EA008438B1

EA008438B1 - Парентеральные композиции пептида для лечения системной красной волчанки

Info

Publication number: EA008438B1
Application number: EA200501129A
Authority: EA
Inventors: Шарон Кохен-Веред; Эсмира Нафтали; Вера Вайнштейн; Адриан Гилберт; Эти Клингер
Original assignee: Тева Фармасьютикал Индастриз, Лтд.
Priority date: 2003-01-14
Filing date: 2004-01-14
Publication date: 2007-06-29
Also published as: KR20050100616A; CO5640149A2; WO2004064788A2; MXPA05007552A; CN1761477A; NZ541659A; BRPI0406737A; CA2513331A1; UA83816C2; ECSP055960A; US20040180059A1; WO2004064788A3; ZA200506205B; US7294687B2; JP2006516034A; US20080287366A1; EP1587525A4; EP1587525A2; EA200501129A1; NO20053761L

Abstract

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей водный носитель; от 0,1 до 20 мг/мл композиции фармацевтически приемлемой соли пептида, имеющего структурную формулу NH-Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu Trp Ile Gly-COOH, и замещенный β-циклодекстрин в количестве, эффективном для растворения пептида в водном носителе, при этом композиция имеет рН от 4 до 9, к способу получения и способу ослабления симптомов системной красной волчанки (СКВ) у человека, включающему в себя введение человеку фармацевтической композиции.

Description

В описании данного изобретения ссылки на различные публикации даны посредством полного цитирования. Описания указанных публикаций в полном объеме включены при этом в данное изобретение в виде ссылки, чтобы более полно описать состояние уровня техники, которое известно специалистам на дату изобретения, описанного и заявленного в данном описании.

Уровень техники

Системная красная волчанка (СКВ), или волчанка, является ослабляющим здоровье аутоиммунным заболеванием, характеризующимся наличием множества аутоантител, включая антитела к днДНК, к ядерным антигенам и к рибонуклеопротеидам. СКВ поражает примерно 1 из 2000 человек (в США 1 из 700 женщин). Заболевание главным образом поражает молодых женщин, при соотношении женщин к мужчинам, составляющем примерно 9:1.

Системная красная волчанка может поражать почти любой орган или систему организма. Системная красная волчанка может охватывать периоды, когда выражено немного симптомов, если они вообще выражены («ремиссия»), и другие периоды, когда заболевание становится более активным («вспышка»). Наиболее часто, когда люди упоминают «волчанку», они относят ее к системной форме заболевания.

Кортикостероиды являются главной опорой при лечении системных аутоиммунных заболеваний. Угрожающие жизни, приводящие к тяжелой инвалидности проявления СКВ лечат высокими дозами глюкокортикоидов (1-2 мг/кг/сутки). Нежелательные эффекты хронического введения глюкокортикоидов включают в себя множество заметных неблагоприятных эффектов, таких как кушингоидный габитус, ожирение центрального действия, гипертония, инфекция, ломкость капилляров, гирсутизм, усиленный остеопороз, катаракты, сахарный диабет, миопатия и психоз. Кроме токсичности кортикостероидов согласие пациентов на схему дозирования также представляет собой серьезную проблему.

Для борьбы с активным заболеванием также используют цитотоксические агенты, снижающие частоту вспышек заболевания и уменьшающие потребность в стероидах. Нежелательные побочные эффекты последних включают в себя угнетение костного мозга, повышенную частоту инфекций оппортунистическими организмами, необратимую недостаточность функции яичников, алопецию и повышенный риск злокачественных новообразований.

СКВ является воспалительным заболеванием, для которого до настоящего времени не существует определенного способа лечения или средства. Заболевание приводит к острым и хроническим осложнениям. Единственными способами лечения являются паллиативные способы, предназначенные для снятия острых симптомов и предотвращения хронических осложнений, часто с сильными побочными эффектами. Поэтому существует неудовлетворенная потребность в данной области, и врачи и пациенты были бы рады новым способам лечения, которые потенциально могли бы устранить или уменьшить нежелательные проявления болезни.

Пептиды на основе определяющей комплементарность области моноклонального анти-ДНКантитела 16/614 человека, способные иммуномодулировать связанные с СКВ ответы, описаны в международной публикации РСТ № ΥΘ02/067848 А2, полное содержание которой, таким образом, включено в настоящее описание в виде ссылки. В частности, обнаружено, что область СЭК1 ингибирует пролиферативный ответ лимфоцитов периферической крови (РВБ) пациентов с СКВ на анти-ДНК 16/614-мАт человека и ослабляет проявления болезни у мышей, пораженных спонтанной или экспериментальной СКВ.

СЭК1 человека, соединение 1, показанное на фиг. 1, является синтетическим пептидом из 19 аминокислот на основе определяющей комплементарность области 1 (СЭК1) анти-днДНК-мАт человека, названного 16/6 И (^а18таи, А., е! а1. «Мо4и1а1юп о£ шигше 8у81еш1с 1ири§ егу1йеша108И8 χνίΐΐι рерйбек Ьа5с4 оп сошр1ешеи1агйу 4е1епшпшд гедюпк о£ ра!йодешс апИ-ΌΝΑ шопос1опа1 аиНЬоФек». Ргос. №111. Аса4. 8с1. И8А. (1997), 94 (4): 4620-4625).

В экспериментальных моделях СКВ - мыши Ва1Ь/с и склонные к СКВ мыши, т.е. мыши (ΝΖΒ/ΝΖ\ν)Ρ1 - лечение либо пептидами на основе шСЭК, либо соединением 1 значимо снижало связанные с СКВ показатели, особенно отложения иммунных комплексов (Κ'Ό) в почке, протеинурию и лейкопению. Лечение не оказывало влияния на 16/6 14-специфический гуморальный ответ (^ащшап, А., е! а1. Мо4и1а1юп о£ шигше хуЧепис 1ири8 егу!йеша!о8И8 χνίΐΐι райюдешс ап!1-О№А шопос1опа1 ап11Ьо41е8. Ргос. №а!1. Аса4. 8сг И8А (1997), 94(4): 620; Е11а!, Е., е! а1., Ргеуеп!юп о£ куйешю 1ири8 егу1йеша!о8И8-11ке 415еа5е ш (ΝΖΒ/ΝΖΥ)Ε1 писе Ьу !геа1шд χνίΐΐι СОВ- ап4 СЭР3- Ьа§е4 рер44е8 о£ раШодешс аи!оап!1Ьо4у

1. С1ш. Iттипо1. (2000), 20: 268; Е11а!, Е., е! а1., Тйе шескашкш Ьу ^Ыск а рер!14е Ьа§е4 оп сошр1ешеп1агйу 4е!е^т^и^пд гедюп-1 о£ раПюдешс ап!1-О№А ап!1Ьо4у аше1юга!е8 ехрепшеп!а1 ЗБЕ (2001), Ргос. №111. Аса4. 8сг И8А 98: 1148).

Указанные пептиды, подобно многим пептидам, не очень хорошо растворимы. Поэтому желательны композиции, которые улучшают растворимость пептидов.

- 1 008438

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей водный носитель;

от 0,1 до 20 мг/мл композиции фармацевтически приемлемой соли пептида, имеющего структурную формулу ИН₂-С1у Туг Туг Тгр 8ег Тгр 11е Агд С1п Рго Рго С1у Ьу5 С1у С1и С1и Тгр 11е С1у-СООН (8Еф ΙΌ N0: 1); и замещенный β-циклодекстрин в количестве, эффективном для растворения пептида в водном носителе, где композиция имеет рН от 4 до 9.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей водный носитель;

от 0,1 до 20 мг/мл композиции ацетатной соли пептида, имеющего структурную формулу ΝΗ₂-61ν Туг Туг Тгр 8ег Тгр 11е Агд С1п Рго Рго С1у Ьу5 С1у С1и С1и Тгр 11е С1у-СООН (8Еф ΙΌ N0: 1); и от 70 до 170 мг/мл композиции гепта(сульфобутиловый эфир)-в-циклодекстрина, в которой пептид и гепта(сульфобутиловый эфир)ф-циклодекстрин растворены в водном носителе; и где раствор имеет рН от 6,5 до 8,5.

Настоящее изобретение также относится к способу ослабления симптомов системной волчанки (СКВ) у человека, включающему в себя введение человеку любой из указанных выше фармацевтических композиций в количестве, эффективном для ослабления симптомов СКВ у человека.

Настоящее изобретение также относится к способу производства указанной выше фармацевтической композиции, включающему в себя стадии:

a) приготовления раствора замещенного β-циклодекстрина в водном носителе в предварительно определенной концентрации;

b) добавления предварительно определяемого количества фармацевтически приемлемой соли пептида ΝΗ2-61ν Туг Туг Тгр 8ег Тгр 11е Агд С1п Рго Рго С1у Ьу5 С1у С1и С1и Тгр 11е С1у-СООН (8Еф ΙΌ NО:

1) к раствору со стадии а);

c) корректировки рН раствора со стадии Ь) вплоть до растворения пептида в растворе; и

б) при необходимости доведения рН раствора со стадии с) до рН 4-9, с получением, таким образом, фармацевтической композиции.

Настоящее изобретение также относится к способу лиофилизации описанной выше фармацевтической композиции, включающему в себя стадии:

a) снижения температуры фармацевтической композиции до -40°С;

b) поддержания температуры на уровне -40°С в течение предварительно определяемого периода времени;

c) повышения температуры раствора до 20°С;

б) поддержания температуры на уровне 20°С в течение предварительно определяемого периода времени; и

е) понижения давления до 10 мкбар с получением, таким образом, лиофилизированной фармацевтической композиции.

Настоящее изобретение также относится к способу лиофилизации указанной выше фармацевтической композиции, включающему в себя стадии:

a) снижения температуры фармацевтической композиции до -45°С;

b) поддержания температуры на уровне -45°С в течение предварительно определяемого периода времени;

c) повышения температуры раствора до -20°С;

б) повышения температуры до 25°С; и

е) поддержания температуры на уровне 25°С в течение предварительно определяемого периода времени с получением, таким образом, лиофилизированной фармацевтической композиции.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 - СОРТ человека (соединение 1) в виде ацетатной соли - показаны молекулярная и структурная формулы БСОК1, аминокислотная последовательность и физические параметры.

Фиг. 2 - секреция 1Ь-2 из клеток, взятых от мышей, обработанных раствором соединения 1 и каптизола, после того, как затем клетки были активированы раствором соединения 1 в РВ8.

-И^- Соединение 1 (К.8) 50 мкг/мышь.

~А— Соединение 1 (К8) 200 мкг/мышь.

^—□- ϋΡ 50 мкг/мышь.

—Δ- ПР 200 мкг/мышь.

— о— 12% каптизол в ампулах.

Фиг. 3 - секреция ΙΕΝ-γ из клеток, взятых от мышей, обработанных раствором соединения 1, после того, как клетки были затем активированы раствором соединения 1 в ЕМ-1 (2,5х 10⁶ клеток/лунку).

Плацебо.

- 2 008438 ·- Соединение 1 50 мкг/мышь (лечебная доза). Δ— Соединение 1 100 мкг/мышь (лечебная доза). Х^_ Соединение 1 200 мкг/мышь (лечебная доза).

Фиг. 4 - секреция ΙΕΝ-γ из клеток, взятых от мышей, обработанных раствором соединения 1, после того, как клетки были затем активированы раствором соединения 1 в ЕМ-1 (5х 10⁶ клеток/лунку).

-0- Плацебо.

~О^- Соединение 1 25 мкг/мышь.

~Л^- Соединение 1 50 мкг/мышь.

—X— Соединение 1 100 мкг/мышь.

—* — Соединение 1 200 мкг/мышь.

Фиг. 5 - анти-днДНК-антитела у мышей (ΝΖΒχΝΖΑ)Ε1 после 10 инъекций соединения 1 в каптизоле [ОП=оптическая плотность; соединение 1 (С) = соединение 1, растворенное в каптизоле].

Плацебо.

^—6— Соединение 1 50 мкг/мышь.

~О— Соединение 1 25 мкг/мышь.

Фиг. 6 - срезы почек от мышей (ΝΖΒχΝΖΑ)Ε1, показывающие интенсивность отложений иммунных комплексов. Срезы в верхнем ряду получены от мыши, обработанной каптизолом, срезы среднего ряда от мыши, обработанной 50 мкг/мышь соединения 1, и срезы нижнего ряда от мыши, обработанной 25 мкг/мышь соединения 1. Увеличение: левые: х100, правые: х400. ФИТЦ-иммуногистология.

Подробное описание

от 0,1 до 20 мг/мл композиции фармацевтически приемлемой соли пептида, имеющего структурную формулу ΝΗ₂-Ο1ν Туг Туг Тгр 8ег Тгр 11е Агд С1и Рго Рго С1у Ьу5 С1у С1и С1и Тгр 11е С1у-СООН (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1); и замещенный β-циклодекстрин в количестве, эффективном для растворения пептида в водном носителе, при этом композиция имеет рН от 4 до 9.

В одном варианте концентрация ацетатной соли пептида составляет по меньшей мере 0,5 мг/мл.

В одном варианте концентрация соли пептида составляет от 0,5 до 10 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет от 0,5 до 2,5 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет от 2,5 до 5 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет от 5 до 7 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет от 7 до 8,5 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет от 8,5 до 10 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет от 9 до 10 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет от 10 до 15 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет от 15 до 20 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет 1,0 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет 2,5 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет 5 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет 10 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет 15 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли составляет от 0,1 до 0,5 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли составляет от 0,1 до 0,2 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли составляет от 0,2 до 0,3 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли составляет от 0,3 до 0,4 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли составляет от 0,4 до 0,5 мг/мл.

В следующем варианте композиция имеет рН от 6,5 до 8,5.

В следующем варианте композиция имеет рН от 7,5 до 8,5.

В следующем варианте композиция имеет рН от 4 до 5.

В следующем варианте композиция имеет рН от 5 до 6.

В следующем варианте композиция имеет рН от 6 до 7.

В следующем варианте композиция имеет рН от 7 до 8.

В следующем варианте композиция имеет рН от 8 до 9.

В другом варианте фармацевтически приемлемой солью является ацетатная соль.

В другом варианте замещенным β-циклодекстрином является β-циклодекстрин, замещенный гидроксипропилом, сульфобутиловым эфиром или сульфопропиловым эфиром.

В следующем варианте замещенным β-циклодекстрином является β-циклодекстрин, замещенный сульфобутиловым эфиром.

В следующем варианте фармацевтически приемлемой солью является ацетатная соль и замещенным β-циклодекстрином является гепта(сульфобутиловый эфир)-в-циклодекстрин.

- 3 008438

В другом варианте композиция, кроме того, содержит фармацевтически приемлемый буфер в таком количестве и такого типа, которые подходят для получения рН фармацевтической композиции в диапазоне 4-9. Буфером может быть ацетатный буфер, цитратный буфер или карбонат натрия.

от 0,1 до 20 мг/мл композиции ацетатной соли пептида, имеющего структурную формулу ЫН₂-С1у Туг Туг Тгр 8ет Тгр 11е Лтд С1п Рго Рго С1у Ьу8 С1у С1и С1и Тгр 11е С1у-С00Н (8ЕО ГО N0: 1); и от 70 до 170 мг/мл композиции гепта(сульфобутиловый эфир)-в-циклодекстрина, в которой пептид и гепта(сульфобутиловый эфир)-в-циклодекстрин растворены в водном носителе; и где композиция имеет рН от 6,5 до 8,5.

В одном варианте концентрация ацетатной соли пептида составляет от 0,5 до 10 мг/мл.

В следующем варианте концентрация ацетатной соли пептида составляет от 0,5 до 2,5 мг/мл.

В следующем варианте концентрация ацетатной соли пептида составляет 1,0 мг/мл.

В следующем варианте концентрация ацетатной соли пептида составляет 2,5 мг/мл.

В другом варианте концентрация гепта(сульфобутиловый эфир)-в-циклодекстрина составляет 120 мг/мл, и рН композиции составляет от 7,5 до 8,5.

Настоящее изобретение также относится к способу ослабления симптомов системной красной волчанки (СКВ) у человека, включающему в себя введение человеку любой из указанных выше фармацевтических композиций в количестве, эффективном для ослабления симптомов СКВ у человека.

Настоящее изобретение также относится к указанным выше фармацевтическим композициям для применения при лечении СКВ у человека.

Настоящее изобретение также относится к способу производства любой из указанных выше фармацевтических композиций, включающему в себя стадии:

a) приготовление раствора замещенного β-циклодекстрина в водном носителе в предварительно определяемой концентрации;

b) добавление предварительно определяемого количества фармацевтически приемлемой соли пептида ΝΗ₂-Ο1ν Туг Туг Тгр 8ет Тгр 11е Агд С1п Рго Рго С1у Ьук С1у С1и С1и Тгр 11е С1у-С00Н (8ЕО ГО N0: 1) к раствору со стадии а);

c) корректировка рН раствора со стадии Ь) вплоть до растворения пептида в растворе; и

б) при необходимости доведение рН раствора со стадии с) до рН 4-9 с получением, таким образом, фармацевтической композиции.

В одном варианте способа полученная в результате конечная концентрация замещенного βциклодекстрина в фармацевтической композиции составляет от 70 до 170 мг/мл.

В одном варианте способа предварительно определяемой концентрацией замещенного βциклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного β-циклодекстрина в фармацевтической композиции от 80 до 170 мг/мл.

В одном варианте способа предварительно определяемой концентрацией замещенного βциклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного β-циклодекстрина в фармацевтической композиции от 90 до 170 мг/мл.

В одном варианте способа предварительно определяемой концентрацией замещенного βциклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного β-циклодекстрина в фармацевтической композиции от 100 до 170 мг/мл.

В одном варианте способа предварительно определяемой концентрацией замещенного βциклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного β-циклодекстрина в фармацевтической композиции от 110 до 170 мг/мл.

- 4 008438

В одном варианте способа предварительно определяемой концентрацией замещенного βциклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного β-циклодекстрина в фармацевтической композиции от 120 до 170 мг/мл.

В одном варианте способа предварительно определяемой концентрацией замещенного βциклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного β-циклодекстрина в фармацевтической композиции от 130 до 170 мг/мл.

В одном варианте способа предварительно определяемой концентрацией замещенного βциклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного β-циклодекстрина в фармацевтической композиции от 140 до 170 мг/мл.

В одном варианте способа предварительно определяемой концентрацией замещенного βциклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного β-циклодекстрина в фармацевтической композиции от 150 до 170 мг/мл.

В одном варианте способа предварительно определяемой концентрацией замещенного βциклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного β-циклодекстрина в фармацевтической композиции от 160 до 170 мг/мл.

В одном варианте способа предварительно определяемой концентрацией замещенного βциклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного β-циклодекстрина в фармацевтической композиции, составляющей 120 мг/мл.

В другом варианте предварительно определенным количеством пептида является такое количество, которое приводит к конечной концентрации пептида в фармацевтической композиции, составляющей по меньше мере 0,1 мг/мл.

В другом варианте предварительно определенным количеством пептида является такое количество, которое приводит к конечной концентрации пептида в фармацевтической композиции,составляющей по меньше мере 0,5 мг/мл.

В другом варианте предварительно определенным количеством пептида является такое количество, которое приводит к конечной концентрации пептида в фармацевтической композиции, составляющей

2,5, 2,0, 1,0, 0,5 или 0,1 мг/мл.

В другом варианте предварительно определенным количеством пептида является такое количество, которое приводит к конечной концентрации пептида в фармацевтической композиции, составляющей 5, 10 или 15 мг/мл.

В другом варианте способа стадия Ь) дополнительно включает в себя перемешивание раствора в течение 1 ч.

В другом варианте на стадии с) рН корректируют, используя 1,0н. НС1 или ΝαΟΗ.

В другом варианте способ дополнительно включает в себя фильтрование раствора со стадии б) через фильтр из ацетата целлюлозы.

В другом варианте указанного выше способа предварительно определяемой концентрацией замещенного β-циклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного β-циклодекстрина в фармацевтической композиции, составляющей 120 мг/мл;

предварительно определяемым количеством пептида является такое количество, которое приводит к конечной концентрации пептида в фармацевтической композиции, составляющей 2,5, 2,0, 1,0, 0,5 или 0,1 мг/мл;

стадия Ь) дополнительно включает в себя перемешивание раствора в течение 1 ч; и на стадии с) рН корректируют, используя 1,0н. НС1 или ΝαΟΗ, и способ дополнительно включает в себя фильтрование раствора со стадии б) через фильтр из ацетата целлюлозы.

Настоящее изобретение также относится к композиции, полученный указанным выше способом.

b) поддержания температуры при -40°С в течение предварительно определяемого периода времени;

c) повышения температуры раствора до 20°С;

б) поддержания температуры при 20°С в течение предварительно определяемого периода времени; и

е) поддержания температуры при 25°С в течение предварительно определяемого периода времени с получением, таким образом, лиофилизированной фармацевтической композиции.

В одном варианте способа стадию а) осуществляют в течение 2 ч.

В другом варианте стадию Ь) осуществляют в течение 3 ч.

В следующем варианте стадию с) осуществляют в течение 13 ч.

В следующем варианте стадию с) осуществляют при давлении 110 мкбар.

В следующем варианте стадию б) осуществляют в течение 13 ч.

В следующем варианте стадию б) осуществляют при давлении 110 мкбар.

В следующем варианте на стадии е) давление понижают до 10 мкбар.

- 5 008438

В следующем варианте стадию е) осуществляют в течение 5 ч.

В другом варианте способа стадию а) осуществляют в течение 2 ч;

стадию Ь) осуществляют в течение 3 ч;

стадию с) осуществляют в течение 13 ч и при давлении 110 мкбар;

стадию ά) осуществляют в течение 13 ч и при давлении 110 мкбар; и стадию е) осуществляют в течение 5 ч и давление снижают до 10 мкбар.

Настоящее изобретение также относится к лиофилизованной фармацевтической композиции, полученной указанным выше способом.

b) поддержания температуры при -45°С в течение предварительно определяемого периода времени;

c) повышения температуры раствора до -20°С;

ά) повышения температуры раствора до 25°С; и

е) поддержания температуры при 25°С в течение предварительно определяемого периода времени, с получением, таким образом, лиофилизированной фармацевтической композиции.

В одном варианте стадию а) осуществляют в течение 6 ч.

В другом варианте стадию с) осуществляют в течение 19 ч.

В другом варианте стадию с) осуществляют при давлении 150 мкбар.

В другом варианте стадию ά) осуществляют в течение 13 ч.

В другом варианте стадию ά) осуществляют при давлении 150 мкбар.

В другом варианте стадию е) осуществляют в течение 8 ч.

В другом варианте стадию е) осуществляют при давлении 150 мкбар.

В другом варианте способа стадию а) осуществляют в течение 6 ч;

стадию Ь) осуществляют в течение 3 ч;

стадию с) осуществляют в течение 19 ч и при давлении 150 мкбар;

стадию ά) осуществляют в течение 13 ч и при давлении 150 мкбар; и стадию е) осуществляют в течение 8 ч и при давлении 150 мкбар.

Настоящее изобретение также относится к лиофилизованной фармацевтической композиции, полученной любым из указанных выше способов.

В одном варианте указанной выше лиофилизованной фармацевтической композиции содержание воды в композиции составляет менее 5%.

В другом варианте содержание воды в композиции составляет менее 4,0%.

В другом варианте содержание воды в композиции составляет менее 3,5%.

Настоящее изобретение также относится к лиофилизованной фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемую соль пептида, имеющего структурную формулу ΝΗ₂-61ν Туг Туг Тгр 8ет Тгр 11е Агд 61η Рго Рго 61у Ьуз 61у 61и 61и Тгр 11е 61у-С00Н (8Ε6 ΙΌ ΝΟ: 1); и замещенный β-циклодекстрин.

Настоящее изобретение также относится к упакованной фармацевтической композиции, состоящей из упаковочного материала и предварительно определяемого количества указанной выше лиофилизованной фармацевтической композиции.

Препараты согласно настоящему изобретению могут быть введены парентерально, местно или ректально. Конечно, они могут быть введены в форме, подходящей для каждого пути введения. Например, их можно вводить посредством инъекции, ингаляции, мази, суппозитория и т.д., введение может быть путем инъекции, инфузии или ингаляции; местное посредством примочки или мази; и ректальное посредством суппозиториев.

Фразы «парентеральное введение» и «введенный парентерально» в используемом в данном описании смысле означают способы введения, отличные от энтерального и местного введения, обычно посредством инъекции, и включают в себя, без ограничения, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, внутрикапсулярную, внутриглазную, внутрисердечную, интрадермальную, внутрибрюшинную, через трахею, подкожную, под кутикулу, внутрисуставную, подкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную и внутригрудинную инъекцию и инфузию.

Фразы «системное введение» и «введенный системно», «периферическое введение» и «введенный периферически» в используемом в данном описании смысле означают введение соединения, лекарственного средства или другого вещества, отличное от прямого введения в центральную нервную систему, так что оно поступает в систему пациента и, таким образом, подвергается метаболизму и другим подобным процессам, например подкожное введение.

Подробности способов общего приготовления композиций и информацию о дополнительных эксципиентах можно найти в КетшдЮи: Тйе 8с1еисе αηά РтасНсе о£ Рйатшасу, 20ΐΗ Εάίίίοη.

- 6 008438

Данное изобретение будет более понятным на основании подробного описания экспериментов, которое следует далее. Однако специалист в данной области без труда поймет, что обсуждаемые конкретные способы и результаты являются только иллюстративными для изобретения, которое более полно описано в формуле изобретения, которая следует далее.

Подробное описание экспериментов

Пример 1. Разработка композиции для соединения 1.

Пептид 11СЭР1 человека (соединение 1) описан в международной публикации РСТ № ΑΘ02/067848, опубликованной 6 сентября 2002 г., и может быть получен способами, хорошо известными в данной области (см., например, РерПбек: 8уи1йек1к, 81гисШге апб Аррйсайоик, еб. Ву В. Сийе, Аса6еш1с Ргекк, 1995; Рерйбе 8уп111ек1к Рто1осок, еб. Ву М. РеппшЦоп аиб В. Эиии, Нитапа Ргекк, 1994; 8сйиокег, М. е1 а1., 1и кйи пеШгаП/абоп ίη Вос-сНетйНу койб рбаке куп1бек1к. Вар1б, Нщб у1е1б аккетЫ1у о£ бЖсиЙ кедиеисек. 1п1. I. Рер1. Рго1е1и Век. (1992) 40: 180-193).

Соединение 1 является синтетическим полипептидом, состоящим из 19 аминокислот. Его получают в виде ацетатной соли. Определена растворимость пептида в воде, составляющая менее 0,5 мг/мл. На фиг. 1 показано соединение 1 в виде ацетатной соли.

Чтобы разработать композицию с концентрацией пептида, превышающей 2 мг/мл, предпочтительно до 10 мг/мл, проводили эксперименты с несколькими усилителями растворимости. Предварительные эксперименты показали, что концентрации 2 мг/мл не легко достигнуть. Чтобы разработать композицию для подкожной инъекции также желательно, чтобы значение рН было в пределах от 4 до 9, и чтобы раствор был изоосмотическим.

На основании всестороннего обзора литературы было принято несколько основных подходов, чтобы получить композицию с максимальной растворимостью. Рассматривались следующие факторы:

корректировка рН и буферы, растворители, сорастворители, солюбилизирующие агенты. Способы.

Соединение 1 растворяли в выбранном растворе усилителя растворимости либо отдельно, либо в комбинации с другими эксципиентами, и растворы перемешивали по меньшей мере в течение 1 ч. При необходимости корректировали рН. Растворы исследовали визуально, чтобы оценить растворимость, и отправляли для аналитического определения. В случае нескольких выбранных композиций также тестировали биологическую активность.

Результаты.

В табл. 1 представлен тип усилителей растворимости, используемых для разработки композиции. В табл. 2 и 3 суммированы эксперименты, которые осуществляли с разными усилителями растворимости. В табл. 2 суммирован исходный скрининг, осуществляемый с концентрациями пептида в диапазоне от 5 до 10 мг/мл. Эксперимент, который проводили с более высокой концентрацией пептида, затем повторяли с более низкими дозами (см. табл. 3).

Исходные тесты показали, что соединение 1 лучше растворимо в пределах требуемых уровней рН, как кислых, так и основных, но менее стабильно в диапазоне основных значений рН. Соответственно, тестировали несколько буферов и агентов для корректировки рН, включая ацетатный буфер, цитратный буфер и карбонат натрия. Ни один из исходно тестированных буферов не давал требуемого уровня растворимости пептида. Только выше рН 9,2 и ниже рН 3,0 наблюдались уровни растворимости 2 мг/мл. Однако на начальной стадии были выбраны композиции с ацетатным буфером и цитратным буфером (с маннитом в качестве агента тоничности), для начальных токсикологических исследований. Указанные композиции тестировали в отношении биологической активности, и было доказано, что они активны.

Тестировали неводные растворители (см. табл. 1), такие как этанол, глицерин, пропиленгликоль, кремофор и их комбинации, но они не увеличивали растворимость соединения 1. Раствор 30% ЭМА (диметилацетамида) давал растворимость в требуемых пределах (5-9 мг/мл), но не подходил для фармацевтической композиции из-за своего профиля токсичности. Улучшенную растворимость также наблюдали при использовании 30% (мас./мас.) ПЭГ 400 (5-9 мг/мл). Указанную последнюю композицию выбрали для токсикологических исследований, но показано, что она является неактивной в биологическом анализе и может быть причиной некоторых неблагоприятных эффектов при исследовании токсичности на мышах. Таким образом, было решено больше не заниматься данной композицией. Учитывая предварительные эксперименты, неводные растворители не использовали в данных композициях.

Тестировали несколько аминокислот (см. табл. 1), включая Ь-аргинин, Ь-глутаминовую кислоту, Ьглицин и Ь-лизин, чтобы повысить растворимость белка. Растворимость пептида в Ь-аргинине была на требуемом уровне, но конечное значение рН было выше 9. Попытка снизить рН или использовать НС1соль аргинина приводила к выпадению пептида в осадок. Также тестировали сывороточный альбумин человека, и он повышал растворимость пептида при низких концентрациях пептида (1 мг/мл) (см. табл.

3). Однако вследствие своей потенциальной иммуногенности и низкой растворимости пептида его не использовали в дальнейших экспериментах.

- 7 008438

Наполнители (см. табл. 1), включая маннит, сорбит и декстран, тестировали отдельно и в комбинации с другими эксципиентами, но они не повышали растворимость пептида в растворе.

Сорастворители (см. табл. 1), включая полисорбат 20 и полисорбат 80, тестировали отдельно и в комбинации с другими эксципиентами. Хотя более низкие концентрации полисорбатов (вплоть до 6%) не увеличивали растворимость пептида, более высокие концентрации (до 10% - см. табл. 2) повышали растворимость пептида до 2 мг/мл. Однако считали, что такие высокие концентрации полисорбатов являются неподходящими для фармацевтических композиций.

Также тестировали два типа циклодекстринов, оба из которых одобрены для применения в продаваемых парентеральных продуктах: гидроксипропил-β-циклодекстрин и сульфобутиловый эфир-βциклодекстрин (каптизол). Оба заметно увеличивали растворимость пептида (концентрации на уровне 10 мг/мл для гидроксипропил-β-циклодекстрина и 2,5 для каптизола). Тестировали биологическую активность двух композиций циклодекстрина и обнаружили, что они равны по активности пептиду, взятому отдельно.

Сар118о1® (каптизол) является коммерчески доступным полианионным производным циклодекстрина, в котором соль сульфоната натрия отделена от гидрофобной полости спейсерной группой простого бутилового эфира или простого сульфобутилового эфира (8ВЕ). Каптизол является торговой маркой препарата гептазамещенного сульфобутиловым эфиром β-циклодекстрина (8ВЕ7-в-СО) Су1)е\ 1пс. (\\л\л\\сар118о1.сот). Структура каптизола позволяет молекулам лекарственного средства войти в гидрофобную полость, таким образом изолируя молекулу лекарственного средства от водного растворителя. Так как наружная поверхность каптизола является гидрофильной, то растворимость готовой молекулы лекарственного средства при этом повышается. Применение циклодекстринов для повышения растворимости молекул лекарственных средств описано в патентах США 5134127 и 5376645, полное содержание которых включено, таким образом, в виде ссылки.

Согласно литературным данным, каптизол Су Вех 1пс. является безопасным при парентеральном введении и не проявляет нефротоксичности, связанной с бета-циклодекстрином. По сравнению с бетациклодекстрином каптизол проявляет сравнимые или более высокие свойства комплексообразования и более высокую растворимость в воде выше 90 г/100 мл - 50-кратной повышение.

Заключение.

Обнаружено, что несколько усилителей растворимости подходят для требуемого диапазона растворимости: ΏΜΆ, ПЭГ-400, диметилацетамид, полиэтиленгликоль, полиоксилированное касторовое масло, К-метил-2-пирролидинон, 1-этенил-2-пирролидинон, полисорбат 20, полисорбат 80, гидроксипропил-βциклодекстрин и сульфобутиловый эфир-β-циклодекстрин (каптизол). Подтверждено, что из указанных усилителей растворимости оба циклодекстрина являются лучшими в отношении растворимости, биологической активности и стабильности. Соответственно, было решено выбрать каптизол в качестве усилителя растворимости для применения в композициях согласно примеру 5 и исследовать обе композиции на основе циклодекстрина далее. Конечная композиция для клинических исследований согласно примеру 5 состоит из 120 мг/мл каптизола в воде с требуемым количеством пептида (0,5, 1,0 или 2,5 мг/мл) и НС1 и ΝαΟΗ для корректировки рН.

Таблица 1

Усилители растворимости, используемые для разработки композиции соединения 1

Классификация усилителей растворимости	Усилители растворимости
Растворители	Кремофор ЕЬ, СМС, этанол, ΌΜΑ, глицерин, пропиленгликоль, ПЭГ 400, монотиоглицерин
Со-растворители	Полисорбат 20, полисорбат 80
Солюбилизаторы	Аргинин, Н5А, глицин, креатинин, глутаминовая кислот, лизин (ацетатная соль и свободное основание), каптизол, гидроксипропил-р-циклодекстрин
Наполнители	Маннит, сорбит, декстроза, лактоза, декстран
Агенты для корректировки рН	Цитратный буфер, ацетатный буфер, карбонат натрия

- 8 008438

Таблица 2

Список сорастворителей и стабилизаторов, оцениваемых в композициях пептидного соединения 1

Усилитель растворимости	Используемый %	Стандартное количество на основании литературы, %	Количество добавляемого пептида (мг/мл)	Анализ (%)	рН композиции	Примечания
Альбумин (НЗА),	1,5	0,4-5,0	5		6,0	Нерастворимо
Декстроза	1,5				Доведено до 4,1
Альбумин (НЗА),	1,0	0,4-5,0	5	-	5,8	Нерастворимо
Полисорбат 80,	0,6	0,8-4,0			Доведено до 4,1
Глицин	2,0	0,2-2,1
Аргинин	1,5	0,8-1,6	15	93	9, 8	Прозрачный раствор
Аргинин·НС1	2,0	0,8-1,6	5	-	3, 5	Нерастворимо
Аргинин	1,5	0,8-1,6	15	93	9,8	При снижении рН
Лактоза	1,5					ниже 8,5 пептид выпадал в осадок и раствор превращался в гель
Сарб1зо1®	10,0	до 30,0	10	86	4,9	Мутный раствор
	20,0			89	Доведено до 4,4
СМС (карбоксиметилцеллюлоза) в ацетатном	0,2 0,05М		5	90	5,0	Для токсикологических исследований
буфере)
Креатинин	0,8	до 0,6	5		6,1 доведено до 4,1	Нерастворимо
Кремофор ЕЬ	15,0	-10,0	5	-	4,0	Очень мутный
Этанол	10,0	0,6-32,9
Диметилацетамид	6,0	0,012-6,0
Декстран	от 4,0 до 15,0	3,0-30,0	5	—	3, 9	Нерастворимо
Диметилацетамид (ЭМА)	6,0-20,0	0,012-6,0	5		4, 6	Нерастворимо
Диметилацетамид (ΌΜΑ)	25,0	0,012-6,0	5	87	5,1	Прозрачный раствор
Диметилацетамид (ΌΜΑ)	30,0	0,012-6,0	10	93	5,1	Прозрачный раствор
Этанол	10,0	6,0-32,9	5	-	-	Нерастворимо
Глутаминовая кислота	2,0		5		3,7	При повышении рН выше 4 пептид выпадал в осадок и раствор превращался в гель
Глицерин	1,5	1,6-32,5	5	37	4,5	Нерастворимо
Глицерин	30, 0	1,6-32,5	5	-	3,7	Нерастворимо
Глицерин,	10,0	1,6-32,5	5	12	6,5	Нерастворимо
Полисорбат 80	0, 6-	0,8-4			Доведено до 4,5
Глицин	0,4	0,2-21	5	-	4,6	Нерастворимо
Гидроксипропилβ-циклодекстрин	20,0	до 30,0	10	99	4,6	Прозрачный раствор
Лизин, ацетатная соль	2,0		5		3,8	Нерастворимо

- 9 008438

Лизин, свободное основание	2,0		5		9,2	При снижении рН ниже 8 пептид выпадал в осадок и раствор превращался в гель
Маннит в цитратном буфере	2,0 0,035М	2,0-10,0	5	38	3,4	Для токсикологических исследований
Маннит в ацетатном буфере	4,0 0,05М	2,0-10,0	5	32	4,3	Для токсикологических исследований
Маннит,	20,0	2,0-10,0	5	14	6,4	Нерастворимо
Глицин	0,4	0,2-2,1			Доведено до 4,5
Маннит,	20,0	2,0-10,0	5	22	6,5	Нерастворимо
Полисорбат 20	0,6	-			Доведено до 4,5
Монотиоглицерин	1,0	0,1-10,0	5	-	4,5	Мутный раствор
ПЭГ 400	30,0	до 30,0	5	88	4,2	Слегка опалесцирующий
ПЭГ 400	30,0	до 30,0	10	89	4,2	Мутный раствор
ПЭГ 400 с ϋΜΑ	30,0 6, 0	до 30,0 0,012-0,6	5	94	4,2	Прозрачный раствор
ПЭГ 400	10,0	6,0-18,0	5	58	4,2	Нерастворимо
ПЭГ 400	10,0	до 30,0	5	-	4,3	Нерастворимо
ϋΜΑ	10,0	0,012-0,6
ПЭГ 400	10,0	до 30,0	5	-	4,1	Нерастворимо
Пропиленгликоль РС	10,0	10,0
ПЭГ 400	18,0	до 30,0	5	100	4,2	Прозрачный раствор
Пропиленгликоль	50,0	10,0
Полисорбат 80	1,6	0,8-4,0	5	24	7,2 доведено до 4,5	Нерастворимо
Полисорбат 80	6, 0	0,8-4,0	5	-	3, 9	Нерастворимо
Полисорбат 80	6,0	0,8-4,0	5	-	4,0	Нерастворимо
Креатинин	0, 6	до 0,6
Пропиленгликоль РС	10,0	10, 0	5	—	4,2	Нерастворимо
ϋΜΑ	10,0	0,012-0,6
Пропиленгликоль РС	10,0, 30,0	10,0	5		4,2	Нерастворимо
Карбонат натрия	1, 5		5		11,4	При снижении рН ниже 8,5 пептид выпадал в осадок и раствор превращался в гель
Сорбит	5, 0	10,0-25,0	5		6, 9 доведено до 4,5	Мутный раствор

Таблица 3 Композиции соединения 1 при низких концентрациях пептида

Усилитель растворимости	Используемый %	Стандартное количество на основании литературы, %	Количество добавляемого пептида (мг/мл)	Анализ (%)	рН композиции	Примечания
Альбумин (НЗА)	5,0	0,4-5,0	1,0 2,5	90	6, 9 доведено до 4,5	Прозрачный раствор Мутный раствор
Аргинин	1,5	0,8-1,6	1,0	24	10,6 доведено до 8,5	При снижении рН ниже 8,5 пептид выпадал в осадок и раствор превращался в гель
СарГ1зо1®	12,0	до 30,0	1,0 2,5	106 100	5,3 от 6,5 до 8,5	Прозрачный раствор
Декстран	20, 0	3,0-30,0	1,0	69	4,8 доведено до 4,0	Мутный раствор
Глицерин	30,0	1,6-32,5	1,0		4,8 доведено до 4,0	Мутный раствор
Маннит	4,0	0,8-4,0	1,о	64	4,7 доведено до 4,0	Мутный раствор
Полисорбат 20	10,0	-	1,0 2,5	95 88	5,8 доведено до	Прозрачный раствор

- 10 008438

					4,8	Прозрачный с небольшим количеством осадка
Полисорбат 20	10,0	-	2,5	115	5,1	Прозрачный раствор
Маннит	2,0	2,0-10,0			Доведено до 4,3
Полисорбат 80	4,0 6,0-10,0	0,8-4,0	1,0 2,5	91 89	5,5 доведено до 5,0	Прозрачный раствор Слегка мутный раствор
Полисорбат 80	4,0	0,8-4,0	2,5	88	5,1	Слегка мутный раствор
Маннит	2,0	2,0-10,0			Доведено до 4,4
Пропиленгликоль РС	10,0	10,0	1,0	78	5,0 доведено до 4,4	Мутный раствор
Сорбит	20,0	10,0-25	1,0	52	4,5	Мутный раствор

Пример 2. Протокол приготовления раствора соединения 1 в каптизоле.

Стандартные способы растворения, такие как смешивание сухого соединения 1 и сухого каптизола в воде или добавление соединения 1 к приготовленному раствору каптизола и воды, не приводили к полному растворению в требуемых концентрациях. Тестировали несколько разных концентраций как соединения 1, так и каптизола при разных уровнях рН. Однако следующий способ приготовления раствора соединения 1 в каптизоле приводил к полному растворению в требуемых концентрациях.

Вещества: каптизол, соединение 1 и вода.

Способ.

1. Взвешивают соответствующее количество каптизола, чтобы получить конечную концентрацию 120 мг/мл.

2. Добавляют 80% конечного количества воды и перемешивают в течение 10 мин с использованием магнитной мешалки.

3. Взвешивают соединение 1, чтобы получить конечную концентрацию 2,5, 2,0, 1,0, 0,5 или 0,1 мг/мл.

4. Добавляют пептид к раствору каптизола. Перемешивают в течение 1 ч.

5. Повышают рН, чтобы получить прозрачный раствор (в композиции 2,0 мг/мл может быть необходимо повысить рН немного выше 9). рН необходимо корректировать, используя 1,0н. НС1 и 1,0н. ЫаОН. Перемешивают в течение 10 мин.

6. При необходимости корректируют рН до диапазона от 7,5 до 8,5 (используя либо НС1, либо ЫаОН, 1,0н.).

7. Добавляют воду до конечного объема.

8. Фильтруют раствор через фильтр из ацетата целлюлозы с порами 0,2 мкм.

9. Регистрируют конечное значение рН.

10. Делят на аликвоты и хранят при подходящей температуре.

Пример 3. Лиофилизация раствора соединения 1 и каптизола.

Данный способ лиофилизации отличается от других способов лиофилизации тем, что процентное содержание сухого остатка в композиции выше (12%), тогда как лиофилизованные продукты обычно содержат от 5 до 10% сухого остатка.

Оборудование.

В качестве лиофильной сушилки использовали лиофилизатор Еб^агбз Туойех 0.6. Осуществляли I^/О^ оборудования и проверяли в отношении соответствия посредством проверки качества до разработки способа.

Готовили растворы соединения 1 и каптизола с концентрациями соединения 1 0,5, 1,0 и 2,5 мг/мл. Загружаемый объем доводили до 1 мл (1,05 г).

Основные стадии способа.

1. Замораживание.

2. Выдерживание (при низкой температуре).

3. Сушка в вакууме в две стадии:

3.1. Первичная сушка - нагревание стеллажа для сушки до верхней поддерживаемой температуры, контролирование температуры стеллажа на верхнем поддерживаемом уровне.

3.2. Вторичная сушка - снижение давления до минимального значения при верхней поддерживаемой температуре стеллажа.

Партии 1-3.

Замораживание - замораживание проводили от комнатной температуры до -40°С в течение 2 ч. Стеллажи поддерживали при -40°С в течение 3 ч.

Сушка - сушку осуществляли при давлении 110 мкбар. Температуру стеллажа увеличивали до 20°С в течение 13 ч и поддерживали при данной температуре еще в течение 13 ч.

- 11 008438

Общее время процесса составляло 31 ч.

Результаты.

Результаты по содержанию воды:

Партия № 1: 3,8%

Партия № 2: 4,0% и

Партия № 3: 4,9%

Партии 4 и 5.

Так как результаты по содержанию воды при использовании способов, приводящих к получению партий 1, 2 и 3, были выше, чем требуемое значение, было решено добавить стадию сушки при той же самой температуре и при низком давлении.

Сушка - сушку осуществляли при давлении 110 мкбар.

Температуру стеллажа увеличивали до 20°С в течение 13 ч и поддерживали при данной температуре еще в течение 13 ч (партия 4) или 8 ч (партия 5). Давление понижали до 10 мкбар дополнительно в течение 5 ч.

Общее время процесса составляло 36 ч.

Результаты.

Результаты по содержанию воды:

Партия 4: Плацебо: 3,0%, мг/мл: 3,9%.

Партия 5: Плацебо: 4,1%.

Заключение.

Как показано, разработан удовлетворительный способ лиофилизации соединения 1 с каптизолом. Вследствие высокого процентного содержания сухого остатка и поэтому конденсированной лиофилизуемой массы разработанный способ является более длительным, чем имеющиеся современные циклы лиофилизации пептидов, и имеет дополнительную стадию вторичной сушки.

В табл. 4 суммирован разработанный способ.

Таблица 4

Стадия	Соединение 1 (пептид) с каптизолом
Загрузка	5°С
Замораживание	2 часа до -40°С
Выдерживание при низкой температуре	3 часа до -40°С
Первичная сушка: Нагревание до 20°С Выдерживание при 20°С	13 часов давление 110 мкбар 13 часов давление 110 мкбар
Вторичная сушка: Выдерживание при 20°С	5 часов давление 10 мкбар
Хранение при	-20°С
Время процесса	36 часов

Пример 4. Исследование биологической активности ίη νίνο лиофилизованного раствора соединения (ИР, 1 мг/флакон, 12% каптизол).

Биологическую активность проверяли по ингибированию секреции 1Ь-2 из специфичных по отношению к стандартному образцу (К8) соединения 1 Т-клеток после подкожной (п/к) обработки лиофилизованным раствором соединения, т.е. лекарственным продуктом (ЭР) при двух концентрациях. Результаты обработки сравнивают с результатами обработки мышей соединением 1 (К8) в фосфатно-солевом буфере (РВ8). Результаты показаны в таблице ниже и на фиг. 2.

План эксперимента.

1. Иммунизация 0 день (Соединение 1 К8, эмульгированное с СТА, во все четыре подушечки лапы)

2. Обработка (п/к в заднюю часть шеи, 0 день в 200 мкл раствора)

3. Активация ίη νΐΐΓο: 10 день

a) соединением 1 К8 в концентрациях 0; 0,5; 1; 2,5; 5; 10; 25; 50 и 100 мкг/мл,

b) пептидом с обратным порядком аминокислот относительно соединения 1 (негативный контроль),

c) Соп А (позитивный контроль).

4. Инкубация культуры в течение 20 ч при 37°С в инкубаторе во влажной атмосфере с 5% СО₂.

5. Измерение 1Ь-2 с помощью ЕЫ8А.

- 12 008438

Таблица экспериментальных групп

Группа	Иммунизация	Обработка
А	50 мкг соединения 1 КЗ	50 мкг соединения 1 КЗ в РВЗ
В	200 мкг соединения 1 КЗ в РВЗ
С	50 мкг ΩΡ (партия 2)
ϋ	200 мкг ΏΡ (партия 2)
Г	Плацебо (12% каптизол)

Секреция 1Б-2 у мышей, обработанных соединением 1 (ΌΡ) после активации ΐπ νΐΐίο соединением 1 КЗ (пг/мл)

Обработаны
	Группа	Г	А	В	С	ϋ
Активатор	Концентрация активатора (мкг/мл)	12% СарПзо1® в ампулах	Соединением 1 КЗ 50 мкг/мышь	% ингибирования	Соединением 1 КЗ 200 мкг/мышь	% ингибирования	6Р 50 мкг/мышь	% ингибирования	ϋΡ 200 мкг/мышь	% ингибирования
Соп А	2,5	5825	6215		5403		3537		4069
Соединение 1 КЗ	0	воь	воь		воь		воь		воь
Соединение 1 КЗ	0,5	11	9		10		8		В(2Ь
Соединение 1 КЗ	1	10	воь		воь		воь		воь
Соединение 1 КЗ	2,5	15	8	51	воь	ΝΑ	6	61	6	62
Соединение 1 КЗ	5	20	9	55	8	60	10	48	7	63
Соединение 1 КЗ	10	25	16	38	11	58	13	48	8	67
Соединение 1 КЗ	25	29	15	48	11	63	16	45	13	56
Соединение 1 КЗ	50	40	21	47	15	62	20	50	12	69
Соединение 1 КЗ	100	42	25	41	18	58	24	43	15	64
Среднее ингибирование (%) (в диапазоне 5- 100 мкг/мл)	45,6		60,4		46,8		63,7
ВОЪ - ниже предела количественного определения; Строки 1-4 не включали в кривую; ΝΑ - не применимо

Пример 5. Оценка оптимальной дозы для обработки.

В дальнейшем описании использовали следующие сокращения:

СТ'А - полный адъювант Фрейнда

Соп А - конканавалин А

ΌΡ - лекарственный продукт

Ό8 - лекарственное вещество

ЕМ-1 - обогащенная среда ЭССМ-1

ЕМ-3 - обогащенная среда ΚΡΜΙ-1640 + фетальная сыворотка теленка

ЕС8 - фетальная сыворотка теленка

ΙΕΝ-γ - интерферон гамма

ΕΝ - лимфатический узел

ΡΒ8 - фосфатно-солевой буфер

КЗ - стандартный образец п/к - подкожное

ТВ - трипановый синий

ΤΟΕ-β - трансформирующий фактор роста бета ^ΕΙ - вода для инъекции

Предисловие.

Группу из 20 мышей иммунизировали 50 мкг/мышь соединения 1 КЗ. Иммунизированных мышей распределяли на пять групп обработки, которые указаны далее: плацебо, 25, 50, 100 и 200 мкг/мышь соединения 1 ΌΡ (подкожное введение). Через десять дней после иммунизации и обработки извлекали ΕΝ и готовили суспензию отдельных клеток. Затем измеряли секрецию ш νίίτο ΙΕΝ-γ и ΤΟΕ-β культивируемыми клетками в ответ на активацию несколькими концентрациями соединения 1 КЗ.

План эксперимента.

1. Иммунизация 0 день.

2. Обработка соединением 1 ΌΡ 0 день.

3. Активация ΐπ νίίτο клеток ΕΝ от обработанных мышей 10 день.

4. Сбор культуральной среды (для определения ΙΕΝ-γ) 12 день.

5. Сбор культуральной среды (для определения ΙΟΕ-β) 13 день.

- 13 008438

Экспериментальные группы

6. ЕЫ8А в отношении ΙΕΝ-γ.

7. ЕЫ8А в отношении ТОЕ-β.

Таблица 7

Экспериментальная группа	Обработка	Активация ϊη-νϊΈιτο
Режим	Мышей/группу	Клеток/лунку	Концентрация соединения 1 КЗ
А1	Контроль 12% СарС15о1®	4	2,5х10^б	Соединение 1 КЗ 0-100 мкг/мл
5х10⁶
А2	25 мкг/мышь	4	2,5х10⁶
5х10⁶
АЗ	50 мкг/мышь	4	2,5х10⁶
5х10^б
А4	100 мкг/мышь	4	2,5х10^б
5х10⁶
А5	200 мкг/мышь	4	2,5х10⁶
5х10^б

Материалы и реагенты.

Животные.

Мыши: 20 самок мышей ВАЬВ/с, поставляемые центром разведения животных Наг1ап, Ке11о\'о1.

Возраст во время иммунизации (неделя+дни): 10.

Средняя масса мышей, включенных в эксперимент: 19,01 г.

Вещества.

Общие реагенты.

70% этанол получали из 96% этанола разбавлением очищенной Н₂О.

Приготовление растворов соединения 1 для иммунизации

Эмульсию СЕА-соединение 1 К8 (500 мкг/мл, 50 мкг/мышь) готовили следующим образом:

1) 1,874 мг соединения 1 растворяли в 1,87 мл ^ΕΙ, получая раствор 1 мг/мл;

2) раствор проверяли с помощью рН-индикаторных полосок и обнаружили, что он имеет рН 5;

3) 1,5 мл раствора эмульгировали с 1,5 мл СЕА, получая конечную концентрацию 500 мкг/мл.

Приготовление растворов для обработки.

Обработку проводили п/к-инъекцией 200 мкл раствора.

Приготовление раствора 12% каптизола.

1,2 г каптизола растворяли в 10 мл ^ΕΙ, получая раствор 12% каптизола.

Последовательность операций при проведении эксперимента.

Взвешивание мышей.

Мышей взвешивали перед иммунизацией. Средняя масса мышей: 19,01±0,97 г.

Иммунизация.

Иммунизацию проводили инъекцией 100 мкл эмульсии (50 мкл в каждую подушечку задней лапы). Обработка.

После стадии иммунизации мышей обрабатывали п/к-инъекцией 200 мкл из указанных растворов соединения 1 ЭР или 12% каптизол в заднюю часть шеи.

Культивирование ΐη У11го.

Мышей забивали смещением шейных позвонков. ΕΝ извлекали из задних конечностей и переносили в стерильную чашку Петри, содержащую примерно 5 мл КРМЕ Клетки выделяли осторожным продавливанием ткани через стальную сетку с ячейками 200 мкм. Клетки собирали и центрифугировали при 300 д в течение 10 мин при комнатной температуре.

Суспензии отдельных клеток готовили из объединенных ΕΝ из каждой экспериментальной группы.

Суспензии 2,5 и 5,0 млн клеток/мл/лунку культивировали с соединением 1 К8 (0-100 мкг/мл) в ЕМ-1.

Секрецию ΙΕΝ-γ и ТОЕ-β в качестве показателя клеточного ответа определяли посредством ΕΙ.ΙΒΛ культуральной среды (48 ч для ΙΕΝ-γ и 72 ч для ТОЕ-β).

- 14 008438

Таблица 8

Экспериментальные группы ίπ νίΐΐΌ

Экспериментальная группа	Обработка	Активация ίη-νίΕτο
Режим	Клеток/лунку	Концентрация активирующего вещества
А1-2.5	Контроль 12%	2,5х10⁶
А1-5	Сар61зо1®	5х10⁶	Соединение 1 К.3
А2-2.5	ϋΡ	2,5х10⁶	0; 3,125; 6,25;
А2-5	25 мкг/мышь	5х10⁶	12,5; 50 и 100
АЗ-2.5	ЭР	2,5х10⁶	мкг/мл
АЗ-5	50 мкг/мышь	5х10^б	Соп А 2,5 мкг/мл
А4-2.5	ЭР	2,5х10^б
А4-5	100 мкг/мышь	5х10⁶
А5-2.5	ϋΡ	2,5х10^б
А5-5	200 мкг/мышь	5х10⁶

Приготовление суспензий клеток.

Таблица 9 Результаты подсчета клеток и приготовление клеточных суспензий (10х10⁶/мл)

Группа	Объем (мп)	Коэффициент разбавления	Живые клетки	Мертвые клетки	% живых клеток	% мертвых клеток	Среднее количество живых клеток	Общее количество живых клеток (х10⁶)	ЕМ-1, необходимое для добавления (мл) для суспензии 10x10* клеток/мл
А1	10	16	115	—	100	—	112	179,2	17,9
109	—	100	—
А2	10	16	50	4	92,6	7,4	47,5	76	7,6
45	2	95,7	4,3
АЗ	10	16	80	4	95,2	4,8	80,5	128,8	12,8
81	5	94,2	5,8
А4	10	16	87	—	100	—	89	142	14,2
91	—	100	—
А5	10	16	120	2	98,4	1,6	112,5	180	18
105	2	98,1	1,9

Приготовление суспензии клеток (5х10⁶/мл).

Суспензию 10х10⁶ клеток/мл разбавляли 1:2 добавлением 5 мл ЕМ-1 к 5 мл клеточной суспензии.

Инкубация культур клеток ЬИ в 48-луночных планшетах.

Готовили 3 планшета для культуры ткани. В каждый планшет добавляли следующее.

Контроль фона (клетки, инкубированные с культуральной средой).

0,5 мл суспензии клеток

0,5 мл культуральной среды (ЕМ-1)

Позитивный контроль системы (клетки, стимулированные Соп А).

0,5 мл суспензии клеток

0,5 мл Соп А 5 мкг/мл в ЕМ-1 (конечная концентрация 2,5 мкг/лунку)

Клетки, инкубированные с активирующими растворами соединения 1 (образцы).

0,5 мл суспензии клеток

0,5 мл соединения 1 К8 6,25-200 мкг/мл (конечная концентрация 3,125-100 мкг/мл/лунку) Инкубация культур клеток ЬИ в 96-луночных планшетах.

После приготовления 48-луночных планшетов готовили 96-луночные планшеты, используя 100 мкл из суспензии клеток и 100 мкл из активирующих растворов.

Планшеты для культивирования инкубировали при 37°С в инкубаторе с увлажнением и 5% СО₂ в течение 48 или 72 ч.

- 15 008438

Сбор надосадков.

Культивируемые планшеты центрифугировали при 300 д в течение 10 мин при комнатной температуре. Надосадки (850 мкл из каждой лунки) переносили либо в зеркальный планшет, либо в пробирку. Затем надосадок делили на аликвоты для работы (две аликвоты по 200 и одна аликвота объемом 450 мкл), чтобы избежать повторного замораживания/оттаивания образцов. Каждую пробирку помечали соответствующей подробной информацией:

1) код эксперимента и время после инкубации,

2) номер группы и образца,

3) активатор и концентрация,

4) дата сбора надосадка.

Надосадки хранили при -20°С вплоть до использования в ЕБ18А.

Результаты.

Таблица 10

Сводная информация о группах

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ГРУППЫ:
Иммунизация	Обработка	Активация ±пνίΡχο
Эксп. группы	Доза иммунизации	Подгруппа	Режим
		А1	12% Сар-Ызо1® контрль, плацебо	Соединение 1 КЗ 3,125-100 мкг/мл
		А2	Соединение 1 25 мкг/М
А	50 мкг/мышь	АЗ	Соединение 1 50 мкг/М
		А4	Соединение 1 100 мкг/М
		А5	Соединение 1 200 мкг/М

Конечные концентрации цитокина

Таблица 11-А

Конечная концентрация цитокина (пг/мл) (2,5 миллиона клеток/лунку)
Концентрация соединения 1	Плацебо	50 мкг/М	100 мкг/М	200 мкг/М
3,125 мкг/мл	321,3	54,1	64,5	103, 9
6,25 мкг/мл	238,6	81, 8	116, 1	126,1
12,5 мкг/мл	397,1	123,1	180,9	129,0
25 мкг/мл	655,5	215,1	262,8	240,3
50 мкг/мл	573, 9	292,5	518,3	378,1
100 мкг/мл	926,0	531,8	582,7	524,1
Соп А	322,6	356,2	337,4	воь

Таблица 11-В

Конечные концентрации цитокина

Конечная концентрация цитокина (пг/мл) (5 миллионов клеток/лунку)

Концентрация соединения 1	Плацебо	25 мкг/М	50 мкг/М	100 мкг/М	200 мкг/М
3,125 мкг/мл	522,3	воъ	76,2	90,8	204,4
6,25 мкг/мл	634,8	воь	109,2	157,8	244,1
12,5 мкг/мл	962,8	41, 9	179, 5	257,1	466,1
25 мкг/мл	967,4	70,0	277,9	421,7	660,5
50 мкг/мл	1338,8	104,2	373,4	739,7	922,5
100 мкг/мл	2010,2	185,2	547,0	995,5	1006,2
Соп А	6839,8	2995,3	4837,0	10126,8	7722,8

- 16 008438

Результаты также представлены на фиг. 3-4.

Результаты наблюдения.

Секреция ΙΡΝ-γ.

1. В группе плацебо показана линейная дозовая зависимость при активации соединением 1 ΐη νίΐΐΌ. Данный график сходен с графиком, полученным для модели ех νι\Ό при такой же дозе иммунизации (50 мкг/мышь) и культуральной среде (ЕМ-1).

2. Дозовая зависимость при активации соединением 1 ΐη νΐΐΐΌ имела место во всех тестированных группах.

3. Значимое ингибирование секреции ΙΡΝ-γ наблюдали при всех дозах, используемых для обработки (среднее 95% ингибирование при дозе обработки 25 мкг/мышь). Может быть выявлена обратная корреляция между дозой, которая служит для обработки, и процент ингибирования, в основном при использовании 5х10⁶ клеток/лунку. При использовании 2,5х10⁶ клеток/лунку обработка животных 50 мкг/мышь давала большее ингибирование, чем 100 или 200 мкг. Точка 25 мкг пропущена (недостаток клеток).

4. Большее ингибирование наблюдали при использовании 5х10⁶ клеток/лунку вместо 2,5 х10⁶ клеток/лунку.

5. На линейном диапазоне кривой 8Ώ ингибирования в % было низким.

6. Техническая проблема, связанная с Соп А, выражена при использовании 2,5х10⁶ клеток/лунку. Секреция ТОР-β.

1. В группе плацебо не наблюдали дозовой зависимости при активации ΐη νΐΐΐΌ соединением 1. Секретируемый уровень ТОР-β был ниже предела определения в ЕЙ18А во всех других группах обработки.

Пример 6. Оптимизации цикла сублимационной сушки в случае соединения 1 и каптизола для инъекции (0, 0,5, 1,0 и 2,5 мг/флакон).

Цель.

Целью данного исследования была оптимизация цикла сублимационной сушки соединения 1 с каптизолом для инъекции, чтобы улучшить форму лиофилизуемой массы и избежать смятия и растрескивания. Соответственно, было решено улучшить и оптимизировать цикл лиофилизации. Данный цикл перенесен в промышленные лиофилизаторы для производства партий для испытаний фазы Ι.

Оптимизация способа.

Готовили партии пептида с концентрациями 0,5, 1,0, 2,5 мг/мл и плацебо и осуществляли несколько циклов сублимационной сушки. В качестве сублимационной сушилки использовали лиофилизатор Еб^агбз ЬуоПех 0.6.

Тестировали растворимость, содержание воды и внешний вид лиофилизованного материала.

Согласно полученным результатам выбран новый цикл лиофилизации соединения 1. Вследствие высокого процентного содержания сухого остатка (12%) и поэтому конденсированной лиофилизуемой массы новый способ является более длительным, чем цикл лиофилизации в примере 3, и имеет дополнительную стадию первичной сушки. В табл. 12 суммированы различия между способами.

Таблица 12

Стадия	Цикл лиофилизации для соединения 1 и каптизола из примера 3	Новый ЦИКЛ лиофилизации для соединения 1 и каптизола
Загрузка	5°С	5°С
Замораживание	2 часа до -40°С	6 часов до -45°С
Выдерживание при низкой температуре	3 часа до -40°С	3 часа до -45°С
Первичная сушка:	до 20°С	до -20°С
Стадия I	13 час давление 110 мкбар	19 час давление 150 мкбар
Стадия II		до 25°С 13 час давление 150 мкбар
Выдерживание при 20°С (25°С)	13 час давление 110 мкбар	8 час давление 150 мкбар
Вторичная сушка: Выдерживание при 20°С	5 часов давление 10 мкбар	-
Хранение при	5°С	5°С
Время процесса	36 часов	49 часов

- 17 008438

Пример 7. Действие соединения 1 (введенного в каптизоле) на симптомы волчанки у склонных к СКВ самок мышей (ΝΖΒχΝΖ^)Ρ1.

Пациентов, принимающих участие в клинических испытаниях, будут лечить соединением 1, используя в качестве эксципиента каптизол (натриевая соль сульфобутиловый эфир-бета-циклодекстрина). По этим причинам важно определить, будет ли обработка мышей (ΝΖΒχΝΖ^)Ρ1 композицией соединения 1, вводимого в каптизоле, оказывать такое же лечебное действие на симптомы волчанки, которое наблюдается при обработке мышей такой же линии соединением 1 в РВ8.

С этой целью самок мышей (ΝΖΒχΝΖ^)Ρ1 (примерно 8-месячного возраста) делили на 3 группы, которые обрабатывали подкожно один раз в неделю в течение 10 недель либо отдельно каптизолом (п=8), либо 25 или 50 мкг/мышь соединения 1 в каптизоле (п=9 и 10 соответственно). Указанные дозы были выбраны потому, что предшествующие исследования показали, что дозы в данном диапазоне более эффективны в ослаблении симптомов СКВ, чем более высокие тестированные дозы (100 и 200 мкг/мышь). Одну и туже партию лекарственного вещества использовали в данном исследовании и в первом клиническом испытании фазы Ι соединения 1.

У мышей проводили наблюдения в отношении анти-днДНК-антител и протеинурии. После забивания мышей определяли интенсивность 1СО в почках.

Как можно видеть на фиг. 5, не наблюдалось значимых различий между группами по уровням днДНК-специфичных антител после 10 инъекционных обработок.

В табл. 13 также показано, что целебное действие обработки соединением 1 может наблюдаться, начиная с 5-й инъекции, и поддерживается до 10-й инъекции. Средние уровни протеинурии в контрольной группе, обработанной каптизолом, были, соответственно, выше, чем в группах, обработанных соединением 1. В табл. 13 также показано, что наблюдалось уменьшение интенсивности 1СО в почках в обеих группах, обработанных разными дозами соединения 1. Имела место общая тенденция, свидетельствующая, что более низкая доза (25 мкг/мышь) была более эффективна, чем более высокая доза (50 мкг/мышь) в снижении клинических симптомов СКВ у данных мышей.

Таблица 13 Клинические симптомы СКВ у мышей (ΝΖΒχΝΖ^)Ρ1, обработанных 25 или 50 мкг/мышь соединения 1 (в каптизоле)

Группа исследования	Среднее значение протеинурии ± ЗЕМ (г/л) Количество недель после начала обработки	1О)^а(среднее ± ЗЕМ)
5	7	8	10
СарБ1зо1®	1,81+1,22 (п=8)	5,74+3,13 (п=8)	4,5±2,92 (п=7)^ь	4,46+2,93 (п=7)^ь	2,29±0,28 (п=7)
Соединение 1 (50 мкг/мышь)	0,75±0,3 (п=10)	0,81+0,3 (п=10)	1,09±0,4 (п=10)	1,29±0,3 (п=10)	1,90±0,23 (п=10)
Соединение 1 (25 мкг/мышь)	0,16±0,05 (п=9)	1,26+1,09 (п=9)	0,5±0,31 (п=9)	0,56+0,3 (п=9)	1,22^с±0,32 (п=9)

^а1СИ = отложения иммунных комплексов. Шкала интенсивности 1СИ: 0 = нет; 1 = умеренное; 2 = тяжелое; 3 = тяжелое/очень интенсивное.

^ЬГибель одного животного с высоким уровнем протеинурии привела к более низкому среднему значению в группе.

^ср<0,05 (по сравнению с контрольными мышами, обработанными каптизолом; Манн-Уитни).

На фиг. 6 показаны типичные срезы одной почки из каждой группы обработки. Срезы верхнего ряда получены от мыши, обработанной каптизолом, срезы среднего ряда - от мыши, обработанной 50 мкг/мышь соединения 1, и срезы нижнего ряда получены от мыши, обработанной 25 мкг/мышь соединения 1. Можно видеть, что интенсивность отложений иммунных комплексов, наблюдаемая в срезах почек мышей, обработанных соединением 1 (растворенным в каптизоле) при обоих уровнях доз, была намного ниже, чем интенсивность, наблюдаемая в контрольной группе.

Пример 8. Клиническое исследование фазы Ι.

Проводимое в нескольких центрах, рандомизированное, двойное слепое, с плацебо-контролем, с использованием однократной дозы, с четырьмя вариантами исследование фазы Ι, чтобы оценить переносимость и безопасность подкожной инъекции соединения 1 в каптизоле у субъектов с СКВ.

Это было первое клиническое исследование с использованием соединения 1 в каптизоле на людях во Франции. Основной целью исследования была оценка переносимости и безопасности соединения 1 в каптизоле, вводимого в виде однократной п/к-инъекции субъектам с СКВ. Второй целью исследования была оценка иммунологических ответов после однократной п/к-дозы соединения 1 в каптизоле у указанных субъектов.

В исследовании принимали участие 36 субъектов. Для включения пациентов с СКВ в исследование должно выполняться по меньшей мере 4 критерия, используемых для диагностики волчанки согласно Американской коллегией ревматологии. Пациенты также должны иметь стабильное, легкое/умеренное

- 18 008438 заболевание и оценку в баллах, меньшую или равную 10, согласно индексу активности заболевания СКВ 8ΕΕΌΑΙ.

Каждый пациент получал однократную п/к-инъекцию перерастворенного соединения 1 для инъекции или соответствующего плацебо (каптизол) в соответствии со следующим распределением по группам:

группа А: Плацебо (каптизол), группа В: 0,5 мг соединения 1 в каптизоле, группа С: 1 мг соединения 1 в каптизоле, группа Ό: 2,5 мг соединения 1 в каптизоле.

Проводили стандартную группу тестов на безопасность, включая сбор крови и мочи для лабораторных тестов, во время отбора, в день введения дозы, через 24 ч после введения дозы и на 2, 4 и 8 неделе после введения дозы. Перед введением дозы и при последующих намеченных посещениях брали образцы крови для иммунологических тестов, имеющих отношение к СКВ, тестов на антитела против соединения 1 и анализа пролиферации РВЬ. Выполняли следующие иммунологические тесты:

Кумбса (прямой и непрямой),

С3, С4 и СН50, общий 1д6, 1дМ и 1дА,

ΑΝΑ, анти-днДНК (анализ Фарра), анти-онДНК, анти-ΕΝΑ (включая анти-Ьа, анти-Ко, анти-РНП, анти-8т), антитела против кардиолипина,

УОКЬ, антитела РТА, ревматоидный фактор.

Безопасность и переносимость соединения 1 в каптизоле в популяции субъектов оценивали на основе следующих критериев:

наличие нежелательных явлений (АЕ), включая вспышку СКВ, основные жизненные показатели,

ЭКГ в 12 отведениях, изменения при физическом обследовании, стандартные клинические лабораторные тесты, оценка критерия 8ΕΕΌΑΙ, результаты иммунологических тестов.

Подробное описание фазы 1а клинического исследования.

Основные исполнители исследования и соответствующие места исследования.

Шесть (6) исследовательских центров во Франции: проф. 1еап Сйаг1ез Р1е11е (Норйа1 Ьа РШе 8а1рейтеге, Рапз), проф. Ойуег Меуег (Норйа1 В1сНа1. Рапз), проф. 1еап Кеуиг (Норйа1 Непп МоЮог, Сге1ей), проф. Бою ОшИеуш (Норйа1 Αν^η^, ВоЫдпу), проф. Бис Насйи11а (Норйа1 С1аЮе Ниле/, Ы11е Сеάеx), проф. Хау1ег МалеИе (Норйа1 В1се1ге, Кгет1ш Вюе1ге).

Соединение 1 (в каптизоле), плацебо, вода для инъекций - ампулы, доза и способ введения.

Соединение 1 в каптизоле (120 мг/флакон) из флаконов инъецировали подкожно в виде однократной дозы субъекту в следующих дозах: 0,5 мг соединения 1/флакон в каптизоле, 1 мг соединения 1/флакон в каптизоле и 2,5 мг соединения 1/флакон в каптизоле.

Плацебо для соединения 1: 120 мг каптизола/флакон (идентичный по внешнему виду с флаконами соединения 1 в каптизоле).

Методика.

В нескольких центрах проводили рандомизированное, двойное слепое, с плацебо-контролем, с четырьмя вариантами исследование, используя однократную подкожную инъекцию соединения 1 или плацебо. Отбор пациентов с СКВ осуществляли вплоть до 21 дня перед исходными процедурами. Каждого выбранного для исследования субъекта наугад распределяли в одну из 4 групп лечения: подкожная инъекция 0,5, 1 или 2,5 мг соединения 1 или соответствующего плацебо. Всех субъектов принимали в клинике в день, предшествующий введению дозы. Каждый субъект получал однократную дозу одного из перечисленных выше средств лечения. Субъектов отпускали из клиники через 24 ч после введения дозы. В дальнейшем проводили наблюдение за субъектами на 2, 4 и 8 неделе после введения дозы. Брали образцы крови (сыворотки и цельной крови) для лабораторных тестов на безопасность при отборе, в день введения дозы (перед дозой), во 2 день (после дозы), на 2, 4 и 8 неделе (последнее посещение). Образцы крови для иммунологических тестов брали при отборе, в день введения дозы (перед дозой) и на 4 и 8 неделе. Пролиферацию лимфоцитов периферической крови (РВЬ) оценивали в день введения дозы (перед дозой) и на 2, 4 и 8 неделе.

Количество субъектов (общее и для каждого режима лечения).

Тридцать шесть субъектов случайным образом распределяли в данном исследовании следующим образом: 9 субъектов в группу лечения 0,5 мг, 9 субъектов в группу лечения 1 мг, 10 субъектов в группу лечения 2,5 мг и 8 субъектов в группу лечения плацебо.

- 19 008438

Диагностика и основные критерии для включения в исследование.

Выбираемые для данного исследования субъекты были пациентами с СКВ, которые удовлетворяли по меньшей мере 4 диагностическим критериям Американской коллегии ревматологии (АСК). Их состояние болезни должно быть стабильным, от слабого до умеренного, с оценкой в баллах, равной или меньшей 10 согласно индексу активности заболевания СКВ, обновленному в 2000 г. (8ЬЕЭА1 2К).

Из участия исключали пациентов с СКВ, которые сообщали об астме нестабильного или тяжелого течения, инсульте, остром инфаркте миокарда, нестабильной ангине, кровоизлиянии в головной мозг и эмболии легких в течение 6 месяцев перед отбором для исследования. Пациенты с СКВ, которые имели какие-либо клинически значимые или нестабильные медицинские или хирургические показания, сахарный диабет, заболевание печени (цирроз, активный гепатит, портальная гипертензия и/или асциты), клинически значимую гипертонию, в истории болезни какую-либо злокачественную опухоль, диализ или хроническое обструктивное заболевание легких (СОРЭ). также исключались из участия в исследовании.

Также из участия в исследовании исключали пациентов с СКВ, которые подвергались плазмаферезу или которых лечили в течение 3 месяцев перед отбором одним из лекарственных средств, перечисленных ниже: преднизон 30 мг/сутки или больше (или эквивалентная доза другого кортикостероида), внутривенные кортикостероиды, внутривенный иммуноглобулин С (1дС), пероральные антикоагулянты и любые цитотоксические средства (например, азатиоприн, хлорамбуцил, циклофосфамид, микофенолят мофетила, метотрексат, такролимус).

Кроме того, из исследования исключали пациентов с СКВ, приступивших к лечению кортикостероидами (более ±10 мг/сутки преднизона или эквивалентная доза другого кортикостероида) и/или противомалярийными средствами в течение последних 3 месяцев перед отбором.

Хотя предпринимали попытку сохранить исходно начатое лечение СКВ на протяжении всего курса исследования, однако, исследователи могли изменить лечение участника в любое время в ходе исследования, чтобы поддержать и оптимизировать здоровье пациента.

Критерии для оценки.

Безопасность.

Оценивали следующие параметры безопасности при отборе, во время госпитализации и при повторных посещениях, включая последнее посещение: основные жизненные показатели (систолическое давление крови, диастолическое давление крови, пульс, насыщение кислородом, температура и масса), ЭКГ в 12 отведениях, изменение при физическом обследовании и стандартные клинические лабораторные тесты на безопасность. Нежелательные явления регистрировали в день введения дозы и при каждом посещении в дальнейшем.

Иммунология.

Имеющие отношение к СКВ иммунологические тесты проводили при отборе, во время госпитализации и при последующих посещениях, включая последнее посещение.

За связанными с лекарственным средством иммунологическими ответами следили, используя анализ пролиферации РВЬ и анализ антител против соединения 1, в день введения дозы и при последующих посещениях, включая последний визит.

Активность заболевания.

Оценку активности заболевания с использованием подсчета индекса активности заболевания СКВ, обновленного в 2000 г. (8ЬЕЭА1 2К), проводили при отборе, во время госпитализации и при последующих посещениях, включая последний визит.

Статистические способы.

Использовали компьютерную программу 8А8®, версия 9,0, чтобы проанализировать и представить данные, собранные во время данного исследования. Не проводили расчетов эффективности и не проводили формальной проверки гипотезы в данном исследовании фазы 1а.

Нежелательные явления.

Возникновение и частоту нежелательных явлений представляли по классам, соответствующим органам и системам, и с помощью предпочтительной терминологии согласно словарю МебЭКА, версия 5.0. Данные сгруппированы по группам обработки.

Клинические лабораторные данные.

Описательные статистические данные, касающиеся лабораторных показателей, включая количество определений, среднее значение, стандартное отклонение, минимальное и максимальное значение, определяли при отборе, в 1 день (перед дозой), 2 день, на 2, 4 и 8 неделе, и они представлены по группам лечения. Изменения от исходного уровня в каждой временной точке/при посещении также представлены для каждого посещения в соответствии с назначением лечения. Процент аномальных результатов (низких или высоких в соответствующих случаях) представлен на основе параметра, в соответствии с группой лечения и посещением/временной точкой. Проводили анализ сдвига от исходного уровня к 24 ч после введения дозы и от исходного уровня к последнему посещению.

Основные жизненные показатели.

Описательные статистические данные, касающиеся основных жизненных показателей, включая количество определений, среднее значение, стандартное отклонение, среднее, минимальное и максималь

- 20 008438 ное значения, определяли при отборе, в 1 день (перед и после введения дозы и в каждой временной точке), 2 день, на 2, 4 и 8 неделе, и они сгруппированы в соответствии с назначенным лечением. Изменения от исходного уровня в каждой временной точке/при посещении также представлены для посещения в соответствии с назначением лечения.

Масса.

Описательные статистические данные, касающиеся массы (кг) исходного уровня, в конце исследования и изменение от исходного уровня представлены по группам лечения.

ЭКГ.

Представлены описательные статистические данные, касающиеся параметров ЭКГ исходного уровня, в конце исследования и изменения от исходного уровня. Представлен анализ сдвига в виде таблиц сдвига от исходного уровня к окончанию исследования между нормальными/аномальными или имеющимися/отсутствующими параметрами ЭКГ. Потенциально клинически значимые (РС8) измерения РТс (по Базетту) идентифицировали согласно предварительно переопределенным критериям. Представлены таблицы анализа сдвига между РС8 и не-РС8 абсолютными значениями РТс (по Базетту) и таблица частоты РС8-изменения в рТс (по Базетту) от исходного уровня к любому посещению.

Физическое обследование.

Результаты физического обследования анализировали по частоте встречаемости субъектов с аномальными или нормальными данными для каждой системы организма на исходном уровне и при последнем визите. Также применяли анализ сдвига от нормальных к аномальным значениям, и наоборот. В том случае, когда не происходило изменения относительно исходного уровня, использовали определение «другое».

Иммунологические тесты, связанные с соединением 1.

В случае иммунологических параметров рассчитывали описательные статистические данные, включая количество определения, среднее значение, стандартное отклонение, среднее, минимальное и максимальное значения, и они представлены по группам лечения и посещениям. Изменение от исходного уровня к каждому последующему визиту также представлено по группам лечения. В соответствующих случаях количество и процент субъектов с негативными/позитивными результатами представлены по группам лечения и посещениям.

8ΕΕΌΑΙ 2К.

Представлены описательные статистические данные, включая среднее значение, стандартное отклонение, среднее, минимальное и максимальное значения 8ΕΕΌΑΙ 2К.

Результаты фазы 1а клинического исследования.

Распределение субъектов и характеристики СКВ.

Тридцать шесть (36) исследуемых субъектов начинали и закончили данное исследование по протоколу. Большинство субъектов (34) во всех группах лечения были женского пола (94,4%) и европеоидной расы (30, 83,3%). Средний возраст во всех группах лечения составлял 35,6 лет (диапазон средних значений от 32 до 39 лет). Большинство субъектов (91,7%) имели диагностические критерии согласно Американской коллегии ревматологии (АСЯ) от 4 до 6 и среднюю для группы оценку 8ΕΕΌΑΙ 2К в пределах от 2,1 до 4,1.

Результаты по безопасности.

Не было заметного различия между исследуемыми группами лечения лекарственным средством и группой, принимавшей плацебо, по частоте встречаемости АЕ. Наиболее распространенными АЕ во всех группах были головная боль, классифицируемая как слабая или умеренная по природе, и реакция в месте инъекции, классифицируемая как слабая по природе. Не наблюдали зависимого от дозы ответа. В ходе исследования не встречались серьезные нежелательные явления (8АЕ) или АЕ, классифицируемые как тяжелые.

Не наблюдали клинически значимого эффекта, который можно приписать исследуемому лекарственному средству в отношении показателей гематологии, биохимии или анализа мочи.

Не наблюдали клинически значимого эффекта, который можно приписать исследуемому лекарственному средству в отношении параметров основных жизненных показателей (систолического кровяного давления, диастолического кровяного давления, пульса, насыщения кислородом).

Не наблюдали клинически значимого эффекта, который можно приписать исследуемому лекарственному средству в отношении температуры и массы.

Не наблюдали клинически значимых различий между группами, которых лечили соединением 1 и плацебо, в отношении измерений ЭКГ по категориям и параметров ЭКГ в цифровой форме. Не было зарегистрировано абсолютного значения РС8-рТс и изменения рТс относительно исходного уровня >60 мс. Сходное количество субъектов в группах, которых лечили соединением 1 и плацебо, имели изменение рТсВ относительно исходного уровня от 30 до 60 мс.

Не отмечено клинически значимого действия соединения 1 при физическом обследовании. Иммунологические результаты.

Оценка образцов сыворотки всех субъектов показала, что однократное подкожное введение соединения 1 при уровне доз 0,5, 1 и 2,5 мг/пациенту не индуцировала образование антител, специфичных в

- 21 008438 отношении соединения 1. У семи субъектов имел место ответ на соединение 1 выше предела отсечения. Указанные повышенные уровни антител уже имелись перед введением дозы. Не наблюдали повышения уровней антител в последующий период (два месяца) исследования. Сыворотки указанных субъектов анализировали в отношении изотипа реагирующих антител. Ответ у двух субъектов был связан с изотипом 1дМ, и с изотипом 1дС - у двух других. Ни у одного из семи не было специфичных антител 1дЕ.

Анализ лимфоцитов периферической крови (РВЬ) показал, что 50% субъектов (18) были классифицированы как отвечающие (8Ι>2) со сходным распределением во всех группах лечения. Т-клеточный ответ был относительно низким, и невозможно было выявить связи между лечебной дозой соединения 1 или концентрацией, используемой в анализе, и статусом респондера/не респондера, принимая во внимание, что вводили только однократную п/к-дозу исследуемого лекарственного средства. Также не наблюдалось признаков повышенной частоты встречаемости статуса респондера с течением времени. Анализ столбнячного токсоида (ТТХ), который служит в качестве контроля безопасности, показывает, что ответ на ТТХ сохранялся в течение периода исследования во всех группах лечения, свидетельствуя о том, что соединение 1 в каптизоле не изменяет иммунологический ответ на повторно введенный антиген ТТХ.

Полученные иммунологические данные являются результатом введения только однократной дозы исследуемого лекарственного соединения 1.

Результаты определения активности заболевания.

Не отмечено клинически значимого влияния соединения 1 на индекс 8ΕΕΌΑΙ (изменение >3, <12 пунктов) во время исследования, за исключением одного субъекта в группе лечения дозой 0,5 мг, у которого регистрировали изменение индекса 8ΕΕΌΆΙ от 2 до 10 пунктов между исходным уровнем и 4 неделей на основе анализа мочи, показывающего пиурию. Исследователем не подтверждены указанные данные анализа мочи как вспышка волчанки по определению в протоколе, и было решено не изменять лечение.

Заключение.

Данное исследование фазы 1а показало, что однократная подкожная инъецированная доза соединения 1, равная 0,5, 1 или 2,5 мг, в 120 мг каптизола была безопасной и хорошо переносимой, и дало возможность для продолжения исследования с многократными дозами в фазе 1Ь.

Пример 9. Клиническое исследование фазы 1Ь.

Проводимое в нескольких центрах, двухнациональное, рандомизированное, двойное слепое, с четырьмя вариантами, с плацебо-контролем, с использованием многократных доз исследование фазы Ι, чтобы оценить переносимость и безопасность подкожной инъекции соединения 1 в каптизоле у субъектов с СКВ.

Данное исследование осуществляется для того, чтобы оценить безопасность и переносимость многократного п/к-введения соединения 1 субъектам с СКВ. Второй целью исследования является оценка иммунологических ответов после многократного п/к-введения соединения 1 в каптизоле у субъектов с СКВ.

Соединение 1 вводят в дозах 0,5, 1,0 или 2,5 мг в каптизоле. Проходящий клиническое испытание продукт вводят через день (исключая выходные дни), всего 12 п/к-инъекций, т.е. 3 дозы в неделю в течение 4 недель. Наблюдение за субъектами проводят при запланированных визитах по графику на 2, 4, 8 и 12 неделе после начала введения доз. Безопасность и переносимость оценивают, используя тесты, сходные с тестами, описанными выше для фазы 1а клинического исследования.

Результаты.

Исследование фазы 1Ь показывает, что многократные подкожно инъецированные дозы соединения 1, равные 0,5, 1 или 2,5 мг в 120 мг каптизола являются безопасными и хорошо переносимыми.

Claims

1. Фармацевтическая композиция, содержащая водный носитель, от 0,1 до 20 мг/мл композиции фармацевтически приемлемой соли пептида, имеющего структурную формулу ΝΗ_;-61ν Туг Туг Тгр 8ет Тгр 11е Агд С1п Рго Рго С1у Ьу8 С1у С1и С1и Тгр 11е С1у-СООН (8Еф ΙΌ ΝΟ: 1), и замещенный βциклодекстрин в количестве, эффективном для растворения пептида в водном носителе, при этом композиция имеет рН от 4 до 9.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, где концентрация соли пептида составляет по меньшей мере 0,5 мг/мл.

3. Фармацевтическая композиция по п.2, где концентрация соли пептида составляет от 0,5 до 10 мг/мл.

4. Фармацевтическая композиция по п.3, где концентрация соли пептида составляет от 0,5 до 2,5 мг/мл.

5. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-4, где композиция имеет рН от 6,5 до 8,5.

6. Фармацевтическая композиция по п.5, где композиция имеет рН от 7,5 до 8,5.

7. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-6, где фармацевтически приемлемой солью является ацетатная соль.

8. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-7, где замещенным β-циклодекстрином является β-циклодекстрин, замещенный гидроксипропилом, сульфобутиловым эфиром или сульфопропило

- 22 008438 вым эфиром.

9. Фармацевтическая композиция по п.8, где замещенным β-циклодекстрином является βциклодекстрин, замещенный сульфобутиловым эфиром.

10. Фармацевтическая композиция по п.7, где замещенным β-циклодекстрином является гепта(сульфобутиловый эфир)-в-циклодекстрин.

11. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-10, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый буфер в таком количестве и такого типа, которые подходят для получения рН фармацевтической композиции в диапазоне 4-9.

12. Фармацевтическая композиция, содержащая водный носитель, от 0,1 до 20 мг/мл композиции ацетатной соли пептида, имеющего структурную формулу ΝΗ₂-Ο1ν Туг Туг Тгр §ег Тгр 11е Агд 61п Рго Рго 61у Ьу8 61у 61ц 61ц Тгр 11е 61у-С00Н (8ЕЦ ГО N0: 1), и от 70 до 170 мг/мл композиции гепта(сульфобутиловый эфир)-в-циклодекстрина, в которой пептид и гепта(сульфобутиловый эфир)-вциклодекстрин растворены в водном носителе, и где композиция имеет рН от 6,5 до 8,5.

13. Фармацевтическая композиция по п.12, где концентрация ацетатной соли пептида составляет по меньшей мере 0,5 мг/мл.

14. Фармацевтическая композиция по п.13, где концентрация ацетатной соли пептида составляет от 0,5 до 10 мг/мл.

15. Фармацевтическая композиция по п.13, где концентрация ацетатной соли пептида составляет от 0,5 до 2,5 мг/мл.

16. Фармацевтическая композиция по п.13, где концентрация гепта(сульфобутиловый эфир)-вциклодекстрина составляет 120 мг/мл и где рН композиции составляет от 7,5 до 8,5.

17. Фармацевтическая композиция по п.16, где концентрация ацетатной соли пептида составляет 1,0 мг/мл.

18. Фармацевтическая композиция по п.16, где концентрация ацетатной соли пептида составляет 2,5 мг/мл.

19. Способ ослабления симптомов системной красной волчанки (СКВ) у человека, включающий в себя введение человеку фармацевтической композиции по любому из пп.1-18 в количестве, эффективном для ослабления симптомов СКВ у человека.

20. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.1-18 для лечения СКВ у человека.

21. Способ производства фармацевтической композиции по любому из пп.1-18, включающий в себя стадии:

a) приготовления раствора замещенного β-циклодекстрина в водном носителе с предварительно определяемой концентрацией;

b) добавления предварительно определяемого количества фармацевтически приемлемой соли пептида ΝΗ₂-Ο1ν Туг Туг Тгр §ег Тгр 11е Агд 61п Рго Рго 61у Ьук 61у 61и 61и Тгр 11е 61у-С00Н (8ЕЦ ГО N0: 1) к раствору со стадии а);

c) корректировки рН раствора со стадии Ь) вплоть до растворения пептида в растворе и

6) при необходимости доведения рН раствора со стадии с) до рН 4-9 с получением таким образом фармацевтической композиции.

22. Способ по п.21, где предварительно определяемой концентрацией замещенного βциклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного β-циклодекстрина в фармацевтической композиции от 70 до 170 мг/мл.

23. Способ по п.22, где предварительно определяемой концентрацией замещенного βциклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного β-циклодекстрина в фармацевтической композиции 120 мг/мл.

24. Способ по п.21, где предварительно определяемым количеством пептида является такое количество, которое приводит к конечной концентрации пептида в фармацевтической композиции по меньшей мере 0,1 мг/мл.

25. Способ по п.21, где предварительно определяемым количеством пептида является такое количество, которое приводит к конечной концентрации пептида в фармацевтической композиции по меньшей мере 0,5 мг/мл.

26. Способ по п.21, где предварительно определяемым количеством пептида является такое количество, которое приводит к конечной концентрации пептида в фармацевтической композиции, составляющей по меньшей мере 2,5, 2,0, 1,0, 0,5 или 0,1 мг/мл.

27. Способ по п.21, в котором стадия Ь) дополнительно включает в себя перемешивание раствора в течение 1 ч.

28. Способ по п.21, в котором на стадии с) рН корректируют, используя 0,1н. НС1 или Να0Η.

29. Способ по п.21, дополнительно включающий в себя фильтрование раствора со стадии 6) через фильтр из ацетата целлюлозы.

30. Способ по п. 21, в котором предварительно определяемой концентрацией замещенного β-циклодекстрина является такая кон- 23 008438 центрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного β-циклодекстрина в фармацевтической композиции, составляющей 120 мг/мл;

стадия Ы) дополнительно включает в себя перемешивание раствора в течение 1 ч и на стадии с) рН корректируют, используя 1,0н. НС1 или ЫаОН, дополнительно включающий в себя фильтрование раствора со стадии б) через фильтр из ацетата целлюлозы.

31. Фармацевтическая композиция, полученная способом по любому из пп.21-30.

32. Способ лиофилизации фармацевтической композиции по п.2, включающий в себя стадии:

а) снижения температуры фармацевтической композиции до -40°С;

Ы) поддержания температуры при -40°С в течение предварительно определяемого периода времени;

с) повышения температуры раствора до 20°С;

б) поддержания температуры при 20°С в течение предварительно определяемого периода времени и

е) снижения давления и поддержания температуры при 20°С в течение предварительно определяемого периода времени с получением таким образом лиофилизированной фармацевтической композиции.

33. Способ по п.32, в котором стадию а) осуществляют в течение 2 ч.

34. Способ по п.32, в котором стадию Ы) осуществляют в течение 3 ч.

35. Способ по п.32, в котором стадию с) осуществляют в течение 13 ч.

36. Способ по п.32, в котором стадию с) осуществляют при давлении 110 мкбар.

37. Способ по п.32, в котором стадию б) осуществляют в течение 13 ч.

38. Способ по п.32, в котором стадию б) осуществляют при давлении 110 мкбар.

39. Способ по п.32, в котором на стадии е) давление понижают до 10 мкбар.

40. Способ по п.32, в котором стадию е) осуществляют в течение 5 ч.

41. Способ по п.32, в котором стадию а) осуществляют в течение 2 ч; стадию Ы) осуществляют в течение 3 ч; стадию с) осуществляют в течение 13 ч и при давлении 110 мкбар; стадию б) осуществляют в течение 13 ч и при давлении 110 мкбар и стадию е) осуществляют в течение 5 ч и давление снижают до 10 мкбар.

42. Лиофилизованная фармацевтическая композиция, полученная способом по любому из пп.32-41.

43. Способ лиофилизации фармацевтической композиции по п.2, включающий в себя стадии:

а) снижения температуры фармацевтической композиции до -45°С;

Ы) поддержания температуры при -45°С в течение предварительно определяемого периода времени;

с) повышения температуры раствора до -20°С;

б) повышения температуры раствора до 25°С и

е) поддержания температуры при 25°С в течение предварительно определяемого периода времени, с получением таким образом лиофилизированной фармацевтической композиции.

44. Способ по п.43, в котором стадию а) осуществляют в течение 6 ч.

45. Способ по п.43, в котором стадию Ы) осуществляют в течение 3 ч.

46. Способ по п.43, в котором стадию с) осуществляют в течение 19 ч.

47. Способ по п.43, в котором стадию с) осуществляют при давлении 150 мкбар.

48. Способ по п.43, в котором стадию б) осуществляют в течение 13 ч.

49. Способ по п.43, в котором стадию б) осуществляют при давлении 150 мкбар.

50. Способ по п.43, в котором стадию е) осуществляют в течение 8 ч.

51. Способ по п.43, в котором стадию е) осуществляют при давлении 150 мкбар.

52. Способ по п.43, в котором стадию а) осуществляют в течение 6 ч; стадию Ы) осуществляют в течение 3 ч; стадию с) осуществляют в течение 19 ч и при давлении 150 мкбар; стадию б) осуществляют в течение 13 ч и при давлении 150 мкбар и стадию е) осуществляют в течение 8 ч и при давлении 150 мкбар.

53. Лиофилизованная фармацевтическая композиция, полученная способом по любому из пп.43-52.

54. Лиофилизованная фармацевтическая составляет менее 5%.

55. Лиофилизованная фармацевтическая составляет менее 4,0%.

56. Лиофилизованная фармацевтическая составляет менее 3,5%.