EA016267B1

EA016267B1 - Энантиомерно чистые фосфоиндолы в качестве ингибиторов hiv

Info

Publication number: EA016267B1
Application number: EA200900358A
Authority: EA
Inventors: Ричард Сторер; Франсуа-Рене Александр; Кирил Дуссон; Адел М. Мусса; Эдвард Бриджиз
Original assignee: Айденикс Фармасьютикалз, Инк.
Priority date: 2006-09-29
Filing date: 2007-09-28
Publication date: 2012-03-30
Also published as: EP2078029A2; IL197777A; US20110257129A1; IL197777A0; BRPI0717511A2; US7960428B2; KR20090077813A; EA200900358A1; ES2488922T3; NO20091258L; WO2008042240A9; US8486991B2; WO2008042240A3; HK1129679A1; US20080213217A1; WO2008042240A2; NZ575831A; CO6190525A2; MA30806B1; MX2009003410A

Abstract

В изобретении предложены 3-фосфоиндольные соединения, полезные для лечения инфекций, вызванных вирусами семейства Flaviviridae, и, в частности, инфекций HLV. Также предложены фармацевтические композиции, содержащие 3-фосфоиндольные соединения самостоятельно или в комбинации с одним или более чем одним другим противовирусным агентом, способы их получения и способы приготовления лекарственного средства, включающего эти соединения. 3-Фосфоиндольными соединениями являются соединения формулы (С)где R″ и R″ независимо представляют собой Салкил или Салкенил, каждый из которых может быть, возможно, независимо замещен CN или галогеном; каждый из R и R независимо представляет собой водород или галоген; Rпредставляет собой водород, фенилсульфонил или 4-метоксибензил и Y представляет собой О-Салкил, и их фармацевтически приемлемые соли.

Description

В изобретении предлагаются энантиомерно чистые фосфоиндольные соединения, полезные для ингибирования вирусной репликации. В некоторых воплощениях здесь предложены Е-фосфоиндольные соединения, полезные для ингибирования вирусной репликации. Кроме того, предложены фармацевтически приемлемые соли соединений, фармацевтические композиции, содержащие соединения, способы применения соединений, например, при лечении или профилактики инфекции Ηΐν (вируса иммунодефицита человека) и способы получения соединений.

Предшествующий уровень техники

Индолы, нуклеозиды и их аналоги известны в области техники как обладающие полезностью при лечении вирусных инфекций у млекопитающих, включая людей. Вирусы, которые инфицируют млекопитающих и которые можно лечить путем введения фармацевтических композиций, содержащих индолы, нуклеозиды или их аналоги или производные, включают гепацивирус, включающий ПСУ (вирус гепатита С), вирус иммунодефицита человека (Ηΐν), пестивирусы, такие как вирус бычьей диареи (ΒνΌν), вирус классической лихорадки свиней (С81Х, также известный как вирус холеры свиней), вирус пограничной болезни овец (ΒΌν) и флавивирусы, такие как вирус геморрагической формы лихорадки денге (ΌΗΤ или ΌΕΝν), вирус жёлтой лихорадки (ΥΤν), вирус лихорадки Западного Нила (№Νν), вирус токсического синдрома и вирус японского энцефалита, но не ограничиваются ими (Моеппщ е1 а1., Αάν. νΐτ. Кез. 1992, 41:53-98; Меуегз, О. и ТЫе1, Η.-1., Αάν. ΐη УнА Кез., 1996, 47:53-118; Моеппщ е! а1., Αάν. νΐτ. Кез. 1992, 41:53-98; 8.Β. ШЫеаб, Κ^ν. 1п£ес1. Όΐδ., 1984, 6:251-64; 8.Β. ШЫеаб, 8с1епсе, 1988, 239:476-81; Т.Р. Мопа!И, \'е\х Епд1. 1. Меб., 1988, 319:641-3).

Индолы

Некоторые индольные аналоги и производные используют для лечения вируса иммунодефицита людей (Ηΐν).

Например, Аййатз е! а1. сообщает о замещенных индолах для лечения инфекции Ηΐν в патенте США № 5527819, выданном Мегск. Соединения, раскрытые в патенте '819, содержат большой класс, представленный, в общем, виде следующей широкой структурной формулой (III):

(Ш) в которой переменные X, Υ, Ζ, Κ и Κ⁶ широко определены таким образом, чтобы охватывать приблизительно одну сотню соединений. В большинстве представленных примеров Υ представляет собой 8О₂, Ζ представляет собой -С(О)ХИ₂ и Κ представляет собой возможно замещенный фенил.

В патенте США № 5124327, выданном Огееп1ее е1 а1. и переуступленном Мегск & Со., раскрыт класс возможно замещенных сульфонилфенилиндольных соединений. Эти соединения предположительно активны в качестве ингибиторов обратной транскриптазы и, таким образом, полезны при лечении инфекции Ηΐν и ΑΙΌ8 (синдрома приобретенного иммунодефицита человека).

В патенте США № 6710068, выданном Иешх РЪагтасеийсаИ, Ыб., раскрыт класс фенилиндолов, замещенных по меньшей мере двумя группировками, отличающимися от водорода на фенильном кольце или бензильном кольце индольной функциональной группы либо на обоих кольцах. Заместители, как правило, располагаются в 3 и 5 позициях, если расположены на фенильном кольце, и в 4' и 5'; 5' и 6' или 5' и 7' позициях, если располагаются на бензильном кольце индольной группировки. Смотри также публикацию РСТ АО 02/083126.

В публикации РСТ АО 2004/014364 от Иешх РЪагтасеийсаИ раскрыт еще один класс фенилиндолов, демонстрирующих усиленную активность против Ηΐν. Подобно своим предшественникам, эти соединения замещены по меньшей мере двумя группировками, отличающимися от водорода, на фенильном кольце или бензольном кольце индольной функциональной группировки, или на обоих кольцах. Дополнительно эти соединения включают множество заместителей, имеющих карбоксамидную функциональную группу в позиции 2 на индольной группе соединения, позиции, изображенной в формуле (ΐΐΐ) выше как Ζ.

Мешх РЪагтасеийсаИ раскрывает еще один класс фенилиндольных соединений, они представляют собой фосфофенилиндолы, полезные при лечении Ηΐν и/или ΑΐΌ8 (ϋ8 2006/0074054 и АО 06/054182).

Β^^8ΐо1 Муегз 8(μιίΙΑ представляет собой патентообладатель многочисленных патентов, опубликованных заявок на патенты, и публикаций РСТ, раскрывающих различные, возможно, замещенные индолы, азаиндолы, пиперазины и пирролидины для лечения Ηΐν и/или ΑΐΌ8. Смотри публикацию ϋ8 № 2004/0006090 от Кабо^ е! а1.; публикацию ϋ8 № 2004/0063746 от Кедие1го-Кеп е! а1.; публикацию ϋ8 № 2003/0096825 от Аапд е! а1.; публикацию ϋ8 № 2003/0236277 от Кас1о\х е! а1. и АО 03/068221 от Кас1о\х е! а1.

В АО 01/02388 от 8т1!йК1те Βеесйат 8.РА раскрыты, возможно, замещенные фенилиндолы с карбамильным заместителем, полезные при лечении Ηΐν, ΑΐΌ8, остеопороза, рака и болезни Альцгеймера.

- 1 016267

ХУагпег-ЬатЬеП Сотрапу раскрывает различные индол-тиазепиноны, оксазепиноны, диазепиноны, бензотиофены, бензофураны и индол-2-карбоксамиды для лечения Ηΐν (смотри и.8. 5424329, выданный ВоксйеШ е1 а1.; и.8. 5565446, выданный ВоксйеШ е1 а1.; и.8. 5703069, выданный Соппог е1 а1.; и \УО 96/29077 от ^агпег-ЬатЬеП Сотрапу).

81ипощ & Со. раскрывает, возможно, замещенные индольные производные, представляющие собой ингибиторы вирусной интегразы, полезные в качестве лекарств против Ηΐν (публикация и8 № 2002/0019434 от РнркйИа е1 а1.; патент США № 6716605, выданный РнркйИа е1 а1.; и патент США № 6506787, выданный РнркйИа е1 а1.)

В патенте США № 5945440, выданном К1ет5с11го111 е1 а1., раскрыт класс индолокарбазоламидов для лечения различных заболеваний, включая рак, вирусные заболевания (включая Ηΐν), сердечные и сосудистые заболевания, бронхолегочные заболевания, воспалительные нарушения, дегенеративные заболевания центральной нервной системы и другие заболевания.

Сипакекега е1 а1. в патенте СШа № 4866084 описывает некоторые бис-индолалкалоидные соединения, обладающие противовирусной и противоопухолевой активностью, включая Η8ν (вирус простого герпеса). Патент США № 5935982, выданный Оукбга е1 а1., сообщает о другом классе бис-индолов, обладающем специфической пользой против ретровирусных инфекций и в особенности Ηΐν.

Майипада е1 а1. в патенте США № 5852011 (ИесетЬег 22, 1998) раскрывает класс индольных производных, замещенных гетероарильной функциональной группой и амидной функциональной группой. Утверждают, что соединения, в общем, обладают противоопухолевыми, противовирусными и антимикробными свойствами.

Иукйга е1 а1. в патенте США № 5935982 раскрывает класс бис-индолов и конкретно представляет их применение для лечения ретровирусных инфекций и в особенности инфекций Ηΐν.

Иотада1а е1 а1. в патенте США № 5929114 (27 июля 1999 года) раскрывает класс арилтио и битиобис-ариламидных соединений, включая индольные производные, которые, как сообщается, обладают антибактериальной и противовирусной активностью.

Реуеаг е1 а1. в патенте США № 5830894 (3 ноября 1998 года) раскрывает класс триазиноиндольных производных, которые, как сообщается, обладают активностью против пестивирусов, в частности активностью против Βνον (вируса бычьей диареи).

Индолы используют при лечении заболеваний, отличающихся от Ηΐν. Патент США № 5981525, выданный Раппа е1 а1., раскрывает комплексный ряд индолов для применения при лечении остеопороза, основанного на их способности ингибировать Н⁺-АТРазу остеокластов и, таким образом, уменьшать резорбцию кости. Патент США № 6025390, также выданный Раппа е1 а1., описывает еще одну группу индольных производных, названных гетероароматические производные пентадиеновой кислоты, которые также полезны при лечении остеопороза. Патент США № 5489685, выданный ИоирЬ е1 а1., раскрывает ряд соединений, представляющих собой сложные эфиры фуро(2,3-Ь)пиридинкарбоновой кислоты, которые полезны при лечении Ηΐν.

В свете того, что инфекции Ηΐν по всему миру достигли эпидемических уровней и оказывают фатальное действие на инфицированного хозяина, сохраняется значительная потребность в получении новых и эффективных фармацевтических агентов для лечения этих вирусных инфекций, обладающих низкой токсичностью в отношении хозяина. Задача изобретения заключается в том, чтобы предложить соединения, способы применения и композиции для лечения хозяина, инфицированного Ηΐν, или для лечения симптомов, связанных с ΑΙΌ8.

Краткое изложение сущности изобретения

Соответственно здесь предложены энантиомерно чистые соединения, полезные для лечения или профилактики вирусной инфекции, например инфекции Ηΐν, у нуждающегося в этом хозяина. Кроме того, предложены фармацевтические композиции, содержащие эти соединения, способы применения этих соединений для лечения или профилактики и способы получения этих соединений.

Как представлено в приведенных ниже примерах, большая часть активности хиральных фосфоиндольных соединений свойственна одному энантиомеру или стереоизомеру. Кроме того, некоторые предложенные здесь соединения представляют собой сильные и избирательные ингибиторы Ηΐν дикого типа и резистентных к ненуклеозидному ингибитору обратной транскриптазы (ΝΝΡΤΐ) ίπ уйго. Некоторые предложенные здесь соединения могут обеспечивать более высокий генетический барьер для развития Ηΐν резистентности по сравнению с имеющимися в настоящее время способами лечения, такими как эфавиренз.

В одном из аспектов здесь предложены В-фосфоиндольные соединения и способы их применения для лечения или профилактики вирусной инфекции, такой как инфекции Ηΐν, у хозяина, нуждающегося в этом.

В одном из аспектов здесь предложены фосфоиндольные соединения формулы (С) или их фармацевтически приемлемые соли

- 2 016267

где К³ и К⁵ независимо представляют собой С_1-6алкил или С₂-балкенил, каждый из которых может быть, возможно, независимо замещен СЫ или галогеном;

каждый из К⁴' и К⁵' независимо представляет собой водород или галоген;

К¹ представляет собой водород, фенилсульфонил или 4-метоксибензил;

Υ представляет собой О-С_1-2алкил.

В одном из воплощений предложено соединение формулы (С), имеющее нижеследующую формулу, или его фармацевтически приемлемая соль:

В другом воплощении предложено соединение формулы (С), имеющее нижеследующую формулу, или его фармацевтически приемлемая соль:

В еще одном аспекте здесь предложены фармацевтически приемлемые соли предложенных здесь соединений.

В еще одном аспекте предложена фармацевтическая композиция, содержащая предложенное здесь соединение и фармацевтический носитель, эксципиент или разбавитель, где указанная композиция, по существу, не содержит противоположного энантиомера указанного соединения.

В еще одном аспекте предложена фармацевтическая композиция, содержащая предложенное здесь соединение и второй агент против Ηΐν, где указанная композиция, по существу, не содержит противоположного энантиомера указанного соединения. Предпочтительно в указанной фармацевтической композиции второй агент против Ηΐν представляет собой ингибитор протеазы или ингибитор интегразы. Более предпочтительно второй агент против Ηΐν представляет собой ампренавир, типранавир, индинавир, саквинавир, лопинавир, ритронавир, фосампренавир, дарунавир, атазанавир, нелфинавир, бреканивир, элвитегравир или ралтегравир.

В еще одном аспекте предложен способ лечения инфекции Ηΐν, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества предложенного здесь соединения.

В одном из воплощений способ дополнительно включает введение субъекту соединения в комбинации или путем чередования по меньшей мере со вторым агентом против Ηΐν. Предпочтительно второй агент против Ηΐν представляет собой ингибитор протеазы, нуклеозидный или нуклеотидный ингибитор обратной транскриптазы, ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы, комбинацию с фиксированной дозой, ингибитор проникновения, антагонист корецептора ССК5, ингибитор созревания или ингибитор интегразы. Более предпочтительно второй агент против Ηΐν представляет собой ампренавир, типранавир, индинавир, саквинавир, лопинавир, ритронавир, фосампренавир, дарунавир, атазанавир, нелфинавир, ламивудин, эмтрицитабин, абакавир, залцитабин, зидовудин, тенофовир, диданозин, ставудин, делавирдин, эфавиренз, невирапин, атриплу, комбивир, тризивир, труваду, маравирок, энфувиртид, бреканивир, амдоксовир, априцитабин, элвуцитабин, этравирин, рилпивирин, каланолид А, аплавирок, викривирок, бевиримат, элвитегравир или ралтегравир.

В другом воплощении способа соединение вводят в комбинации или путем чередования с агентом против ΗΒν. Предочтительно агент против ΗΒν представляет собой энтекавир, ламивудин, интерферон альфа-2Ь, пегинтерферон альфа-2а, адефовира дипивоксил, телбивудин, эмтрицитибин, клевудин, тенофовир, валторцитабин, амдоксовир, ремофовир или рацивир.

- 3 016267

В еще одном воплощении способа соединение вводят перорально. В еще одном воплощении соединение вводят в комбинации со вторым соединением, эффективным для лечения или предупреждения инфекции НСУ у субъекта.

В еще одном аспекте предложено применение предложенного здесь соединения в терапии.

В еще одном аспекте предложено применение предложенного здесь соединения в изготовлении лекарственного средства для лечения, предупреждения, уменьшения симптомов или контроля над симптомами, ассоциированными с инфекцией Ηΐν.

В еще одном аспекте предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение формулы

и фармацевтический носитель, эксципиент или разбавитель, где указанная композиция, по существу, не содержит противоположного энантиомера указанного соединения. Предпочтительно фармацевтическая композиция дополнительно содержит второй агент против Ηΐν. Более предпочтительно в указанной фармацевтической композиции второй агент против Ηΐν представляет собой ингибитор протеазы или ингибитор интегразы. Наиболее предпочтительно, второй агент против Ηΐν представляет собой ампренавир, типранавир, индинавир, саквинавир, лопинавир, ритронавир, фосампренавир, дарунавир, атазанавир, нелфинавир, бреканивир, элвитегравир или ралтегравир.

В еще одном аспекте предложен способ лечения инфекции Ηΐν, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества соединения формулы (С), имеющего нижеследующую формулу:

В другом воплощении способ дополнительно включает введение субъекту соединения в комбинации или путем чередования с агентом против ΗΒν. Предпочтительно агент против ΗΒν представляет собой энтекавир, ламивудин, интерферон альфа-2Ь, пегинтерферон альфа-2а, адефовира дипивоксил, телбивудин, эмтрицитибин, клевудин, тенофовир, валторцитабин, амдоксовир, ремофовир или рацивир.

В еще одном воплощении способа соединение вводят перорально. В еще одном воплощении соединение вводят в комбинации со вторым соединением, эффективным для лечения или предупреждения инфекции ПСУ у субъекта.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1А демонстрирует кристаллическую структуру обратной транскриптазы Ηΐν К103К/У181С с 3-фосфоиндольным соединением формулы ΐ;

фиг. 1В - схему кристаллической структуры обратной транскриптазы Ηΐν К103К/У181С с 3фосфоиндольным соединением формулы ΐ;

фиг. 2А - кристаллическую структуру молекулы соединения (ΐΐΐ);

фиг. 2В - кристаллическую структуру молекулы соединения (ΐΐΐ).

Подробное описание изобретения

Предложены композиции вещества, способы применения и фармацевтические композиции для лечения вирусных инфекций, в частности инфекций Ηΐν, у млекопитающих. В частности, предложены чистые 3-фосфоиндольные соединения, композиции, содержащие эти соединения, и способы применения

- 4 016267 соединений и композиций для лечения или профилактики инфекции, включая инфекцию Ηΐν, у хозяина. Дополнительно здесь предложены способы получения чистых 3-фосфоиндолов.

Определения

В предложенных здесь композициях энантиомерно чистый фосфоиндол или его фармацевтически приемлемая соль могут присутствовать с другими активными или неактивными ингредиентами. Например, фармацевтическая композиция, содержащая (Р)-фосфоиндол, может содержать, например, приблизительно 90% эксципиента и приблизительно 10% (Я)-фосфоиндола. В некоторых воплощениях активный ингредиент может быть приготовлен с небольшим количеством носителя, эксципиента или разбавителя, или без них.

Независимо от упомянутого здесь диапазона, он включает независимо и по отдельности каждый член диапазона. В качестве неограничивающего объем изобретения примера считают, что термин С₁С₁₀алкил включает независимо каждый член группы таким образом, что, например, С₁-С₁₀алкил включает прямоцепочечную, разветвленную и, когда подходит, циклическую С₁, С₂, С₃, С₄, С₅, С₆, С₇, С₈, С₉ и С₁₀ алкильную функциональную группу. Аналогично, в качестве еще одного неограничивающего объем изобретения примера 1-10% включает независимо 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10%, а также диапазоны между ними, такие как 1-2%, 2-3% и т.д.

Использованный здесь термин хиральный включает соединение, обладающее свойством, которое заключается в том, что это соединение не налагается на свое зеркальное изображение.

Термин выделенный включает композицию, которая включает по меньшей мере 85 или 90 мас.%, 95, 98, 99 или 100 мас.% соединения.

Если не указано иное, использованный здесь термин алкил включает насыщенный прямоцепочечный, разветвленный или циклический первичный, вторичный или третичный углеводород типично С_1-10>, и конкретно включает метил, СЕ₃, СС1₃, СЕС1₂, СЕ₂С1, этил, СН₂СЕ₃, СЕ₂СЕ₃, пропил, изопропил, циклопропил, бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил, циклопентил, изопентил, неопентил, гексил, изогексил, циклогексил, циклогексилметил, 3-метилпентил, 2,2-диметилбутил и 2,3-диметилбутил, но не ограничивается ими. Термин включает замещенные и незамещенные алкильные группы и, в частности, включает галогенированные алкильные группы и более конкретно фторированные алкильные группы. Неограничивающие объем изобретения примеры группировок, которыми алкильная группа может быть замещена, выбраны из группы, состоящей из галогена (фторо, хлоро, бромо или йодо), гидроксила, амино, алкиламино, ариламино, алкокси, арилокси, нитро, циано, сульфоновой кислоты, сульфата, фосфиновой кислоты, фосфата или фосфоната, незащищенного или защищенного при необходимости, как известно специалистам в данной области техники, например как изложено в Сгсспс с( а1., Рго1сс1сй Сгоирк ίη Огдаше 8уп1йе515, 1о1т Айсу апй 8оп§, 2'¹ Ей.. 1991.

Если не указано иное, использованный здесь термин низший алкил относится к С_1-6 насыщенной прямоцепочечной, разветвленной или, если подходит, циклической (например, циклопропильной) алкильной группе, включая замещенные и незамещенные группировки.

Термины алкиламино или ариламино относятся к аминогруппе, имеющей один или два алкильных или арильных заместителя соответственно. Если специально не указано в данной заявке, когда алкил представляет собой подходящую группировку, то он представляет собой низший алкил, замещенный или незамещенный.

Использованный здесь термин нитро обозначает -ΝΟ₂; термин сульфгидрил обозначает -8Н и термин сульфонил обозначает -8О₂.

Термины алкенил и алкинил включает алкильные группировки, включающие замещенные и незамещенные формы, где по меньшей мере одна насыщенная связь С-С замещена двойной или тройной связью. Таким образом, С2-6алкенил может представлять собой винил, аллил, 1-пропенил, 2-пропенил, 1бутенил, 2-бутенил, 3-бутенил, 1-пентенил, 2-пентенил, 3-пентенил, 4-пентенил, 1-гексенил, 2-гексенил, 3-гексенил, 4-гексенил или 5-гексенил. Аналогично, С2-6алкинил может представлять собой этинил, 1пропинил, 2-пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил, 3-бутинил, 1-пентинил, 2-пентинил, 3-пентинил, 4пентинил, 1-гексинил, 2-гексинил, 3-гексинил, 4-гексинил или 5-гексинил.

Термин алкилен включает насыщенный прямоцепочечный двухвалентный алкильный радикал формулы -(СН₂)_п-, где п может представлять собой любое целое число от 1 до 10.

Алкил, алкокси, алкенил, алкинил и т.д. включают прямоцепочечные и разветвленные группы. Тем не менее, ссылка на индивидуальный радикал, такой как пропил, охватывает только прямоцепочечный радикал, тогда как изомер с разветвленной цепью, такой как изопропил, назван специальным образом.

Если не указано иное, использованный здесь термин защищенный относится к группе, добавляемой к атому кислорода, азота, серы или фосфора для предотвращения их дальнейшего взаимодействия или для других задач. Широкое разнообразие защитных групп кислорода, азота, серы или фосфора известно специалистам в области органического синтеза.

Если не указано иное, использованный здесь термин арил относится к любому стабильному моноциклическому, бициклическому или трициклическому углеродному кольцу, имеющему до 8 членов в каждом кольце, где по меньшей мере одно кольцо является ароматическим, что определено правилом

- 5 016267

Хюккеля 4п+2, и в частности, фенил, бифенил или нафтил. Термин включает замещенные и незамещенные группировки. Арильная группа может быть замещена любой описанной группировкой, включающей одну или более чем одну группировку, выбранную из группы, состоящей из галогена (фторо, хлоро, бромо или йодо), гидроксила, амино, азидо, алкиламино, ариламино, алкокси, арилокси, нитро, циано, сульфоновой кислоты, сульфата, фосфоновой кислоты, фосфата или фосфоната, защищенной или незащищенной, как необходимо, но не ограничивающейся ими, как известно специалистам в данной области техники, например как изложено Сгсспс с1 а1., РгсЯссбгс Сгоирк ίη Огдашс 8уп1йе515, ίοΐιη \УПсу & 8опк, 3^гб Еб., 1999.

Термины алкарил или алкиларил относятся к алкильной группе с арильным заместителем или алкильной группе, связанной с молекулой через определенную здесь арильную группу. Термины аралкил или арилалкил относятся к арильной группе, замещенной алкильным заместителем или связанной с молекулой через определенную здесь алкильную группу.

Термин циклоалкил включает кольцо С_3-8, включая циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил и циклооктил, но не ограничиваясь ими. Термин алкокси обозначает прямоцепочечную или разветвленную алкильную группу, имеющую присоединенный кислородный радикал, алкильную группу, имеющую атомы углерода в указанном количестве или в любом количестве в пределах данного диапазона. Например, -О-алкил, С_1-4алкокси, метокси и т.д.

Использованный здесь термин галогено относится к любому члену семейства галогенов. Специально включены фторо, хлоро, бромо и йодо.

Термин ацил или О-связанный сложный эфир включает группу формулы С(О)В', где В' представляет собой прямоцепочечный, разветвленный или циклический алкил (включая низший алкил), карбоксилатный остаток аминокислоты, арил, включая фенил, гетероарил, алкарил, аралкил, включая бензил, алкоксиалкил, включая метоксиметил, арилоксиалкил, такой как феноксиметил; или замещенный алкил (включая низший алкил), арил, включая фенил, возможно, замещенный хлоро, бромо, фторо, йодо, С₁-С₄-алкил или С₁-С₄-алкокси, сульфонатные сложные эфиры, такие как алкил- или аралкилсульфонил, включая метансульфонил, моно-, ди- или трифосфатный эфир, тритил или монометокситритил, замещенный бензил, алкарил, аралкил, включая бензил, алкоксиалкил, включая метоксиметил, арилоксиалкил, такой как феноксиметил. Арильные группы в сложных эфирах оптимально содержат фенильную группу. В не ограничивающих объем изобретения воплощениях ацильные группы включают ацетил, трифторацетил, метилацетил, циклопропилацетил, циклопропилкарбокси, пропионил, бутирил, изобутирил, гексаноил, гептаноилоктаноил, нео-гептаноил, фенилацетил, 2-ацетокси-2-фенилацетил, дифенилацетил, α-метокси-а-трифторметилфенилацетил, бромацетил, 2-нитробензолацетил, 4-хлорбензолацетил, 2-хлор-2,2-дифенилацетил, 2-хлор-2-фенилацетил, триметилацетил, хлордифторацетил, фторацетил, бромдифторацетил, метоксиацетил, 2-тиофенацетил, хлорсульфонилацетил, 3метоксифенилацетил, феноксиацетил, трет-бутилацетил, трихлорацетил, монохлорацетил, дихлорацетил, 7Н-додекафторгептаноил, перфторгептаноил, 7-хлордодекафторгептаноил, 7Н-додекафторгептаноил, нонафтор-3,6-диоксагептаноил, метоксибензоил, метил 3-амино-5-фенилтиофен-2-карбоксил, 3,6дихлор-2-метоксибензоил, 4-(1,1,2,2-тетрафторэтокси)бензоил, 2-бромопропионил, омега-аминокаприл, деканоил, н-пентадеканоил, стеарил, 3-циклопентилпропионил, 1-бензолкарбоксил, О-ацетилманделил, пивалоилацетил, 1-адамантанкарбоксил, циклогексанкарбоксил, 2,6-пиридиндикарбоксил, циклопропанкарбоксил, циклобутанкарбоксил, перфторциклогексил-карбоксил, 4-метилбензоил, хлорметилизоксазолилкарбонил, перфторциклогексилкарбоксил, кротонил, 1-метил-1Н-индазол-3-карбонил, 2-пропенил, изовалерил, 1-пирролидинкарбонил, 4-фенилбензоил.

Термин ациламино включает группу, имеющую структуру -Ы(В')-С(=О)-В', где каждый В' независимо является таким, как определено выше.

Термин карбонил включает группу структуры -С(=О)-Х-В' или Х-С(=О)-В' , где X представляет собой О, 8 или связь и каждый В' независимо является таким, как определено выше.

Термин гетероатом включает атом, отличающийся от углерода или водорода в структуре гетероциклического соединения, не ограничивающие объем изобретения примеры которого представляют собой азот, кислород, серу, фосфор или бор.

За исключением того, где специально указано, использованные здесь термины гетероцикл или гетероциклический включают стабильное 5-7-членное моноциклическое или стабильное 8-11-членное бициклическое гетероциклическое кольцо, являющееся насыщенным или ненасыщенным, включая гетероарил, и которое состоит из атома(ов) углерода и от одного до четырех гетероатомов, включая О, 8, N и Р, но не ограничивающихся ими; и где гетероатомы азота и серы могут быть, возможно, окислены и/или гетероатом азота кватернизирован, и включают любую бициклическую группу, в которой любое из идентифицированных выше гетероциклических колец конденсировано с бензольным кольцом. Гетероциклическое кольцо может быть присоединено к любому гетероатому или атому углерода, приводя в результате к образованию стабильной структуры. Гетероароматическое кольцо может быть частично или полностью гидрированным, если желательно. Например, дигидропиридин может быть использован вместо пиридина. Функциональные группы кислорода и азота на гетероариле могут быть, если необходимо или желательно, защищенными. Подходящие защитные группы для кислорода или азота включают триме

- 6 016267 тилсилильные, диметилгексилсилильные, трет-бутилдиметилсилильные, трет-бутилдифенилсилильные, тритильные, замещенные тритильные, алкильные, метансульфонильные, пара-толуолсульфонильные или ацильные группы, такие как ацетил и пропионил.

Не ограничивающие объем изобретения примеры гетероарильных и гетероциклических групп включают фурил, пиридил, пиримидил, пиридазинил, пиразинил, пиперидинил, пиперазинил, тиенил, пирролил, пирролинил, пирролидинил, имидазолил, тетразолил, триазолил, триазинил, тиазинил, оксазолил, пуринил, карбазолил, хинолинил, пиразолил, морфолинил, бензимидазолил и т.п. Любая из гетероароматических и гетероциклических группировок может быть, возможно, замещена, как описано выше для арила, включая замещение(я) одним или более чем одним гидроксилом, амино, алкиламино, ариламино, алкокси, арилокси, алкил, гетероциклилом, галогено, карбокси, ацил, ацилокси, амидо, нитро, циано, сульфоновой кислоты, сульфатом, фосфиновой кислоты, фосфатом или фосфонатом, защищенным или незащищенным, если необходимо, как известно специалистам в данной области техники и как изложено, например, в Сгсспс с1 а1., РгсИеебуе Сгоирз ίη Огдаше 8упШе518, ίοΐιη ^йеу аиб 8опз, ТЫгб Еб., 1999.

Если не указано иное, использованный здесь термин амино включает группировку, представленную структурой -ΝΚ₂, и включает первичные, вторичные и третичные амины, возможно, замещенные алкильными, арильными, гетероциклильными и/или сульфонильными группами. Таким образом, может представлять собой два атома водорода, две алкильные группировки или один водород и одну алкильную группировку.

Термин аминокислота или остаток аминокислоты включает встречающиеся в природе и синтетические α, β, γ или δ аминокислоты и включает аминокислоты, обнаруживаемые в белках, т.е. глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин, фенилаланин, триптофан, пролин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин, глутамин, аспартат, глутамат, лизин, аргинин и гистидин, но не ограничивается ими. В одном из воплощений аминокислота находится в Ь-конфигурации, но также может быть использована в Ό-конфигурации. Альтернативно, аминокислота может представлять собой производное аланила, валинила, лейцинила, изолейцинила, пролинила, фенилаланинила, триптофанила, метионинила, глицинила, серинила, треонинила, цистеинила, тирозинила, аспарагинила, глутаминила, аспартоила, глутароила, лизинила, аргининила, гистидинила, β-аланила, β-валинила, β-лейцинила, β-изолейцинила, β-пролинила, βфенилаланинила, β-триптофанила, β-метионинила, β-глицинила, β-серинила, β-треонинила, βцистеинила, β-тирозинила, β-аспарагинила, β-глутаминила, β-аспартоила, β-глутароила, β-лизинила, βаргининила или β-гистидинила. Когда используется термин аминокислота, предполагается, что он представляет собой специфическое и независимое описание каждого из сложных эфиров α, β, γ или δ глицина, аланина, валина, лейцина, изолейцина, метионина, фенилаланина, триптофана, пролина, серина, треонина, цистеина, тирозина, аспарагина, глутамина, аспартата, глутамата, лизина, аргинина и гистидина в Ό- и Ь-конфигурациях. Использованный здесь термин амидо включает аминозамещенный карбонил, тогда как термин амидино обозначает группу, имеющую структуру -Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂. Некоторые содержащие серу и фосфор термины имеют следующие структурные значения: сульфонат включает группу структуры -8(=О)(=О)-ОК.'; сульфат включает группу структуры О-8(=О)(=О)-ОР': сульфонамид включает группу структуры ^К.')-8(=О)(=О)-К.'; сульфамоил включает группу структуры -8(=О)(=О)Ν(Κ.')(Κ.'); фосфорил включает группу структуры -Р(=О)-ОВ' и фосфороамидат включает группу структуры р-Р(НК.₁В₂)(=О)-ОЯ', где каждый В' независимо является таким, как определено выше.

Использованный здесь термин хозяин относится к одноклеточному или многоклеточному организму, в котором вирус может реплицироваться, включая клеточные линии и животных, и, в некоторых случаях, человека. Альтернативно, хозяин может нести часть вирусного генома Ηΐν, репликация или функция которого может быть изменена соединениями по настоящему изобретению. Термин хозяин конкретно относится к инфицированным клеткам, клеткам, трансфицированным целым геномом или частью генома Ηΐν, и животным, в частности приматам (включая шимпанзе) и людям. Для большинства применений настоящего изобретения в отношении животных хозяин представляет собой пациентачеловека. Ветеринарные применения при некоторых показаниях, тем не менее, ясно охвачены воплощениями настоящего изобретения (такими как шимпанзе).

Термин замещенные включает множественные степени замещения одним или более чем одним названным заместителем, таким как, например, галогено, гидроксил, тио, алкил, алкенил, алкинил, нитро, циано, азидо, амино, карбоксамидо и т.д. Когда существует множество возможных заместителей, соединение может быть замещенным одним или более чем одним, раскрытых или заявленных групп заместителей, независимо друг от друга, и взятых в единственном или множественном числе.

- 7 016267

Соединения

В некоторых воплощениях здесь предложены соединения формулы (С) или их фармацевтически приемлемые соли

......../ н~У \-κ³' р»· Ч>=<

и р О Н

где К³” и К⁵” независимо представляют собой С1_₆алкил или С_2-6алкенил, каждый из которых может быть, возможно, независимо замещен ΟΝ или галогеном;

каждый из К⁴ и К⁵ независимо представляет собой водород или галоген;

К¹ представляет собой водород, фенилсульфонил или 4-метоксибензил и

Υ представляет собой О-С_1-2алкил.

В одном из воплощений предложено соединение или его фармацевтически приемлемые соли

где абсолютная конфигурация по атому фосфора представляет собой К. Химическое название соединения I представляет собой метиловый эфир (2-карбамоил-5-хлор-4-фтор-1Н-индол-3-ил)-[3-((Е)-2циановинил)-5-метилфенил]-(К)фосфиновой кислоты, и эмпирическая формула представляет собой 0₂οΗ₁₆01ΕΝ₃0₃Ρ с молекулярной массой 431,39.

В одном из воплощений предложено соединение или его фармацевтически приемлемая соль

(III) где абсолютная конфигурация по атому фосфора представляет собой К. Химическое название соединения III представляет собой метиловый эфир (2-карбамоил-5-хлор-1Н-индол-3-ил)-[3-((Е)-2циановинил)-5-метилфенил]-(К)фосфиновой кислоты, и эмпирическая формула представляет собой С₂₀Н₁₇СШ₃О₃Р с молекулярной массой 413,79.

В одном из воплощений предложено соединение, выбранное из группы, состоящей из метилового эфира (2-карбамоил-5-хлор-1Н-индол-3-ил)-[3-((Е)-2-циановинил)-5-метилфенил](К)фосфиновой кислоты и метилового эфира (2-карбамоил-5-хлор-4-фтор-1Н-индол-3-ил)-[3-((Е)-2-циановинил)-5метилфенил]-(К)фосфиновой кислоты, или его фармацевтически приемлемой соли.

В одном из аспектов здесь раскрыты 8-фосфоиндольные соединения и способы их применения для лечения или профилактики вирусной инфекции, такой как инфекция ШУ, у хозяина, нуждающегося в этом.

В настоящем изобретении раскрыто соединение или его фармацевтически приемлемая соль

(II)

- 8 016267 где абсолютная конфигурация по атому фосфора представляет собой 8. Также в настоящем изобретении раскрыто соединение или его фармацевтически приемлемая соль

ΝΗ₂ (IV) где абсолютная конфигурация по атому фосфора представляет собой 8.

Кроме того, в настоящем изобретении раскрыто соединение, выбранное из группы, состоящей из метилового эфира (2-карбамоил-5-хлор-1Н-индол-3-ил)-[3-((Е)-2-циановинил)-5-метилфенил](8)фосфиновой кислоты и метилового эфира (2-карбамоил-5-хлор-4-фтор-1Н-индол-3-ил)-[3-((Е)-2-циановинил)-5метилфенил]-(8)фосфиновой кислоты, или его фармацевтически приемлемой соли.

Также предложены соединения, которые могут быть введены в виде соли, сложного эфира или пролекарства, которое после введения реципиенту приводит прямо или опосредованно к предложенному здесь соединению или которое само демонстрирует желаемую активность.

Фармацевтически приемлемые соли, пролекарства, стереоизомеры и таутомеры

Предложенное здесь соединение может быть введено в виде любой соли или пролекарства, которое после введения реципиенту способно прямо или опосредованно приводить к исходному соединению или которое само демонстрирует активность. Не ограничивающие объем изобретения примеры представляют собой фармацевтически или физиологически приемлемые соли. Фраза фармацевтически или физиологически приемлемая соль или пролекарство используется в описании для описания любой фармацевтически приемлемой формы (такой как сложный эфир, амид, соль сложного эфира, соль амида или родственная группа) соединения, которая после введения пациенту приводит к активному соединению по изобретению. Модификации, подобные этим, могут влиять на биологическую активность соединения, в некоторых случаях увеличивая активность относительно исходного соединения.

Термин фармацевтически приемлемая соль относится к состоянию соединения, в котором соединение несет противоион, являющийся фармацевтически приемлемым, и где соль сохраняет желаемую биологическую активность идентифицированных здесь соединений, в то же время демонстрируя минимальные нежелательные токсические эффекты. Такие соли представляют собой нетоксичные терапевтически полезные формы соединений по настоящему изобретению. Любая соль, сохраняющая желаемую биологическую активность содержащихся здесь соединений и которая демонстрирует минимальные или отсутствие нежелательных или токсических действий, предполагается для включения в изобретение. Фармацевтически приемлемые соли включают соли, являющиеся производными фармацевтически приемлемых органических или неорганических кислот и оснований. Фармацевтически неприемлемые кислоты и основания также могут применяться здесь, например, при синтезе и/или очистке интересующих соединений. Таким образом, все соли предполагаются для включения в изобретение.

Фармацевтически приемлемые соли включают соли, являющиеся производными фармацевтически приемлемых неорганических или органических оснований и кислот, и включают тозилат, метансульфонат, ацетат, цитрат, малонат, тартрат, сукцинат, бензоат, аскорбат, альфа-кетоглутарат, альфаглицерофосфат, формиат, фумарат, пропионат, гликолят, лактат, пируват, оксалат, малеат, салицилат, сульфат, сульфонат, нитрат, бикарбонат, гидробромат, гидробромид, гидройодид, карбонат и соли ортофосфорной кислоты. Конкретное воплощение представляет собой соль моно- или дигидрохлорид. Подходящие соли включают соли, являющиеся производными щелочных металлов, таких как калий и натрий, щелочно-земельных металлов, таких как кальций и магний, среди множества других кислот, хорошо известных в фармацевтической области. Фармацевтически приемлемые пролекарства относятся к соединению, которое подвергается метаболизму, например гидролизуется или окисляется в организме хозяина, с образованием соединения по настоящему изобретению. Типичные примеры пролекарств включают соединения, которые обладают биологически лабильными защитными группами на функциональной группировке активного соединения, включая группировку сложного эфира или ацильную группировку, но не ограничиваются ими. Пролекарства включают соединения, которые могут быть подвергнуты окислению, восстановлению, аминированию, дезаминированию, гидроксилированию, дегидроксилированию, гидролизу, дегидролизу, алкилированию, деалкилированию, ацилированию, деацилированию, фосфорилированию, дефосфорилированию с образованием активного соединения.

Фармацевтически приемлемые соли могут быть получены с использованием стандартных способов, хорошо известных в области техники, например путем взаимодействия достаточно основного соединения, такого как амин, с подходящей кислотой, с образованием физиологически приемлемого аниона. Также могут быть получены соли карбоновых кислот с щелочным металлом (таким как калий, натрий

- 9 016267 или литий) или щелочно-земельным металлом (таким как кальций).

Не ограничивающие объем изобретения примеры подходящих солей включают соли, являющиеся производными неорганических кислот, таких как, например, соляная кислота, бромисто-водородная кислота, серная кислота, ортофосфорная кислота, азотная кислота, гидрокарбоновая кислота, карбоновая кислота; и соли, образованные с органическими кислотами, такими как, например, муравьиная кислота, уксусная кислота, щавелевая кислота, винная кислота, янтарная кислота, яблочная кислота, малоновая кислота, аскорбиновая кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, дубильная кислота, пальмовая кислота (ра1то1с ас1б), альгиновая кислота, полиглутаминовая кислота, тозиновая кислота, метансульфоновая кислота, нафталинсульфокислота, нафталиндисульфокислота, α-кетоглутаровая кислота, αглицерофосфорная кислота и полигалактуроновая кислота. Подходящие соли включают соли, являющиеся производными щелочных металлов, таких как литий, калий и натрий, щелочно-земельных металлов, таких как кальций и магний, а также других оснований, хорошо известных специалистам в фармацевтической области. Другие подходящие соли включают соли, являющиеся производными катионов металлов, таких как цинк, висмут, барий или алюминий, или катиона, образованного из амина, такого как аммоний, Ν,Ν-дибензилэтилендиамин, Ό-глюкозамин, тетраэтиламмоний или этилендиамин. Кроме того, подходящие соли включают соли, являющиеся производными комбинации кислот и оснований, такие как, например, соль танната цинка.

Фармацевтически приемлемое пролекарство относится к соединению, которое метаболизирует (т.е., например, гидролизуется или окисляется) в организме хозяина с образованием соединения по настоящему изобретению. Типичные примеры пролекарств включают соединения, обладающие биологически лабильными защитными группами на функциональной группировке активного соединения. Пролекарства включают соединения, которые могут быть окислены, восстановлены, аминированы, дезаминированы, гидроксилированы, дегидроксилированы, гидролизованы, дегидролизованы, алкилированы, деалкилированы, ацилированы, деацилированы, фосфорилированы и/или дефосфорилированы с образованием активного соединения.

В одном из воплощений предложенные здесь соединения обладают антивирусной активностью против Ηΐν или метаболизируют в соединение, которое демонстрирует такую активность.

Способы лечения

В одном из воплощений предложены способы лечения или профилактики инфекции Ηΐν у хозяина, включающие введение эффективного против вируса количества описанного здесь соединения, включая соединение формулы (С), или его фармацевтически приемлемой соли. Соединения могут быть комбинированы с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.

В еще одном основном воплощении предложено применение раскрытого здесь соединения, включая соединение формулы (С), или его фармацевтически приемлемой соли при лечении или профилактике инфекции Ηΐν у хозяина, возможно, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.

Также предложено применение описанного здесь соединения или его фармацевтически приемлемой соли в изготовлении лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции Ηΐν у хозяина, возможно, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.

В одном из воплощений предложен способ лечения или профилактики инфекции Ηΐν у хозяина, включающий введение 3-фосфоиндольного соединения, по существу, в форме одного энантиомера, или его фармацевтически приемлемой соли, возможно, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем хозяину, нуждающемуся в этом. В одном из воплощений 3-фосфоиндол имеет формулу С. В одном из воплощений 3-фосфоиндол имеет формулу I, где абсолютная стереохимия по атому фосфора является Я. В еще одном воплощении 3-фосфоиндол может иметь формулу III с абсолютной стереохимией Я.

В других воплощениях у хозяина может быть поставлен диагноз путем измерения титра антитела против НА в крови. В еще одном воплощении соединения вводят для уменьшения или предупреждения симптомов ЛГО§ (синдром приобретенного иммунодефицита) у хозяина. В еще одном воплощении раскрытые здесь соединения вводят хозяину, имеющему риск инфицирования НА.

В еще одном воплощении активное соединение демонстрирует активность против резистентных к лекарствам формам ΗΓν и таким образом демонстрирует уменьшенную перекрестную резистентность против принятых в настоящее время антивирусных терапий. Фраза активность против резистентной к лекарству форме ШУ' означает, что соединение (или его пролекарство, или фармацевтически приемлемая соль) активно против мутантного штамма с ЕС₅₀ (средней эффективной концентрацией), например меньше чем приблизительно 50, 25, 10 или 1 мкмоль. В одном из воплощений ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы (ΝΝΕΉ) демонстрирует ЕС₅₀ (в мольной концентрации) против мутантного штамма НА меньше чем приблизительно 5, 2,5, 1 или 0,1 мкмоль. В одном из не ограничивающих объем изобретения воплощений мутантный штамм НА имеет мутацию обратной транскриптазы по лизину 103 аспарагин и/или тирозин 181 цистеин.

Предложенные здесь соединения могут быть оценены в отношении их способности ингибировать активность обратной транскриптазы ίη νίΐτο в соответствии со стандартными способами скрининга.

- 10 016267

Спектр активности, демонстрируемой каким-либо конкретным соединением, определяют путем оценки соединения в анализах, описанных в этом описании или других подтверждающих анализах, известных специалистам в области соединений против Ηΐν. Соединения могут демонстрировать ЕС₅о меньше чем 10-15 мкМ.

В одном из воплощений эффективность 3-фосфоиндолов измеряют при помощи иммуноферментного анализа, специфического в отношении Ηΐν, р24 ЕЫ8Л. Эффективность лекарства выражают в виде процентного ингибирования р24 антигена Ηΐν в этом быстром и чувствительном анализе. В родственном воплощении, полезном для конкретных экспериментов, эффективность соединения против Ηΐν определяют при помощи анализа уменьшения бляшек, в котором измеряют концентрацию соединения, необходимую для уменьшения количества бляшек вируса ίη νίίτο, в соответствии со способами, изложенными более конкретно далее, на 50% (т.е. ЕС₅₀ соединения). В некоторых воплощениях соединение демонстрирует ЕС₅₀ меньше чем 15 или меньше чем 10 мкмоль до наномольных количеств ίη νίίτο.

В еще одном аспекте здесь предложены способы перорального введения соединения формулы (С) для терапии или для лечения. Как показано в приведенных ниже примерах, некоторые соединения формулы (С) обладают пероральной биодоступностью с благоприятной фармакокинетикой.

В еще одном аспекте здесь предложены способы ингибирования цитохрома Р450. Как показано в приведенных ниже примерах, некоторые описанные здесь соединения эффективны для ингибирования одного или более чем одного цитохрома Р450, включая цитохром Р450 3А4, цитохром Р450 2С8 и цитохром Р450 2С9. Соответственно здесь предложены способы применения предложенных здесь соединений для ингибирования цитохрома Р450. Способы включают стадию приведения в контакт цитохрома Р450 с количеством раскрытого здесь соединения, такого как соединение формулы (С), эффективным для ингибирования цитохрома Р450.

В еще одном аспекте здесь предложены способы модуляции фармакокинетики лекарства, метаболизируемого цитохромом Р450. Способы включают стадию введения лекарства в комбинации или путем чередования с описанным здесь соединением. Лекарство может представлять собой любую фармацевтически приемлемую молекулу, известную специалистам в данной области техники как метаболизируемую цитохромом Р450. В некоторых воплощениях цитохром Р450 представляет собой цитохром Р450 3А4, цитохром Р450 2С8 или цитохром Р450 2С9.

Предложенные здесь соединения могут быть введены самостоятельно или в комбинации либо путем чередования с одним или более чем одним другим противовирусным агентом. Соединения или их композиции также могут быть использованы профилактически для предотвращения или замедления прогресса клинического заболевания индивидов, несущих антитело против Ηΐν, являющихся положительными по Ηΐν-антигену, или подвергшихся воздействию вируса Ηΐν.

В еще одном аспекте предложены композиции и способы лечения хозяина, коинфицированного Ηΐν и гепатитом В, включающие введение чистого раскрытого здесь соединения в комбинации с одним или более чем одним агентом, эффективным для лечения инфекции гепатитом В. В еще одном аспекте предложены композиции и способы лечения хозяина, коинфицированного Ηΐν и гепатитом С, включающие введение чистого раскрытого здесь соединения в комбинации с одним или более чем одним агентом, эффективным для лечения инфекции гепатитом С.

Комбинированная или чередующаяся терапия

В некоторых воплощениях индольное соединение вводят в комбинации и/или путем чередования с одним или более чем одним другим агентом против Ηΐν. В еще одном воплощении введение двух или более чем двух агентов против Ηΐν приводит в результате к синергическому действию при ингибировании Ηΐν. В еще одном воплощении действие от введения двух или более чем двух таких агентов в комбинации и/или путем чередования приводит к аддитивному действию при ингибировании репликации Ηΐν.

В некоторых воплощениях индольное соединение вводят в комбинации и/или путем чередования с одним или более чем одним агентом против ΗΒν или одним или более чем одним агентом против ΗСV. Например, в некоторых воплощениях индольное соединение может быть введено хозяину, коинфицированному Ηΐν и ΗΒν в комбинации с агентом, эффективным для лечения ΗΒν. Агент, эффективный для лечения ΗΒν, может представлять собой любой такой агент, известный специалистам в области техники. Здесь описаны примеры агентов. В некоторых воплощениях индольное соединение может быть введено хозяину, коинфицированному Ηΐν и ΗСV, в комбинации с агентом, эффективным для лечения ΗСV. Агент, эффективный для лечения ΗСV, может представлять собой любой такой агент, известный специалистам в данной области техники. В некоторых воплощениях индольное соединение вводят в комбинации и/или путем чередования с одним или более чем одним агентом, который метаболизируется цитохром Р450-монооксигеназой. Агент может представлять собой любой агент, который, как известно специалистам в данной в области техники, метаболизируется цитохром Р450-монооксигеназой. Здесь описаны примеры агентов. В некоторых воплощениях цитохром Р450 представляет собой цитохром Р450 3А4, цитохром Р450 2С8 или цитохром Р450 2С9.

В комбинированной терапии эффективные дозы двух или более чем двух агентов вводят вместе, тогда как при чередующейся терапии эффективную дозу каждого агента вводят последовательно. Дозы

- 11 016267 зависят от скоростей абсорбции, инактивации и экскреции лекарств, а также других факторов, известных специалистам в данной области техники. Дозы также варьируют в зависимости от тяжести состояния, которое облегчают. Для любого конкретного индивида специфические схемы и графики приема лекарственного средства должны быть скорректированы по времени для того, чтобы удовлетворять потребностям индивида, и в зависимости от профессионального решения лица, осуществляющего введение или наблюдающего за введением композиций.

Лекарственная резистентность наиболее типично возникает при мутации гена, кодирующего фермент, используемый в цикле вирусной репликации. Продемонстрировано, что эффективность лекарства против Ηΐν может быть продлена, увеличена или восстановлена путем введения соединения в комбинации или путем чередования со вторым и, возможно, третьим противовирусным соединением, вызывающим мутацию(и), отличающуюся(иеся) от выбранной(ых) для основного лекарства. Такие комбинации лекарств одновременно уменьшают возможность резистентности в отношении любого единичного лекарства и любые ассоциированные токсичные действия. Альтернативно, фармакокинетика, биологическое распределение или другие параметры лекарства могут быть изменены при помощи такой комбинированной или чередующейся терапии. Например, применение комбинации лекарств может дать возможность для введения индивидуального лекарства в комбинации в дозировке, меньшей чем дозировка, которая потребовалась бы при введении лекарства в виде монотерапии. Аналогично, когда объединяют лекарства, направленные против различных стадий жизненного цикла вируса, существует возможность усиления их действий. Кроме того, применение комбинаций лекарств может уменьшать или устранять неблагоприятные побочные действия применения одиночного лекарства, в то же время обеспечивая противовирусное действие. Как правило, комбинированная терапия обычно предпочтительна перед чередующейся терапией, поскольку она оказывает множественное одновременное воздействие на вирус.

Агенты против ИСУ

Интерфероны (ΙΤΝ) для лечения хронического гепатита почти в течение десятилетия имеются в продаже и образуют основу имеющихся в настоящее время терапий против ΗΟν. ΙΤΝ представляют собой гликопротеины, продуцируемые иммунными клетками в ответ на вирусные инфекции. Они ингибируют репликацию множества вирусов, включая ΗΟν, и при использовании в качестве самостоятельного лечения инфицирования гепатитом С ΙΤΝ могут иногда подавлять РНК ΗΟν в сыворотке крови до необнаруживаемых уровней. Кроме того, ΙΡΝ могут нормализовать уровни аминотрансферазы в сыворотке крови. К сожалению, действие ΙΡΝ является временным, и длительный ответ возникает только у 8-9% пациентов, хронически инфицированных ΗΟν (Оату Ь. Όανίδ, Оа51тоеп!ето1о§у, 2000, 118:8104-8114). Тем не менее, большинство пациентов тяжело переносят лечение интерфероном, который вызывает тяжелые симптомы, подобные симптомам гриппа, утрату массы тела и потерю энергии и сопротивляемости организма.

Во множестве патентов раскрыты способы лечения Е1ау1ушбае, включая ΗΟν, при которых используются основанные на интерфероне терапии. Например, в патенте США № 5980884, выданном В1ай е! а1., раскрыты способы лечения пациентов, пораженных ΗΟν, с использованием консенсусного интерферона. В патенте США № 5942223, выданном Вахег е! а1., раскрыта терапия против ΗΟν с использованием овечьего или бычьего интерферона тау. В патенте США № 5928636, выданном А1Ьег е! а1., раскрыта комбинированная терапия интерлейкином-12 и интерфероном-альфа для лечения инфекционных заболеваний, включая ΗΟν. В патенте США № 5849696, выданном Сйтейеп е! а1., раскрыто применение тимозинов, самостоятельно или в комбинации с интерфероном для лечения ΗΟν. В патенте США № 5830455, выданном Vа1!иеηа е! а1., описана комбинированная терапия ΗΟν, в которой используется интерферон и акцептор свободного радикала. В патенте США № 5738845, выданном Заката, описано применение белков человеческого интерферона-тау для лечения ΗΟν. Другие основанные на интерфероне способы лечения ΗΟν приведены в патенте США № 5676942, выданном Те51а е! а1., и патенте США № 5372808, выданном В1а!! е! а1. Во множестве патентов также раскрыты пегилированные формы интерферонов и их применение, таких как, например, патенты США №№ 5747646, 5792834 и 5834594, все из которых выданы Ηоίίтаηη-^аΒосйе, Ιηο.; РСТ АО 99/32139 и АО 99/32140 от Εηζοη; АО 95/13090 и патенты США №№ 5738846 и 5711944, выданные 8сйетшд СотротаДоп; и патент США № 5908621, выданный О1ие е! а1.

Интерферон альфа-2а и интерферон альфа-2Ь в настоящее время приняты в качестве монотерапии для лечения ΗΟν. ΚΟΕΕΚΟΝ®-Α от Росйе представляет собой рекомбинантную форму интерферона альфа-2а. ΡΕΟΑ8Υ8® от Росйе представляет собой пегилированную или модифицированную полиэтиленгликолем форму интерферона альфа-2а. ΙΝΤΡΟΝ® А от 8с11епп§ ^трота!^ представляет собой рекомбинантную форму интерферона альфа-2Ь, и ΡΕΟ-ΙΝΤΚ.ΟΝ® от 8с11епп§ ^трота!^ представляет собой пегилированную форму интерферона альфа-2Ь.

Другие формы интерферона альфа, а также интерферон бета, гамма, тау и омега в настоящее время разрабатываются для лечения ΗΟν. Включенные здесь примеры представляют собой ΙΝΡΕΡΟΕΝ. интерферон альфакон-1, от йЦегМипе; ΟΜΝΙΕΕΚ.ΟΝ, природный интерферон, от Уйадеп; ΑΕΒυΕΕΚΟΝ от Читан Оепоше 8с1епсе§; ΚΕΒΙΕ, интерферон бета-1а, от Ате5-8етопо; омега интерферон от ВюМебюше; интерферон альфа для перорального введения от Ашап11о Вю5с1епсе5 и интерфероны гамма, тау и гамма

- 12 016267

1-Ь от 1п1етМипе.

Рибавирин (1-в-О-рибофуранозил-1-1,2,4-триазолил-3-карбоксамид) представляет собой синтетический, не индуцирующий интерферон нуклеозидный аналог широкого противовирусного спектра, продаваемый под товарным знаком Уйахо1е (Тке Мегск 1пбех. 11^4Ь Еб., 1989, Ебкот: Вибасап. 8., Мегск & Со., 1пс., Какгау, N1; р. 1304). Смотри патент США №№ 3798209 и КЕ29835. Структурно рибавирин близок гуанозину и обладает активностью ш νίΐτο против нескольких ДНК и РНК вирусов, включающих ИауМпбае (Сагу Ь. Όανίδ, 2000, Сак1тоеп1его1о§у, 118:8104-8114).

Рибавирин уменьшает уровни аминотрансферазы в сыворотке крови до нормального у 40% пациентов, но не уменьшает уровни РНК НСУ в сыворотке крови (Сагу Ь. 03115, 2000, Сак1тоеп1ето1о§у, 118:8104-8114). Таким образом, рибавирин самостоятельно не эффективен при уменьшении уровней вирусной РНК. Дополнительно рибавирин обладает значительной токсичностью и, как известно, вызывает анемию. Он не одобрен для монотерапии против НСУ, но одобрен в комбинации с интерфероном альфа2а или интерфероном альфа-2Ь для лечения НСУ.

Существующий в настоящее время стандарт лечения хронического гепатита С представляет собой комбинированную терапию альфа интерфероном и рибавирином. Исследования продемонстрировали, что больше пациентов, страдающих от НСУ, отвечают на комбинированную терапию пегилированным интерфероном-альфа/рибавирином по сравнению с комбинированной терапией непегилированным интерфероном альфа. Тем не менее, как с монотерапией во время комбинированной терапии развиваются значительные побочные действия, включающие гемолиз, симптомы, подобные симптомам гриппа, анемию и утомляемость (Сагу Ь. Οηνίκ, 2000, Сак1тоеп1его1о§у, 118: 8104-8114).

Комбинированная терапия капсулами РЕС-ΙΝΤΚΟΝ® (пегинтерферон альфа-2Ь) и КЕВЕТОЬ® (КтЬКапп, И8Р) предложена 8скетшд Сотротайоп.

КЕВЕТОЬ® от 8скетшд Сотротайоп также одобрен в комбинации с ΙΝΤΚΟΝ® А (рекомбинантный интерферон альфа-2Ь от 8скетшд Сотротайоп). Коске'к РЕСА8У8® (пегилированный интерферон альфа2а) и СОРЕСИ8® (рибавирин) также одобрен для лечения инфекции НСУ.

В заявках РСТ АО 99/59621, АО 00/37110, АО 01/81359, АО 02/32414 и АО 03/024461, все от 8с11еппд Сотротайоп, раскрыто применение комбинированной терапии пегилированным интерфероном альфа и рибавирином для лечения инфекции НСУ. В заявках РСТ АО 99/15194, АО 99/64016 и АО 00/24355, все от Ной'тапп-ЬаКоске, 1пс., также раскрыто комбинированное применение пегилированного интерферона альфа и рибавирина для лечения инфекции НСУ. Ведется разработка новых противовирусных агентов для лечения инфекций Р^Мпбае, в особенности инфекций гепацивирусом НСУ. Исследуют специфические ингибиторы НСУ-производных ферментов, таких как протеаза, геликаза и полимераза. Также исследуются лекарства, которые ингибируют стадии репликации НСУ, и включают лекарства, которые блокируют продукцию антигенов НСУ из РНК (1КЕ8 ингибиторы), лекарства, которые предотвращают нормальный процессинг белков НСУ (ингибиторы гликозилирования), лекарства, которые блокируют проникновение НСУ в клетки, такое как путем блокирования их рецепторов, и неспецифические цитопротективные агенты, которые блокируют повреждение клеток, вызванное вирусной инфекцией. Кроме того, исследуются молекулярные подходы к лечению инфекции вирусом гепатита С. Например, проводятся исследования рибозимов, ферментов, которые разрушают специфические молекулы вирусной РНК, и антисмысловых олигонуклеотидов, которые представляют собой небольшие комплементарные сегменты ДНК, которые связываются и ингибируют вирусную РНК. Обзор способов лечения НСУ можно найти в Вутоск е! а1., Ап111Йа1 Скет^ку & Скето1кегару, 2000,11:2 и Ое Ртапсексо е! а1., Ап1Ака1 Кек., 2003, 55:1-16.

Другие классы лекарств, которые разрабатывают для лечения инфицирования ЕкиМпбае и инфицирования гепатитом С, в частности, включают:

1) ингибиторы протеазы:

а) основанные на субстрате ингибиторы протеазы N83 раскрыты Аймооб е! а1. в АО 98/22496 и ОЕ 19914474; в АНмооб е! а1. Ап111Йа1 Скет1к1ту апб Скето1кетару, 1999, 70:259-273 и Типд е! а1. в АО 98/17679, которые включают альфакетоамиды и гидразиномочевины;

б) ингибиторы субстрата, которые заканчиваются электрофилом, таким как бороновая кислота или фосфонат, представлены Ькпак-Втипе! е! а1. в АО 99/07734;

в) не основанные на субстрате ингибиторы протеазы N83, такие как 2,4,6-тригидрокси-3-нитробензамидные производные, КО3-4082 и КО3-4078 (первый замещен по амиду 14-углеродной цепью, а последний имеет пара-феноксифенильную группу), представлены 8ибо е! а1. в Вюс11е1шса1 апб В1орНук1са1 Кек. Сотт., 1997, 255:643-7 и в Ап1Мга1 Скетщйу апб Скето1кегару, 1998, 9:186;

г) 8ск 68631, фенантренхинон, раскрытый Ски е! а1. в Текакебтоп Ьейетк, 1996, 57:7229-32 и 8ск 351633, выделенный из гриба РешсШшт дпкеоЕикит, раскрытый Ски е! а1. в Вюотдашс апб Мебкша1 Скет. Ьей., 9:1949-52;

д) Едкп с, макромолекула, выделенная из пиявок, которая демонстрирует наномольную активность ингибирования по сравнению с некоторыми сериновыми протеазами, такими как 8. дпкеик протеазы А и В, α-химотрипсин, химаза и субтилизин, как раскрыто Оакпп е! а1., Вюскетщйу, 1997, 36:1598-1607;

- 13 016267

е) ингибиторы цистеиновых протеаз для ингибирования НСУ эндопептидазы 2, как раскрыто в патенте США № 6004933, выданном 8ргисе е! а1.;

ж) синтетические ингибиторы N83 протеазы вируса гепатита С или Ν84Α кофактора, представляющие собой подпоследовательности субстратов, используемых протеазой и/или кофактором, как показано в патенте США № 5990276, выданном Ζ1ι;·ιη§ е! а1.;

з) рестриктазы для лечения НСУ, раскрытые в патенте США № 5538865, выданном Веуек е! а1.;

и) пептиды, такие как ингибиторы N83 сериновой протеазы НСУ, как представлено в АО 02/008251 от Согуак 1п!ета!юпа1, 1пс. и в АО 02/08187 и АО 02/008256 от 8сйегшд Согрога!юп;

к) НСУ трипептидные ингибиторы, раскрытые в патентах США №№ 6534523; 6410531 и 6420380, выданных Воейппдег 1пде1йе1т и АО 02/060926 от Впк1о1 Муегк 8с.|шЬЬ;

л) диарильные пептиды, такие как ингибиторы сериновой протеазы НСУ, изложенные 8сйегшд Согрогайоп в АО 02/48172;

м) имидазолидиноны, такие как ингибиторы N83 сериновой протеазы НСУ, раскрытые в АО 02/08198 от 8сйегшд Согрога!юп и АО 02/48157 от Впк1о1 Муегк 8с.|шЬЬ; и

н) ингибиторы протеазы НСУ, изложенные Уейех РйагтасеиНсак в АО 98/17679 и Впк!о1 Муегк 8(]шЬЬ в АО 02/48116;

2) тиазолидиновые производные, демонстрирующие релевантное ингибирование в анализе путем обращенно-фазовой ВЭЖХ со слитым белком Ν83/4Α и субстратом Ν85Α/5Β, что продемонстрировано в 8ибо е! а1., Ап!1У1га1 Век., 1996, 52:9-18, в особенности соединения ВЭ4 6205, ВЭ4 6193 и ВЭ-1-6250, которые имеют конденсированную циннамоильную группировку, замещенную длинной алкильной цепью;

3) тиазолидины и бензанилиды, раскрытые КакшсЫ е! а1., 1. РЕВ8 Ье!!егк, 421:217-220 и ТакекЫ!а е! а1., Апа1уйса1 Вюсйет1к!гу, 1997, 247:242-46;

4) ингибиторы геликазы, раскрытые Э1апа е! а1. в патенте США № 5633358 и АО 97/36554;

5) нуклеотидные ингибиторы полимеразы и глиотоксин, представленные В. Ееггап е! а1., 1. Упо1оду, 1999, 73:1649-54;

6) церуленин, природный продукт, представленный У. Ьойтапп е! а1., Упо1оду, 1998, 249:108-118;

7) антисмысловые фосфоротиоатные олигодезоксинуклеотиды (8-ОЭХ). комплементарные протяженным последовательностям в 5'-н кодирующей (ЦСВ) последовательности вируса Е1ау1ушбае, как продемонстрировано М. А1! е! а1., Нера!о1оду, 1995, 22:707-717;

8) нуклеотиды 326-348, содержащие 3'-конец ΝΟΒ, и нуклеотиды 371-388, располагающиеся в коровой кодирующей области РНК НСУ, что продемонстрировано М. А1! е! а1., АгсЫуек о! У1го1оду, 1997, 742:589-599; Са1бепк1 е! а1., 1. о! Се11и1аг РЬу8ю1о§у, 1999, 757:251-257;

9) ингибиторы 1ВЕ8-зависимой трансляции, раскрытой 1кеба е! а1., 1Р-08268890, и Υ. Ка1 е! а1., 1Р10101591;

10) рибозимы, такие как резистентные к нуклеазе рибозимы, представленные Ό.Ό. Масдак е! а1., Нера!о1оду, 1999, 50: аЬк!гас! по. 995; ВагЬег е! а1. в патенте США № 6043077 и Эгарег е! а1. в патентах США 5869253 и 5610054;

11) нуклеозидные аналоги, включая применение разветвленных нуклеозидов при лечении флавивирусов, пестивирусов и гепацивируса, как представлено 1бешх Ркагтасеи!1са1к в АО 01/92282, АО 01/90121, патентах США 6812219 и 6914054, где способ раскрыт для лечения инфекции гепатитом С, пестивирусом и/или флавивирусом у людей и других животных-хозяев, включающий введение эффективного количества биологически активного 1'-, 2'-, 3'- или 4'-разветвленных (β-Ό или β-Ь нуклеозидов или их фармацевтически приемлемой соли или производного, вводимых самостоятельно или в комбинации с другим противовирусным агентом, возможно, в фармацевтически приемлемом носителе. Нуклеозидные аналоги также можно найти в АО 01/32153 и АО 01/60315 от ВюСйет Ркагта, 1пс. (в настоящее время 8Ыге Вюсйет, 1пс.); АО 02/057425 и АО 02/057287, поданных Мегск & Со., 1пс.; АО 02/18404 от Воске; АО 01/79246, АО 02/32920 и АО 02/48165 от Ркагтакке!, Ь!б.; и АО 99/43691 от Етогу Ишуегкйу. На устных слушаниях У, посвященных вирусу гепатита С, Е1ау1ушбае, 16 международной конференции по антивирусным исследованиям, 27 апреля, Саванна, Джоржия (Ога1 8еккюп У, НераИИк С У1гик, Е1ау1У1Г1бае, 16'¹' 1п!ета1юпа1 СопГегепсе оп Ап11У1га1 Векеагск, Арп1 27, 2003, 8ауаппак, СА), 2'модифицированные нуклеозиды для ингибирования НСУ описаны Е1бгир е! а1.; нуклеозидные аналоги как возможные ингибиторы репликации РНК НСУ изложены Вкаг е! а1. (р. А75), где автор сообщает о том, что 2'-модифицированные нуклеозиды демонстрируют сильную ингибирующую активность в основанных на клетках анализах репликона; действие 2'-модифицированных нуклеозидов на репликацию РНК НСУ сообщалось О1кеп е! а1. (р. А76).

12) смешанные соединения, разработанные для лечения инфекций Е1ау1ушбае и инфекций гепатитом С, в частности, включают 1-аминоалкилциклогексаны, описанные в патенте США № 6034134, выданном Со1б е! а1.; алкиллипиды, витамин Е и другие антиоксиданты в патенте США № 5922757, выданном Сйо_)к1ег е! а1.; сквален, амантадин и желчные кислоты, представленные в патенте США № 5846964, выданном Охек| е! а1.; №(фосфоноацетил)-Е-аспарагиновая кислота и пиперидины, представленные в патенте США № 5830905, выданном Э1апа е! а1.; бензолдикарбоксамиды, раскрытые в патенте США № 5633388, выданном Э1апа е! а1.; производные полиадениловой кислоты, описанные в патенте США №

- 14 016267

5496546, выданном ОТапд с1 а1.; 2',3'-дидезоксиинозин, представленный в патенте США № 5026687, выданном Уагсйаоп с1 а1.; бензимидазолы, продемонстрированные в патенте США № 5891874, выданном Со1ас1по с1 а1.; и растительные экстракты, представленные в патенте США № 5837257, выданном Тза1 с1 а1., и патенте США № 5725859, выданном Отег е! а1.;

13) соединения, в настоящее время находящиеся в преклинической или клинической разработке для лечения вируса гепатита С, включая интерлейкин-10 от 8сйеппд Р1оидк; ΐΡ-501 от [п1егпенгоп; меримебодиб (νΧ-497) от Уойох; ΑΜΑΝΤΑΌΐΝΕ® (8утте1ге1) от Епбо ЬаЬз 8о1уау; ΗΕΡΤΑΖΥΜΕ® от ΒΡΐ; ΐΌΝ6556 от Иип Ркагтасеибсак; ХТЬ-002 от ХТЬ; ΗСV/ΜΕ59 от СЫгоп; СЛУЛСШ® (иммуноглобулин против гепатита С) от ΝΑΒΐ; ΕΕνΟνΐΒΐΝ® от ΐСN/Β^Ьарка^т; νΐΒΑΜΐΌΐΝΕ® от ΐСN/Β^Ьарка^т (¥а1еаηί); ΖΑΌΑΧΐΝ® (тимозин альфа-1) от δα С1опе; тимозин плюс ПЭГилированный интерферон от δα С1опе; СЕРЬЕЯЕ® (гистамина дигидрохлорид) от Мах1т; νΧ 950/ЬУ 570310 от ¥ейех/Е11 Ы11у; ΐδΐδ 14803 от ΐδΐδ Ркагтасеи11са1з/Е1ап; ТТК 003 от ΑΒΒΟδ Ркагта; ΒΐΕΝ-2061 от Воейппдег ШдеШет; Се11Сер! (микофенолата мофетил) от Воске; Т67 (Р-тубулиновый ингибитор) от Ти1апк; терапевтическую вакцину, направленную на Е2, от ΐηηодепеΐ^сз; ЕК788 от Еи)|задаа ШаНксаю, 1пс.; ϊ6Β 1016 (8Шрко§, силибинфосфатидилхолиновая фитосома для перорального введения); ингибитор репликации РНК УР50406 от ¥|гоРкагта/ОТуе1к; терапевтические вакцины от ΕιΙοιόοΠ апб Ер1ттипе/Сепепсог; ингибитор ΐΒΕδ от Апабуз; ΑΝΑ 245 и ΑΝΑ 246 от Апабуз; иммунотерапию Ткегароге от Ауап1; ингибиторы протеаз от Вп51о1 Муегз 8с.|шЬЬ/Л.ху5 и Согуаз/8скегшд; ингибитор геликазы от ¥ейех; ингибитор слияния от Тптепз; Т-клеточную терапию от Се11Ех8уз; ингибитор полимеразы от Вюсгуз!; нацеленное на РНК химическое соединение от РТС Ткегареибсз; дикатион от ΐттίеск, ингибиторы протеаз от

Адоигоп и СЫгоп/МебМг; антисмысловые способы терапии от Ανΐ ВюРкагта и ЦуЬпбоп; гемоочиститель от Ле1к1оп Меб1са1; терапевтическую вакцину от Мепх; Скгоп-¥асС, терапевтическую вакцину, от Тпрер; ИТ 23ΐΒ от ипйеб Ткегареибсз; ингибиторы протеазы, геликазы и полимеразы от Сепе1аЬз Тескпо1од1ез; ингибиторы ΐΒΕδ от 1шшизо1; В803 от В1де1 Ркагтасеибсак; ΐΝΕΕΒΟΕΝ® (интерферон альфакон-1) от биегМите; ΟΜΝΐΕΕΒΟΝ® (природный интерферон) от ¥1гадеп; ΑΕΒυΕΕΒΟΝ® от ^таи Сепоте 8аепсез; ΒΕΒΐΕ® (интерферон бета-1а) от Α^ез-δе^опо; омега интерферон от Б|оМеб1с1пе; интерферон альфа для перорального введения от Αта^^^1о Б|о5с1епсе5; интерфероны гамма, тау и гамма-1Ь от ΐпΐе^Μипе; консенсусный интерферон от ¥а1еап1; нексавар от Опух Ркагтасеибса1з; Р1-88 от Ргодеп 1п6избтез; трансгенный доксорубицин от Ею ΑΠία^ Ркагта; ТОК-122 от 1епкеп Β^озс^епсез; валопицитабин от Негих; ¥СХ-410С от νΟΧ Ркагтасеибса1з; целгосивир от М1дешх; сувус от Б|оепу131оп; мультиферон от Уп^ощ омега интерферон от бИагаа; ΐΝΝΟ0101 (Е1) от ^оде^Шз; РЕ-03491390 от Рбхег; интерферон медузы от Е1ате1 Тескпо1од1ез; 1С41 от биегсеП; 8ОТ 503034 от 8скегшд; С126270 от С1ахо8шккКкпе; С¥1001 от Ркагтеха; Β1626 от Βоске; МахудепТОоске; Β7128 от Ркагтаззе1^оске; белерофон от №ш1Пиз Б|о1еск; алинию от Βота^к; бавитуксимаб от Регедгше; пероральный интерферон альфа от Αтап11о Бюзаепсез; ΝΟν-205 от №хе1оз; СС1 5005 от С1оЬеΐшшипе; ΗС¥-796 от ¥^^оΡка^та/ОТуеΐк; ΗС¥/ΜЕ59 от СЫгоп/Ыогуагбз; ΕΜΖ702 от ТгапзШоп Ткегареибсз; Ανΐ-4065 от Β^орка^та; ΑΝΑ975 от ΑΝΑΌΥδ; МкоС от Αпбробеап Ркагтасеибса1з, 1пс.; ΑΟΗ-0137171 от Αск^11^оп Ркагтасеибса1з; Β1626 от Βоске; ХТЬ-2125 от ХТЬ; ХТЬ-6865 от ХТЬ; ΒΕΧ-883 от 6ю1ех Τке^ареибсз/ΟсΐоΡ1из; ΌΕΒΐΟ-025 от ΌΕΒΐΟ и иТ-231Β от ипйеб Ткегареибсз;

14) нуклеозидные пролекарства, описанные ранее для лечения других форм гепатита, включая 2'дезокси-в-Ь-нуклеозиды и их 3'-пролекарства для лечения ΗΒν, раскрытые в XVΟ 00/09531 и XVΟ 01/96353, выданных Мешх Ркагтасеибса1з; и терапевтические сложные эфиры ацикловира, представленные в патенте США № 4957924, выданном Βеаискатр. Другие примеры противовирусных агентов, которые могут быть использованы в комбинации и/или при чередовании с раскрытыми здесь соединениями, включают агенты, такие как νΧ-950 и интерферон, но не ограничиваются ими. Интерфероны, которые могут быть использованы, включают альфа интерферон-2Ь от δске^^пд-Ρ1оидк, 1п6оп® А и РЕСбпбоп™; и Со-Редазиз и ΡΕСΑδΥδ (пегилированный интерферон альфа-2а) от Ηϋί^ Ьа Βоске.

Агенты против гепатита В

Агент против гепатита В может представлять собой любой агент, который известен специалистам в данной области техники как эффективный для лечения инфекции гепатитом В у нуждающегося в этом хозяина. В некоторых воплощениях агент против гепатита В представляет собой интерферон-альфа (1пбоп Α, δске^^пд-Ρ1оидк), пегилированный интерферон (Редазуз, Βоске), ламивудин (Εр^ν^^-ΗΒ¥, ΖοΓΓίχ. или ^рЮбт, С1ахо^11Шкк1те). адефовир дипивоксил борзею. Сбеаб), энтекавир (Βа^ас1ибе, Βбзΐо1Муегз^дшЬЬ), телбивудин (Тухека или δеЬ^νо, Негих) или иммуноглобулин против ΗΒν ШуреШЕР δ/Ό, Та1еспз; ΝπΝ-ΗΒ¥. №1Ы; Шра Сат Β, Сапдепе).

В некоторых воплощениях агент против гепатита В представляет собой ЕТС (эмтрицитабин, Сбеаб), Ь-ΕΜΑυ (клевудин, Ркагтаззе!; Ьеуоущ бикдаапд). тенофовир (виреад, Сбеаб), топоуа1 ЬбС (валторцитабин, [6оп1х). ^ΑΡ^ (амдоксовир, ΒΕδ Ркагт ЕЬС), Αιι;! 380 (ΕΒ80380, Αпабуз), ремофовир (прадефовир, δске^^пд-Ρ1оидк), рацивир (ΒΤ’¥. Ркагтаззе!), ΒΑΜ-205 (ΝΟν-205, №хе1оз). ХТЬ-001 (ΗереΧ-Β, ХТЬ Β^орка^т, СиЫз1), нитоксанид (алиниа, Βота^к ЬаЬз), иТ 231-Β (ипйеб Ткегареибсз), Βау 41-4109 (ΒηνοΓ). ЕЭТ899 (Епхо Β^оскет), тимозин альфа-1 (задаксин, δс^С1оπе), Ηί-8 ΗΒν Щххоп),

- 15 016267 αΡΝΑ (НерХ, Νιιοίοοηίοδ). НераУахх В (У1гехх), вакцину против корового антигена НВУ (ЕтетдеШ Еигоре) или 8ресШЕх-НерВ (СЬготок).

Другие противовирусные агенты

Любой из способов лечения от вируса, описанных здесь в разделе Предшествующий уровень техники, может быть использован в комбинации или путем чередования с соединениями, описанными в этом описании. Не ограничивающие объем изобретения примеры включают а) ингибиторы протеазы; б) тиазолидиновые производные; в) ингибиторы геликазы; г) бензанилиды; д) фенантренхиноны; е) ингибиторы полимеразы и глиотоксин; ж) антисмысловые фосфоротиоатные олигодезоксинуклеотиды (8-ΟΌΝ); з) ингибиторы ГКЕ8-зависимой трансляции; и) рибозимы; к) нуклеозидные аналоги; л) двузамещенные нуклеозидные аналоги, раскрытые Иешх Рйаттасеибсак в XVО 01/90121, XVО 01/92282, XVО 04/00300, XVО 04/002999 и XVО 04/002422; м) 2'-фторнуклеозидные аналоги; н) 1-Ж₂-алкилциклогексаны; о) алкиллипиды; п) витамин Е и другие антиоксиданты; р) сквален, амантадин и желчные кислоты; с) Ν(фосфоноацетил)-Ь-аспарагиновую кислоту; т) бензолдикарбоксамиды; у) производные полиадениловой кислоты; ф) бензимидазолы; х) 2',3'-дидезоксиинозин; ц) растительные экстракты; ч) пиперидины и ш) другие соединения, в настоящее время находящиеся в преклинической или клинической разработке для лечения пестивирусов, флавивирусов и/или гепацивируса, включая рибавирин и семейства интерферонов.

Второй противовирусный агент для лечения ШУ может представлять собой, например, ингибитор протеазы, ингибитор интегразы ШУ, хемокиновый ингибитор или ингибитор обратной транскриптазы (КЦ), последний из которых может представлять собой синтетический нуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы (ΝΕΤΊ) или ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы (ΝΝΕΤ!). В других воплощениях второе или третье соединение может представлять собой пирофосфатный аналог или связанный со слиянием ингибитор. Перечень обобщенных данных по резистентности, собранных ίη νίίτο и ίη νίνο для некоторых противовирусных соединений, можно найти в 8сШпа/1 е1 а1. ΜιιΙηΙίοηδ ίη ге1гоу|га1 деиез а88οс^аΐеб \νί11ι бгид ^е8^8ίаηсе, ΑηΙίνίΓαΙ Νονκ, 1997, 5(8).

В некоторых воплощениях индольное соединение вводят в комбинации и/или при чередовании с ЕТС (2',3'-дидезокси-3'-тиа-5-фторцитидин); 141^94 (ампренавир, Ο1α.\ο ^еПотте, Шс.); вирамун (невирапин); рескриптор (делавирдин); ΌΜΡ-266 (эфавиренз); ЭЭ! (2',3'-дидезоксиинозин); 3ТС (3'-тиа-2',3'дидезоксицитидин); ЭЭС (2',3'-дидезоксицитидин), абакавир (1592И89), представляющий собой (18,4К)-

4- [(2-амино-6-циклопропиламино)-9Н-пурин-9-ил]-2-циклопентен-1-метанола сукцинат, тенофовир ΌΡ (Унеаб), Ό4Τ или ΑΖΤ.

Другие примеры противовирусных агентов, которые могут быть использованы в комбинации и/или при чередовании с раскрытыми здесь соединениями, включают фоскарнет; карбовир; ацикловир; интерферон; слитые ингибиторы, такие как энфувиртид; и β-Ό-диоксолановые нуклеозиды, такие как β-Όдиоксоланилгуанин (ИХС), в-О-диоксоланил-2,6-диаминопурин (ΌΑΡΌ), и в-И-диоксоланил-6хлорпурин (АСР), но не ограничиваются ими. Интерфероны, которые могут быть использованы, включают альфа интерферон-2Ь от Зсйегшд-Ркидй, Енгом® А и РЕС-Шгоп™; и Се-Редазиз и ΡΕ6Α8Υ8 (пегилированный интерферон альфа-2а) от Нοίϊтаη Ьа ^ске. Комбинации, с которыми могут быть введены 3-фосфоиндолы, включают эпзиком (АВС+3ТС), тризивир (АВС + 3ТС + ΑΖΤ), трувада (ЕТС +У1геаб) и комбивир (ΑΖΤ+3ΤΟ).

Примеры ингибиторов протеаз, которые могут быть использованы в комбинации и/или при чередовании с раскрытыми здесь соединениями, включают индинавир ({1(18,2К),5(8)}-2,3,5-тридезокси-№(2,3дигидро-2-гидрокси-1Н-инден-1-ил)-5-[2-[[(1,1-диметилэтил)амино]карбонил]-4-(3-иридинилметил)-1пиперазинил]-2-(фенилметил)-О-эритропентоамида сульфат; Мегск & ^., Шс.); нелфинавир (Αдοи^οη); ритронавир (ΑЬЬοй ЬаЬз), саквинавир Шнске); ампренавир; атазанавир; фосампренавир; калетру и ИМР450 {[4К-4(г-а,5-а,6-Ь,7-6)гексагидро-5,6-бис-(гидрокси)-1,3-бис-(3-амино)фенил]метил-4,7-бис(фенилметил)-2Н-1,3-диазепин-2-он}-бис-мезилат (Τπηι^Ε Рйаттасеибсак, Шс.), но не ограничиваются ими.

Другие соединения, которые могут быть введены в комбинации или путем чередования с фосфоиндолом для усиления его противовирусных свойств, включают (18,4К)-4-[2-амино-6-циклопропиламино9Н-пурин-9-ил]-2-циклопентен-1-метанола сукцинат (1592И89, аналог карбовира от С1аxο8т^ίЪΚ1^ηе); Β^Α 1906 (Ν-{ 18-[[[3-[28-{(1,1-диметилэтил)амино}карбонил]-4К-]-3-пиридинилметил)тио]-1пиперидинил]-2К-гидрокси-18-фенилметил)пропил]амино]карбонил]-2-метилпропил}-2-хинолинкарбоксамид) (Βίο Μеда/Βοей^^ηде^ ШдеШеш); Β^-Α 2185 Щ-(1,1-диметилэтил)-1-[28-[[[2-2,6-диметилфенокси]-1-оксоэтил]амино]-2К-гидрокси-4-фенилбутил]-4К-пиридинилтио-2-пиперидинкарбоксамид) (Βίο Μеда/Βοей^^ηде^ ЬдеШеш); ВМ+51.0836 (триазолоизо-индолиноновое производное) и ВМ8 186,318 (аминодиольное производное ингибитор протеазы ШУ-1) (ВпзкЕМуетз 8дшЬЬ); б4ΑРI (9-[2,5-дигидро-

5- (фосфонометокси)-2-фуранил]аденин) (Сйеаб); ΜΥ097 (8-4-изопропоксикарбонил-6-метокси-3- [метилтиометил]-3,4-дигидрохиноксалин-2(1Н)тион); НЕРТ (1 -[(2-гидроксиэтокси)метил]6[фенилтио]тимин); ΚΝΊ-272 (содержащий (28,38)-3-амино-2-гидрокси-4-фенилмасляную кислоту трипептид); Ь-697,593 (5-этил-6-метил-3-(2-фталимидоэтил)пиридин-2(1Н)-он); Ь-732,524 (гидрокси- 16 016267 аминопентан амид Н1У-1, ингибитор протеазы) (Мегск & Со.); Ь-697,661 (3-{[(-4,7-дихлор-1,3бензоксазол-2-ил)метил]амино}-5-этил-6-метилпиридин-2(1Н)-он); Ь-РИИС ((-)-в-Ь-5-фторо-2',3'дидезоксицитидин); Ь-РИОС ((-)-р-Ь-5-фтородиоксолан цитозин); РРА (фосфоноформиат; фоскарнет; А§1га); РМЕА (9-(2-фосфонилметоксиэтил)аденин) (Сйеаб); РМРА ((К)-9-(2фосфонилметоксипропил)аденин) (Сйеаб); Ко 31-8959 (гидроксиэтиламиновое производное ингибитор протеазы Н1У-1) (КосРе); КР1-3121 (пептидильный ингибитор протеазы, 1-[(38)-3-(н-альфабензилоксикарбонил)- 1-аспаргинил)амино-2-гидрокси-4-фенилбутирил]-н-трет-бутил-1-пролина амид); 2720 (6-хлоро-3,3-диметил-4-(изопропенилоксикарбонил)-3,4-дигидрохиноксалин-2(1Н)тион); 8С-52151 (гидроксиэтилмочевины изостерический ингибитор протеазы) (Θ.Ό. 8еаг1е); 8С-55389А (гидроксиэтилмочевины изостерический ингибитор протеазы (Θ.Ό. 8еаг1е); Т1ВО К82150 ((+)-(58)-4,5,6,7-тетрагидро-5метил-6-(3-метил-2-бутенил)имидазо[4,5,1-)к]-[1,4]бензодиазепин-2(1 Н)тион) (1ап§8еп РРагшасеийсак); Т1ВО 82913 ((+)-(58)-4,5,6,7-тетрагидро-9-хлоро-5-метил-6-(3-метил-2-бутенил)имидазо[4,5,1-)к]-[1,4]бензодиазепин-2(1Н)тион (1ап§§еп РРагшасеибсак); Т8АО-т3Т ([2',5'-бис-О-(трет-бутилдиметилсилил)3'-спиро-5'-(4'-амино-Г,2'-оксатиол-2',2'-диоксид)]-в-И-пентофуранозил-И3-метилтимин); И90152 (1-[3[(1-метилэтиламино)]-2-пиридинил]-4-[[5-[(метилсульфонил)амино]-1Н-индол-2-ил]карбонил]пиперазин); ИС (тиокарбоксанилидные производные) (Ишгоуа1); ИС-781 (И-[4-хлор-3-(3-метил-2бутенилокси)фенил]-2-метил-3-фуранкарботиоамид); ИС-82 (И-[4-хлор-3-(3-метил-2бутенилокси)фенил]-2-метил-3-тиофенкарботиоамид); УВ 11,328 (гидроксиэтилсульфонамидный ингибитор протеазы) (Уег1ех/С1ахо Ае11соте); ХМ 323 (циклическая мочевина ингибитор протеазы) (Иироп! Мегск) и пенцикловир. В еще одном воплощении индольное соединение по изобретению вводят в комбинации с ингибитором протеазы ЬС 1350.

Следующие лекарства могут быть использованы в комбинации и/или путем чередования с соединениями по настоящему изобретению

Название лекарства	Производитель
ЗТС, Ερϊνϊ г® товарный знак ламивудин	(31ахо8тПпК1\|пе
абакавир дженерик Ζΐθοβη®, АВС, или 1592Ы89	СИахоЗтИККНпе
АВС, Ζΐθρβη® товарный знак абакавир, или 15921)89	С1ахо5тИпК1\|'пе
ΑΒΤ-378/г, или Ка!ека® товарный знак лопинавир/ритронавир	АЬЬой 1_аЬога1опе5
АС-1549, 8-1153 или каправирин (СР\/)	РЛгег
АС 1661, Ретипе® товарный знак Ηΐν-1 иммуноген или вакцина Солка	1ттипе Ревропзе Согр.
Аоепегазе® товарный знак ампренавир (АРУ). 14ΐνν94 или УХ-478	<31ахо8тНпК1\|пе
алдеслейкин дженерик Рго1еик1’п®, или интерлейкин-2 (Ιί--2)	СЫгоп Согрогайоп
амдоксовир или ϋΑΡϋ	(ЗНеас1 δοίβηοβε
ампренавир дженерик Аоепегаве®, АР\/, 14ΐνν94 или УХ-478	С1ахо8тИИКПпе
Αρΐΐνιΐδ®	ВоеНппоег 1пде!Негт
АРУ, Адепегазе® товарный знак ампренавир, 141Х/У94 или УХ-478	(31ахо8тИпКНпе
атазанавир дженерик Εβνθΐθζ™ или ΒΜδ- 232632	Вп5к)1-Муег5 8ди1ЬЬ

- 17 016267

А1пр1а®	ΒΓΐδίοΙ-ΜνβΓδ Зои’\|ЬЬ и СПеаб
ΑΖΤ, ΚθίΓονίΓ® товарный знак зидовудин (Ζϋν)	О1ахоЗтИНК11пе
ΒίδίΡΟΟ) РМРА, У\|геас1® товарный знак тенофовир РР	(ЗНеад Зависев
ΒΜδ-232632 или Чеуа1аг™ товарный знак атазанавир	Впз(о1-Муегз ЗоЫЬЬ
ВМ8-56190 или ϋΡΟ-083	Впз1о1-Муегз ЗаЫЬЬ
каланолидА	Загам/ак Месйспет
каправирин (СРУ). АО-1549 или 8-1153	ΡΐϊζβΓ
СотЬмг® товарный знак зидовудин + ламивудин, или ΑΖΤ + ЗТС	С1ахоЗтИпК1\|пе
СРУ(каправирин), АО-1549 или 8-1153	ΡΐίζβΓ
Спхмап® товарный знак индинавир (1РУ), или М К-639	Мегск & Со
с!4Т, Ζθπί® товарный знак ставудин, или ΒΜΥ- 27857	Впз1о1-Муегз ЗоЫЬЬ
ОАРО или змдоксовир	СЛеас! Зависев
скЮ или Ηΐνίά® товарный знак залцитабин	Но(Ттапп-1_а ЧосЬе
άάΙ, νϊάβχ® товарный знак диданозин, или ΒΜΥ- 40900	Впз(о1-Муегз ЗоЫЬЬ
делавирдин дженерик Чезсг1р(ог®, 013/ или и901523/Т	ΡΐϊζβΓ
диданозин дженерик Х/Иех®, скИ или ΒΜΥ-40900	Впз(о1-Муегз 301ПЬЬ
Р!У, ЧезспрЮг® товарный знак делавирдин или 11-901528/Т	ΡΓιζθγ
СРС-083 или ВМ8-56190	Впз1о1-Муегз ЗоЫЬЬ
Ργοχϊθ® товарный знак гидроксимочевина (Ни)	Впз1о1-Муегз ЗдипЬЬ
эсЬавиоенз дженерик Зизйуа® или ЕРУ	Βπ8ΐοΙ-ΜνβΓ8 ЗаслЬЬ
ЕРУ, Зизйуа® товарный знак эфавиренз	Впз(о1-Муегз ЗоЫЬЬ
эмтрицитабин дженерик Ет1т/а™, или РТС	(ЗНеас! Зс1епсез
ЕтМуа® товарный знак эмтрицитабин или РТС	СНеас! Зс1епсез
энфувиртид дженерик Ρυζβοη™ или Т-20	Тптепз и НоНгпапп-Ьа ЧосЬе

- 18 016267

ΕρϊνίΓ® товарный знак ламивудин или ЗТС	С1ахоЗтИ11К11пе
эпоэтин альфа (эритропоэтин) дженерик РгосгИ®	Ογ6ίο Βίοΐβοή
Ερζίοοηΐ®	С1ахоЗтИпК1\|пе
эритропоэтин (эпоэтин альфа) дженерик РгосгК®	Огбю Βϊοίβοή
Ройоуаэе® товарный знак саквинавир (5оЙ <3е1 Сар), или 8СУ (ЗСС)	НоНгпапп-1_а Еосбе
фосампренавир или С\Л/-433908 или УХ-175	С1ахоЗтИ11К1\|пе
РТС или Еттриуа® товарный знак эмтрицитабин	<ЗНеас1 δοίβηοβδ
Ригеоп™ товарный знак энфувиртид или Т-20	Тптепз и НоЯталп-1_а Носбе

С]Л/-433908 или Фосампренавир. или УХ-175	С1ахо8тИпК1\|пе
НЕ2000 или альфа-эпибромид	ΗοΙΙϊδΕεΙβη РЬагтасеибса1з
Н1\/-1 1ттипооеп дженерик Ретипе®, вакцина Солка или АС 1661	1ттипе Кевропве Согр.
Ηϊνίά® товарный знак залцитабин или άάΟ	Но1Ттапп-1_а Еосбе
ΗΙΙ или Ογοχϊθ® товарный знак гидроксимочевина	ΒπδΐοΙ-ΜνβΓδ Зои\|ЬЬ
гидроксимочевина дженерик Ογοχϊθ® или Ни	ΒπδΐοΙ-ΜνβΓδ ЗдшЬЬ
1РУ, Спхмап® товарный знак индинавир или МК- 639	Мегск & Со.
/1-2 (интерлейкин-2), или Рго1еик/п® товарный знак альдеслейкин	СЫгоп Согрогабоп
индинавир дженерик Спхп/ап®, Ю\/, или МК-639	Мегск & Со.
интерлейкин-2 (1Ь-2) или Рго1еик/п® товарный знак альдеслейкин	СЫгоп Согрогабоп
ΙδβηίΓβδδ товарный знак ралтегравир	Мегск
ΙηνΐΓθδβ® товарный знак саквинавир (Нагб <3е1 Сар), 50ν (НОС) или Ко-31-8959	Но1Ттапп-1_а Еосбе
Ка1ейа® товарный знак лопинавир/ритронавир, или ΑΒΤ-378/г	АЬЬоб: ЬаЬогабэпез
ламивудин дженерик Ермг® или ЗТС	С1ахоЗт1б1КПпе
1 ехма®	(31ахо8т1б1КНпе
лопинавир/ритронавир дженерик ΚθΙθΙγθ^ или ΑΒΤ-378/г	АЬЬой 1_аЬога1опев

- 19 016267

МК-639, Спхмап® товаоный знак индинавир (Ιϋν);	Мегск & Со
нелфинавир дженеоик \Лгасео1®, ΝΡΫ или АС- 1343 :	Рйгег
невирапин, дженеоик \/1гатипе®. Ν\/Ρ или ΒΙ-КС- 587	Воепппоег ΙηοβΙΙιβίΓη
ΝΡ\Ζ, \/1гасер1® товарный знак нелфинавир или АС-1343	ΡίΐζθΓ
ΝοΓνίΓ® товарный знак ритронавир (КТУ) или АВТ-538	АЬЬой ЬаЬогаЮпез
МУР, ХЛгатипе® товарный знак невирапин или В1-КС-587	ВоеНппоег 1пое1Ие1гп
ΡΝυ-140690 или типранавир	ВоеЬппрег 1пре1пе1т
Ргег151а®	ΤΦοΐβο
РРО-542	Ргооеп1ез РНагтасеи1:1са1з
РгосгИ® товарный знак эпоэтин альфа (эритропоэтин)	ОгШо Βίοΐβοή
Рго1еик1п^& товарный знак алдеслейкин или интерлейкин-2 (1Ь-2)	СЫгоп СогрогаНоп
Ретипе® товарный знак Ηΐν-1 иммуноген или вакцина Солка	1ттипе Кезропзе Согр.
КезспрФг® товарный знак делавирдин (О1А/) или υ-901528/Τ	ΡΐίζθΓ
ΚβίΓονΪΓ® товарный знак зидовудин (ΖΟν) или ΑΖΤ	С1ахо8тИНК11пе
Кеуа1аг™ товарный знак атазанавио или ВМ8- 232632	Впзк)1-Муегз δουίϋό
ритронавир дженерик Νοη/ίΓ®, РТУ, или АВТ-538	АЬЬой ЬаЬогаФпез
РТУ, Νοιλ/ιγ® товарный знак ритронавир или АВТ-538	АЫэой 1_аЬога1опез
Вакцина Солка, Ретипе® товарный знак Ηΐν~1 иммуноген или АС 1661	1ттипе Кезропзе Согр.
саквинавир (Нагс! Се! Сар) дженерик 1пу1газе®,	НоТтапп-Ьа КосКе

- 20 016267

δον (НОС) или Ко-31-8959
саквинавир (Зой Се1 Сар) дженерик Еойоуазе® или 8СЛ/ (ЗСС)	Нойтапп-1_а Коспе
8СН-С	ЗсНеппо-Р1оиоп
Зе1геп(гу товарный знак маравирок	ΡίίζθΓ
Зегозйт® товарный знак соматропин	Зегопо каЬогаФпез
соматропин дженерик Зегозйт®	Зегопо каЬогаЮпез
δον (НОС), ΙηνΐΓθδβ® товарный знак саквинавир (Нагс! Се1 Сар) или Ко-31-8959	Нойтапп-ка Коспе
δθν (ЗСС). или Еойоуазе® товарный знак саквинавир (Зой Се1 Сар)	Нойтапп-ка Коспе
ставудин дженерик Ζβπΐ®, с!4Т или ΒΜΥ-27857	Впз(о1-Муегз ЗоиФЬ
Зизйуа® товарный знак эфавиренз (ЕЕУ)	Впз1о1-Муегз ЗоиФЬ
Т-1249	Тптепз и Нойтапп-ка Коспе

Т-20 или Еигеоп™ товарный знак энфувиртид	Тптепз и Нойтапп-ка Коспе

ТРЕ, тенофовир РЕ дженерик \Лгеас1™ или В\|8(РОС) РМРА	СНеас1 Заепсез
тенофовир РЕ (ТРЕ) дженерик Укеас!®, ΒϊδίΡΟΟ РМРА	СЛеаб Заепсез
типранавир или ΡΝυ-140690	ВоеИгтоег 1преФе1Гп
ТМС-114	ТФо(ес-У1гсо Сгоир
ТМС-125	Т'\|Ьо{ес-У\|гсо Сгоир
ΤπζΐνΐΓ^ товарный знак абакавир + зидовудин + ламивудин (АВС + : ΑΖΤ + ЗТС)	С1ахо5т\|ФК1\|пе
Т гиуаба®	СНеас!
У\|'с!ех® товарный знак диданозин, άάΙ или ΒΜΥ40900	ΒπδΐοΙ-Муегз ЗоиФЬ
У\|с!ех® ЕС товарный знак диданозин (скП): капсулы с длительным высвобождением	ΒπδΐοΙ-Муегз ЗоиФЬ
У\|гасео1® товарный знак нелфинавир (ЫЕУ) или АС-1343	ΡίίζθΓ
У\|гатипе® товарный знак невирапин (ΝνΡ) или ΒΙ-Κ6-587	Воепппоег ΙηοβΙήβίηΊ
У\|геас1® товарный знак тенофовир РЕ или Βίδ(ΤΟΟ) РМРА \/Х-175 или сЬосампренавир, или 6\Л/-433908 залцитабин дженерик Ηίνίά® или сФС ΖΡν, ΚβΐΓονίΓ® товарный знак зидовудин или ΑΖΤ Ζθπί® товарный знак ставудин, 64Т или ΒΜΥ27857	С\|1еас1 Зс1епсез С1ахоЗгп\|ФК1\|пе Нойтапп-ка Коспе С1ахоЗт\|ФКГте Впз(о1-Муегз ЗаиФЬ
Ζίθοβη® товарный знак абакавир (АВС) или 15921189	ΟΙθχοδηιίΐήΚΙίηβ
зидовудин дженерик ΚβΐΓονΪΓ®, ΑΖΤ или ΖΡν	С1ахоЗт\|ФК11пе

- 21 016267

Дополнительные лекарства, которые могут быть использованы в комбинации и/или путем чередования с 3-фосфоиндолами, включают _____________________________________

θν\/5634 (С8К)	Μΐν-150 (Мебмг/СЫгоп)	Типранавир (В-1)
РООЗЗ-4649 (Роспе)	ТМС125 (Τίόοΐθο)
16М640385 (СЗКЛ/ейех)	ТМС114(Т\|Ьо(ес)
Элвуцитабин (АсЫПюп Ρϊί.)	Аловудин (Е1_Т) (В-1)
Μΐν-210(Ο8Κ/ΜθάίνίΓ)	Расмг (РКагтаззе!)
ЗРО754 (8!з1ге РЬагт.)	ΕθνθΓβθΐ (1псу1е Согр.)
РР21399 (Ειψ РНагт.)	АМ6070 (АпогМеф
<3\Л/873140 (С8К)	ВМ8-488043 (ВМ8)
ЗсНеппдС/О (417690)	РРО 542 (Ргодеп1ез РНагт)
	ТАК-220 (Такеба)
	ΤΝΧ-355 (Тапох)
	иК-427,857 (ΡΐΐζθΓ)

Следующие лекарства могут быть использованы в комбинации и/или путем чередования с соединениями по настоящему изобретению_________________________________________

Товарный знак	Дженерик	Применение	Название производителя
Абельцет, Амбизом	амфотерицин В, АВ1 С	противогрибковое при аспергиллезе	различные
Бактрим, Септра	сульфаметоксазол и триметоприм	антипротозойное антибиотик для лечения и профилактики пневмонии, вызванной	различные

- 22 016267

Биаксин, Клацид

Цитовен

Дауноксом

Дифлюкан

Доксил

Фамвир

Фоскарнет

Гамимун Н

Интрон А

Маринол

Мегейс

Мепрон

Микобутин, Ансамицин

Небупент кларитромицин ганцикловир, ОНРС даунорубицинлипосомальный флуконазол дрксорубицин гидрохлоридлипосомальный фамцикловир фоскавир иммуноглобулин, гамма-глобулин, ιοιν интерферон альфа26 дронабинол мегестрола ацетат атовахон рифабутин пентамидин

Рпеитосузйз саппИ антибиотик для профилактики и лечения МусоЬас1епит ау/ит противовирусный против ретинита, вызванного СМУ (цитомегаловирусом) химиотерапия саркомы Капоши антигрибковый против кандидоза, криптококкового менингита химиотерапия саркомы Капоши противовирусный против вируса ______герпеса______ противовирусный против вируса герпеса, ретинита, вызванного СМУ иммуностимулятор для предотвращения бактериальных инфекций у детей саркома Капоши, _____гепатит С_____ лечение потери ______аппетита______ лечение потери аппетита, массы тела антипротозойный антибиотик для лечения и профилактики пневмонии, вызванной Рпеитосузйз саппИ антимикобактериальный антибиотик для профилактики МусоЬас1епит аУ1ит антипротозойный антибиотик для профилактики пневмонии,

АЬЬой ЬаЬогаЮпез

РосЬе

СНеаб

ΡΓιζθγ

ΟίΐΪΊΟ ΒίΟΐθΟίΊ

ΝονθΓΐίβ

Азйа

РНагтасеи11са1з

Вауег Вю1одюа1з

ЗсНеппд

Рохапе 1_аЬога1опез ΒΓΪ8ΪΟ1 Муегз_____8дц|ЬЬ С1ахо8тй11К1|пе

Абла

Рпагтасеийса1з

Рирзам/а

- 23 016267


Нейтрексин	триметрексата глюкуронат и лейковорин
Панретин гель	алитретиноиновый гель 0,1%
Прокрит, Эпоген	эритропоэтин, ЕРО
Роферон А	интерферон альфа- 23
Серостим	соматропин рДНК
Споранокс	итраконазол
Таксол	паклитаксел
Вальцит	валганцикловир
Вистид	цидофовир, НРМРС
Витрасерт имплантат	ганцикловировый вкладыш
Витравен, инъецируемый внутрь стекловидного тела	фомивирсена натрия инъекция
Зитромакс	азитромицин

вызванной Рпеитосузйз саппИ
антипротозойный антибиотик для лечения пневмонии, вызванной РпеитосузНз саппИ	МесПттипе
связанная со АЮ8 саркома Калоши	Ыдапс! РНагтасе1Люа1з
лечение анемии, связанной с терапией ΑΖΤ	Атдеп
саркома Калоши и гепатит С	Поспе
лечение потери массы тела	Зегопо
противогрибковое в отношении бластомикоза, гистоплазмоза, аспергиллоза и кандидоза	бапззеп Рпагтасеи11са1з
саркома Калоши	ΒπβίοΙ МуегзЗци\|ЬЬ
противовирусное действие при ретините, вызванном СМУ	ПосНе
противовирусное действие при ретините, вызванном СМУ	СЛеаб
противовирусное действие при ретините, вызванном СМУ	ВаизсН & 1_отЬ
противовирусное действие при ретините, вызванном СМУ	1313 РНагтасеийса1з
антибиотик против МусоЬас1епит βνίυιη	ΡΐίζβΓ

Могут быть использованы продукты, которые разрешены к применению как Исследуемые новые лекарства (ΕΝΏ) в соответствии с ΓΌΆ (Управление по контролю за продуктами питания и лекарственными средствами) для лечения осложнений инфекции III ν и ЛГО8. Следующие лекарства могут быть использованы в комбинации и/или путем чередования с соединениями по настоящему изобретению.

Триметрексата глюкуронат для лечения пневмонии, вызванной РпеитосузИз сагтп, у пациентов, страдающих от ЛГО8, которые не могут переносить стандартные формы лечения.

Ганцикловир для лечения ретинита, вызванного цитомегаловирусом, у пациентов, страдающих от ЛГО8.

Аэрозольный пентамидин для профилактики пневмонии, вызванной РпеитосузИз саппн, у пациентов, страдающих от ЛГО8.

Эритропоэтин для лечения анемии, связанной с зидовудином.

Атовахон для лечения пациентов, страдающих от ЛГО8, имеющих пневмонию, вызванную Рпеитосузйз саппн, не толерантных или не проявляющих ответ на триметоприм-сульфаметоксазол.

Рифабутин для профилактики против бактериемии, вызванной комплексом МусоЬас1ег1ит Ηνίιιηι, у пациентов, страдающих от ЛГО8.

Вистид внутривенный цидофовир для лиц, инфицированных I Пу, с рецидивами цитомегаловируса (ΟΜν), который прогрессирует, несмотря на лечение (Нойтапп-Ьа КосГе).

Серостим, продуцируемый млекопитающими рекомбинантный человеческий гормон роста для лечения связанной с ЛГО8 атрофии (8егопо ЬаЬога1ог1е8).

В конкретных воплощениях раскрытые здесь соединения могут быть введены в комбинации или путем чередования с одним, двумя или более чем двумя другими агентами против I ПУ. В одном из подвоплощений дополнительный агент выбран из ингибитора протеазы, возможно, выбранного из ампренавира, типранавира, индинавира, саквинавира (включающего саквинавира мезилат), лопинавира, ритронавира, фосампренавира, дарунавира, атазанавира (включающего соль сульфат) и нелфинавира (включающего соль мезилат);

нуклеозидного или нуклеотидного ингибитора обратной транскриптазы, возможно, выбранного из ламивудина, эмтрицитабина, абакавира, залцитабина, зидовудина, тенофовира (включающего тенофовира дизопроксила фумарата), диданозина и ставудина;

ненуклеозидного ингибитора обратной транскриптазы, возможно, выбранного из делавирдина, эфа

- 24 016267 виренза и невирапина;

комбинации с фиксированной дозой, возможно, выбранной из атрипла, комбивира, тризивира и трувада;

ингибитора проникновения (такого как ингибитор слияния или антагонист корецептора ССЕ5), возможно, выбранного из маравирока и энфувиртида; и ингибитора интегразы, такого как ралтегравир (МК-0518) или элвитегравир (О8-9137).

Когда используют дополнительный агент против Ηΐν, он может находиться в другой форме, такой как соль, сольват, гидрат, форма пролекарства, полиморф, энантиомер и т.п. Дополнительный агент против Ηΐν также может быть выбран из нуклеозидного ингибитора обратной транскриптазы, возможно, выбранного из амдоксовира, априцитабина и элвуцитабина;

ингибитора протеазы, который, возможно, представляет собой бреканивир или О8-8374; антагониста рецептора ССЕ5, возможно, выбранного из аплавирока, РКО2000 и викривирока; ненуклеозидного ингибитора обратной транскриптазы, который, возможно, представляет собой этравирин (ТМС-125), рилпивирин (ТМС-278) или каланолид А;

ингибитора интегразы, который, возможно, представляет собой элвитегравир, О8К-364735 или ралтегравир; и ингибитора созревания, который, возможно, представляет собой бевиримат (РА457);

клеточного ингибитора, такого как гидроксимочевина;

ингибитора проникновения, такого как викривирок или ΤΝΧ-355; и иммунного ингибитора, такого как иммунитин (альфа-эпибромид), пролейкин (ΐΕ-2), ремун (Ηΐν-1 иммуноген), ΒΑΥ 50-4798 или ΐΚ103.

Агенты, метаболизируемые цитохромом Р450.

В некоторых воплощениях предложенное здесь соединение может быть введено в комбинации или путем чередования с фармацевтически приемлемым агентом, метаболизируемым цитохром Р450 моноксигеназой. Примеры полезных цитохром Р450 моноксигеназ включают цитохром Р450 2С8, цитохром Р450 2С9 и цитохром Р450 3А4. В некоторых воплощениях предложенные здесь чистые соединения могут ингибировать цитохром Р450 моноксигеназу, таким образом улучшая фармакокинетику вводимого одновременно агента. В конкретных воплощениях ингибируемый изофермент Р450 представляет собой СΥР3Α4. В конкретных воплощениях фосфоиндольное соединение вводят в комбинации со вторым соединением против Ηΐν без необходимости сенсибилизации ритронавиром. В конкретных воплощениях фосфоиндольное соединение вводят в комбинации с одним или более чем одним из атазанавира, фосампренавира, дарунавира, индинавира, лопинавира, нелфинавира, саквинавира, типранавира или энфувиртида.

В конкретных воплощениях фосфоиндольное соединение вводят в комбинированной терапии с одним или более чем одним нуклеозидным ингибитором обратной транскриптазы и/или одним или более чем одним ингибитором интегразы.

Фармацевтически приемлемый агент, метаболизируемый цитохром Р450 моноксигеназой, может представлять собой любой агент, известный или идентифицированный специалистом в области техники. Не ограничивающие объем изобретения примеры соединений, которые могут быть метаболизированы цитохром Р450 моноксигеназой, включают паклитаксел, торсемид, амодиаквин, церивастатин и репаглинид (цитохром Р450 2С8); некоторые Ν8ΑΓΟ (нестероидные противовоспалительные средства) (например, диклофенак, ибупрофен, лорноксикам, мелоксикам, 8-напроксен, пироксикам, супрофен), некоторые вводимые перорально гипогликемические агенты (например, толбутамид, глипизид), некоторые блокаторы ангиотензина ΐΐ (например, лосартан, ирбесартан), некоторые сульфонилмочевины (например, глибурид, глибенкламид, глипизид, глимепирид, толбутамид, амитриптилин), целекоксиб, флуоксетин, флувастатин глибурид, натеглинид, фенитоин, розиглитазон, тамоксифен, торсемид, 8-варфарин (цитохром Р450 2С9); некоторые макролидные антибиотики (например, кларитромицин, эритромицин, телитромицин), некоторые антиаритмические средства (например, хинидин), некоторые бензодиазепины (например, алпразолам, диазепам, мидазолам, триазолам), некоторые иммуномодуляторы (циклоспорин, такролимус), некоторые противовирусные средства против Ηΐν (например, индинавир, нелфинавир, ритронавир, саквинавир), некоторые прокинетические агенты (например, цисаприд), некоторые антигистаминовые средства (например, астемизол, хлорфенирамин, терфенидин), некоторые блокаторы кальциевых каналов (например, амлодипин, дилтиазем, фелодипин, лерканидипин, нифедипин, низолдипин, нитрендипин, верапамил), некоторые ингибиторы ΗМС СоА редуктазы (например, аторвастатин, церивастатин, ловастатин, симвастатин), некоторые стероиды (эстрадиол, гидрокортизон, прогестерон, тестостерон), алфентанил, апрепитант, арипипразол, буспирон, кафергот, кафеин=>ТМи, цилостазол, кокаин, кодеин-Ы-деметилированный, дапсон, дексаметазон, декстрометорфан, доцетаксел, домперидон, эплеренон, фентанил, финастерид, глевек, галоперидол, иринотекан, Г-ЛЛМ. лидокаин, метадон, натеглинид, оданестрон, пимозид, пропранолол, кветиапин, хинин, рисперидон, ЫОТ розувастатин, салметерол, силденафил, сиролимус, тамоксифен, таксол, терфенадин, тразодон, винкристин, залеплон, зипразидон, золпидем (цитохром Р450 3А4), но не ограничиваются ими. В конкретных воплощениях здесь предложены

- 25 016267 способы в комбинации или путем чередования с противовирусными агентами против Ηΐν, которые метаболизируются цитохромом Р450 (например индинавиром, нелфинавиром, ритронавиром, саквинавиром).

Дополнительные примеры соединений, которые могут метаболизироваться цитохром Р450 моноксигеназой, включают ингибиторы ССВ5 (например, РВО-140, вицивирок или 8СН-417,690 и маравирок или иК-427857), ингибиторы интегразы (например, 1ТК-303/С8-9137, 6-(3-хлор-2-фторбензил)-1-[(28)-1гидрокси-3-метилбутан-2-ил]-7-метокси-4-оксо-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновая кислота, МК-0518, 5(1,1-диоксидо-1,2-тиазинан-2-ил)-М(4-фторбензил)-8-гидрокси-1,6-нафтиридин-7-карбоксамид, и описанные в патентах США №№ 6924282, 6921759, 6919351, 6841558, 6541515, 6403347, 6395743, 6380249, 6306891, 6271402, 6262055, 6245806, 6124327, 6110716, 5939414, 5858738, 5759842, 7176220 и 7112600, содержание которых включено здесь путем ссылки), ингибиторы протеаз (например, саквинавир, индинавир, ритронавир, нелфинавир, ампренавир, лопинавир, ритронавир, атазанавир, фосампренавир, типранавир, ампренавир и дарунавир), ингибиторы слияния (например, энфурвитид), ингибиторы созревания (например, бевиримат или РА-457) и нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (например, зидовудин, диданозин, залцитабин, ставудин, ламивудин, абакавир, энофовир, эмтрицитабин, комбивир, тризивир, трувада и эпзиком), но не ограничиваются ими.

Дополнительные примеры соединений, которые могут быть метаболизированы цитохром Р450 моноксигеназой, включают ритронавир, иммуносупрессанты циклоспорин, РК-506 и рапамицин, химиотерапевтические агенты таксол и таксотер, антибиотик кларитромицин и ингибиторы протеазы Ηΐν А77003, А-80987, МК-639, саквинавир, νΧ-478, ЛС1343, ΌΜΡ-323, ХМ-450, ВША 2011 Б8, ВША 1096 В8, ВША 2185 В8, ВМ8 186,318, ЬВ71262, 8С-52151, 8С-629 (НМдиметилглицин-М(2-гидрокси-3-(((4метоксифенил)сульфонил)(2-метилпропил)амино)-1-(фенилметил)пропил)-3-метил-Ь-валинамид), КМ272, ССР 53437, ССР 57813 и И-103017, но не ограничиваются ими.

В некоторых воплощениях предложены способы улучшения фармакокинетики ингибитора протеазы Ηΐν (или его фармацевтически приемлемой соли), который метаболизируется цитохром Р450 моноксигеназой. Способы включают введение ингибитора протеазы Ηΐν в комбинации или путем чередования с описанным здесь соединением. Такая комбинация или чередование может быть полезно для ингибирования протеазы Ηΐν у людей и также может быть полезно для ингибирования, лечения или профилактики инфекции Ηΐν или АГО8 у людей. Ингибитор протеазы Ηΐν может представлять собой любой ингибитор протеазы Ηΐν, известный специалистам в данной области техники. В некоторых воплощениях ингибитор протеазы Ηΐν представляет собой ампренавир (агенераза, С1ахо8тйЬк1те), типранавир (аптивус, ВоеЬппдег [пдеНеип). индинавир (криксиван, Мегск), саквинавир (фортоваза, НоГГтапп-Ьа Вое1е), саквинавира мезилат (инвираза, НоГГтапп-Ьа Вое1е), лопинавир и ритронавир (калетра, С1ахо8тВЬк1те), ритронавир (норвир, АЬой), дарунавир (презиста, Т1Ьо1ее), атазанавира сульфат (Веуа1ах) или нелфинавира мезилат (вирацепт, Адоигоп) или их комбинацию.

В конкретных подвоплощениях раскрытые здесь соединения могут быть введены в комбинации или путем чередования с одним, двумя или более чем двумя другими ингибиторами протеазы или ингибиторами интегразы - агентами против Ηΐν, которые потенциально могут улучшать метаболизм второго агента. В одном из подвоплощений дополнительный агент выбран из ингибитора протеазы, возможно выбранного из ампренавира, типранавира, индинавира, саквинавира (включающего саквинавира мезилат), лопинавира, ритронавира, фосампренавира, дарунавира, атазанавира (включающего соль сульфат), нелфинавира (включающего соль мезилат), бреканавира или С88374;

ингибитора интегразы, такого как ралтегравир (МК-0518) или элвитегравир (С8-9137) или С8К364735.

Как правило, при чередующейся терапии эффективную дозу каждого агента вводят последовательно. При комбинированной терапии эффективные дозы двух или более чем двух агентов вводят вместе. Вводимые дозы зависят от факторов, таких как скорости абсорбции, биораспределения, метаболизма и экскреции для каждого лекарства, а также других факторов, известных специалистам в данной области техники. Следует отметить, что количества доз варьируют в зависимости от тяжести состояния, которое облегчают, возраста, массы и общего физического состояния субъекта, принимающего лекарство. Также должно быть понятно, что для любого конкретного субъекта специфические схемы и графики приема лекарственного средства должны быть скорректированы по времени в соответствии с реакцией пациента на лекарство, потребностей субъекта и профессионального решения лица, осуществляющего введение или осуществляющего контроль за введением композиций. Примеры подходящих диапазонов доз для соединений, включающих нуклеозидные производные, такие как, например, Ό4Τ, ΌΌΐ и 3ТС, 2'разветвленный нуклеозиды или ингибиторы протеаз, такие как нелфинавир и индинавир, можно найти в научной литературе и настольных руководствах для лечащих врачей. Предложенные диапазоны эффективных доз соединений по настоящему изобретению представляют собой лишь руководство, и не предполагают, что они ограничивают объем или применение по изобретению.

Раскрытая комбинированная и осуществляемая путем чередования схема приема может быть полезна при лечении и профилактике ретровирусных инфекций и других связанных состояний, таких как,

- 26 016267 например, комплекс, связанный со ΑΙΌ8 (ΑΚΟ), персистирующая генерализованная лимфаденопатия (РСЬ), связанные со ΑΙΌ8 неврологические состояния, положение антител против ΗΙν и ΗΙνположительные состояния, саркома Капоши, пурпурная тромбоцитопения и оппортунистические инфекции. Кроме того, эти соединения или препараты могут применяться профилактически для предотвращения или замедления прогресса клинического заболевания у индивидов, являющихся положительными в отношении антител против ΗΙν или антигена ΗΙν либо которые подверглись воздействию ΗΙν.

Анализы.

Предложенные здесь соединения могут быть проанализированы в отношении активности против ΗΙν или инфекции ΗΙν при помощи анализа, который, как полагает специалист в данной области, является подходящим. Примеры анализов включают анализы, описанные в этом разделе, и которые предложены в приведенных ниже примерах.

Системы на основе культуры клеток для определения противовирусных активностей.

Схемы обнаружения амплифицированного продукта.

Гетерогенное обнаружение. Например, саузерн-блоттинг представляет собой способ гетерогенного обнаружения. При саузерн-блоттинге электрофорез используют для разделения продуктов амплификации по размеру и заряду. Фракционированные по размеру продукты переносят на мембрану или фильтр путем диффузии, вакуумирования или электроблоттинга. Меченые обнаруживающие зонды гибридизуют со связанными с мембраной мишенями в растворе, фильтры промывают для удаления любого негибридизованного зонда, и гибридизованный зонд на мембране обнаруживают при помощи любого из множества способов, известных специалистам в данной области техники.

Другие типы гетерогенного обнаружения основаны на специфическом захвате продуктов амплификации при помощи иммуноферментных анализов (ИФА). Один из способов, используемых вместе с ПЦР (полимеразной цепной реакции), включает мечение одним праймером с гаптеном или лигандом, таким как биотин, и после амплификации захват антителом - или покрытым стрептавидином микропланшетом. Другой праймер метят репортером, таким как флуоресцеин, и обнаружение осуществляют путем добавления антитела против флуоресцеина, такого как конъюгат с пероксидазой хрена (ΗΚΡ). Этот тип способа не так специфичен, как использование обнаруживающих зондов, которые гибридизуются с определенными интересующими продуктами амплификации.

Система зондов ΕΟχ (ΑЬЬο!! ЬаЬога!опе5, ΑЬЬο!! Рагк, Ш) и тест ЛтрЕсог ΗΙν-1 (Коске Мо1еси1аг 8у5!ет5, Фс., Р1еа§ап!оп, ΟΑ) представляют собой системы, в которых используются способы гетерогенного обнаружения. В системе ΕΟχ меченые гаптеном олигонуклеотидные зонды термоциклируют в лигазной цепной реакции. Захватываемый гаптен или обнаруживаемый гаптен ковалентно присоединяют с каждым из четырех праймерных олигонуклеотидов. После амплификации каждый амплифицированный продукт (ампликон) имеет один захватываемый гаптен и один обнаруживаемый гаптен. После завершения амплификации система ΕΟχ переносит реакционную среду в новую лунку, где связанные с антителами микрочастицы связываются с захватываемым гаптеном. Каждая микрочастица затем необратимо связывается с матрицей из стекловолокна. На стадии промывки удаляют микрочастицы слабым зондом, содержащим только обнаруживаемый гаптен. Аппарат ΕΟχ добавляет конъюгат щелочная фосфатаза (АР) - антитело, связывающийся с обнаруживаемым гаптеном. Флуорогенный субстрат для АР представляет собой 4-метилумбеллиферил. Дефосфорилирование 4-метилумбеллиферила АР превращает его в 4метилумбеллиферон, который флуоресцирует.

В тесте Αтр1^сο^ ΗΙν-1 используется формат ΕΕ18Α. После амплификации путем ПЦР ампликон химически денатурируют. Специфические в отношении ампликона олигонуклеотидные зонды захватывают денатурированные цепи на покрытом микропланшете. Оператор отмывает любые не включенные праймеры и не подвергшийся гибридизации материал на стадии промывки и затем добавляет в каждую лунку конъюгат авидин-ИКР. Конъюгат связывается с меченым биотином ампликоном, захваченным на планшете. Оператор затем добавляет 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ), представляющий собой хромогенный субстрат ЧКР. В присутствии перекиси водорода ЧКР окисляет ТМВ. Сигнал обнаруживают колориметрически.

Гомогенное обнаружение: поскольку гибридизуемые и негибридизуемые обнаруживаемые зонды физически не разделены в системах гомогенного обнаружения, эти способы требуют меньше стадий по сравнению с гетерогенными способами и, таким образом, менее подвержены контаминации. Такие имеющиеся в продаже наборы, в которых используется гомогенное обнаружение флуоресценции и хемилюминесцентные метки, представляют собой систему ТадМап (АррИей Вю5у5!ет5, Ео§!ег ΟίΑ, ΟΑ), система ВЭРгоЬеТесНТ (Вес!оп ЭюктБоп, Егапккп ЬакеБ, ΝΙ), система ОРСТ 5000 (Регк|п-Н1тег ^гр., Ыогтеа1к, СТ) и анализ гибридизации и защиты (Сеп-РгоЬе, Фс., 8ап П1едо, ΟΑ).

Система ТадМап обнаруживает ампликон в режиме реального времени. Обнаруживаемый зонд, который гибридизуется с областью внутри ампликона, содержит донорный флуорозонд, такой как флуоресцеин, на своем 5'-конце и гасящую группировку, такую как родамин, на своем 3'-конце. Когда гаситель и флуорофор располагаются на одном и том же олигонуклеотиде, флуоресценция донора ингибируется. Во время амплификации зонд связывается с мишенью. Тад полимераза вытесняет и расщепляет обнаруживаемый зонд, поскольку она синтезирует замещающую цепь. Расщепление обнаруживаемого зон

- 27 016267 да приводит в результате к отделению флуорофора от гасителя, приводя к увеличению флуоресцентного сигнала донора. Во время каждого цикла амплификации процесс повторяется. Величина флуоресцентного сигнала увеличивается по мере увеличения числа ампликонов. В молекулярных маяках также используются гасители и флуорофоры. Маяки представляют собой зонды, комплементарные ампликонумишени, но содержат короткие участки (приблизительно из 5 нуклеотидов) комплементарных олигонуклеотидов по каждому концу. 5'- и 3'-концы маяков мечены флуорофором и гасителем соответственно. Когда маяк не гибридизован с мишенью, образуется структура шпильки, приводящая в контакт флуорофор и гаситель и приводящая в результате к гашению флуоресценции. Область петли содержит область, комплементарную ампликону. После гибридизации с мишенью структура шпильки раскрывается и гаситель и флуорофор разделяются, давая возможность для проявления флуоресцентного сигнала. Флуориметр измеряет сигнал в режиме реального времени.

В системе БЭРгоЬеТесЕТ используется способ обнаружения в режиме реального времени, комбинирующий аспекты Тас.|Мап и молекулярных маяков. Зонд имеет структуру шпилька-петля и содержит флуоресцеиновые и родаминовые метки. Тем не менее, в этой системе область, комплементарная молекуле-мишени, находится не в петле, а скорее в области 3' относительно родаминовой метки. Вместо того чтобы содержать последовательность, комплементарную мишени, одноцепочечная петля содержит сайт рестрикции рестриктазы Β^Βΐ. Одноцепочечная последовательность не представляет собой субстрат для фермента. Флуоресцеиновая и родаминовая метки перед амплификацией находятся рядом друг с другом, что гасит флуоресценцию флуоресцеина. Амплификация превращает зонд в двухцепочечную молекулу. Рестриктаза Β^Βΐ может расщеплять молекулу, приводя в результате к отделению меток и увеличению флуоресцентного сигнала.

В системе ОРСЕ 5000 используется электрохемилюминесценция с рутениевыми метками. Используют биотинилированный праймер. После амплификации биотиновые продукты захватываются на покрытых стрептавидином парамагнитных шариках. Шарики переносят в электрохимическую проточную ячейку путем аспирации и магнитно удерживаются на поверхности электрода. После электрической стимуляции меченый рутением зонд испускает свет.

Анализ гибридизации-защиты используется в анализах Оеп-РтоЬе'к неамплифицированного РАСЕ, а также в анализах амплифицированных М. !иЬегси1о818 и С. [гасНошаНх Обнаруживаемые олигонуклеотидные зонды в НРА мечены хемилюминесцентным акридиниевым эфиром (АЕ) при помощи связывающей последовательности. Гибридизация протекает в течение 15 мин при 60°С в той же самой пробирке, в которой происходит амплификация. Отбирающий реагент, представляющий собой слегка основный буферный раствор, добавляемый после гибридизации, гидролизует АЕ на любом негибридизованном зонде, делая его нехемилюминесцентным. АЕ на гибридизованных зондах укладывается внутри небольшого желобка двойной спирали, таким образом защищаясь от гидролиза отбирающим реагентом. АЕ испускает хемилюминесцентный сигнал после гидролиза перекисью водорода с последующим добавлением гидроксида натрия. Люминометр регистрирует хемилюминесцентный сигнал в течение 2 с (период, названный выключенный свет) и представляет количество испущенных фотонов, выраженное в относительных световых единицах (КЕИ).

Дизайн обнаруживаемого зонда является критическим во всех способах, в которых используются зонды для обнаружения продуктов амплификации. Хорошо обнаруживаемые зонды гибридизуются только со специфическими продуктами амплификации и не гибридизуются с неспецифическими продуктами. Другой ключевой аспект при оптимизации способов обнаружения включает мечение зондов и максимизацию объема образца.

Способы мечения и молекулы-репортеры.

Обнаруживаемые зонды могут быть мечены несколькими различными путями. Ферментативное включение ³²Р или ³⁵8 в зонды представляет собой самый обычный способ изотопного мечения. После гибридизации и промывки сигнал обнаруживают на авторадиографической пленке.

Для осуществления нерадиоактивного обнаружения зонды могут быть мечены ферментативно множеством молекул. Биотин может быть включен ферментативно и затем обнаружен с помощью конъюгированной со стрептавидином щелочной фосфатазы с использованием субстратов АР, таких как 5бром-4-хлор-3-индолил фосфат ЩС^ и нитроголубой тетразолий (ΝΒΈ). Хемилюминесцентные субстраты, такие как Бинн-РНо^ 530 или Бинн-РНо^ Р1н5 (Ьитздеп, 8ои1Ы!е1б, М1), также могут быть использованы с АР. Дополнительно, дигоксегинин-11-бИТР может быть включен ферментативно в ДНК или РНК, и конъюгаты антител против дигоксигенина с АР могут быть использованы с колориметрическим или хемилюминесцентным обнаружением.

Существует множество других типов молекул-репортеров, включающих хемилюминесцентные группировки, такие как акридиниевые сложные эфиры. Также существует множество флуоресцентных группировок. Также могут быть использованы электрохемилюминесцентные соединения, такие как трис(2,2'-бипиридин)рутений(П). Дополнительное обсуждение этих и похожих способов можно найти в 8сН1ГГ е! а1. 8ет1п. Ыуег Όίδ., 1999, 79:8ирр1. 1:3-15.

Анализ биодоступности у обезьян Супото1ди8.

В течение 1 недели перед началом исследования обезьянам Супото1ди8 хирургически имплантиру

- 28 016267 ют венозный катетер длительного использования и подкожный порт для доступа к вене (νΑΡ) для облегчения отбора крови, и подвергают физической проверке, включающей гематологическую оценку и оценку сыворотки крови, и регистрировали массу организма. Каждая макака (всего шесть) получает каждую дозу активного соединения при уровне дозы 10 мг/кг с концентрацией дозы 5 мг/мл при помощи внутривенного болюса (3 макаки, ΐν (внутривенно)) или при помощи перорального зонда (3 макаки, РО (перорально)). Каждый дозирующий шприц взвешивают перед введением дозы для гравиметрического определения количества вводимого препарата. Образцы мочи собирают при помощи поддона-ловушки в обозначенные интервалы времени (приблизительно 18-0 ч перед введением дозы, 0-4, 4-8 и 8-12 ч после введения дозы) и обрабатывают. Также собирают образцы крови (перед введением дозы, 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 6, 8, 12 и 24 ч после введения дозы) при помощи длительного венозного катетера и νΑΡ или из периферического сосуда, если процедура с длительным венозным катетером невозможна. Образцы крови и мочи анализируют при помощи ЖХ/МС (жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии) в отношении максимальной концентрации (С_тах), времени достижения максимальной концентрации (Т_тах), площади под кривой (АИС), периода полувыведения дозы (Т_1/2), клиренса (СЬ), объема и распределения в спокойном состоянии (ν₈₈) и биодоступности (Р).

Анализ токсичности в отношении костного мозга.

Человеческие клетки костного мозга собирают у здоровых нормальных добровольцев, и мононуклеарную популяцию отбирают путем центрифугирования в градиенте Фиколла-Гипак, как описано ранее в 8оттабокк1 Ι-Р., Саг11к1е К. Тохюйу о£ 3'-а/|бо-3'-беоху1Нут1б1пе апб 9-(1,3-б1Нубгоху-2ргорохуте1Ну1)диашпе £ог погта1 Нитап Нета1оро1ебс ргодепйог се11к ш уйго, АпбтюгоЫа1 Адеп1к апб СНетоИегару 1987; 31:452-454 и 8оттабокк1 Ι-Р., 8с1ипа/1 К.Р., СНи С.К., Х1е М.-Υ. Сотрапкоп о£ су(о1ох1с11у о£ (Не (-)- и (+)-епапботег о£ 2'.3'-б|беоху-3'-11иасуббте т погта1 Нитап Ьопе тагготе ргодепйог се11к ВюсНет1са1 РНагтасо1оду 1992; 44:1921-1925. Культуральные анализы в отношении СРИ-СМ (гранулоцитарно-макрофагальной колониеобразующей единицы) и ВРИ-Е (колониеобразующей эритроидной взрывообразующей единицы) осуществляют с использованием двухслойного мягкого агара или способа с метилцеллюлозой. Лекарства разбавляют в тканевой культуральной среде и фильтруют. Через 14-18 суток при 37°С в увлажненной атмосфере 5% СО₂ в воздухе колонии из более чем 50 клеток подсчитывают с использованием обращенной микроскопии. Результаты представлены в виде процентного ингибирования образования колоний в присутствии лекарства по сравнению с контрольными культурами, обработанными растворителем.

Анализ цитотоксичности.

Клетки высевают в количестве от 5х10³ до 5 х10⁴/лунку в 96-луночные планшеты в среде для роста в течение ночи при 37°С в увлажненной атмосфере СО₂ (5%). Затем добавляют новую ростовую среду, содержащую серийные разведения лекарств. После инкубации в течение 4 суток культуры фиксируют в 50% ТХУ (трихлоруксусной кислоте) и окрашивают сульфородамином В. Оптическую плотность считывают при 550 нм.

Цитотоксическую концентрацию выражают в виде концентрации, требуемой для уменьшения количества клеток на 50% (СС50).

Анализ клеточной защиты (СРА).

Анализ осуществляют, по существу, как описано ВадшкИ, 8.С.; Реуеаг, Э.С.; 8е1ре1, М.; 8ип, 8.С.С.; Вепе1а1ок. С.А.; СНипбиги, 8.К.; Кюе, С.М. апб М.8. Со11е(1 МесНашкт о£ асбоп о£ а ректзгик апбу1га1 сотроипб, ΡNΑ8 И8А 2000, 97(14), 7981-7986. Клетки МОВК (АТСС) высевают в 96-луночные культуральные планшеты (4000 клеток в лунку) за 24 ч до применения. После инфицирования ВУЭУ (штамм ΝΑΟΙ, АТСС) при множественности заражения (МО1) 0,02 бляшкообразующих единиц (РРИ) на клетку, серийные разведения тестируемых соединений добавляют к инфицированным и неинфицированным клеткам в конечной концентрации 0,5% ДМСО в ростовой среде. Каждое разведение тестируют в четырех параллелях. Плотности клеток и вирусные инокуляты корректируют таким образом, чтобы обеспечивать непрерывный клеточный рост в течение эксперимента и достигать более чем 90% вызванную вирусом клеточную деструкцию в необрабатываемых контролях через четверо суток после инфицирования. Через четверо суток планшеты фиксируют при помощи 50% ТХУ и окрашивают сульфородамином В. Оптическую плотность в лунках считывают в аппарате для визуализации микропланшетов при 550 нм. Значения 50% эффективной концентрации (ЕС₅₀) определяют как концентрацию соединения, которая позволяет достичь 50% уменьшение цитопатического действия вируса.

Анализ уменьшения бляшек.

Для каждого соединения эффективную концентрацию определяют в двух 24-луночных планшетах при помощи анализов уменьшения бляшек. Клеточные монослои инфицируют 100 РРИ (бляшкообразующих единиц) вируса/лунку. Затем серийные разведения тестируемых соединений в МЕМ дополняют 2% инактивированной сывороткой крови и к монослоям добавляют 0,75% метилцеллюлозу. Культуры дополнительно инкубируют при 37°С в течение 3 суток, затем фиксируют 50% этанолом и 0,8% кристаллическим фиолетовым, промывают и сушат на воздухе. Затем бляшки подсчитывают для определения концентрации, обеспечивающей 90% вирусную супрессию.

Биологическая активность в отношении резистентных к лекарствам штаммов Ηΐν.

- 29 016267

В одном из воплощений эффективность соединения против Ηΐν измеряют ίη νίίτο при помощи быстрого, чувствительного и автоматического анализа, включающего восстановление 3-(4,5диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромида (МТТ). Трансформированную Ηΐν клеточную линию, которая является высоко пермиссивной и избирательна в отношении инфекции Ηΐν, такая как, например, клеточная линия Т-4, МТ-4, выбирают в качестве линии клеток-мишеней (Коуапад οί а1., ΐηί. I. Сапсег, 1985, 36:445-451). Восстановление 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромида (МТТ) т зйи, оцениваемое спектрофотометрически, представляет собой стандарт, при помощи которого измеряют живучесть ложно-инфицированных клеток и Ηΐν-инфицированных клеток. Ингибирование вызванного Ηΐν цитопатического действия служит в качестве конечной точки. 50% цитотоксическую концентрацию (СС₅₀ в мкМ) определяют как концентрацию соединения, которая уменьшает абсорбцию ложно-инфицированного контрольного образца на 50%. Процентную эффективность соединения против Ηΐν рассчитывают при помощи формулы (выраженной в виде %) (СЮн|у тестируемого соединения) ^_ (ООконтроля)/(0^ложно-инфицированных клеток)-(ООконтроля)

Здесь (Οϋ_Ηΐν тестируемого соединения) представляет собой оптическую плотность, измеренную для специфического количества тестируемого соединения в Ηΐν-инфицированных клетках; (ОЭ_{контроля}) представляет собой оптическую плотность, измеренную для необработанных Ηΐν-инфицированных контрольных клеток; и (ОЭ_{ложно-ин}ф_{ицированных клеток}) представляет собой оптическую плотность, измеренную для контрольных ложно-инфицированных клеток, которые не подверглись обработке. Значения оптической плотности типично оценивают при 540 нм. Дозу тестируемого соединения против Ηΐν, которая обеспечивает 50% защиту в соответствии с предшествующей формулой, определяют как 50% ингибирующую концентрацию (1С₅₀ в мкМ). Индекс селективности (8ΐ) определяют как отношение СС₅₀ к 1С₅₀.

В еще одном воплощении анализ р24 ИФА используют для определения эффективности соединения против Ηΐν. Иммуноанализ вирусной репликации измеряет количество присутствующего антигена р24 вирусного капсида (корового) и имеется в продаже из источников, таких как, например, СоиЙег Согрогаί^οη/ΐттиηοίес1, 1пс.® (АезФгоок, Μΐ).

Другие воплощения включают анализ обратной транскриптазы, в котором величину вирусной репликации измеряют путем использования гомополимерной поли гА: олиго йТ матричной системы праймеров, количественно оценивающей включение в клетки тритированного тимидинмонофосфата при помощи способов подсчета сцинтилляции (8оиФегп Кезеагс! ХпзИШе, Цпщегзйу ок А1аЬаша, Ыгттдйат, АЬ); синцитиального ингибирующего анализа, использующего клетки СЕМ-88, Ηе^а-С^4 или Ηе^а-С^4ЬТК-Ь-галактозидаза, имеющего иммунофлуоресцентную, хемилюминесцентную или колориметрическую конечную точку; и анализа ингибирования прикрепления и слияния, использующего индикаторные клеточные линии и количественную оценку путем хемилюминесцентной, колориметрической или микроскопической оценки (8оиФегп Кезеагс! ^зШ^е, СшуегЩу ок А1аЬата, Ыгттдйат, АЬ).

В одном из воплощений индольные соединения по настоящему изобретению не демонстрируют перекрестную резистентность с другими ненуклеозидными ингибиторами обратной транскриптазы (ΝΝΚΤΐ), проявляющуюся в том, что соединения по настоящему изобретению демонстрируют ЕС₅₀ (в мольной концентрации) в мутантном штамме Ηΐν меньше чем приблизительно 50, 25, 10 или 1 мкМ. В типичном воплощении ΝΝΚΤΐ демонстрирует ЕС₅₀ в мутантном штамме Ηΐν меньше чем приблизительно 5, 2,5, 1 или 0,1 мкМ. Степень перекрестной резистентности против резистентного к лекарству штамма Ηΐν измеряют путем оценки ЕС₅₀ желаемого оксопиримидинового соединения у мутанта-мишени, т.е. резистентного к лекарству вируса.

Фармацевтические композиции.

Хозяев, включая людей, инфицированных вирусом или страдающих от любого другого описанного здесь состояния, можно лечить путем введения пациенту эффективного количества активного соединения или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства, возможно в присутствии фармацевтически приемлемого носителя или разбавителя. Соединения могут быть введены субъекту, нуждающемуся в таком введении, возможно, в комбинации или путем чередования с другим терапевтическим агентом, и/или с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или эксципиентом. В одном из воплощений субъекта, инфицированного Ηΐν, можно лечить путем введения этому субъекту эффективного количества раскрытого здесь соединения или его соли, пролекарства, стереоизомера или таутомера в присутствии фармацевтически приемлемого носителя или разбавителя. Для субъектов, имеющих множественную резистентность к лекарствам, фосфоиндольное соединение вводят самостоятельно или в комбинации с одним или более чем одним другим терапевтическим агентом. Активные соединения могут быть введены любым подходящим путем, например перорально, парентерально, энтерально, внутривенно, внутрикожно, подкожно, чрескожно, трансдермально, интраназально, местно или путем ингаляционной терапии, и могут находиться в твердой, жидкой или парообразной форме.

Активное(ые) соединение(я) в одном из воплощений включено(ы) в фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент в количестве, достаточном для доставки пациенту терапевтически эффективного количества активного соединения, например, для ингибирования вирусной инфекции, не вызывая серьезных токсических действий в отношении субъекта, которого лечат. Ингибирующее количество включает количество активного ингредиента, достаточное для прекращения вирусной реплика

- 30 016267 ции, измеряемого, например, при помощи анализа, такого как упомянутый здесь анализ.

Типичная доза соединения может находиться в диапазоне от приблизительно 1 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 20 мг/кг массы тела в сутки, в общем, от приблизительно 0,1 до приблизительно 100 мг/кг массы тела реципиента в сутки. Могут быть использованы меньшие дозы, например дозы приблизительно 0,5-100 мг, 0,5-10 мг или 0,5-5 мг на 1 кг массы тела в сутки. Могут быть полезны еще меньшие дозы, и такие диапазоны могут включать приблизительно 0,10,5 мг/кг массы тела реципиента в сутки. Диапазон эффективных доз фармацевтически приемлемых производных рассчитывают на основе массы доставляемого родительского индольного производного соединения. Если само производное соединение демонстрирует активность, то эффективную дозу можно оценивать, как описано выше, с использованием массы производного или при помощи других способов, известных специалистам в данной области техники.

Соединения для удобства вводят в любой подходящей лекарственной форме, включая содержащую от приблизительно 7 до 3000 мг, от приблизительно 70 до 1400 мг или от приблизительно 25 до 1000 мг активного ингредиента на стандартную лекарственную форму, но не ограничивающейся ими. Например, обычно удобна доза для перорального введения, составляющая от приблизительно 50 до 1000 мг, включающая в одной или множестве лекарственных форм 50, 100, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 мг. Могут быть предпочтительны меньшие дозы, например приблизительно 10-100 или 1-50 мг. Также охвачены дозы 0,1-50 мг, 0,1-20 мг или 0,1-10 мг. Кроме того, могут быть использованы меньшие дозы в случае введения не пероральным путем, таким как, например, путем инъекции или ингаляции.

Активный ингредиент может быть введен разово или может быть разделен на множество меньших доз, которые вводят через временные интервалы. Понятно, что точная доза и длительность лечения зависит от заболевания, которое лечат, и может быть определена эмпирически с использованием известных протоколов тестирования или путем экстраполяции данных тестов ш νί\Ό или ш νίϋΌ. Следует отметить, что концентрации и дозы также могут варьировать в зависимости от тяжести состояния, которое облегчают. Кроме того, понятно, что для любого конкретного субъекта специфические схемы приема лекарственного средства следует корректировать в соответствии с индивидуальными потребностями и профессиональным решением лица, осуществляющего введение, или наблюдающего за введением композиций, и что изложенные выше диапазоны концентраций приведены только для примера, и не предполагается, что они ограничивают объем или практическое применение предложенных здесь композиций.

В некоторых воплощениях предложенное здесь соединение или композицию можно вводить в виде разовой вводимой один раз в сутки дозы или предпочтительно в виде дробных доз в течение суток. В конкретных воплощениях соединение или композицию вводят четыре раза в сутки. В конкретных воплощениях соединение или композицию вводят трижды в сутки. В конкретных воплощениях соединение или композицию вводят дважды в сутки. В конкретных воплощениях соединение или композицию вводят один раз в сутки.

В одном из воплощений активный ингредиент вводят для достижения максимальных концентраций в плазме крови активного соединения от приблизительно 0,02 до 70 мкМ или от приблизительно 0,5 до 10 мкМ. Например, этого можно достичь путем внутривенной инъекции от 0,1 до 5% раствора активного ингредиента, возможно, в физиологическом растворе или вводимого в виде болюса активного ингредиента. Понятно, что для любого конкретного субъекта специфические схемы приема лекарственного средства должны быть скорректированы по времени для удовлетворения индивидуальным потребностям и варьируют в зависимости от абсорбции, скоростей инактивации и экскреции лекарства. Представленные здесь концентрации приведены только для примера, и не предполагается, что они ограничивают объем или практическое применение заявленных композиций. Активный ингредиент может быть введен разово или может быть разделен на множество меньших доз, вводимых через изменяющиеся промежутки времени.

Один из способов введения активного соединения является пероральным. Композиции для перорального введения включают инертный разбавитель или пригодный в пищу носитель. Они могут быть заключены в желатиновые капсулы, прессованы в таблетки или доставлены в жидкой форме. Для перорального терапевтического введения активное соединение может быть включено с эксципиентами или приготовлено в виде твердых дисперсий или твердых растворов и применено в форме таблеток, пастилок или капсул. Под твердой дисперсией подразумевают твердое состояние, включающее по меньшей мере два компонента, где один из компонентов диспергирован более или менее равномерно в другом компоненте. Под твердым раствором подразумевают твердое состояние, включающее по меньшей мере два компонента, которые химически и физически интегрированы с образованием гомогенного продукта. Твердый раствор является типичным по сравнению с твердой дисперсией, поскольку он легче образует жидкий раствор при контакте с подходящей жидкой средой, таким образом увеличивая биодоступность лекарства. Фармацевтически совместимые связывающие агенты и/или адъюванты также могут быть включены как часть этой композиции.

Таблетки, пилюли, капсулы, троше и т.п. могут содержать любой из следующих ингредиентов или соединений похожей природы: связующее вещество, такое как микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая камедь или желатин; эксципиент, такой как крахмал или лактоза; разрыхлитель, такой как аль

- 31 016267 гиновая кислота, примогель или кукурузный крахмал; смазывающее вещество, такое как стеарат магния или стероты; скользящее вещество, такое как коллоидный диоксид кремния; подсластитель, такой как сахароза, сахарин; и корригент, такой как мята перечная, метилсалицилат или экстракт апельсиновой корки. Когда стандартная лекарственная форма представляет собой капсулу, она может содержать жидкий носитель, такой как жирная кислота, дополнительно к любому из вышеупомянутых веществ. Дополнительно стандартные лекарственные формы могут содержать различные другие вещества, которые модифицируют физическую форму стандартной дозы, такие как, например, оболочки из сахара, шеллак или другие энтеросолюбильные агенты.

Соединения могут быть введены в виде компонента эликсира, суспензии, сиропа, облатки, жевательной резинки и т. п. Сироп может содержать сахарозу в качестве подсластителя, консерванты, красители, красящие вещества и корригенты дополнительно к активным соединениям. Активные соединения или их фармацевтически приемлемые соли или пролекарства могут быть смешаны с другими активными материалами, которые не нарушают желаемого действия, или с веществами, которые дополняют желаемое действие, такими как антибиотики, противогрибковые препараты, противовоспалительные средства, ингибиторы протеаз или другие нуклеозидные или ненуклеозидные противовирусные агенты. Растворы или суспензии, используемые для парентерального, внутрикожного, подкожного или местного применения, могут включать следующие компоненты: стерильный разбавитель, такой как вода для инъекции, физиологический раствор, жирные масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатообразующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и агенты, придающие ионную силу, такие как хлорид натрия или декстроза. Препарат для парентерального введения обычно включает стерильную воду и может быть заключен в ампулы, одноразовые шприцы или виалы, содержащие дробные дозы, изготовленные из стекла или пластика.

При внутривенном введении некоторые носители представляют собой физиологический раствор, забуференный фосфатом физиологический раствор (ΡΒ8), раствор глюкозы или смешанный раствор, содержащий глюкозу и физиологический раствор. В одном из воплощений активное соединение готовят с носителем, который защищает соединение от быстрого выведения из организма, таким как препарат с контролируемым высвобождением, включающий имплантат и/или микроинкапсулированную систему доставки. Могут быть использованы биоразрушаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортосложные эфиры и полимолочная кислота. Вещества могут быть приобретены в продаже от Αίζα СогрогаБоп или получены в соответствии со способами, известными специалистам в данной области техники. Если введение является подкожным, таким как, например, путем применения пластыря или масла, ассоциированный носитель может содержать агент, усиливающий проницаемость, и/или подходящий увлажнитель, который не вреден коже. Если желаемый путь введения представляет собой ингаляцию или инсуффляцию, то композиция по настоящему изобретению включает соединение в форме раствора, суспензии или сухого порошка, который может быть доставлен через ротовое и/или носовое отверстия.

Липосомальные суспензии, которые включают липосомы, нацеленные на инфицированные клетки с моноклональными антителами против вирусных антигенов, также типичны в качестве фармацевтически приемлемых носителей. Они могут быть получены в соответствии со способами, известными специалистам в данной области техники, например как описано в патенте США № 4522811, который включен здесь путем ссылки. Например липосомальные препараты могут быть приготовлены путем растворения подходящего(их) липида(ов), такого как стеароилфосфатидилэтаноламин, стеароилфосфатидилхолин, араходоилфосфатидилхолин и холестерин, в неорганическом растворителе, затем последний упаривают, оставляя тонкую пленку высушенного липида на поверхности контейнера. Водный раствор активного соединения или его соли либо пролекарства затем вводят в контейнер. Контейнер путем вихреобразного встряхивания освобождают от свободных липидов со стенок и для диспергирования липидных агрегатов, таким образом образуя липосомальную суспензию.

Способы получения активных соединений.

В настоящем изобретении раскрыты способы получения соединений, включающих энантиомерно чистые фосфоиндольные соединения, К-фосфоиндольные соединения и соединения формулы (С).

Пример общей схемы синтеза фосфоиндолов предложен на схеме 1.

- 32 016267

Общая схема синтеза фосфоиндолов

Синтез включает обработку Ν-защищенного индола 1 подходящими вводящими литий соединениями, например н-бутиллитием, с последующим подходящим фосфорным электрофилом, например диэтилхлорфосфитом, с получением Р(Ш) промежуточного соединения, которое частично гидролизуется в кислых условиях с получением Н-фосфината 2. Стадия (ΐΐ) состоит из катализируемой палладием реакции сочетания между индол Н-фосфинатом 2 и йодциннамонитрилом 11. Трансэтерификация из этила в метил с последующим гидролизом карбоксилатного эфира и Ν-защитных групп, например гидроксидом лития или трет-бутоксидом калия при 5°С в воде-тетрагидрофуране, позволяет получить индолильную кислоту 5. Хиральное расщепление энантиомеров 5 с использованием хирального основания с последующим образованием амида позволяет получить конечное соединение 7.

Второй пример общей схемы синтеза фосфоиндолов приведен на схеме 2.

Общая схема 2 синтеза фосфоиндолов

Этот синтез включает обработку Ν-защищенного индола 1 метилфосфинатом в мягких условиях палладиевого катализа с получением индол Н-фосфината 2. Стадия (ΐΐ) состоит из катализируемой палладием реакции сочетания между индол-Н-фосфинатом 2 и йодциннамонитрилом 11. Гидролиз карбоксилатного эфира и Ν-защитных групп, например, гидроксидом лития или трет-бутоксидом калия при 5°С в воде-тетрагидрофуране позволяет получить индолильную кислоту 5. Хиральное расщепление энантиомеров 5 с использованием хирального основания с последующим образованием амида позволяет получить конечное соединение 7.

Пример альтернативного пути синтеза фосфоиндолов изображен на схеме 3.

- 33 016267

Альтернативный путь синтеза фосфоиндолов

Альтернативный синтез включает сочетание Ν-защищенного индола 1 арил-Н-фосфинатом 13 с использованием палладиевого катализатора, лиганда, основания в подходящем растворителе при умеренной температуре с получением фосфоиндола 4. Образование арил Н-фосфината 13 описано на схеме 4. Гидролиз карбоксилатного эфира и Ν-защитных групп, например, гидроксидом лития или третбутоксидом калия при 5°С в воде-тетрагидрофуране позволяет получить индолильную кислоту 5. Хиральное расщепление энантиомеров 5 с использованием хирального основания с последующим образованием амида позволяет получить конечное соединение 7. Примеры синтезов йодциннамонитрила и циннамонитрил Н-фосфината представлены на схеме 4.

Синтез йодциннамонитрила из дибромтолуола

Синтезы циннамонитрил Н-фосфината из йодциннамонитрила

Йодциннамонитрил 11 может быть получен из дибромтолуола 8. Образование моноальдегида 9 осуществляют путем монолитирования, например, н-бутиллитием и н-бутилмагния хлоридом и последующей обработки Ν,Ν-диметилформамидом. Реакция Виттига-Хорнера-Эммонса альдегида 9 с использованием, например, диэтилцианометилфосфоната и гидрида натрия позволяет получить прежде всего транс-изомер, который может быть дополнительно обогащен путем кристаллизации с получением бромциннамонитрила 10. Затем осуществляют йодирование с получением желаемого промежуточного соединения 11.

Возможно йодциннамонитрил 11 может быть превращен в арил Н-фосфинат 13 путем (1) сочетания с солью анилина гипофосфорной кислоты с последующей этерификацией или путем (2) непосредственного сочетания палладия с алкилфосфинатом. Дополнительно этиларил Н-фосфинат 14 может быть подвергнут трансэтерификации с получением метил Н-фосфината 13.

3-фосфоиндолы могут быть получены в соответствии со способами, известными специалистам в данной области техники, включающими способы, описанные в публикации заявки на патент США № 2006/0074054, содержание которой включено здесь путем ссылки.

Еще один общий способ синтеза для получения индолфосфината приведен в схеме ниже. Синтез

- 34 016267 начинается с индола 1, который 3-галогенирован и Ν-защищен (или Ν-защищен и 3-галогенирован) с получением защищенного индола 3. Защитные группы (РО) могут представлять собой фенилсульфонил, трет-бутилкарбамат (Вос), бензилкарбамат (Ο6ζ), бензоил, бензил, параметоксибензил или другой замещенный бензил, трет-бутилдиметилсилил, трет-бутилдифенилсилил или любую Ν-1 индольную защиту. Последний 3 вовлечен в галогенметаллический обмен, например, с н-бутиллитием и затем вступает во взаимодействие с диэтилхлорфосфитом с получением после кислого гидролиза Н-фосфината 4 или вовлечен в катализируемое палладием взаимодействие с гипофосфорным эфиром с получением того же самого продукта 4. Индол Н-фосфинат 4 затем вовлечен в еще одно катализируемое палладием взаимодействие с арилгалогенидом с получением индол 3-фосфината 5. В случае К, отличающегося от метильной группы, трансэтерификация 4 в аммиак в метаноле позволяет получить Н-фосфинат индолкарбоксамид 6. Это соединение также вовлечено в катализируемое палладием взаимодействие с арилгалогенидом с получением конечного соединения 7.

Подходящие палладиевые катализаторы реакции перекрестного сочетания включают, например палладия тетракис(трифенилфосфин), палладия ацетат, палладия пропионат, палладия диацетонитрилдихлорид, дипалладия трис-(дибензилиденацетон) (Рб₂бЬа₃), палладия Ν-гетероциклический карбен (ΝΗΟ), или любой другой палладиевый катализатор, которые известны специалистам в данной области техники, используемые самостоятельно или в ассоциации с лигандами, такими как трифенилфосфиновый, дифенилфосфиноферроценовый, дифенилфосфинопропановый или анилфосфиновый или дифосфиновый лиганды, известные специалистам в данной области техники. Подходящие растворители катализируемой палладием реакции перекрестного сочетания включают, например: ДМФ (диметилформамид), ацетонитрил, NΜΡ (Ν-метилпирролидон), диоксан, метанол, ТГФ, толуол. Подходящие основания для катализируемой палладием реакции перекрестного сочетания включают, например Ε!3Ν, диизопропиламин, Κ₂ΟΟ₃, ^^Ο^ №11ΟΟ₃, Ο8₂ΟΟ₃, Ν-метилморфолин, ^ΑΒСΟ (1,4-диазабицикло[2.2.2]октан), ЭВи (1,8диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен).

В других воплощениях 3-фосфоиндолы могут быть получены путем взаимодействия Нарилфосфината с 3-йодиндолом, что изображено на схеме ниже. 3-Йодиндол может быть получен путем йодирования индола с использованием йодирующих реагентов, известных специалистам в данной области техники. Возможно, атом азота 3-йодиндола может быть защищен любой защитной группой, которая, как видимо, подходит специалистам в данной области техники. Взаимодействие с Н-арилфосфинатом позволяет получить 3-фосфоиндольное соединение. На схеме РО указывает на защитную группу. Защитная группа может быть удалена в соответствии с любым из способов, известных специалистам в данной области техники.

- 35 016267

Получение энантиомерно чистых 3-фосфоиндолов.

Получение 3-фосфоиндолов, по существу, в форме одного энантиомера может быть осуществлено путем расщепления рацемических смесей 3-фосфоиндолов, полученных при помощи любого подходящего способа или путем хирального синтеза из хиральных исходных материалов, реагентов или катализаторов. Соединения могут быть получены при помощи одного из описанных здесь способов или путем комбинации способов, если это необходимо. Например, хиральный синтез может быть комбинирован с химическим расщеплением с получением энантиомера 3-фосфоиндола, имеющего желаемую химическую и стереоизомерную чистоту. Дополнительно стереоизомеры 3-фосфоиндолов могут быть разделены путем хроматографии с использованием хиральной твердой фазы. Также рассматривается хроматографическое разделение диастереоизомерных производных стереоизомеров 3-фосфоиндолов.

Для расщепления смеси хиральных соединений может быть использован любой способ, который, по-видимому, подходит специлистам в данной области техники, например образование ионных диастереоизомерных солей (или координационных комплексов) с хиральными соединениями и разделение путем фракционной кристаллизации или других способов, образование диастереоизомерных соединений с хиральными дериватизирующими реагентами, разделение диастереоизомеров и превращение в чистые энантиомеры, разделение энантиомеров непосредственно в хиральных условиях на различных матрицах, включая сверхкритическую хроматографию и ферментативный гидролиз. Смотри, например, Е11е1 & ^|1еп. 1994, ЕНегеоскетФИу ой Огдашс Сотроипбз, 1оЬп ^11еу & 8опз, 1пс., №\ν Уогк (1994); ЬосЬтиПег, 1975, 1. СЬгота1одг., 113:(3) 283-302.

Например, диастереоизомерные соли могут быть образованы путем взаимодействия энантиомерно чистых хиральных оснований, таких как, например, цинхонидин, бруцин, хинин, эфедрин, стрихнин, αметил-в-фенилэтиламин (амфетамин) и т.п., с предложенными здесь соединениями. В некоторых воплощениях диастереоизомерную соль получают путем взаимодействия с алкалоидом, таким как цинхонидин. Диастереоизомерные соли могут быть индуцированы для разделения, например, путем фракционной кристаллизации или ионной хроматографии. Альтернативно, смесь хиральных соединений, которые разделяют, может взаимодействовать с одним энантиомером хирального соединения с образованием диастереоизомерной пары. Например, диастереоизомерные соединения могут быть образованы путем взаимодействия соединений по изобретению с энантиомерно чистыми хиральными дериватизирующими реагентами, такими как, например, метильные производные, с последующим разделением диастереоизомеров и гидролизом с получением свободного энантиомерно обогащенного соединения. Альтернативно, смесь хиральных соединений может быть разделена путем хроматографии с использованием хиральной стационарной фазы, смотри, например, СЫга1 Ыс.|шб СЬготаЮдгарйу, V.! Боидк, Еб. Скартап апб На11, №\ν Уогк, (1989); ОкатоЮ, 1990, 1. СЬготаЮдг. 513:375-378.

В некоторых воплощениях здесь предложены способы получения соединения по изобретению путем взаимодействия рацемической смеси с хиральным реагентом с последующим выделением получающегося в результате продукта и превращения в соединение по изобретению. В некоторых воплощениях предложены способы получения соединения формулы С, включающие стадии взаимодействия рацемической формы соединения с хиральным реагентом, таким как цинхонидин, выделения продукта реакции и превращения в соединение формулы С. В некоторых воплощениях здесь предложены способы получения соединения I, включающие стадию приведения в контакт рацемической формы 2-карбоксильного производного соединения I с (-)-цинхонидином, выделения продукта реакции и превращения в соединение I, например, с кислотой с последующим образованием амида. В некоторых воплощениях здесь предложены способы получения соединения II, включающие стадию приведения в контакт рацемической формы 2-карбоксильного производного соединения II с (+)-цинхонином, выделения продукта реакции и превращения в соединение II, например, с кислотой с последующим образованием амида. В некоторых воплощениях здесь предложены способы получения соединения III, включающие стадию приведения в контакт рацемической формы 2-карбоксильного производного соединения III с (-)-цинхонидином, выделения продукта реакции и превращения в соединение III, например, с кислотой с последующим образованием амида. В некоторых воплощениях здесь предложены способы получения соединения ΐν, включающие стадию приведения в контакт рацемической формы 2-карбоксильного производного соединения ΐν с (+)-цинхолином, выделения продукта реакции и превращения в соединение ΐν, например, с кислотой с последующим образованием амида. В других воплощениях здесь предложены альтернативные способы с другими хиральными реагентами, такими как эфедрин и эфедрина полугидрат.

В некоторых воплощениях здесь предложены способы получения предложенного здесь соединения путем повторного использования его противоположного энантиомера. В таких воплощениях рацемическую смесь расщепляют в соответствии с описанным здесь способом. Дополнительно к получению желаемого энантиомера противоположный энантиомер может быть повторно использован с увеличением выхода желаемого энантиомера. В реакции повторного использования соединение приводят в контакт с реагентом, способным рацемизировать соединение. Например, в некоторых воплощениях предложенное здесь фосфоиндольное соединение приводят в контакт с рацемизирующим реагентом, способным взаимодействовать с его фосфогруппой. В некоторых воплощениях рацемизирующий реагент представляет

- 36 016267 собой, например, кислоту, основание или галогенирующий реагент. В некоторых воплощениях рацемизирующий реагент представляет собой, например, оксалилхлорид. После контакта с рацемизирующим реагентом энантиомеры могут быть расщеплены в соответствии с любым из описанных здесь способов. В некоторых воплощениях соединение II может быть повторно использовано с получением соединения I. В некоторых воплощениях соединение IV может быть повторно использовано с получением соединения III. Примеры способов предложены ниже.

Приведенные далее способы описывают синтез энантиомерно чистых 3-фосфоиндолов формулы С или соединений I и III в качестве не ограничивающих объем изобретения примеров этих способов.

1. Динамическое кинетическое расщепление (ΌΚΚ).

В кинетическом расщеплении, начиная с рацемической смеси 8 (8_К и 8₈), один энантиомер предпочтительно вступает во взаимодействие с получением продукта Р_к с теоретическим максимальным выходом 50%. Если рацемизация может происходить одновременно с кинетическим расщеплением, то теоретически 100% рацемической смеси может быть превращено в один энантиомер (схема 7). Этот способ известен как динамическое кинетическое расщепление (ΌΚΚ).

З_я ----Ь------ Р„ 5р ----ίΐ------ р„ бас ||

8₅ Р₃ 3₅ —— Р₃ к_г»к₃ макс, выход Р_г=50%

Требуется расщепление Рр и 3₅ к_гас>к_г»к₃

Теоретический выход макс 100% в Рр

Стандартное кинетическое расщепление Динамическое кинетическое расщепление

Схема 7 (8 = субстрат, Р = продукт)

Проблемы, связанные со стандартным кинетическим расщеплением, заключаются в том, что возможен только максимальный теоретический выход 50%, и необходимо отделение желаемого продукта от значительного количества непревращенного субстрата. Для эффективного ΌΚΚ существует несколько специфических требований (81гаи§§, и.Т.; ЕеИег, и.; ЕаЬег, Κ. ТеДгайеОгоп: Лзушше/гу 1999, 70, 107).

1. Кинетическое расщепление должно быть необратимым для обеспечения высокой энантиоселективности.

2. Энантиомерное отношение (Е = к_к/к₈), по меньшей мере, должно быть больше чем приблизительно 20.

3. Для того чтобы избежать истощения 8_К, скорость рацемизации (к_гас), по меньшей мере, должна быть равна или больше, чем скорость реакции быстрого энантиомера (к_к).

4. В случае, когда селективности являются лишь умеренными, к_гас должна быть больше чем к_к приблизительно в 10 раз.

5. Любое спонтанное взаимодействие, включающее энантиомеры субстрата, а также рацемизация продукта должны отсутствовать.

Схема 8

В одном из воплощений синтез энантиомерно чистых 3-фосфоиндолов, хиральное разделение энантиомеров для того, чтобы вступать во взаимодействие с арилгалогенидом, осуществляют с хиральным фосфином, который представляет собой компонент палладиевого катализатора и приводит предпочтительно к соединению 4' (схема 8). Эта реакция сочетания на палладии представляет собой разновидность реакций сочетания на палладии, описанных на вышеприведенных схемах для получения рацемических смесей 3-фосфоиндолов. Хиральные фосфиновые лиганды могут представлять собой любой подходящий лиганд, который приводит к требуемой избирательности и скорости реакции при превращении 3фосфоиндола 3' в замещенный 3-фосфоиндол 4'. Хиральные фосфиновые лиганды могут представлять

- 37 016267 собой монодентатные или бидентатные лиганды. Не ограничивающие объем изобретения примеры хиральных фосфиновых лигандов включают Р-хиральные ферроценилфосфины, (Κ)-(+)-ΒΙΝΑΡ, (8)-(-)ΒΐΝΑΡ, (В,В)-СН1ВАРНО8 и (8,8)-СН1ВАРНО8.

В еще одном воплощении хиральное различие может быть введено путем добавления хиральной группы в рацемическую смесь 3-фосфоиндолов с получением смеси диастереоизомеров, которые вступают во взаимодействие с различными скоростями с нехиральной системой палладиевого катализатора (схема 9). Второй хиральный центр может быть добавлен в виде компонента заместителя Кд, группы Ζ или защитной группы ΡΘ. Хиральная группа не является ограниченной, и может быть использована любая группа, которая вызывает желаемую селективность реакции с приемлемой скоростью. Один из не ограничивающих объем изобретения примеров хиральной группы, которая может быть использована как К₃ в этой реакции, включает хиральный спирт, например (+) или (-)-ментол. Другие не ограничивающие объем изобретения примеры групп, которые могут быть использованы в качестве групп Ζ или ΡΘ на схеме 9, включают хиральный эфир или хиральный сульфон.

Когда К₃ является хиральным (К*), для превращения в желаемый 3-фосфоиндол хиральная группировка К* может быть удалена с использованием условий, описанных в ЮС 1975, 1523-1525, с использованием триалкилоксониевой соли с последующим кислотным отщеплением, с обращением конфигурации (схема 10)

Тот же самый способ 1ЖК может также может быть использован с рацемическим арил-Нфосфинатом и броминдолом в реакции перекрестного сочетания (схема 11)

- 38 016267

Схема специфического ΏΚΚ.

В следующем не ограничивающим объем изобретения примере способа ΏΚΚ, изображенном на схеме 12, катализатор Рб представляет собой палладия ацетат, хиральный фосфин представляет собой (К)-1-[(8)-2-ди-2-фурилфосфино)ферроценил]этилди-(2-метилфенил)фосфин, основание представляет собой диизоприлэтиламин, и растворитель представляет собой ацетонитрил. После нагревания при 100°С основное соединение получают с энантиомерным избытком 40%.

2. Химическое разделение 3-фосфоиндолов.

Разделение 3-фосфоиндольных свободных кислот может быть осуществлено путем химического разделения с использованием хирального основания. Хиральное основание демонстрирует селективность в отношении свободной кислоты одного из двух энантиомеров 3-фосфоиндолов, таким образом обеспечивая способы для разделения энантиомеров. Как описано в нижеприведенном примере, химическое разделение 2-карбоксильного производного 3-фосфоиндолов формул Ι/ΙΙ может быть осуществлено на стадии 1 с использованием (-)-цинхонидина 2 (схема 13, с получением желаемого энантиомера, первый элюируемый изомер при анализе путем хиральной ВЭЖХ) и (+)-цинхонин 3 (который может быть использован для удаления нежелаемого энантиомера от фильтрата второго элюируемого изомера при помощи анализа путем хиральной ВЭЖХ). Нежелаемый энантиомер может быть рацемизирован с получением большего количества вещества.

Стратегия также может быть применена с использованием хирального альфа-метилзамещенного бензиламина, как изображено на приведенной ниже схеме. Индол 1 галогенируют в положении 3, затем функциональную группу сложного эфира гидролизуют с получением индола 3. Хиральный (когда хиральность определена как 8 или К) альфа-метилзамещенный (или незамещенный) бензиламин затем вводят в карбоксильной функциональной группе индол 3 путем реакции сочетания пептидного типа. Альтернативно, 4 может быть получен путем образования кислого хлорида путем обработки кислотой 3 хлорирующим реагентом, затем добавления хирального альфа-метилзамещенного (или незамещенного) бензиламина. Промежуточное соединение 4 затем вводят в катализируемую палладием реакцию с получением смеси диастереоизомеров 5а и 5Ь. Смесь 5а и 5Ь может быть разделена при помощи силикагеля или перекристаллизации. 5Ь (К хиральность по фосфору) затем включают в реакцию отщепления для удаления хиральной группировки в положении 2 и получения чистого (К)-энантиомера 6. 5а может быть по- 39 016267 вторно использован путем превращения в фосфиновую кислоту путем расщепления (например, с ТМ8Вг), затем повторно этерифицирован с получением смеси 5 а и 5Ь, затем диастереоизомеры могут быть повторно разделены.

Пример 1.

Настоящий пример описывает получение соединения ΐΐΐ и соединения ΐ.

Реакция 7, 8.

В колбу в атмосфере аргона добавляли индол 7 (1 экв.), добавляли йод (1,98 экв.), твердый гидроксид калия (1 экв.) и безводный ДМФ (4,5 мл/ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 3 ч, затем добавляли воду и суспензию фильтровали через бумажный фильтр, твердый остаток сушили при пониженном давлении и несколько раз растирали/фильтровали в воде с получением после сушки при пониженном давлении 3-йодиндол 8. ¹Н ЯМР (СБС1₃, 400 МГц) δ 1.45 (1, 3Η), 4.50 (ς, 2Η), 7.20-7.40 (т, 2Η), 7.55 (8, 1Η), 9.40 (Ьг8, 1Η).

Реакция 8, 9.

К перемешиваемому раствору индола 8 (1 экв.) в дихлорметане (3,5 мл/ммоль) в атмосфере азота добавляли ди-трет-бутилдикарбонат (1,8 экв.) и 4-диметиламинопиридин (2 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 18 ч, затем добавляли фосфатный буфер (рН 7) и экстрагировали дихлормета

- 40 016267 ном. Объединенные органические слои сушили (№₂ВС)|) и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный остаток очищали путем флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: петролейный эфир/ΕΐОΑс: 1/1) с получением N-Βοс-защищенного индола 9. Светло-желтое твердое вещество. ¹Н ЯМР (б₆-ДМСО, 400 МГц) δ 1.34 (ί, I = 8.0 Гц, 3Н), 1.56 (з, 9Н), 4.35 (ς, I = 8.0 Гц, 2Н), 7.46 (б, 1=4.0 Гц, 1Н), 7.55 (άά, I = 12.0 и 4.0 Гц, 1Н), 8.0 (б, I = 12.0 Гц, 1Н), МС (ИРЭ^-) т/ζ = 448 (М-Н).

Реакция 9, 10.

Перемешиваемый раствор дегазируемого ДМФ с Ν₂, N-Βοс 3-йодиндолом 9 (1 экв.), Нарилфосфинатом 11 (1,1 экв.), триэтиламином (2 экв.) и Рб₂бЬа₃ (0,2 экв.) нагревали при 70 или 90°С до завершения реакции в соответствии с ТСХ или в соответствии с анализом ВЭЖХ. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и растворитель упаривали. Неочищенный остаток очищали путем флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: петролейный эфир/ΕΙΟΑ^ 8/2) с получением индолфосфината 10 (также в некоторой степени с индолом с удаленной защитой). Белое твердое вещество. 'Н ЯМР (б6-ДМСО, 400 МГц) δ 1.26 (ί, I = 7.1 Гц, 3Н), 1.58 (з, 9Н), 2.35 (з, 3Н), 3.70 (б, I = 11.5 Гц, 3Н), 4.29 (т, 2Н), 6.53 (б, I = 16.8 Гц, 1Н), 7.53 (бб, I = 9.0 и 2.2 Гц, 1Н), 7.65 (б, I = 13.3 Гц, 1Н), 7.70 (б, I = 16.8 Гц, 1Н), 7.76 (з, 1Н), 7.84 (б, I = 13.3 Гц, 1Н), 7.92 (б, I = 2.2 Гц, 1Н), 8.06 (б, I = 9.0 Гц, 1Н), МС (иРЭ⁺) т/ζ = 543 (МН⁺).

Реакция 12, 13.

Йодарил 12 (1 экв.), диметилформамид (1 мл/ммоль), триэтиламин (3 экв.) и анилина гипофосфористую соль* (1,25 экв.) помещали в пробирку под давлением и дегазировали Ν₂ в течение 15 мин. Затем добавляли палладия тетракис и эту смесь перемешивали при 85°С в течение ночи.

Растворитель выпаривали и добавляли воду (рН 5-6). Смесь подщелачивали NаНСΟ₃ до рН 8 и экстрагировали диэтиловым эфиром. Водный слой подкисляли НС1 1н. до рН 1 и экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои сушили, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением соединения #13.

Соль анилина синтезировали в соответствии со способом Μοηίскатр е! а1. (I. Αт. Скет. 8ο^, 2001, 123, 510-511).

Беловатое твердое вещество. 'Н ЯМР (б₆-ОМСО, 400 МГц) δ 6.54 (б, I = 16.8 Гц, 1Н), 7.46 (б, I = 549.8 Гц, 1Н), 7.57 (б, I = 13.6 Гц, 1Н), 7.71 (т, 3Н), ³¹Р ЯМР (б6-ДМСО, 121.49 МГц) δ 15.56, МС (ИРЭ^-) т/ζ = 208.

Реакция 13-11.

Пиридин (1 экв.) осторожно добавляли к интенсивно перемешиваемому раствору алкилхлорформиата (1 экв.) и арилфосфиновой кислоты 12 (1 экв.) в дихлорметане (2 мл/ммоль) при комнатной температуре. После прекращения выделения пузырьков газа раствор кипятили с обратным холодильником в течение 15 мин и затем давали возможность охладиться до комнатной температуры. Раствор выливали в 0,1 М соляную кислоту (1 мл/ммоль) и органический слой отделяли. После промывания водой и сушки над №₂ВС)| растворитель удаляли в вакууме с получением соединения #11. Белое твердое вещество. 'Н ЯМР (б₆-ДМСО, 400 МГц) δ 2.40 (з, 3Н), 3.71 (б, I = 12.2 Гц, 3Н), 6.58 (б, I = 16.8 Гц, 1Н), 7.52 (б, I = 576,0 Гц, 1Н), 7.63 (б, I = 14.0 Гц, 1Н), 7.71 (б, I = 16.8 Гц, 1Н), 7.80 (т, 2Н), МС (ИРЭ^-) т/ζ = 222.

Реакция 7, 8.

К перемешиваемому раствору индола 7 (1,0 экв.) в диметилформамиде (4,4 мл/ммоль) в атмосфере аргона добавляли йод (1,98 экв.) и гидроксид калия (1,0 экв.). Реакционную смесь перемешивали в тече

- 41 016267 ние 3 ч. Реакционную смесь гасили путем добавления воды (8,8 мл/ммоль) и осаждался продукт, который фильтровали и сушили. Твердое вещество повторно подвергали воздействию условий реакции (диметилформамид (4,4 мл/ммоль) в атмосфере аргона, йод (0,4 экв.) и гидроксид калия (0,2 экв.) и перемешивали в течение 1 ч для превращения оставшегося исходного вещества. Реакционную смесь гасили путем добавления воды (8,8 мл/ммоль) и осаждался продукт, который фильтровали и сушили с получением 3йодиндола 8. Бежевое твердое вещество. ²Н ЯМР (д6-ДМСО, 400 МГц) δ 1.39 (!, I = 7.2 Гц, 3Н), 4.40 (ς, I = 7.2 Гц, 2Н), 7.35-7.42 (т, 2Н), 12.66 (к, 1Н), ¹⁹Р ЯМР (46-ДМСО, 376 МГц) δ -126.87, МС (ИРЭ^-) т/ζ = 366.13 (М-Н)^- 100%, 368.15 (М-Н)^- 35%.

Реакция 8, 9.

К перемешиваемому раствору индола 8 (1 экв.) в дихлорметане (3,5 мл/ммоль) в атмосфере азота добавляли ди-трет-бутилдикарбонат (1,8 экв.) и 4-диметиламинопиридин (2 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 18 ч, затем добавляли фосфатный буфер (рН 7) и экстрагировали дихлорметаном. Объединенные органические слои сушили (№₂8О.|) и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный остаток очищали путем флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: петролейный эфир/Е!ОАс: 1/1) с получением Ν-Вос-защищенного индола 9. Белое твердое вещество. ²Н ЯМР (ά₆ЭМСО, 400 МГц) δ 1.35 (!, I = 7.1 Гц, 3Н), 1.57 (к, 9Н), 4.39 (ς, I = 7.1 Гц, 2Н), 7.64 (άά, I = 7.3 и 9.1 Гц, 1Н), 7.90 (ά, I = 9.1 Гц, 1Н), ¹⁹Р ЯМР ^-ДМСО, 377 МГц) δ -126.9, МС (ИРЭ, Е1⁺) т/ζ = 490 (\1-\а).

Реакция 9, 10.

Перемешиваемый раствор дегазированного ДМФ с Ν₂, Ν-Вос 3-йодиндола 9 (1 экв.), Нарилфосфината 11 (1,1 экв.), триэтиламина (2 экв.) и Рά₂άЬа₃ (0,2 экв.) нагревали при 70 или 90°С до завершения реакции в соответствии с анализом путем ТСХ или ВЭЖХ. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и растворитель упаривали. Неочищенный остаток очищали путем флэшхроматографии на силикагеле (элюент: петролейный эфир/Е!ОАс: 8/2) с получением индолфосфината 10 (также в некоторой степени с индолом с удаленной защитой). Белое твердое вещество. ²Н ЯМР (ά6ВМСО, 400 МГц) δ 1.34 (!, I = 7.1 Гц, 3Н), 1.62 (к, 9Н), 2.35 (к, 3Н), 3.66 (ά, I = 11.6 Гц, 3Н), 4.37 (ς, I = 7.1 Гц, 2Н), 6.51 (ά, I = 16.7 Гц, 1Н), 7.58-7.65 (т, 2Н), 7.69-7.77 (т, 3Н), 7.94 (ά, I = 9.5 Гц, 1Н), ¹⁹Р ЯМР (ά6ДМСО, 377 МГц) δ -116.0 (к, 1Р), ³¹Р ЯМР ^₆-ДМСО, 162 МГц) δ 23.42 (к, 1Р), МС (ИРЭ, Е1⁺) т/ζ = 561 (М+Н⁺).

Реакция 12, 13.

Йодарил 12 (1 экв.), диметилформамид (1 мл/ммоль), триэтиламин (3 экв.) и анилина гипофосфористую соль* (1,25 экв.) помещали в пробирку под давлением и дегазировали с Ν₂ в течение 15 мин. Затем добавляли палладия тетракис и эту смесь перемешивали при 85°С в течение ночи. Растворитель упаривали и добавляли воду (рН 5-6). Смесь подщелачивали №11СО₃ до рН 8 и экстрагировали диэтиловым эфиром. Водный слой подкисляли НС1 до рН 1 и экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои сушили, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением соединения #13. Соль анилина синтезировали в соответствии со способом Моп!скатр е! а1. (I. Ат. Скет. 8ос., 2001, 123, 510-511). Беловатое твердое вещество. ²Н ЯМР ^₆-ДМСО, 400 МГц) δ 6.54 (ά, I = 16.8 Гц, 1Н), 7.46 (ά, I = 549.8 Гц, 1Н), 7.57 (ά, I = 13.6 Гц, 1Н), 7.71 (т, 3Н), ³¹Р ЯМР ^-ДМСО, 121.49 МГц) δ 15.56, МС (ИРЭ) т/ζ = 208.

Реакция 13-11.

Пиридин (1 экв.) осторожно добавляли к интенсивно перемешиваемому раствору алкилхлорформиата (1 экв.) и арилфосфиновой кислоты 13 (1 экв.) в дихлорметане (2 мл/ммоль) при комнатной температуре. После прекращения выделения газа раствор кипятили с обратным холодильником в течение 15 мин и затем давали возможность охладиться до комнатной температуры. Раствор выливали в 0,1 М соляную кислоту (1 мл/ммоль) и органический слой отделяли. После промывания водой и сушки над №₂8О.| растворитель удаляли в вакууме с получением соединения #11. Белое твердое вещество. ²Н ЯМР (ά₆ДМСО, 400 МГц) δ 2.40 (к, 3Н), 3.71 (ά, I = 12.2 Гц, 3Н), 6.58 (ά, I = 16.8 Гц, 1Н), 7.52 (ά, I = 576,0 Гц, 1Н), 7.63 (ά, I = 14.0 Гц, 1Н), 7.71 (ά, I = 16.8 Гц, 1Н), 7.80 (т, 2Н), МС (ИРЭ^-) т/ζ = 222.

Некоторые соединения данного примера получали в соответствии с приведенной ниже схемой и способами.

- 42 016267

Схема 14. Сочетание Н-арилфосфината с 3-йодиндолом

Способ ΑΏ.

В колбу добавляли в атмосфере аргона индол 10 (1 экв.), добавляли йод (1,98 экв.), твердый гидроксид калия (1 экв.) и безводный ДМФ (4,5 мл/ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 3 ч, затем добавляли воду и суспензию фильтровали через бумажный фильтр, твердое вещество сушили при пониженном давлении и растирали/фильтровали в воде несколько раз с получением после сушки при пониженном давлении 3-йодиндола 61.

Способ АЕ.

К перемешиваемому раствору индола 10 (1 экв.) в дихлорметане (3,5 мл/ммоль) в атмосфере азота добавляли ди-трет-бутилдикарбонат (1,8 экв.) и 4-диметиламинопиридин (2 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 18 ч, затем добавляли фосфатный буфер (рН 7) и экстрагировали дихлорметаном. Объединенные органические слои сушили (Ыа₂8О₄) и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный остаток очищали путем флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: петролейный эфир/ЕЮАс: 1/1) с получением Ν-Вос-защищенного индола 62а.

Способ ΑΡ.

К перемешиваемому раствору индола 10 (1 экв.) в ДМФ (3,5 мл/ммоль) в атмосфере азота и охлажденному до 0°С (ледяная баня) порциями добавляли гидрид натрия (1,2 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 15 мин до прекращения выделения газа и по каплям добавляли 4-метоксибензилхлорид. Реакционную смесь перемешивали в течение 18 ч, затем при 0°С добавляли небольшое количество воды. Реакционные среды разбавляли водой/фосфатным буфером (рН 7). Водный слой экстрагировали этилацетатом и органические слои промывали водой, сушили (Ыа₂8О₄) и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный остаток очищали путем флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: петролейный эфир/ЕЮАс: от 98/2 до 1/1) с получением Ν-пара-метоксибензилзащищенного индола 62Ь.

Способ АО.

К перемешиваемому и охлажденному (приблизительно до 0°С) раствору этилиндол-2-карбоксилата 10 (1 экв.) в ДМФ (2 мл/ммоль) в атмосфере Ν₂ порциями добавляли ΝαΗ (60% в масле, 1,2 экв.). После прекращения выделения газа добавляли бензолсульфонилхлорид (1,2 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение приблизительно 1 ч (контроль путем ТСХ (тонкослойной хроматографии), элюент дихлорметан); затем осторожно добавляли небольшое количество воды и ДМФ выпаривали. Неочищенный остаток растворяли в этилацетате и промывали водой и рассолом. После сушки и выпаривания растворителей соединение очищали путем хроматографии на силикагеле (элюент: С^^/ЕЮАс от 9/1 до 7/3) с получением Ν-фенилсульфонилиндола 62с.

Способ АН.

К перемешиваемому раствору индола 10 (1 экв.) в ТГФ (3,5 мл/ммоль) в атмосфере азота добавляли трет-бутоксид калия (1,5 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 15 мин, затем добавляли бензоилхлорид (1,2 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 18 ч, затем добавляли воду. ТГФ выпаривали при пониженном давлении и водный слой трижды экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои сушили (Να₂8Ο₄) и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный остаток очищали путем флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: петролейный эфир/ЕЮАс: 3/1) с получением Ν-Βζ-защищенного индола 62ά.

Способ Αΐ.

Перемешиваемый раствор дегазированного ДМФ с Ν₂, Ν-защищенного 3-йодиндола 62 (1 экв.), Нарилфосфината 23 (К=Ме или Е1) (1,1 экв.), триэтиламина (2 экв.) и Рб₂дЬа₃ (0,2 экв.) нагревали при 70

- 43 016267 или 90°С до завершения реакции в соответствии с анализом путем ТСХ или ВЭЖХ. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и растворитель упаривали. Неочищенный остаток очищали путем флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: типично петролейный эфир/Ε!ΟΑс: 8/2) с получением индолфосфината 63 (внимание, когда РО=Вос, получали смесь Вос защищенного соединения и индольного соединения с удаленной защитой).

Способ ΑΙ.

К охлажденному до -90°С раствору (баня ацетон/жидкий азот) броминдола 11 (1 экв.) в ТГФ (5 мл/ммоль) в атмосфере азота по каплям добавляли н-бутиллитий (2,5 М в гексанах, 1,1 экв.), поддерживая температуру приблизительно -90°С. После окончания добавления реакционные среды перемешивали в течение 5 мин при той же самой температуре и по каплям добавляли хлордиэтилфосфит (1 экв.). Реакционной смеси давали возможность нагреться до -20°С и затем быстро промывали небольшим объемом рассола. Органический слой затем немедленно добавляли к перемешиваемому раствору ΗΟ1 0,5 М, и смесь перемешивали в течение 1 ч. После декантации водный слой несколько раз экстрагировали ΕιΟΑγ. Объединенные органические слои сушили (Nа₂8Ο₄), затем концентрировали при пониженном давлении и маслянистый остаток очищали путем флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: ДХМ/Ε!ΟΑс: 95/5) с получением индол 3-Н-фосфината 64.

Способ ΑΗ

К раствору индола 3-Н-фосфината 64 или 65 в атмосфере Ν₂ в дегазированном ацетонитриле добавляли 3-йод-5-метилциннамонитрил (1,1 экв.), Ε!₂Ν (1 экв.) и палладия тетракис(трифенилфосфин) (0,2 экв.). Реакционную смесь нагревали при 100°С до прекращения реакции (контроль при помощи ВЭЖХ). Реакционную смесь охлаждали и растворитель упаривали при пониженном давлении. Неочищенный остаток затем очищали путем флэш-хроматографии на силикагеле с получением 3-Н-фосфината 63 или 66.

Способ ΑΜ.

В пробирке под давлением индол 3-Н-фосфинат 64 (1 экв.) растворяли в метаноле, раствор охлаждали до 0°С, затем насыщали аммиаком. Реакционную смесь затем нагревали при 50°С под давлением в течение 18 ч. После охлаждения растворители упаривали. Добавляли воду и осуществляли экстракцию ΕιΟΑγ. Органические слои сушили (Ν₂8Ο₄) и упаривали в вакууме. Остаток растирали в ацетонитриле и после фильтрации получали 3-Н-фосфината индола карбоксамид 65.

Промежуточное соединение 62Ь.

Этил-1 -(4-метоксибензил)-5-хлор-3-йод-1 Н-индол-2-карбоксилат.

МеО

Промежуточное соединение 62Ь синтезировали в соответствии со способом ΑΕ. Белое твердое вещество, ¹Н ЯМР (4₆-ДМСО, 400 МГц) δ 1.33 (!, 1 = 7.1 Гц, 3Н), 3.67 (з, 3Н), 4.35 (ς, 1 = 7.1 Гц, 2Н), 5.73 (з, 2Η), 6.82 (ά, 1 = 8.7 Гц, 2Н), 6.97 (ά,), 7.40 (1 = 8.9 и 2.1 Гц, 1Н), 7.45 (ά, 1 = 2.1 Гц, 1Н), 7.72 (ά, 1 = 8.9 Гц, 1Н).

Промежуточное соединение 62с.

Этил-1-фенилсульфонил-5-хлор-3-йод-1 Η-индол-2-карбоксилат.

I

Промежуточное соединение 62с синтезировали в соответствии со способом ΑΟ. ¹Η ЯМР ^₆-ДМСО,

400 МГц) δ 1.40 (!, 3Η), 4.50 (Ьг ς, 2Η), 7.45 (з, 1Н), 7.52-7.80 (т, 4Η), 8.00 (т, 3Н). МС (ИРЭ, ЭИ^-) т/ζ = 488 (М-Н⁺).

Промежуточное соединение 62ά.

Этил-1-бензоил-5-хлор-3-йод-Ш-индол-2-карбоксилат.

Промежуточное соединение 62ά синтезировали в соответствии со способом АН. Светло-желтое твердое вещество, ¹Н ЯМР ^-ДМСО, 400 МГц) δ 1.03 (!, 1 = 9.4 Гц, 3Н), 3.88 (ς, 1 = 9.4 Гц, 2Н), 7.52-7.71 (т, 8Η). МС (ИРЭ, ЭИ⁺) т/ζ = 476 (М'\а'), МС (ИРЭ^-) т/ζ = 452.

- 44 016267

Промежуточное соединение 62е.

Метил-1-фенилсульфонил-5-хлор-4-фтор-3-йод-1Н-индол-2-карбоксилат

Промежуточное соединение 62е синтезировали в соответствии со способом АС. Бежевое твердое вещество, ²Н ЯМР (б6-ДМСО, 400 МГц) δ 1.41 (ί, I = 7.2 Гц, 3Н), 4.51 (ς, I = 7.2 Гц, 2Н), 7.63-7.71 (т, 3Н), 7.78-7.82 (т, 1Н), 7.89-7.91 (б, 1Н), 8.00-8.03 (т, 2Н), ¹⁹Р ЯМР (б6-ДМСО, 376 МГц.) δ -125.60 (б, 1Р). МС (ИРЭ^-) т/ζ = 506.12 (М-Н)^- 30%, 380.21 (М-Ι)^- 100%, 382.21 (М-Ι)^- 35%.

Промежуточное соединение 62к.

Метил-1-(4-метоксибензил)-4-фтор-5-хлор-3-йод-1 Н-индол-2-карбоксилат

МеО

Промежуточное соединение 62к синтезировали в соответствии со способом АР. Белое твердое вещество, 'И ЯМР (б6-ДМСО, 400 МГц) δ 1.31 (ί, I = 7.1 Гц, 3Н), 3.67 (5, 3Н), 4.34 (ς, I = 7.1 Гц, 2Н), 5.68 (5, 2Н), 6.82 (б, I = 8.6 Гц, 2Н), 6.96 (б, I = 8.6 Гц, 2Н), 7.45 (бб, I = 7.0 и 9.2 Гц, 1Н), 7.59 (б, I = 8.8 Гц, 1Н), ¹⁹Р ЯМР (б₆-ДМСО, 377 МГц) δ -126.1 (к, 1Р). МС (ИРЭ, ЭИ⁺) т/ζ = 487.

Соединение 63Ь. 1-Бензолсульфонил-5-хлор-3-[метил-3-((Е)-2-циановинил)-5-метилфенил]фосфиноил-1Н-индол-2карбоновой кислоты этиловый эфир

Соединение 63Ь синтезировали в соответствии со способом ΑΙ. Белое твердое вещество, ¹Н ЯМР (б₆-ДМСО, 400 МГц) δ 1.33 (ί, I = 7.1 Гц, 3Н), 2.65 (к, 3Н), 3.69 (б, I = 11.7 Гц, 3Н), 4.41 (т, 2Н), 6.52 (б, I = 16.7 Гц, 1Н), 7.53 (бб, I = 9.0 и 2.2 Гц, 1Н), 7.62 (б, I = 13.6 Гц, 1Н), 7.60-7.71 (т, 3Н), 7.76-7.81 (т, 3Н), 7.85 (б, I = 2.2 Гц, 1Н), 8.04-8.09 (т, 3Н). МС (ИРЭ⁺) т/ζ = 583 (МН⁺)

Соединение 63с.

1-(4-Метоксибензил)-5-хлор-3-[метил-3-((Е)-2-циановинил)-5-метилфенил]фосфиноил-1Н-индол-2карбоновой кислоты этиловый эфир

Соединение 63с синтезировали в соответствии со способом ΑΙ. Белое твердое вещество, ¹Н ЯМР (б₆-ацетон, 400 МГц) δ 1.18 (ί, I = 7.1 Гц, 3Н), 2.39 (к, 3Н), 3.74 (к, 3Н), 3.76 (б, I = 11.4 Гц, 3Н), 4.26 (т, 2Н), 5.63 (к, 2Н), 6.35 (б, I = 16.8 Гц, 1Н), 6.86 (б, I = 8.6 Гц, 2Н), 7.14 (б, I = 8.6 Гц, 2Н), 7.35 (бб, I = 9.0 и 2.2 Гц, 1Н), 7.61 (б, I = 16.8 Гц, 1Н), 7.67 (бб, I = 8.9 и 1.9 Гц, 1Н), 7.69 (к, 1Н), 7.75 (б, I = 13.2 Гц, 1Н), 7.91 (б, I = 13.2 Гц, 1Н), 8.24 (б, I = 2.2 Гц, 1Н). МС (ИРЭ⁺) т/ζ = 563 (МН⁺).

Соединение 63Г.

1-(трет-Бутилкарбонат)-5-хлор-4-фтор-3-[метил-3-((Е)-2-циановинил-5-метилфенил)фосфиноил]1Н-индол-2-карбоновой кислоты этиловый эфир

- 45 016267

Соединение 63Г синтезировали в соответствии со способом Αΐ. Белое твердое вещество, ¹Н ЯМР (б6-ДМСО, 400 МГц) δ 1.34 (!, 1 = 7.1 Гц, 3Н), 1.62 (з, 9Н), 2.35 (з, 3Н), 3.66 (б, 1 = 11.6 Гц, 3Н), 4.37 (ς, 1 = 7.1 Гц, 2Н), 6.51 (б, 1 = 16.7 Гц, 1Н), 7.58-7.65 (т, 2Η), 7.69-7.77 (т, 3Н), 7.94 (б, 1 = 9.5 Гц, 1Η), ¹⁹Р ЯМР (б6-ДМСО, 377 МГц) δ -116.0 (з, 1Р), ³¹Р ЯМР (б6-ДМСО, 162 МГц) δ 23.42 (з, 1Р). МС (ИРЭ, ЭИ⁺) т/ζ = 561 (М+Н⁺).

Соединение 63д. 5-Хлор-4-фтор-3-[метил-3-((Е)-2-циановинил)-5-метилфенил]фосфиноил-1Н-индол-2-карбоновой кислоты этиловый эфир

Соединение 63д синтезировали в соответствии со способом Αΐ. Белое твердое вещество, ¹Н ЯМР (б6-ДМСО, 400 МГц) δ 1.24 (!, 1 = 7.1 Гц, 3Н), 2.35 (з, 3Н), 3.58 (б, 1 = 11.6 Гц, 3Н), 4.24 (ς, 1 = 7.2 Гц, 2Н), 6.49 (б, 1 = 16.7 Гц, 1Н), 7.38-7.82 (т, 6Η), 13.19 (Ьз, 1Η), ¹⁹Р ЯМР (б6-ДМСО, 376 МГц) δ -115.0 (з, 1р), ³¹Р ЯМР (б₆-ДМСО, 162 МГц) δ 25.24 (з, 1Р). МС (ИРЭ, ЭИ⁺) т/ζ = 461 (М+Н⁺).

Соединение 63Н.

1-(4-Метоксибензил)-5-хлор-4-фтор-3-[метил3-((Е)-2-циановинил-5-метилфенил)фосфиноил]-1Ниндол-2-карбоновой кислоты этиловый эфир

Соединение 63Н синтезировали в соответствии со способом Αΐ. Белое твердое вещество, ¹Н ЯМР (б6-ДМСО, 400 МГц) δ 1.20 (!, 1 = 7.1 Гц, 3Н), 2.35 (з, 3Н), 3.61 (б, 1 = 11.6 Гц, 3Н), 3.70 (з, 3Н), 4.28 (ς, 1 = 7.1 Гц, 2Н), 5.43 (б, 1 = 16.2 Гц, 1Н), 5.48 (б, 1 = 16.2 Гц, 1Н), 6.48 (б, 1 = 16.7 Гц, 1Н), 6.88 (б, 1 = 8.7 Гц, 2Н), 7.12 (б, 1 = 8.7 Гц, 2Н), 7.46 (бб, 1 = 6.8 и 8.8 Гц, 1Н), 7.55-7.79 (т, 5Η), ¹⁹Р ЯМР (б6-ДМСО, 377 МГц) δ -116.7 (з, 1Р), ³¹Р ЯМР (б₆-ДМСО, 162 МГц) δ 24.55 (з, 1Р). МС (ИРЭ, ЭИ⁺) т/ζ = 581 (М+Н⁺).

Промежуточное соединение 64а.

1-Бензолсульфонил-5-хлор-3-этоксигидрофосфинил-1Н-индол-2-карбоновой кислоты этиловый эфир

Промежуточное соединение 64а синтезировали в соответствии со способом ΑΡ Светло-желтое вязкое масло, ¹Н ЯМР (66-ДМСО, 300 МГц) δ 1.25 (!, 1 = 7.2 Гц, 3Н), 1.37 (!, 1 = 7.2 Гц, 3Н), 4.1 (т, 2Η), 4.46 (ς, 1 = 12 Гц, 3Н), 7.58 (бб, 1 = 9.0 и 2.1 Гц, 1Н), 7.71 (т, 2Н), 7.80 (б, 1 = 609.6 Гц, 1Н), 7.83 (т, 1н), 7.97 (б, 1 = 2.1 Гц, 1Н), 8.11 (т, 3Н), ³¹Р ЯМР (б₆-ДМСО, 162 МГц) δ 13.43. МС (ИРЭ⁺) т/ζ = 456 (МН⁺).

Промежуточное соединение 64Ь. 1-Бензолсульфонил-5-хлор-4-фтор-3-этоксигидрофосфинил-1Н-индол-2-карбоновой кислоты метиловый эфир

Промежуточное соединение 64Ь синтезировали в соответствии со способом Α1. Белое твердое вещество, ¹Н ЯМР (бб-ДМСО, 300 МГц) δ 1.20 (!, 1 = 6.9 Гц, 3Н), 3.99 (з, 3Н), 4.03 (т, 2Н), 4.10 (т, 2Н), 7.70

- 46 016267 (т, 4Н), 7.71 (т, 2Н), 7.79 (άά, I = 616.8 и 4.8 Гц, 1Н), 7.84 (т, 1Н), 7.96 (т, 1Н), ³¹Р ЯМР ^-ДМСО, 121.49 МГц) δ 12.42 (Ιρ__ρ=12.6 Гц). МС (ИРЭ⁺) т/ζ = 460 (МН⁺).

Соединение 64Г

5-Хлор-3- [этил-3 -((Е)-2-циановинил)-5-метилфенил] фосфиноил-1Н-индол-2-карбоновой кислоты этиловый эфир

н *

Соединение 63Г синтезировали в соответствии со способом АЬ. Белое твердое вещество, ¹Н ЯМР (фтДМСО, 400 МГц) δ 1.09 (ΐ, I = 7.1 Гц, 3Н), 1.26 (ΐ, I = 7.0 Гц, 3Н), 2.34 (δ, 3Н), 3.99 (т, 2Н), 4.16 (т, 2Н), 6.48 (ά, I = 16.5 Гц, 1Н), 7.39 (άά, I = 8.8 и 2.2 Гц, 1Н), 7.59 (т, 2Н), 7.71 (т, 3Н), 8.39 (ά, I = 2.2 Гц, 1Н), 12.93 (Ъг8, 1Н). МС (ИРЭ⁺) т/ζ = 597 (МН⁺).

Промежуточное соединение 65а.

5-Хлор-3-метоксигидрофосфинил-1 Н-индол-2-карбоксамид

Промежуточное соединение 65а синтезировали в соответствии со способом АМ. Белое твердое вещество, ¹Н ЯМР ^-ДМСО, 300 МГц) δ 3.71 (ά, I = 12.6 Гц, 3Н), 7.35 (άά, I = 8.7 и 2.1 Гц, 1Н), 7.60 (άά, I = 8.7 и 1.8 Гц, 1Н), 7.85 (ά, I = 2.1 Гц, 1Н), 7.99 (άά, I = 616.8 и 5.4 Гц 1Н), 8.00 (Ъг8, 1н), 9.28 (Ъг8, 1Н), 12.71 (Ьг8, 1Н), ³¹Ρ ЯМР ^₆-ДМСО, 121.49 МГц) δ 22.38. МС (ИРЭ’) т/ζ = 271 (М-Н).

Промежуточное соединение 65Ъ.

5-Хлор-4-фтор-3-метоксигидрофосфинил-1Н-индол-2-карбоксамид

Промежуточное соединение 65Ъ синтезировали в соответствии со способом АМ. Белое твердое вещество, ¹Н ЯМР (б₆-ДМСО, 300 МГц) δ 3.72 (ά, I = 13.2 Гц, 3Н), 7.45 (т, 2Н), 7.99 (άά, I = 616.8 и 5.4 Гц 1Н), 8.08 (Ъг8, 1Н), 9.96 (Ъг8, 1Н), 13.0 (Ъг8, 1Н), ³¹Р ЯМР ^-ДМСО, 121.49 МГц) δ 22.79 (άά, I = 28.8 и 4.6 Гц). МС (ИРЭ’) т/ζ = 289 (М-Н).

Соединение 66а.

5-Хлор-3-[метил-3-((Е)-2-циановинил)-5-метилфенил]фосфиноил-1Н-индол-2-карбоксамид

Н '

Соединение 66а синтезировали в соответствии со способом АЬ. Белое твердое вещество, ¹Н ЯМР (СПС13, 300 МГц) δ 2.40 (δ, 3Н), 3.88 (ά, I = 11.7 Гц, 3Н), 5.89 (ά, I = 16.5 Гц, 1Н), 5.97 (Ъг8, 1Н), 7.33-7.67 (т, 7Н), 10.46 (δ, 1Н), 10.89 (Ъг8, 1Н), ³¹Р ЯМР (СПС13, 121.49 МГц) δ 31.54. МС (ИРЭ⁺) т/ζ = 414 (МН⁺).

Соединение 66Ъ.

5-Хлор-4-фтор-3-[метил-3-((Е)-2-циановинил)-5-метилфенил]фосфиноил-1Н-индол-2-карбоксамид

Соединение 66Ъ синтезировали в соответствии со способом АЬ. Белое твердое вещество, ¹Н ЯМР (СПС13, 300 МГц) δ 2.42 (δ, 3Н), 3.88 (ά, 7=12.0 Гц, 3Н), 6.38 (ά, I = 16.5 Гц, 1Н), 7.20 (Ъг8, 1Н), 7.42 (άά, I = 8.8 и 6.7 Гц, 1Н), 7.61-7.66 (т, 2Н), 7.74 (т, 2Н), 7.89 (т, 1Н), 11.24 (δ, 1Н), 12.07 (Ъг8, 1Н), ³¹Р ЯМР (СПС13, 121.49 МГц) δ 30.29, ¹⁹Г ЯМР (фгДМСО, 282.4 МГц) δ -115.0. МС (иРЭ⁺) т/ζ = 432 (МН⁺).

- 47 016267

Промежуточные соединения 4а и 4Ь

К раствору 3-йод-5-хлориндол-2-карбоновой кислоты (1 экв.) в ДМФ (7 мл/ммоль) в атмосфере азота добавляли НОВ! (1 экв.), (В) или (З)-альфа-метил-пара-метоксибензиламин (1 экв.) и наконец ЕЭС1 (1 экв.). Реакционную среду перемешивали в течение 18 ч, затем добавляли воду. Осажденное твердое вещество фильтровали, промывали водой, солюбилизировали ЕЮАе, сушили над №₂8О₄ и упаривали при пониженном давлении. Неочищенный остаток очищали путем флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: петролейный эфир/Е1ОАс: от 95/5 до 8/2) с получением индола 4а или 4Ь.

4а: 5-хлор-3-йод-№-((8)-1-(4-метоксифенил)этил)-1Н-индол-2-карбоксамид. Беловатое твердое вещество, Ή ЯМР (б₆-ДМСО, 400 МГц) δ 1.48 (б, 1 = 7.0 Гц, 3Н), 3.73 (8, 3Н), 5.10 (т, 1Н), 6.90 (б, 1 = 8.8 Гц, 2Н), 7.27 (бб, 1 = 8.7 и 2.0 Гц, 1н), 7.35-7.38 (т, 3Н), 7.45 (б, 1 = 8.7 Гц, 1Н), 8.37 (б, 1 = 1.6 Гц, 1Н), 12.15 (Ьгб, 1Н), МС (ИРЭ⁺) т/ζ = 455 (МН⁺).

4Ь: 5-хлор-3-йод-И-((В)-1-(4-метоксифенил)этил)-1Н-индол-2-карбоксамид. Белое твердое вещество, ¹Н ЯМР (б₆-ДМСО, 400 МГц) δ 1.48 (б, 1 = 7.0 Гц, 3Н), 3.73 (8, 3Н), 5.10 (т, 1Н), 6.90 (б, 1 = 8.8 Гц, 2Н), 7.27 (бб, 1 = 8.7 и 2.1 Гц, 1Н), 7.35-7.38 (т, 3Н), 7.45 (б, 1 = 8.7 Гц, 1Н), 8.37 (б, 1 = 7.7 Гц, 1Н), 12.20 (Ьг8, 1Н), МС (ИРЭ⁺) т/ζ = 455 (МН⁺).

Промежуточные соединения 5с и 5б

Перемешиваемый раствор дегазированного ДМФ с Ν₂, 3-йодиндол 4Ь (1 экв.), Н-арилфосфинат #11 (1,1 экв.), триэтиламин (2 экв.) и Рб₂бЬа₃ (0,2 экв.) нагревали при 70°С до завершения реакции в соответствии с анализом путем ТСХ или ВЭЖХ. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и растворитель выпаривали. Получающиеся диастереоизомеры разделяли путем флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: петролейный эфир/Е1ОАс: от 9/1 до 1/1) с получением последовательно фосфината 5с и 5б.

5с: (В)-метил-3-((Е)-2-циановинил)-5-метилфенил(2-((В)-1-(4-метоксифенил)этилкарбамоил)-5хлор-1Н-индол-3-ил)фосфинат. Белое твердое вещество, ¹Н ЯМР (б₆-ДМСО, 400 МГц) δ 1.48 (б, 1 = 6.8 Гц, 3Н), 2.24 (8, 3Н), 3.73 (8, 3Н), 3.75 (б, 1 = 11.8 Гц, 3Н), 5.14 (т, 1Н), 6.52 (б, 1 = 16.8 Гц, 1Н), 6.91 (б, 1 = 8.5 Гц, 2Н), 7.30 (бб, 1 = 8.5 и 2.1 Гц, 1Н), 7.36 (б, 1 = 8.5 Гц, 2Н), 7.56 (бб, 1 = 8.8 и 1.5 Гц, 1Н), 7.61 (т, 2Н), 7.48 (бб, 1 = 2.2 и 8.9 Гц, 1Н), 7.70 (б, 1 = 16.8 Гц, 1Н), 7.77 (8, 1Н), 7.80 (б, 1 = 13.0 Гц, 1Н), 11.12 (б, 1 = 6.8 Гц, 1Н), 12.76 (Ьг8, 1Н), МС (ИРЭ⁺) т/ζ = 548 (М+Н⁺).

5б: (8)-метил-3-((Е)-2-циановинил)-5-метилфенил (2-((В)-1 -(4-метоксифенил)этилкарбамоил)-5хлор-1Н-индол-3-ил)фосфинат. Белое твердое вещество, ¹Н ЯМР (б₆-ДМСО, 400 МГц) δ 1.48 (б, 1 = 7.1 Гц, 3Н), 2.24 (8, 3Н), 3.72 (8, 3Н), 3.79 (б, 1 = 11.5 Гц, 3Н), 5.14 (т, 1Н), 6.42 (б, 1 = 16.5 Гц, 1Н), 6.85 (б, 1 = 8.5 Гц, 2Н), 7.31 (бб, 1 = 2.1 и 8.8 Гц, 1Н), 7.34 (б, 1 = 8.5 Гц, 2Н), 7.44 (б, 1 = 13.2 Гц, 1Н), 7.58 (т, 2Н), 7.70 (т, 3Н), 11.11 (Ьг8, 1Н), 12.77 (Ьг8, 1н), МС (иРЭ⁺) т/ζ = 548 (М+Н⁺).

Соединение (В)-66а.

Раствор (В)-5е (1 экв.) в ацетонитриле в атмосфере азота охлаждали до -15°С (№С1/ледяная баня), затем по каплям добавляли церия аммония нитрат (7,5 экв.) в воде. Реакционную среду перемешивали в течение 30 мин при этой температуре. Реакционную среду разбавляли Е1ОАс и водой. Органический слой промывали водой, затем рассолом, сушили (№₂8О₂) и упаривали при пониженном давлении. Хиральная ВЭЖХ неочищенного образца продемонстрировала присутствие только одного энантиомерного соединения 66а: (В)-метил-3-((Е)-2-циановинил)-5-метилфенил(2-карбамоил-5-хлор-1Н-индол-3-ил)-3фосфината. Данные анализов приведены выше.

Альтернативно, индол 4 может быть Ν-защищен перед сочетанием с палладием с Нарилфосфинатом, как описано выше. После разделения Ν-защищенных диастереоизомеров оптически чистый карбоксамид 6 может быть получен путем последовательного удаления индол Ν-защитной группы и хиральной группировки.

Пример 2.

Химическое разделение 2-карбоксильного производного 3-фосфоиндолов формул ΐ/ΐΐ осуществляли

- 48 016267 на 280,82 г 1 с использованием (-)-цинхонидина 2 (схема 15, с получением требуемого энантиомера, первый элюируемый изомер в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ) и (+)-цинхонина 3 (который может быть использован для удаления нежелаемого энантиомера из фильтрата, второй элюируемый изомер в сответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ).

Исходное разделение в масштабе 280,82 г рацемической кислоты

1. Исходное разделение в масштабе 280,82 г рацемической кислоты.

Первое разделение - с использованием (-)-цинхонидина 2.

Свободную кислоту индола 1 (280,83 г, 675,61 моль, схема 15) суспендировали в ацетоне (4,2 л) и перемешивали при комнатной температуре в запаяной колбе. (-)-Цинхонидин 2 (198,89 г, 675,61 ммоль) добавляли одной порцией и через 1 ч обнаруживали прозрачный раствор. Через еще 1 ч обнаруживали осаждение белого твердого вещества и суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение еще 2 ч (в общем 4 ч). После этого осажденное твердое вещество выделяли путем фильтрования и промывали ацетоном (200 мл). Фильтрат концентрировали в вакууме и осажденное твердое вещество и остаток из фильтрата сушили в течение ночи в вакууме с получением 198,5 г твердого вещества (чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 96:4) и 308,4 г фильтрата (чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 20:80).

Кислотное расщепление соли.

Частично разделенную соль индола 1 (198,5 г, чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ 96:4) суспендировали в смеси этилацетата (3 л) и 1н. НС1 (3 л) и интенсивно перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. После этого реакционную смесь переносили в воронку и слои разделяли. Водный слой дополнительно экстрагировали этилацетатом (2 л) и органические экстракты, содержащие продукт, объединяли, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением частично разделенной кислоты в виде беловатого твердого вещества (107,34 г, чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 95:5)

Второе разделение - с использованием (-)-цинхонидина 2.

Частично разделенный кислотный индол 1 (107,34 г, 258,78 ммоль, чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 95:5) суспендировали в ацетоне (1,07 л) и перемешивали при комнатной температуре в запаяной колбе. (-)-Цинхонидин 2 (76,18 г, 258,78 ммоль) добавляли одной порцией и через 1 ч обнаруживали прозрачный раствор. После еще 1 ч обнаруживали осаждение белого твердого вещества и суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение еще 2 ч (в общем 4 ч). После этого осажденное твердое вещество выделяли путем фильтрации и промывали ацетоном (200 мл). Фильтрат концентрировали в вакууме, осажденное твердое вещество и остаток из фильтрата сушили в течение ночи в вакууме с получением 199,07 г твердого вещества (чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 98,6:1,4) и 13,83 г фильтрата (чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 55:45).

Кислотное расщепление соли.

Разделенную соль (199,07 г, чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 98,6:1,4) суспендировали в смеси этилацетата (3 л) и 1н. НС1 (3 л) и интенсивно перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. После этого реакционную смесь переносили в воронку и слои разделяли. Водный слой дополнительно экстрагировали этилацетатом (2 л) и органические экстракты, содержащие продукт, объединяли, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением разделенной кислоты в виде беловатого твердого вещества (98,08 г, чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 98,6:1,4).

²Н ЯМР (б₆-ДМСО, 400 МГц): δ 2.33 (3Н, 8, Аг-СН₃, 3.70 (3Н, ά, 1 = 11.72 Гц, Р-ОСН₃), 6.50 (1Н, б, 1

- 49 016267 = 16.84 Гц, СН=СИСИ), 7.34 (1Н, бб, I = 1.95 Гц, I 8.79 Гц), 7.57 (1Н, б, I = 8.56 Гц), 7.62-7.79 (3Н, т), 7.82-7.85 (1Н, т или б с I = 13.43 Гц), 7.98 (1Н, т), 13.02 (1Н, 8, СО₂Н), 14.36 (1Н, Ьг-8, ΝΗ); ³¹Р ЯМР (ф;ДМСО, 161.8 МГц): 533.42; т/ζ (ИРЭ⁺) 415 (М+Н)⁺.

Выделение.

Затем выделяли 98,08 г требуемого энантиомера кислоты (70% выделение на основе 140,42 г желаемого энантиомера кислоты из 280,83 г рацемической кислоты). Дополнительно 322,25 г соли из объединенных фильтратов после двух разделений 4 (308,4 г + 13,85 г) дополнительно обрабатывали для выделения дополнительного количества требуемого энантиомера.

2. Выделение из фильтрата.

Кислотное расщепление соли.

Частично разделенную объединенную соль 4 (322,25 г) суспендировали в смеси этилацетата (4,8 л) и 1н. НС1 (4,8 л) и интенсивно перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч (схема 16). После этого реакционную смесь переносили в воронку и слои разделяли. Водный слой дополнительно экстрагировали этилацетатом (4 л) и органические экстракты, содержащие продукт, объединяли, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением частично разделенной кислоты в виде беловатого твердого вещества (169,75 г, чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 22:78)

Первое разделение - с использованием (+)-цинхонина 3.

Частично разделенный кислотный индол (169,75 г, 409,25 моль, чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 22:78) суспендировали в ацетоне (3,06 л) и перемешивали при комнатной температуре в запаяной колбе. (+)-Цинхонин 3 (120,48 г, 409,25 ммоль) добавляли одной порцией и через 1 ч обнаруживали прозрачный раствор. Через 5 мин обнаруживали быстрое осаждение белого твердого вещества и вязкую суспензию, требующую дополнительного количества ацетона (1,14 л общий объем использованного ацетона = 4,2 л) для возможности перемешивания реакционной смеси при комнатной температуре в течение еще 3 ч (в общем 4 ч). После этого осажденное твердое вещество выделяли путем фильтрации и промывали ацетоном (150 мл). Фильтрат концентрировали в вакууме, осажденное твердое вещество и остаток из фильтрата сушили в течение ночи в вакууме с получением 324,2 г твердого вещества (чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 4,5:95,5) и 80,71 г фильтрата (чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 77:23).

Кислотное расщепление соли с получением нежелательного энантиомера.

Частично разделенную соль (324,2 г, чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 4,5:95,5) суспендировали в смеси этилацетата (4,8 л) и 1н. НС1 (4,8 л) и интенсивно перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. После этого реакционную смесь переносили в воронку и слои разделяли. Водный слой дополнительно экстрагировали этилацетатом (3 л) и органические экстракты, содержащие продукт, объединяли, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением разделенной кислоты в виде беловатого твердого вещества (122,14 г, чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 3,5:96,5). ¹Н ЯМР (б₆-ДМСО, 400 МГц): δ 2.33 (3Н, 8, Аг-СН₃), 3.70 (3Н, б, I = 11.72 Гц, Р-ОСН₃), 6.50 (1Н, б, I = 16.84 Гц, СН=СНСК),

7.34 (1Н, бб, I = 1.95 Гц, I = 8.79 Гц), 7.57 (1Н, б, I = 8.56 Гц), 7.62-7.79 (3Н, т), 7.82-7.85 (1Н, т или б с I = 13.43 Гц), 7.98 (1Н, т), 13.02 (1Н, 8, СО₂Н), 14.36 (1Н, Ьг-8, ΝΠ); ³¹Р ЯМР (б₆-ДМСО, 161.8 МГц): 533.42 т/ζ (иРЭ⁺) 415 (М+Н)⁺.

Кислотное расщепление соли с получением требуемого энантиомера из фильтрата.

Частично разделенную соль (80,71 г, чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 77:23) суспендировали в смеси этилацетата (1,21 л) и 1н. НС1 (1,21 л) и интенсивно перемешивали при комнатной температуре, в течение 2 ч. После этого реакционную смесь переносили в воронку, и слои разделяли. Водный слой дополнительно экстрагировали этилацетатом (1 л) и органические экстракты, содержащие продукт, объединяли, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением частично разделенной кислоты в виде беловатого твердого вещества

- 50 016267 (46,97 г, чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 77:23).

Частично разделенный кислотный индол (46,97 г, 113,24 ммоль, чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 77:23) суспендировали в ацетоне (470 мл) и перемешивали при комнатной температуре в запаяной колбе. (-)-Цинхонидин 2 (33,34 г, 113,24 ммоль) добавляли одной порцией и через 1 ч обнаруживали прозрачный раствор. После еще 1 ч обнаруживали осаждение белого твердого вещества и суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение еще 2 ч (в общем 4 ч). Осажденное твердое вещество выделяли путем фильтрации и промывали ацетоном (100 мл). Фильтрат концентрировали в вакууме и твердый остаток из фильтрата сушили в течение ночи в вакууме с получением 48,5 г твердого вещества (чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 97,5:2,5) и 33,7 г фильтрата (чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 39:61).

Частично разделенную соль (48,5 г, чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 97,5:2,5) суспендировали в смеси этилацетата (728 мл) и 1н. НС1 (728 мл) и интенсивно перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. После этого реакционную смесь переносили в воронку, и слои разделяли. Водный слой дополнительно экстрагировали этилацетатом (700 мл) и органические экстракты, содержащие продукт, объединяли, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением разделенной кислоты в виде беловатого твердого вещества (25,87 г, чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 97,4:2,6); *Н ЯМР (б₆-ДМСО, 400 МГц): δ 2.33 (3Н, з, ЛгСНэ) 3.70 (3Н, б, I = 11.72 Гц, Р-ОСН3), 6.50 (1Н, б, I = 16.84 Гц, СН=СНСМ

7.34 (1Н, бб, I = 1.95 Гц, I = 8.79 Гц), 7.57 (1Н, б, I = 8.56 Гц), 7.62-7.79 (3Н, т), 7.82-7.85 (1Н, т или б с I = 13.43 Гц), 7.98 (1Н, т), 13.02 (1Н, з, СО2Н), 14.36 (1Н, Ьг-з, Ν^; ³¹Р ЯМР (б6-ДМСО, 161.8 МГц): 533.42; т/ζ (ИРЭ⁺) 415 (М+Н)⁺.

Выделение.

Таким образом, 25,87 г требуемого энантиомера выделяли из фильтрата.

Общее выделение требуемого энантиомера кислоты

98,08 г + 25,87 г = 123,95 г (без возможных 140,42 г из 280,83 г рацемической кислоты) = 88% выход.

Пример 3.

Химическое разделение 3-фосфоиндолов формул ΐΐΐ/ΐν.

Таким образом, разделение индола свободной кислоты формул ΐΐΐ/ΐν далее осуществляли на 432,6 г 5 с использованием (-)-цинхонидина 2. Этот способ изображен на схеме 17 ниже.

Исходное разделение в масштабе 432,6 г рацемической кислоты.

Схема 17. Экспериментальный способ.

1. Исходное разделение в масштабе 432,6 г рацемической кислоты.

Разделение - с использованием (-)-цинхонидина 2.

Индол свободной кислоты 5 (432,6 г, 1,0 моль) суспендировали в ацетоне (7,79 л) и перемешивали при комнатной температуре в запаяной колбе. (-)-Цинхонидин 2 (294,39 г, 1,0 моль) добавляли одной порцией и суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч. После этого твердое вещество (не наблюдают осаждение, суспензия всегда присутствует в этом масштабе) выделяли путем фильтрации и промывали ацетоном (300 мл). Фильтрат концентрировали в вакууме и твердый остаток из фильтрата сушили в течение ночи в вакууме с получением 343,2 г твердого вещества (чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 98:2) и 420,52 г фильтрата (чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 9:91).

Кислотное расщепление соли.

Частично разделенную соль индола 5 (343,2 г, чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ 98:2) суспендировали в смеси этилацетата (5,2 л) и 1н. НС1 (5,2 л) и интенсивно перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. После этого реакционную смесь переносили в воронку и слои

- 51 016267 разделяли. Водный слой дополнительно экстрагировали этилацетатом (2,7 л) и органические экстракты, содержащие продукт, объединяли, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением разделенной кислоты в виде беловатого твердого вещества (145,44 г, чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 98,4:1,6). ¹Н ЯМР 5_Н (400 МГц, д₆-ДМСО):

2.35 (3Н, 8, Лг-СИз), 3.78 (3Н, ά, РОСН₃), 6.52 (1Н, ά, СИ=СИСХ), 7.46 (2Н, ά, Аг-Н), 7.66 (1Н, ά, СН=СНСХ), 7.69, 7.81 (2Н, 2 х ά, Н-6, Н-7), 7.77 (1Н, 8, Аг-Н), 13.63 (1Н, 8, Ν-Н), 15.70 (1Н, Ьг-8, СООН); ³¹Р ЯМР δΡ (162 МГц, ά6-ДМСО): 36.44 (1Р, 8); ¹⁹Г ЯМР δΡ (376 МГц, ά₆-ДМСО): -114.27 (1Г, 8); т/ζ (ИРЭ⁺): 433.0 (МН⁺, 100%), 435.0 (МН⁺, 35%).

Выделение.

Таким образом, выделяли 145,44 г требуемого энантиомера кислоты (68% выделение основано на 216,3 г имеющегося энантиомера кислоты из 432,6 г рацемической кислоты). Кроме того, 420,52 г соли из фильтрата дополнительно обрабатывали для выделения дополнительного требуемого энантиомера.

2. Выделение из фильтрата.

Кислотное расщепление соли.

Частично разделенную объединенную соль 4 (420,52 г) суспендировали в смеси этилацетата (6,31 л) и 1н. НС1 (6,31 л) и интенсивно перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч (схема 18). После этого реакционную смесь переносили в воронку и слои разделяли. Водный слой дополнительно экстрагировали этилацетатом (3 л) и органические экстракты, содержащие продукт, объединяли, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением частично разделенной кислоты в виде беловатого твердого вещества (222,7 г, чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 9:91).

Выделение требуемого энантиомера из фильтрата

Частично разделенный кислотный индол (222,7 г, 409,25 моль, чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 9:91) суспендировали в ацетоне (4,38 л) и перемешивали при комнатной температуре в запаяной колбе. (+)-Цинхонин 3 (120,48 г, 409,25 ммоль) добавляли одной порцией и через 1 ч обнаруживали прозрачный раствор. Через еще 5 мин обнаруживали быстрое осаждение белого твердого вещества и вязкую суспензию, требующую дополнительного количества ацетона (0,5 л общий объем использованного ацетона = 4,88 л) для обеспечения перемешивания реакционной смеси при комнатной температуре в течение еще 3 ч (в общем 4 ч). После этого осажденное твердое вещество выделяли путем фильтрации и промывали ацетоном (400 мл). Фильтрат концентрировали в вакууме, осажденное твердое вещество и остаток из фильтрата сушили в течение ночи в вакууме с получением 360,6 г твердого вещества (чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 3:97) и 58,32 г фильтрата (чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 84:12).

Частично разделенную соль (360,6 г, чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 3:97) суспендировали в смеси дихлорметана (5,4 л) и 1н. НС1 (5 л) и интенсивно перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. После этого реакционную смесь переносили в воронку и слои разделяли. Водный слой дополнительно экстрагировали дихлорметаном (2 л) и органические экстракты, содержащие продукт, объединяли, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением разделенной кислоты в виде беловатого твердого вещества (210,0 г, чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 2:98). ¹Н ЯМР δ_κ (400 МГц, ά₆-ДМСО):

2.35 (3Н, 8, АГ-СН3), 3.78 (3Н, ά, РОСН3), 6.52 (1Н, ά, СН=СНСК), 7.46 (2Н, ά, Аг-Н), 7.66 (1Н, ά, СН=СНС^, 7.69, 7.81 (2Н, 2χά, Н-6, Н-7), 1.11 (1Н, 8, Аг-Н), 13.63 (1Н, 8, Ν-Н), 15.70 (1Н, Ьг-8, СООН); ³¹Р ЯМР δР (162 МГц, ά6-ДМСО): 36.44 (1Р, 8); ¹⁹Г ЯМР δΡ (376 МГц, ά₆-ДМСО): -114.27 (1Г, 8); т/ζ (ИРЭ⁺): 433.0 (МН⁺, 100%), 435.0 (МН⁺, 35%).

- 52 016267

Частично разделенную соль (58,32 г, чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 84:12) суспендировали в смеси дихлорметана (875 мл) и 1н. Ηί,Ί (875 мл) и интенсивно перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. После этого реакционную смесь переносили в воронку и слои разделяли. Водный слой дополнительно экстрагировали дихлорметаном (400 мл) и органические экстракты, содержащие продукт, объединяли, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением частично разделенной кислоты в виде беловатого твердого вещества (36,65 г, чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 88:12).

Частично разделенный кислотный индол (36,65 г, 85,0 ммоль, чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 88:12) суспендировали в ацетоне (367 мл) и перемешивали при комнатной температуре, в запаяной колбе. (-)-Цинхонидин 2 (25,02 г, 85,0 ммоль) добавляли одной порцией и через 1 ч обнаруживали прозрачный раствор. После еще 1 ч обнаруживали осаждение белого твердого вещества и суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение еще 2 ч (в общем 4 ч). Осажденное твердое вещество выделяли путем фильтрации и промывали ацетоном (100 мл). Фильтрат концентрировали в вакууме и твердый и остаток из фильтрата сушили в течение ночи в вакууме с получением 24,92 г твердого вещества (чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 99:1) и 36,65 г фильтрата (чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 49:51).

Частично разделенную соль (24,92 г, чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 99:1) суспендировали в смеси дихлорметана (374 мл) и 1н. Ηί,Ί (374 мл) и интенсивно перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. После этого реакционную смесь переносили в воронку и слои разделяли. Водный слой дополнительно экстрагировали дихлорметаном (200 мл) и органические экстракты, содержащие продукт, объединяли, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением разделенной кислоты в виде беловатого твердого вещества (13,02 г, чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 99:1). ¹Н ЯМР 5Н (400 МГц, (6-ДМСО): 2.35 (3Н, 8, Аг-СЩ), 3.78 (3Н, ά, ΡΟίΗ3), 6.52 (1Н, ά, ίΗ=ίΗίΝ), 7.46 (2Н, ά, Аг-Η), 7.66 (1Н, ά, 01=^0¾ 7.69, 7.81 (2Η, 2χά, Η-6, Η-7), 7.77 (1Η, 8, Аг-Η), 13.63 (1Η, 8, Ν-Η), 15.70 (1Η, Ьг8, СООЩ; ³¹Ρ ЯМР 5Р (162 МГц, (^ДОСО): 36.44 (1Ρ, 8); ¹⁹Ε ЯМР δ_Ρ (376 МГц, бб-ДМСО): -114.27 (1Ε, 8); т/ζ (ИРЭ⁺): 433.0 (ΜΗ⁺, 100%), 435.0 (ΜΗ⁺, 35%).

Выделение.

Таким образом, 13,02 г требуемого энантиомера выделяли из фильтрата.

145,44 г + 13,02 г = 158,46 г (без возможных 216,3 г из 432,6 г рацемической кислоты) = 73% выход.

Разделение свободной кислоты 3-фосфоиндола 6 осуществляли на 1,02 г соединения с использованием (1К,28)-эфедрина 7 и (18,2К)-эфедрина полугидрата 8 в 95% ЕΐΟΗ (схема 19). Принцип этого разделения является таким же, как описано выше с использованием цинхонидиновых оснований.

- 53 016267

Пример 4.

1. Первое разделение - с использованием (1К,28)-(-)-эфедрина 7.

Свободную кислоту 3-фосфоиндола 6 (1,2 г, 3,17 ммоль) суспендировали в 95% этаноле (12 мл) и перемешивали при комнатной температуре в запаяной колбе. (1К,28)-(-)-Эфедрин 7 (0,52 г, 3,17 ммоль) добавляли одной порцией и через 5 мин обнаруживали прозрачный раствор. Через 5 мин обнаруживали быстрое осаждение белого твердого вещества и перемешивание продолжали при комнатной температуре в течение 3 ч. После этого осажденное твердое вещество выделяли путем фильтрации и промывали 95% этанолом (2 мл). Фильтрат концентрировали в вакууме и осажденное твердое вещество и остаток из фильтрата сушили в течение ночи в вакууме с получением 558 мг осажденного твердого вещества (чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 14:86) и 706 мг фильтрата (чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 74:26).

Второе разделение.

Частично разделенную соль 6 (558 мг, чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ 14:86) суспендировали в 95% этаноле (12 мл) и перемешивали при комнатной температуре в запаяной колбе в течение 3 ч. После этого твердое вещество выделяли путем фильтрации и промывали 95% этанолом (2 мл). Фильтрат концентрировали в вакууме и осажденное твердое вещество и остаток из фильтрата сушили в течение ночи в вакууме с получением 236 мг твердого вещества (чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 1:99) и 197 мг фильтрата (чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 25:75).

Кислотное разделение соли.

Разделенную соль 6 (236 мг, чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ 1:99) суспендировали в смеси этилацетата (7 мл) и 1н. ΗΟ1 (7 мл) и интенсивно перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. После этого реакционную смесь переносили в воронку (дополнительное количество этилацетата (3 мл) и 1н. ΗΟ1 (3 мл) потребовалось для переноса материала из колбы) и слои разделяли. Водный слой дополнительно экстрагировали этилацетатом (2x6 мл) и органические экстракты объединяли, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением разделенной кислоты в виде белого твердого вещества (106 мг, чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 1:99, [α]_ο = -59,1°).

¹Н ЯМР (Й6-ДМСО, 400 МГц): δ 2.27 (6Н, з, 2 х Αγ-ΟΗ3), 3.71 (3Н, ά, I = 11.72 Гц, Р-ОСН3), 7.2-7.30 (1Н, т), 7.35-7.45 (т, 3Н), 7.57-7.6 (т, 1Н), 7.78-7.79 (т, 1Н), 12.99 (1Н, з, ΟΟ2Η), 14.73 (1Н, Ьг-з, ΝΗ); ³¹Р ЯМР (б6-ДМСО, 161.8 МГц): 535.41; т/ζ (ИРЭ⁺) 378 (М+Н)⁺.

2. Первое разделение - с использованием (18,2К)-(+)-эфедрина 8.

Индол свободной кислоты 6 (1,2 г, 3,17 ммоль) суспендировали в 95% этаноле (12 мл) и перемешивали при комнатной температуре в запаяной колбе. (18,2К)-(+)-Эфедрин 8 (0,55 г, 3,17 ммоль) добавляли одной порцией и через 5 мин обнаруживали прозрачный раствор. Через 5 мин обнаруживали быстрое осаждение белого твердого вещества и перемешивание продолжали при комнатной температуре в течение 3 ч. После этого осажденное твердое вещество выделяли путем фильтрации и промывали 95% этано

- 54 016267 лом (0,5 мл). Фильтрат концентрировали в вакууме и осажденное твердое вещество и остаток из фильтрата сушили в течение ночи в вакууме с получением 618 мг осажденного твердого вещества (чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 94:6) и 840 мг фильтрата (чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 25:75).

Второе разделение.

Частично разделенную соль (618 мг, чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ 94:6) суспендировали в 95% этаноле (12 мл) и перемешивали при комнатной температуре в запаяной колбе в течение 3 ч. После этого твердое вещество выделяли путем фильтрации и промывали 95% этанолом (0,5 мл). Фильтрат концентрировали в вакууме и осажденное твердое вещество и остаток из фильтрата сушили в течение ночи в вакууме с получением 250 мг твердого вещества (чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 100:0) и 127 мг фильтрата (чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 85:15).

Кислотное расщепление соли.

Разделенную соль 6 (250 мг, чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ 100:0) суспендировали в смеси этилацетата (7 мл) и 1н. 11С1 (7 мл) и интенсивно перемешивали при комнатной температуре, в течение 3 ч. После этого реакционную смесь переносили в воронку (дополнительное количество этилацетата (3 мл) и 1н. 11С1 (3 мл) потребовалось для переноса вещества из колбы) и слои разделяли. Водный слой дополнительно экстрагировали этилацетатом (2x6 мл), и органические экстракты объединяли, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением разделенной кислоты в виде белого твердого вещества (108 мг, чистота в соответствии с анализом путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 100:0, [α]ρ = +59.2°); 'И ЯМР (Й6-ДМСО, 400 МГц): δ 2.27 (6Н, з, 2хАгСН₃), 3.71 (3Н, й, I = 11.72 Гц, Р-ОСН₃), 7.2-7.30 (1Н, т), 7.35-7.45 (т, 3Н), 7.57-7.6 (т, 1Н), 7.78-7.79 (т, 1Н), 12.99 (1Н, з, ^Η), 14.73 (1Н, Ьг-з, ΝΗ); ³¹Р ЯМР (Й6-ДМСО, 161.8 МГц): 535.41; т/ζ (ИРЭ⁺) 378 (М+Н)⁺.

Выделение.

Общее выделение составляет 18% из рацемической кислоты 6 с использованием (1К,28)-эфедрина 7 или (18,2К)-эфедрина полугидрата 8, но без какой-либо оптимизации способа.

Пример 5.

Хиральный синтез 3-фосфоиндолов.

Синтез с оптически чистыми промежуточными соединениями, где хиральный центр полностью защищен или полностью обращен. В этом случае основание, используемое для перекрестного связывания (например, Εί₃Ν), не является достаточно сильным для того, чтобы дать возможность для рацемизации исходного Н-Р фосфината (в противоположность способу ΌΚΚ). Реакция перекрестного сочетания протекает с сохранением конфигурации. Расщепление ментилфосфината с использованием триалкилоксониевой соли с последующей обработкой кислотой протекает с обращением конфигурации (I. Огд. С1ет.,

Получение ментилфосфинатного соединения осуществляется в две стадии из арилгалогенидов или трифлатов (схема 21). Первая стадия представляет собой получение Н-фосфиновой кислоты в соответствии с описанными способами, такими как работа МоЫсйатр еί а1., I. Ат. С1ет. 8ос. 2001, 723:570-511 и МопКйатр еί а1., I. Огдапоте! С1ет. 2002, 643-644:154-163. Вторая стадия представляет собой реакцию 11е\\И1, такую как описанная в ТеЧайейгоп Ьей. 2003, 781-783.

- 55 016267

диастереоизомерной смеси, как описано в I. Αιη.

Второй подход синтеза ментилфосфината начинается также с арилгалогенида с получением дихлорфосфита с использованием способа, имеющегося в литературе (схема 22). Затем атака (-) или (+)ментола позволяет получить ментилфосфинат в виде Скет. δο^, 1967, 90, 3459-3465.

ментилхлорформиат пиридин/ДХМ

Разделение диастереоизомеров осуществляют путем кристаллизации с использованием или адаптацией условий, описанных в I. Αт. Скет. δο^, 1970, 92, 5809-5810, Неίе^οаίοт Скет1з1гу 1995, 6, 365-70, Кизз. I. Степ. Скет. 2005, 75, 656-657 (схема 23).

На схемах 24 и 25 изображен хиральный синтез 3-фосфоиндолов формул I и III с использованием данного подхода

Для аналитического разделения энантиомеров условия анализа путем хиральной ВЭЖХ представляют собой:

колонка: ΏΑΚΈβ ^ΗΑΕΡΑΚ® Αϋ-Н 5 мкм, 250x4,6 мм Ю;

- 56 016267 подвижная фаза А: метанол;

подвижная фаза В: ΙΓΑ (изопропиловый спирт)+0,05 мас.% ТФУ (трифторуксусная кислота); изократический: А/В (25/75);

скорость потока: 0,4 мл/мин;

обнаружение: РЭА макс. граф 210-400 нм;

энантиомер 1 ВУ (время удержания)=13,4 мин;

энантиомер 2 ВУ=19,6 мин;

Способ получения.

Инжекция 2 г рацемической смеси 6М403).

Колонка: ОАГСЕЬ СШКАЬРАК® АЭ 20 мкм, 260x50 мм Ι.Ώ.

Подвижная фаза: 50 этанол/50 метанол/0,1 диэтиламин (об./об./об.).

Скорость потока: 120 мл/мин.

Обнаружение: УФ 320 нм.

Энантиомер 1 ВУ=7,0 мин; энантиомер 2 ВУ=25,3 мин.

Еще один подход синтеза энантиомерно чистых 3-фосфоиндолов изображен в схемах 49 и 50.

Определение эффективности стереоконтроля для каждой стадии должно быть определено при помощи 31Р ЯМР и ВЭЖХ для подтверждения того, является ли предполагаемое удержание или обращение полным или обнаруживается ли смесь диастереоизомеров. Наиболее чувствительная стадия может представлять собой удаление защиты бора, требующее нагревание. С этой стадии измерение энантиомерного избытка требует применение колонки для хиральной аналитической ВЭЖХ.

Если конфигурация по фосфору на 100% контролируется на каждой стадии, единственный предшественник 4 может приводить также к двум различным энантиомерам 8 или 12 в зависимости от выбранного химического пути.

Пример 6.

Разделение диастереоизомерных промежуточных соединений.

Еще один способ получения энантиомерно чистых 3-фосфоиндолов основан на получении диастереоизомеров путем образования функциональных групп индолов с использованием хиральных реагентов. Применение хиральных аминокислот для получения диастереоизомерных 3-фосфоиндолов изображено на схеме 26. 5-Хиральность по атому углерода альфа-аминокислоты не меняется. Синтез осуществляют в соответствии со следующим:

Схема 26

Два диастереоизомера разделяют с использованием стандартной колонки диоксида кремния.

Эта стратегия может быть применена для получения, например, других диастереоизомерных амидов с энантиомерно чистыми бензиламинами или для получения диастереоизомерных сложных эфиров, а не амидов, которые могут быть расщеплены после диастереоизомерного разделения с высвобождением отделенного энантиомера. Этот подход изображен на схеме 27 ниже.

К °Αο^ζ

Индольная кислота

ΜβΟΗ.ΝΗ3 70’С

82%

С1

Диастереоизомерное разделение 1.ΝΗ3 ΜΒΟΗ.ΝΗ3

Разделенные энантиомеры

Пример 7.

- 57 016267

Получение соединения I

Условия:

ί. Вос₂О 3,0 экв., н-гептан, 90°С, 4 ч ίί. Η-Βυίί 3,1 экв, Ι₂ 3,5 эка, -80°С < Т < -75°С ίίί. 1. Конц. НС16,0 экв. 55°С; 2. 2М ЫаОН, 15°С ίν. ОАВСО, виноградная кислота, Рб{ОАс)₂ν. 1. СО1, ДМФ; 2. МеОН или ЕЮН νί. 1. №Н, ДМФ; 2. РИЗО₂С1 νίί. 1. №Н, ДМФ; 2. РН5О₂С1 νίίί. ϋΒϋΜΗ, ТГФ ίχ. 1. ИаН, ДМФ,'2. РИЗО₃С1 хМ*·⁰⁰¹· — оА^{еО й} ’

Альтернативно, этиловый эфир

Часть А. Синтез 3-броминдольного промежуточного соединения.

Соединение 102

4-Хлор-3-фторанилин (250,3 г, 1,719 моль) добавляли в четырехгорлую круглодонную колбу объемом 5 л, оборудованную верхним перемешивателем, обратным холодильником, колбонагревателем, температурным контроллером, датчиком внутренней температуры и каналом входа аргона. н-Гептан (2000 мл) и ди-трет-бутилдикарбонат (450,3 г, 2,064 моль) загружали в колбу. Смесь перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 15 мин, давая возможность для растворения большинства твердых веществ. Смесь нагревали до температуры дефлегмации в течение 4 ч в атмосфере аргона (осторожно: образование газообразного СО₂). Анализ реакционной смеси при помощи способа ВЭЖХ тест 20 (ТГФ:ΜеСN 1:1) указывал на полноту превращения исходного вещества (ВУ 4,57 мин) в один продукт (ВУ 6,17 мин). Реакционной смеси давали возможность охлаждаться до 50-55°С и двумя порциями переносили в одногорлую ВВР объемом 3 л. В общем, 1500 мл дистиллята удаляли путем концентрирования в вакууме при 45°С с получением окрашенного в персиковый цвет раствора с белыми кристаллами. Суспензии давали возможность охлаждаться до комнатной температуры при перемешивании в течение 1,5 ч. Колбу хранили при 4°С в течение 15 ч, после чего кристаллы фильтровали в вакууме и промывали охлажденным н-гептаном (400 мл).

После сушки при 35°С в вакууме в течение 7 ч получали очень мелкие белые кристаллы соединения 102 (393,1 г, выход 93%). Соединение 102: С₁₁Н₁зС1РNО₂ 245,68 г/моль. Анализ ВЭЖХ (тест 20, МеСЯ): ВУ 6.16 мин; чистота 99% @ 254 нм. т.пл.: 103-104°С. Ή ЯМР δ_Н (400 МГц, СОС1₃): 1.51 (9Н, 8, 3хСН₃), 6.56 (1Н, Ьг-8, Ν-Н), 6.94, 7.25, 7.35 (3х1Н, 3хт, 3хАг-Н).

Соединение 103

Соединение 102 (80,2 г, 0,326 моль) добавляли в четырехгорлую круглодонную колбу объемом 3 л, оборудованную верхним перемешивателем, датчиком внутренней температуры, добавляющей воронкой объемом 500 мл и каналом входа аргона. Безводный тетрагидрофуран (640 мл) загружали в колбу и охлаждали с использованием бани на основе сухого льда с жидким азотом, обеспечивая внутреннюю температуру -80°С<Т<-75°С все время в течение реакции. н-Бутиллитий (405 мл, 1,011 моль) переносили через канюлю в заполненную аргоном воронку и по каплям добавляли в раствор с минимальным разбрызгиванием в течение 2 ч. После окисления в течение 40 мин по каплям добавляли раствор йода (289,9 г, 1,142 моль) в безводном тетрагидрофуране (430 мл + 100 мл промывка) к охлажденной реакционной смеси, обеспечивая внутреннюю температуру -80°С<Т<-75°С в течение 3 ч.

Реакционной смеси давали возможность медленно нагреться до -30°С в течение 14 ч, после чего анализ путем ВЭЖХ в тесте 20 (образец гасили ЯаН8О₃ водн., разбавляли МеСЯ, затем МеСЯ слой разбавляли МеОН) указал на почти полное превращение исходного вещества (ВУ 6,17 мин, 1,6% при 254 нм) в один продукт (ВУ 6,73 мин).

- 58 016267

Постепенно добавляли раствор ΝΗ₄Ο (41,6 г в 160 мл воды) с последующим раствором №ΗδΟ₃(184,8 г в 560 мл воды), поддерживая Т<-10°С. Гасящей смеси давали возможность нагреться до 10°С при перемешивании в течение 1,5 ч.

После переноса смеси в одногорлую колбу 1370 мл ТГФ дистиллят удаляли и добавляли воду (500 мл). Смесь интенсивно перемешивали при 4°С в течение 15 ч и фильтровали. После промывания водой (400 мл) получали бежевое твердое вещество с бесцветным фильтратом, который не содержал продукт в соответствии с ВЭЖХ.

Твердое вещество растворяли в горячем (65°С) этаноле (700 мл) и фильтровали в горячем состоянии для удаления нерастворимого вещества (3,5 г, отсутствие продукта в соответствии с ВЭЖХ). Полученный фильтрат концентрировали при 45°С в вакууме до 150 мл, после чего твердые вещества начинали осаждаться. По каплям к смеси добавляли воду (32 мл), которую затем медленно охлаждали до 4°С в течение 1,5 ч. Фильтрация в вакууме, промывка при 4°С этанолом: водой 2:1 (250 мл) и сушка в вакууме при 40°С позволила получить соединение 103 в виде бледно-желтого твердого вещества (114,1 г, выход 94%). Соединение 103: ^ιΗ₁₂ΟΕΐΝΟ₂ 371,57 г/моль.

Анализ путем ВЭЖХ (тест 20, МеОН): ВУ 6,73 мин; чистота 99% @ 272 нм. т.пл.: 66-67°С. ¹Н ЯМР 0н (400 МГц, СВОД: 1.45 (9Н, з, 3хСН3), 7.27 (1Н, бб, Αγ-Η), 7.55 (1Н, ΐ, Αγ-Η), 8.70 (1Н, з, ^Ν-Η). ¹³С ЯМР 0_С (100 МГц, СОС1₃): 28.04 (С(СН₃)₃), 79.73 (С(СН₃)₃), 86.23, 86.49 (С-ΐ), 115.11, 115.32 (С-С1), 122.35, 122.38 (С-Ν), 129.89 (С-Н), 140.99, 141.02 (С-Н), 152.94 ^=Ο), 155.47, 157.87 (С-Е).

Соединение 104

Е

Соединение 103 (110,0 г, 0,296 моль) добавляли в четырехгорлую круглодонную колбу объемом 3 л, оборудованную верхним перемешивателем, обратным холодильником, водяной баней, добавляющей воронкой объемом 250 мл, датчиком внутренней температуры и каналом входа аргона. Этанол (900 мл) загружали в колбу и охлаждали до 5°С. Соляную кислоту (37%, 145,9 мл) по каплям добавляли, поддерживая внутреннюю температуру меньше 15 °С.

Смесь нагревали до 50-55°С в течение 2 ч, после чего анализ путем ВЭЖХ в тесте 20 (МеОН) указал на полное превращение исходного вещества (ВУ 6,73 мин) в один продукт (ВУ 5,44 мин). Реакционную смесь охлаждали до 5°С и постепенно добавляли раствор \а(')11 (готовили 80,0 г в 1000 мл воды, добавляли 865 мл), поддерживая температуру меньше 15°С, контролируя рН до нейтрального. Смесь переносили в одногорлую колбу и хранили при 4°С в течение 15 ч.

В общем 970 мл дистиллята удаляли путем концентрирования в вакууме при 35°С с получением бесцветного раствора с осаждением твердых веществ. Суспензии давали возможность охладиться до 4°С в течение 1 ч, после чего твердое вещество фильтровали в вакууме и промывали при 4°С этанолом: водой 1:4 (200 мл). После сушки при 35°С в вакууме в течение 72 ч получали соединение 104 с примесями (80 г, выход 99%, чистота 95% при 254 нм).

Твердое вещество растворяли в горячем (60°С) этаноле (450 мл) и фильтровали в горячем состоянии для удаления тонкодисперсного нерастворимого вещества. Полученный фильтрат концентрировали при 35°С в вакууме до 175 мл, после чего к смеси в течение 3-4 ч по каплям добавляли воду (70 мл), затем смесь медленно охлаждали до 4°С и перемешивали в течение еще 0,5 ч. Фильтрация в вакууме, промывка при 4°С этанолом:водой 3:2 (100 мл) и сушка в вакууме при 35°С позволила получить соединение 104 в виде оранжевых игл (70,5 г, выход 88%, чистота 98% при 272 нм). Второй выход вещества получали из маточного раствора в виде бледно-желтого твердого вещества (4,6 г, 5%, чистота 98% при 272 нм). Объединенный выход = 93%. Соединение 104: СбЩСГЕШ 271,45 г/моль. Анализ путем ВЭЖХ (тест 20, МеСХ): ВУ 5,44 мин; чистота 98% при 272 нм, т.пл.: 80.5-81°С. ИРЭ +уе: т/ζ 271.9 [М+Н]⁺ 65%; 312.9 [М+МеСЖИГ 100%. ¹Н ЯМР 0Н (400 МГц, б6-ДМСО): 5.69 (2Н, з, 2χΝ-Η), 6.55 (1Н, б, Αγ-Η), 7.18 (1Н, ΐ, Αγ-Η). ¹³С ЯМР 0С (100 МГц, б₆-ДМСО): 70.97, 71.24 (С-ΐ), 104.03, 104.25 (С-С1), 110.14, 110.17 (С-Н), 129.90 (С-Н), 150.09, 150.14 (С-Ν), 155.45, 157.82 (С-Е). ¹⁹Е ЯМР δ_Ε (376 МГц, б₆-ДМСО): -91.60 (1Е,б)

Соединение 105

Р

Соединение 104 (74,5 г, 0,275 моль) добавляли в четырехгорлую круглодонную колбу объемом 2 л, оборудованную верхним перемешивателем, обратным холодильником, колбонагревателем, температурным контроллером, добавляющей воронкой объемом 250 мл, датчиком внутренней температуры и каналом входа аргона. Ν,Ν-Диметилформамид (575 мл) загружали в колбу при комнатной температуре. ^ΑΒСΟ (95,5 г, 0,851 моль) добавляли одной порцией и внутренняя температура снижалась до 15°С. Смесь перемешивали в течение 20 мин для осуществления растворения и раствор дегазировали путем

- 59 016267 интенсивного продувания через него аргона в течение 10 мин. Виноградную кислоту (57,33 мл, 0,824 моль) добавляли к коричневому раствору в течение 10 мин и внутренняя температура увеличивалась до 36°С. Раствор вновь дегазировали с аргоном в течение 10 мин и палладия ацетат (678 мг, 0,0030 моль) добавляли одной порцией.

Смесь нагревали до 100°С в течение 3 ч, после чего анализ путем ВЭЖХ в тесте 20 (МеСЫ, фильтровали) указывал на полное превращение исходного вещества (ВУ 5,44 мин) в один продукт (ВУ 3,64 мин). Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры в течение 15 ч и затем до 5°С. Постепенно добавляли раствор соляной кислоты (1,15н., 575 мл, затем 0,115н., 280 мл), поддерживая температуру меньше 10°С, контролируя рН до 3,5. Желтовато-коричневое твердое вещество осаждалось из раствора, и смесь перемешивали в течение еще 0,5 ч при 5°С. Твердое вещество фильтровали в вакууме и промывали 10°С водой (3x200 мл). После сушки при 40°С в вакууме в течение 36 ч получали соединение 105 (55,9 г, выход 95%). Соединение 105: Ο)Η₅αΤΝ0₂ 213,59 г/моль. Анализ путем ВЭЖХ (тест 20, МеСЫ): ВУ 3,63 мин; чистота 99% при 272 нм ИРЭ -уе: т/ζ 212.1 [М-Н]^- 10%; 168.1 [М-СООН]^-100% ¹Н ЯМР 0н (400 МГц, б6-ДМСО): 7.10, 7.11 (1Н, б, Аг-Η), 7.25-7.32 (2Н, т, 2хАг-й), 12.30, 13.33 (2х1Н, 2хк, Ν-Η, СОО-Η) ¹³С ЯМР 0с (100 МГц, б6-ДМСО): 102.45 (С-3), 108.76, 108.92 (С-9), 110.20, 110.24 (С-6), 116.88, 117.09 (С-5), 125.46 (С-7), 130.34 (С-2), 137.90, 138.00 (С-8), 149.76, 152.25 (С-4), 162.12 (С=О) ¹⁹Р ЯМР δ_Ρ (376 МГц, б6-ДМСО): -121.35 (1Р, б).

Соединение 106 ^С1хЬо^^с°^2Ме

Соединение 105 (55,9 г, 0,262 моль) добавляли в четырехгорлую круглодонную колбу объемом 5 л, оборудованную верхним перемешивателем, добавляющей воронкой, датчиком внутренней температуры и каналом входа аргона. Ν,Ν-Диметилформамид (695 мл) загружали в колбу при комнатной температуре в атмосфере аргона, перемешивали в течение 20 мин с получением коричневого раствора. Карбонилдиимидазол (51,0 г, 0,314 моль) добавляли одной порцией с получением коричневой суспензии. Смесь перемешивали в течение 1 ч в атмосфере аргона при комнатной температуре, после чего анализ путем ВЭЖХ в тесте 20 (МеОН с получением Ме эфира, фильтровали) указывал на полное превращение исходного вещества (ВУ 3,64 мин, 0,5%) в основной продукт (ВУ 5,48 мин) и промежуточное соединение (ВУ 4,77 мин). Добавляли дополнительное количество карбонилдиимидазола (0,43 г, 0,0026 моль) и Ν,Νдиметилформамида (45 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение еще 2 ч, после чего анализ путем ВЭЖХ в тесте 20 (МеОН с получением Ме эфира, фильтровали) указывал на полное превращение исходного вещества (ВУ 3,64 мин) в продукт (ВУ 5,48 мин).

Метанол (297 мл, 7,34 моль) добавляли к перемешиваемой реакционной смеси в атмосфере аргона при 24°С с получением мутной коричневой суспензии. Через 3 ч анализ путем ВЭЖХ в тесте 20 (МеСИ, фильтровали) указал на присутствие одного продукта (ВУ 5,48 мин). Реакционную смесь охлаждали с использованием ледяной бани и воду (2000 мл) добавляли в течение 0,5 ч, поддерживая внутреннюю температуру 15-20°С, с осаждением желтовато-коричневого твердого вещества. Твердое вещество фильтровали в вакууме и промывали при 5°С водой (2х400 мл). После сушки в воздухе твердое вещество суспендировали в дихлорметане (800 мл) и этилацетате (1600 мл) и сушили над безводным сульфатом натрия (400 г). Фильтрация через целит и элюция дихлорметаном (1000 мл) позволили получить прозрачный оранжевый раствор. Раствор концентрировали в вакууме при 30°С с получением суспензии кристаллов в оставшемся этилацетате (160 мл). Суспензию охлаждали до 5°С в ледяной бане в течение 15 мин. Фильтрация в вакууме, промывка при 4°С этилацетатом :н-гептаном 1:1 (2x100 мл), затем 1:3 (100 мл) и сушка в вакууме при 35°С позволила получить соединение 6 в виде длинных белых игл (37,3 г, выход 63%, чистота 99% при 272 нм). Второй выход вещества получали из маточного раствора в виде менее белых игл (5,3 г, 9%, чистота 98% при 272 нм). Объединенный выход = 72%. Соединение 106: ^οΗγΟΓΝ^ 227,62 г/моль. Анализ путем ВЭЖХ (тест 20, МеСК): ВУ 5,48 мин; чистота 99% при 272 нм, т.пл.: 216.5-218°С ¹Н ЯМР δχ (400 МГц, б6-ДМСО): 3.88 (3Н, к, СН3), 7.16 (1Н, к, Аг-Η), 7.27-7.35 (2Н, т, 2хАг-Я) 12.48 (1Н, к, Ν-Η) ¹³С ЯМР δс (100 МГц, б6-ДМСО): 52.15 (СОг^), 102.90 (С-3), 108.97, 109.12 (С-9), 110.27, 110.31 (С-6), 116.77, 116.98 (С-5), 125.84 (С-7), 128.82 (С-2), 138.00, 138.09 (С-8), 149.77, 152.26 (С-4), 161.05 (С=О) ¹⁹Р ЯМР δΓ (376 МГц, б₆-ДМСО): -121.11 (1Р, б).

Соединение 107

Е

Соединение 106 (46,5 г, 0,204 моль) добавляли в четырехгорлую круглодонную колбу объемом 2 л, оборудованную верхним перемешивателем, ледяной баней, датчиком внутренней температуры и каналом входа аргона. Безводный Ν,Ν-диметилформамид (450 мл) загружали в колбу при комнатной темпе

- 60 016267 ратуре в атмосфере аргона, перемешивали с получением оранжевого раствора. Гидрид натрия (95%, 7,30 г, 0,290 моль) добавляли порциями в течение 45 мин, поддерживая внутреннюю температуру меньше 5°С. Дополнительного выделения газа не обнаружено. Фенилсульфонилхлорид (35,8 мл, 0.280 моль) по каплям добавляли в течение 15 мин, поддерживая внутреннюю температуру меньше 10°С. Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч, после чего анализ путем ВЭЖХ в тесте 20 (МеСК) указывал на неполное превращение исходного вещества (ВУ 5,48 мин, 4% при 272 нм) в продукт (ВУ 6,42 мин). Добавляли дополнительные порции гидрида натрия (95%, 1,1 г) и фенилсульфонилхлорида (4,0 мл) и смесь перемешивали в течение еще 1,5 ч. Анализ путем ВЭЖХ в тесте 20 (МеСН) указывал на неполное превращение исходного вещества (ВУ 5,48 мин, 3% при 272 нм) в продукт (ВУ 6,43 мин). Реакционную смесь обрабатывали путем медленного добавления воды (770 мл) в течение 25 мин, обеспечивая поддержание внутренней температуры меньше 20°С, давая возможность осаждаться желтому твердому веществу. Твердое вещество фильтровали в вакууме, промывали при 5°С водой (770 мл) и сушили при 37°С в течение 15 ч. Твердое вещество суспендировали в этаноле (700 мл) и нагревали до 55°С при перемешивании в течение 1 ч. Горячую суспензию концентрировали в вакууме при 40°С, удаляя 350 мл дистиллята, затем давали возможность охладиться до 5°С в течение 0,5 ч. Фильтрация в вакууме, промывка при 4°С этанолом (150мл) и сушка в вакууме при 40 °С позволила получить соединение 107 в виде бледножелтого твердого вещества (68,5 г, выход 91%). Соединение 107: С1₆Н11С1РNО48 367,78 г/моль. Анализ путем ВЭЖХ (тест 20, МеСЦ): ВУ 6,43 мин; чистота 98% при 272 нм, т.пл.: 163°С расшир., 166-167°С расплавл. ¹Н ЯМР δ_Η (400 МГц, ά₆-ДМСО): 3.88 (3Н, к, СН3), 7.51 (1Н, к, Аг-Н), 7.62-7.68 (3Н, т, 3хАг-Н), 7.77 (1Н, !, Аг-Н), 7.92 (1Н, ά, Аг-Н), 8.04 (2Н, ά, Аг-Н) ¹³С ЯМР 5с (100 МГц, άβ-ДМСО): 53.21 (СО2СН3), 110.60 (С-3), 112.30, 112.34 (С-6), 114.02, 114.17 (С-9), 117.93, 118.14 (С-5), 127.14 (2хАг-С), 128.78 (С-7), 129.85 (2хАг-С), 132.29 (С-2), 135.24 (С-пара), 136.82 (С-ипсо), 136.88, 136.96 (С-8), 149.37, 151.89 (с-4), 160.51 (С=О); ¹⁹Р ЯМР δρ (376 МГц, й-ДОСО): -119.42 (1Р, ά)

Соединение 108

Е Вг

У Г /—СО^Ме

Соединение 107 (68,4 г, 0,186 моль) добавляли в четырехгорлую круглодонную колбу объемом 2 л, оборудованную верхним перемешивателем, добавляющей воронкой, ледяной баней, датчиком внутренней температуры и каналом входа аргона. Безводный дихлорметан (685 мл) загружали в колбу при комнатной температуре в атмосфере аргона, перемешивали с получением частичной суспензии. По каплям в течение 20 мин добавляли бром (11,5 мл, 0,223 моль), поддерживая внутреннюю температуру ниже 10°С, с получением темно-красной смеси. Реакционной смеси давали возможность нагреться до комнатной температуры в течение 1 ч, после чего анализ путем ВЭЖХ в тесте 20 (образец гасили \а118О₃ водн., разбавляли МеОН, затем МеОН, фильтровали и разбавляли МеСЦ) указывал на неполное превращение исходного вещества (ВУ 6,43 мин, 78% при 272 нм) в минорный продукт (ВУ 6,76 мин). Порциями в течение следующих 6 ч добавляли дополнительное количество брома (12,4 мл) и реакционную смесь оставляли перемешиваться при комнатной температуре в течение 14 ч, после чего анализ путем ВЭЖХ в тесте 20 (образец гасили \а118О₃ водн., разбавляли МеОН, затем МеОН, фильтровали и разбавляли МеСЦ) указывал на полное превращение исходного вещества (ВУ 6,43 мин) в один основной продукт (ВУ 6,76 мин). Реакционную смесь гасили путем добавления по каплям в течение 30 мин раствора \а118О₃ (132 г в 400 мл воды), обеспечивая Т<15°С. Слои разделяли, и органический слой промывали насыщенным водным бикарбонатом натрия (400 млх2). Водные слои экстрагировали дихлорметаном (400 мл) и объединенные органические слои промывали водой (1000 мл), сушили над безводным сульфатом натрия (500 г). Фильтрация и концентрирование в вакууме при 28°С позволило получить неочищенное желтое твердое вещество (78 г). Твердое вещество растирали в горячем этаноле (650 мл) при 50°С в течение 1 ч. Горячую суспензию концентрировали в вакууме при 40°С, удаляя 450 мл дистиллята, затем давали возможность охладиться до 5°С в течение 0,5 ч. Фильтрация в вакууме, промывка при 4°С этанолом (150 мл) и сушка в вакууме при 25°С позволила получить соединение 108 в виде бледно-желтого порошка (72,6 г, выход 88%, чистота 93% при 272 нм). Это твердое вещество растворяли в горячем этилацетате (500 мл) при 50°С в течение 1 ч. Медленно при 50°С добавляли этанол (200 мл) и перемешивали в течение 15 мин. Начиналось осаждение, и горячую суспензию концентрировали в вакууме при 40°С, удаляя 475 мл дистиллята, затем давали возможность охлаждаться до 5°С в течение 0,5 ч. Фильтрация в вакууме, промывка при 4°С этанолом (150 мл) и сушка в вакууме при 25°С позволила получить соединение 108, метил-3-бром-5-хлор-4-фтор-1-бензолсульфонилиндол-2-карбоксилат, в виде бледно-желтого порошка (57,4 г, выход 69%, чистота 97% при 272 нм). Второй выход вещества получали из маточного раствора в виде светлого твердого вещества (9,6 г, 12%). Объединенные выход = 81%. Метил-3-бром-5хлор-4-фтор-1-бензолсульфонилиндол-2-карбоксилат соединение 108: С1₆Н1₀Β^С1РNО48 446,68 г/моль. Анализ путем ВЭЖХ (тест 20, МеСЦ): ВУ 6,76 мин; чистота 97% при 272 нм ИРЭ +уе: т/ζ 447.8 [М+Н]⁺

- 61 016267

90%; 464.8 [М+Ν^Γ 100% ИРЭ -уе: т/ζ 445.9 [М-Н]’ 100% ¹Н ЯМР δн (400 МГц, б6-ДМСО): 3.99 (3Н, 8, СН3), 7.66 (3Н, ΐ, 3хАг-Н), 7.78 (1Н, ΐ, Аг-Н), 7.90 (1Н, б, Аг-Н), 7.98 (2Н, б, 2хАг-Н); ¹³С ЯМР δс (100 МГц, б⁶-ДМСО): 53.88 (СО2СН₃), 96.66 (С-3), 111.87, 111.90 (С-6), 115.36, 115.51 (С-9), 117.29, 117.45 (С5), 127.16 (2хАг-С), 129.40 (С-7), 130.15 (2хАг-С), 130.45 (С-2), 134.63, 134.69 (С-8), 135.46 (С-пара), 135.81 (С-ипсо), 149.31, 151.85 (С-4), 160.30 (С=О); ¹⁹Р ЯМР δρ (376 МГц, б6-ДМСО): -124.00 (1Р, б)

Часть Б. Синтез соединения I

В подходящий реактор загружали соединение 201 (57 г, 0,12 моль) и тетрагидрофуран (570 мл). Получающийся в результате раствор охлаждали от -90 до -100°С в атмосфере азота с использованием ледяной бани Ь^/1РА, затем обрабатывали н-бутиллитием (2,5 М в гексанах, 52 мл, 0,13 моль), добавляемым в течение 10 мин. К смеси добавляли диэтила хлорфосфит (20,5 г, 0,13моль) в течение 10 мин. ВЭЖХ (способ 001, ВУ = 17,7 мин) продемонстрировала отсутствие исходного вещества и приблизительно 70% продукта. Реакционную смесь затем разбавляли этилацетатом (570 мл), давали возможность нагреться до -40°С. Смесь затем обрабатывали соляной кислотой (0,5 М, 400 мл) и давали возможность нагреться до температуры окружающей среды и перемешивали в течение 30 мин. Получающиеся в результате слои разделяли и водный слой экстрагировали этилацетатом (500 мл). Органические слои объединяли и промывали рассолом (500мл), сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали до масла. 78% ВЭЖХ АиС (площадь под кривой) (способ 20, ВУ = 5,6 мин) >100% выход ввиду примесей и растворителя. Использовали как таковой на следующей стадии. Данные для С-2-метилового эфира: #2х: С₁₈Н₁₆С1РШ₆Р8 459,81 г/моль т/ζ (ИРЭ⁺): 460.0 (МН+, 100%), 462.0 (МН⁺, 35%).

Соединение 203.

В подходящий реактор загружали соединение 202 (56 г, подсчитано 0,10 моль), йодциннамонитрил (27 г, 0,10 моль), триэтиламин (17 мл, 0,12 моль) и толуол (475 мл). Получающуюся в результате смесь дегазировали путем продувания тока азота в течение 10 мин при температуре окружающей среды, после чего добавляли тетракис(трифенилфосфин)палладий(0) (6,0 г, 0.005 моль). Смесь продували в течение еще 5 мин, затем нагревали до 80°С в течение 2 ч. ВЭЖХ (способ 20, ВУ = 6,2 мин) продемонстрировал полноту реакции. Смесь охлаждали до температуры окружающей среды и фильтровали через целит и промывали этилацетатом (1000 мл). Объединенные органические вещества промывали рассолом (2500 мл), затем сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали до объема 170 мл. Концентрат охлаждали до 0°С и перемешивали в течение 1 ч, в течение которого продукт кристаллизовался. Твердые вещества фильтровали и промывали гексан:толуол (2:1, 150 мл). Сушили с высвобождением 54 г, ВЭЖХ АиС 85% (способ 20.)

Неочищенное твердое вещество затем очищали путем колоночной хроматографии с элюцией 25 мас.% этилацетатом в метиленхлориде. Чистые фракции собирали и объединяли с получением соединения 203, 41 г, 67%, выход 96% ВЭЖХ АиС (способ тест 20, ВУ = 6,2 мин). Данные для С-2-этилового эфира: #3: Са^СЖОЛ 615,01 г/моль. ¹Н ЯМР δн (400 МГц, СПС1₃): 1.35 (3Н, ΐ, РО₂СН₂СН₃), 1.52 (3Н, ΐ, СО₂СН₂СН₃), 2.40 (3Н, 8, Аг-СН₂), 4.08-4.20 (2Н, т, РО₂СН₂СН₃), 4.61 (2Н, ς, СО₂СН₂СН₃), 5.90 (1Н, б, СН-СНС№), 7.33-7.37 (3Н, т, 2хАг-Н, СН=СНСК), 7.55 (2Н, а-ΐ, 2хАг-Н), 7.67 (1Н, а-ΐ, Аг-Н), 7.74

- 62 016267

7.79 (3Н, т, 3χΑγ-Η), 8.13 (2Н, б, 2χΑγ-Η). Данные для С-2-метилового эфира: #3х: С^ЫгзСТРЫгО^З 600,98 г/моль т/ζ (ИРЭ⁺): 601.1 (МА, 100%), 603.0 (МН⁺, 35%). ^!Н ЯМР δΗ (400 МГц, б6-ДМСО): 1.18 (3Н, !, СЩСИ2ОР), 2.34 (3Н, з, Αγ-СН,), 4.02 (5Н, т, СН3СН2ОР, СО2СИ3), 6.47 (1Η, б, αΐ=ΟΚΝ), 7.54 (1Н, б, Αγ-Η), 7.62 (1Н, !, Αγ-Η), 7.72 (1Η, б, ОЖЫ), 7.70-7.76 (4Η, т, 4χΑγ-Η), 7.82 (1Η, !, Αγ-Η), 7.91 (1Η, б, Αγ-Η), 8.13 (2Η, б, 2χΑγ-Η). Множественные значения 5С указывают на расщепление сигнала с атома углерода ввиду Р и/или Р. ¹³С ЯМР 8С (100 МГц, б₆-ДМСО): 15.97, 16.03 (СН₃СН₂ОР), 20.79 (ΑγСН,), 53.88 (СОЮЩ), 61.73, 61.79 (СН₃СН₂ОР), 98.39 (01=0¾ 107.50, 107.54 (С), 108.95, 108.99 (С), 111.37, 111.42 (С), 115.47, 115.63 (С), 116.82, 116.91, 117.01, 117.10 (С), 118.43 (СЫ), 127.44 (8О₂РИ, 2хС_орто), 127.91, 128.02 (С-Н), 128.67 (С-Н), 130.27 (8О₂РИ, 2хС_мета), 131.21, 131.41 (С-Н), 132.68 (С), 133.29, 133.40 (С-Н), 134.12, 134.27 (С), 134.55, 134.63, 134.72 (С), 135.49 (8О₂РИ, С_ипсо), 136.09 (8О₂РИ, С_пара), 139.10, 139.25 (С), 149.06, 151.60 (С-4), 149.51 (С^СЯСЫ), 161.10 (С=О). ¹⁹Р ЯМР δ!, (376 МГц, б6-ДМСО): -112.36 (1Р, б). ³¹Р ЯМР δ₽ (162 МГц, б6-ДМСО): 23.49 (1Р, з).

Соединение 204.

В подходящий реактор загружали соединение 203 (41 г, 0,067 моль) и метиленхлорид (175 мл). Получающийся в результате раствор охлаждали до 0°С и обрабатывали бромтриметилсиланом (46 г, 0,30 моль), добавляемым в течение 15 мин. Реакционную смесь затем нагревали до 40°С в течение 1,5 ч. ВЭЖХ (способ 20, ВУ = 4,3 мин) указывала на полноту реакции. Избыток ТМ8Ег отбирали в вакууме (40-45°С) и получающееся в результате липкое твердое вещество ресуспендировали в ДХМ (200 мл) и охлаждали до 0°С. Оксалилхлорид (12 мл, 0,13 моль) добавляли в течение 15 мин при 0°С с последующим Ν,Ν-диметилформамидом (1,0 мл) при 0°С. Выделение газа обнаруживалось при добавлении ДМФ. Через 1 ч при температуре окружающей среды ВЭЖХ (способ 20, ВУ = 6,0 мин, образец гасили метанолом перед инъекцией) продемонстрировала полноту реакции. Растворители вновь отбирали для удаления остаточного оксалилхлорида и смесь ресуспендировали в метиленхлориде (100 мл). Раствор охлаждали до 0°-5°С, затем обрабатывали метанолом (300 мл) и давали возможность нагреться до температуры окружающей среды. Через 2 ч ВЭЖХ указывала на полноту реакции (ВЭЖХ способ 20, ВУ = 6,0 мин.) Растворители отбирали, и неочищенное твердое вещество использовали само по себе на следующей стадии. Соединение 204 48 г, ВЭЖХ ΑυС 91%, >100% выход ввиду растворителей и примесей. Данные для С-2этилового эфира: 204: С₂₈Η₂₃С1РN₂О_бР8 600,98 г/моль ¹Н ЯМР δ_Η (400 МГц, СИС1₃): 1.53 (3Н, !,

СО₂СΗ₂СΗ₃), 2.40 (3Н, 8, Α^-СΗ₃), 3.79 (3Н, б, РОСН₃), 4.61 (2Н, ф СО₂СΗ₂СΗ₃), 5.90 (1Н, б, ^=^6^, 7.33-7.37 (3Η, т, 2χΑγ-Η, 7.55 (2Η, а-!, 2χΑγ-Η), 7.67 (1Η, а-!, Αγ-Η), 7.73-7.79 (3Η, т, 3χΑγΗ), 8.13 (2Η, б, 2χΑγ-Η)

Данные для С-2-метилового эфира: 204х: С₂7Η₂1С1РN₂О_бР8 586,96 г/моль т/ζ (ИРЭ⁺): 587.1 (МН⁺, 100%), 589.0 (МН⁺, 35%). ^!Н ЯМР δΗ (400 МГц, б6-ДМСО): 2.33 (3Н, з, Α^-СΗ3), 3.66 (3Н, б, РОСН3), 4.02 (3Н, з, СОЮЩ), 6.47 (1Η, б, СΗ=СΗСN), 7.53 (1Н, б, Αγ-Η), 7.61 (1Н, бб, Αγ-Η), 7.70 (1Η, б, ^=^6^, 7.68-7.76 (4Η, т, 4χΑγ-Η), 7.82 (1Η, !, Αγ-Η), 7.90 (1Η, б, Αγ-Η), 8.13 (2Η, б, 2χΑγ-Η). Множественные значения 5С указывают на расщепление сигнала с атома углерода ввиду Р и/или Р. ¹³С ЯМР δС (100 МГц, б₆-ДМСО): 20.81 (Αγ-СН,), 52.07, 52.13 (СН₃ОР), 53.99 (СОЮЩ), 98.46 (СΗ=СΗСN), 106.99 (С), 108.41 (С), 111.45 (С-Н), 115.51, 115.67 (С), 116.77, 116.86, 117.07 (С), 118.48 (СИ), 127.51 (8О₂РИ, 2хС_орто), 127.92, 128.04 (С-Н), 128.71 (С-Н), 130.32 (8О₂РИ, 2хС_мета), 131.56 (С-Н), 132.20 (С), 133.35, 133.46 (С-Н), 134.19, 134.34 (С), 134.55, 134.63, 134.72 (С), 135.47 (8О₂РИ, С_ипсо), 136.16 (8О₂РИ, С_пара), 139.20, 139.35, 139.39, 139.54 (С), 149.09, 151.63 (С-4), 149.51 ^Η^^Ν), 161.15 (С=О). ¹⁹Р ЯМР δ!, (376 МГц, б6ДМСО): -113.93 (1Р, б). ³¹Р ЯМР δР (162 МГц, б₆-ДМСО): 25.42 (1Р, з).

Соединение 205.

В подходящий реактор загружали соединение 204 (48 г, прибл. 0,072 моль) и тетрагидрофуран (800 мл.) Получающийся в результате раствор затем охлаждали до 5°С и обрабатывали моногидратом гидроксида лития (12 г, 028 моль) и водой (180 мл), добавляемой в течение 15 мин. Реакции давали возможность нагреться до температуры окружающей среды, в течение этого времени окраска просветлялась. После перемешивания в течение ночи ВЭЖХ указывала на завершение реакции (способ теста 20, ВУ продукта = 4,5, ВУ основной примеси = 3,7). Реакционную смесь охлаждали до 5°С и подкисляли соляной кислотой (5н., 300 мл). Избыток ТГФ удаляли путем упаривания при пониженном давлении и получающиеся в результате липкие твердые вещества суспендировали в ацетоне (200 мл). Смесь нагревали до 40°С в течение 30 мин и затем оставляли охлаждаться до температуры окружающей среды. Твердые вещества оставляли для грануляции в течение 2 ч, затем фильтровали и промывали ацетоном/водой (2:1, 100 мл.) Сушили с получением соединения 205, 21 г, выход 67%. ВЭЖХ ΑυС 93% (способ теста 20).

Использовали само по себе на следующей стадии.

Соединение 206 (хиральное расщепление).

В подходящий реактор загружали соединение 205 (432,6 г, 1,0 моль) и ацетон (7,79 л). (-)Цинхонидин (294,39 г, 1,0 моль) добавляли одной порцией и получающуюся в результате суспензию перемешивали в течение 4 ч. Твердые вещества выделяли путем фильтрации и промывали ацетоном (300 мл) с получением 343,2 г соли после сушки в вакууме. Отношение в анализе путем хиральной ВЭЖХ =

- 63 016267

98:2.

Соль суспендировали в смеси этилацетата (5,2 л) и 1н. НС1 (5,2 л) и интенсивно перемешивали при температуре окружающей среды в течение 2 ч. После этого слои разделяли. Водный слой дополнительно экстрагировали этилацетатом (2,7 л) и органические экстракты объединяли, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением разделенного соединения 206 в виде белого твердого вещества. 145,44 г, общий выход 68%. Анализ путем хиральной ВЭЖХ, отношение = 98,4:1,6. Использовали само по себе на следующей стадии. #6: С₂₀Н₁₅С1Г^О₄Р 432.77 г/моль т/ζ (ИРЭ⁺): 433.0 (МН⁺, 100%), 435.0 (МН⁺, 35%). ¹Н ЯМР δН (400 МГц, б6-ДМСО): 2.35 (3Н, з, Αγ-СНД 3.78 (3Н, б, РОСН3), 6.52 (1Н, б, СН=СНСК), 7.46 (2Н, б, Αγ-Η), 7.66 (1Н, б, СН=СНСК), 7.69, 7.81 (2Н, 2хб, Н-6, Н-7), 7.77 (1Н, з, Αγ-Η), 13.63 (1Н, з, Ν-Н), 15.70 (1Н, Ьг-з, СООН). ¹⁹Е ЯМР δΡ (376 МГц, б₆-ДМСО): -114.27 (1Е, з). ³¹Р ЯМР δ_Ρ (162 МГц, б₆-ДМСО): 36.44 (1Р, з).

Соединение I.

В подходящий реактор загружали соединение 206 (0,63 г, 0,0014 моль) и 1,2-диметоксиэтан (10 мл). Смесь обрабатывали 1,1-карбонилдиимидазолом (0,47 г, 0,0028 моль), добавляемым одной порцией, и смеси давали перемешиваться при температуре окружающей среды до прекращения выделения газа (прибл. 1,5 ч). Раствор затем охлаждали до 5°С и продували газообразным аммиаком в течение 5 мин. ВЭЖХ (способ 20, ВУ продукта = 5,0 мин) продемонстрировала полноту реакции через 1 ч при температуре окружающей среды. Реакционную смесь гасили путем добавления 100 г измельченного льда и концентрировали при пониженном давлении для удаления ЭМЕ. Получающуюся в результате суспензию перемешивали в течение 1 ч при 5°С для гранулирования продукта. Твердые вещества фильтровали и сушили с получением чистого соединения I (метилового эфира (2-карбамоил-5-хлор-4фтор-1Н-индол-3ил)-[3-((Е)-2-циановинил)-5-метилфенил]-(К)фосфиновой кислоты). 0,56 г, выход 89%. Химическая чистота в соответствии с ВЭЖХ (способ 20) 98,5%. Хиральная чистота 97%.

В подходящий реактор загружали соединение 206 (10 г, 0,024 моль) и 1,2-диметоксиэтан (150 мл). Смесь обрабатывали 1,1-карбонилдиимидазолом (7,8 г, 0,048 моль), добавляемым одной порцией, и смеси давали перемешиваться при температуре окружающей среды до прекращения выделения газа. Раствор затем охлаждали до 5°С и продували газообразным аммиаком в течение 5 мин. ВЭЖХ (способ 20, ВУ продукта = 5,0 мин) продемонстрировала завершение реакции через 1 ч. Реакционную смесь гасили путем добавления 100 г истолченного льда и концентрировали при пониженном давлении для удаления ЭМЕ. Получающееся в результате маслянистое твердое вещество (в воде) разбавляли метанолом (20 мл) и перемешивали в течение 1 ч при 5°С для гранулирования продукта. Твердые вещества фильтровали и сушили для высвобождения чистого соединения I (метилового эфира (2-карбамоил-5-хлор-4-фтор-1Ниндол-3-ил)-[3-((Е)-2-циановинил)-5-метилфенил]-(К)фосфиновой кислоты). 9,8 г, выход 98%. Химическая чистота в соответствии с ВЭЖХ (способ 20) 99,5%. Хиральная чистота 94,3%. Белое твердое вещество.

Соединение I: С₂₀Н₁₆С1ЖО₃Р 431,78 г/моль т/ζ (ИРЭ⁺): 432.1 (МН⁺, 100%), 434.0 (МН⁺, 35%) ^(КВг б18с) (см^-1) 1619.0 (амид I), 1672.5 (ат1бе II), 2218.4 (С^, 3063.0, 3286.0 (Ν-Н) [α]ο²⁰: +33.42 (с, 10.04 мг/мл в СНС13) т.пл.: 177°С блестит, 181°С размягчается, 183-185°С плавится. Элементарный анализ: С₂₀Н₁₇СШ₃О₃Р вычислено С 55.63%, Н 3.73%, Ν 9.73%, С1 8.21%, Г 4.40%, Р 7.17%. Найдено С 55.56%, Н 3.74%, Ν 9.72%, С1 8.24%, Г 4.21%, Р 7.11% ¹Н ЯМР δ_Н (400 МГц, б₆-ДМСО): 2.32 (3Н, з, ΑγСН₃), 3.70 (3Н, б, СН₃ОР), 6.49 (1Н, б, СН=СНСК), 7.37 (1Н, бб, Н-6), 7.43 (1Н, бб, Н-7), 7.54 (1Н, б, Н-6'), 7.66 (1Н, б, СН=СНС^, 7.69 (1Н, б, Н-2'), 7.73 (1Н, з, Н-4'), 8.05, 10.63 (2х1Н, 2хз, ΝΗ), 13.02 (1Н, з, ΝН). Множественные значения δ_ρ указывают на расщепление сигнала с атома углерода ввиду Г и/или Р. ¹³С ЯМР δο (100 МГц, б6-ДМСО): 20.77 (Α-^), 51.70, 51.76 (СН3ОР), 96.03, 96.07, 97.52, 97.56 (С-3), 98.29 (СН=СНС^, 110.70 (С-7), 111.66, 111.83 (С-5), 118.04, 118.13, 118.22, 118.32 (С-9), 118.56.(СК), 125.84 (С-6), 127.11, 127.22 (С-2'), 131.05 (С-4'), 132.57, 132.67 (С-6'), 132.96, 134.50 (С-1'), 134.03, 134.18 (С-3'), 136.40, 136.51, 136.61 (С-8), 138.95, 139.10 (С-5'), 141.71, 141.91 (С-2), 149.19, 151.70 (С-4), 149.65 (СН=СНС^, 160.46 (С=О). ¹⁹Г ЯМР δΓ (376 МГц, б6-ДМСО): -113.11 (1Г, б). ³¹Р ЯМР δр (162 МГц, б6ДМСО): 33.39 (1Р, з).

Пример 8

- 64 016267

В подходящий реактор загружали соединение 301 (100 г, 0,23 моль) и тетрагидрофуран (1 л). Получающийся в результате раствор охлаждали до температуры от -90 до -100°С в атмосфере азота с использованием ледяной бани ^N2/IΡΑ, затем обрабатывали н-бутиллитием (2,5 М в гексанах, 99 мл, 0,25 моль), добавляемым в течение 10 мин. К смеси добавляли диэтилхлорфосфит (37,1 г, 0,24 моль) в течение 10 мин. ВЭЖХ (способ 001, ВУ = 18,9 мин) продемонстрировала отсутствие исходного вещества и прибл. 85% продукта. Реакционную смесь затем разбавляли этилацетатом (1 л) и давали нагреться до -40°С. Смесь затем обрабатывали соляной кислотой (0,5 М, 590 мл), давали нагреться до температуры окружающей среды и перемешивали в течение 30 мин. Получающиеся в результате слои разделяли, и водный слой экстрагировали этилацетатом (500 мл). Органические слои объединяли и промывали рассолом (500 мл), сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали до масла. 88% ВЭЖХ АИС (способ 20, ВУ = 5,8 мин) 115 г, >100% выход ввиду примесей и растворителя. Использовали само по себе на следующей стадии.

Соединение 303.

В подходящий реактор загружали соединение 302 (111 г, оценено 0,18 моль), йодциннамонитрил (47,1 г, 0,175 моль), триэтиламин (29,3 мл, 0,21 моль) и толуол (800 мл). Получающуюся в результате смесь дегазировали путем продувания потока азота в течение 10 мин при температуре окружающей среды, после чего добавляли тетракис(трифенилфосфин)палладия(0) (10,1 г, 0,0088 моль). Смесь продували в течение еще 5 мин, затем нагревали до 80°С в течение 2 ч. ВЭЖХ (способ 20, ВУ = 6,5 мин) продемонстрировала завершение реакции. Смесь охлаждали до температуры окружающей среды и фильтровали через целит, и промывали этилацетатом (400 мл). Объединенные органические вещества промывали рассолом (2x500 мл), затем сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали до объема 350 мл. Концентрат охлаждали до 0°С и перемешивали в течение 1 ч, в течение которого продукт кристаллизовался. Твердые вещества фильтровали и промывали смесью гексан:толуол (2:1, 150 мл). Сушили с получением 95 г, выход 90%, ВЭЖХ АИС 98% (способ 20). Использовали как таковой в следующей реакции.

303: С29Н26С1N2О6Ρ8 597,02 г/моль т/ζ (ИРЭ⁺): 597.0 (МН⁺, 100%), 599.0 (МН⁺, 35%) ¹Н ЯМР δн (400 МГц, СБС13): 1.38, 1.48 (2х3Н, 2χΐ, СООСН2СН3, РООСН2СН3), 2.41 (3Н, δ, Аг-СН3), 4.09-4.16 (2Н, т, РООСН2СН3), 4.52 (2Н, ς, СООСН2СНД, 5.93 (1Н, ά, СН=СНСК), 7.33-7.38 (3Н, т, СН=СНСН 2хАгН), 7.52 (2Н, ΐ, 2хАг-Н), 7.64 (1Н, ΐ, Аг-Н), 7.74, 7.77 (2х1Н, 2χά, 2хАг-Н), 7.85 (1Н, ά, Аг-Н), 7.94 (1Н, άά, Аг-Н), 8.08 (2Н, ά, 2хАг-Н) ¹Н ЯМР δН (400 МГц, άί^-ДМСО): 1.26, 1.33 (2х3Н, 2х1, СООСН₂СН₃, ΡООСН2СН₃), 2.34 (3Н, δ, Аг-СН₃), 3.95-4.10 (2Н, т, ΡООСН2СН₃), 4.40 (2Н, ς, СООСН2СНД, 6.52 (1Н, ά, С11С11СИ), 7.52 (1Н, άά, Аг-Н), 7.60-7.84 (8Н, т, СН-СНСН 7хАг-Н), 8.07 (3х1Н, т, 3хАг-Н).

Соединение 304.

В подходящий реактор загружали соединение 303 (537 г, 0,90 моль) и метиленхлорид (2,0 л). Получающийся в результате раствор охлаждали до 0°С и обрабатывали бромтриметилсиланом (450 г, 2,9 моль), добавляемым в течение 15 мин. Реакционную смесь затем нагревали до 40°С в течение 1,5 ч. ВЭЖХ (способ 20, ВУ = 4,4 мин) указывала на завершенность реакции. Избыток ТМ8Вг отбирали в вакууме (40-45°С) и получающееся в результате липкое твердое вещество ресуспендировали в ДХМ (2,5 л)

- 65 016267 и охлаждали до 0°С. Оксалилхлорид (156 мл, 1,8 моль) добавляли в течение 15 мин при 0°С, затем Ν,Νдиметилформамид (13,7 мл, 0,18 моль) при 0°С. Выделение газа обнаруживали во время добавления ДМФ. Через 1 ч ВЭЖХ (способ 20, ВУ = 6,2 мин, образец гасили безводным метанолом перед инжекцией) продемонстрировала завершение реакции. Растворители вновь отбирали для удаления оставшегося оксалилхлорида и смесь ресуспендировали в охлажденном метаноле (3,0 л) при 0-5°С, затем давали возможность нагреться до температуры окружающей среды. Через 2 ч ВЭЖХ указала на завершение реакции (ВЭЖХ способ 20, ВУ = 6,2 мин). Раствор концентрировали до объема 1,5 л и получающуюся в результате жидкую суспензию охлаждали 0°С и разбавляли водным раствором бикарбоната натрия (126 г, 3 л воды). Через 2 ч при 5°С продукт фильтровали и промывали охлажденной водой/метанолом (2:1, 1,5 л), затем сушили с получением 500 г соединения 304. Продукт, имеющий чистоту в соответствии с ВЭЖХ (способ 20) 92%, использовали как таковой.

Соединение 305.

В подходящий реактор загружали соединение 304 (прибл. 280 г, 0,48 моль) и тетрагидрофуран (2,8 л). Получающийся в результате раствор затем охлаждали до 5°С и обрабатывали моногидратом гидроксида лития (45 г, 1,07 моль), добавляемым одной порцией. Реакционной смеси давали возможность нагреться до температуры окружающей среды, в течение этого времени окраска просветлялась и образовывался белый осадок. После перемешивания в течение ночи ВЭЖХ указала на завершение реакции (способ 20, ВУ продукта = 4,3, ВУ продукта с частичным удалением защиты = 5,1, ВУ основной примеси = 3,8). Добавляли дополнительное количество 10% ΕίΟΗ-Η₂Ο, но через 10 ч промежуточное соединение с частичным удалением защиты оставалось на уровне 5%, и пик примеси на 3,8 мин увеличился, приблизительно до 25%. Реакционную смесь охлаждали до 5°С и подкисляли соляной кислотой (5н., 280 мл), затем разбавляли этилацетатом (2 л). Слои разделяли и водный слой экстрагировали этилацетатом (500 мл). Объединенные органические вещества промывали рассолом (1 л) и сушили над сульфатом натрия, затем концентрировали с получением неочищенного маслянистого твердого вещества, соединения 305. Приблизительно 300 г, ВЭЖХ ΑυΟ 57%.

Неочищенный продукт суспендировали в ацетонитриле (1,2 л) при 40°С и продукт растирали в воде (1,2 л). Получающуюся в результате суспензию охлаждали до 5°С и давали возможность гранулироваться в течение 30 мин, после чего продукт фильтровали и промывали ΑΟΝ:Η2Ο (1:1, 100 мл). Приблизительно 103 г, 88% в соответствии с ВЭЖХ. Продукт затем перекристаллизовывали из 360 мл ΑΟΝ при 40°С и 360 мл воды как ранее. Фильтровали, промывали и сушили с получением 75 г соединения 305. ВЭЖХ ΑυΟ 97%. Использовали как таковой на следующей стадии.

Соединение 306 (хиральное расщепление).

В подходящий реактор загружали соединение 305 (280 г, 0,66 моль) и ацетон (4,2 л). Получающуюся в результате жидкую суспензию затем обрабатывали (-)-цинхонидином (199 г, 0,66 моль), добавляемым одной порцией. Через 1 ч образовывался раствор, через еще 1 ч осаждалось белое твердое вещество и смесь оставляли перемешиваться в течение еще 2 ч (в общем 4 ч), после чего твердые вещества фильтровали, промывали ацетоном (200 мл) и сушили с получением 199 г неочищенного соединения 306 цинхонидиновой соли. ВЭЖХ продемонстрировала соотношение изомеров 96:4.

Неочищенную соль затем суспендировали в этилацетате (3 л) и соляной кислоте (1н., 3 л). Двухфазный раствор интенсивно перемешивали в течение 2 ч при температуре окружающей среды. Слои разделяли и водный слой экстрагировали этилацетатом (3 л). Органические слои объединяли, сушили над сульфатом натрия и концентрировали с получением свободного основания соединения 306, 107 г, 95:5 в соответствии с хиральной ВЭЖХ.

Неочищенное соединение 306 затем суспендировали в ацетоне (1,07 л) и обрабатывали (-)цинхонидином (76 г, 0,26 моль). После общего времени перемешивания 4 ч (как выше) твердые вещества фильтровали, промывали ацетоном (200 мл) и сушили с получением 199 г соли. ВЭЖХ 98,6:1,4.

Соль разрушали путем растворения в этилацетате (3 л) и соляной кислоте (1н., 3 л). Двухфазный раствор перемешивали в течение 2 ч при температуре окружающей среды. Слои разделяли и водный слой экстрагировали этилацетатом (2 л). Органические слои объединяли, сушили над сульфатом натрия и концентрировали с получением свободного основания соединения 306, 98 г, 98,6:1,4 в соответствии с хиральной ВЭЖХ. 70% выделение желаемого изомера, 35% выход из рацемического соединения 306. #6: С₂₀Η₁₆С1N₂Ο₄Ρ 414,78 г/моль т/ζ (ИРЭ⁺): 415.1 (МН⁺, 100%), 417.0 (МН⁺, 35%) [α]Β²⁵: -47.51 (с, 10.66 мг/мл в Ε!ΟΑφ [противоположный энантиомер [α]с^25: +47.26 (с, 9.60 мг/мл в ΕίΟΑο)]. ¹Н ЯМР δ,, (400 МГц, άβ-ДМСО): 2.33 (3Н, з, Αγ-СНз), 3.71 (3Н, ά, СН3ОР), 6.50 (1Н, ά, ΟΗ=ΟΗΟΝ), 7.36 (1Н, άά, Η-6), 7.57 (1Н, ά, Н-7), 7.66-7.71 (2Н, т, Н-4, Αγ-Н^, 7.67 (1Н, ά, ΟΗ=ΟΗΟΝ), 7.84 (1Н, ά, Αγ-Η^), 7.98 (1Η, з, Αγ-Ππ^), 12.97 (1Η, з, Ν-Η), 14.38 (1Η, Ьг-з, ΟΟΟΗ). Множественные значения 5С указывают на расщепление сигнала с атома углерода ввиду Р. ¹³С ЯМР 5С (100 МГц, 20.68 (Αγ-СНД 51.70 (СН₃ОР), 98.15 (ΟΗ=ΟΗΟΝ), 102.33, 103.85, 114.98, 120.91 (3хС), 118.47 (ΟΝ), 125.39 (С), 126.78 (С), 127.74, 127.86 (С-Н_орто), 129.78, 129.88 (С), 131.25 (С), 132.06 (С), 133.44, 133.55 (С), 133.89, 134.05 (С), 134.62, 134.75 (С), 135.47, 135.66 (С), 138.78, 138.91 (С), 149.62 (ΟΗ=ΟΗΟΝ), 160.40 (ϋ=Ο). ³¹Р ЯМР 8_Р(162 МГц, ά6-ДМСО): 33.50 (1Р, з)

- 66 016267

Соединение ΐΐΐ.

В подходящий реактор загружали соединение 306 (0,63 г, 0,0014 моль) и 1,2-диметоксиэтан (10 мл). Смесь обрабатывали 1,1-карбонилдиимидазолом (0,47 г, 0,0028 моль), добавляемым одной порцией, и смеси давали возможность перемешиваться при температуре окружающей среды до прекращения выделения газа (прибл. 1,5 ч). Раствор затем охлаждали до 5°С и продували газообразным аммиаком в течение 5 мин. ВЭЖХ (способ 20, ВУ продукта = 5,0 мин) продемонстрировала завершение реакции через 1 ч при температуре окружающей среды. Реакционную смесь гасили путем добавления 10 г измельченного льда и концентрировали при пониженном давлении для удаления БМЕ. Получающуюся в результате суспензию перемешивали в течение 1 ч при 5°С для гранулирования продукта. Твердые вещества фильтровали и сушили с получением чистого соединения ΐΐΐ (метилового эфира(2-карбамоил-5-хлор-1Ниндол-3-ил)-[3-((Е)-2-циановинил)-5-метилфенил]-(К)фосфиновой кислоты) в виде белого твердого вещества, 0,56 г, выход 89%. Химическая чистота в соответствии с ВЭЖХ (способ 20) 98,5%. Хиральная чистота 97%.

В подходящий реактор загружали соединение 306 (10 г, 0,024 моль) и 1,2-диметоксиэтан (150 мл). Смесь обрабатывали 1,1-карбонилдиимидазолом (7,8 г, 0,048 моль), добавляемым одной порцией, и смеси давали возможность перемешиваться при температуре окружающей среды до прекращения выделения газа. Раствор затем охлаждали до 5°С и продували газообразным аммиаком в течение 5 мин. ВЭЖХ (способ 20, ВУ продукта = 5,0 мин) продемонстрировала завершение реакции через 1 ч. Реакционную смесь гасили путем добавления 100 г измельченного льда и концентрировали при пониженном давлении для удаления БМЕ. Получающееся в результате маслянистое твердое вещество (в воде) разбавляли метанолом (20 мл) и перемешивали в течение 1 ч при 5°С для гранулирования продукта. Твердые вещества фильтровали и сушили с получением чистого соединения ΐΐΐ (метилового эфира (2-карбамоил-5-хлор-1Ниндол-3-ил)-[3-((Е)-2-циановинил)-5-метилфенил]-(К)фосфиновой кислоты), 9,8 г, выход 98%. Химическая чистота в соответствии с ВЭЖХ (способ 20) 99,5%. Хиральная чистота 94,3%. Соединение ΐΐΐ: С₂оΗ17СINзΟ₃Ρ 413.79 г/моль т/ζ (ИРЭ⁺): 414.1 (МН⁺, 100%), 416.1 (МН⁺, 35%) ν,^ΚΒι- (18с) (ем’¹) 1620.0 (амид ΐ), 1670.6 (амид ΐΐ), 2218.7 (ΌΝ), 3125.5, 3291.9 (Ν-Η) [α]ο²⁰: -75.08 (с, 9.04 мг/мл в СИСЬ) т.пл.: 144-148°С превращение в непрозрачное полутвердое вещество, 209-210°С расплавы. Элементарный анализ: С2оΗ17С1NзΟзΡ вычислено С 58.05%, Н 4.14%, Ν 10.15%, С1 8.57%, Р 7.49%. Найдено С 58.13%, Н 4.08%, Ν 10.16%, С1 8.69%, Р 7.44%. ¹Н ЯМР 6н (400 МГц, с1,,-Д\1СО): 2.32 (3Н, 8, Аг-ОД), 3.74 (3Н, ά, СН3ОР), 6.52 (1Н, ά, СЫЧНСМ), 7.30 (1Н, άά, Η-6), 7.53-7.58 (3Н, т, Н-4, Н-7, Н-6'), 7.68 (1Н, ά, ^=^^, 7.73 (1Н, 8, Н-4'), 7.75 (1Н, ά, Н-2'), 8.02, 10.15 (2х1Н, 2x8, ΝΗ2), 12.80 (1Н, 8, Ν-Η). Множественные значения 6С указывали на расщепление сигнала с атома углерода ввиду Р. ¹³С ЯМР 6С (100 МГц, (6-ДМСО): 20.77 (АГ-СН3), 51.75, 51.81 (СН3ОР), 98.39, 98.91 (С-3), 98.44 (€Η=№Ν), 115.05 (С7), 118.53 (СН), 119.96 (С-4), 124.73 (С-6), 126.68 (С-5), 127.15, 127.26 (С-2'), 129.25, 129.35 (С-9), 131.37 (С-4'), 132.45, 134.04 (С-1'), 132.69, 132.80 (С-6'), 133.92 (С-8), 134.30, 134.44 (С-3'), 139.33, 139.46 (С-5'), 139.96, 140.17 (С-2), 149.55 (ΟΗΚΗΝ), 160.65 (С=О). ³¹Р ЯМР δρ(162 МГц, (6-ДМСО): 33.72 (1Р, 8).

Пример 9.

Рециркуляция 8 энантиомера соединения ΐ-2-карбоновой кислоты 2(8)

Р % н

2(5)

1) Цинхонидин Ацетон

2) НС1, ДХМ

/ ΟΝ 1) Оксалилхлорид Кат. ДМФ ДХМ, 0-5°С

2) 1 н. №ОН водн.

3) 1 н. НС!/ацетон

В охлажденный (0-5°С) раствор исходного энантиомера 2(8) (50,0 г, 120,8 ммоль) в безводном ДХМ (300 мл) по каплям в течение 5 мин добавляли оксалилхлорид (15,2 мл, 174,2 ммоль, 1,5 экв.). Безводный ДМФ (1,43 мл, 18,5 ммоль) добавляли с использованием шприца в течение 2 мин. Обнаруживали выделение газа. Получающийся в результате желтый раствор перемешивали в атмосфере аргона при 0-5°С. Через 60 мин результат ВЭЖХ, полученный на аликвоте после реакции, погашенной метанолом, указывал на то, что только 10% исходной кислоты не прореагировало. После перемешивания в течение еще 10 мин реакционную смесь разбавляли охлажденным (0-5°С) ДХМ (300 мл). Разбавленную смесь быстро переносили в добавляющую воронку и добавляли к перемешиваемому водному раствору NаΟΗ (1н., 695 мл) в течение 7 мин. Температура гасимой смеси увеличивалась (с 26,5°С, исходная температура водного \а()11) до 33°С, когда добавление завершалось. После непрерывного перемешивания в течение еще 3 мин жидкость верхнего слоя сливали. Нижний слой (содержащий осажденную соль) концентрировали при пониженном давлении для удаления ДХМ. Остаток суспендировали в ацетоне (300 мл) и подкисляли с использованием 1н. 11С1 (в общем добавляли 275 мл) до рН 4. Получающуюся в результате смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Собранный путем фильтрации твердый продукт промывали 1:1 ацетоном/Όΐ (деионизированной) водой (100 мл). Полученное твердое вещество сушили в вакуумной печи при 45°С в течение 18 ч. Чистая масса этого вещества 1 выхода = 31,4 г. Химическая чистота = 98,4% в соответствии с ВЭЖХ (АИС). Хиральная ВЭЖХ в результате указывала на смесь 2(К) (51,7%) и 2(8) (47,5%). ¹Н-ЯМР спектр указывал на чистый продукт со следами ДХМ.

- 67 016267

Выделение 2 выхода продукта из маточного раствора продукта 1 выхода: в маточном растворе присутствовали два слоя. Слои разделяли. Верхний слой экстрагировали ДХМ (400 мл). Нижний слой маточного раствора 1 выхода (коричневое масло, основной продукт в соответствии с ВЭЖХ) суспендировали в толуоле (30 мл) и промывали смесью 1н. НС1 (5 мл) и рассола (15 мл). Объединенный толуольный слой с экстрактом в ДХМ промывали Όΐ водой (400 мл), сушили над безводным сульфатом натрия. Растворители удаляли при пониженном давлении. Вещество из 2 выхода сушили в высоком вакууме в течение 16 ч. Чистая масса = 15,1 г. Химическая чистота = 90% в соответствии с ВЭЖХ (ЛИС). Результат хиральной ВЭЖХ указывает на смесь 2(К) (91,4%) и 2(8) (8,6%). ¹Н-ЯМР спектр указывает в основном на продукт с остатком толуола (5,3 мас.%) и следами минорных примесей. Общее выделение свободной кислоты (смесь 2 энантиомеров)=92%.

Рециркуляция 8 энантиомера соединения ΐΐΐ-2-карбоновой кислоты 1(8)

3) 1 н. НС1/ацетон 2) НС1, ДХМ

1(3) 1(Κ),1(δ) ¹<^к)

К охлажденному (0-5°С) мутному раствору исходного энантиомера 1(8) (50,0 г, 120,8 ммоль) в безводном ДХМ (300 мл) по каплям в течение 5 мин добавляли оксалилхлорид (15,7 мл, 180 ммоль, 1,5 экв.). Безводный ДМФ (1,45 мл, 18,8 ммоль) добавляли с использованием шприца в течение 2 мин. Обнаруживали выделение газа. Получающийся в результате желтый раствор перемешивали в атмосфере аргона при 0-5°С в течение 30 мин. Реакционную смесь затем разбавляли ДХМ (300 мл) и быстро переносили в добавляющую воронку. Разбавленную реакционную смесь добавляли к перемешиваемому водному раствору ΝπΟΙ I (1н., 725 мл) в течение 6 мин. Температура гасящей смеси поднималась (с 24,5°С, исходная температура водного ΝπΟΙ I) до 33°С, когда добавление завершалось. После непрерывного перемешивания в течение еще 5 мин гасимую смесь помещали в ледяную баню. 1н. НС1 (365 мл) добавляли через добавляющую воронку в течение 2 мин. Получающуюся в результате подкисленную смесь (рН 2) перемешивали в течение 5 мин. Слои разделяли с использованием делительной воронки. Водный слой дополнительно экстрагировали ДХМ (200 млх2). Объединенный органический слой и экстракты в ДХМ промывали Όΐ водой (200 мл), сушили над безводным сульфатом натрия. ДХМ удаляли при пониженном давлении. Неочищенное вещество сушили в вакуумной печи в течение 42 ч. Чистая масса = 52,4 г. Химическая чистота >97% в соответствии с ВЭЖХ (ЛИС). Результат хиральной ВЭЖХ указывает на смесь 1(К) (64,1%) и 1(8) (35,9%). ¹Н-ЯМР спектр указывает на прозрачный продукт с остатком ДХМ (4,3 мас.%) и следы ДМФ. Выделение свободной кислоты (смесь 2 энантиомеров) = 100%.

Пример 10.

Получение йодциннамонитрила

3-Бром-5-метилбензальдегид(3).

Безводный толуол (365 мл) добавляли в четырехгорлую круглодонную колбу объемом 3 л, оборудованную верхним перемешивателем, одной добавляющей воронкой объемом 250 мл и одной объемом 1 л, датчиком внутренней температуры и каналом входа аргона. Колбу погружали в баню лед/метанол для поддержания внутренней температуры около -15°С. н-Бутиллитий (2,5 М в гексане, 232 мл, 0,581 моль) добавляли в колбу через шприц в атмосфере аргона при умеренной скорости перемешивания, нбутилмагния хлорид (2,0 М в ТГФ, 145 мл, 0,290 моль, светло-коричневый раствор) вводили в атмосфере аргона в добавляющую воронку объемом 250 мл через шприц. Добавление этого раствора осуществляли по каплям в течение 22 мин, в течение которых внутренняя температура росла с -16 до -13°С, и смесь превращалась из прозрачной в непрозрачную светло-желтую. Раствор перемешивали в течение еще 0,5 ч при -13°С.

Раствор 3,5-дибромтолуола (196 г, 0,784 моль; Л1бпсБ) в безводном толуоле (1458 мл) готовили в одногорлой круглодонной колбе объемом 2 л в атмосфере аргона. Этот бледно-желтый раствор переносили двумя порциями в добавляющую воронку объемом 1 л. Добавление этого раствора осуществляли по каплям в течение 50 мин, в течение которых внутреннюю температуру поддерживали от -13 до -17°С, и смесь становилась непрозрачной, приобретая более темный оранжево-коричневый цвет. Суспензию перемешивали в течение еще 2,75 ч при температуре от -13 до -17°С в атмосфере аргона. Образец ВЭЖХ брали через 2 ч и готовили путем добавления 2 капель метанола с последующим удалением растворителя при пониженном давлении. ВЭЖХ способ теста 20 указывал на отсутствие исходного вещества (ВУ 6,64 мин) и смеси промежуточных соединений (ВУ 4,94, 6,15, 7,40 мин). Эту суспензию обозначали Смесь

- 68 016267

А.

Во время добавления 3,5-дибромтолуола безводный Ν,Ν-диметилформамид (78,7 мл, 1,016 моль) добавляли через шприц в четырехгорлую круглодонную колбу объемом 5 л, оборудованную верхним перемешивателем, добавляющей воронкой объемом 1 л, датчиком внутренней температуры и каналом входа аргона. Колбу погружали в баню лед/метанол для поддержания внутренней температуры около -15°С. Безводный толуол (91 мл) добавляли в колбу через шприц в атмосфере аргона при умеренной скорости перемешивания. Этот раствор обозначали смесь В.

Смесь А переносили двумя порциями (2x950 мл) в добавляющую воронку объемом 1 л колбы объемом 5 л, содержащей смесь В. Добавляющую воронку закрывали алюминиевой фольгой для того, чтобы избежать чрезмерного притока тепла. Добавление смеси А осуществляли по каплям в течение 38 мин, в течение которых внутреннюю температуру реакционной смеси поддерживали от -16 до -12°С, и реакционная смесь превращалась в оранжевый раствор. Раствор перемешивали в течение еще 1 ч при температуре между -13 и -16°С в атмосфере аргона, после чего образец ВЭЖХ готовили путем удаления толуола при пониженном давлении, растворения в МеОН и отфильтровывания любого нерастворимого вещества. ВЭЖХ способ теста 20 указывал на один основной продукт (ВУ 5,42 мин). Реакция, по-видимому, была завершена и готова к гашению. Полученный раствор лимонной кислоты (341,54 г) в воде (650 мл) в конической колбе объемом 1 л добавляли медленно в течение 20 мин к реакционной смеси порциями по 50 мл, поддерживая внутреннюю температуру ниже 0°С. Этот желтый раствор перемешивали при 0°С в течение еще 20 мин.

После этого погашенную реакционную смесь переносили в делительную воронку объемом 4 л и две фазы разделяли. Органический слой промывали водой (650 мл) и насыщенным рассолом (550 мл) перед сушкой путем добавления безводного сульфата натрия (500 г). Осушитель удаляли путем вакуумной фильтрации. Высушенный органический слой переносили двумя порциями в круглодонную колбу объемом 3 л и растворители удаляли в высоком вакууме при 35°С. Получали имеющее низкую вязкость красно-оранжевое масло 3-бром-5-метилбензальдегид (159,1 г). С₈Н₇ВгО 199,04 г/моль; ВЭЖХ: ВУ 5,42 мин; чистота 96% при 272 нм; '11 ЯМР δ_Н (400 МГц, СОС1₃): 2.41 (3Н, к, СН₃), 7.58, 7.60, 7.81 (3х1Н, 3хк, 3хАгН), 9.92 (1Н, к, СНО); ¹³С ЯМР 8_С (100 МГц, СОС1₃): 21.17 (СН₃), 123.27 (С-3), 129.15, 129.93 (С-2, С-6), 138.06 (С-1), 138.11 (С-4), 141.33 (С-5), 191.20 (СНО).

3-Бром-5-метилциннамонитрил (4).

Гидрид натрия (60% дисперсия в неорганическом масле, 39,2 г, 0,980 моль) добавляли в четырехгорлую круглодонную колбу объемом 5 л, оборудованную верхним перемешивателем, добавляющей воронкой объемом 250 мл, датчиком внутренней температуры и каналом входа аргона. В колбу в атмосфере аргона добавляли безводный тетрагидрофуран (2,6 л) и перемешивание осуществляли с умеренной скоростью с получением белой непрозрачной суспензии. Диэтилцианометилфосфонат (152,1 мл, 0,941 моль, слегка вязкая бледно-желтая жидкость) вводили в добавляющую воронку объемом 250 мл в атмосфере аргона. Добавление фосфоната осуществляли по каплям в течение 56 мин, в течение которых внутренняя температура росла с 21 до 29°С, и смесь превращалась в менее непрозрачную бледно-желтую суспензию. Раствор перемешивали в течение еще 1 ч, в течение которых внутренняя температура уменьшалась с 29 до 22°С, и смесь превращалась в бледно-желтый прозрачный раствор. 3-Бром-5-метилбензальдегид (159 г, 0,784 моль, предполагается количественный выход, красное масло) переносили из круглодонной колбы объемом 3 л в добавляющую воронку объемом 250 мл путем выливания. Колбу ополаскивали безводным тетрагидрофураном (3х5 мл). Три промывки также выливали в добавляющую воронку, которую затем продували аргоном. Добавление альдегида осуществляли по каплям в атмосфере аргона в течение 71 мин, в течение которых внутренняя температура увеличивалась с 20 до 33°С, и смесь превращалась в темно-оранжевый раствор. Раствор перемешивали в течение еще 2 ч, в течение которых внутренняя температура уменьшалась с 32 до 19°С. Образец для ВЭЖХ темно-коричневого раствора готовили через 1 ч путем разбавления ТГФ. ВЭЖХ способ теста 20 указывал на полное превращение исходного вещества (ВУ 5,42 мин) в один основной продукт со смесью 10:1 Е:2 изомеров (272 нм, ВУ 5,76 мин Ζ; ВУ 5,83 мин Е).

Соляную кислоту (6н., 21,66 мл) и воду (2578,33 мл) смешивали в конической колбе объемом 4 л с получением водного раствора 0,05 М НС1 (2,6 л).

Реакционную смесь разбавляли трет-бутил-метиловым эфиром (0,5 л) и гасили водным 0,05 М НС1 (0,5 л), после чего внутренняя температура увеличивалась до 22°С. Частично погашенную реакционную смесь переносили в делительную воронку объемом 22 л. Остаток из реакционного сосуда переносили в делительную воронку путем последовательного ополаскивания трет-бутилметиловым эфиром (1,5 л), водным 0,05 М НС1 (1,0 л), трет-бутилметиловым эфиром (2,0 л), водным 0,05 М НС1 (1,1 л), третбутилметиловым эфиром (1,2 л). Слои встряхивали в течение 30 с, давая газам возможность для периодического выхода, и водный слой отделяли в колбе объемом 22 л. Органический слой промывали водой (2,0 л) и водные слои объединяли. Органический слой сушили с безводным сульфатом натрия (500 г) в течение 10 мин, и осушитель затем отфильтровывали в вакууме. Растворители удаляли при пониженном давлении с получением бледно-желтого твердого вещества, которое сушили в течение ночи в вакууме

- 69 016267 при 30°С. Получающееся в результате неочищенное вещество (200,2 г) представляло собой желтое порошковидное, но слегка липкое твердое вещество.

Неочищенное желтое твердое вещество (200 г) в трехгорлой круглодонной колбе объемом 2 л, оборудованной внутренним температурным датчиком, добавляющей воронкой объемом 500 мл и верхним перемешивателем, растворяли в метаноле (700 мл) путем погружения в водяную баню при 50°С. После растворения желтое твердое вещество превращалось в красно-оранжевый раствор. Водяную баню удаляли и воду (250 мл) вводили в добавляющую воронку объемом 500 мл. Добавление воды осуществляли по каплям при умеренной скорости перемешивания в течение 3 ч, в течение которых внутренняя температура уменьшалась с 50 до 25°С. Желтое твердое вещество начинало осаждаться из красно-оранжевого раствора через 5 мин и после добавления 50 мл воды. Маточный раствор периодически проверяли при помощи ВЭЖХ для определения отношения Ε:Ζ изомеров в растворе. После добавления 250 мл воды отношение Ε:Ζ составляло 1:1,2 и определялось как благоприятное. Суспензию охлаждали в ледяной бане в течение 10 мин, давая возможность для уменьшения внутренней температуры до 17°С перед фильтрацией через воронку из спеченного стекла объемом 3 л при пониженном давлении. Получающееся в результате твердое вещество промывали охлажденным раствором метанол:вода (1:1, 2х50 мл, 5-10°С). Твердое вещество сушили до постоянной массы в вакуумной печи при 35°С. Получали бледно-желтый твердый 3бром-5-метилциннамонитрил (144,1 г, выход 83%). Это вещество, тем не менее, было загрязнено неудаляемым неорганическим маслом, что обнаруживалось в протонных и углеродных ЯМР спектрах. 3-Бром5-метилциннамонитрил: ^ο^ΒγΝ 222,08 г/моль; ВЭЖХ: Е-изомер ВУ 5,83 мин; чистота 97% при 272 нм. Ζ-изомер ВУ 5,76 мин; -1,7% при 272 нм; '11 ЯМР δΗ (400 МГц, СПС1₃): 2.36 (3Н, 8, СН₃), 5.86 (1Н, ά, .1.... 16.7, СН=СНСЦ), 7.17 (1Н, 8, Аг-Н), 7.28 (1Н, ά, .1.... 16.7, СН=СНСЦ), 7.39 (2х1Н, 8, 2хАг-Н); ¹³С ЯМР 5_с (100 МГц, СОС1₃): 21.23 (СН₃), 97.86 (СН=СНСК), 117.89 (ΌΝ), 123.19 (С-3), 127.03, 127.38 (С-4, С-6), 134.85 (С-2), 135.38 (С-1), 141.16 (С-5), 149.31 (СН=СНСЦ).

3-Йод-5-метилциннамонитрил (1).

Три закрываемые колбы под давлением с закручивающимся верней частью объемом 500 мл (меченые А, В и С) индивидуально оборудовали магнитной мешалкой и располагали над масляными банями, нагретыми до 115°С. В каждую колбу индивидуально и последовательно добавляли 3-бром-5метилциннамонитрил (3х47,5 г, 3x0,214 моль); метаксилол (3x171 мл) с получением оранжевого раствора; диэтиленгликоля диметиловый эфир (3x43 мл); йодид натрия (3x64,12 г, 3x0,428 моль); йодид медиЦ) (3x4,08 г, 3x0,0214 моль) и, наконец, Ν,Ν'-диметилэтилендиамин (3x4,60 мл, 3х0,0427моль), после чего цвет становился темно-зеленым-черным. Резьбовую верхнюю часть каждой колбы ополаскивали метаксилолом (3x1 мл). Затвердевший нерастворимый твердый йодид натрия вносили на шпателе, в то же время дегазируя раствор: постоянные потоки аргона продували через растворы в каждой колбе в течение 10 мин.

Три колбы закрывали в атмосфере аргона и погружали в соответствующие масляные бани при 115°С, обеспечивая умеренную скорость перемешивания в каждой. Реакционным смесям давали возможность перемешиваться при 115°С за противоударным экраном в течение 14 ч ночью.

После этого обнаружили, что в колбе С перемешивание остановилось. Колбам давали возможность охладиться на воздухе в течение 5 мин перед открыванием. Образцы для ВЭЖХ из трех реакций готовили путем удаления метаксилола при пониженном давлении и растворения в МеСК Анализ осуществляли с использованием способа ВЭЖХ в тесте 20.

Колба А: основной продукт (ВУ 5,97 мин), 2,5% исходного вещества (ВУ 5,83 мин).

Колба В: основной продукт (ВУ 5,97 мин), 1,0% исходного вещества (ВУ 5,83 мин). Колба С: основной продукт (ВУ 5,97 мин), 20% исходного вещества (ВУ 5,83 мин).

Все три колбы дегазировали путем продувания постоянных потоков аргона через соответствующие реакционные смеси в течение 10 мин. Три колбы закрывали в атмосфере аргона и погружали в соответствующие масляные бани при 120°С, обеспечивая умеренную скорость перемешивания в каждой. Реакционные смеси оставляли перемешиваться при 120°С за противоударным экраном в течение 2 ч. После этого колбам давали возможность охлаждаться на воздухе в течение 5 мин перед их открыванием. Образцы трех реакционных смесей для ВЭЖХ готовили путем удаления метаксилола при пониженном давлении и растворения в МеС№ Анализ осуществляли с использованием способа ВЭЖХ теста 20.

Колба А: Основной продукт (ВУ 5,97 мин), 1,9% исходного вещества (ВУ 5,83 мин).

Колба В: Основной продукт (ВУ 5,97 мин), 0,9% исходного вещества (ВУ 5,83 мин). Колба С: Основной продукт (ВУ 5,97 мин), 7,5% исходного вещества (ВУ 5,83 мин).

По-видимому, взаимодействия А и В завершались, и реакционные смеси оставляли охлаждаться до комнатной температуры. Колбу С вновь дегазировали путем продувания постоянного потока аргона через реакционную смесь в течение 10 мин. Колбу закрывали в атмосфере аргона и погружали в масляную баню при 125°С, обеспечивая умеренную скорость перемешивания. Реакционную смесь оставляли перемешиваться при 125°С за противоударным экраном в течение еще 4 ч.

После этого колбе С давали возможность охлаждаться на воздухе в течение 5 мин перед тем, как ее открыли. Образец реакционной смеси для ВЭЖХ готовили путем удаления метаксилола при понижен

- 70 016267 ном давлении и растворения в МеСК Анализ осуществляли с использованием способа ВЭЖХ теста 20/

Колба С: основной продукт (ВУ 5,97 мин), 2,0% исходного вещества (ВУ 5,83 мин). По-видимому, взаимодействие С завершилось и реакционную смесь оставляли охлаждаться до комнатной температуры.

Содержимое колбы А разбавляли трет-бутилметиловым эфиром (2x150 мл) и смесь фильтровали в вакууме для удаления нерастворимых веществ через воронку объемом 3 л из спеченного стекла, содержащую целит (1,5 л), предварительно промытый трет-бутилметиловым эфиром. Колбы В и С аналогично разбавляли и фильтровали через ту же самую воронку из спеченного стекла с целитом с концентрированием трех фильтратов А, В и С в конической колбе объемом 12 л. Колбы ополаскивали и целит элюировали трет-бутилметиловым эфиром (3 л).

Объединенные фильтраты повторно фильтровали в вакууме через прозрачную воронку объемом 3 л из спеченного стекла, содержащую свежий целит (1,5 л), предварительно промывали третбутилметиловым эфиром для удаления оставшихся мутных частиц. Элюирование осуществляли третбутилметиловым эфиром (4 л). Получающийся в результате прозрачный красно-коричневый фильтрат был стабилен при хранении при 4°С в течение 48 ч.

Фильтрат концентрировали при пониженном давлении при 40°С и кипящие при высокой температуре растворители затем удаляли в высоком вакууме при 45°С. Совместное упаривание с метанолом (2x50 мл) позволило получить неочищенное коричневое твердое вещество (203 г).

Неочищенное коричневое твердое вещество (200 г) в трехгорлой круглодонной колбе объемом 2 л, оборудованной внутренним температурным датчиком, добавляющей воронкой объемом 500 мл и верхним перемешивателем, растворяли в метаноле (700 мл) путем погружения в водяную баню при 53°С. После растворения коричневое твердое вещество превращалось в красно-коричневый раствор. Водяную баню удаляли и воду (300 мл) добавляли через добавляющую воронку объемом 500 мл. По каплям в течение 3 ч добавляли воду с умеренной скоростью перемешивания, в течение которых внутренняя температура уменьшалась с 50 до 24°С. Желтовато-коричневое твердое вещество начинало осаждаться из красно-коричневого раствора через 10 мин и добавления 80 мл воды. Маточный раствор периодически проверяли при помощи ВЭЖХ для определения отношения изомеров Ε:Ζ в растворе. После добавления 300 мл воды отношение Ε:Ζ составляло 1:1,1 и определили, что оно является благоприятным. Суспензию охлаждали в течение 14 ч для уменьшения внутренней температуры до 4°С перед фильтрацией через воронку объемом 3 л из спеченного стекла при пониженном давлении. Получающееся в результате твердое вещество промывали охлажденным раствором метанол:вода (1:4, 100 мл, затем 200 мл, 5°С). Твердое вещество сушили до постоянной массы в вакуумной печи при 35°С. Получали бледно-коричневый твердый 3-йод-5-метилциннамонитрил (149,4 г, выход 86%). Тем не менее, это вещество содержало примеси неудаленного минерального масла, о чем свидетельствовали протонные и углеродные ЯМР спектры.

Слегка липкое коричневое твердое вещество (148,8 г) в конической колбе объемом 2 л растворяли в ацетонитриле (1,5 л) с получением темно-оранжевого-коричневого раствора с нерастворимыми глобулами минерального масла. Это смесь фильтровали под действием силы тяжести через фильтровальную бумагу (АЬа1тап, 541) с удалением большей части минерального масла (10,6 г). Фильтрат переносили в делительную воронку объемом 4 л и промывали гептаном (0,5 л). Гептановый слой экстрагировали ацетонитрилом (250 мл) и концентрировали при пониженном давлении с получением дополнительного количества минерального масла (3,2 г). Ацетонитрильные слои объединяли, концентрировали при пониженном давлении и сушили в вакуумной печи при 35°С с получением 3-йод-5-метилциннамонитрила (132,5 г, выход 77%) в виде светло-коричневого твердого вещества. Обнаружили, что это вещество не содержит минерального масла в соответствии с протонным и углеродным ЯМР спектрами. 3-Йод-5метилциннамонитрил: ЦЩГЫ 269,08 г/моль; т.пл.: 98°С размягчения, 99-100°С плавления; ВЭЖХ (ацетонитрил): Е-изомер ВУ 5,97 мин; чистота 97% при 272 нм (3-бром-5-метилциннамонитрил, Е-изомер ВУ 5,83 мин; -1,4% при 272 нм.); '11 ЯМР δ_Н (400 МГц, СБС1₃): 2.33 (3Н, з, СН₃), 5.85 (1Н, й, Ι_Η,_Η 16.7, СΗ=СΗСN), 7.20 (1Н, з, Аг-Η), 7.25 (1Η, й, Ι_Η,_Η 16.7, €Η=№Ν), 7.59, 7.60 (2χ1Η, 2хз, 2хАг-Ц); ¹³С ЯМР δο (100 МГц, СБС1₃): 21.09 (СЩ), 94.93 (С-3), 97.70 ^Η^^Ν), 117.91 (ΟΝ), 127.61 (С-6), 133.37 (С-2), 135.44 (С-1), 140.81 (С-4), 141.15 (С-5), 149.18 ^Η^^Ν).

Пример 11.

Абсолютная конфигурация соединения ΐΐΐ метилового эфира (2-карбамоил-5-хлор-1Н-индол-3-ил)[3-((Е)-2-циановинил)-5-метилфенил]-(К)фосфиновой кислоты.

мг соединения ΐΐΐ суспендировали в 50 мл анизола. Кристаллы, подходящие для рентгеноструктурного анализа одиночного кристалла, образовывались через 2 суток. Кристаллы были моноклинными с пространственной группой Р21 и размерами элементарной ячейки а = 13,0983 А, Ь = 10,9625 А, с = 16,4266 А, α = 90°, β = 103.6063° и γ = 90°. В кристалле асимметрическая ячейка содержала две независимые молекулы соединения ΐΐΐ (молекула А и молекула В), и единичную частично занятую (приблизительно 86%) молекулу анизола в качестве растворителя. Параметр Е1аск определяли равным -0,04(7) для молекулы А и 1,04(7) для молекулы В. Исходя из предшествующего определения, определили абсолютную стереохимию, и оба хиральных центра по Р1 А и Р1 В находились в К-конфигурации. На фиг. 2А приведено изображение молекулы А, включающее стереохимию по Р1 А, а на фиг. 2В приведено изобра

- 71 016267 жение молекулы В, включающее стереохимию по Р1 В.

Пример 12.

Фармакология соединения ΐ (метиловый эфир 2-карбамоил-5-хлор-4-фтор-1Н-индол-3-ил)-[3-((Е)-2циановинил)-5-метилфенил]-(В)фосфиновой кислоты и соединения ΐΐΐ (метиловый эфир 2-карбамоил-5хлор-1Н-индол-3-ил)-[3-((Е)-2-циановинил)-5-метилфенил]-(В)фосфиновой кислоты.

В следующих таблицах представлена активность энантиомерно чистых 3-фосфоиндольных соединений ΐ и ΐΐΐ против НА ш νίΙΐΌ в анализах, включающих анализ резистентности к тестируемым лекарствам. В табл. 1 представлена активность соединений против панели мутантных ферментов обратных транскриптаз Ш'-1. Противовирусную активность 3-фосфоиндольных соединений: соединения ΐ и соединения ΐΐΐ сравнивают с активностью контрольного соединения ЕЕ' (эфавиренз, 6-хлор-4циклопропилэтинил-4-трифторметил-1,4-дигидро-2Н-3,1-бензоксазин-2-она) в отношении различных вирусов.

Как представлено в табл. 1, соединение ΐ ингибировало фермент обратную транскриптазу Ш'-1 (ВТ) (подтип В, штамм ВН10) со средней ингибирующей концентрацией (1С₅₀), находящейся в диапазоне от 0,366 ± 0,251 мкМ (ВТ дикого типа) до 1,411 ± 0,873 мкМ (Ι<103Ν/Υ181ί’). Аналогично, 1С₅₀ соединения ΐΐΐ находится в диапазоне от 0,343 ± 0.083 мкМ (ВТ дикого типа) до 1,614 ± 0,279 мкМ (Ι<103Ν/Υ181ί’). Соединение ΐ и соединение ΐΐΐ не ингибировали человеческие полимеразы альфа (1С₅₀ > 145 мкМ), бета (1С₅₀ > 422 мкМ) или гамма (1С₅₀ > 60 мкМ), как представлено в табл. 5, что демонстрирует избирательность тестируемых соединений. Кристаллографические исследования с соединением ΐ и двойным мутантом НЕ' ВТ К103N/Υ181С выявили, что соединение ΐ связывается с известным гидрофобным карманом ΝΝΕΉ в ферменте.

В культуральных анализах с Н1'-1 с использованием клеток МТ-4 и подтипа В Н['-1 (штамм ВН10), соединение ΐ и соединение ΐΐΐ ингибировали продукцию Н[' со средней эффективной концентрацией (ЕС50) 1 и 1,2 нМ соответственно (см. табл. 6). В анализах, осуществляемых с человеческими РВМС, соединение ΐ и соединение ΐΐΐ ингибировали продукцию Н1'-1 со средней ЕС₅₀ 0,4 нМ (штамм ВН-10) или 1,5 нМ (штамм ΝΣ4-3). Против 3 различных вирусных штаммов Н1'-1 в 5 различных линиях человеческих клеток диапазон ЕС50, определенный для соединения ΐ, составлял 0,5-2,0 нМ и для соединения ΐΐΐ составлял 0,5-1,7 нМ. Соединение ΐ и соединение ΐΐΐ обладали активностью против панели 9 различных подтипов Н['-1 с соответствующими диапазонами активности от 0,25 до 3,2 нМ и от 0,2 до 2,14 нМ. Активности соединения ΐ и соединения ΐΐΐ уменьшались в 24,8 и 19,5 раз соответственно в присутствии альфа-1 кислого гликопротеина и 45% человеческой сыворотки крови.

В 4-суточном тестировании цитотоксичности в 6 линиях человеческих клеток-хозяев Н1'-1 соединение ΐ и соединение ΐΐΐ продемонстрировали среднюю цитотоксическую концентрацию (СС50) от 16,6 до 32,9 мкМ и от 14,8 до 50,0 мкМ соответственно. Для РВМС определили значения СС₅₀ 52,6 (соединение ΐ) и 66,9 мкМ (соединение ΐΐΐ). В 9-12 суточном тестировании в линиях клеток НеЬа, НиН7 и НерС2 значения СС₅₀ для соединения ΐ и соединения ΐΐΐ находились в диапазоне от 23,5 до 31,5 мкМ. На основе отношений СС₅₀/ЕС₅₀, определенных для клеток МТ-4, индекс селективности (8ΐ) >22000 и >18000 рассчитали для соединения ΐΐΐ и соединения ΐ соответственно.

В тестировании перекрестной резистентности с использованием множества клеточных линий и штаммов Н['-1 соединение ΐ и соединение ΐΐΐ сохраняли хорошую активность против резистентных вирусов ΝΝΚΉ, несущих мутации К103Ы, Υ181ί’ или Ι<103Ν/Υ181ί’ (соответствующие значения ЕС₅₀ оставались ниже 4,5 и 14,5 нМ), тогда как ЕЕ' продемонстрировал значительную резистентность против двойного мутанта в частности (значения ЕС₅₀ от 36 до 116 нМ).

Профиль резистентности для соединения ΐ и соединения ΐΐΐ исследовали глубже с использованием 3 различных панелей вирусов в тесте, осуществляемом Моподгат Вю8е1епее8 (ранее 'иоЬодю): скрининговая панель от слабо до умеренно резистентных к ЕЕ' вирусов; панель из 8 высокорезистентных к ЕЕ' вирусов и широкий спектр панели 64 вирусов, включающей 40 резистентных к ΝΝΚΉ вирусов с единичными, двойными и тройными мутантами по резистентности к ΝΝΚΉ. Соединение ΐ и соединение ΐΐΐ высокоактивны против субпанели мутантов, несущих мутации ΝΕΉ и Р1. Соединение ΐ и соединение ΐΐΐ превосходили ЕЕ' в отношении, по существу, всех резистентных к ЕЕ' вирусов, включающих вирусы с двойными и тройными мутантами. Соединение ΐ в 2-3 раза более сильное, чем соединение ΐΐΐ в отношении резистентных к ЕЕ' вирусов с двойными и тройными мутантами.

В сериях исследований взаимодействия 1п νίΙΐΌ не обнаружено отрицательное взаимодействие между соединением ΐ и соединением ΐΐΐ и 7 Ν^Π или 6 Р1, одобренных для терапии Н1'-1 в клинической практике.

- 72 016267

Основная фармакодинамика.

Перечень сокращений

ΙΙΙΒ обычно используемый лабораторный штамм Ηΐν-1

А98 Аланин в позиции 98 в КТ

ААС Альфа-1 кислый гликопротеин

АЮ8 Синдром приобретенного иммунодефицита

ΑΖΤ Зидовудин

ВН10 Лабораторно адаптированный штамм человеческого вируса иммунодефицита 1 типа

СС₅₀ средняя цитотоксическая концентрация

СРЕ цитопатическое действие

ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота ϋ8Α Анализ чувствительности к лекарству

Е138К Замена глутамата на лизин в позиции 138 в КТ

ЕС₅о средняя эффективная концентрация

ΕΕν Эфавиренз

ИФА иммуноферментный анализ

Е227Е/[_ Фенилаланин/лейцин в позиции 227 в КТ

ФТС фетальная телячья сыворотка

С190А Замена глицина на аланин в позиции 190 в КТ

С190А/С Глицин/аланиновая замена в позиции 190 в КТ

С1908 Замена глицина на серин в позиции 190 в КТ

СЕР надлежащая лабораторная практика

Н9 Человеческая Т-клеточная линия, полученная у пациента, страдающего от Т-клеточной лимфомы

НерС2 Человеческая линия клеток лимфомы

- 73 016267

Не!_а

Человеческая линия клеток, выделенная у пациента,

страдающего от аденокарциномы

Ηΐν, Ηΐν-1 Вирус иммунодефицита человека 1 типа

Ηΐν-2	Вирус иммунодефицита человека 2 типа
Н8	Человеческая сыворотка
НиН7	Человеческая линия клеток гепатомы
1С₅₀ ΙΝϋ	50% ингибирующая концентрация Исследуемое новое лекарство
К101Е	Замена лизина на глутамат в позиции 101 в КТ
Κ103Ν	Замена лизина на аспарагин по остатку 103 в КТ
К103К	Замена лизина на аргинин по остатку 103 в КТ
К1033	Замена лизина на серин в позиции 103 в КТ
1.1001	Замена лейцина на изолейцин в позиции 100 в КТ
М184У	Замена метионина на валин в позиции 184 в КТ
мг	миллиграмм

МОЬТ-4 Человеческие Т-клетки, выделенные у пациента, страдающего от лейкемии

МТ-2	Человеческая Т-клеточная линия, выделенная у пациента,

страдающего от Т-клеточной лейкемии взрослых

МТ-4	Человеческая Т-клеточная линия, выделенная у пациента,

МТ5	(3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-

сульфофенил)-2Н-тетразолий, внутренняя соль)

МТТ	3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенил-тетразолия бромид
ΝΑΜ	Ассоциированная с нуклеозидом мутация

N1.4-3, 4595 Обычно используемый лабораторный штамм ΗΙΥ-1

нМ	наномольный
ΝΝΚΤΙ,	ΝΝΚΤΙ Ненуклеозидный(ые) ингибитор(ы) обратной

транскриптазы

ΝΚΤΙ	Нуклеозидный/нуклеотидный ингибитор обратной

транскриптазы

Р225Н	Замена пролина на гистидин по остатку 225 в КТ
Р227Ь	Замена пролина на лейцин в позиции 227 в КТ
Ρ236Ι.	Замена пролина на глицин в позиции 236 в КТ
р24 р28 ΡΙ	Ηΐν р24 коровый белок δίν р28 коровый белок Ингибитор протеазы
РВМС	Мононуклеарные клетки периферической крови
КС	Реплицирующая способность
КОО	Обычно используемый лабораторный штамм ΗΙΧ/-2
КТ	Обратная транскриптаза
СО	Стандартное отклонение
3Ι	Индекс избирательности
3ΐν	Вирус иммунодефицита обезьян
ΙΙ937	Человеческая моноцитарная клеточная линия, выделенная у

пациента, страдающего от лимфомы

νΐΟ6Α	Замена валина на аланин в позиции 106 в КТ
УЮбМ	Замена валина на метионин в позиции 106 в КТ
71081	Замена валина на изолейцин в позиции 108 в КТ
νΐ79ϋ	Замена валина на аспарагиновую кислоту по остатку 179 в КТ

\Л/Т, νν.Τ., ννΐ Дикий тип

У181С	Замена тирозина на цистеин по остатку 181 в КТ
У181У	Замена тирозина на валин в позиции 181 в КТ
ΥΙ 881_	Замена тирозина на лейцин в позиции 188 в КТ
мкг	микрограмм
мкМ	микромоль

- 74 016267

Противовирусная активность ш νΐΐΐΌ против фермента Н1У КТ.

Профили активности соединения I, соединения III и ЕРУ против Н1У КТ определяли с использованием панели анализов обратной транскриптазы (КТ) ШУ ш νΐΐΐΌ, как представлено в табл. 1. В них использовали фермент КТ дикого типа, полученный из ШУ подтипа В (штамм ВН-10), вместе со стандартной панелью резистентных к NNКТI сайт-направленных мутантных ферментов с заменами Κ103Ν и У181С самостоятельно или в комбинации.

При тестировании ш νΐΐΐΌ соединение I ингибировало транскрипцию ревертазы ШУ с ГС₅₀ в диапазоне от 0,366 ± 0,251 мкМ (КТ дикого типа) до 1,411 ± 0,873 мкМ (Κ103Ν/Υ181^. Аналогично, значения ГСзо для соединения III находятся в диапазоне от 0,343 ± 0,083 мкМ (КТ дикого типа) до 1,614 ± 0,279 мкМ (Κ103Ν/Υ181^. ЕРУ позволил получить ожидаемый ш νΐΐΐΌ профиль ингибирования, демонстрирующий активность дикого типа против фермента Υ181^ но значительно нарушенную активность против мутантных ферментов Κ103Ν и Κ103Ν/Υ1816.

Таблица 1

Активность против ШУ-1 КТ в иммуноферментном анализе

Соединение

Средние значения 1С₅о (мкМ) ± стандартное отклонение \Л/.Т.^а

У181С^Ь

Κ103Ν¹³

У181С/К1031Ч^ь

I

ΪΙΙ

ЕРУ

0,366±0,251

0,343±0,083

0,055±0,019

0,526±0,285 0,782+0,801

0,361±0,086 2,203±1,259

0,0765+0,047 1,7973±0,19

1,411+0,873

1,614±0,279

1,4313±0,31

ГСзо - концентрация ингибитора, которая уменьшает ферментативную активность на 50%.

N - количество проведенных повторных экспериментов. ^а - фермент КТ ШУ-1 дикого типа в носителе ВН10.

Относительную активность тестируемого агента и агента, используемого для сравнения, против различных вирусов можно видеть из данных кратной резистентности, представленных в табл. 2.

Таблица 2

Соединение		Кратное изменение
νν.τ.	У181С	Κ103Ν	У181С/ Κ103Ν
1	1	1,6±0,7	3,2±3,5	5,0±3,4
III	1	3,2±1,1	1,2±0,4	12,7±4,3
ЕРУ	1	2,3±1,5	34,3+17,5	36,8±20,5

Кратное изменение - ЕС50 для мутантного ШУ, деленное на ЕС50 для вируса

ШУ дикого типа.

Среднее кратное изменение рассчитывали как среднее значение индивидуальных кратных изменений, тестированных в параллельных исследованиях.

Рассчитанные концентрации лекарства, необходимые для блокирования 50% фермента (4С₅₀), и данные, показанные в табл. 1-4, измеряли в присутствии детергента (который увеличивает значение ГС₅₀), тем не менее, в отсутствие детергента, как правило, получали меньшие значения. Противовирусная активность ш νΐΐΐΌ против дополнительных мутантных ферментов ШУ КТ. Соединения I и III тестировали против более широкой панели ферментов КТ, несущих обычные мутации резистентности к ΝΝΗΣΕ Данные эффективности представлены в табл. 3, и соответствующие кратные изменения обобщены в табл. 4. Исследования обобщены в следующем тексте.

- 75 016267

Таблица 3

Антивирусная активность ίη νίΐΓΡ против сайт-направленных мутантных ферментов Н1У-1 ВТ

Средние значения 1С₅о (мкМ) ± стандартное отклонение

Мутация КТ νν.τ?

1_1001^с

У106М^с

Соединение I

0,23±0,05

0,23±0,06

Соединение III

0,20±0,06

ЕЕУ

0,04±0,006

Ц26±0?09

У1081^с

1,20±0,71

Е138К^СΜ184ν^ά

Υ18811.° и001/К103№

Диапазон средней

0,43±0,33

0,16-4,67

2,99±0,18

0,40±0,26

0,13-2,99

0,6±0,16

0,02±0,00

1,73±0,22 >2

0,02->2 активности (мкМ)

1С₅₀ - концентрация ингибитора, которая уменьшает ферментативную активность на 50%. ^а - если не указано иное, количество проведенных повторных экспериментов для фермента. ^Ь - фермент ВТ Н1У-1 дикого типа в носителе ВН10.

^с - ферменты ВТ, полученные из ВН10, с сайт-направленными мутациями лекарственной резистентности к ΝΝΚΙΊ.

^ά - фермент ВТ, полученный из ВН10 с сайт-направленными мутациями лекарственной резистентности к ΝΚ.ΊΊ.

^е - два набора данных, использованных для расчетов 1С₅₀

Как можно видеть из данных, соединение III и соединение I сохраняют значительную эффективность ίη νίΐΐΌ против ферментов ШУ ВТ с заменами по кодонам 100, 106, 184 и 134. Значительная утрата эффективности обнаружена только для мутантов по кодонам 108, 138 и 188.

Таблица 4

Кратная резистентность против панели сайт-направленного мутанта НГУ-1 ВТ

Средние кратные изменения±стандартное отклонение
Мутация КТ	N	Соединение I	Соединение III	ЕРУ
νν.τ?	10	1	1	1
Ь1001°	3	0,5±0,2	0,6±0,6	3,3+4,0
УЮбМ⁰	3	1,2±0,5	1,0±0,3	13,4±8,2
У108Г	3	4,0±5,3	3,8±3,8	3,7±2,3
Ε138Κ°	3	15,5±6,8	13,7±1,9	7,6±7,5
М184У^а	4	1,7±0,5	0,8±0,3	0,8±0,4
Υ18811-°	3	6,0±1,7	7,0±5,9	59,6±25,8
1_1001/К103№	4	2,4±1,2	1,8±0,8	>101±43,2
Диапазон средней активности (мкМ)		0,5-15,5	0,6-13,7	0,8-101

Кратная резистентность - КА, для мутантного ШУ-1 КТ, деленная на КХ, для фермента дикого типа в соответствующем анализе.

Среднее кратное изменение рассчитывали как средние значения для индивидуальных кратных изменений, тестированных в параллели.

N - количество повторных наборов проведенных экспериментов, за исключением случаев, указанных в сносках.

^а - два набора данных, используемых для расчета средней кратной резистентности.

В общем, соединения I и III приводят к кратным изменениям, находящимся в диапазоне от 0,5±0,2 до 15,50±6,8.

Влияние человеческих ДНК полимераз альфа, бета и гамма.

ШУ ВТ, подобно другим вирусным полимеразам, обладает ограниченной структурной гомологией с клеточными ДНК полимеразами, ответственными за нормальный синтез и восстановление ядерной и митохондриальной ДНК. Последнее увеличивает формальную возможность того, что ингибиторы ШУ ВТ могут ингибировать клеточные полимеразы, приводя в результате к клеточной токсичности. В част

- 76 016267 ности, ингибирование полимеразы гамма потенциально приводит в результате к митохондриальной токсичности. Способность соединения I и соединения III ингибировать клеточные ДНК полимеразы оценивали с использованием стандартных анализов ιη νΐΐΓΟ (табл. 5).

При тестировании ιη νΐΐΓΟ соединение III, соединение I и ЕРУ не достигали Κ'\₀ с человеческой клеточной ДНК полимеразой альфа или бета в концентрациях, находящихся в диапазоне от 100 - >450 мкМ. Аналогично, предварительные данные (η = 1) продемонстрировали, что ΚΥ₀ соединения I и ЕРУ составляли >100 мкМ против активности человеческой ДНК полимеразы гамма ιη νΐΐΓΟ, тогда как соединение III имело ГС₅₀ 60,1 мкМ против этого фермента.

Таблица 5

Активность ιη νΐΐΓΟ против человеческих клеточных ДНК-зависимых полимераз альфа, бета и гамма

Соединение	Ν	Средние значения 1С₅₀ (мкМ) ± стандартное отклонение
ДНК Пол. альфа³	ДНК Пол. бета⁰	ДНК Пол. гамма⁰
1	4/4/1	145,7±44,5	>422,2±149,6	118,5
III	4/4/1	159,3+84,3	>479,0±41,9	60,1
ЕРУ	4/4/1	108,6±40,9	314,2±177,2	116,3
ΑοΐΌ	4/4/1	16,1±11,2	23,0±10,4	16,9

1С\₀ - концентрация ингибитора, которая ингибирует ферментативную активность на 50% ίη νΐΐΓΟ.

Ν - количество проведенных повторных экспериментов для каждой полимеразы. АсТ I) - актиномицин I), используемый в качестве положительного контроля в анализе. ^а - человеческая ДНК полимераза альфа. ^ь - человеческая ДНК полимераза бета. ^с - человеческая ДНК полимераза гамма.

предварительные данные в результате единичного эксперимента.

Прямая демонстрация связывания с ШУ КТ.

Осуществляли определение структуры Κ103Ν/Υ181Ρ двойного мутанта ШУ КТ (фермент того же самого штамма ВН-10, который использовали в анализах активности), сокристаллизованного с соединениями I и III.

NNКТI обычно являются небольшими и обладают сильной аффинностью в отношении гидрофобного кармана, располагающегося рядом с каталитическим КТ. Связывание ингибитора ограничивает гибкость фермента и влияет на правильный синтез ДНК (С1ауе1 αηά Няпсс, ШУ Жид ΓΟδίδΐαικο. Ν Εη§1. I. Мей.; 350:1023-35 (2004)).

Осуществляли кристаллизацию мутантного белка Κ103 Ν/Υ181С в присутствии соединения I. Рекомбинантный ШУ-1 Κ103 Ν/Υ181С КТ белок концентрировали в присутствии соединения I, затем использовали в последующих экспериментах микрозатравки кристаллов с получением белковых кристаллов, имеющих размер, достаточный для того, чтобы дать возможность для сбора данных рентгеноструктурного анализа. Одиночный кристал использовали для дифракции рентгеновских лучей и моделирования. При 3А схематически представлено соединение I, связавшееся с карманом NNКТI в ШУ-1 КТ.

Рентгеновская кристаллическая структура соединения I в сокомплексе с ферментативно активным Κ103Ν/Υ181Ο ШУ-1 двойным мутантным ферментом представлена на фиг. 1А и схематически изображена на фиг. 1В. Структура демонстрирует связывание соединения I с карманом NNКТI в ШУ КТ аналогично с одобренным лекарством эфавиренз (ВасРе1ег, еΐ а1., I. У1го1.; 75:4999-5008 (2001)). Индольное кольцо соединения I можно обнаружить в тесной близости с кодонами 101 и 103 в ШУ-1 КТ.

Клеточная активность.

В этом разделе обобщены профили антивирусной активности соединения I и соединения III против ШУ-1 и ШУ-2 в системах культуры клеток. Эти активности измеряли в широком разнообразии анализов и конечных точек с использованием множественных штаммов ШУ и типов человеческих клеток, которые поддерживают репликацию ШУ.

Пример 13. Активность против штамма ВН10 ШУ-1.

Стандартный используемый клеточный анализ ШУ представлял собой 4-суточный анализ в клетках МТ-4 со считыванием путем р24 ИФА. Активность против ШУ-1 ιη νΐΐΓΟ (значение ЕС₅₀) для ГОХ12899 определяли в стандартном клеточном анализе чувствительности к лекарству (Б8А), по существу, как описано у ^еν^ηе Ό., МаОеиъ Ν., ΚΐηΛΐη§ΐοη Ό. (2000), А^гОга1 МеО αηά Ργοϊ. Нитаη Ρκ'δδ ^с., То1оии, ΝΡ 185-199. Тестируемый вирус ШУ-1 имеет подтип В, происхождение из штамма ВН10. Стандартная тестируемая панель включала вирус дикого типа, а также Υ181^ Κ103Ν и Κ103Ν/Υ181Ο сайтнаправленные производные мутанты дикого типа. Данные этого анализа обобщены в табл. 6 ниже. Против вируса дикого типа ВН10 ингибирующие активности соединения I и соединения III, и ЕРУ были близки с ЕС50 приблизительно 1 нМ. Контрольные значения хорошо согласовывались с ранее опубликованными результатами (Υοηη§ еΐ а1., 1995, АийтгсгоЬ А^^8 СРетоШег: 39(12):2602-5; Αηά^^еδ еΐ а1.,

- 77 016267

2004, Αηΐ^т^с^οЬ ΑηοίιΓ СкетοШе^; 48(12):4680-6; бапззеп е! а1., 2004, I. Меб. 01ет.; 48(6): 1901-9; Воопе 2006, Οπγγ. ()рт Ипуезбд Бгидз; 7(2): 128-35) и результатам, полученным с использованием анализа Ркепо8сгееп™.

_______________________________________________Таблица 6

Средние значения 1С₅₀ (мкМ) ± стандартное отклонение

Соединение N ДНК Пол. ДНК Пол. ДНК Пол. гамма⁰ альфа³ бета^ь

1	4	145,7144,5	422,21149,6	118,5
III	4	159,3184,3	>479,0141,9	>95,219,5
ЕРУ	4	108,5140,9	314,21177,2	>100
Αοί. ϋ	4	16,1111,2	23,0110,4	11,811,9
ббСТР	4	н/п	н/п	1,510,6

ΙΟ₅₀ - концентрация ингибитора, которая ингибирует ферментативную активность на 50% 1п уйго.

Ν - количество проведенных повторных экспериментов для каждой полимеразы. Αсΐ. Ό - актиномицин Ό, используемый в качестве положительного контроля ингибитора в анализе. ййСТР - дидезоксицитидин трифосфат, используемый в качестве положительного контроля ингибитора в анализе ДПК полимеразы гамма. н/п - не применимо. ^а - человеческая ДПК полимераза альфа. ^Ь - человеческая ДПК полимераза бета. ^с - человеческая ДПК полимераза гамма. ^ά - обнаружены видимые преципитаты.

Против мутантных вирусов ΕΕν демонстрировал ожидаемый профиль антивирусной активности; он эффективно ингибировал рост вируса Υ181Ο (ЕС₅₀ = 2,5 нМ), но существенно менее активен против мутантных вирусов Κ103Ν или Υ181Ο/Κ103Ν (средние значения ЕС₅₀ от 41 до 42 нМ). Активности различных тестируемых продуктов против мутантных вирусов очевидны из соответствующих значений кратной резистентности, обобщенных в табл. 7. Все 5 соединений продемонстрировали похожую уменьшенную активность против мутанта Υ181Ο (среднее изменение кратности находится в диапазоне от 2,3 до 3,7). Тогда как ΕΕν продемонстрировал в среднем 34,3-кратное изменение против вируса Κ103Ν, оставшиеся соединения продемонстрировали, по существу, неизмененную активность (0,8-1,2-кратное) Таблица 7

Кратность резистентности соединений против вируса ΗΙΥ-1 ВП10

Соединение	Кратность изменений
νν.τ.	У181С	Κ103Ν	Κ103Ν/Υ181ΰ
Соед. I	1	3,4±1,7	0,910,4	4,512,5
Соед. III	1	3,211,1	1,210,4	12,7±4,3
ЕРУ	1	2,311,5	34,3117,5	36,8120,5

Кратность изменений - ЕС₅₀ для мутанта ΗΙν, деленная на ЕС₅₀ для вируса ΗΙν дикого типа.

Среднее кратное изменение рассчитывали как среднее значение индивидуальных кратных изменений, тестированных в параллели.

Активность соединений также оценивали с тем же самым вирусом и типом клеток с использованием различной визуализации результатов анализа на основе цитопатического эффекта (СРЕ). В этом анализе измеряют клеточную жизнеспособность после инфекции ΗΙν-1, нежели чем продукцию капсидного белка, и также он отличается от стандартных анализов с точки зрения организации и проведения анализа и, следовательно, обеспечивает полезное доказательство результатов, полученных при помощи последнего способа. Данные 5 независимых экспериментов обобщены в табл. 8 ниже.

Таблица 8

Активность против вирусов ΗΙΥ-1 ВП10 в МТ-4 клеточном анализе СРЕ

Соединение	М^а	Средние значения ЕС₅₀ (мкМ) ± стандартное отклонение
νν.τ?	γίδΐΰ¹¹	Κ1Ο3Ν⁰	Κ103Ν/Υ181Ο ь
Соед. 1	5	0,000310,0001	0,001810,0003	0,000310,0001	0,003510,0015
Соед. III	5	0,000210,0001	0,001510,0006	0,000110,0001	0,006610,0010
ЕЕУ	5	0,000610,0001	0,001610,0001	0,041010,0130	0,053010,0120

- количество проведенных повторных экспериментов.

^Ь - адаптированные для лаборатории вирусы дикого типа и сайт-направленные мутантные вирусы ВП10.

- 78 016267

Таблица 9

Соединение	Кратность изменений
νν.τ.	У181С	Κ103Ν	К103Ы/У181С
Соед. 1	1	6,5±0,9	1,0±0,3	12,7±5,0
Соед. III	1	11,914,7	1,1+0,3	55,6±21,8
ЕЕУ	1	2,7±0,7	66,8+14,8	88,0+20,5

Кратность изменений - ЕС₅₀ для мутанта ШУ, деленная на ЕС₅₀ для вируса ШУ дикого типа.

В анализе СРЕ репликация вируса ВН10 АТ сильно ингибировалась соединением Ι, соединением ΙΙΙ и ЕРУ, как представлено субнаномольными средними значениями ЕС₅₀ (диапазон от 0,1 до 0,7 нМ).

Вирусы панели У181С, Κ103Ν и Κ103Ν/Υ1816 ВН10 эффективно ингибировались соединением Ι, соединением ΙΙΙ, со средними значениями ЕС₅₀, находящимися в диапазоне от 0,1 до максимально 6,6 нМ. Как ожидалось, ЕРУ эффективно ингибировал рост вируса Υ181^ но был гораздо менее активным против других мутантных вирусов (значения ЕС₅₀ от 41 до 53 нМ). Контрольные значения хорошо согласовывались с ранее описанными результатами ^оипд еί а1., 1995, АтжисгоЬ Адеп!к СйетоШег: 39(12):2602-5; Апбпек еί а1., 2004, АпйткгоЬ Адеп!к СйетоШег; 48(12):4680-6; 1апккеп еί а1., 2004, I. Меб. Скет.; 48(6): 1901-9; Воопе 2006, Сигг. Орт Пиекбд Бгидк; 7(2): 128-35).

С точки зрения кратности изменений по сравнению со штаммом ВН10 АТ соединение Ι, соединение ΙΙΙ и ЕРУ демонстрировали диапазон увеличения от 2,7 до 11,9 раз против мутанта Υ181^ тогда как соединение Ι и соединение ΙΙΙ не демонстрировали изменения (<1,8 раз) против мутанта Κ103Ν. Мутант Ι<103Ν/Υ1816 обеспечивал большую изменчивость и кратные изменения 12,7 (соединение Ι) и 55,6 (соединение ΙΙΙ). ЕРУ демонстрировал соответствующие средние кратные изменения 66,8 и 88,0 против мутантов Κ103Ν и Κ103Ν/Υ181ί' соответственно.

Активность против штамма ШУ-1 ΝΕ4-3.

Активности соединения Ι и соединения ΙΙΙ также определяли в клеточном анализе с использованием вирусов ШУ-1 подтипа В с носителем ΝΕ4-3. Стандартную панель ΝΕ4-3 вирусов (м.!., Υ181^ Κ103Ν и Κ103Ν/Υ181^ измеряли как с тестируемыми соединениями, как описано для панели вируса ВН-10 выше с использованием ИФА. Результаты этих анализов обобщены в табл. 10.

Результаты этого исследования, в общем, сравнимы с результатами, обнаруженными для вирусов ВН10. В носителе ΝΕ4-3 соединения оказались сильными против вируса м.!. ΝΕ4-3 (ЕС₅₀, находящиеся от 0,7 до 2,3 нМ) и вируса Υ1816 (ЕС₅₀, находящиеся в диапазоне от 0,7 до 2,3 нМ).

Таблица 10

Активность против вирусов ШУ-1 ΝΕ4-3 в МТ-4 клеточном анализе

Соединение	№	Средние значения ЕС₅₀ (мкМ) ± стандартное отклонение
νν.τ?	У181С⁰	Κ103Ν^&	Κ103Ν/Υ18ΐσ^ΰ
Соед. 1	5	0,002010,0001	0,0039+0,0016	0,001410,0004	0,002810,0008
Соед. III	5	0,001710,0003	0,0036+0,0020	0,0015+0,0003	0,006510,0023
ЕЕУ	5	0,002310,0002	0,005710,0019	0,0612+0,0338	0,061910,0183

ЕС₅₀ - эффективная концентрация, которая уменьшает продукцию вируса на 50% в культуре клеток.

Ν'¹ - количество проведенных повторных экпериментов.

^Ь - адаптированные для лаборатории вирусы дикого типа и сайт-направленные мутантные вирусы ВН10.

Таблица 11

Кратная резистентность

Соединение	Кратность изменений
νν.τ.	У181С	Κ103Ν	К103Ы/У181С
Соед. I	1	2,0±0,8	0,7±0,2	1,4±0,4
Соед. III	1	2,1±1,1	0,9±0,2	3,9±1,7
ЕЕУ	1	2,5±0,7	34,6±7,8	27,418,6

Активность против клинических изолятов ШУ-1 в клетках МТ-2.

Антивирусную эффективность соединения Ι и соединения ΙΙΙ затем измеряли против двух к адаптированных к клеточной линии МТ-2 клинических изолятов ШУ-1 вместе с лекарствами, используемыми

- 79 016267 для сравнения. Тестируемую панель вирусов, состоящую из выделенных клинически мутантов, экспрессирующих Υ1816 (#3350) и К103N/Υ181С (#5054), сравнивали с чувствительным вирусом νΤ. Данные обобщены в табл. 12 ниже.

Таблица 12

Активность в отношении клинических изолятов Ηΐν-1 в клеточном анализе МТ-2

Соединение	N	Средние значения ЕС₅о (мкМ) 1 стандартное отклонение
νν.Τ. (ВН10)^а	У181С^Ь	К103Ы/У181С^с
Соед. 1	5	0,000910,0006	0,001410,0006	0,002010,0003
Соед. III	5	0,0011 ±0,0004	0,001510,0005	0,005710,0035
ЕРУ	5	0,000810,0002	0,001810,0003	0,072410,0217

^а - адаптированный для лаборатории штамм дикого типа.

^Ь - клинический изолят 3350 резистентен к невирапину. Этот мутант также имеет мутацию М184У.

^с - клинический изолят 5054.

Таблица 13

Кратная резистентность

Соединение	Кратность изменений
νν.τ.	У181С	К103М/У181С
Соед. I	1	2,211,3	3,212,1
Соед. III	1	1,710,9	6,214,3
ЕРУ	1	2,210,6	93,1131,4

Кратность изменений - ЕС₅₀ для мутанта Ηΐν, деленная на ЕС₅₀для вируса Ηΐν дикого типа.

Следует отметить, что кратность изменений не определяли из средних значений ЕС₅₀ в табл. 12, а исходно рассчитывали для отдельных экспериментов. Затем среднее кратное изменение +/- СО выводили из всех экспериментов.

Активность против штаммов Ηΐν-1 в человеческих РВМС.

Антивирусную активность соединения ΐ и соединения ΐΐΐ и агентов, используемых для сравнения, затем измеряли против панели Ηΐν-1 в мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС). Полная вирусная панель состояла из 3 мутантов клинических изолятов, экспрессирующих вирусы Ε103Ν (#4937 и #5002) и К103Н^181С (#5004), наряду с двумя чувствительными к ΝΝΚΤΐ вирусами νΤ (ВШ0 и \1,43). Результаты пяти независимых совокупностей данных обобщены в табл. 14.

Таблица 14 Активность против вирусов ΗΐΥ-1 в анализе с клетками РВМС

Соединение	Средние значения ЕС50 (мкМ) ± стандартное отклонение
νν.Τ. (ВН10)^а	νν.τ. (ΝΙ_4-3)³	Κ103Ν¹³	К103М/У181С^с
Соед. 1	0,000410,0001	0,001510,0007	0,000710,0003	0,002710,0016
Соед. III	0,000410,0001	0,001510,0005	0,000910,0004	0,008810,0044
ЕРУ	0,000910,0003	0,002110,0007	0,041410,0369	0,068710,0487

ЕС50 - эффективная концентрация, которая уменьшает продукцию вируса на 50% в культуре клеток.

Числа представляют средние значения +/- стандартное отклонение, полученное в результате 5 независимых экспериментов.

^а - адаптированный для лаборатории штамм вируса дикого типа.

^Ь - результаты с использованием клинических изолятов 4937 (п=3) и 5002 (п=2). ^с - клинический изолят 5004.

Все 5 соединений были чрезвычайно активны против вируса те! ВШ0 в РВМС со значениями ЕС₅₀от 0,4 до 0,9 нМ. Агенты как правило были в 2-4 раза менее эффективны против вируса ΝΕ4-3 в тех же самых клетках. Соединение ΐ и соединение ΐΐΐ эффективно ингибировали репликацию вирусов К103Н лишь с 1-2-кратной утратой активности (в противоположность вирусу ВН10), но в 6-22 раза меньше ингибировали изолят К103N/Υ181С. Наоборот, ЕТУ демонстрировал приблизительно в 40-70 раз меньшую активность против единичных и двойных изолятов мутантов соответственно. Значения для контрольных и тестируемых продуктов хорошо согласовывались с ранее опубликованными результатами ^оипд е! а1., 1995, Аи11Ш1сгоЬ Адеп!к СНешоНег: 39(12):2602-5; Апбпек е! а1., 2004, Ап!тисгоЬ Адеп!к СНетоИег; 48(12):4680-6; 1апккеп е! а1., 2004, I. Меб. СНет.; 48(6): 1901-9) и с другими значениями, приведенными в этом разделе.

Активность против вирусов Ηΐν-1 ШВ в клетках МТ-4 в анализе СРЕ.

Профиль тестируемых продуктов затем выявляли против панели выращиваемых в лаборатории му

- 80 016267 тантов НГУ-1 ΙΙΙΒ, как обобщено далее. Антивирусную эффективность определяли путем анализа СРЕ с визуализацией клеточной жизнеспособности при помощи МТ8. Вирусы, тестированные в этом анализе, включали стандартные ΙΐΐΒ ν.ΐ, а также культурально отобранные вирусы У181С и У181С/К103Н но обычный Κ103Ν заменяли отобранным тройным мутантным вирусом К103КЛ/179В/Р225Н, который дополнительно описан ниже. Средние данные по эффективности представлены в табл. 15.

Таблица 15

Активность против вирусов НГУ-1 ΙΙΙΒ в клетках МТ-4 в анализе СРЕ

Соединение	№	Средние значения ЕС₅₀ (мкМ) ± стандартное отклонение
νν.τ?	У181С⁰	Κ103Κ/νΐ79Ο/Ρ2 25Н^Ь	Κ103Ν/Υ181Ο¹¹
Соед. 1	5	0,0010±0,0004	0,002810,0003	0,010010,0015	0,004710,0009
Соед. III	5	0,000510,0001	0,002110,0003	0,025010,0060	0,009110,0019
ЕРУ	5	0,001510,0006	0,006910,0020	>1,0	0,112010,0330

а

^Ь - адаптированные для лаборатории вирусы ВР10 дикого типа и сайт-направленные мутантные вирусы Таблица 16

Кратная резистентность

Соединение	Кратность изменений
νν.τ.	У181С	Κ103Κ/νΐ79ϋ/Ρ225 Η	Κ103Ν/Υ181Ο
Соединение 1	1	2,910,8	11,114,1	4,8+1,6
Соединение III	1	4,511,0	53,5112,8	19,514,3
ЕРУ	1	4,610,5	>711,71255,3	74,2117,2

Кратность изменений - ЕС₅₀ для мутанта ΜΙΥ, деленная на ЕС₅₀ для вируса НГУ дикого типа.

Вирус ν.Τ. ΙΐΐΒ эффективно ингибировался всеми пятью лекарствами со средними значениями ЕС₅₀ (в мкМ), находящимися в диапазоне от 0,0004±0,0002 до 0,0017±0,0004.

Репликация культурально отобранного вируса ΙΙΙΒ У181С также эффективно ингибировалась каждым лекарством со средними значениями ЕС₅₀ (в мкМ), находящимися в диапазоне от 0,0021±0,0003 до 0,0120±0,0026. Эти значения хорошо согласуются с другими результатами, представленными в данном разделе.

Вирус ΙΙΙΒ Κ103Ν/Υ181^ как правило, эффективно ингибировался соединением I и соединением III, о чем свидетельствовали средние значения ЕС₅₀ (в мкМ), находящиеся в диапазоне от 0,0026±0,0004 до 0,0099±0,0016. Тем не менее, ΕΓν был гораздо менее эффективен, о чем свидетельствует среднее значение ЕС₅₀ (в мкМ) 0,1120±0,0330.

Тройной мутантный вирус К103К/У179Б/Р225Н ΙΙΙΒ демонстрировал более изменчивые результаты и гораздо большую резистентность к ΕΡΎ, хотя он оставался относительно чувствительным к соединению I и соединению III. Средние значения ЕС₅₀ (в мкМ) составляли: 0,0100±0,0015 (соединение I), 0,0250±0,0060 (соединение III) и >1,0 (ΕΓν). Следует отметить, что мутантный фермент К103К КТ не является резистентным к ΝΝΚΤΙ (данные не представлены).

С точки зрения кратных изменений чувствительности к лекарству для мутантной панели ΙΙΙΒ средние значения кратной резистентности для соединения I, соединения III и ΕΓν, в общем, мало изменялись (с 2,9±0,8 до 7,7±2,8 раз) против вируса Υ181Ο Кратная резистентность против мутанта Ι<103Ν/Υ181С была более изменчивой, но находилась в диапазоне всех изменений, обнаруженных в данном разделе: кратные изменения составляли 4,8±1,6 (соединение I) и 19,5±4,3 (соединение III). Средние значения кратной резистентности, обнаруженные для мутанта К103К/У179В/Р225Н, составляли: 11,1±4,1 (соединение I), 53,5±12,8 (соединение III) и >711,7±255.3 (ΕΓν).

Вкратце, эти тесты в анализе СРЕ с вирусом ΙΙΙΒ, в общем, подтверждают выводы, представленные в данном разделе, за исключением тройного мутантного вируса К103К/У179Б/Р225Н. Соединение I обладало наибольшей активностью против этого мутанта (ЕС₅₀ = 10 нМ), затем соединение III с умеренной активностью (ЕС₅₀ = от 21 до 25 нМ), тогда как ΕΓν был, по существу, не активен (ЕС₅₀>1000 нМ). Хотя генотипическая картина мутанта К103К/У179Б/Р225Н обычно не распознается в клинических образцах, известно, что комбинация К103К/У179Б подтверждает значительные уменьшения чувствительности в отношении всех трех одобренных ΝΝΚΤΙ (Нагпдап е! а1., 2005, ΆΙΌ8; 19:549-54; Рагкт е! а1., 2006, Лпйт1сгоЬ Лдеп1з СкетоШег; 50(1):351-4).

Активность против различных штаммов НГУ-1 в различных человеческих клеточных линиях.

Влияние соединения I, соединения III и контрольных лекарств на вирус и клетку-хозяина дополнительно исследовали в анализах чувствительности, проводимых на 3 различных штаммах подтипа В дико

- 81 016267 го типа ШУ-1 и 5 различных клеточных линиях. Используемые штаммы Н1У-1 представляли собой ВН10, ΝΕ4-3 и 111В: клеточные линии представляли собой клетки И-937 (человеческие моноциты, происходящие из гистиоцитарной лимфомы); клетки МОЬТ-4 (линия человеческих клеток Т-лимфобластной лейкемии); клетки Н-9 (человеческие лимфобластные Т-клетки) и МТ-2 и МТ-4 человеческие Т-клетки лейкемии. Средние значения ЕС₅₀ и стандартные отклонения для трех независимых экспериментов обобщены в табл. 17. В экспериментальных условиях этого исследования соединение I, соединение III и ЕРУ сохраняли в основном не измененные активности в каждой из тестированных комбинаций вируса дикого типа и клетки хозяина. Обнаруженные активности находились в диапазоне от 0,4 до 3,2 нМ.

Таблица 17

Активность против штаммов ШУ-1 А.Т. в известных линиях человеческих клеток-хозяев

Средние значения ЕС₅₀ (мкМ) ± стандартное отклонение
Хозяин	Вирус	Соед. I	Соед. III	ЕРУ
11937	ΙΙΙΒ	0,0005±0,0001	0,0005±0,0001	0,0015±0,0008
МОЬ.Т-4	ΙΙΙΒ	0,0007±0,0001	0,0006+0,0001	0,0009+0,0002
Н9	ΙΙΙΒ	0,0006±0,0001	0,0005±0,0002	0,0015±0,0006
и937	ВН10	0,0006±0,0002	0,0013±0,0006	0,001910,0008
МТ-2	ВН10	0,0009±0,0006	0,0011 ±0,0004	0,000810,0002
МТ-4	ВН10	0,0010±0,0004	0,0012±0,0006	0,001210,0008
МТ-4	ΝΙ-4-3	0,0020±0,0001	0,0017±0,0003	0,002310,0002
Средний диапазон активности (мкМ)	0,0005±0,0020	0,0005±0,0017	0,0008+0,0023

Числа представляют средние значения +/- стандартное отклонение, полученное в результате трех независимых экспериментов.

Диапазоны средней активности, обнаруженные для каждого из лекарств в каждом из штаммов вируса и типов клеток, обобщены в последней строке таблицы. Соединение I и соединение III демонстрировали сильную противовирусную активность 1п У1!го (диапазон от 0,5 до 2 нМ) для трех штаммов ШУ-1 и морфологически отличающихся человеческих Т- и моноцитарных клеточных линий. Все пять соединений демонстрировали достаточно сравнимую активность.

Активность против панели различных подтипов ШУ-1.

Активности тестируемых и контрольных соединений затем тестировали против панели подтипов, которая охватывает все основные подтипы или монофилетические группы ШУ-1 (А, В, С, Ό, Р1, С, Н, АЕ и АС). Эта панель представляла собой часть 64-вирусной панели, выбранной из крупной библиотеки клинических изолятов Моподгат Вю8с1епсек (ранее У1гоЕо§1ск). Каждый из подтипов в панели представлен двумя различными вирусами, которые обладают множественным сходством последовательностей, но также некоторыми ключевыми различиями, и поэтому могут по-разному отвечать на одно или более чем одно из лекарств, включенных в это исследование.

В результате тестирования Ркепо8епке™ тестируемых продуктов соединения I, соединения III и контрольного лекарства ЕРУ активность соединения I, соединения III и ЕРУ против панели подтипов (18 вирусов), содержащей девять различных подтипов ШУ-1 (А, В, С, Ό, Р1, С, Н, АЕ, АС), находились в пределах 2-кратного диапазона относительно значений активности дикого типа (данные не представлены). Среди различных подтипов общие диапазоны активности представляли собой соединение I, от 0,25 до 3,20 нМ; соединение III от 0,2 до 2,14 нМ; ЕРУ от 0,40 до 3,10 нМ. Неудивительно, что диапазон активности был несколько больше между подтипами (10-11 раз), чем внутри подтипов, но эта вариабельность прежде всего возникает в результате всего двух вирусных изолятов: второй изолят ШУ-1 подтипа С среди всей панели был наименее чувствительным в отношении всех тестируемых лекарств; наоборот, два изолята подтипа Н, по-видимому, высоко чувствительны в отношении всех лекарств (значения ЕС50 от 0,17 до 0,55 нМ). Тем не менее, эти вирусы также обладали уменьшенной способностью к репликации на 42 и 10% соответственно, что могло вносить вклад в их кажущуюся гиперчувствительность. Оставшиеся подтипы вирусов, как правило, демонстрировали <2,5-кратное отклонение активности от референсного штамма СМ)О.

Активность против ШУ-2 ВОБ в клетках Н9.

Чувствительность ШУ тип 2 ВОБ в клетках Н9 к соединению I и соединению III определяли против зидовудина (ΑΖТ) в качестве контроля. Средние данные получены в результате двух независимых экспериментов противовирусной активности и представлены в табл. 18. Соединению I и соединению III не удалось подавить репликацию ШУ-2 ВОБ в наивысшей измеренной концентрации (1,25 мкМ), тогда как контроль ΑΖТ демонстрировал активность (0,1619±0,0767 мкМ), сравнимую с опубликованными значениями (Айугои\у, е! а1., 2004, Ап!1У1га1 Ткегару 9:57-65).

- 82 016267

Таблица 18 Активность против ШУ-2 КОБ VI' в Н9 клеточном анализе

Соединение	Значения ЕС₅₀ (мкМ)
Соединение 1	>1,25

Соединение III	>1,25
ΑΖΤ	0,1619 ±0,0767

ЕС50 - эффективная концентрация, которая уменьшает продукцию вируса на

50% в культуре клеток.

Числа представляют средние значения +/- стандартное отклонение, полученное в результате двух независимых экспериментов.

Активность против ШУ-1 в присутствии человеческой сыворотки крови и альфа-1 кислого гликопротеина.

В предшествующих исследованиях типично измеряли ЕС₅₀ каждого лекарства против роста ШУ-1 в культуре клеток в присутствии 10% фетальной телячьей сыворотки (ФТС). Для оценки скорректированных к сыворотке крови ЕС₅₀ для тестируемых продуктов осуществляли дополнительные эксперименты в присутствии 45% человеческой сыворотки крови или 1 мг/мл альфа-1 кислого гликопротеина или обоих. Средние результаты для 3-7 экспериментов противовирусной активности представлены в табл. 19.

Таблица 19

Активность против ШУ-1 ВН10 Ψ.Τ. в присутствии Н8 или ΑΑС

Соединение	N	Средние значения ЕС₅₀ (мкМ) ± стандартное отклонение
10% фетальная телячья сыворотка	10% фетальная телячья сыворотка + ААС^а	45% человеческая сыворотка крови ^ь	45% человеческая сыворотка крови + ΑΑΘ
Соед. 1	5	0,0011±0,0004	0,002910,0012	0,014610,0063	0,019010,0017
Соед. 111	5	0,001210,0004	0,002810,0004	0,021910,0117	0,032610,0073
ЕЕУ	7	0,001610,0005	0,005010,0023	0,011510,0039	0,011610,0074

^а - α-1 кислый гликопротеин в концентрации 1 мг/мл.

^Ь - человеческая сыворотка крови - АВ + лишенная антител против антигенов крови типов А и В.

Таблица 20

Кратная резистентность

Соединение	N	Кратность изменений
10% фетальная телячья сыворотка	10% фетальная телячья сыворотка + ААС^а	45% человеческая сыворотка крови	45% человеческая сыворотка крови + ААС
Соед. 1	5	1	2,710,7	15,9111,1	19,517,6
Соед. III	5	1	2,110,5	17,016,3	24,813,8
ЕЕУ	7	1	2,410,8	8,413,2	5,413,2

Кратность изменений - ЕС₅₀, полученная с фетальной телячьей сывороткой + ΑΑС или человеческой сывороткой крови +/- ΑΑ^ деленная на ЕС₅₀, полученную только с фетальной телячьей сывороткой. Следует отметить, что кратность изменений не определяли по средним значениям ЕС₅₀ в табл. 19, а исходно рассчитывали для отдельных экспериментов. Затем среднее кратное изменение +/- стандартное отклонение получали для всех экспериментов.

Пять лекарств ингибировали репликацию вируса VI' в присутствии 10% ФТС с ожидаемыми активностями, где значения ЕС₅₀ находились в диапазоне от 1,0 до 1,6 нМ. Добавление 1 мг/мл ΑΑν как правило, уменьшало активность лекарства в 2-3 раза для каждого лекарства, сдвигая средние значения ЕС50 в диапазон 2-5 нМ.

Активности пяти лекарств уменьшались в большей степени с 45% человеческой сывороткой крови (Н8), приводя к средним значениям ЕС₅₀ от 11,5 до 21,9 нМ и кратным сдвигам от 8,4 до 17,0 раз. Присутствие 45% Н8 + ΑΑС в культуральных экспериментах приводило к более вариабельным результатам и средним значениям ЕС₅₀ (в нМ) 19,0 (соединение I), 32,6 (соединение III) и 11,6 (ЕГУ). Значения, обнаруженные для контролей, хорошо согласовывались с опубликованными результатами (Υοπη§ е1 а1., 1995, Αηί^κΓοΚ ΑηείιΓ Скетοΐке^: 39(12):2602-5; Απ6ι^8 е1 а1., 2004, Αηί^κΓοΚ ΑηείιΓ Скетοΐке^; 48(12):4680-6; ^аη88еη е1 а1., 2004, I. Меб. СБет.; 48(6): 1901-9; Βοοηе 2006, Сигг. Орт Итуезйд Бгидз; 7(2): 128-35). Соответствующие средние кратные изменения составляли 19,5 (соединение I), 24,8 (соединение III) и 5,4 (ЕГУ).

В итоге не обнаружено значительное взаимодействие белкового связывания только с ΑΑС (<3кратное изменение) для соединения I и соединения III. Умеренная оценка ЕС₅₀ (16-25-кратное изменение) оценивали в Н8 или Н8 + ΑΑ& В общем, данные свидетельствуют о том, что белковое связывание несколько выше для соединения I и соединения III, чем для ЕГУ.

- 83 016267

Пример 14. Цитотоксичность ΐη νΐΐΓΟ.

Обычные клеточные анализы с использованием пролиферирующих клеток использовали для оценки цитотоксичности соединения I и соединения III. Эти 3-12-суточные исследования цитотоксичнсти сфокусированы на линиях человеческих клеток, которые (1) чувствительны к инфекции вирусом I ϋν-1 ΐη νΐΐΓΟ (например, первичные моноциты крови; Т-клетки лейкемии МТ-2 и МТ-4), или (2) обычно используются для оценки вызванной лекарством цитотоксичности ΐη νΐΐΓΟ (например НерС2, I Ы 17 или НеЬа) (Όΐνΐ К.Ь., Иаνе^кο8 Κ.Ι., I Ιιιηΐ8ΐ 1.А., еΐ а1. (2006) МогрНо1о§1са1 аηά то1еси1аг соиг8е о£ тЧосЬопс!па1 раШо1оду ΐη сиНш^ Нитап се118 еxрΟ8еά 1оп§Чегт ω ζ^άоνиά^ηе. ΕηνΐΐΌη Мо1. МШадеп; 47). Клеточную жизнеспособность измеряли при помощи стандартного окрашивания МТТ или МТ8.

Цитотоксическое действие в клетках РВМС.

Цитотоксичность тестируемых продуктов ΐη νΐΐΐΌ оценивали в четырех независимых экспериментах в стимулированных человеческих первичных мононуклеарных клетках крови (РВМС). На РВМС воздейтвовали соединением I и соединением III вместе с контрольным лекарством ΕΡν в течение 3 суток в концентрациях, находящихся в диапазоне от 0,005 до 100 мкМ. Клеточную жизнеспособность определяли путем окрашивания МТТ. Результаты представлены в виде средних эффективных концентраций лекарства, уменьшающих клеточную жизнеспособность на 50% (СС50).

Средние значения СС50 (в мкМ), определенные для тестируемых продуктов в РВМС, представляли собой для соединения I = 52,6±15,2 и для соединения III = 66,9±19,6. Для контрольного продукта среднее определенное значение СС₅₀ (в мкМ) составляло для ΕΡν = 70,9±7,6.

Клеточная цитотоксичность в человеческих клетках-хозяевах Н1У-1.

Цитопатическое действие ΐη νΐΐΐΌ тестируемых продуктов соединения I и соединения III и контрольного лекарства ΕΡν затем тестировали в следющих шести чувствительных к I ϋν-1 линиях человеческих клеток-хозяев: клетки И-937 (человеческие моноциты, происходящие из гистиоцитарной лимфомы); клетки МОЬТ-4 (линия человеческих клеток Т-лимфобластной лейкемии); клетки Н9 (человеческие лимфобластные Т-клетки); клетки !М9 (линия человеческих В-лимфобластных клеток) и МТ-2 и МТ-4 человеческие Т-клетки лейкемии.

После воздействия лекарства в течение 4 суток клеточную жизнеспособность измеряли путем окрашивания МТ8 и определяли значения СС50. Концентрации лекарства находились в диапазоне от 0,005 до 100 мкМ. Результаты трех независимых экспериментов (если не указано иначе) обобщены в табл. 21.

Таблица 21

Клеточная цитотоксичность в линиях человеческих клеток-хозяев ^ν-1

Соедине ние	Средние значения ЕС₅₀ (мкМ) ± стандартное отклонение	Диапазон средних СС₅₀ (мкМ)
11937°	МОЬТ-4^е	Н9^Г	ΙΜ9⁹	МТ-2¹¹	МТ-4^П
1	26,5±0,5	16,6±0,4	20,0±1,6	32,9±2,6	23,5±1,0	18,6±3,1	16,6-32,9
III	24,6±1,9	14,8±1,0	31,3±5,2	50,0+17,4	25,9±2,1	27,3±12,9	14,8-50,0
ЕЕУ	23,2±1,0	41,7±3,4	50,0±9,0	51,0±1,3	24,6+4,5	44,1±18,2	23,2-51,0

СС₅₀ - эффективная концентрация, которая уменьшает клеточную жизнеспособность на 50%.

^Ь - если не указано иначе, числа представляют средние значения +/- стандартное отклонение, полученные в результате трех независимых экспериментов.

^с - значения получены в результате двух независимых экспериментов.

^ά - человеческие моноциты, происходящие из гистиоцитарной лимфомы; высеяны в количестве 5x10³ клеток на лунку.

^е - человеческая Т-лимфобластная лейкемия; высеяны в количестве 2x104 клеток на лунку.

^г - человеческая лимфобластная Т-клеточная лимфома; высеяны в количестве 4x104 клеток на лунку.

^д - человеческая В-лимфобластоидная клеточная линия; высеяны в количестве 2x104 клеток на лунку.

^Н - человеческая Т-клеточная лейкемия; высеяны в количестве 1,25x104 (МТ-2) и 2,5x104 (МТ-4) клеток на лунку.

Тестируемые продукты соединение I и соединение III и контрольные соединения демонстрировали заметную цитотоксичность ΐη νΐΐΐΌ в 6 человеческих клеточных линиях, чувствительных к Н№-1. В зависимости от клеточного типа средние значения СС₅₀ для соединения I находились в диапазоне от 16,6 до 32,9 мкМ по сравнению с диапазоном от 14,8 до 50,0 мкМ для соединения III (табл. 21), аналогично средним диапазонам СС₅₀, определенным для ΕΡν (от 23,2 до 51,0 мкМ).

Среди 6 клеточных линий линия клеток МОЬТ-4 наиболее чувствительная к цитотоксичности в отношении соединения I и соединения III. ΕΡν демонстрировал наибольшую цитотоксичность в клетках И937 и МТ-2.

Пример 15. Индекс селективности соединения I и соединения III против Н1У-1.

Предшествующие данные дают возможность рассчитать значения индекса селективности (8^ на основе отношения СС₅₀ к Ε^₀ в клетках МТ-4 (стандартный анализ, использованный в этой работе).

СС₅₀ соединения I в Т-клетках МТ-4 составляла 27 мкМ по сравнению с ЕС₅₀ 1,2 нМ, обеспечивая

- 84 016267

8ΐ>22000. СС₅₀ соединения ΐΐΐ составляла 18,6 мкМ по сравнению с ЕС₅₀ 1,0 нМ для 8ΐ>18000. Аналогично, оцениваемый индекс селективности для контрольного лекарства составлял для ΕΡν = 37000. Эти значения хорошо согласуются с ранее сообщаемыми значениями 8ΐ (Уоипд е! а1., 1995, Ап!1т1сгоЬ Адеп!з СНетоИег: 39(12):2602-5; Апйпез е! а1., 2004, Ап!1т1сгоЬ Адеп!з СНетоИег; 48(12):4680-6; 1апззеп е! а1., 2004, I. Мей. СНет.; 48(6): 1901-9; Воопе 2006, Сигг. Орт ^езбд Эгидз; 7(2): 128-35).

С использованием цитотоксичности и данных активности, полученных с РВМС, значения 8ΐ>100000 могут быть рассчитаны для соединения ΐ и соединения ΐΐΐ.

Длительная клеточная цитотоксичность в отношении других типов человеческих клеток.

Наконец, цитотоксичность т νίΙΐΌ тестируемых продуктов определяли в других походящих для токсикологического исследования линиях человеческих клеток; клетки печени ΗυΗ7 и 11ер62 (Кпо\1ез е! а1., 1980, 8с1епсе; 209(25):497-9) и эпителиальные клетки НеРа (Оеу е! а1., 1952, Сапсег Кезеагсй; 12:264-5) при помощи окрашивания МТ8 для определения жизнеспособности. Клетки повторно обрабатывали диапазоном концентраций лекарства (от 0,005 до 100 мкМ) в течение 9 ^еЬа) или 12 суток (ΗυΗ7, 11ер62). Средние значения СС₅₀ и стандартные отклонения, полученные в результате 3-5 независимых экспериментов, обобщены в табл. 22.

Таблица 22

Клеточная цитотоксичность в избранных линиях человеческих клеток

Соединение	Средние значения СС₅₀ (мкМ) ± стандартное отклонение
	Не1 а^а,а	НиН7^ь,е	НерС2^се
1	27,8811,14	23,4911,61	25,6913,26
III	29,8612,09	31,4613,37	23,5011,51
ЕЕУ	48,5712,50	75,72112,43	80,56112,12

Числа представляют средние значения +/- стандартное отклонение, полученные в результате 3-5 независимых экспериментов, как указано: ^а = 3-4; ^Ь = 4-5; ^с = 3-5.

^й - клетки 11е1,а, клетки высевали в количестве 1 х 10³ клеток/лунку и инкубировали в присутствии лекарства в течение 9 суток. Лекарство и среды меняли каждые 3 суток.

^е - клетки ΗυΗ7 и ^рС2 высевали в количестве 1 х 10³ и 7х10³ клеток/лунку соответственно и инкубировали в течение 12 суток в присутствии лекарства. Лекарство и среды меняли каждые 3 суток.

Тенденции, наблюдаемые в этом более длительном тестировании цитотоксичности, отражают обнаруженные в предшествующих исследованиях. В общем, соединение ΐ и соединение ΐΐΐ обеспечивали похожие значения СС₅₀ в трех клеточных линиях, находящихся в диапазоне от 23 до 32 мкМ. ΕΡν вновь представлял собой наименее цитотоксическое соединение (диапазон СС50 48-81 мкМ).

Пример 16. Сравнительные данные т ν^ΤΌ.

Соединения ΐ и ΐΐΐ, соответствующие энантиомеры (т.е. соединения ΐΐ и ΐν) и соответствующие рацематы оценивали в стандартных описанных выше клеточных анализах ВН10 Ηΐν. Стандартная тестируемая панель включала вирус дикого типа, а также сайт-направленные мутантные производные У181С, Κ103Ν и К103Х/У181С. В таблице ниже приведены данные для соединения ΐ, соединения ΐΐ и их соответствующего рацемата. По сравнению с вирусом ВН10 дикого типа и мутантными вирусами У181С, Κ103Ν и Κ103N/Υ181Ο рацемат имел ЕС₅₀ от 2,4 до 6,2 нМ. По сравнению с вирусом ВН10 дикого типа и мутантными вирусами У181С, Κ103Ν и Κ103N/Υ181Ο соединение ΐ имело ЕС₅₀ от 0,6 до 3,5 нМ. По сравнению с вирусом ВН10 дикого типа и мутантными вирусами У181С и Κ103Ν соединение ΐΐ имело ЕС50 от 129 до 920 нМ.

Активность против вирусов Ηΐν-1 ΒΗ10 в клеточном анализе

	вню	Κ103Ν	У181С	Υ1810/Κ103Ν
Соед.		η		η		η		η
I	0,00110,0005	8	0,000610,0002	3	0,002610,0011	3	0,003510,0014	3
I	0,000710	1	0,000910	1	0,002410	1	0,00310	1
II	0,191710	1	0,920110	1	0,363710	1
рац,	0,002510,0004	3	0,002410,0007	3	0,003210,0006	3	0,006210,0036	3

ЕС₅₀ - эффективная концентрация, которая уменьшает продукцию вируса в культуре клеток на 50%.

^а Ν - количество проведенных повторных экспериментов. ^Ь - адаптированные для лаборатории вирусы дикого типа и сайт-направленные мутантные вирусы ВН10.

В таблице ниже приведены данные для соединения ΐΐΐ, соединения ΐν и их соответствующего рацемата. По сравнению с вирусом дикого типа ΒΗ10 и мутантными вирусами У181С, Κ103Ν и Κ103N/Υ181Ο рацемат имел ЕС₅₀ от 1,6 до 24,4 нМ. По сравнению с вирусом ВН10 дикого типа и му

- 85 016267 тантными вирусами У181С, Ε103Ν и К103N/Υ181С соединение ΐΐΐ имело ЕС₅₀ от 0,6 до 23,1 нМ. По сравнению с вирусом ВН10 дикого типа и мутантными вирусами У181С, Ε103Ν и К103N/Υ181С соединение ΐν имело ЕС₅₀ от 89,2 до 824 нМ.

	ВН10	Κ103Ν	У181С	Υ181Ο/Κ103Ν
Соед.		η		η		η		η
III	0,00110,0005	10	0,0013+0,0005	5	0,002810,0005	5	0,011410,0023	5
III	0,0018±0,0003	3	0,0016+0,0005	3	0,004010,0005	3	0,023110,0121	3
III	0,0006±0	1	0,000610	1	0,002910	1	0,004510	1
IV	0,190210,0038	2	0,377610,2047	2	0,824110,3636	2		0
IV	0,089210,1068	2	0,105310,0579	2	0,2286+0,0605	2	0,5167+0	1
IV	0,097610	1	0,312310	1	0,33110	1		0
рац.	0,03110,0002	2	0,003110,0005	2	0,004910,0011	2	0,016710,0088	2
рац.	0,0017±0	1	0,0017+0	1	0,001610	1	0,004210	1
рац.	0,002510,0007	3	0,002510,0013	3	0,00510,0037	3	0,024410,0188	3

^а Ν - количество проведенных повторных экспериментов.

Как представлено в таблицах ниже, в этих анализах большая часть, если не вся активность, рацемической смеси принадлежит К-энантиомерным соединениям ΐ и ΐΐΐ.

Анализ защиты клеток.

Соединения ΐ и ΐΐΐ, соответствующие энантиомеры (т.е. соединения ΐΐ и ΐν) и соответствующие рацематы оценивали в анализе защиты клеток. Стандартная тестируемая панель включала вирус дикого типа, а также сайт-направленные мутантные производные У181С, К103Х и К103Х/У181С.

Тестируемые соединения растворяли в ДМСО в концентрации 15 мМ и затем разбавляли в культуральной среде КРМИ640 + 2 г/л Νοί 1С()₃ + 1% раствор канамицина 100х(10000 мкг/мл) + 10% ФТС +/1,2% ДМСО.

МТ-4 клетки (источник: каталог ΝΐΗ (национального института здравоохранения) № 120) высевали в 96-луночные клеточные культуральные планшеты (1 х 10⁴ клеток на лунку в 50 мкл).

Серийные 2-кратные разведения тестируемых соединений в 50 мкл (от 0,29 до 75 мкМ) добавляли к клеткам в полных ростовых средах (КРМ1, 10% фетальная телячья сыворотка, пенициллинстрептомицин) и клетки инфицировали 20 мкл аликвотой суспензии Ηΐν (штамм Ηΐν-1 ΒΗ10 дикого типа и резистентные вирусы У181С, К103Х и У181С/К103Х) с разведением, обеспечивающем 90% цитопатическое действие. Конечная концентрация ДМСО в анализе составляла 0,5% в 120 мкл. Культуры клеток затем инкубировали при 37°С/5% СО₂ в течение 4 суток. Затем Се11 ТДег 96 Α^иеоиз Опе 8о1и!юп Се11 РгоНГегаЕоп Αззау (Рготеда) использовали для измерения клеточной жизнеспособности. Кратко, реагент Опе 8о1и!юп добавляли непосредственно в лунки с культурой (20 мкл/лунку), инкубировали в течение 5 ч и абсорбцию регистрировали при 492 нм с использованием спектрофотометра 8иппзе от Тесап.

Значения ЕС₅₀ определяли на основе процентного ингибирования в зависимости от концентраций с использованием четырехпараметрового сигмоидного анализа нелинейной регрессии с использованием программного обеспечения Тесап Маде11ап.

В таблице ниже приведены данные для соединения ΐ, соединения ΐΐ и их соответствующего рацемата. По сравнению с вирусом ВН10 дикого типа и мутантными вирусами У181С, К103Х и К103Х/У181С рацемат имел ЕС₅₀ от 1,5 до 7,0 нМ. По сравнению с вирусом ВН10 дикого типа и мутантными вирусами У181С, К103Х и К103Х/У181С соединение ΐ имело ЕС₅₀ от 0,26 до 3,5 нМ. По сравнению с вирусом ВН10 дикого типа и мутантными вирусами У181С и К103Х соединение ΐΐ имело ЕС₅₀ от 62 до около 1000 нМ.

Активность против вирусов Ηΐν-1 ΒΗ10 в анализе защиты клеток

	ΒΗ10	Κ103Ν	У181С	Υ1810/Κ103Ν
Соед. I	0,0002810,000072	0,0002610,000057	0,001810,00029	0,0035+0,0015
II	0,06210,019	0,277+0,099	0,42410,21	>1
рац.	0,001510,0007	0,001+0	0,0045+0,0007	0,007+0,0028

ЕС₅₀ - концентрация соединения, обеспечивающая уменьшение на 50% цитопатического действия вируса.

В таблице ниже приведены данные для соединения ΐΐ и его соответствующего рацемата. По сравнению с вирусом ВН10 дикого типа и мутантными вирусами У181С, К103Х и К103Х/У181С рацемат имел ЕС₅₀ от 0,2 до 9,0 нМ. По сравнению с вирусом ВН10 дикого типа и мутантными вирусами У181С,

- 86 016267

Γ103Ν и К103N/Υ181С соединение ΐΐΐ имело ЕС₅₀ от 0,14 до 6,6 нМ.

Активность против вирусов НГ'-1 ВН10 в анализе защиты клеток

	ВН10	Κ103Ν	У181С	Υ181Ο/Κ103Ν
Соед.
III	0,0001510,00011	0,0001410,000052	0,001510,0006	0,006610,00097
IV
рац.	0,000210,0001	0,000310	0,002310,0005	0,00910,0048

Связывание, ингибирование и индукция цитохрома Р450.

Соединения ΐ и ΐΐΐ, соответствующие энантиомеры (т.е. соединения ΐΐ и ΐ') и соответствующие рацематы оценивали в анализах связывания цитохрома Р450. Исследования ингибирования осуществляли для оценки потенциала соединений ΐ и ΐΐΐ в отношении ингибирования каталитической активности изоферментов СΥΡ450 человеческих микросомальных белков печени. Скорость образования метаболита СΥΡ450-специфических субстратов зонда человеческими микросомами печени определяли в присутствии и отсутствие соединения ΐ или ΐΐΐ. Также оценивали прямое ингибирование, а также зависимое от времени ингибирование, также названное как основанное на механизме ингибирование или МВГ. Исходные исследования определяли значения 1С₅₀ с последующим определением к1 или кщ_ас1 и к1 в отношении МВГ, когда отмечено отчетливое ингибирование (1С₅₀<10 мкМ). Дополнительно также оценивали тип ингибирования. Соединения анализировали с использованием рекомбинантных человеческих микросомальных белков с флуориметрическими субстратами. Сигнал измеряли с использованием аппарата для визуализации планшетов Ри8юп с использованием подходящих длин волны возбуждения и испускания, установленных для специфического метаболита

Фермент Субстрат Возбуждение Испускание (ширина щели) (ширина щели)

СУР1А2	СЕС	400 нм (20 нм)	535 нм (25 нм)
СУР2В6	ЕРС	400 нм (20 нм)	535 нм (25 нм)
СУР2О6	АММС	400 нм (20 нм)	460 нм (35 нм)
СУРЗА4	ВЕС	400 нм (20 нм)	535 нм (25 нм)

Ингибирование СΥΡ2С9 осуществляли путем инкубации люминогенного субстрата СΥΡ450 люциферина-Н с СΥΡ2С9 и системой регенерации NА^ΡΗ (восстановленной формы никотинамидадениндинуклеотидфосфата). Люминесценцию измеряли с использованием аппарата для визуализации планшетов РИ8ЮП.

Ингибирование рекомбинантного изофермента цитохрома Р450 1п уйго

Изофермент Наибольшая СУР450 тестируемая конц-я (мкМ)	1С₅₀ (нМ) рац.(1+П)	1С₅₀(мкМ) I	1С₅₀ (мкМ) II	1С₅₀(мкМ) рац. (ΙΙΙ+ΐν)	Ю50 (мкМ) III	1С₅₀ (мкМ) IV
СУР1А2	20	ОТС.	17,5%	ОТС.	ОТС.	17,612,0	ОТС.
СУР2В6	20	ОТС.	21,6%	ОТС.	ОТС.	о 22,9%	ОТС.
СУР2С9	10	ОТС.	8,401	ОТС.	5,99	6,851	3,38
			0,67			0,48
СУР2О6	10	ОТС.	11,2%	ОТС.	16-23%	15,2%	29,1%
СУРЗА4	10	1,608	1,461	3,21	2,269	2,861	2,962
			0,39			0,78

Исследования ингибирования ГС₅₀ - 50% ингибирующая концентрация (мкМ) или процент ингибирования при наибольшей тестируемой концентрации. Значения представляют среднее значение ± СО для трех независимых экспериментов. ОТС. - отсутствуют.

Ферментативные кинетические исследования ингибирования цитохрома Р450 осуществляли с использованием человеческих микросом печени. Скорость образования метаболита СΥΡ450специфических субстратов зонда объединенными человеческими микросомами печени определяли в присутствии и отсутствие стандартных ингибиторов или соединения ΐ или ΐΐΐ (0, 0,01, 0,1, 1, 10 и 50 мкМ). Зависимое от времени ингибирование также исследовали путем оценки действия соединения ΐ или ΐΐΐ перед инкубированием (30 мин) на ингибирование ферментов СΥΡ450 (в указанных выше концентрациях) с микросомами. Значения 1С₅₀ для прямого и зависимого от времени ингибирования определяли, когда ингибирование достигало уровней больше чем 50%. Кроме того, прямое ингибирование СΥΡ2С8 и СΥΡ2С9 соединением ΐ или ΐΐΐ (в концентрациях 0, 1, 3, 6, 9 и 12 мкМ) исследовали путем определения

- 87 016267 значения Κί и типа ингибирования.

Дополнительно к значениям Κί для прямого ингибирования СУР2С8 и СУР2С9 определяли значения К_Ьас1 и Κί для зависимого от времени ингибирования СУР3А4 (тестостерон и мидазолам) соединением ΐ или соединением ΐΐΐ. Соединение ΐ и соединение ΐΐΐ в концентрации 0, 0,0125, 0,125, 1,25, 12,5 и 62,5 мкМ для СУР3А4 (мидазолам и тестостерон) преинкубировали с человеческими микросомами печени и NΑ^ΡΗ в течение 0, 1, 5, 10, 20 и 30 мин при 37°С. Контрольные инкубаты включали тестируемый продукт в одной концентрации, преинкубированной без NΑ^ΡΗ, и ингибитор в качестве положительного контроля. Образование метаболита контролировали при помощи одобренных способов ЖХ-МС/МС (жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии/масс-спектрометрии) и определяли процент оставшейся активности дополнительно к значениям 1<_|пас1 и Κι.

Соединение ΐ демонстрировало ограниченное ингибирование (1С₅₀>20 мкМ) СУР1А2, СΥΡ2Β6, СУР2В6 и СУР2С19 (1С₅₀ = 10,2 мкМ) и явное ингибирование (1С₅₀<10 мкМ) СУР2С8, СУР2С9 и СУР3А4. Соединение ΐ демонстрировало конкурентное ингибирование СУР2С8 и СУР2С9 со значениями к, 1,1 и 1,4 мкМ соответственно. Поскольку СУР3А4 имеет множество сайтов связывания, ингибирование типично оценивали с двумя структурно не связанными субстратами зонда, тестостероном и мидазоламом. Соединение ΐ демонстрировало явное зависимое от механизма ингибирование СУР3А4тестостерона и СУР3А4-мидазолама со значениями к, 0,14 и 0,18 мкМ соответственно.

Ингибирование изофермента цитохрома Р450 человеческих микросом соединением ΐ ΐη νΐΐΐΌ Изофермент СУР450 К, (мкМ) кСас! (мин^-1 )^с Тип ингибирования

СУР1А2 (Фенацетин)³	КСГО
СУР2В6 (Бупропион)	н.о.
СУР2С8 (Паклитаксел)	1,1		Конкурентное
СУР2С9 (Диклофенак)	1,4		Конкурентное
СУР2С19 (8-Мефенитоин)	н.о.
СУР2О6 (Декстрометорфан)	н.о.
СУРЗА4 (Мидазолам)	0,36	0,072	Основанное на
			механизме
			ингибирование
СУРЗА4 (Тестостерон)	0,14	0,033	Основанное на

механизме ингибирование ^а - специфический субстрат зонда СУР450.

^Ь - не определяли, значения к;, определенные для значений 1С₅₀<10 мкМ.

^с - максимальная константа скорости для инактивации.

Релевантно только для зависимого от времени ингибирования.

Соединение ΐΐΐ демонстрировало ограниченное ингибирование (1С₅₀>20 мкМ) СУР1А2, СΥΡ2Β6, СУР2О6, умеренное ингибирование СУР2С19 (1С₅₀ = 10,2 мкМ) и явное ингибирование (1С₅₀<10 мкМ) СУР2С8, СУР2С9 и СУР3А4. Соединение ΐΐΐ демонстрировало конкурентное ингибирование СУР2С8 и СУР2С9 со значениями к, 0,66 и 0,93 мкМ соответственно. Поскольку СУР3А4 имеет множество сайтов связывания, ингибирование типично оценивали с двумя структурно несвязанными субстратами зонда тестостероном и мидазоламом. Соединение ΐΐΐ демонстрировало явное основанное на механизме ингибирование СУР3А4-тестостерона и СУР3А4-мидозолама со значениями к, 0,21 и 0,06 мкМ соответственно.

- 88 016267

Ингибирование изофермента цитохрома Р450 человеческих микросом соединением ΐΐΐ ш уйго

Изофермент СУР450	К, (мкМ)	К\|пас1 (МИН¹ )^С	Тип ингибирования
СУР1А2 (Фенацетин)³	н.о.^ь
СУР2В6 (Бупропион)	н.о.
СУР2С8 (Паклитаксел)	0,66		Конкурентное
СУР2С9 (Диклофенак)	0,93		Конкурентное
СУР2С19 (δ-Мефенитоин)	н.о.
СУР2О6 (Декстрометорфан)	н.о.
СУРЗА4 (Мидазолам)	0,06	0,06	Основанное на
			механизме
			ингибирование
СУРЗА4 (Тестостерон)	0,21	0,05	Основанное на
			механизме
			ингибирование

^а - специфический субстрат зонда СΥΡ450.

^Ь - не определяли, значения к;, определенные для значений 1С₅₀<10 мкМ. ^с - максимальная константа скорости для инактивации.

Потенциал индукции СΥΡ3Α4 т уйго исследовали в клетках БРХ2. Линия клеток 1)РХ2 представляет собой производное линии человеческих клеток гепатоклеточной карциномы (ΗерС2), трансформированных человеческим рецептором прегнан х (РХК) и вектором с геном-репортером, содержащим область энхансера СΥΡ3Α4. Потенциал для индукции СΥΡ1Α2 т уйго исследовали в клетках СΥΡ1Α2ΌΒΕ. Линия клеток СΥΡ1Α2-^ΒΕ представляет собой стабильно трансформированные клетки 11ер62 с элементами, зависимыми от диоксина (ΌΒΕ), и геном-репортером, содержащим промоторные элементы СΥΡ1Α2. Степень индукции СΥΡ3Α4 определяли путем сравнения активации ΡΧΒ тестируемым продуктом с активацией, обеспечиваемой рифампицином (сильный индуктор), мифепристон (умеренный индуктор) и андростанол (слабый индуктор). Степень индукции СΥΡ1Α2 определяли путем сравнения активации арилуглеводного рецептора (ΑΗΒ), обеспечиваемой тестируемым продуктом, с активацией, обеспечиваемой ТСББ (сильным индуктором), омепразолом (умеренным индуктором) и 2ацетиламинофлуореном (слабым индуктором).

Соединение	Индукция
ϋΡΧ2 (СУРЗА4)	СУР1А2-ОКЕ (СУР1А2)
рац. (I + II)		ОТС	ОТС
I		Умеренная (п=2)	Не индуктор (п=1)
II		ОТС	ОТС
рац. (III + IV)	Умеренная (п=1)	ОТС
III	Умеренная (п=2)	Не индуктор (п=1)
IV	Умеренная (п=1)	ОТС

ОТС - отсутствует.

Как изображено в таблице выше, соединения ΐ и ΐΐΐ представляют собой умеренные индукторы СΥΡ3Α4 и СΥΡΐΑ2.

Связывание с белками плазмы крови т уйго.

Связывание с белками плазмы крови т уйго соединения ΐ и соединения ΐΐΐ в плазме крови крысы, собаки, обезьяны и человека определяли при помощи равновесного диализа. Связывание с белками оценивали путем равновесного диализа с использованием плазмы крови крысы, собаки, обезьяны и человека. Образцы анализировали при помощи ВЭЖХ с обнаружением путем ЖХ-МС/МС. Связывание с белками плазмы крови было выше (>99%) для всех видов и обоих соединений.

_______Связывание с белками соединения ΐ и соединения ΐΐΐ________

Процентное связывание с белками плазмы крови

Виды Соединение I Соединение III

Крысы	99,1	99,4
Собаки	99 0	99 4
Обезьяны	99,9	99,9
Люди	99,8	99,9

Пример 17. Ингибирование цитохрома Р450 т уйго.

Действия соединения ΐ и соединения ΐΐΐ в комбинации с другими агентами.

Осуществляли исследования взаимодействия между лекарствами т уйго, включающие соединение ΐ

- 89 016267 и соединение ΙΙΙ и соединения классов ΝΚΉ и Р^ активные против ΗΙν. Действие ш νί!ΐΌ каждого антиретровирусного лекарства на противовирусную активность любого тестируемого продукта тестировали в трех параллелях на инфицированных вирусом ΗΙν-1 дикого типа МТ-4 человеческих Т-клетках с использованием стандартного анализа чувствительности к лекарству (Ό8Α), осуществляемом в 45% человеческой сыворотке крови (Η8), для обеспечения более хорошей оценки взаимодействий, которые могут возникать в условиях белкового связывания, обнаруженных ш νι\·Ό. Соединение Ι или соединение ΙΙΙ титровали самостоятельно или в комбинации с каждым из ΝΚΉ или РГ

Влияние каждого из ΝΚΉ или ΡI на эффективность соединения Ι или соединения ΙΙΙ тестировали при двух различных концентрациях лекарства: низкой (1х) и высокой (5х) концентрации; высокую концентрацию, используемую для каждого соединения, определяли в предварительных экспериментах, проводимых для того, чтобы гарантировать, что измеряемые значения ингибирования все еще могут быть получены в присутствии 45% Η8.

Эти исследования взаимодействия между лекарствами ш νί!ΐΌ прежде всего проводили для определения возможности отрицательных взаимодействий между различными классами лекарств против ΗΙν, нежели чем для проверки возможного синергического взаимодействия между различными агентами. В итоге, ни одно из тестированных семи ΝΚΉ лекарств против ΗΙν или шести ΡI лекарств против ΗΙν не демонстрировало измеримое отрицательное или антагонистическое взаимодействие с соединением Ι или соединением ΙΙΙ против ΗΙν в этих экспериментах ш νί!ΐΌ.

Пример 18. Метаболизм.

Метаболизм соединений Ι и ΙΙΙ оценивали в клетках крысы, собаки, обезьяны и человека, а ингибирование цитохрома Р450 оценивали в человеческих микросомах печени.

Способы.

Свежие гепатоциты высевали на покрытые коллагеном планшеты и подвергали воздействию тестируемыми соединениями в концентрации 1 мкМ в течение до 2 ч. Тканевую культуральную среду оценивали в отношении утраты соединения при помощи обнаружения путем ЖХ/МС. Значения в табл. 23 демонстрируют независимые эксперименты на 5-7 донорах.

Ингибирование активности СΥΡ450 определяли путем контроля изменений в метаболизме СΥΡ450специфических субстратов человеческими микросомами печени при изменяющихся концентрациях соединения Ι или ΙΙΙ. Субстрат зонда для 2С8 представлял собой паклитаксел, субстрат зонда для 2С9 представлял собой диклофенак и субстраты для зонда 3А4 представляли собой мидазолам и тестостерон. Два субстрата используют для оценки взаимодействий 3А4 ввиду наличия множественных сайтов связывания на ферменте.

Результаты.

Таблица 23

Истощение соединения в гепатоцитах

11/2 (мин)

Виды	Соединение 1	Соединение III
Крыса	33+26	17+15
Собака	28+14	21+10
Обезьяна	63+40	52+24
Человек	215148	125+55

Как представлено в таблице выше, соединение Ι и соединение ΙΙΙ демонстрировали ограниченный метаболизм ш νί!ΐΌ в человеческих гепатоцитах.

Ингибирование изофермента СУР450

К, (мМ)

	Соединение I	Соединение III
2С8	1,10	0,66
2С9	1,45	0,93
ЗА4	0,36	0,06

Как представлено в таблице выше, соединение Ι и соединение ΙΙΙ демонстрировали конкурентное ингибирование СΥΡ2С8 и СΥΡ2С9. Кроме того, соединение Ι и соединение ΙΙΙ демонстрировали основанное на механизме ингибирование СΥΡ3Α4. Основанное на механизме ингибирование характеризуется зависимой от времени утратой ферментативной активности, ассоциированной с ковалентным связыванием между ферментом и реакционноспособным метаболическим промежуточным соединением. Основанное на механизме ингибирование также ассоциируется с индукцией СΥΡ450, поскольку новый фермент требуется для восстановления ферментативной активности. Ингибирование СΥΡ 2Ό6, 1А2, 2В6 и 2С19 не обнаружено.

Метаболизм соединения Ι и ΙΙΙ по сравнению с соответствующими рацематами

Метаболизм ш νί!ΐΌ оценивали с использованием микросом печени всех видов. Соединения инку

- 90 016267 бировали в концентрации 1 мкМ с микросомами печени в течение периода времени до 1 ч. Приведенные периоды полувыведения, больше чем общее время инкубации, представляют собой экстраполированные значения. Экстракты исследовали в отношении исчезновения родительского соединения при помощи обнаружения путем ЖХ-МС/МС. Данные представляют собой один независимый проведенный эксперимент.

Период полувыведения соединений I и III и рацематов в микросомах печени ιη νΐΐΓΟ

Виды	1 рац. (1 + II)	III	рац. (III + IV)
		Период полувыведения (мин)
Крыса	100	146	88.8	105
Собака	19,3	287	13.2	257
Обезьяна	15,4	18.4	12.6	16,3
Человек	120,6	115	154	91,2

Как представлено в таблице выше, чистые энантиомерные соединения I и III обладали значительно более короткими периодами полувыведения из микросом печени по сравнению с соответствующими энантиомерами.

Пример 19. Фармакокинетика ιη νίνο.

Фармакокинетику соединений I и III оценивали у крыс (только соединение III), собак и обезьян. Способы.

Все животные получали разовую пероральную или внутривенную дозу соединения в полиэтиленгликоле 400 (ΡΕ0400) или смеси 10% этанола (ЕЮН), 10% диметилацетамине (ЭМА) и 80% ΡΕ0400 при указанном уровне дозы. Данные по концентрации в плазме крови получали с использованием чувствительных и специфических способов ЖХ-МС/МС. Фармакокинетические данные в результате исследования токсичности включали аспекты половых различий, изменчивости и воздействия.

Образцы крови (1,5-2,5 мл) собирали в гепаринизированные пробирки на 0 (перед дозой), 5 (только в.в.), 10, 20, 30 мин, 1, 2, 4, 6, 8, 12 (только п.о.) и 24 ч после введения дозы. Плазму крови отделяли и хранили при -70°С до анализа.

Концентрации немеченых соединения I и соединения III в образцах плазмы крови и экскретах крысы, собаки и обезьяны в ФК (фармакокинетических) исследованиях идентифицировали при помощи способов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), включающих обнаружение путем массспектрометрии (ЖХ-МС/МС).

Абсолютную биодоступность при пероральном введении определяли в фармакокинетическом исследовании путем сравнения значений АиС (площади под кривой) родительского соединения после введения разовых внутривенных и пероральных доз крысам (только соединение III), собакам и обезьянам.

Биодоступность при пероральном введении соединения (5 мг/кг) в результате предварительных ФК исследованиях составляла 38% у крыс (только соединение III), 4-9% у собак и 42-58% у обезьян. Хотя биодоступность соединения III у крыс больше, чем у собак, и сравнима с обезьянами, крысы имели гораздо меньшую АиС воздействия в плазме крови по сравнению с собаками и обезьянами.

Абсолютную биодоступность также оценивали для обоих соединений в исследованиях на обезьянах в концентрации 5 мг/кг. Абсолютная биодоступность соединения III составляла 42% у самцов и 76% у самок, что свидетельствовало о возможном различии между полами при системном введении. Биодоступность соединения I, рассчитанная с использованием средних значений Аи%, составляла 54% у самцов и 61% у самок. Тем не менее, значение для самцов может быть недооценено, поскольку абсорбция у одного из животных была медленной, и концентрации в плазме крови, по-видимому, оставались увеличенными через 8 ч после введения дозы. На основе значений АиС и исключения животного, для которого АиО не может быть рассчитана, биодоступность у самцов составляла 75%. После пероральной дозы 5 мг/кг концентрации в плазме крови через 24 ч после введения дозы составили 12 нг/мл для соединения III и 17,9 нг/мл для соединения I. Пероральная доза 5 мг/кг у обезьяны эквивалентна (на основе площади поверхности организма) дозе для людей приблизительно 100 мг (смотри Отдаче £ог ИнкШгу: Εδΐ^таΐ^ηд (Ре Мах1тит 8а£е 81аПтд Ос^е т ИшЫ С11'м1са1 Тг1'и18 £ог ТРегареШЮ т Ас1и11 НеаИИу УокпНеечх. и.8. □ерагПпееП о£ НеаРР аηά Нитаη 8е^ν^сеδ, Ροοά аηά Эгид Аат^^-айо^ СееНег £ог Эгид ЕлМиаиоп аηά Кеδеа^сР, 1и1у 2005). Этот уровень соединения через 24 ч после введения дозы поддерживается введением дозы один раз в сутки.

- 91 016267

Биодоступность соединений ΐ и ΐΐΐ при пероральном введении

Виды	Доза (мг/кг)^а	Путь введения	Кол-во животных / пол	Ттах (ч)	ВА (%)
Собака	5	ПО-Сыт.	Соединение 1 2М, 1Е	0,З^ь	9
Обезьяна	5	ПО-Сыт.	ЗМ	2,7^Ь	58
Обезьяна	5	ПО-Сыт.	ЗМ	4,0^е	54
Обезьяна	5	ПО-Сыт.	ЗЕ	4,0^е	61
Крыса	10	ПО-Голодн.	Соединение III ЗМ	0,4^ь	38
Собака	5	ПО-Сыт.	1М, 1Е	1,5^Ь	4
Собака	20	ПО-Сыт.	1М, 1Е	2,2^Ь	23
Обезьяна	5	ПО-Сыт.	2М	3,0^ь	42
Обезьяна	5	ПО-Сыт.	ЗМ	2,0^е	42
Обезьяна	5	ПО-Сыт.	ЗЕ	2,0^е	76
Обезьяна	20	ПО-Сыт.	2М	2,5^Ь	61

ВА - абсолютная биодоступность при пероральном введении.

^а - крысы, собаки и обезьяны получали разовую пероральную дозу соединения ΐ или соединения ΐΐΐ.

Дополнительно крысы получали в.в. дозу 2 мг/кг, а собаки и обезьяны получали в.в. дозу мг/кг.

^Ь - среднее значение. ^с - срединное значение.

Пример 20. Токсикология.

Потенциальные токсичности соединений ΐ и ΐΐΐ оценивали у крыс и обезьян т у1уо.

Способы.

Крысам 8ргадие-Эате1еу и обезьянам супото1дик один раз в сутки в течение 14 суток при помощи перорального зонда вводили дозу соединения ΐ или соединения ΐΐΐ или разбавитель дозы (68% Сарти1 РС-8, 20% РЕС 400, 2% 'Гтеееп 20 и 10% лабрасол) в соответствии с СЬР. Использовали 10 самцов и 10 самок крыс и 3 самца и 3 самки обезьян. Крысам и обезьянам вводили дозу 0, 50, 150 или 500 мг/кг/сутки соединения ΐ или 0, 50, 150, 450 мг/кг/сутки соединения ΐΐΐ.

Токсичность оценивали в соответствии с клиническими наблюдениями, массой организма, потреблением корма и клинической патологией (гематология, свертывание крови и химия сыворотки крови). Исчерпывающее некропсическое исследование и общее патологическое исследование осуществляли на всех животных, и выбранные органы и ткани отбирали для гистологической оценки. Определения гематокрита, концентрации гемоглобина, подсчет эритроцитов, общий подсчет лейкоцитов и подсчет тромбоцитов проводили во всех образцах. Осуществляли дифференциальные и морфологические оценки лейкоцитов. Клинические биохимические оценки включали активности аланинаминотрансферазы (ΆΣΤ), аспартатаминотрансферазы (АОТ), гамма-глутамилтрансферазы (СОТ) и щелочной фосфатазы (АЬР) и концентрации азота мочевины в крови (ВиМ), креатинина, общего белка, альбумина, глобулина, глюкозы, холестерина, триглицеридов, общего билирубина и уровней электролитов (На, К, Р, С1, Са).

Образцы мочи (только у обезьян) оценивали макроскопически и микроскопически и тестировали в отношении рН, билирубина, глюкозы, белка, кетонов, крови, уробилиногена, нитритов, лейкоцитов и удельной массы.

Результаты.

Никакие эффекты в отношении потребления корма или разницы массы тела не ассоциировались с дозой соединения ΐ или соединения ΐΐΐ. Ые обнаружены связанные с лечением клинические факты, и не обнаружены токсикологически важные изменения гематологических параметров или химии сыворотки крови или факты, связанные с исследованием мочи.

Отсутствовало токсикологически значимое действие в отношении массы органов (абсолютные или относительные), за исключением увеличенной массы печени у крыс (только самок) и обезьян, обработанных соединением ΐΐΐ при средних и высоких дозах. Тем не менее, эти образцы печени микроскопически ничем не выделялись.

У крыс, обработанных соединением ΐ и соединением ΐΐΐ, обнаружена минимальная-умеренная гипертрофия/гиперплазия тиреоидных фолликулярных клеток во всех дозируемых группах, за исключением самок, которых лечили низкой дозой соединения ΐΐΐ. Влияние на тиреоидную функцию не может быть

- 92 016267 оценено, поскольку уровни тиреоидного гормона и Т8Н (тиреоидстимулирующего гормона) в системе кровообращения не исследовали.

Никакие другие макроскопические поражения, микроскопические явления или гистопатологические явления не обнаружены у крыс или обезьян.

Все публикации и заявки на патенты, цитированные в этом описании, включены здесь путем ссылки, как если бы было указано, что каждая индивидуальная публикация или заявка на патент специфически и индивидуально включена путем ссылки. Изобретение описано со ссылкой на некоторые воплощения. Хотя предшествующее изобретение более подробно описано путем иллюстрации и примеров для задач ясности понимания, для специалистов в данной области техники в свете идеи изобретения будет понятно, что некоторые изменения и модификации могут быть произведены, не отходя от сущности или объема формулы изобретения. Вариации и модификации изобретения будут очевидны специалистам в данной области техники из предыдущего подробного описания изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Соединение формулы (С) или его фармацевтически приемлемая соль где К³ и К⁵ независимо представляют собой С1_-6алкил или С_2-6алкенил, каждый из которых может быть, возможно, независимо замещен СN или галогеном;

каждый из К⁴ и К⁵ независимо представляет собой водород или галоген;

К¹ представляет собой водород, фенилсульфонил или 4-метоксибензил и

Υ представляет собой О-С1_-2алкил.
2. Соединение по п.1 формулы или его фармацевтически приемлемая соль.
3. Соединение по п.1 формулы или его фармацевтически приемлемая соль.
4. Фармацевтически приемлемая соль соединения по любому из пп.1-3.
5. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по любому из пп.1-3 и фармацевтический носитель, эксципиент или разбавитель, где указанная композиция, по существу, не содержит проти воположного энантиомера указанного соединения.
6. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по любому из пп.1-3 и второй агент против ШУ (вирус иммунодефицита человека), где указанная композиция, по существу, не содержит проти воположного энантиомера указанного соединения.
7. Фармацевтическая композиция по п.6, где второй агент против ШУ представляет собой ингибитор протеазы или ингибитор интегразы.
8. Способ лечения инфекции ШУ, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества соединения по любому из пп.1-3.
9. Способ по п.8, дополнительно включающий введение субъекту соединения в комбинации или путем чередования, по меньшей мере, со вторым агентом против ШУ.
10. Способ по п.9, где второй агент против ШУ представляет собой ингибитор протеазы, нуклео

- 93 016267 зидный или нуклеотидный ингибитор обратной транскриптазы, ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы, комбинацию с фиксированной дозой, ингибитор проникновения, антагонист корецептора ССК5, ингибитор созревания или ингибитор интегразы; где комбинацией с фиксированной дозой является комбинация нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы с фиксированной дозой или комбинация нуклеозидного ингибитора обратной транскриптазы, нуклеотидного ингибитора обратной транскриптазы и, возможно, ненуклеозидного ингибитора обратной транскриптазы с фиксированной дозой.
11. Способ по п.8, где соединение вводят в комбинации или путем чередования с агентом против НВУ (вируса гепатита В).
12. Способ по п.8, где соединение вводят перорально.
13. Способ по п.8, где соединение вводят в комбинации со вторым соединением, эффективным для лечения или предупреждения инфекции НСУ (вирус гепатита С) у субъекта.
14. Применение соединения по любому из пп.1-3 в терапии.
15. Применение соединения по любому из пп.1-3 в изготовлении лекарственного средства для лечения, предупреждения, уменьшения симптомов или контроля над симптомами, ассоциированными с инфекцией ШУ.
16. Фармацевтическая композиция по п.7, где второй агент против ШУ представляет собой ампренавир, типранавир, индинавир, саквинавир, лопинавир, ритронавир, фосампренавир, дарунавир, атазанавир, нелфинавир, бреканивир, элвитегравир или ралтегравир.
17. Способ по п.10, где второй агент против ШУ представляет собой ампренавир, типранавир, индинавир, саквинавир, лопинавир, ритронавир, фосампренавир, дарунавир, атазанавир, нелфинавир, ламивудин, эмтрицитабин, абакавир, залцитабин, зидовудин, тенофовир, диданозин, ставудин, делавирдин, эфавиренз, невирапин, атриплу, комбивир, тризивир, труваду, маравирок, энфувиртид, бреканивир, амдоксовир, априцитабин, элвуцитабин, этравирин, рилпивирин, каланолид А, аплавирок, викривирок, бевиримат, элвитегравир или ралтегравир.
18. Способ по п.11, где агент против НВУ представляет собой энтекавир, ламивудин, интерферон альфа-2Ь, пегинтерферон альфа-2а, адефовира дипивоксил, телбивудин, эмтрицитибин, клевудин, тенофовир, валторцитабин, амдоксовир, ремофовир или рацивир.
19. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по п.2 и фармацевтический носитель, эксципиент или разбавитель, где указанная композиция, по существу, не содержит противоположного энантиомера указанного соединения.
20. Фармацевтическая композиция по п.19, дополнительно содержащая второй агент против ШУ.
21. Фармацевтическая композиция по п.20, где второй агент против ШУ представляет собой ингибитор протеазы или ингибитор интегразы.
22. Фармацевтическая композиция по п.20, где второй агент против ШУ представляет собой ампренавир, типранавир, индинавир, саквинавир, лопинавир, ритронавир, фосампренавир, дарунавир, атазанавир, нелфинавир, бреканивир, элвитегравир или ралтегравир.
23. Способ лечения инфекции ШУ, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества соединения по п.2.
24. Способ по п.23, дополнительно включающий введение субъекту соединения в комбинации или путем чередования, по меньшей мере, со вторым агентом против ШУ.
25. Способ по п.24, где второй агент против ШУ представляет собой ингибитор протеазы, нуклеозидный или нуклеотидный ингибитор обратной транскриптазы, ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы, комбинацию с фиксированной дозой, ингибитор проникновения, антагонист корецептора ССК5, ингибитор созревания или ингибитор интегразы; где комбинацией с фиксированной дозой является комбинация нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы с фиксированной дозой или комбинация нуклеозидного ингибитора обратной транскриптазы, нуклеотидного ингибитора обратной транскриптазы и, возможно, ненуклеозидного ингибитора обратной транскриптазы с фиксированной дозой.
26. Способ по п.24, где второй агент против ШУ представляет собой ампренавир, типранавир, индинавир, саквинавир, лопинавир, ритронавир, фосампренавир, дарунавир, атазанавир, нелфинавир, ламивудин, эмтрицитабин, абакавир, залцитабин, зидовудин, тенофовир, диданозин, ставудин, делавирдин, эфавиренз, невирапин, атриплу, комбивир, тризивир, труваду, маравирок, энфувиртид, бреканивир, амдоксовир, априцитабин, элвуцитабин, этравирин, рилпивирин, каланолид А, аплавирок, викривирок, бевиримат, элвитегравир или ралтегравир.
27. Способ по п.23, дополнительно включающий введение субъекту соединения в комбинации или путем чередования с агентом против НВУ.
28. Способ по п.27, где агент против НВУ представляет собой энтекавир, ламивудин, интерферон альфа-2Ь, пегинтерферон альфа-2а, адефовира дипивоксил, телбивудин, эмтрицитибин, клевудин, тенофовир, валторцитабин, амдоксовир, ремофовир или рацивир.
29. Способ по п.23, где соединение вводят перорально.
30. Способ по п.23, где соединение вводят в комбинации со вторым соединением, эффективным для лечения или предупреждения инфекции НСУ у субъекта.