1, (2005) АпХ1-ап§к§ешс асХМху οί Ле тиХапХ ОиХсЬ А(ЬеХа) ρβρίίάβ оп Ьитап Ъгат ткгоуазси!аг епЗоХЬеИа! сеПз. Вгат Ке.! Мо1 Вгат Ке!. 136: 212-30,

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Применение левосимендана или его соли для приготовления медикамента для лечения болезни Альцгеймера (БА) или родственного нарушения, выбираемого из сенильного (старческого) слабоумия типа Альцгеймера (δΏΑΤ), болезни Паркинсона, деменции с тельцами Леви, сосудистой (микроинфарктной) деменции, умеренных когнитивных нарушений (МС1), возрастного нарушения памяти (ΑΑΜΙ) и проблем, связанных со старением, постцеребрального Паркинсонизма, бокового амиотрофического склероза (ΑΕδ), рассеянного склероза (Μδ) и синдрома Дауна.
2. Применение по п.1, при котором левосимендан или его соль используются в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным агентом, выбранным из аминокапроновой кислоты, акампросата, амлодипина, баклофена, цинакалцета, фенолдопама, лефлуномида, фенформина, прилокаина, сульфизоксазола, тадалафила, тербинафина, циннаризина, эплеренона, карбеноксолона, сулодексида, карбамазина, этомидата и зонисамида или их солей, которые вводятся совместно, отдельно или последовательно.
3. Применение по п.2, при котором указанный по меньшей мере один дополнительный агент выбран из аминокапроновой кислоты, баклофена, сульфизоксазола, тербинафина и зонисамида или их соли.
4. Применение по любому из предшествующих пунктов, при котором левосимендан или его соль составлены в композицию, содержащую фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
5. Применение по любому из предшествующих пунктов, при котором левосимендан или его соль вводятся пациенту многократно.
6. Применение по любому из пп.2-4, при котором левосимендан или его соль, дополнительный агент или его соль вводятся пациенту многократно.
7. Применение по любому из пп.2 или 3, при котором дополнительный агент или его соль составлены в композицию, содержащую фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
8. Применение по любому из пп.2-4, при котором левосимендан или его соль, по меньшей мере один дополнительный агент или его соль составлены в одну и ту же композицию, содержащую фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
9. Применение композиции, содержащей левосимендан или его соль, для приготовления медикамента защиты эндотелиальных и/или нервных клеток от Αβ-токсичности.
10. Способ лечения болезни Альцгеймера у млекопитающего, включающий его введение указанному субъекту эффективного количества левосимендана, его соли(ей) или его состава(ов) с замедленным высвобождением.