CN114568028A - 用于诊断阿尔茨海默病的遗传变体 - Google Patents

用于诊断阿尔茨海默病的遗传变体 Download PDF

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Abstract

本发明提供了与阿尔茨海默病(AD)相关的遗传标志物，AD的诊断和治疗方法以及用于诊断AD的试剂盒。

Description

用于诊断阿尔茨海默病的遗传变体
相关申请
本申请要求2019年8月29日提交的美国临时专利申请第62/893,502号的优先权，其内容通过引用整体并入本文中用于所有目的。
发明背景
脑疾病如神经变性疾病和神经炎性病症是影响大部分人口的破坏性病况。许多是不能治愈的，高度衰弱的，并且经常导致脑结构和功能随时间的渐进性退化。疾病流行也由于世界范围内增长的老龄人口而迅速增加，因为老年人处于发展这些病症的高风险中。目前，由于对这些疾病的病理生理学的了解有限，许多神经变性疾病和神经炎性病症难以诊断。同时，目前的治疗无效，不能满足市场需求；由于人口老龄化，每年的需求显著增加。例如，阿尔茨海默病(AD)的特征是学习和记忆的逐渐但渐进的下降，以及老年人中死亡率的主要原因。AD流行的增加正在推动更好诊断的需要和需求。根据阿尔茨海默病国际组织(Alzheimer's Disease International)，该疾病目前在全球影响了4.68亿人，但是在未来的三十年中，病例的数量预计是三倍。中国是老龄人口增长最快的国家之一。基于人口预测，到2030年，4个个体中的1个将超过60岁，这将在发生AD的风险中占有很大比例。实际上，从1990-2010年，中国AD病例的数量从370万增加到920万，并且到2050年，国家预计有2250万病例。香港人口也在快速老龄化。在2012年，65+岁的老人数量占人口的14.9％。据估计，到2025年，老年人将占人口的24％，到2050年，老年人将占人口的39.3％。在2009年有103,433例AD病例，但到2039年，该数量预计增加到332,688。
更令人担忧的是，尽管AD流行在增加，但许多人不能接受正确的AD诊断。根据阿尔茨海默病国际世界阿尔茨海默病报告2015，在高收入国家，仅20-50％的痴呆病例被记录在初级护理中。其余仍未诊断或诊断不正确。这种“治疗差距”在低收入国家和中收入国家更为显著。在没有正式诊断的情况下，患者不接受他们所需的治疗和护理，他们或他们的看护人也没有资格进行关键的支持计划。早期诊断和早期干预是缩小治疗差距的两个重要手段。因此，既能快速又能准确地确定疾病风险的早期诊断工具在许多水平上具有显著的治疗价值。研究已经证实，AD在记忆丧失或认知衰退的实际症状实际表现之前很久就影响大脑了。然而，到目前为止，还没有早期检测的诊断工具；到患者使用当前可用的方法(其涉及主观的临床评估)被诊断患有AD时，病理症状通常已经处于晚期状态。因此，为了改善AD治疗和长期管理的目的，迫切需要开发新的、有效的早期诊断AD的方法或检测患者中以后增加的发生AD的风险的方法。本发明解决了这种和其它相关的需求。本发明公开了与遗传变体或其组合的使用相关的组合物，方法和试剂盒，以评估发生阿尔茨海默病(AD)的个体风险。诸如AD的疾病可以与一种或多种遗传变异有关，其中遗传变异的存在可能增加发生AD的风险或指示AD，从而使得能够进行遗传分析作为疾病预测的工具。
具体地，本发明人已经确定血浆和脑脊液(CSF)中的可溶性ST2蛋白(sST2)升高，连同血浆中与sST2蛋白相关的特定新变体的存在，与中国人口中AD风险增加有关。此外，本发明人已经证明在AD患者的血液中ST2转录物，嗜酸性粒细胞计数和相关标志物基因表达被改变。本发明人进一步鉴定了可以降低血浆sST2水平的药物，其在临床实践中能够减轻AD。
通过利用这些发现，本发明人开发了通过检测个体基因组DNA序列中的特定变体来确定受试者是否患有AD或处于增加的发生该疾病的风险中的新方法。还开发了基于基因组信息的多基因风险评分系统，其通过包括关于血细胞计数和血浆蛋白水平的信息而进一步优化，以预测AD的相对风险。总之，本发明为疾病的临床筛查(例如，诊断，预后)提供了显著的突破。
发明内容
本发明涉及与阿尔茨海默病(AD)相关的新的遗传变体的发现。因此，本发明提供了用于诊断或治疗AD的方法和组合物。因此，在第一方面，本发明提供了通过检测取自受试者的生物样品中表3中的一种或多种遗传变体，例如表3中的至少5、10、15、20或25种或更多种遗传变体的存在来检测受试者中AD的存在或增加的以后发生AD的风险的方法。在一些实施方案中，所述受试者是中国人，例如香港中国人或内地中国人。在一些实施方案中，所述受试者具有AD的家族史，但没有表现出AD的症状。在一些实施方案中，所述受试者没有AD的家族史。在一些实施方案中，所述样品是血液样品，例如全血样品或血细胞样品。在一些实施方案中，所述样品含有来自患者身体的任何部位的细胞或组织，例如唾液、口腔拭子、汗液或尿液。在一些实施方案中，检测步骤包括扩增遗传变体的扩增反应，例如聚合酶链式反应(PCR)，包括逆转录PCR(RT-PCR)。在一些实施方案中，检测步骤包括基于杂交的方法或基于测序的方法。在一些实施方案中，遗传变体包括以下或由以下组成：rs1921622、rs75687525、rs4499395、rs56238602、rs2140316、rs12052753、rs199977663、rs2141304、rs4103380、rs4703514、rs191531802、rs2300619、rs1229502、rs9886235、rs6587006、rs7047059、rs5006678、rs7849649、rs1907370、rs11615704、rs66994203、rs117523785、rs17641976、rs7208104、rs12600563、rs142226688、rs111246464、rs4583526和rs56242654，或以上的任意组合。在一些实施方案中，所述变体包括rs1921622和rs12052753或由其组成。在一些实施方案中，所要求保护的方法还包括确定受试者的APOE基因型或单倍型的步骤。在一些实施方案中，所要求保护的方法还包括确定血液样品中嗜酸性粒细胞计数的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括确定血液样品中sST2、全长ST2或CCR3表达水平的步骤。在一些实施方案中，所述表达水平是蛋白质水平。在一些实施方案中，其中确定sST2或CCR3表达水平的步骤包括免疫测定或质谱分析。在其它实施方案中，所述表达水平是mRNA水平，其中确定sST2、全长ST2或CCR3表达水平的步骤包括逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、原位杂交或基于测序的方法。在一些实施方案中，所要求保护的方法还包括将多基因风险评分(PRS)计算为样品中相应变体对sST2水平的效应大小加权(βi)的基因型剂量之和的步骤，其中n是测试的遗传变体的数量：PRS＝β1snp1+β2snp2+...+βnsnpn。在一些实施方案中，测试的遗传变体的数量是29。在一些实施方案中，所述方法用于确定PRS不大于0的受试者为未患有AD或不具有增加的AD风险，并且PRS大于0的受试者为患有AD或具有增加的AD风险。在一些实施方案中，所述方法还包括在确定受试者患有AD或具有增加的发生AD的风险时向受试者施用有效治疗AD的药剂的步骤。在一些实施方案中，所述药剂是曲唑酮。
在第二方面，本发明提供了通过向受试者施用包含(1)有效量的曲唑酮和(2)药学上可接受的赋形剂的组合物来治疗受试者的AD或降低受试者的AD风险的方法。在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用有效量的用于AD的第二治疗活性剂的步骤。在一些实施方案中，向患者施用的组合物被配制用于皮下、透皮、肌内、静脉内、腹膜内、颅内注射、局部、经鼻或经口施用。在一些实施方案中，治疗方法包括这些步骤：(a)根据上文或本文公开的用于检测AD或增加的以后发生AD的风险的方法中的任一种，选择已经被确定为患有AD或具有增加的AD风险的受试者；和(b)向所述受试者施用包含有效量的曲唑酮和药学上可接受的赋形剂的组合物。
在第三方面，本发明提供了用于治疗受试者的AD或降低受试者的AD风险的药物。所述药物包含(1)有效量的曲唑酮；和(2)药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，所述药物还包含用于AD的第二治疗活性剂。在一些实施方案中，配制所述药物用于皮下、透皮、肌内、静脉内、腹膜内、颅内注射、局部、经鼻或经口施用。
在第四方面，本发明提供了用于检测受试者中阿尔茨海默病(AD)的存在或受试者中增加的发生AD的风险的试剂盒。所述试剂盒通常包含适于扩增携带表3中至少一种遗传变体的基因组DNA序列的一组寡核苷酸引物。所述试剂盒任选地还包含能够特异性鉴定所述至少一种遗传变体的试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含适于指导从基因组DNA序列转录的mRNA的逆转录的引物。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于检测AD的存在或增加的发生AD的风险的说明书。
定义
术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限定，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述天然核苷酸的已知类似物具有与参考核酸相似的结合特性，并且以与天然存在的核苷酸相似的方式被代谢。除非另有说明，特定的核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)，等位基因，直向同源物，SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子取代可以通过产生其中一个或多个选择的(或所有的)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；以及Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。术语核酸与基因，cDNA和基因编码的mRNA可互换使用。
术语“基因”是指参与产生多肽链的DNA片段。它可以包括在编码区之前和之后的区域(前导和尾随)以及在各个编码区(外显子)之间的插入序列(内含子)。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及氨基酸类似物和氨基酸模拟物，其以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用。天然存在的氨基酸是由遗传代码编码的那些氨基酸，以及随后被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构，即，与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳的化合物，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化合物。
本领域中有各种已知的方法允许以位点特异性方式将非天然氨基酸衍生物或类似物掺入多肽链，参见例如WO02/086075。
氨基酸在本文中可以通过通常已知的三字母符号或IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的单字母符号来提及。同样，核苷酸可以用它们通常接受的单字母代码来提及。
“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。所有三个术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。本文所用的术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。
“表达盒”是重组或合成产生的核酸构建体，其具有允许在宿主细胞中转录特定多核苷酸序列的一系列指定的核酸元件。表达盒可以是质粒，病毒基因组或核酸片段的一部分。通常，表达盒包括与启动子可操作地连接的待转录和/或待表达的多核苷酸。
如本文所用，术语“基因表达”用于指形成编码特定蛋白质的RNA分子的DNA转录或由多核苷酸序列编码的蛋白质的翻译。换句话说，本公开中的术语“基因表达水平”涵盖由目的基因编码的mRNA水平和蛋白质水平。
在本公开中，术语“生物样品”或“样品”包括组织切片例如活检和尸检样品，以及为了组织学目的而取的冷冻切片，或任何这样的样品的经处理的形式。生物样品包括血液和血液级分或产物(例如，全血、血清、血浆、血小板、血细胞如嗜酸性粒细胞等)、痰或唾液、淋巴和舌组织、培养的细胞例如原代培养物、外植体和转化的细胞、粪便、尿液、胃活检组织等。生物样品通常获自真核生物，其可以是哺乳动物，可以是灵长类动物并且可以是人类受试者。
术语“免疫球蛋白”或“抗体”(本文可互换使用)是指具有由两条重链和两条轻链组成的基本四条多肽链结构的抗原结合蛋白，其具有特异性结合抗原的能力，所述链例如通过链间二硫键稳定。重链和轻链都折叠成结构域。
术语“抗体”还指抗体的抗原结合片段和表位结合片段，例如Fab片段，其可用于免疫亲和力测定中。有许多充分表征的抗体片段。因此，例如，胃蛋白酶消化铰链区中二硫键C-末端的抗体以产生F(ab)'2,其是Fab的二聚体，其本身通过二硫键将轻链与VH-CH1连接。F(ab)'2可以在温和的条件下还原以断裂铰链区中的二硫键，从而将(Fab')2二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体基本上是具有部分铰链区的Fab(参见，例如Fundamental Immunology,Paul,ed.,Raven Press,N.Y.(1993)，其对其它抗体片段有更详细的描述)。尽管就完整抗体的消化而言定义了各种抗体片段，但是本领域技术人员将理解，可以通过化学方法或利用重组DNA方法从头合成片段。因此，术语抗体也包括通过修饰完整抗体或使用重组DNA方法合成而产生的抗体片段。
当在描述特定分子与蛋白质或肽的结合关系的上下文中使用时，短语“特异性结合”是指确定蛋白质在蛋白质和其它生物制品的异质群体中的存在的结合反应。因此，在指定的结合测定条件下，特定的结合剂(例如抗体)与特定蛋白质的结合是背景的至少两倍，并且基本上不以显著量与样品中存在的其它蛋白质结合。在这样的条件下，抗体的特异性结合可能需要针对其对特定蛋白质或蛋白质的特异性而不是其类似的“姐妹”蛋白质而选择的抗体。各种免疫测定形式可用于选择与特定蛋白质特异性免疫反应或特定形式的抗体。例如，固相ELISA免疫测定通常用于选择与蛋白质特异性免疫反应的抗体(参见，例如Harlow&Lane,Antibodies,A Laboratory Manual(1988)，其描述了可用于确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件)。通常，特异性或选择性结合反应是背景信号或噪声的至少两倍，更通常是背景的10-100倍以上。另一方面，术语“特异性结合”在涉及与另一条多核苷酸序列形成双链复合物的多核苷酸序列的上下文中使用时，描述了基于Watson-Crick碱基配对的“多核苷酸杂交”，如在术语“多核苷酸杂交方法”的定义中所提供的。
如本申请中所用的，“增加”或“减少”是指与比较对照(例如，已建立的标准对照(例如从健康非AD受试者的样品中发现的sST2或嗜酸性粒细胞的平均水平/量))在量上可检测的正或负变化。增加是正变化，即其通常为对照值的至少10％，或至少20％，或50％，或100％，并且可以高达对照值的至少2倍，或至少5倍，或甚至10倍。类似地，降低是负变化，即其通常为对照值的至少10％，或至少20％、30％或50％，或甚至高达对照值的至少80％或90％。在本申请中以与上述相同的方式使用表示与比较基础的定量变化或差异的其它术语，诸如“更多”、“更少”、“更高”和“更低”。相比之下，术语“基本上相同”或“基本上没有变化”表示与标准对照值相比在量上变化很小或没有变化，通常在标准对照的±10％内，或在标准对照的±5％、1％内，或甚至更少的变化。
本文所用的“多核苷酸杂交方法”是指基于预先确定的多核苷酸序列在适当的杂交条件下与已知序列的多核苷酸探针形成Watson-Crick碱基配对的能力来检测其存在和/或数量的方法。这种杂交方法的实例包括Southern印迹、Northern印迹和原位杂交。
本文所用的“引物”是指可用于扩增方法(例如聚合酶链式反应(PCR))以基于对应于目的基因(例如本文所述的任何一种遗传变体或其部分)的多核苷酸序列扩增核苷酸序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的至少一种PCR引物对该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度将取决于多种因素，包括温度，引物的来源和使用的方法。例如，对于诊断和预后应用，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有至少10个，或15个，或20个，或25个或更多个核苷酸，尽管它可以含有更少的核苷酸或更多的核苷酸。确定引物的适当长度所涉及的因素是本领域技术人员容易了解的。在本公开中，术语“引物对”是指与靶DNA分子的相对链或与靶DNA的侧翼待扩增的核苷酸序列的区域杂交的引物对。在本公开中，术语“引物位点”是指与引物杂交的靶DNA或其它核酸的区域。
“标记”、“可检测标记”或“可检测部分”是通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段可检测的组合物。例如，有用的标记包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如通常用于ELISA)、生物素、洋地黄毒苷或半抗原和蛋白质，其例如通过将放射性组分掺入肽中而可被检测或用于检测与肽特异性反应的抗体。通常，可检测标记连接于具有确定的结合特性(例如，具有已知的结合特异性的多肽或多核苷酸)的探针或分子，从而使得探针(以及因此其结合的靶标)的存在易于检测。
本申请中使用的术语“量”是指存在于样品中的目的物质的量，所述目的物质例如目的多核苷酸或目的多肽或某种类型的血细胞。这样的量可以用绝对术语表示，即样品中物质的总量，或者用相对术语表示，即样品中物质的浓度。
本文所用的术语“受试者”或“需要治疗的受试者”包括由于AD的风险(例如，具有家族史)或已经被诊断为AD而寻求医学护理的个体。受试者还包括当前正在进行寻求治疗方案的操作的治疗的个体。需要治疗的受试者或个体包括表现出AD症状或处于患有AD或其症状的风险中的受试者或个体。例如，需要治疗的受试者包括具有AD的遗传倾向或家族史的个体，过去已经经历相关症状的个体，已经暴露于触发物质或事件的个体，以及患有所述病况的慢性或急性症状的个体。“需要治疗的受试者”可以处于任何生命年龄。
靶蛋白的“抑制剂”、“活化剂”和“调节剂”分别用于指使用蛋白质结合或信号传导的体外和体内测定鉴定的抑制、活化或调节分子，例如配体、激动剂、拮抗剂及其同系物和模拟物。术语“调节剂”包括抑制剂和活化剂。抑制剂是例如部分或完全阻断、降低、预防、延迟活化、失活、脱敏或下调靶蛋白活性的试剂。在一些情况下，抑制剂直接或间接结合蛋白质，例如中和抗体。本文所用的抑制剂与失活剂和拮抗剂同义。活化剂是例如刺激、增加、促进、增强活化、敏化或上调靶蛋白活性的试剂。调节剂包括靶蛋白的配体或结合伴侣，包括对天然存在的配体和合成设计的配体、抗体和抗体片段、拮抗剂、激动剂、包括含碳水化合物的分子在内的小分子、siRNA、RNA适体等的修饰。
本申请中使用的术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”描述了导致预先确定的医学病况的任何症状的消除、减轻、缓解、逆转、预防和/或延迟发作或复发的行为。换句话说，“治疗”病况涵盖对该病况的治疗和预防性干预。
本文所用的术语“有效量”是指施用物质产生治疗效果的量。所述效果包括预防、校正或抑制疾病/病况的症状和相关并发症进展至任何可检测的程度。确切的量将取决于治疗的目的，并且将由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见，例如，Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1-3,1992)；Lloyd,The Art,Science andTechnology of Pharmaceutical Compounding(1999)；和Pickar,Dosage Calculations(1999))。
本文所用的术语“标准对照”是指这样的样品，其包含预定量的分析物，以指示存在于取自未患有预先确定的疾病或病症(例如阿尔茨海默病)或处于发生预先确定的疾病或病症的风险中的平均健康受试者的这种类型的样品(例如DNA/mRNA、蛋白质或血细胞如嗜酸性粒细胞)中的这种分析物的量或浓度。
在描述未患有相关疾病或病症(例如AD)且不具有发生相关疾病或病症的风险的健康受试者的上下文中使用的术语“平均”是指某些特征，诸如相关基因的mRNA或蛋白质在人的组织(例如血液)中的水平或血细胞(例如嗜酸性粒细胞)计数，其代表未患有所述疾病或病症且不具有发生所述疾病或病症的风险的随机选择的健康人组。该选择的组应该包括足够数量的人类受试者，使得这些个体中目的分析物的平均量或浓度以合理的精确度反映健康人的一般群体中的相应概况。任选地，选择的受试者组可被选择为具有与测试其相关疾病或病症的适应症或风险的人的背景类似的背景，例如匹配或相当的年龄，性别，种族和病史等。
本文所用的术语“抑制(inhibiting)”或“抑制(inhibition)”是指对靶生物过程的任何可检测的负面影响。通常，当与不存在这种抑制的对照相比时，抑制反映在指示生物过程或其下游效应(例如，sST2的血浆水平或嗜酸性粒细胞计数或血液CCR3水平)的一个或多个参数中至少10％、20％、30％、40％或50％的降低。术语“增强(enhancing)”或“增强(enhancement)”以类似的方式定义，不同之处在于指示正向影响，即，与对照相比，正向影响为至少10％、20％、30％、40％、50％、80％、100％、200％、300％或甚至更多。术语“抑制剂”和“增强剂”分别用于描述表现出如上所述的抑制或增强作用的试剂。在本公开中还以类似方式使用的是术语“增加”、“降低”、“更多”和“更少”，其旨在指示一个或多个预定参数中至少10％、20％、30％、40％、50％、80％、100％、200％、300％或甚至更多的正变化，或一个或多个预定参数中至少10％、20％、30％、40％、50％、80％或甚至更多的负变化。
“香港中国人”和“内地中国人”是用于指中国民族的术语，他们以及他们的祖先分别居住在中国香港和内地一段时间，例如，至少过去的3、4、5、6、7或8代或过去的100、150、200、250或300年。
附图说明
图1.女性AD患者血浆sST2水平的升高。(a)女性AD患者的血浆sST2水平升高(n＝427；在香港中国人AD群组中，男性NC、男性AD、女性NC和女性AD受试者的n分别＝76、69、118和164)。数据为平均值±SEM(**P<0.01；针对年龄、病史和人口结构进行调整的线性回归分析)。(B)在没有任何心血管疾病的女性AD患者中血浆sST2水平升高(n＝176；在没有心血管疾病的香港中国人AD群组中，男性NC、男性AD、女性NC和女性AD受试者的n分别＝39、22、64和51)。数据为平均值±SEM(**P<0.01；针对年龄、病史和人口结构进行调整的线性回归分析)。
图2.AD患者CSF中sST2水平的升高。数据为平均值±SEM(针对年龄和性别进行调整的线性回归；来自UKBBN的NC和AD的n分别＝5和12)。
图3.女性患者血浆sST2水平与认知表现呈负相关。(A,B)在香港中国人AD群组中，(A)所有女性(n＝282)和(B)无心血管疾病的女性(n＝115)的血浆sST2水平与认知表现呈负相关。针对年龄、病史和人口结构进行调整的线性回归分析。(C,D)在香港中国人AD群组中，(C)所有女性AD患者(n＝164)和(D)没有心血管疾病的女性AD患者(n＝42)的血浆sST2水平与认知表现呈负相关。针对年龄、病史和人口结构进行调整的线性回归分析。
图4.AD患者血液中ST2基因表达水平的改变。外周血中的全长ST2(ST2L)转录物水平在AD中降低(分别来自香港中国人群组的男性NC、男性AD、女性NC和女性AD受试者的n＝62、47、95和118个血液总RNA-seq数据)。数据为平均值±SEM(*P<0.05；针对年龄、性别、病史、RIN(RNA完整数)和人口结构进行调整的线性回归分析。
图5.GWAS鉴定的与血浆sST2水平相关的变体。(A)曼哈顿图，其显示通过GWAS鉴定的与香港中国人AD数据集中的sST2的血浆水平相关的遗传变体。蓝色和红色的水平线分别代表暗示阈值(suggestive threshold)(P＝1E-5)和全基因组显著性阈值(P＝5E-8)。(B)与血浆sST2水平相关的IL1RL1变体的区域图。黑色菱形指示基因座中的前哨变体(sentinel variant)。不同的颜色说明在前哨变体及其相邻变体之间测量为R2的LD。cm/Mb，每兆碱基的厘摩。
图6.IL1RL1变体与血浆sST2水平的相关性。在香港中国人AD群组中，rs1921622与(A)女性(n＝282)和(B)男性(n＝145)患者的血浆sST2水平降低有关。X轴表示rs1921622次要等位基因的拷贝数。数据为平均值±SEM(针对年龄、疾病状态和人口结构进行调整的线性回归分析)。
图7.IL1RL1变体与血浆sST2水平的相关性。在香港中国人AD人口(n＝427)中，rs12052753与血浆sST2水平升高有关。X轴表示rs12052753次要等位基因的拷贝数。数据为平均值±SEM(针对年龄、性别、疾病状态和人口结构进行调整的线性回归分析)。
图8.血液ST2L转录物水平与血液嗜酸性粒细胞标志物或嗜酸性粒细胞计数的相关性。(A)ST2L转录物水平与血液中CCR3(嗜酸性粒细胞标志物)的转录物水平呈正相关(n＝322，香港中国人AD群组的全血总RNA测序数据集；针对年龄、性别、疾病状态、RNA质量和人口结构进行调整的线性回归分析)。(B)ST2L转录物水平与嗜酸性粒细胞血液计数呈正相关(n＝香港中国人AD群组的144个绝对血细胞计数数据集)；针对年龄、性别、疾病状态、RNA质量和人口结构进行调整的线性回归分析)。
图9.女性AD患者具有降低的血液嗜酸性粒细胞标志物水平和细胞计数。(A)在来自女性AD患者的血液中，嗜酸性粒细胞标志物CCR3的转录物水平降低(在香港中国人AD群组的全血总RNA测序数据集中，男性NC、男性AD、女性NC和女性AD的n分别＝62、47、95和118；针对年龄、性别、疾病状态、RNA质量和人口结构进行调整的线性回归分析)。(B)在来自女性AD患者的血液中，嗜酸性粒细胞数降低(在香港中国人AD群组中，男性NC、男性AD、女性NC和女性AD受试者的n分别＝18、30、27和78)。数据为平均值±SEM(*P<0.05，**P<0.01；针对年龄、性别、疾病状态和人口结构进行调整的线性回归)。
图10.曲唑酮与女性AD患者血浆sST2水平降低有关。数据为平均值±SEM(***P<0.001；针对年龄和人口结构进行调整的线性回归检验；在香港中国人AD群组中，未摄入曲唑酮的女性AD患者[Ctrl]和摄入曲唑酮的女性AD的n分别＝149和15)。
图11.AD风险预测的多基因风险评分模型的ROC(接受者操作特征)曲线。通过使用来自以下的信息生成数据：(红色)作为参考的APOE-ε4；(绿色)APOE-ε4、多基因风险评分(PRS)和血浆sST2水平；以及(蓝色)APOE-ε4、多基因风险评分(PRS)、血浆sST2水平和嗜酸性粒细胞计数。通过曲线下面积(AUC)值评估模型。
图12.基于PRS的女性APOE-ε4携带者AD风险预测的工作流程。
图13.曲唑酮治疗下调野生型小鼠中的血清sST2水平。通过腹膜内注射(IP)或经口施用(Oral)，每天给予18月龄的雌性野生型小鼠曲唑酮或媒介物对照(Ctrl)，持续2天或4天。n＝2只小鼠/组。数据为平均值±SEM。
图14.曲唑酮治疗下调AD小鼠模型中的血清sST2水平。通过经口施用，每天给予18月龄的雌性APP/PS1小鼠曲唑酮或媒介物对照(Ctrl)，持续7天或14天。n＝5只小鼠/组。数据为平均值±SEM。非配对t检验。
图15.曲唑酮治疗下调野生型和APP/PS1小鼠中的血清sST2水平。通过腹膜内注射(WT IP)或经口施用(WT经口)，每天给予18月龄的雌性野生型小鼠曲唑酮或媒介物对照(Ctrl)，持续2天或4天。N＝2只小鼠/组。通过经口施用(APP/PS1经口)，每天给予18月龄的雌性APP/PS1小鼠曲唑酮或媒介物对照(Ctrl)，持续7天或14天。N＝5只小鼠/组。数据为平均值±SEM。线性回归检验。
发明的详细描述
I.引言
AD患者由于该疾病的渐进性和不可治愈的性质而面临严峻的预后。早期诊断AD或检测到增加的以后发生AD的风险可以为患者及其家属在疾病的治疗和长期管理方面提供更多的选择。
本发明人首次发现，直接影响血浆sST2蛋白水平的某些遗传变体，特别是在IL1RL1基因座的那些，与患者中AD的存在或患者在以后发生该疾病的风险增加有关。因此，该发现提供了用于早期诊断和治疗AD的新方法和组合物。
II.一般方法
实施本发明利用分子生物学领域中的常规技术。公开在本发明中使用的一般方法的基础教科书包括Sambrook和Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第3版，2001)；Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990)；和CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel等人编辑，1994))。
对于核酸，大小以千碱基(kb)或碱基对(bp)给出。这些是来自琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳，测序的核酸，或公开的DNA序列的估计。对于蛋白质，大小以千道尔顿(kDa)或氨基酸残基数给出。蛋白质大小由凝胶电泳，测序的蛋白质，衍生的氨基酸序列或公开的蛋白质序列估计。
不可商购的寡核苷酸可以使用自动合成仪化学合成，例如根据Beaucage和Caruthers,Tetrahedron Lett.22:1859-1862(1981)首先描述的固相亚磷酰胺三酯方法，如Van Devanter等人,Nucleic Acids Res.12:6159-6168(1984)中所描述的。寡核苷酸的纯化使用任何本领域已知的策略进行，例如天然丙烯酰胺凝胶电泳或阴离子交换高效液相色谱(HPLC)，如Pearson和Reanier,J.Chrom.255:137-149(1983)中所描述的。
用于本发明的目的序列，例如表2和3中所示的任何一种遗传变体的多核苷酸序列，和合成的寡核苷酸(例如用于扩增任何一种遗传变体的引物)可以使用例如Wallace等人,Gene 16:21-26(1981)的用于测序双链模板的链终止方法来验证。
III.诊断方法
本发明涉及检测AD相关的遗传变体，测量在人的生物样品(例如血液样品)中发现的标志物mRNA/蛋白的量，和/或测量某种类型的血细胞(例如嗜酸性粒细胞)的数量，作为检测AD的存在，评估发生AD的风险和/或监测AD的进展或治疗功效的手段。更具体地，所述方法包括(1)确定表2或3中的任何一种或多种遗传变体的存在；(2)定量确定一种或多种标志物基因(例如sST2或CCR3)在mRNA或蛋白质水平上的表达水平，和/或(3)确定患者生物样品中的嗜酸性粒细胞计数，并与标准对照值比较，以检测任何定量变化，其继而指示患者中AD的存在或升高的以后发生AD的风险。
为了实施该方法，通常对相关基因组序列进行测序以检测AD相关的变体或分析从被测试的人采集的样品(例如血液样品，尤其是全血样品或血细胞样品)中发现的相关mRNA或蛋白质的量。从个体收集血液按照医院或诊所通常所遵循的标准方案来进行。在一些情况下收集适当量的外周血，例如通常5-50ml，并且可以在进一步制备之前根据标准程序储存。从含有体细胞的广泛范围的解剖部位采集的其它生物样品也可用于检测遗传变体的目的，例如唾液、口拭子、组织活检或脑脊髓液(CSF)。
为了检测特定的AD相关的遗传变体(例如表2和3中列出的那些)或APOE基因型(例如APOE-ε4)的存在，对测试受试者的基因组DNA进行基于多核苷酸序列的分析。在一些情况下，多核苷酸杂交方法可以用于分析，例如，通过含有大量固定的多核苷酸探针的芯片，允许容易地鉴定各种不同的目的遗传序列。在一些情况下，在序列分析之前的扩增反应是任选的。多种多核苷酸扩增方法是公认的，并且在研究中经常使用。例如，用于多核苷酸序列扩增的聚合酶链式反应(PCR)的一般方法在本领域是众所周知的，因此在这里不再详细描述。关于PCR方法，方案和设计引物的原理的综述，参见例如Innis等人,PCR Protocols:AGuide to Methods and Applications,Academic Press,Inc.N.Y.,1990。PCR试剂和方案也可从商业供应商处获得，例如Roche Molecular Systems。
当设法在mRNA水平检测特定的AD相关的遗传变体(例如表2和3中列出的那些)或APOE基因型的存在时，逆转录(RT)步骤通常在扩增反应(例如PCR)之前进行。一旦获得了可能含有遗传变体的足够DNA，就可以进行测序以揭示这些相关变体例如单核苷酸多态性(SNP)的存在。各种高通量，全自动测序技术可通过商业供应商(例如ThermoFisherScientific)获得，并可用于实施本发明。
尽管PCR扩增经常用于实施本发明，但本领域技术人员将认识到相关基因组序列的扩增可以通过任何已知的方法来完成，例如连接酶链式反应(LCR)、转录介导的扩增和自持序列复制或基于核酸序列的扩增(NASBA)，其中每一种都提供足够的扩增。用于多核苷酸序列确定的技术也已经很好地建立并且在相关研究领域中广泛地实施。例如，在关于分子生物学和重组遗传学的各种研究报告和论文中描述了多核苷酸测序的基本原理和一般技术，例如Wallace等人，同上；Sambrook和Russell，同上，和Ausubel等人，同上。在研究实验室中常规实施的DNA测序方法，无论是手动的还是自动的，都可以用于实施本发明。
类似地，根据本发明对患者样品中发现的相关蛋白质或mRNA(如sST2或CCR3)的分析可以使用例如全血或细胞样品如所有血细胞进行。研究领域中已知的标准方法可用于分离和分析样品中标志物基因的蛋白质或RNA水平。参见，例如，Sambrook和Russell，同上。
为了建立用于实施本发明方法的标准对照，首先选择没有任何神经变性病症，特别是AD并且不知道处于发生该疾病的风险中的健康人组。如果适用，为了使用本发明的方法进行筛查和/或评估这种病症的未来风险的目的，这些个体在适当的参数内。任选地，个体具有相同或相当的性别，年龄，种族背景和病史。所选择的个体的健康状态通过充分确立的，常规使用的方法来确认，所述方法包括但不限于对个体的一般身体检查和对其医疗记录的一般检查。
此外，所选择的健康个体组必须具有合理的大小，使得从该组获得的样品中相关mRNA或蛋白质或血细胞(例如嗜酸性粒细胞)的平均量/浓度可以合理地被认为是没有AD并且没有发生AD的风险的健康人的一般群体中正常或平均水平的代表。优选地，所选择的组包括至少10个人类受试者。
一旦基于在所选健康对照组的每个受试者中发现的个体值建立了相关蛋白质或mRNA或血细胞的这种平均值，则该平均值或中值或代表值或图谱被认为是标准对照。标准偏差也在相同的过程中确定。在一些情况下，可以为具有不同特征(诸如年龄、性别、种族背景或病史中的任何不同过去事件)的单独限定的组确定单独的标准对照。
在相关方面，本发明还提供了在检测到AD或在患者中增加的以后发生AD的风险时对AD患者的治疗方法。例如，当完成上述和本文所述的诊断方法步骤时，任选地进行额外的诊断检查以提供进一步的证实信息(例如，通过经由CT扫描的脑成像或其他成像技术以显示脑体积的过度损失，或通过测试认知能力以显示加速下降)，并且患者已经被确定为已经患有AD或处于显著增加的以后发生AD的风险中，合适的治疗或预防方案可以由医师或其他医学专业人员来指示以治疗患者，控制/减轻正在经历的症状，或延迟疾病的未来发作。美国食品和药品管理局(FDA)已经批准了多种胆碱酯酶抑制剂，包括多奈哌齐(AriceptTM，被批准用于治疗AD的所有阶段，包括中度至重度的唯一胆碱酯酶抑制剂)、利凡斯的明(ExelonTM，被批准用于治疗轻度至中度AD)、加兰他敏(RazadyneTM，轻度至中度患者)和美金刚胺(NamendaTM)。多奈哌齐是被批准用于治疗AD的所有阶段，包括中度至重度的唯一胆碱酯酶抑制剂。这些药物中的任何一种或多种可以开处方用于治疗已经根据本发明的方法被诊断患有AD的患者。对于血浆sST2表达增加的患者，治疗的一种可能性是施用曲唑酮，其目前被批准用作抗抑郁药并且已经被本发明人显示为降低血浆sST2水平的有效药剂。
对于被认为是在将来的时间内具有AD的高风险但尚未表现出任何临床症状的患者，持续监测也是合适的，例如，可以对患者进行常规测试(例如，每年一次或每两年一次)以检测其认知能力的任何变化。适用于这种定期监测的方法包括认知的一般实施者评估(GPCOG)、Mini-Cog、区分衰老和痴呆的八项信息访谈(AD8)、以及老年人认知衰退的简短信息人调查表(IQCODE)。此外，还可以推荐用曲唑酮进行预防性治疗。
IV.试剂盒和装置
本发明提供了用于诊断或确定受试者中AD风险的试剂盒。所述试剂盒通常包含第一容器，其含有用于扩增可能携带表2或3中的一种或多种遗传变体的基因组序列的试剂。任选地，所述试剂盒包含第二容器，其含有用于检测表2或3中一种或多种遗传变体存在的试剂。例如，第一容器中的试剂可以包括用于扩增基因组序列的一对引物或寡核苷酸，例如在PCR中。在旨在用于RT-PCR的试剂盒的情况下，还包括用于逆转录的另一引物。第二容器可包括特异性结合包含一种或多种变体的DNA序列的多核苷酸探针，以便能够指示所述变体的存在或不存在。在一些实施方案中，引物和/或探针可以与可检测标记缀合，以促进容易检测相关的DNA扩增子和/或目的遗传变体。
试剂盒的其它任选组分可包括(a)含有用于确定取自受试者的生物样品中sST2或CCR3 mRNA或蛋白质的表达水平的试剂(例如特异性识别所述蛋白质的抗体或特异性结合所述mRNA的编码序列的多核苷酸探针)的容器；以及(b)含有标准对照的另一容器，所述标准对照指示取自未患有AD且未处于罹患AD的风险中的平均健康受试者的相同类型的生物样品中的相应sST2或CCR3水平(其可以是蛋白质或mRNA水平)。任选地，用可检测部分标记多核苷酸探针或抗体。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些情况下，所述试剂盒可以包括至少两种不同的抗体，一种用于特异性结合靶蛋白(即，第一抗体)，另一种用于检测第一抗体(即，第二抗体)，其通常附着于可检测部分。此外，本发明的试剂盒可以提供指导使用者分析测试样品和评估测试受试者中胃癌的存在，风险或状态的说明书手册。
本发明还提供了根据本公开的方法抑制或治疗AD以治疗或预防相关症状的试剂盒。所述试剂盒通常包括容器，其含有(1)具有有效量的活性剂(例如曲唑酮)的药物组合物和(2)含有关于如何分配药物组合物的说明的信息材料，所述信息材料包括对可治疗的患者(例如，患有AD的患者)的类型、时间表(例如，剂量和频率)和施用途径等的描述。任选地，试剂盒中可包括另外的容器，其提供已知有效治疗AD的第二治疗剂，例如，用于AD的早期至中度阶段的胆碱酯酶抑制剂(Aricept、Exelon、Razadyne、Cognex)或治疗中度至重度AD阶段的认知症状(记忆丧失，混乱及思考和推理问题)的美金刚胺(Namenda)中的任一种。
在另一方面，本发明还可以体现在装置或包括一个或多个这样的装置的系统中，所述装置能够执行本文描述的方法步骤中的所有或一些。例如，在一些情况下，所述装置或系统在接收生物样品，例如，从测试AD的受试者采集的血液样品，评估发生AD的风险，或监测病况的进展时执行以下步骤：(a)确定样品中表2或3中的一种或多种遗传变体的存在或不存在；(b)从在步骤(a)中获得的信息产生复合评分(多基因风险评分或PRS)；和(c)提供输出，其指示受试者中是否存在AD或受试者是否处于发生AD的风险中，或在与AD相关的受试者病况中是否存在变化，即恶化或改善。
在一些情况下，本发明的装置或系统在进行步骤(a)之后执行步骤(b)和(c)的任务，并且来自(a)的相关遗传变体的存在或不存在已经被输入到装置中。优选地，所述装置或系统是部分或完全自动化的。
任选地，所述装置或系统还可以在步骤(c)之前执行评估样品中存在的蛋白质或mRNA形式的另外的标志物(例如sST2和/或CCR3)的量，或确定血液样品中的血细胞计数(例如嗜酸性粒细胞计数)，或确定受试者的APOE基因型，尤其是APOE-ε4基因型的另外的步骤；可选地，包括存在于样品中的标志物的量/浓度，血细胞计数，APOE基因型，或测试受试者的性别和/或种族背景的另外的信息是从一个或多个不是用所述装置或系统执行的单独的过程获得的，但是被提供到所述装置或系统中以便在考虑这些另外的信息的同时执行步骤(c)。
实施例
以下实施例仅以说明的方式，而不是以限制的方式提供。本领域技术人员将容易认识到可改变或修改以产生基本上相同或类似结果的各种非关键参数。
引言
阿尔茨海默病(AD)是世界范围内最常见的痴呆形式之一，占所有痴呆病例的60-70％。它是一种不可逆的变性脑病，并且是老年人中死亡率的主要原因。AD的标志是细胞外β-淀粉样(Aβ)斑块和细胞内神经元纤维缠结的沉积，其导致记忆、推理、判断和运动能力的逐渐下降。据估计，全世界有4680万人受到AD的折磨，但预计该数字到2050年将显著上升至1亿人，这是由于更长的预期寿命和更老的人口导致。目前对于AD尚无法治愈，并且其病理生理学仍相对未知。
美国食品和药品管理局(FDA)批准仅有五种药物用于治疗AD，但这些药物仅减轻症状而不是改变疾病病理学，即，它们不能逆转病况或防止进一步恶化。此外，AD在记忆丧失或认知衰退的实际症状表现之前很久就影响大脑了。然而，没有早期检测的诊断工具；在使用现有方法(其涉及主观临床评估)诊断患者患有AD时，病理症状已经处于晚期。此外，尽管已经鉴定了几种血清蛋白生物标志物，例如血清APOE、Aβ、Tau和p-Tau，并且已经引入了脑成像技术，例如正电子发射断层(PET)扫描和功能性磁共振成像(MRI)，以帮助预测AD进展，但限制例如高成本、高个体间变异和低通量率阻止了它们用于疾病诊断。因此，早期治疗性干预对于AD的管理是至关重要的，并且迫切需要用于AD的早期诊断和确定个体发生疾病的风险的新的且有效的方法。
AD的病理生理学机制是复杂的，但遗传因素被认为起关键作用。由于基因组变异性，个体之间的基因可以不同---其中最常见的是由于单核苷酸多态性(SNP)。人类基因组中的其它遗传多态性可由DNA的短和/或长片段的复制、插入、缺失、易位和/或反转引起。遗传变异可编码可导致疾病易感性增加或导致疾病发作(包括AD)的蛋白质变体。AD可以与一种或多种遗传变异相关，其中遗传变异的存在可以增加AD发展的风险或者可以指示AD。因此，遗传分析可用于确定这种遗传变异的存在。
AD基于发病年龄分为两种类型：发病年龄≤45岁的家族性AD(也称为早发型AD)或发病年龄≥65岁的晚发型AD。早发型AD占所有病例的10％，并且由于APP、PSEN1或PSEN2中的特异性和罕见的错义突变的遗传，倾向于在某些家族中占优势。同时，晚发型AD占所有病例的90％。APOE中的多态性是晚发型AD最相关的风险因素。包括但不限于全基因组关联研究(GWAS)、候选基因测序和全外显子组测序的遗传学研究已经鉴定了几种疾病基因和风险等位基因。然而，大多数以前的AD遗传学研究，包括在APOE基因座上的那些，已经在具有高加索人祖先的个体上进行，而来自其他种族的数据是有限的。考虑到跨不同种族的不同基因组含量，AD的遗传风险因素在亚洲人(例如，中国)和高加索人起源的人口之间可能是不同的。此外，对某些遗传风险因素的敏感性在群体之间是不同的。因此，对不同种族人口的遗传风险因素进行系统的研究是至关重要的。
炎性病症和心血管疾病潜在地与AD风险相关(McGeer&McGeer,2001；Newman等人,2005)。受炎性病症和心血管疾病影响的个体可能具有这些疾病的遗传易感性(Grotenboer,Ketelaar,Koppelman,&Nawijn,2013；Tu等人，2013)。大规模全基因组关联研究(GWAS)已经在各种人口的不同疾病中鉴定出IL1RL1(编码全长ST2和sST2蛋白的基因)的单核苷酸多态性(SNP)，其与可溶性ST2(IL-33的诱饵受体)的血浆蛋白质水平关联(Gudbjartsson等人，2009；Zhu等人，2018)。报道的哮喘中的两种IL1RL1 SNP证明了对气道炎症的可能的功能作用(Gordon等人，2016)，而其它的被假定通过影响IL-33活性发挥保护功能(Ramirez-Carrozzi，Dressen，lupardus，Yaspan，&Pappu，2015)。与血清sST2水平相关的IL1RL1 SNP也已经在心血管疾病中被鉴定(Ho等人，2013)，而其它研究也已经证明了IL1RL1 SNP作为冠状动脉和外周动脉疾病中的死亡预测物的效用(Lin等人，2017)。因此，研究IL1RL1在不同疾病中的遗传变体，以及它们对人血液中sST2水平的调节，可以有助于鉴定用于不同疾病的新生物标志物，并发现新的疾病途径。
几项研究已经表明IL-33/ST2信号传导介导变应性哮喘。IL-33表达在支气管哮喘的气道中升高，在那里其促进气道重塑。在肺部炎症的小鼠模型中，预暴露于sST2导致TH2细胞因子的产生减少，这与sST2作为IL-33的诱饵受体的作用一致，并且支气管哮喘患者显示出升高的血清sST2水平(Kakkar&Lee，2008)。同时，IL-33/ST2信号传导在心脏成纤维细胞和心肌细胞中发挥保护作用，其中IL-33、sST2和ST2L的表达水平响应心肌应激而增加。在实验模型中，IL-33/ST2信号传导预防纤维化和心肌细胞肥大并减少细胞凋亡，从而改善心脏功能。IL-33的抗肥厚作用可以通过ROS(活性氧物质)的抑制、NF-κB的调节或其它机制来发挥(Sanada等人，2007)。sST2似乎拮抗IL-33/ST2L的心脏保护作用。在刺激的心肌细胞中，用sST2预孵育逆转了IL-33的抗肥厚作用，并导致游离IL-33的降低。在患有急性心肌梗塞和急性心力衰竭的患者中也观察到高血清sST2水平(Pascual-Figal&Januzzi,2015)。这些结果共同表明sST2或相关基因组信息作为炎性疾病，心血管病症以及神经病症如AD的有希望的生物标志物的潜在用途。因此，本发明人对中国人口中AD的遗传基础进行了全面的研究，重点研究sST2。
结果
在包括427名参与者的香港中国人AD群组中通过ELISA测定测量血浆sST2的水平(表1)。与年龄和性别匹配的正常对照(NC)(图1A)以及没有心血管疾病病史的女性AD患者(图1B)相比，女性AD患者表现出更高的血浆sST2水平。此外，AD患者脑脊液(CSF)中sST2蛋白水平升高(图2)。通过进一步将检测到的血浆sST2水平与MoCA评分测量的认知表现相关联，本发明人在女性受试者以及患有AD的女性患者中鉴定了血浆sST2水平与认知表现之间的负相关(图3)。此外，通过分析来自322名参与者的全血RNA-seq数据，本发明人证明AD患者表现出全长ST2(特别是女性ST2)的降低的转录物水平(图4)。
表1.香港中国人AD群组的特征概况
NC AD
N 194 233
年龄,岁 73.47 80.20
性别,M(F) 76(118) 69(164)
Edu,年 8.03 4.85
MoCA评分 23.15 11.92
心脏疾病(％) 13(6.70％) 45(19.31％)
高血压(％) 114(58.76％) 143(61.37％)
糖尿病(％) 45(23.19％) 79(33.90％)
高血脂(％) 66(34.02％) 102(43.77％)
APOE-ε4等位基因频率 9.02％ 19.74％
APOE-ε2等位基因频率 11.08％ 7.72％
NC，正常对照；AD，阿尔茨海默病
另外，本发明人对香港中国人AD群组进行了全基因组测序(WGS)分析，并进行了遗传变体和sST2的血浆水平之间的关联试验。IL1RL1(编码全长ST2和sST2蛋白的基因)区域附近的变体与血浆sST2水平的变化相关(图5A)。IL1RL1区域的区域图(chr2:102,500,000-103,500,000)揭示了该基因座中的多种变体可以调节中国人口中的血浆sST2水平(图5A和表2)。特别地，前哨变体rs1921622的次要等位基因与男性和女性中血浆sST2的较低水平相关(有效大小＝-3.346，T＝-10.21，P＝5.35E-22；图6和表2)。
表2.与血浆sST2水平相关的变体列表。对于每种SNP，正的β值表示在次要等位基因携带者中较高的血浆sST2水平，负的β值表示在次要等位基因携带者中较低的血浆sST2水平。SNP，单核苷酸多态性；MA，次要等位基因，β，效应大小；Stat，系数t-统计量。
Figure GDA0003553920020000231
Figure GDA0003553920020000241
Figure GDA0003553920020000251
Figure GDA0003553920020000261
Figure GDA0003553920020000271
Figure GDA0003553920020000281
Figure GDA0003553920020000291
Figure GDA0003553920020000301
表3.所列变体的序列：
Figure GDA0003553920020000302
Figure GDA0003553920020000311
Figure GDA0003553920020000321
Figure GDA0003553920020000331
Figure GDA0003553920020000341
Figure GDA0003553920020000351
Figure GDA0003553920020000361
Figure GDA0003553920020000371
Figure GDA0003553920020000381
Figure GDA0003553920020000391
Figure GDA0003553920020000401
Figure GDA0003553920020000411
Figure GDA0003553920020000421
Figure GDA0003553920020000431
Figure GDA0003553920020000441
Figure GDA0003553920020000451
Figure GDA0003553920020000461
Figure GDA0003553920020000471
AD中sST2的血浆水平升高(图1)以及rs1921622次要等位基因与血浆sST2水平降低的关联提示该变体可发挥针对AD的保护作用。虽然在内地中国人(另一个具有可用基因型信息的中国人AD群组)或香港群组中未发现rs1921622与AD相关，但是rs1921622的次要等位基因在内地中国人AD群组的女性APOE-ε4携带者中显示出保护作用(优势比[OR]＝0.63，P＝0.01；表4)，在香港中国人AD群组中具有一致的趋势(OR＝0.59；P＝0.25；表4)。此外，在内地中国人AD群组中，rs1921622次要等位基因携带者中的APOE-ε4的风险效应低于非携带者(对于rs1921622次要等位基因携带者和非携带者分别为OR＝1.94-3.64和4.06-12.40，P＝1.2E-9和1.1E-11；表5)，在香港中国人AD群组中具有类似趋势(对于rs1921622次要等位基因携带者和非携带者分别为OR＝2.09–9.64和1.62–37.77，P＝1.4E–4和0.0175；表5)。此外，另一种变体，rs12052753的次要等位基因与血浆sST2的较高水平相关(图7)，并且在香港中国人AD群组中显示出AD风险效应(OR＝1.80,P＝0.04，表6)。此外，IL1RL1的最后一个外显子的Sanger测序在来自内地中国人AD群组的AD患者中显示出稀有突变的富集(P＝0.02，表7)。因此，与血液sST2水平相关的IL1RL1变体可通过调节AD中的APOE-ε4相关风险来发挥AD保护作用。
表4.通过APOE-ε4基因型对女性中rs1921622的MAF和OR分类。NC，正常对照；AD，阿尔茨海默病；OR,优势比；P，p值。
Figure GDA0003553920020000481
表5.通过rs1921622基因型对女性APOE-ε4的MAF和OR分类。NC，正常对照；AD，阿尔茨海默病；OR,优势比；P，p-值；CI，置信区间。
Figure GDA0003553920020000482
表6.APOE-ε4基因分型对雌性小鼠rs12052753mf和ors的影响。NC，正常对照；AD，阿尔茨海默病；OR，优势比；P，p值。
Figure GDA0003553920020000491
表7.内地中国人AD群组IL1RL1最后一个外显子稀有突变的富集
Figure GDA0003553920020000492
*P，调整年龄和性别的逻辑回归。
**稀有突变定义为MAF<1％。
表8.用于IL1RL1最后一个外显子的Sanger测序的引物
基因 引物链 引物序列 Seq.ID
IL1RL1 正向 5′-AGACTTTTAAATGTTCAGGATGTTT-3′ 576
IL1RL1 反向 5′-CCCAGAAGCAGGGAAATG-3′ 577
表9.sST2、IL1RL1和CCR3的氨基酸和转录物序列
Figure GDA0003553920020000493
Figure GDA0003553920020000501
Figure GDA0003553920020000511
此外，由于AD患者的外周血中sST2蛋白和全长ST2转录物的水平改变，这意味着外周循环系统中IL-33/ST2信号传导的失调，本发明人检查这种失调的IL-33/ST2信号传导是否导致血液特征的改变，例如血细胞比例的改变。因此，测定全长ST2转录物水平与血细胞计数或特定血细胞类型标志物的转录物水平之间的相关性。在香港中国人AD群组中，全长ST2的转录物水平与血液中CCR3(嗜酸性粒细胞标志物)的转录物水平以及绝对嗜酸性粒细胞计数呈正相关(图8)。此外，在AD患者中，血液中CCR3的基因表达和嗜酸性粒细胞计数降低(图9)，并且与AD保护性IL1RL1变体rs1921622的基因型剂量相关。这些结果共同表明在AD发病机理中IL33/ST2信号传导和嗜酸性粒细胞功能之间的关联。
另外，研究了可以调节血浆sST2蛋白水平的药物。本发明人对香港女性AD患者收集的血浆sST2蛋白水平和医学信息进行了关联分析。曲唑酮可导致AD患者的血浆sST2水平降低(图10)，并改变女性AD患者的认知表现(P＝0.0202)。因此，曲唑酮可能降低血浆sST2水平并改善认知表现。
此外，本发明人开发了多基因风险评分(PRS)模型，以通过汇总来自所列的总共29种sST2相关变体的效应来计算个体风险水平：rs75687525、rs4499395、rs56238602、rs1921622、rs2140316、rs12052753、rs199977663、rs2141304、rs4103380、rs4703514、rs191531802、rs2300619、rs1229502、rs9886235、rs6587006、rs7047059、rs5006678、rs7849649、rs1907370、rs11615704、rs66994203、rs117523785、rs17641976、rs7208104、rs12600563、rs142226688、rs111246464、rs4583526、rs56242654。关联分析显示，内地中国人AD群组中，针对具有APOE-ε4风险变体的女性参与者获得的PRS与AD之间存在显著的关联(效应大小＝0.344,P值＝0.046；表10)，在香港中国人AD群组中具有一致的趋势。
表10.sST2-多基因评分与女性APOE-ε4携带者中的AD风险相关。N，样品大小；β，效应大小。
Figure GDA0003553920020000521
Figure GDA0003553920020000531
*P，线性回归试验，根据年龄，病史和人口结构调整的。
通过增加APOE基因型和血浆sST2水平的信息，进一步优化PRS模型，以提高其对AD和NC分类的准确性(对于单独的APOE和增加PRS和血浆sST2后AUC分别＝0.6203和0.6678；图11)，其可以通过增加嗜酸性粒细胞计数数据进一步改善(AUC＝0.6829，图11)。因此，本发明人已经证明使用来自sST2区域的遗传信息，或整合血浆蛋白和血细胞计数数据的改进策略，作为筛选AD风险的一般群体的可行策略。
方法
香港中国人AD群组的受试者招募：从咨询过香港中文大学威尔士亲王医院专科门诊室的个体招募香港中国人的群组。共招募427名受试者：233名患有AD和194名正常对照(NC)。所有受试者均≥60岁。AD的临床诊断是基于美国精神病学协会的精神病症诊断和统计手册，第五版(DSM-5)建立的。通过蒙特利尔认知评估(MoCA)测试和MRI神经成像评估，对所有受试者进行病史评估，认知和功能评估。记录每个个体的数据，包括年龄、性别、教育、病史和心血管病史。排除患有任何显著神经疾病或精神病症的个体。收集受试者的血浆，并作为等分试样储存在-80℃下直至使用。本研究被威尔士亲王医院、香港中文大学和香港科技大学批准。所有参与者都提供书面知情同意书供研究登记和样品收集。绝对血细胞计数通过威尔士亲王医院的完全血细胞计数(CBC)测定。也从威尔士亲王医院获得香港中国人AD群组的药物和疾病记录。
内地中国人AD群组的受试者招募：从2007年至2018年，通过中国上海复旦大学华山医院神经内科或记忆门诊部招募了患有AD、轻度认知损害(MCI)以及年龄和性别匹配的正常对照的内地中国人参与者的群组。AD患者基于国家老年研究所和阿尔茨海默病协会工作组的建议被诊断，并且具有≥50岁的发病年龄。根据Peterson标准诊断患有MCI的患者。排除患有任何显著神经疾病或精神病症的个体。从上海的一般社区招募没有主观记忆抱怨的正常对照部分。共招募了1696名参与者(对于AD和NC分别为N＝867和829),其中911名女性参与者。对所有参与者进行病史评估，神经心理学评估和成像评估，包括计算机断层扫描(CT)或磁共振成像(MRI)。一些受试者也接受使用匹兹堡化合物B的正电子发射断层扫描。该研究由华山医院伦理委员会，香港科技大学(HKUST)和HKUST深圳研究院批准。所有受试者都提供书面知情同意书供研究登记和样品收集。
人脑脊液样品：所有人脑脊液(CSF)样品均获自MRC UK脑库网(UKBBN)。在临床诊断的基础上选择来自AD和未痴呆NC的样品，事后剖析持续时间≤30小时。
通过ELISA检测可溶性ST2蛋白：使用人ST2/IL-33R Quantikine ELISA试剂盒(DST200)测量人血浆和CSF可溶性ST2(sST2)蛋白水平。
血液转录物组RNA测序：从收集在PAXgene管中的血液样品提取总RNA，然后使用GLOBINclear试剂盒(Thermo Fisher)除去珠蛋白，以从总RNA中清除高拷贝珠蛋白mRNA。通过Fragment Analyzer和Biodrop分光光度计评价完整性、纯度和浓度。通过Novogene(北京)进行文库构建和RNA测序(RNA-seq)。简言之，使用oligo-dT珠从总RNA中富集mRNA，然后进行化学片段化。将片段化的mRNA逆转录为cDNA，与适配子连接，并通过PCR扩增以产生cDNA文库。评估所有文库的质量(即，浓度和文库大小分布)，并将通过质量控制要求的文库置于Illumina HiSeq X平台上进行转录物组分析，每个样品产生1200万个150bp的成对末端读数。使用感知剪接的校准器STAR将测序读数映射到人类参考基因组(Grch37)，然后用Stringtie进行转录物定量。
全基因组测序和变体召集方法：通过Novogene进行全基因组测序(WGS,5×覆盖范围)。在Illumina HiSeq X Ten平台上对基因组DNA文库进行测序，该平台产生150bp的成对末端读数。通过Gotcloud管线检测来自测序数据的变体，随后对其进行FastQC以进行质量检查和Trimmomatic从而修整和过滤低质量读数。采用含有诱饵片段的GRCh37作为参考基因组，通过BWA-mem对过滤后的数据进行映射。在对重叠的成对末端读数进行去重复和修剪之后，对BAM文件进行samtools以产生glf文件，该glf文件包含基因型的边缘可能性，随后通过glfFlex用于基于群体的SNP召集。在Gotcloud管线中实现的作为VcfCooker的硬过滤被用于基于与已知插入/缺失位点的距离，等位基因平衡和映射质量来过滤低置信度变体召集。对具有高置信度召集和次要等位基因频率(MAF)≥5％的变体进行Beagle定相。前五个主成分由具有以下参数的PLINK软件生成：–pca header tabs、--maf 0.05、--hwe0.00001和—不是-chr x y。
GWAS的关联测试和数据可视化：使用PLINK软件进行全基因组SNP与血浆sST2水平的关联测试，其调整协变量(包括年龄、性别和前五个主成分)，并且具有以下参数：-keep-allele-order、–linear、--ci 0.95、--hwe 0.00001和--maf 0.05。为了使数据可视化，使用R qqman包生成曼哈顿图。使用LocusZoom产生IL1RL1基因座的区域图。使用CAVIAR软件以及使用以下参数从PLINK产生的关联测试结果和成对连锁不平衡(LD)信息，对IL1RL1基因座对血浆sST2表达的影响进行精细映射分析，并：--hwe 0.00001、--maf 0.05、--r、--matrix、--chr 2、--from-bp102000000和--to-bp 104000000。
IL1RL1的最后一个外显子的Sanger测序：使用以下用于PCR的引物，以10ng提取的血液基因组DNA作为输入进行Sanger测序：正向引物：5′-AGACTTTTAAATGTTCAGGATGTTT-3′(SEQ ID NO:576)；反向引物：5′-CCCAGAAGCAGGGAAATG-3′(SEQ ID NO:577)。
通过TaqMan测定对APOE进行基因分型：对于APOE-ε4(rs429358和rs7412)，通过TaqMan测定，用从Thermo Scientific订购的探针(测定ID:C_3084793_20和C_904973_10)进行基因分型。在QuantStudio 7Flex实时PCR系统(Applied Biosystems)上对10ng基因组DNA进行实时PCR，并使用QuanStudio实时PCR软件(Applied Biosystems)进行基因型召集。
sST2水平的多基因风险评分及其与AD的关联：对P值低于1E-5的sST2相关变体进行SNP修剪(r2<0.2)以产生29个独立的信号。通过按每种相应变体对sST2水平的效应大小对基因型剂量进行加权来计算多基因风险评分(PRS)，从而产生个体水平上的PRS。对单独的PRS或PRS与血浆sST2水平和嗜酸性粒细胞计数相结合进行具有交叉验证的Lasso回归，以评估它们在分类AD和NC方面的有效性。使用调整年龄的R程序进行逻辑回归以测试PRS与AD之间的相关性。
统计分析和数据可视化：使用GraphPad Prism 6.0版，Locuszoom或R编程生成所有统计图。对于sST2水平分析，进行ELISA的研究者对实验组和条件不知情。进行线性回归，调整协变量，包括年龄、性别、病史和人口结构(从使用全基因组测序数据的主成分分析获得的前面的主成分)。显著性水平设定为P<0.05。对于血液转录物组和血细胞计数分析，进行线性回归，调整年龄、性别、病史、RNA完整性数(RIN)和人口结构(从使用全基因组测序数据的主成分分析获得的前面的主成分)。显著性水平设定为P<0.05。对于药物分析，使用R进行女性AD患者的血浆sST2蛋白水平、由MoCA评分指示的个体认知表现和药物史的线性回归分析，针对年龄和人口结构进行调整。
多基因风险衍生的预测AD风险的sST2-相关变体：为了研究IL1RL1基因座(其潜在地影响血浆sST2)对AD风险的多基因效应，在汇总来自多个sST2-相关变体的效应的个体水平上计算多基因风险评分(PRS)。关联分析显示，在具有APOE-ε4风险变体的女性参与者的内地AD群组中获得的PRS与AD之间存在显著的关联性(效应大小＝0.344,P值＝0.046，与在香港中国人AD群组中观察到一致的趋势)。具体而言，PRS的截止值为0能够预测内地女性APOE-ε4携带者中个体的AD风险(灵敏度＝62.32％，特异度＝57.74％；表11)。因此，为了预测女性APOE-ε4携带者的AD风险，可以从血液中提取基因组DNA用于29个sST2相关SNP的基因分型。基于如前所述的29种SNP的基因型剂量计算多基因风险评分(PRS)，并且大于0的PRS表明测试中个体的AD的高风险(图12)。
此外，在增加APOE基因型和血浆sST2水平的信息后，PRS模型对AD和NC的分类展现出更高的准确性(对于单独的APOE和增加PRS和血浆sST2后，AUC分别＝0.6203和0.6678；图11)，其可以在增加嗜酸性粒细胞计数数据后得到进一步改善(AUC＝0.6829，图11)。因此，通过依赖来自sST2区域的遗传信息，或通过整合血浆蛋白和血细胞计数的改进策略，可以设计试剂盒或策略以在人口规模上筛查AD风险。
sST2水平的多基因风险评分及其与AD的关联：对P值低于1E-5的sST2相关变体进行SNP修剪(r2<0.2)，产生29个独立的信号。通过相应变体对sST2水平的效应大小加权(βi)的基因型剂量之和(snpi)来计算多基因风险评分(PRS)，以产生个体水平上的PRS：
个体PRS＝β1snp1+β2snp2+...+β29snp29
通过减去平均值并除以标准差来进一步标准化个体多基因评分。对单独的PRS，或PRS与血浆sST2水平和嗜酸性粒细胞计数相结合进行具有交叉验证的Lasso回归，以评估它们在分类AD和NC方面的有效性。使用R程序(调整年龄)进行逻辑回归，以测试PRS和AD之间的关联。
表11.sST2-多基因风险评分(PRS)在内地女性APOE-ε4携带者中预测AD的不同截止评分的灵敏性和特异性。
PRS截止评分 灵敏性 特异性
PRS>-2 100.00％ 0.00％
PRS>-1.5 98.14％ 1.41％
PRS>-1 90.23％ 8.45％
PRS>-0.5 75.81％ 28.17％
PRS>0 62.32％ 57.74％
PRS>0.5 41.86％ 76.05％
PRS>1 19.07％ 97.18％
PRS>1.5 8.84％ 100.00％
PRS>2 2.79％ 100.00％
小鼠的曲唑酮治疗：通过腹膜内(IP)注射或经口施用用曲唑酮或媒介物对照治疗小鼠。对于IP注射，小鼠每天注射50mg/kg曲唑酮或媒介物(盐水)。对于经口施用，小鼠每天饲喂100mg/kg曲唑酮或媒介物(水)。治疗2天、4天、7天或14天后，在处死时通过心内放血收集小鼠血液。将不含抗凝血剂的血液在室温下孵育2小时，然后以2,000×g离心20分钟。使用小鼠ST2/IL-33R Quantikine ELISA试剂盒(MST200,R&D)测量血清sST2水平。
调节人血浆sST2水平的药物：为了研究可调节血浆sST2蛋白水平的药物，对香港女性AD患者的血浆sST2蛋白水平和药物进行关联分析。曲唑酮与AD患者的血浆sST2水平降低有关(图10)。同时，通过腹膜内注射或经口施用曲唑酮的治疗导致老年雌性野生型小鼠以及APP/PS1小鼠中血清SST2水平降低(图13-15)。此外，曲唑酮与女性AD患者中改变的认知表现相关(P＝0.0202)。因此，曲唑酮能够调节血浆sST2水平和认知表现。
本文引用的所有专利，专利申请，其它出版物和GenBank登录号或等同物通过引用整体并入用于所有目的。
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Claims (30)

1.用于检测受试者中阿尔茨海默病(AD)的存在或增加的以后发生AD的风险的方法，其包括检测取自所述受试者的生物样品中表3中的一种或多种遗传变体，优选表3中的至少5种、10种、15种、20种或25种或更多种遗传变体的存在的步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者是中国人。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述受试者是香港中国人或内地中国人。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者具有AD的家族史但没有表现出AD的症状，或者所述受试者没有AD的家族史。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述样品是血液样品(如全血或血细胞)或细胞(或来自身体任何部位的组织)、唾液、口腔拭子、汗液或尿液。
6.如权利要求1所述的方法，其中检测步骤包括扩增所述遗传变体的扩增反应、基于杂交的方法或基于测序的方法。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述扩增反应是聚合酶链式反应(PCR)，特别是逆转录PCR(RT-PCR)。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述变体包括以下或由以下组成：rs1921622、rs75687525、rs4499395、rs56238602、rs2140316、rs12052753、rs199977663、rs2141304、rs4103380、rs4703514、rs191531802、rs2300619、rs1229502、rs9886235、rs6587006、rs7047059、rs5006678、rs7849649、rs1907370、rs11615704、rs66994203、rs117523785、rs17641976、rs7208104、rs12600563、rs142226688、rs111246464、rs4583526和rs56242654。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述变体包括rs1921622和rs12052753或由rs1921622和rs12052753组成。
10.如权利要求1所述的方法，其还包括确定受试者的APOE基因型或单倍型的步骤。
11.如权利要求1所述的方法，其还包括确定血液样品中嗜酸性粒细胞计数的步骤。
12.如权利要求1所述的方法，其还包括确定血液样品中sST2、全长ST2或CCR3表达水平的步骤。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述表达水平是蛋白质水平。
14.如权利要求13所述的方法，其中确定sST2或CCR3表达水平的步骤包括免疫测定或质谱分析。
15.如权利要求12所述的方法，其中所述表达水平是mRNA水平。
16.如权利要求15所述的方法，其中确定sST2或CCR3表达水平的步骤包括逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、原位杂交或基于测序的方法。
17.如权利要求1所述的方法，其还包括将多基因风险评分(PRS)计算为样品中相应变体对sST2水平的效应大小加权(βi)的基因型剂量之和的步骤，其中n是测试的遗传变体的数量：
PRS＝β1snp1+β2snp2+...+βnsnpn
18.如权利要求17所述的方法，其中测试的遗传变体的数量是29。
19.如权利要求17所述的方法，将PRS不大于0的受试者确定为未患有AD或不具有增加的AD风险，而将PRS大于0的受试者确定为患有AD或具有增加的AD风险。
20.如权利要求9所述的方法，其还包括在确定所述受试者患有AD或具有增加的AD风险时对所述受试者施用有效治疗AD的药剂的步骤。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述药剂是曲唑酮。
22.治疗受试者的AD或降低受试者的AD风险的方法，其包括向所述受试者施用包含(1)有效量的曲唑酮和(2)药学上可接受的赋形剂的组合物。
23.如权利要求22所述的方法，其还包括向所述受试者施用有效量的用于AD的第二治疗活性剂。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述组合物被配制用于皮下、透皮、肌内、静脉内、腹膜内、颅内注射、局部、经鼻或经口施用。
25.用于治疗受试者的AD或降低受试者的AD风险的药物，其包含(1)有效量的曲唑酮；和(2)药学上可接受的赋形剂。
26.如权利要求25所述的药物，其还包含用于AD的第二治疗活性剂。
27.如权利要求25所述的药物，其被配制用于皮下、透皮、肌内、静脉内、腹膜内、颅内注射、局部、经鼻或经口施用。
28.用于检测受试者中阿尔茨海默病(AD)的存在或增加的发生AD的风险的试剂盒，其包含适于扩增携带表3中的至少一种遗传变体的基因组DNA序列的一组寡核苷酸引物；以及任选地，能够特异性鉴定所述至少一种遗传变体的试剂。
29.如权利要求28所述的试剂盒，其还包含适于指导从基因组DNA序列转录的mRNA的逆转录的引物。
30.如权利要求28所述的试剂盒，其还包含用于检测AD的存在或增加的发生AD的风险的说明书。
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