JP5977172B2 - アルツハイマー病を処置するための新しい治療アプローチ - Google Patents
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Description
本発明は、アルツハイマー病(AD)及び関連疾患の処置のための組成物及び方法に関する。更に具体的には、本発明は、アルツハイマー病及び関連疾患の新規な併用療法に関する。詳しくは、本発明は、単独で又は組合せで、シナプス機能及び/又は血管新生及び/又は細胞ストレス応答を効果的に調節することができる化合物に関する。本発明はまた、アルツハイマー病を処置するための薬剤又は薬剤の組合せを選択する方法、及びアルツハイマー病又は関連疾患を処置する方法に関する。
ADは、皮質連合野の障害に起因する、不全失語症(会話及び会話の理解に障害のある言語障害)、統合運動障害(運動又は感覚障害がないが、ある種の意図的動作及び身ぶりを統合及び遂行する能力を欠くこと)及び失認症(物体、人間、音、形状、又は匂いを認識する能力)を伴う記憶欠損を特徴とする原型的な皮質認知症である。痙性不全対麻痺(下肢に影響する衰弱)のような特定の症状を伴うこともある(1-4)。
本発明の目的は、AD及び関連疾患を処置するための新しい治療アプローチを提供することである。
ビヒクルと有意な差がある。*:p<0.05;****:p<0.0001:Aβ25−35と有意な差がある。両側スチューデントt検定。Aβ25−3520μMは、ビヒクル処理ニューロンに比較して有意な中毒(25%超)を起こす。この中毒は、アカンプロセート(図1A)又はゾニサミド(図1B)のいずれかにより有意に阻止される。
ビヒクルと有意な差がある。**:p<0.001:Aβ25−35と有意な差がある。両側スチューデントt検定。Aβ25−3520μMは、ビヒクル処理ニューロンに比較して有意な中毒(25%超)を起こす。この中毒は、フェンホルミンにより有意に阻止される。
ビヒクルと有意な差がある。**:p<0.01;***:p<0.0001;****:p<0.00001:Aβ25−35と有意な差がある。両側スチューデントt検定。Aβ25−3530μMは、わずかであるが有意な中毒を起こす(図3A〜D)。この中毒は、レフルノミド(図3A)、テルビナフィン(図3B)、スルフイソキサゾール(図3C)又はバクロフェン(−)(図3D)により有意に阻止される。更に、レフルノミド及びテルビナフィンは、アミロイドの有害作用を阻止するだけでなく、培地中の細胞の自然死も減少させる。
ビヒクルと有意な差がある。**:p<0.01;***:p<0.0001:Aβ25−35と有意な差がある。両側スチューデントt検定。Aβ25−3510μMは、ビヒクル処理ニューロンに比較して有意な中毒(25%超)を起こす(図4A及び4B)。この中毒は、プリロカイン(図4A)又はアムロジピン(図4B)により有意に阻止される。
ビヒクルと有意な差がある。*:p<0.05;***:p<0.001:Aβ25−35と有意な差がある。両側スチューデントt検定。Aβ25−3520μMは、ビヒクル処理ニューロンに比較して有意な中毒(25%超)を起こす(図5A及びB)。この中毒は、ゾニサミド(図5A)又はスルフイソキサゾール(図5B)又はレフルノミド(図5C)のいずれかにより有意に阻止される。
アミロイド中毒と有意な差がある(ANOVA+ダネットのポストホック(Dunett Post-Hoc)検定)。中毒は、それぞれ図6B、図6C、図6D、図6E、図6F、図6G、図6Hの用量反応実験において示されるように、スルフイソキサゾール、レボシメンダン、テルビナフィン、バクロフェン、アミノカプロン酸、スロデキシド、又はフェノルドパムにより有意に阻止される。
次の用量と有意な差がある。*:p<0.05:アミロイド中毒と有意な差がある(ANOVA+ダネットのポストホック検定)。
アミロイド中毒と有意な差がある(ANOVA+ダネットのポストホック検定)。全ての実験について、Aβ1−42は、ビヒクル処理ニューロンに比較して有意な中毒を起こす。この中毒は、バクロフェン(−86%)(B)、スルフイソキサゾール(−42%)(C)、レボシメンダン(−133%)(D)、エトミデート(−50%)(E)、カルベノキソロン(−39%)(F)、及びシンナリジン(−50%)(G)により有意に阻止される。全ての実験について、
Aβ1−42中毒と有意な差がある(ANOVA+ダネットのポストホック検定)。
Aβ1−42と有意な差がある。*:p<0.05、ビヒクルと有意な差がある。ANOVA+ダネットのポストホック検定。凝集ヒトアミロイドペプチド(Aβ1−422.5μM)は、ビヒクル処理ニューロンに比較して有意な中毒(40%超)を起こす。この中毒は、スルフイソキサゾールとレボシメンダンの併用により有意に阻止される(A)が、この濃度で、レボシメンダン(B)及びスルフイソキサゾール(C)単独では、中毒に及ぼす有意な作用はない。
Aβ1−42と有意な差がある。*:p<0.05、ビヒクルと有意な差がある。ANOVA+ダネットのポストホック検定。凝集ヒトアミロイドペプチド(Aβ1−422.5μM)は、ビヒクル処理ニューロンに比較して有意な中毒(40%超)を起こす。この中毒は、スルフイソキサゾールとテルビナフィンの併用により有意に阻止される(A)が、この濃度で、スルフイソキサゾール(B)及びテルビナフィン(C)単独では、中毒に及ぼす有意な作用はない。
Aβ1−42と有意な差がある。*:p<0.05、ビヒクルと有意な差がある。ANOVA+ダネットのポストホック検定。凝集ヒトアミロイドペプチド(Aβ1−422.5μM)は、ビヒクル処理ニューロンに比較して有意な中毒(40%超)を起こす。この中毒は、バクロフェンとレボシメンダンの併用により有意に阻止される(A)が、この濃度で、レボシメンダン(B)及びバクロフェン(C)単独では、中毒に及ぼす有意な作用はない。
Aβ1−42と有意な差がある。*:p<0.05、ビヒクルと有意な差がある。ANOVA+ダネットのポストホック検定。凝集ヒトアミロイドペプチド(Aβ1−422.5μM)は、ビヒクル処理ニューロンに比較して有意な中毒(40%超)を起こす。この中毒は、テルビナフィンとアミノカプロン酸の併用により有意に阻止される(A)が、この濃度で、アミノカプロン酸(B)及びテルビナフィン(C)単独では、中毒に及ぼす有意な作用はない。
Aβ1−42と有意な差がある。*:p<0.05、ビヒクルと有意な差がある。ANOVA+ダネットのポストホック検定。凝集ヒトアミロイドペプチド(Aβ1−422.5μM)は、ビヒクル処理ニューロンに比較して有意な中毒(40%超)を起こす。この中毒は、レボシメンダンとアミノカプロン酸の併用により有意に阻止される(A)が、この濃度で、アミノカプロン酸(B)及びレボシメンダン(C)単独では、中毒に及ぼす有意な作用はない。
Aβ1−42と有意な差がある。*:p<0.05、ビヒクルと有意な差がある。ANOVA+ダネットのポストホック検定。凝集ヒトアミロイドペプチド(Aβ1−422.5μM)は、ビヒクル処理ニューロンに比較して有意な中毒(40%超)を起こす。この中毒は、テルビナフィンとレボシメンダンの併用により有意に阻止される(A)が、この濃度で、テルビナフィン(B)及びレボシメンダン(C)単独では、中毒に及ぼす有意な作用はない。
本発明は、AD又は関連疾患を処置するための新しい治療アプローチを提供する。本発明は、このような疾患の有効な矯正を可能にし、かつ患者の処置に使用することができる、薬剤又は薬剤の組合せの新規な使用を開示する。
(1) アルツハイマー病の家族性症例の原因遺伝子との直接相互作用(APP、ApoE、プレセニリン、タウタンパク質)、
(2) 基準(1)により選択される遺伝子の機能的パートナー、
(3) 基準(2)により選択される遺伝子の最も近い機能的パートナー。
− AMPKのモジュレーター(好ましくは、フェンホルミン)及びナトリウムチャネルSCN1Aのインヒビター及びBKチャネルのアクチベーター(好ましくは、ゾニサミド)又はBKチャネルのモジュレーター(好ましくは、メチクロチアジド)、
− AMPKのモジュレーター(好ましくは、フェンホルミン)並びにGABA作動性及びグルタミン酸作動性受容体活性のモジュレーター(好ましくは、アカンプロセート、エトミデート及びアプリンジンから選択される)、
− AMPKのモジュレーター(好ましくは、フェンホルミン)及びEDNRAエンドセリン受容体のアンタゴニスト(好ましくは、スルフイソキサゾール)、
− ナトリウムチャネルSCN1Aのインヒビター及びBKチャネルのアクチベーター(好ましくは、ゾニサミド)又はBKチャネルのモジュレーター(好ましくは、メチクロチアジド)及びRYR3リアノジン受容体のモジュレーター(好ましくは、プリロカイン)、
− GABBR2受容体のモジュレーター(好ましくは、バクロフェン)及びRHOAのモジュレーター(好ましくは、テルビナフィン及びリセドロネートから選択される)、
− GABBR2受容体のモジュレーター(好ましくは、バクロフェン)及びEDNRAエンドセリン受容体のアンタゴニスト(好ましくは、スルフイソキサゾール)、
− GABBR2受容体のモジュレーター(好ましくは、バクロフェン)及びナトリウムチャネルSCN1Aのインヒビター及びBKチャネルのアクチベーター(好ましくは、ゾニサミド)又はBKチャネルのモジュレーター(好ましくは、メチクロチアジド)、
− GABBR2受容体のモジュレーター(好ましくは、バクロフェン)及びHAS1−3ヒアルロナン合成酵素のモジュレーター(好ましくは、レフルノミド)、
− ナトリウムチャネルSCN1Aのインヒビター及びBKチャネルのアクチベーター(好ましくは、ゾニサミド)又はBKチャネルのモジュレーター(好ましくは、メチクロチアジド)及びアデノシン受容体ADORA1/2/3のモジュレーター(好ましくは、ダイフィリン)、
− ナトリウムチャネルSCN1Aのインヒビター及びBKチャネルのアクチベーター(好ましくは、ゾニサミド)又はBKチャネルのモジュレーター(好ましくは、メチクロチアジド)及びEDNRAエンドセリン受容体のアンタゴニスト(好ましくは、スルフイソキサゾール)、
− RHOAのモジュレーター(好ましくは、テルビナフィン及びリセドロネートから選択される)及びEDNRAエンドセリン受容体のアンタゴニスト(好ましくは、スルフイソキサゾール)、
− RHOAのモジュレーター(好ましくは、テルビナフィン及びリセドロネートから選択される)及びホスホリパーゼPLA1A及びPLA2のインヒビター(好ましくは、メパクリン)、
− RHOAのモジュレーター(好ましくは、テルビナフィン及びリセドロネートから選択される)並びにGABA作動性及びグルタミン酸作動性受容体活性のモジュレーター(好ましくは、アカンプロセート、エトミデート及びアプリンジンから選択される)、
− RHOAのモジュレーター(好ましくは、テルビナフィン及びリセドロネートから選択される)及び化学シャペロン(好ましくは、リファブチン)、
− AMPKのモジュレーター(好ましくは、フェンホルミン)並びにPDE11A及びPDE4A、PDE5Aホスホジエステラーゼのインヒビター(好ましくは、タダラフィル、エンプロフィリン及びオクストリフィリンから選択される)、
− ナトリウムチャネルSCN1Aのインヒビター及びBKチャネルのアクチベーター(好ましくは、ゾニサミド)又はBKチャネルのモジュレーター(好ましくは、メチクロチアジド)及びトロンビン受容体F2Rシグナル伝達のモジュレーター(好ましくは、アルガトロバン及びセフメノキシム)、
− AMPKのモジュレーター(好ましくは、フェンホルミン)並びにプリン作動性受容体P2RY1及びP2RY12のモジュレーター(好ましくは、クロピドグレル)、
− GABA作動性及びグルタミン酸作動性受容体活性のモジュレーター(好ましくは、アカンプロセート、エトミデート及びアプリンジンから選択される)並びにCASRのモジュレーター(好ましくは、シナカルセト)、
− EDNRAエンドセリン受容体のアンタゴニスト(好ましくは、スルフイソキサゾール)及びCASRのモジュレーター(好ましくは、シナカルセト)、
− RHOAのモジュレーター(好ましくは、テルビナフィン及びリセドロネートから選択される)及びトロンビン受容体F2Rシグナル伝達のモジュレーター(好ましくは、アルガトロバン及びセフメノキシムから選択される)、
− GABBR2受容体のモジュレーター(好ましくは、バクロフェン)並びにプリン作動性受容体P2RY1及びP2RY12のモジュレーター(好ましくは、クロピドグレル)、
− RHOAのモジュレーター(好ましくは、テルビナフィン及びリセドロネートから選択される)並びにプリン作動性受容体P2RY1及びP2RY12のモジュレーター(好ましくは、クロピドグレル)、
− ナトリウムチャネルSCN1Aのインヒビター及びBKチャネルのアクチベーター(好ましくは、ゾニサミド)又はBKチャネルのモジュレーター(好ましくは、メチクロチアジド)及び電位依存性カルシウムCACNAチャネルのアンタゴニスト(好ましくは、シンナリジン、ベニジピン、パラメタジオン及びアムロジピンから選択される)、
− GABA作動性及びグルタミン酸作動性受容体活性のモジュレーター(好ましくは、アカンプロセート、エトミデート及びアプリンジンから選択される)並びに電位依存性カルシウムCACNAチャネルのアンタゴニスト(好ましくは、シンナリジン、ベニジピン、パラメタジオン及びアムロジピンから選択される)、
− ナトリウムチャネルSCN1Aのインヒビター及びBKチャネルのアクチベーター(好ましくは、ゾニサミド)又はBKチャネルのモジュレーター(好ましくは、メチクロチアジド)及びHIF1Aシグナル伝達のモジュレーター(好ましくは、シクロピロックス)、
− GABA作動性及びグルタミン酸作動性受容体のモジュレーター(好ましくは、アカンプロセート、エトミデート及びアプリンジンから選択される)並びにHIF1Aシグナル伝達のモジュレーター(好ましくは、シクロピロックス)、
− EDNRAエンドセリン受容体のアンタゴニスト(好ましくは、スルフイソキサゾール)及び酸化的リン酸化のモジュレーター(好ましくは、アモバルビタール及びメチマゾールから選択される)、
− ナトリウムチャネルSCN1Aのインヒビター及びBKチャネルのアクチベーター(好ましくは、ゾニサミド)又はBKチャネルのモジュレーター(好ましくは、メチクロチアジド)及び酸化的リン酸化のモジュレーター(好ましくは、アモバルビタール及びメチマゾールから選択される)、
− EDNRAエンドセリン受容体のアンタゴニスト(好ましくは、スルフイソキサゾール)及びビタミンK代謝のモジュレーター(好ましくは、セフォテタン)、
− ナトリウムチャネルSCN1Aのインヒビター及びBKチャネルのアクチベーター(好ましくは、ゾニサミド)又はBKチャネルのモジュレーター(好ましくは、メチクロチアジド)及びビタミンK代謝のモジュレーター(好ましくは、セフォテタン)、
− GABA作動性及びグルタミン酸作動性受容体活性のモジュレーター(好ましくは、アカンプロセート、エトミデート及びアプリンジンから選択される)並びにPRKG1のモジュレーター(好ましくは、四硝酸エリスリチル)、
− ナトリウムチャネルSCN1Aのインヒビター及びBKチャネルのアクチベーター(好ましくは、ゾニサミド)又はBKチャネルのモジュレーター(好ましくは、メチクロチアジド)及びPRKG1のモジュレーター(好ましくは、四硝酸エリスリチル)、
− EDNRAエンドセリン受容体のアンタゴニスト(好ましくは、スルフイソキサゾール)及びPRKG1のモジュレーター(好ましくは、四硝酸エリスリチル)、
− KCNJ11のモジュレーター(好ましくは、ミチグリニド及びレボシメンダンから選択される)及びPRKG1のモジュレーター(好ましくは、四硝酸エリスリチル)、
− KCNJ11のモジュレーター(好ましくは、ミチグリニド及びレボシメンダンから選択される)及びナトリウムチャネルSCN1Aのインヒビター及びBKチャネルのアクチベーター(好ましくは、ゾニサミド)又はBKチャネルのモジュレーター(好ましくは、メチクロチアジド)、
− KCNJ11のモジュレーター(好ましくは、ミチグリニド及びレボシメンダンから選択される)及びRHOAのモジュレーター(好ましくは、テルビナフィン及びリセドロネートから選択される)。
− フェンホルミン及びゾニサミド、
− フェンホルミン及びメチクロチアジド、
− フェンホルミン及びアカンプロセート、
− フェンホルミン及びスルフイソキサゾール、
− バクロフェン及びアミノカプロン酸、
− バクロフェン及びレボシメンダン、
− バクロフェン及びテルビナフィン、
− バクロフェン及びリセドロネート、
− バクロフェン及びスルフイソキサゾール、
− バクロフェン及びゾニサミド、
− バクロフェン及びメチクロチアジド、
− バクロフェン及びスルフイソキサゾール、
− バクロフェン及びレフルノミド、
− アミノカプロン酸及びスルフイソキサゾール、
− アミノカプロン酸及びテルビナフィン、
− アミノカプロン酸及びレボシメンダン、
− レボシメンダン及びスルフイソキサゾール、
− レボシメンダン及びテルビナフィン、
− ゾニサミド及びダイフィリン、
− メチクロチアジド及びダイフィリン、
− ゾニサミド及びプリロカイン、
− メチクロチアジド及びプリロカイン、
− ゾニサミド及びスルフイソキサゾール、
− フェンホルミン及びクロピドグレル、
− アカンプロセート及びシナカルセト、
− スルフイソキサゾール及びシナカルセト、
− テルビナフィン及びアルガトロバン、
− テルビナフィン及びセフメノキシム、
− バクロフェン及びクロピドグレル、
− テルビナフィン及びクロピドグレル、
− リセドロネート及びクロピドグレル、
− ゾニサミド及びシンナリジン、
− アカンプロセート及び四硝酸エリスリチル、
− スルフイソキサゾール及び四硝酸エリスリチル、
− ミチグリニド又はレボシメンダン及び四硝酸エリスリチル、
− ミチグリニド又はレボシメンダン及びゾニサミド、
− ミチグリニド又はレボシメンダン及びテルビナフィン、
− ミチグリニド又はレボシメンダン及びリセドロネート、
− ミチグリニド又はレボシメンダン及びメチクロチアジド、
− メチクロチアジド又はゾニサミド及びスルフイソキサゾール、
− テルビナフィン又はリセドロネート及びスルフイソキサゾール、
− テルビナフィン又はリセドロネート及びメパクリン、
− テルビナフィン又はリセドロネート及びアカンプロセート、
− テルビナフィン又はリセドロネート及びリファブチン、
− タダラフィル又はエンプロフィリン又はオクストリフィリン及びフェンホルミン、
− ゾニサミド又はメチクロチアジド及びアルガトロバン又はセフメノキシム、
− リセドロネート及びアルガトロバン又はセフメノキシム、
− ゾニサミド又はメチクロチアジド及びシンナリジン又はベニジピン又はパラメタジオン又はアムロジピン、
− アカンプロセート及びシンナリジン又はベニジピン又はパラメタジオン又はアムロジピン、
− ゾニサミド又はメチクロチアジド及びシクロピロックス、
− スルフイソキサゾール及びアモバルビタール、
− ゾニサミド又はメチクロチアジド及びアモバルビタール、
− スルフイソキサゾール及びセフォテタン、
− ゾニサミド又はメチクロチアジド及びセフォテタン、
− ゾニサミド又はメチクロチアジド及び四硝酸エリスリチル。
− バクロフェン及びアミノカプロン酸、
− バクロフェン及びレボシメンダン、
− アミノカプロン酸及びスルフイソキサゾール、
− アミノカプロン酸及びテルビナフィン、
− アミノカプロン酸及びレボシメンダン、
− レボシメンダン及びスルフイソキサゾール、
− レボシメンダン及びテルビナフィン、
− エプレレノン及びレボシメンダン、
− エプレレノン及びスルフイソキサゾール、
− エプレレノン及びフェノルドパム、
− スロデキシド及びレボシメンダン、
− スロデキシド及びスルフイソキサゾール、
− スロデキシド及びフェノルドパム、又は
− エプレレノン及びスロデキシド。
経口使用のための製剤は、活性成分を非毒性の薬学的に許容しうる賦形剤との混合物中に含有する錠剤を包含する。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤又は充填剤(例えば、ショ糖、微結晶性セルロース、バレイショデンプンを包含するデンプン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、又はリン酸ナトリウム);造粒剤及び崩壊剤(例えば、微結晶性セルロースを包含するセルロース誘導体、バレイショデンプンを包含するデンプン、クロスカルメロースナトリウム、アルギン酸塩、又はアルギン酸);結合剤(例えば、アカシアゴム、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、デンプン、α化デンプン、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はポリエチレングリコール);並びに滑沢剤、流動促進剤、及び粘着防止剤(例えば、ステアリン酸、シリカ、又はタルク)であろう。他の薬学的に許容しうる賦形剤は、着色料、着香剤、可塑剤、保湿剤、緩衝剤などであってよい。
水の添加により水性懸濁液の調製に適している散剤、分散性散剤、又は顆粒剤は、経口投与に便利な投与剤形である。懸濁剤としての製剤は、分散剤又は湿潤剤、懸濁化剤、及び1種以上の保存料との混合物中の活性成分を提供する。適切な懸濁化剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウムなどである。
本医薬組成物はまた、注射、点滴又は体内移植(静脈内、筋肉内、皮下など)により、従来の非毒性の薬学的に許容しうる担体及び補助剤を含有する、投与剤形、製剤にして、又は適切な送達装置若しくはインプラントを介して非経口投与してもよい。このような組成物の製剤設計及び調製法は、医薬品製剤の当業者には周知である。
直腸内適用には、組成物に適している投与剤形は、坐剤(乳剤又は懸濁剤型)、及び直腸用ゼラチンカプセル剤(液剤又は懸濁剤)を包含する。典型的な坐剤製剤では、活性薬剤は、適切な薬学的に許容しうる坐剤基剤(カカオ脂、エステル化脂肪酸、グリセリンゼラチンなど)及びポリエチレングリコールのような種々の水溶性又は分散性基剤と合わせられる。種々の添加剤、増強剤、又は界面活性剤を組み込んでもよい。
本医薬組成物はまた、ミクロスフェア及びリポソームを包含する、従来の非毒性の薬学的に許容しうる担体及び賦形剤を含有する投与剤形又は製剤として、経皮吸収のため皮膚上に局所投与することができる。この製剤は、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、リニメント剤、ゲル剤、ヒドロゲル剤、液剤、懸濁剤、スティック剤、噴霧剤、泥膏、硬膏剤、及び他の種類の経皮薬物送達システムを包含する。薬学的に許容しうる担体又は賦形剤は、乳化剤、酸化防止剤、緩衝剤、保存料、保湿剤、浸透促進剤、キレート剤、ゲル形成剤、軟膏基剤、香料、及び皮膚保護剤を包含してもよい。
当然のことながら、組合せの薬剤は、同一であるか若しくは異なる医薬品製剤のいずれかで同時に、又は連続して投与することができる。連続投与であるならば、第2の(又は追加の)活性成分を投与する際の遅延時間は、活性成分の組合せの有効な作用の恩恵を失わないようにすべきである。本説明の組合せにとって最小限の要件は、この組合せが、活性成分の組合せの有効な作用の恩恵を持つ組合せ使用を目的とすることである。組合せの使用目的は、本発明の組合せの使用を助けるための施設、設備、適応及び/又は他の手段により推察することができる。
− アミノカプロン酸 1日に約0.05〜15g、
− レボシメンダン 1日に0.05〜4mg、
− アムロジピン 経口 1日に約0.05〜1mg、
− クロピドグレル 経口 1日に約0.75〜7.5mg、
− タダラフィル 経口 1日に約0.05〜0.5mg、
− シロスタゾール 経口 1日に約1〜10mg、
− テルビナフィン 経口 1日1回又は2回 約2.5〜25mg、
− レフルノミド 経口 1日に約0.25〜2.5mg、
− シナカルセト 経口 1日に約0.3〜3mg、
− アカンプロセート 経口 1日3回 約7〜70mg、
− メチマゾール 経口 1日に約0.05〜1.5mg、
− メパクリン 経口 1日に約3〜30mg、
− フェンホルミン 経口 1日に約0.5〜5mg、
− バクロフェン 経口 1日に約0.4〜8mg(2回又は3回の分割用量にして投与)、
− リファブチン 経口 1日に約6〜60mg、
− アモバルビタール 経口 1日に約0.06〜15mg、
− セフォテタン 経口 1日に約0.01〜0.4mg、
− ダイフィリン 経口 1日に約6〜60mg(2回又は3回の分割用量にして)、
− メチクロチアジド 経口 1日に約0.025〜1mg、
− リセドロネート 経口 1日に約0.05〜3mg、
− エトミデート 経口 1日に約0.6〜6mg、
− ゾニサミド 経口 1日に約1〜40mg。
I. 化合物及びその組合せはAβ25−35ペプチドの毒性を阻止する。
この第1シリーズの実験では、候補化合物は、Aβ25−35ペプチドの毒性作用を阻止又は縮小するその能力に関して試験した。薬剤は、最初に個々に試験し、続いてそれらの組合せの作用の分析を行う。効果は、化合物の活性を更に例証するために種々の細胞型で測定する。
細胞培養
ラット初代皮質ニューロンは、Singer et al., 1999に報告されたように培養する。簡単に述べると、妊娠期間15日のメス妊娠ラットを頚椎脱臼により殺処分して(Rats Wistar; Janvier)、胎仔を子宮から取り出す。皮質を取り出し、1%のペニシリン−ストレプトマイシン(PS;Invitrogen)及び1%のウシ血清アルブミン(BSA;Sigma)を含有するLeibovitz(L15;Invitrogen)の氷冷培地に入れる。皮質は、37℃で20分間のトリプシン処理(トリプシンEDTA 1×;Invitrogen)により分離し、カルシウム及びマグネシウムを含まないPBSに希釈する。反応は、DNAアーゼIグレードII(0.1mg/ml;Roche Diagnostic)及び10%のウシ胎仔血清(FCS;Invitrogen)を含有するダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM;Invitrogen)の添加により停止させる。次に細胞は、3代継代により10mlピペットを介して機械的に分離する。次いで細胞は、180×gで10℃で10分間遠心分離する。上清は廃棄して、ペレットの細胞は、B27(2%;Invitrogen)、L−グルタミン(0.2mM;Invitrogen)、1%のPS溶液及び10ng/mlの脳由来神経栄養因子(BDNF、Pan Biotech)を補足したNeurobasal(Invitrogen)よりなる合成培地に再懸濁する。生存細胞は、トリパンブルー色素排除試験法を用いてNeubauer細胞計数器でカウントする。細胞は、30,000細胞/ウェルの密度で96ウェルプレート(ウェルはポリ−L−リシン(10μg/ml;Sigma)でプレコートする)に播種して、加湿空気(95%)/CO2(5%)雰囲気で37℃で培養する。
細胞は、エタノール(95%)及び酢酸(5%)の冷溶液で10分間固定する。0.1%のサポニンでの透過処理後、細胞は、10%ヤギ血清を含有するPBSで2時間ブロックする。次に細胞は、微小管結合タンパク質2(MAP−2;Sigma)に対するモノクローナル抗体と共にインキュベートする。この抗体は、細胞体及び神経突起を特異的に明らかにする。使用する第2の抗体は、Alexa Fluor 488ヤギ抗マウスIgG(Molecular probe)である。ニューロンの核は、蛍光色素(Hoechst溶液、SIGMA)により明らかにする。InCell AnalyzerTM 1000(GE Healthcare)を倍率20×で用いて、1ウェルにつき20枚の写真を撮る。全ての画像は、同じ条件で撮る。神経突起長は、Developerソフトウェア(GE Healthcare)を用いて定量する。
図1に提示される結果は、1条件につき2回の独立培養、6ウェルから抽出される。全ての値は、平均±標準誤差として表す。両側スチューデントt検定解析を生データで実施する。結果は、対照(ビヒクル)に比較した神経突起長の百分率として表す。
細胞培養
ラット脳内皮細胞の初代培養(Vect-Horus SAS, Marseille)は、継代数0で培養する。コンフルエンスで、内皮細胞はトリプシンEDTA(Pan Biotech Ref: P10-023100)で分離する。細胞は、25,000細胞/ウェルの密度で96ウェルプレート(ウェルは、30μlのラットI型コラーゲン(1.5mg/ml、Vect-Horus SAS、Marseille)でコートする)に播種して、1%の微小血管増殖補給剤(MVGS、S-005-25、Invitrogen)を補足したMCBD 131培地(M-131-500、Invitrogen)中で培養する。細胞は、加湿空気(95%)/CO2(5%)雰囲気で37℃で培養する。培地の半分は1日おきに新鮮培地と交換する。
各培養液について、3日間の中毒後、上清を採取して細胞毒性検出キット(LDH、Roche Applied Sciences)で分析する。細胞死の定量のためのこの比色定量法は、損傷細胞のサイトゾルから上清に放出される乳酸脱水素酵素(LDH)活性の測定に基づく。光学密度(DO)は、波長492nmでマルチスキャン装置(Thermo、Ref Ascent)により分光計によって評価する。
図3に提示される結果は、1条件につき2回の独立培養、6ウェルから抽出される。全ての値は、平均±標準誤差として表す。両側スチューデントt検定解析を生データで実施する。結果は、対照(ビヒクル)に比較した細胞生存の百分率として表す。
PC12細胞培養
ATCC(ATCC CRL-1721)からのP12(褐色細胞腫ラット、ATCC ref: CRL-1721)細胞は、37℃の水中で急速に解凍した。上清は直ちに9mlのPC12増殖培地[15%熱失活ウマ血清(Invitrogen ref: 16050-130)、2.5%のウシ胎仔血清(FBS;Invitrogen ref: 16000-036)、1%のペニシリン10,000U/ml及びストレプトマイシン10mg/ml(PS;Pan Biotech ref: P06-07100)並びに1%のL−グルタミン200mM(Pan Biotech ref: P04-80100)を含むダルベッコ修飾イーグル培地DMEM-F12(Pan Biotech ref: P04-41450)を含有する]に入れた。
PC12細胞(継代数2)は、ポリ−L−リシン(Sigma)でプレコートした96ウェルプレート(Greiner Ref: 655180)に1cm2あたり3300細胞の計算で、B27(2%、Invitrogen、Ref: 21103049)、ペニシリン(50U/ml)−ストレプトマイシン(50μg/ml)及びグルタミン(1%)並びに50ng/mlのNGF(Sigma Ref: N1408)を含有するNeurobasal培地(Invitrogen、Ref: 21103049)に播種する。NGFによりPC12は交感神経ニューロン様細胞に分化することができる。
ラット初代皮質ニューロンは、Singer et al., 1999に報告されたように培養する。簡単に述べると、妊娠期間15日のメス妊娠ラットを頚椎脱臼により殺処分して(Rats Wistar; Janvier)、胎仔を子宮から取り出す。皮質を取り出し、1%のペニシリン−ストレプトマイシン(PS;Invitrogen)及び1%のウシ血清アルブミン(BSA;Sigma)を含有するLeibovitz(L15;Invitrogen)の氷冷培地に入れる。皮質は、37℃で20分間のトリプシン処理(トリプシンEDTA 1×;Invitrogen)により分離し、カルシウム及びマグネシウムを含まないPBSに希釈する。反応は、DNAアーゼIグレードII(0.1mg/ml;Roche Diagnostic)及び10%のウシ胎仔血清(FCS;Invitrogen)を含有するダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM;Invitrogen)の添加により停止させる。次に細胞は、3代継代により10mlピペットを介して機械的に分離する。次いで細胞は、180×gで10℃で10分間遠心分離する。上清は廃棄して、ペレットの細胞は、B27(2%;Invitrogen)、L−グルタミン(0.2mM;Invitrogen)、1%のPS溶液及び10ng/mlの脳由来神経栄養因子(BDNF、Pan Biotech)を補足したNeurobasal(Invitrogen)よりなる合成培地に再懸濁する。生存細胞は、トリパンブルー色素排除試験法を用いてNeubauer細胞計数器でカウントする。細胞は、30,000細胞/ウェルの密度で96ウェルプレート(ウェルはポリ−L−リシン(10μg/ml;Sigma)でプレコートする)に播種して、加湿空気(95%)/CO2(5%)雰囲気で37℃で培養する。
2日間の培養後、上清を採取して細胞毒性検出キット(LDH、Roche Applied Sciences)で分析する。細胞死の定量のためのこの比色定量法は、損傷細胞のサイトゾルから上清に放出される乳酸脱水素酵素(LDH)活性の測定に基づく。光学密度(DO)は、波長492nmでマルチスキャン装置(Thermo、Ref Ascent)により分光計によって評価する。結果は、陰性対照(ビヒクル)に比較した細胞生存の百分率として表す。
図4及び5に提示される結果は、1条件につき2回の独立培養、6ウェルから抽出される。全ての値は、平均±標準誤差として表す。両側スチューデントt検定解析を生データで実施する。結果は、対照(ビヒクル)に比較した神経突起長の百分率として表す。
シナプス機能及び/又は血管新生及び/又は細胞ストレス応答を調節する幾つかの薬剤の組合せによりインビトロ試験法も実施する。
この更なるシリーズの実験では、候補化合物は、ヒトAβ1−42の毒性作用を阻止又は縮小するその能力に関して試験した。Aβ1−42は、ADに罹患したヒト患者からの生検で見い出される凝集体を構成する完全長ペプチドである。薬剤は、最初に個々に試験し、続いてそれらの組合せの作用の分析を行う。効果は、化合物の活性を更に実証するために種々の細胞型で測定する。
候補化合物により得られるAβ1−42毒性からの保護作用を試験するために、ヒト脳微小血管内皮細胞培養物を使用した。
簡単に述べると、Aβ1−42ペプチド(Bachem、ref: H1368 batch 1010533)は、合成培地に20μM(母液)で再構成して、凝集させるために+37℃で暗所で3日間ゆっくり振盪した。対照培地は、同じ条件で調製した。
VEGF−Aの血管新生促進性アイソフォームであることが知られているVEGF−165を、本試験の全ての実験について基準化合物として使用した。VEGF−165は、血管新生に関与する最も豊富なVEGFアイソフォームの1つである。VEGFは、10nMで基準試験化合物として使用した。
・ 陰性対照:培地単独+0.1% DMSO
・ 中毒:アミロイド−β1−42(2.5μM)18時間
・ 陽性対照:VEGF−165(10nM)(1基準化合物/培養)、1時間後Aβ1−42(2.5μM)添加、インキュベーション時間18時間。
・ 試験化合物:試験化合物、1時間後Aβ1−42(2.5μM)添加、インキュベーション時間18時間。
1ウェルあたり、透過光でInCell AnalyzerTM 1000(GE Healthcare)を用いて4×レンズで写真2枚を撮った。全ての画像は、同じ条件で撮った。血管新生ネットワークの分析は、Developerソフトウェア(GE Healthcare)を用いて行った。毛細管網の全長を評価した。
全ての値は、培養3回の平均±標準誤差として表す(1条件につきn=6)。統計解析は、様々な条件について、ANOVAと可能であればダネット検定を実施した(Statviewソフトウェア、バージョン5.0)。グラフに挿入される値(%として)は、アミロイド毒性の展開を示す。実際、アミロイド毒性を100%としてとり、試験化合物の作用は、このアミロイド毒性の%として算出した。
結果は、図6及び表3に示す。これらは、薬剤が単独で、Aβペプチド1−42に起因する毒性に対する実質的な保護作用を誘導することを証明している:
− アミノカプロン酸は単独で、例えば、160nMの低用量で強い保護作用を誘導する;
− レボシメンダンは、8nMという低い用量で強い保護作用を誘導する。
試験化合物及びヒトアミロイド−β1−42の処理
ラット初代皮質ニューロンは前記のように培養する。
エストラジオール−βを100及び150nMで基準試験化合物として使用し、そしてBDNFを50ng/mlで陽性対照として使用した。
− 1対照プレート:12ウェル/条件
・ 陰性対照:培地単独+0.1% DMSO
・ 中毒:アミロイド−β1−42(10μM)24時間
・ 陽性対照:BDNF(50ng/ml)1時間、続いてアミロイド−β1−42(10μM)24時間
・ 基準化合物:エストラジオール(150nM)1時間、続いてアミロイド−β1−42(10μM)24時間
− 薬剤プレート:6ウェル/条件
・ 陰性対照:培地単独+0.1% DMSO
・ 中毒:アミロイド−β1−42(10μM)24時間
・ 薬剤1:薬剤1−1時間、続いてアミロイド−β1−42(10μM)24時間
・ 薬剤2:薬剤2−1時間、続いてアミロイド−β1−42(10μM)24時間
中毒の24時間後、上清を取り出して細胞毒性検出キット(LDH、Roche Applied Sciences、ref: 11644793001、batch: 11800300)で分析した。細胞毒性の定量のためのこの比色定量法は、死滅細胞のサイトゾルから上清に放出される乳酸脱水素酵素(LDH)活性の測定に基づく。
全ての値は、培養3回の平均±標準誤差として表す(1条件につきn=6)。統計解析は、様々な条件について実施した(ANOVA、続いて可能であればダネット検定、Statviewソフトウェア、バージョン5.0)。
初代皮質神経細胞の毒性試験法で個々の選択薬剤について得られる結果は、表3及び図7に提示される。
本発明の薬剤の組合せの効力をヒト細胞で評価する。これらの試験法に使用されるプロトコールは、上記II.1項に記載されたものと同じである。
以下の薬剤の組合せをヒト脳微小血管内皮細胞で試験する:
− バクロフェン及びアミノカプロン酸、
− バクロフェン及びレボシメンダン、
− アミノカプロン酸及びスルフイソキサゾール、
− アミノカプロン酸及びテルビナフィン、
− アミノカプロン酸及びレボシメンダン、
− レボシメンダン及びスルフイソキサゾール、
− レボシメンダン及びテルビナフィン、
− エプレレノン及びレボシメンダン、
− エプレレノン及びスルフイソキサゾール、
− エプレレノン及びフェノルドパム、
− スロデキシド及びレボシメンダン、
− スロデキシド及びスルフイソキサゾール、
− スロデキシド及びフェノルドパム、又は
− エプレレノン及びスロデキシド。
本実施例では、レボシメンダン及びスルフイソキサゾールを用いた併用療法を、ヒトAβ1−42の毒性作用を阻止又は縮小するその能力に関して評価した。
本実施例では、テルビナフィン及びスルフイソキサゾールを用いた併用療法を、ヒトAβ1−42の毒性作用を阻止又は縮小するその能力に関して評価した。
本実施例では、レボシメンダン及びバクロフェンを用いた併用療法を、ヒトAβ1−42の毒性作用を阻止又は縮小するその能力に関して評価した。
本実施例では、アミノカプロン酸及びテルビナフィンを用いた併用療法を、ヒトAβ1−42の毒性作用を阻止又は縮小するその能力に関して評価した。
本実施例では、アミノカプロン酸及びレボシメンダンを用いた併用療法を、ヒトAβ1−42の毒性作用を阻止又は縮小するその能力に関して評価した。
本実施例では、レボシメンダン及びテルビナフィンを用いた併用療法を、ヒトAβ1−42の毒性作用を阻止又は縮小するその能力に関して評価した。
インビトロ試験で活性な化合物及びその組合せは、アルツハイマー病のインビボモデルで試験する。アルツハイマー病関連突然変異ヒトアミロイドβタンパク質前駆体(APP)導入遺伝子の過剰発現は、トランスジェニックマウスの脳へのAβの沈着を促進する最も信頼できる手段であり、多数の研究においてAD疾患モデルの役割を果たす。老化するにつれ、これらの突然変異APPマウスは、揺るぎないアミロイド病変及び他のAD様の特色(シナプス密度の低下、反応性神経膠症、及び多少の認知障害を包含する)を現す。多くの突然変異APPマウスモデルは、顕性ニューロン脱落及び神経原線維変化(NFT)病変の証拠をほとんど示さない。このBRI−Aβ42導入遺伝子が半接合であるマウスは、正常な寿命で生存及び繁殖できる。トランスジェニックBRI−Aβ42 mRNAは、マウスプリオンタンパク質プロモーターに特徴的なパターンで発現し;導入遺伝子発現の最高レベルは、小脳顆粒細胞及び海馬で検出され、続いて皮質、橋、視床、及び中脳で検出される。トランスジェニック融合タンパク質では、Aβ1−42をBRIタンパク質のC末端にフューリン様切断部位で融合させるため、切断により内腔又は細胞外空間への効率的なAβ1−42分泌が起こる。したがって、これらのマウスは、Aβ1−42アイソフォームを特異的に発現する。半接合BRI−Aβ42マウスは、加齢により界面活性剤不溶性アミロイド−βを蓄積して、早ければ3月齢で小脳に有芯プラークが生じる。前脳病変の発症は遅れて起こり、細胞外Aβプラークは、海馬及び内嗅/梨状皮質では12月齢までは存在しない場合もある。アミロイドβ沈着(有芯プラーク)は、トランスジェニックマウスの小脳の分子層では早ければ3月齢で観察することができ、加齢と共により顕著になる;偶発的な細胞外プラークは、6月齢で内嗅/梨状皮質及び海馬において見られるが、12月齢を超えるまでは見い出せない場合もある。最高齢マウスは、小脳、皮質、海馬、及び嗅球において有芯及び拡散プラークを伴う広範囲の病変を示す。細胞外アミロイド斑は、放射状の線維を伴う濃厚アミロイド芯を示す;多くの変性神経突起の束がこれらのプラークの周辺に観察される。反応性神経膠症はプラークと関連する。
トランスジェニックTg(Prnp-ITM2B /APP695*42)A12E mcマウス(37)は、Jackson Laboratory(http://jaxmice.jax.org/strain/007002.html)から入手した。最も高いAβ42血漿レベルを持つマウス樹立系統である、BRI−Aβ42A(12e)系統は、混合B6C3バックグラウンドで維持した。オス成体トランスジェニックマウスに飼料と水を自由に与える。承認されたInstitutional Animal Care and Use Committeeのプロトコールにより、マウスを秤量して、様々な用量で調製した、対照溶液(プラセボ)又は本発明の薬剤若しくは表2の薬剤組合せのいずれかを連続10〜20週間、1日1回腹腔内注射又は強制給餌する。
生存率は、Kaplan-Meier法を用いて解析した。全てのペアワイズ多重比較検定にはHolm-Sidak法(ポストホック)を使用した。無関係な死は検閲する。全ての比較は、背景の系統差からの任意の交絡可能性のある作用を制限するために同腹仔間で行った。
行動試験は、幾人かの著者により発表された方法により設計及び実施した(38-41)。
本実験は、白色プラスチック製で、乳白色水を充填した直径90cmの円形プール中で実施する。透明プラスチック製の直径8cmの避難プラットフォームを水面下0.5cmに沈めた。視覚的手掛かりは、A4サイズの文字で印刷した様々な幾何学形状により提供され、周囲壁4面に設置する(プールからの距離は50〜70cmとした)。各マウスに1日4回の試行を4日間行わせた(試行の間は5〜7分の間隔、全部で16回試行)。各試行は、4カ所の異なる出発点の1つから実施した。マウスの運動は、Videotrack Software(View Point)を用いてモニターする。避難プラットフォームを探し出すのにかかる時間(逃避潜時:最大60秒間)を測定した。プラットフォームを探し出したら、マウスはそこに15秒間座ることができる。60秒以内にプラットフォームを見つけられないマウスは、プラットフォームに導かれ、そこに15秒間留まることができる。60秒の潜時はこのような出来事についての記録となる。1日目の1回目の試行を除いて、1日につき全4回の試行から統計解析のために平均値を求めた。9日目(最後の訓練の5日後)に、マウスに60秒の探査試行を行わせたが、この試行では、プラットフォームを取り外し、そしてマウスにそれを探索させる。各マウスが各四分円で過ごした時間を記録した(四分円探索時間)。3、7、10、及び12月齢の数群のオスマウスを使用した。
この作業記憶の認知に基づく高感度測定は、6つの放射状に区分された水泳アームを作り出すためのアルミニウム挿入物を取り付けた直径100cmの水を充填したプール(モリス水迷路及びプラットフォーム認知課題にも使用された)よりなる装置を活用して得られた。試験は、連続9〜12日間、1日のセッションにつき5回の1分間の試行よりなる。各セッションの開始時、透明な沈めたプラットフォームを6つの水泳アームの内の1つの末端に配置する(ランダムに選択し、毎日変更する)。最初の4回の獲得試行のそれぞれについて、マウスは、プラットフォームを含まないアームの1つに入れて(ランダム化した順序)、プラットフォームを探索させる。60秒の試行中、マウスが別のプラットフォームを含まないアームに入るたびに、穏やかにその開始位置にマウスを戻して、エラーを記録する。4回目の試行後、マウスを30分間休息させ、次に5回目の(記憶保持)試行をさせるが、これは最後のプラットフォームを含まない水泳アームに始まる。エラーの数(誤ったアームの選択)及び逃避潜時(プラットフォームに到達するまでの時間、最大60秒)を各試行について記録する。
この認知に基づく課題試験は、円周を囲んで等距離に間隔を空けた16個の「避難」穴を有する直径69cmの円形プラットフォームよりなる装置を活用して実施される。避難所は、穴の1つの下に据え付けられ、そして種々の視覚的合図を取り付けた暗幕がプラットフォームを取り囲む。単回の5分間試行の開始時にマウスをプラットフォームの中心に置き、嫌悪刺激(まぶしい光、送風)を示す。エラーの総数(非避難穴への頭部の突き出し)及び逃避潜時(避難穴に到達するまでの時間)を記録する。
この認知に基づく探索課題では、物体識別及び認知能力を評価する。標的物体は、10cm×40cmの黒色の旗を取り付けた直径9cmの円形プラットフォームよりなり、これを直径100cmの円形プールに水表面の0.8cm上に配置する。試験は、連続4日間のそれぞれに1日につき4回の60秒の試行よりなる。各日に、標的物体は、各試行のためプールの異なる四分円に入れて、マウスは、全4回の試行でプールの円周に沿って同じ位置で解放する。総潜時(最大60秒)を各試行について記録する。
マウスのいずれかが、その遺伝子型に関連する生理、行動、又は感覚運動障害を示すかどうかを究明するために、Irwin法から修飾した包括的スクリーニング法を利用する。運動技能、協調、及び筋力を探索するために、2本の高さ30cmの円柱の間にぴんと張った針金にマウスを載せ、針金上でバランスをとるその能力を評価する。更に、少なくとも5秒間、四足全部で針金をつかんでしがみつく能力、及び針金によじ登る能力を測定する。
脳アミロイド血管症(CAA)の定量のために、頭頂又は小脳皮質軟髄膜にわたる30μm間隔の5μmパラフィン包埋切片を、ビオチン化−Ab9抗体(抗−Aβ1−16、1:500)で4℃で一晩免疫染色する(各月齢群で遺伝子型あたりマウスn=5〜7匹、マウス1匹あたりn=6切片)。染色陽性の血管は、修飾Vonsattel採点システムを用いて視覚的に評価する(42)。CAA重症度スコアは、CAA血管の数にCAA重症度をかけて算出する。
3〜12月齢のTg及びWTマウスに麻酔をかけて、0.1mol/Lリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(pH7.4)中の0.9% NaCl及び4%パラホルムアルデヒドにより、又は0.1mol/L PBS(pH7.4)中の10%ホルマリン及び4%パラホルムアルデヒドにより連続して経心腔的灌流を行う。脳及び脊髄を取り出し、4%パラホルムアルデヒド中に保存する。幾つかの試料は、パラフィンに包埋し、滑走式ミクロトームで10μmの厚さに切る。凍結切片(14μm)をクリオスタットで切り、クロム・ミョウバン被覆スライドに載せる。内因性ペルオキシダーゼは、切片を0.3% H2O2を含有するメタノールで30分間処理することによりクエンチする。切片は10%ウマ血清中でブロッキング処理する。一次抗体を使用したが、これを1%ウマ血清の存在下で4℃で一晩インキュベートする。全ての二次ビオチン化又はフルオレセイン−、テキサスレッド−、及びAMCA−結合抗体、蛍光色素、ABC−キット、並びにペルオキシダーゼ活性の色素原としての3,3’−ジアミノベンジジンは、Vector Laboratories製である。二次抗体とのインキュベーションは、室温で1時間保持する。全ての洗浄工程(3〜10分間)及び抗体希釈は、リン酸緩衝生理食塩水(0.1mol/L PBS、pH7.4)又はトリス緩衝生理食塩水(0.01mol/L、トリス、0.15mol/L NaCl、pH7.4)を用いて実施する。ABC複合体とのインキュベーション及び3,3’−ジアミノベンジジンでの検出は、製造業者のマニュアルにより行う。ヘマトキシリン対比染色は、標準法により実施する。遺伝子型、月齢、及び性別につき最低3匹のマウスを各測定に使用する(43)。
脳は、最後の注射の90〜120分後の間に氷上で迅速に摘出して、−80℃に凍結する。各マウスからの右大脳半球は、凍結後に秤量する。中央値絶対偏差による半球質量の分析によって、我々は、4中央値絶対偏差の域を超える試料をその残りの試料から除外することができる。大脳半球をホモジナイズして、酵素測定法キット(R&D Systems, Inc.)のために製造業者の取扱説明書により、全タンパク質を含有する細胞溶解物を調製する。簡単に述べると、大脳皮質を800μlの低塩含有の1×抽出緩衝液(R&Dキット)中でホモジナイズして、氷上で10分間インキュベートする。次にホモジネートを13,000gで4℃で15分間遠心分離する。各試料中のタンパク質濃度は、ビウレット系測定法(Pierce)により概算する。APP、Aβ40、及びAβ42のレベルは、ウエスタン免疫ブロット法及びサンドイッチELISA法により測定する。更に、α、β−、及びγ−セクレターゼの活性は、同じ抽出物から測定できよう。
タンパク質同量の大脳抽出物を各ゲルに試料あたりレーンあたり30μg添加する。各ゲルには8種の処理を含めた:対照;薬剤1 7.5mg/kgの用量;及び薬剤2 数種の用量。ゲル内変動を最小にするために、各ゲルには3セットの全処理群を含めた。各ブロットは、22C11抗体で調べる。各ブロットはまた、転写効率に対する正規化のためにβ−アクチン抗体でも調べる。APPバンドシグナルの強度は、β−アクチンの強度で正規化する。2種の試料の「対照」は、ブロット間変動について試験するために各ゲル/ブロットに添加する。ブロットの分析は、2通りに実施する:報告(38-39)されるように、ブロットワイズ(n=3)、ゲル間変動について試験するため;及び組合せたブロット(n=9又は10)。n=3でのブロットワイズ解析は、n=9又は10での最終解析が示すのと同じ傾向を示す。組合せ解析の結果が提示される。
脳Aβ ELISAのために、前脳及び後脳Aβレベルを独立に測定し、そして嗅球を分析から除外する。血漿Aβ分析には、心穿刺後に血液をEDTA被覆チューブに採取する。血液試料は3000rpmで4℃で10分間遠心分離して、血漿は等分して使用時まで−80℃で保存する。Aβレベルは、Ab9(抗−Aβ1−16 Ab)をAβ40に対する捕捉Abとして、13.1.1−HRP(抗−Aβ35−40 Ab)をAβ40に対する検出Abとして、2.1.3(抗−Aβ35−42 Ab)をAβ42に対する捕捉Abとして、及びAb9−HRPをAβ42に対する検出Abとして使用する末端特異的サンドイッチELISAにより測定する(各月齢群で遺伝子型につきn=5〜7匹マウス)。Aβレベルは、報告(46)されるようにELISA変動可能性を最小にするために、同じセットのマウスを内部対照として用いて前述の結果に対して正規化する。
瞬間凍結前脳試料は、1%プロテアーゼインヒビター混合物(Roche)を含む放射免疫沈降法(RIPA)緩衝液(Boston BioProducts, Worcester, MA)中でホモジナイズする。このホモジネートを100,000×gで4℃で1時間遠心分離する。上清中のタンパク質濃度をBCAタンパク質測定法(Pierce)を用いて測定する。タンパク質試料(20μg)をビス−トリス12% XTゲル又はビス−トリス4〜12% XTゲル(Bio-Rad, Hercules, CA」)に流して、0.2μmニトロセルロース膜に転写する。ブロットは、報告(46)されるように、0.1M PBS中で2分間2回電子レンジにかけて、Ab 82E1(抗−Aβ1−16、1:1000;IBL, Gunma, Japan)及び抗−APP C−末端20アミノ酸(1:1000)で調べる。ブロットを剥がして、添加対照としての抗β−アクチン(1:1000;Sigma)で再び調べる。ImageJソフトウェアを用いて相対バンド強度を測定する。
半脳を10%ホルマリンに浸漬固定して、パラフィン包埋の処理をする。脳組織切片(5μm)は、抗−全Aβ抗体(Ab)で免疫染色した。切片をヘマトキシリンで対比染色する。海馬、梨状皮質(ブレグマ、−1.70〜−2.80mm)、又は小脳(傍片葉、係蹄状小葉脚、及び単小葉;ブレグマ、−5.40〜6.36mm)を経て脳あたり6切片を定量のために使用する(各月齢群で遺伝子型につきn=5〜7匹マウス)。Aβプラーク負荷はMetaMorphソフトウェア(Molecular Devices, Palo Alto, CA)を用いて測定する。有芯プラークの定量には、Aβ負荷が分析されたこれらの連続切片をチオフラビンS(ThioS)で染色して、海馬、内嗅/梨状皮質、又は小脳におけるThioS陽性プラークの数をカウントする。上記分析の全ては、盲検法で実施する。
全ての実験からの結果は、STATISTICA 8.0(Statsoft)で解析する。Aβレベル、アミロイド斑負荷、及びCAA重症度は、ポストホックHolm-Sidak多重比較検定又は両側スチューデントt検定と共にANOVAを利用することにより解析する。データセットがパラメトリック検定の前提を満たさないならば、クラスカル・ワリス検定とこれに続くポストホックDunnの多重比較か、又はマン・ホイットニー順位和検定のいずれかを実施する。二重トランスジェニックマウスのAβレベルが、単一トランスジェニック同腹仔のAβレベルの加算の合計と一致したかどうかを試験するために、切片のない多重線形回帰試験を利用する。全ての比較は、同腹仔間で行う。薬物反応モデル化は、対照(0mg/kg)試料を除外して行う。ED50は、実験において最大薬物誘導反応の50%を誘導するのに必要な用量(mg/kg)に相当する。これは、ED50の対数に関するヒル方程式モデルを利用して算出する。
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Claims (8)
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- アミノカプロン酸と、アカンプロセート、アムロジピン、アルガトロバン、バクロフェン、シロスタゾール、シナカルセト、クロピドグレル、ダイフィリン、フェノルドパム、レフルノミド、メパクリン、メチマゾール、フェンホルミン、プリロカイン、リファブチン、スルフイソキサゾール、タダラフィル、テルビナフィン、シンナリジン、シクロピロックス、エプレレノン、カルベノキソロン、スロデキシド、カルバマジン、アモバルビタール、セフォテタン、四硝酸エリスリチル、メチクロチアジド、リセドロネート、エンプロフィリン、オクストリフィリン、パラメタジオン、セフメノキシム、アプリンジン、エトミデート、ミチグリニド、ベニジピン及びゾニサミド、又はその塩から選択される、少なくとも1種の追加の化合物とを含む、併用投与、個別投与又は連続投与のための、請求項1に記載の使用のための組成物。
- アミノカプロン酸又はその塩と、アカンプロセート、アムロジピン、アルガトロバン、バクロフェン、シロスタゾール、シナカルセト、クロピドグレル、ダイフィリン、フェノルドパム、レフルノミド、メパクリン、メチマゾール、フェンホルミン、プリロカイン、リファブチン、スルフイソキサゾール、タダラフィル、テルビナフィン及びゾニサミド、又はその塩から選択される、少なくとも1種の化合物とを組み合わせて含む、請求項2に記載の使用のための組成物。
- 該組成物が、アミノカプロン酸、又はその塩と、バクロフェン、スルフイソキサゾール及びテルビナフィン又はその塩から選択される、少なくとも1種の追加の化合物とを含む、併用投与、個別投与又は連続投与のための、請求項2に記載の使用のための組成物。
- 薬学的に許容しうる担体又は賦形剤を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- 該組成物が、対象に反復投与される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
- アミノカプロン酸、又はその塩を含む、Aβ毒性に対してヒト細胞の保護に使用するための組成物。
- 有効量のアミノカプロン酸又はその塩の、哺乳動物対象のアルツハイマー病を処置するための医薬の製造のための使用。
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