CN114832116B - 基于小胶质细胞表型调节和脑内铁清除的ros响应型纳米载体及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

基于小胶质细胞表型调节和脑内铁清除的ROS响应型纳米载体及其制备方法与应用，属于药物技术领域，在阿尔兹海默症(AD)病理脑内ROS和微酸环境的双重作用下，该纳米粒载体表面链状蛋白间微小孔径变大，包载于载体内的药物得到释放，作用于脑内小胶质细胞，起到将小胶质细胞促炎M1表型调节至抗炎M2表型的作用，释放药物后的中空载体由于与铁的亲和性，可以吸附脑内堆积的过量铁，减少过多活性铁存在下催化形成高反应性和破坏性的活性氧等使脑内炎症加剧的反应，降低铁导致的Aβ蛋白的聚集和寡聚化。本发明针对AD的病理生理特点，构建实现AD治疗的靶向小胶质细胞表型调节和清除堆积铁的多功能纳米递送载体。

Description

基于小胶质细胞表型调节和脑内铁清除的ROS响应型纳米载 体及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体涉及一种基于小胶质细胞表型调节和脑内铁清除的治疗阿尔兹海默症的纳米粒子的制备及其作为阿尔兹海默症治疗药物的应用。
背景技术
阿尔兹海默症(Alzheimer disease，AD)是在老年人身上发生的神经系统退行性疾病,其特征是大脑沉积异常和认知功能障碍。AD不仅降低患者生活质量还有较高的致死率，目前，阿尔兹海默症仍无法治愈，已有的可用药物能适当改善患者症状并有可能延长生存期。因此寻找AD的有效治疗手段刻不容缓。
研究发现，在AD大脑中发生小胶质细胞极化异常内源性刺激，包括活性氧化物(ROS)、炎症因子和聚集的Aβ蛋白，持续激活促炎性M1小胶质细胞，M1促炎表型和M2抗炎表型之间的平衡被打破。M1型小胶质细胞对免疫刺激极其敏感，这会导致过度和失控的炎症反应，并加速阿尔茨海默病的进展。神经炎症的高效抗炎方法之一是使用激活β2肾上腺素能受体(β2-AR)的治疗化合物。许多不同类型的脑细胞，包括小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元表达β2-ARs。
铁是大脑中最丰富的过渡金属，大脑中的铁水平随着年龄的增长而积累，除了在神经元组织中被升高外，铁还在淀粉样斑块本身中富集。有学者已证明铁在阿尔茨海默病患者的大脑中富集，并在体内和体外与淀粉样斑块直接相关。大脑铁稳态的异常会提高氧化还原活性金属的水平，导致金属的错误定位和对敏感细胞和亚细胞结构的灾难性氧化损伤。铁催化形成高反应性和破坏性的活性氧，导致关键大分子的氧化损伤。一些研究表明，铁通过促进Aβ蛋白的聚集和寡聚化而直接导致AD病理，增强淀粉样前体蛋白的翻译和淀粉样生成过程来影响Aβ的产生。在机体水平上，身体自身没有调节和清除过量铁的方法，铁的稳定只能通过铁摄取的调节来控制。
基于此，有必要提供一种多功能药物，该药物能够在脑内调节异常极化的小胶质细胞，维持其两种表型之间的稳态平衡，同时特异性清除脑内过多富集且无法靠机体自行排出的铁，降低其通过氧化还原反应形成的高反应性和破坏性的活性氧，减少进一步对脑内神经和细胞等的损伤和炎症的产生。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于小胶质细胞表型调节和脑内铁清除的ROS响应型纳米载体及其制备方法，同时还提供该纳米载体在制备治疗阿尔兹海默症药物方面的应用。该纳米载体表面蛋白具有在ROS存在下表面蛋白结构改变，表面孔径增大的特性，使内部包裹的药物得到一定程度的释放，同时释放完药物的蛋白载体与脑内过量的铁结合转运出脑外，达到调节脑内铁稳态的作用。
本发明所提供的基于小胶质细胞表型调节和脑内铁清除的ROS响应型纳米载体(简称纳米粒子)，由具有独特的空腔结构和可逆的解离与重组特性的蛋白载体包载具有调控小胶质细胞表型作用的β2-肾上腺素受体激动剂制备而成。内部包载的β2-肾上腺素受体激动剂得到一定程度的释放为可控释放，为ROS敏感释放或pH敏感释放。
所述纳米粒子具有球形形貌，平均粒径为15-200nm，优选为15-100nm。
所述纳米粒子由摩尔比为(1:10)-(1:40)的蛋白载体与β2-肾上腺素受体激动剂制备而成。
所述蛋白载体为铁蛋白、去铁蛋白或乳铁蛋白；优选为去铁蛋白；
所述β2-肾上腺素受体激动剂为沙美特罗、维朗特罗、吲哒卡特罗、福莫特罗、班布特罗或沙丁胺醇；优选为沙美特罗。
上述基于小胶质细胞表型调节和脑内铁清除的ROS响应型纳米载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)将蛋白载体溶于第一溶剂，得到第一溶液；
(2)将β2-肾上腺素受体激动剂溶于第二溶剂，得到第二溶液；
(3)将第一、第二溶液混合，得到混合溶液，通过调节混合溶液pH、避光搅拌反应使药物包裹于蛋白载体的空腔内，超纯水洗涤超滤，得到中间产物；
(4)将活化后的小胶质细胞特异性靶向肽与中间产物混合，避光反应后超滤离心，洗涤、离心，除去未反应的物质后，得终产物纳米粒，即基于小胶质细胞表型调节和脑内铁清除的ROS响应型纳米载体。
上述制备方法，其中：
所述步骤(1)中，所述第一溶剂为四氢呋喃、DMSO、乙醇、超纯水中的任一种或几种混合物；所述蛋白载体为铁蛋白、去铁蛋白或乳铁蛋白；优选为去铁蛋白。
所述步骤(2)中，所述第二溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、四氢呋喃、超纯水中任一种；所述β2-肾上腺素受体激动剂为沙美特罗、维朗特罗、吲哒卡特罗、福莫特罗、班布特罗或沙丁胺醇；优选为沙美特罗。
所述步骤(3)中，所述第一溶液与第二溶液混合后得到的混合溶液，pH调节至1-3；反应时间为1-5h；超纯水洗涤次数为3-10次。
所述步骤(4)中，用于活化小胶质细胞特异性靶向肽的物质为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)。
本发明所述基于小胶质细胞表型调节和脑内铁清除的ROS响应型纳米载体药物输送系统通过注射、口服方式导入生物体内治疗部位或血液循环系统(如图1所示)。
本申请还提供所述基于小胶质细胞表型调节和脑内铁清除的ROS响应型纳米载体在制备治疗阿尔兹海默症药物方面的应用。
本发明的有益效果：
本发明采用简单的制备方法得到了粒径可控、稳定性好、安全性有保证的新型纳米药物；本发明的制备工艺简单无污染，并且成本低廉效率高、容易实现工业化生产，具有广阔的应用前景。
相比于现有阿尔兹海默症药物仅能缓解症状的特点，本发明希望立足于切断阿尔兹海默症发病进程中的某一环节来终止病症进程，对本而非对标，达到彻底地、一劳永逸的治疗效果。
附图说明
图1为本发明的基于小胶质细胞表型调节和脑内铁清除的ROS响应型纳米载体的合成及其作用示意图。
图2为AFt和Ft的紫外全扫描图。
图3为Sal-AFt-CPPs的TEM图。
图4为小鼠尾静脉分别注射(A)Sal(B)Sal-AFt-CPPs 6小时后的主要器官摄取情况，以及脑、心、肝、脾、肺、肾分别的荧光强度占比(C)(D)。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一种基于小胶质细胞表型调节和脑内铁清除的ROS响应型纳米载体(沙美特罗@AFt-CPPs纳米粒)，由去铁蛋白包载沙美特罗制备而成。内部包载的沙美特罗的释放为可控释放，具体为ROS敏感释放或pH敏感释放。该纳米粒子具有球形形貌，平均粒径为100nm。去铁蛋白与沙美特罗的用量摩尔比为1:30。
上述基于小胶质细胞表型调节和脑内铁清除的ROS响应型纳米载体(沙美特罗@AFt-CPPs纳米粒)的制备方法，包括如下步骤：
(1)将去铁蛋白(AFt)溶于超纯水中，得到浓度为50mg/mL的第一溶液；
(2)将8.7mg沙美特罗溶于4.8m L甲醇中充分稀释溶解，得到第二溶液；
(3)将960μL第一溶液加入到第二溶液中进行混合，得到混合溶液，取1M HCl调节混合溶液pH至2.5，避光搅拌反应使药物包裹于去铁蛋白的空腔内，15min后再用1M NaOH将溶液pH值调回中性，磁力搅拌下反应2h，产物用超滤离心管(100KD)超滤离心(2000rpm，10min)，超纯水振荡洗涤3次，至超滤液无色为止，从而除去游离的或去铁蛋白表面吸附的沙美特罗分子，最终得到中间产物沙美特罗@AFt；
(4)按1:1.5:1.5的摩尔比精密称取细胞穿透肽(CPPs)、EDC和NHS，加入到圆底烧瓶，超纯水为溶剂，磁力搅拌下避光反应0.5h，以活化CPPs分子上羧基。然后将中间产物沙美特罗@AFt按中间产物:活化靶向肽摩尔比1:3加入，避光条件下继续反应4h。反应后产物仍用超滤离心管(100KD)超滤离心(2000rpm，10min)，超纯水洗涤3次后再次超滤，除去EDC、NHS及游离的CPPs，得到终产物沙美特罗@AFt-CPPs纳米粒。
检测沙美特罗@AFt-CPPs纳米粒结构：
采取紫外分光光度对沙美特罗、去铁蛋白和实施例1中制得的纳米复合物沙美特罗@AFt进行紫外全波长扫描，若该纳米复合物沙美特罗@AFt的图谱中同时出现沙美特罗的特征吸收峰与蛋白类物质的特征吸收峰，则表明沙美特罗成功的被包载到去铁蛋白笼内部。
通过傅立叶红外光谱仪分别检测AFt、AFt-CPPs的红外光谱，通过吸收峰的变化情况判断CPPs是否通过化学键成功连接在去铁蛋白笼的表面。
通过透射电镜对AFt与最终制剂沙美特罗@AFt-CPPs的形态进行观察，观察AFt和经修饰后的复合物(沙美特罗@AFt-CPPs)是否具有明显笼状结构，分散是否均匀，大小是否均一，以及分别的粒径大小。
为了考察该药物递送系统的靶向性，本实验借用DIR作为荧光探针，通过活体荧光成像可以直观的观察到药物在体内的分布。
实验结果：
如图2为AFt和Ft的紫外全扫描图，可知二者吸光度存在差异，表明成功得到去除铁核的去铁蛋白。
如图3为Sal-AFt-CPPs(沙美特罗@去铁蛋白@细胞穿透肽复合物)的TEM图。射电镜对AFt与最终制剂沙美特罗@AFt-CPPs的形态具有明显笼状结构，分散均匀，平均粒径100nm。
如图4为小鼠尾静脉注射6h后主要器官摄取情况，以及脑、心、肝、脾、肺、肾分别的荧光强度占比，脑部荧光强度由表明本发明方法成功提高了药物的脑靶向能力，增加了注射后药物在脑部聚集的量，达到更好的治疗效果。
实施例2
一种基于小胶质细胞表型调节和脑内铁清除的ROS响应型纳米载体(维朗特罗@AFt-CPPs纳米粒)，由去铁蛋白包载维朗特罗制备而成。内部包载的维朗特罗的释放为可控释放，具体为ROS敏感释放或pH敏感释放。该纳米粒子具有球形形貌，平均粒径为100nm，去铁蛋白与维朗特罗的摩尔比为1:30。
上述基于小胶质细胞表型调节和脑内铁清除的ROS响应型纳米载体(维朗特罗@AFt-CPPs纳米粒)的制备方法，包括如下步骤：
(1)将去铁蛋白溶于超纯水中，得到浓度为50mg/mL的第一溶液；
(2)将10.2mg维朗特罗溶于5m L甲醇中充分稀释溶解，得到第二溶液；
(3)将960μL第一溶液加入到第二溶液中进行混合，得到混合溶液，取1M HCl调节混合溶液pH至2.5，避光搅拌反应使药物包裹于蛋白载体的空腔内，15min后再用1M NaOH将溶液pH值调回中性，磁力搅拌下反应2h，产物用超滤离心管(100KD)超滤离心(2000rpm，10min)，超纯水振荡洗涤3次，至超滤液无色为止，从而除去游离的或去铁蛋白表面吸附的维朗特罗分子，最终得到中间产物维朗特罗@AFt；
(4)按1:1.5:1.5的摩尔比精密称取CPPs、EDC和NHS加入到圆底烧瓶，超纯水为溶剂，磁力搅拌下避光反应0.5h，以活化CPPs分子上羧基。然后将中间产物维朗特罗@AFt按中间产物:活化靶向肽摩尔比1:3加入，避光条件下继续反应4h。反应后产物仍用超滤离心管(100KD)超滤离心(2000rpm，10min)，超纯水洗涤3次后再次超滤，除去EDC、NHS及游离的CPPs，得到终产物维朗特罗@AFt-CPPs纳米粒。
实施例3
一种基于小胶质细胞表型调节和脑内铁清除的ROS响应型纳米载体(维朗特罗@Ft-CPPs纳米粒)，由铁蛋白包载维朗特罗制备而成。内部包载的维朗特罗的释放为可控释放，具体为ROS敏感释放或pH敏感释放。纳米粒子具有球形形貌，平均粒径为100nm。铁蛋白与维朗特罗的摩尔比为1:30。
上述基于小胶质细胞表型调节和脑内铁清除的ROS响应型纳米载体(维朗特罗@Ft-CPPs纳米粒)的制备方法，包括如下步骤：
(1)将铁蛋白溶于超纯水中，得到浓度为50mg/mL的第一溶液；
(2)将10.2mg维朗特罗溶于5m L甲醇中充分稀释溶解，得到第二溶液；
(3)将960μL第一溶液加入到第二溶液中进行混合，得到混合溶液，取1M HCl调节混合溶液pH至2.5，避光搅拌反应使药物包裹于铁蛋白的空腔内，15min后再用1M NaOH将溶液pH值调回中性，磁力搅拌下反应2h，产物用超滤离心管(100KD)超滤离心(2000rpm，10min)，超纯水振荡洗涤3次，至超滤液无色为止，从而除去游离的或铁蛋白表面吸附的维朗特罗分子，最终得到中间产物维朗特罗@Ft；
(4)按1:1.5:1.5的摩尔比精密称取CPPs、EDC和NHS加入到圆底烧瓶，超纯水为溶剂，磁力搅拌下避光反应0.5h，以活化CPPs分子上羧基。然后将中间产物维朗特罗@Ft按中间产物:活化靶向肽摩尔比1:3加入，避光条件下继续反应4h。反应后产物仍用超滤离心管(100KD)超滤离心(2000rpm，10min)，超纯水洗涤3次后再次超滤，除去EDC、NHS及游离的CPPs，得到终产物维朗特罗@Ft-CPPs纳米粒。

Claims (7)

1.一种基于小胶质细胞表型调节和脑内铁清除的ROS响应型纳米载体的制备方法，其特征在于，所述纳米载体由具有独特的空腔结构和可逆的解离与重组特性的蛋白载体包载具有调控小胶质细胞表型作用的β2-肾上腺素受体激动剂制备而成；内部包载的β2-肾上腺素受体激动剂的释放为ROS敏感释放或pH敏感释放；所述蛋白载体为去铁蛋白，所述β2-肾上腺素受体激动剂为沙美特罗，去铁蛋白与沙美特罗的摩尔比为1:10~40；
具体包括如下步骤：
（1）将蛋白载体溶于第一溶剂，得到第一溶液；
（2）将β2-肾上腺素受体激动剂溶于第二溶剂，得到第二溶液；
（3）将第一、第二溶液混合，得到混合溶液，通过调节混合溶液pH、避光搅拌反应使药物包裹于蛋白载体的空腔内，超纯水洗涤超滤，得到中间产物；
（4）将活化后的小胶质细胞特异性靶向肽与中间产物按摩尔比3:1混合，避光反应后超滤离心，洗涤、离心，除去未反应的物质后，得终产物纳米粒，即基于小胶质细胞表型调节和脑内铁清除的ROS响应型纳米载体，所述纳米粒具有球形形貌，平均粒径为100nm。
2.根据权利要求1所述的基于小胶质细胞表型调节和脑内铁清除的ROS响应型纳米载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述第一溶剂为四氢呋喃、DMSO、乙醇、超纯水中的任一种或几种混合物。
3.根据权利要求1所述的基于小胶质细胞表型调节和脑内铁清除的ROS响应型纳米载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述第二溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、四氢呋喃、超纯水中任一种。
4.根据权利要求1所述的基于小胶质细胞表型调节和脑内铁清除的ROS响应型纳米载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，所述第一溶液与第二溶液混合后得到的混合溶液，pH调节至1-3；反应时间为1-5h；超纯水洗涤次数为3-10次。
5.根据权利要求1所述的基于小胶质细胞表型调节和脑内铁清除的ROS响应型纳米载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，用于活化小胶质细胞特异性靶向肽的物质为1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺。
6.一种基于小胶质细胞表型调节和脑内铁清除的ROS响应型纳米载体，其特征在于，采用权利要求1-5任一项所述的制备方法制得。
7.一种权利要求6所述的基于小胶质细胞表型调节和脑内铁清除的ROS响应型纳米载体在制备治疗阿尔兹海默症药物方面的应用。
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