KR100771411B1 - 피리미딘-2,4,6-트리온의 시클로덱스트린 포접 복합체 - Google Patents

피리미딘-2,4,6-트리온의 시클로덱스트린 포접 복합체 Download PDF

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Abstract

놀랍게도, 본원의 화학식 (I) 에 의해 나타내지는 트리옥소피리미딘 유도체 및 수용성 시클로덱스트린 (이하 CD 로 약칭됨) 으로 형성되는 트리옥소피리미딘-시클로덱스트린 복합체가 향상된 수용해도, 뛰어난 안정성, 및 낮은 국소 자극을 나타내고, 치료제로서 유용하다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 트리옥소피리미딘 유도체 또는 그의 염과 시클로덱스트린, 바람직하게는 α-, β- 또는 γ-시클로덱스트린 또는 수용성 시클로덱스트린 유도체 (수용성은 25 ℃ 물에서 0.5 gr/100 ml 이상의 용해도로서 정의됨) 로 형성되고, 상기 트리옥소피리미딘 유도체가 본원의 화학식 (I) 에 의해 나타내지는, 트리옥소피리미딘-시클로덱스트린 복합체를 제공한다. 또한, 시클로덱스트린과 항원보강제 (예를 들어 L-라이신 또는 L-아르기닌) 의 트리옥소피리미딘 복합체가 개선된 수용해도 및 생체이용율, 뛰어난 안정성, 및 낮은 국소 자극을 나타내고, 치료제로서 유용하다는 것이 밝혀졌다.

Description

피리미딘-2,4,6-트리온의 시클로덱스트린 포접 복합체 {CYCLODEXTRIN INCLUSIONS COMPLEXES OF PYRIMIDINE-2,4,6-TRIONES}
본 발명은 피리미딘-2,4,6-트리온 (트리옥소피리미딘) 의 약학 조성물, 그의 제조 방법 및 용도를 포함한다.
매트릭스 메탈로프로테아제 (MMP) 는 세포외부 매트릭스 (ECM) 및 기저막을 분해할 수 있는 아연- 및 칼슘-의존적 프로테아제의 한 계열이다 (Egeblad, M., and Werb, Z., Nat. Rev. Cancer 2 (2002) 161-174; Overall, C.M., and Lopez-Otin, C., Nat. Rev. Cancer 2 (2002) 657-672). 이들은 배아 발달 및 성장 (Holmbeck, K., et al., Cell 99 (1999) 81-92; Vu, T.H., et al., Cell 93 (1998) 411-422) 뿐 아니라 조직 재건 및 재생 (Shapiro, S.D., Curr. Opin. Cell Biol. 10 (1998) 602-608; Lund, L.R., et al., EMBO J. 18 (1999) 4645-4656) 에서 중추적인 역할을 갖는다고 믿어진다. 그러므로, MMP 의 과도한 또는 부적절한 발현은 종양 진행 (Egeblad, M., and Werb, Z., Nat. Rev. Cancer 2 (2002) 161-174; Overall, C.M., and Lopez-Otin, C., Nat. Rev. Cancer 2 (2002) 657-672) 및 동맥류 형성 (Carmeliet, P., et al., Nat. Genet. 17 (1997) 439-444) 을 포함하는, 많은 조직-재건 과정의 병인에 기여할 수 있다. MMP 효과가 ECM 분해에 한정되 는 것은 아니다 (Chang, C., and Werb, D., Trends Cell Biol. 11 (2001) S37-43). ECM 단백질에 의해 격리되는 펩티드 성장 인자가 MMP-9 에 의해 한번 분해되는 것이 가능해진다 (Manes, S., et al., J. Biol. Chem. 274 (1999) 6935-6945). MMP 는 VEGF 의 생체이용율을 증가시킬 수 있을 뿐 아니라 (Bergers, G., et al., Nat. Cell Biol. 2 (2000) 737-744), 플라스미노겐의 분해에 의해 안지오스타틴과 같은 혈관신생 억제제를 발생시킬 수 있다 (Dong, Z., et al., Cell 88 (1997) 801-810). MMP 는 골수 줄기 세포의 이동에 관여한다고 생각된다 (Janowska-Wieczorek, A., et al., Blood 93 (1999) 3379-3390). 고농도의 MMP9 는 G-CSF 유도된 HPC 이동 동안 관찰되었다 (Carstanjen, D., et al., Transfusion 42 (2002) 588-596).
트리옥소피리미딘은 잘 알려진 구조 종류로부터의 화합물이다. 이러한 화합물은, 예를 들어, 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 제 6,242,455 호 및 제 6,110,924 호; WO 97/23465; WO 98/58915; WO 01/25217, 및 [Grams, F., et al., Biol. Chem. 382 (2001) 1277-1285] 에서 기재되고, MMP-2, MMP-9 및 MMP-14 에 대해 유효하고 선택성이 높다.
시클로덱스트린은 전분으로부터 유도된 시클릭 탄수화물이다. 이들은 그 구조 내의 글루코피라노스 단위의 수에 따라 서로 상이하다. 모 시클로덱스트린은 6, 7 및 8 개의 글루코피라노스 단위를 함유하고, 각각 알파, 베타 및 감마 시클로덱스트린으로 불린다. 효소적 전분 전환에 의해 생성된 α-, β- 또는 γ-시클로덱스트린은 소수성 공동의 지름이 상이하고, 일반적으로 수많은 친유성 물질의 포접에 적합하다.
매우 강력한 MMP 억제제인 트리옥소피리미딘은 물 및 물에 기초한 용매에서 단지 약하게 가용성이다. 그러므로 본 발명의 목적은 트리옥소피리미딘이 가용성이고, 그러한 트리옥소피리미딘의 수성 조성물이 약학 조성물로서 사용될 수 있는 수성 조성물을 제공하는 것이다.
발명의 요약
놀랍게도, 하기 기재되는 화학식 (I) 에 의해 나타내지는 트리옥소피리미딘 유도체 및 수용성 시클로덱스트린 (이하 CD 로 약칭됨) 으로 형성되는 트리옥소피리미딘-시클로덱스트린 복합체가 향상된 수용해도, 뛰어난 안정성, 및 낮은 국소 자극을 나타내고, 치료제로서 유용하다는 것이 밝혀졌다.
또한, 시클로덱스트린과 항원보강제 (예를 들어 L-라이신 또는 L-아르기닌) 의 트리옥소피리미딘 복합체가 개선된 수용해도 및 생체이용율, 뛰어난 안정성, 및 낮은 국소 자극을 나타내고, 치료제로서 유용하다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 트리옥소피리미딘 유도체 또는 그의 염과 시클로덱스트린, 바람직하게는 α-, β- 또는 γ-시클로덱스트린 또는 수용성 시클로덱스트린 유도체 (수용성은 25 ℃ 물에서 0.5 gr/100 ml 이상의 용해도로서 정의됨) 로 형성되고, 상기 트리옥소피리미딘 유도체가 하기 화학식 (I) 에 의해 나타내지는, 트리옥소피리미딘-시클로덱스트린 복합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 L-라이신 또는 L-아르기닌, 바람직하게는 L-라이신과 같은 항원보강제의 존재하에서, 화학식 (I) 에 의해 나타내지는 트리옥소피리미딘 유도 체 또는 그의 염과 시클로덱스트린, 바람직하게는 α-, β- 또는 γ-시클로덱스트린 또는 수용성 시클로덱스트린 유도체 (수용성은 25 ℃ 물에서 0.5 gr/100 ml 이상의 용해도로서 정의됨) 로 형성되는 트리옥소피리미딘-시클로덱스트린 복합체를 제공한다.
본 발명에 따른 상기 복합체는 트리옥소피리미딘-시클로덱스트린의 포접 복합체이고, 액체 또는 고체 형태로 제공된다.
본 발명에 따른 복합체에서, 바람직하게는 1 몰의 트리옥소피리미딘은 약 1 몰 내지 2 몰의 시클로덱스트린, 바람직하게는 β- 또는 γ-시클로덱스트린 또는 그의 유도체에 의해 복합체가 형성되고 둘러싸진다.
또한 본 발명은 활성 성분으로서 본 발명에 따른 트리옥소피리미딘-시클로덱스트린 복합체를 약학적 유효량으로 함유하는, 기관지 염증 질환의 치료로 언급될 수 있는, 이를 필요로 하는 환자의 치료를 위한 약학제를 제공한다.
본 발명에 따른 약학제는 매우 중요한 또는 부적절한 MMP 발현으로부터 야기하는 병인에, 치료학적으로, 예방적으로 또는 보호적으로 적용가능하다. 바람직하게는 이러한 치료는 류마티스 관절염, 종양, 전이 침윤, 골다공증, 황반 변성, 당뇨 망막병증, 각막 궤양, 죽상동맥경화증, 기관지 염증 질환, 천식과 같은 기관지 염증 질환, 만성 폐쇄 폐질환 또는 폐기종의 치료학적, 예방적 또는 보호적 치료이다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 트리옥소피리미딘-시클로덱스트린 복합체를 약학적 유효량으로 함유하는 주사 제형을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 복합체의 액체 수성 제형이고, 약학적으로 허용가능한 담체는 물이고, 투여하기 위한 조성물은 수용액이다. 그래서 본 발명에 따른 활성 물질은 물 중의 용액으로 시클로덱스트린 포접에 의한 복합체 상태이다.
본 발명의 또 다른 목적은 L-라이신 (L-라이신 농도는 10 mM 내지 1000 mM, 바람직하게는 10 mM 내지 500 mM 이고, 더욱 바람직하게는 10 mM 내지 100 mM 임) 의 존재하의 본 발명에 따른 복합체의 액체 수성 제형이고, 약학적으로 허용가능한 담체는 물이고, 투여하기 위한 조성물은 수용액이다. 그래서 본 발명에 따른 활성 물질은 L-라이신의 존재하의 물 중의 용액으로 시클로덱스트린 포접에 의한 복합체 상태이다.
본 발명의 또 다른 목적은 고체 상태의 본 발명에 따른 복합체이고, 상기 복합체는 투여 전에 용해되거나 또는 그 자체로 투여되기 위한 물에 용해가능한 분말의 형태이다.
본 발명의 또 다른 목적은 비경구 투여용 정제, 캡슐, 복합미립자 시스템, 경구 용액, 경구 현탁액, 용액, 현탁액, 및 이식, 흡입용 용액 또는 분말, 국소, 경피용 친수성 또는 친유성 유형 크림 및 연고, 수성 또는 히드로-알코올계 젤, 로션, 또는 질용 용도의 자궁 내 장치, 안과용 용도의 용액, 현탁액, 이식, 직장용 용도의 좌약, 현탁액, 스프레이, 용액, 및 발포체일 수 있는, 바람직한 형태의 투여에 따른 상이한 생약 형태로 포함되는 복합체이다 .
또한 본 발명은 질환, 바람직하게는 기관지 염증 질환으로 고생하는 환자에 게 그러한 질환의 치료를 위해 그러한 약학제를 약학적 유효량으로 사용하는 것을 제공한다. 본 발명에 따른 복합체는 바람직하게는 국소, 피부경유, 피부통과, 경구 또는 비경구 수준으로 투여된다.
또한 본 발명은 트리옥소피리미딘과 시클로덱스트린을 바람직하게는 또한, 보조제 물질, 완충제, 방부제, 용매 및/또는 점도 조절제를 함유하는 물 또는 완충된 수용액 중에 약학적 유효량으로 복합체를 형성시키는 것을 특징으로 하는, 바람직하게는 그러한 질환, 바람직하게는 기관지 염증 질환의 치료를 위한 약학제의 제조 방법을 제공한다.
바람직한 시클로덱스트린은 다음과 같다:
- 알파-시클로덱스트린 및 그의 합성 유도체, 예를 들어 HPαCD, 메틸화 αCD, 히드록시부틸 αCD, 말토실 αCD, 글루코실 αCD.
- 베타-시클로덱스트린 및 그의 합성 유도체, 예를 들어 HPβCD, SBEβCD, RMβCD, DIMEβCD, TRIMEβCD, 히드록시부틸 βCD, 글루코실 βCD, 말토실 βCD.
- 감마-시클로덱스트린 및 그의 합성 유도체, 예를 들어 HPγCD, RMγCD 및 DIMEγCD, 히드록시부틸 γCD, 글루코실 γCD, 말토실 γCD.
또한 본 발명은 상기 언급한 질병의 치료학적, 예방적 또는 보호적 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 피리미딘-2,4,6-트리온 및 하나 이상의 시클로덱스트린 뿐 아니라, 가능하게는 약학적으로 허용가능한 담체를 치료학적 유효량으로 포함하는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 언급한 질병의 치료학적, 예방적 또는 보호적 치료를 위한 약제의 제조를 위한, a) 피리미딘-2,4,6-트리온, b) 하나 이상의 시클로덱스트린 c) L-라이신 또는 L-아르기닌, 바람직하게는 L-라이신뿐 아니라 d) 가능하게는 약학적으로 허용가능한 담체를 치료학적 유효량으로 포함하는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 피리미딘-2,4,6-트리온 (트리옥소피리미딘) 은 하기 화학식 (I) 의 것이다:
Figure 112006071794402-pct00001
[식 중,
R1 은 -S-, -O- 또는 -NH- 에 의해 한번 또는 여러번 임의로 삽입될 수 있는 C3-C20 알킬; 또는
W-V 기이고, 여기서
W 는 화학 결합 또는 페닐이고;
V 는 페닐, 페닐옥시, 페닐티오, 페닐술피닐, 페닐술포닐 또는 페닐아미노 (페닐 부분은 할로겐, 히드록시, C1-C6-알킬, C1-C6-알콕시, C1-C6-알킬티오, C1-C6-알킬술피닐, C1-C6-알킬아미노, 시아노, 니트로 또는 C1-C6-알킬술포닐에 의해 한번 또는 여러번 치환 또는 미치환될 수 있음) 이고;
R2 는 C1-C10 알킬 (알킬기는 히드록시 또는 아미노에 의해 한번 또는 2 번 치환 또는 미치환되고, -S-, -O- 또는 -NH- 에 의해 한번 또는 여러번 임의로 삽입될 수 있음);
벤조일기 (할로겐, 히드록시, 니트로, C1-C6-알콕시, C1-C6-알킬아미노, C1-C6-알킬티오, C1-C6-알킬술피닐, C1-C6-알킬술포닐, 아미도술포닐, C1-C6-알킬아미도술포닐, 비스-C1-C6-알킬아미도술포닐에 의해 한번 또는 여러번 치환 또는 미치환될 수 있음);
헤테로방향족 아실기; 또는
페닐- 또는 헤테로아릴기 (할로겐, 히드록시, C1-C6-알콕시, C1-C6-알킬아미노, C1-C6-디알킬아미노, 시아노, C1-C6-알킬, C2-C6-알케닐, C2-C6-알키닐, C1-C6-아실, C1-C6-알킬티오, C1-C6-알킬술포닐, C1-C6-알킬술피닐, C1-C6-알킬아미노카르보닐, 아미노카르보닐, C1-C6-알킬아미도술포닐, 아미도술포닐, 비스-C1-C6-알킬아미도술포닐, 니트로, C1-C6-알콕시카르보닐, 카르복시에 의해 한번 또는 여러번 치환 또는 미치환됨) 임].
본 발명의 목적은 신규 약학적 제제의 제조에서의 화학식 (I) 의 화합물뿐 아니라 그들의 약학적으로 허용가능한 염, 거울상이성질체 형태, 부분입체 이성질체 및 라세미체의 용도이다.
본원의 R1 에 대해 사용되는 바와 같은 "C3-C20 알킬" 이라는 용어는 3 내지 20, 바람직하게는 4 내지 12, 더욱 바람직하게는 8 내지 12 개의 탄소 원자를 함유하는 선형 또는 분지형 포화 탄화수소를 나타낸다. 예는 부틸, 헥실, 옥틸, 데실, 2-에틸헥실, 2-에틸옥틸이다. 바람직한 C3-C20 알킬 잔기는 n-옥틸 및 n-데실이다. C3-C20 알킬기는 -S-, -O- 또는 -NH-, 바람직하게는 -O- 에 의해 한번 또는 여러번 삽입될 수 있다. 그러한 C3-C20 알킬기에 대한 예는 5-에톡시-n-펜틸, 9-메톡시-n-옥틸이다.
"V" 의 페닐 부분 중의 치환체는 바람직하게는 p- 및/또는 메타-위치에 위치한다.
바람직하게는 "W-V" 군은 p-부톡시페닐, 비페닐, 페녹시페닐, p-클로로-페녹시페닐, p-브로모-페녹시페닐, 3,4 디클로로-페녹시페닐이다.
R2 에서 사용되는 바와 같은 "C1-C10-알킬" 이라는 용어는 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 6, 더욱 바람직하게는 1 내지 4 개의 탄소 원자를 함유하는 선형 또는 분지형 포화 탄화수소를 나타낸다. 상기 C1-C10-알킬은 -S-, -O- 또는 -NH-, 바람직하게는 -O- 에 의해, 더욱 바람직하게는 에틸렌옥시 부분으로 구성된 기를 제공하는 방식으로 한번 또는 여러번 삽입될 수 있다. C1-C10-알킬기의 바람직한 예는 히드록시에틸; 히드록시프로필; 에톡시에틸; 1,2-비스에톡시에틸; 1,2-비스-히드록시-에틸이다.
R2 중의 "헤테로방향족 아실기" 에서 사용되는 바와 같은 헤테로방향족이라는 용어는 5- 또는 6 원 방향족 고리 (1, 2 또는 3 개의 고리 원자가 산소, 질소 또는 황이고, 나머지 고리 원자는 탄소 원자임) 를 표시한다. 상기 헤테로방향족기는 또다른 페닐 고리에 융합될 수 있다. 이러한 헤테로방향족 아실기에 대한 예는 푸란카르복실, 티오펜카르복실, 4-이미다졸릴카르복실, 3-벤즈티오펜카르복실, 피리딜카르복실이다. 바람직한 예는 푸란카르복실 및 티오펜카르복실이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "헤테로아릴" 이라는 용어는 상기 정의된 바와 같은 헤테로방향족을 의미한다. 바람직한 헤테로아릴기는 예를 들어 피리딘, 피리미딘, 피라진 또는 1,3,5-트리아진과 같은 질소 함유 6-원 고리와 같은 전자 결핍 잔기이다. 특히 바람직한 것은 헤테로아릴기 피리미디닐 또는 피라지닐이다.
R2 의 페닐 또는 헤테로아릴기에 존재할 수 있는 치환체는 주로 각 치환 반응에 적합한 임의의 위치에 위치할 수 있다. 바람직하게는 하나 또는 2 개의 치환체는 파라 및/또는 메타 위치에 존재한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "C1-C6-알킬" 이라는 용어는 단독 또는 C1-C6-알콕시, C1-C6-알킬아미노, C1-C6-디알킬아미노, C1-C6-아실, C1-C6-알킬티오, C1-C6- 알킬술포닐, C1-C6-알킬술피닐, C1-C6-알킬아미노카르보닐, C1-C6-알킬아미도술포닐, 비스-C1-C6-알킬아미도술포닐 또는 C1-C6-알콕시카르보닐과 조합으로 1 내지 6, 바람직하게는 1 내지 4 개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 포화 탄화수소를 표시한다. 바람직한 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필 또는 tert-부틸이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "C2-C6-알케닐" 이라는 용어는 2 내지 6, 바람직하게는 2 내지 5 개의 탄소 원자 및 1 또는 2 개의 이중 결합을 함유하는 선형 또는 분지형 불포화 탄화수소를 표시한다. 2 개의 이중 결합이 존재하는 경우, 이들은 고립된 또는 공액된 이중 결합, 바람직하게는 공액된 이중 결합일 수 있다. 바람직한 예는 알릴 또는 펜타디에닐이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "C2-C6-알키닐" 이라는 용어는 2 내지 6, 바람직하게는 2 내지 4 개의 탄소 원자를 함유하는 선형 또는 분지형 탄화수소를 표시한다. 바람직한 예는 프로파르길이다.
"할로겐" 이라는 용어는 불소, 염소, 브롬, 요오드, 바람직하게는 염소 또는 브롬을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "여러번" 이라는 용어는 1, 2, 3 또는 4 번, 바람직하게는 1 또는 2 번을 의미한다.
본원에서 상기 사용된 바와 같은 "약학적으로 허용가능한 염" 이라는 용어는 화학식 (I) 의 화합물의 생물학적 유효성 및 특성을 유지하는 통상적인 산-첨가염 또는 염기-첨가염을 말하고, 적합한 비독성 유기 또는 무기산 또는 유기 또는 무기 염기로부터 형성된다. 샘플 산-첨가염에는 무기산, 예를 들어 염산, 브롬산, 요오드산, 황산, 술팜산, 인산 및 질산으로부터 유도된 것들, 및 유기산, 예를 들어 p-톨루엔술폰산, 살리실산, 메탄술폰산, 옥살산, 숙신산, 시트르산, 말산, 락트산, 푸마르산으로부터 유도된 것 등이 포함된다. 샘플 염기-첨가염에는 암모늄, 칼륨, 나트륨 및, 4차 수산화암모늄, 예를 들어, 수산화테트라메틸암모늄으로부터 유도되는 것들이 포함된다. 화합물의 개선된 물리적 및 화학적 안정성, 흡습성, 유동성 및 용해도를 수득하기 위한 약학 화합물 (즉, 약물) 의 염으로의 화학적 변형은 약사에게 잘 공지된 기술이다 (참조, 예를 들어, Ansel, H., et. al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 6th ed., (1995), pp. 196 and 1456-1457).
본 발명의 화합물은 EP 0 869 947 및 WO 01/25217 에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
본 발명에 따르면, 하기 화합물이 특히 바람직하다:
5-비페닐-4-일-5-[4-(4-니트로-페닐)-피페라진-1-일]피리미딘-2,4,6-트리온
(화합물 I)
5-(4-페녹시-페닐)-5-(4-피리미딘-2-일-피페라진-1-일)-피리미딘-2,4,6-트리온
(화합물 II)
5-[4-(4-클로로-페녹시)-페닐]-5-(4-피리미딘-2-일-피페라진-1-일)-피리미딘-2,4,6-트리온
(화합물 III)
5-[4-(3,4-디클로로-페녹시)-페닐]-5-(4-피리미딘-2-일-피페라진-1-일)-피리미딘-2,4,6-트리온
(화합물 IV)
5-[4-(4-브로모-페녹시)-페닐]-5-(4-피리미딘-2-일-피페라진-1-일)-피리미딘-2,4,6-트리온
(화합물 V).
또한, 트리옥소피리미딘 유도체 (I) 이 산성 부분, 예를 들어 카르복실기 또는 술포닐기를 함유하는 경우, 유도체가 산성 부분을 통해 염기와 염을 형성할 수 있다는 것이 명백하다.
상기 기재된 첨가물-유형 염에 더해, 트리옥소피리미딘은 수화물 형태 또는 용매화물 형태를 취할 수 있다. 수화물 및 용매화물에는 화학식 (I) 의 유리 화합물 및 화학식 (I) 의 화합물의 염의 것이 둘 다 포함된다. 또한 이들에는 화학식 (I) 의 화합물의 토토머가 포함된다.
본 발명에 따른 시클로덱스트린 (CD) 은 다양한 수의 글루코피라노오스 단위 (대개 6, 7 또는 8 개) 로 구성된 전분의 효소적 분해로부터 생성된 시클릭 올리고당류이다: 이러한 시클로덱스트린은 각각 α, β 및 γ 시클로덱스트린 (αCD, βCD 및 γCD) 으로 불린다. 본 발명에 따른 시클로덱스트린은 25 ℃ 에서 0.5 gr/100 ml 의 양 이상으로 수용성인, 시클로덱스트린 그 자체 또는 시클로덱스트린 유도체이다.
본 발명에서 사용되는 수용성 시클로덱스트린은 바람직하게는 β-시클로덱스트린의 것 이상의 수용성을 갖는 시클로덱스트린을 말한다. 그러한 수용성 시클로덱스트린의 예는 술포부틸시클로덱스트린, 히드록시프로필시클로덱스트린, 말토실시클로덱스트린, 및 그의 염이다. 특히, 술포부틸-β-시클로덱스트린, 히드록시프로필-β-시클로덱스트린, 말토실-β-시클로덱스트린, 및 그의 염이다.
또한 본 발명에 따른 바람직한 시클로덱스트린은 메틸시클로덱스트린 (시클로덱스트린 메틸화의 생성물), 디메틸시클로덱스트린 (DIMEB) (바람직하게는 2 및 6 에서 치환됨), 트리메틸시클로덱스트린 (바람직하게는 2, 3 및 6 에서 치환됨), "랜덤 메틸화" 시클로덱스트린 (바람직하게는 2, 3 및 6 에서 랜덤으로, 그러나 단위 글루코피라노오스에 의해 1,7 내지 1,9 메틸의 숫자로 치환됨, RMβCD), 히드록시프로필시클로덱스트린 (HPCD), 히드록시프로필화 시클로덱스트린 (바람직하게는 주로 2 및 3 위치에서 랜덤하게 치환됨 (HP-βCD, HP-γCD)), 술포부틸에테르시클로덱스트린 (SBECD), 히드록시에틸시클로덱스트린, 카르복시메틸에틸시클로덱스트린, 에틸시클로덱스트린, 히드록실기 중의 탄화수소화 사슬의 그래프트에 의해 수득되고 나노입자를 형성할 수 있는 양친매성 시클로덱스트린, 모노아민화 (스페이서 (spacer) 가지를 가짐) 시클로덱스트린의 그래프트에 의해 수득되는 콜레스테롤 시클로덱스트린 및 트리글리세리드-시클로덱스트린이다.
본 발명에 따른 항원보강제는 L-라이신 또는 L-아르기닌, 바람직하게는 L-라이신이다. 이러한 항원보강제는 3원 복합체 형성에 의해 산성 성분의 용해도를 증가시키기 위해 사용할 수 있다. 본 발명의 트리옥소피리미딘-시클로덱스트린 복합체는 트리옥소피리미딘 또는 그의 염을 함유하는 수용액 및 수용성 시클로덱스트린을 제조하여 수득될 수 있다. 수용성 시클로덱스트린은 바람직하게는 트리옥소피리미딘 또는 그의 염 몰 당 1 몰에 대해 1 몰 이상, 더욱 바람직하게는 1-10 몰, 특히 바람직하게는 트리옥소피리미딘 몰 당 1-2 몰 시클로덱스트린의 양으로 사용된다.
수용성 시클로덱스트린의 농도가 더 높을수록, 트리옥소피리미딘의 용해도가 더 증가한다. 수용액의 제조 방법에 특정 제한은 없으며, 예를 들어 이것은 대략 -5 내지 35 ℃ 의 온도 범위에서 물 또는 완충제를 사용하여 제조된다.
시클로덱스트린 수용액이 과량의 화학식 I 의 트리옥소피리미딘과 함께 교반되는 경우, 상기 2 가지 분자 간에 복합체가 형성된다. 그러나, 평형에 도달하는 것은 약 며칠 이상 걸리므로, 몇 시간 또는 심지어 하루 후에는 본 발명에 따른 트리옥소피리미딘의 개선된 용해도가 발견되지 않는다. 용액의 여과는 여과물에서 용액 중의 복합체를 회수하는 것이 가능하고, 복합체는 물에 가용성이다. 또한 복합체는 수용액 중의 가용화된 공지 양의 화학식 I 의 트리옥소피리미딘과 가용화된 공지 양의 CD 를 적합한 비율을 계산하여 혼합하여 수득할 수 있다.
복합체를 수득하는 또 다른 방법은 용매 (예, 알코올, 아세톤 등) 중의 화학식 I 의 트리옥소피리미딘의 용액을 시클로덱스트린 수용액에 첨가하는 것이다. 복합체는 충분한 교반 후에, 용매의 증발 후, 또는 심지어 용매의 존재하에서도 형성될 수 있다.
트리옥소피리미딘-CD 복합체를 수득하는 모든 이러한 방법에서, L-라이신 또는 L-아르기닌의 용액 (아미노산 농도는 10 mM 내지 1000 mM, 바람직하게는 10 mM 내지 500 mM, 더욱 바람직하게는 10 mM 내지 100 mM 임) 은 항원보강제로서 사용될 수 있다. L-라이신의 용액은 항원보강제로서 바람직하다.
본 발명에 따른 복합체의 용액의 동결건조 또는 분무는 복합체를 고체 형태로 수득되도록 한다. 그러므로 하나는 복합체를 비결정 분말의 형태로 수득할 수 있다. 또한 적합한 유기 용매 중에 CD 및 화학식 I 트리옥소피리미딘의 용해, 그리고 용매의 추가 증발 후, 복합체를 고체 상태로 수득하는 것이 가능하다.
매우 소량의 물 중의 화학식 I 의 트리옥소피리미딘 및 CD 의 현탁액을 격렬히 교반한 다음, 초임계 상태에서 CO2 의 존재하에 화학식 I 의 트리옥소피리미딘 및 CD 를 혼합하기 위해 초임계 상태에서 CO2 의 사용 또는 건조 후 복합체를 수집하는, 고체 복합체 제조를 위한 다른 방법이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 복합체는, 예를 들어, 용액으로부터 단독으로 공지된 방법으로 또는 시클로덱스트린 대 트리옥소피리미딘의 중량비가 2 (2:1) 내지 540 (540:1) 이 되어야만 하고, 약 1,300 의 시클로덱스트린의 분자량에 대해 바람직하게는 2 내지 25, 특히 바람직하게는 2.6 내지 3.5 (시클로덱스트린과 1:1 의 복합체) 또는 5.2 내지 6.2 (시클로덱스트린과 1:2 의 복합체) 의 범위인 페이스트 (paste) 법을 사용하여 제조될 수 있다.
농축된, 수성 시클로덱스트린 제제로부터 복합체를 제조하는 것이 바람직하다. 제제의 시클로덱스트린 농도는 바람직하게는 50 내지 400 mM 이다. 100 내지 250 mM 의 시클로덱스트린 농도가 바람직하다. 일관성에 따라, 혼합물을 격렬하게 교반 또는 혼련시킨다. 시클로덱스트린의 중량% 는 수성 시클로덱스트린 제제의 총 중량에 기초한다.
또한, L-라이신 용액 (L-라이신 농도는 10 mM 내지 1000 mM, 바람직하게는 10 mM 내지 500 mM, 더욱 바람직하게는 10 mM 내지 100 mM 임) 의 존재하에서 농축된, 수성 시클로덱스트린 제제로부터 복합체를 제조하는 것이 바람직하다. 제제의 시클로덱스트린 농도는 바람직하게는 50 내지 400 mM 이다. 100 내지 250 mM 의 시클로덱스트린 농도가 바람직하다. 일관성에 따라, 혼합물을 격렬하게 교반 또는 혼련시킨다. 시클로덱스트린의 중량% 는 수성 시클로덱스트린 제제의 총 중량에 기초한다.
반응 온도는 일반적으로 20 ℃ 내지 80 ℃, 바람직하게는 20 ℃ 내지 60 ℃, 특히 바람직하게는 25 ℃ 내지 45 ℃ 이다. 반응 시간은 온도에 따르고, 며칠 이상이다. 복합체 형성의 평형에 도달하기 위해 7 일 이상의 반응 시간이 바람직하다. 이어서, 불용해된 물질이 여전히 존재하는 경우 반응 혼합물을 여과하고, 완전히 용해된 경우 직접 사용한다. 원한다면 복합체를, 예를 들어 크로마토크래피 수단에 의해 단리할 수 있다. 바람직하게는, 트리옥소피리미딘 및 시클로덱스트린의 농도 및 비는 복합체 형성이 완전히 일어나고 (평형에 도달함), 불용해되거나 복합체가 형성되지 않은 트리옥소피리미딘이 검출되지 않는 것이다.
본 발명에 따르면, 화학식 I 의 트리옥소피리미딘과 시클로덱스트린 간의 복합체가 물 중의 트리옥소피리미딘의 용해도를 놀랍게 증가시킨다는 것이 성립되었다. 또한 복합체의 형성이 트리옥소피리미딘의 약리학적 특성을 방해하지 않았다는 것이 밝혀졌다.
본 발명에 따르면, 화학식 I 의 트리옥소피리미딘, 시클로덱스트린 및 L-라이신 또는 L-아르기닌과 같은 항원보강제 간의 복합체가 물 중의 트리옥소피리미딘의 용해도를 놀랍게 증가시킨다는 것이 성립되었다. 또한 복합체의 형성이 트리옥소피리미딘의 약리학적 특성을 방해하지 않았다는 것이 밝혀졌다.
상기 모든 특성은 액체 제형을 주사용 또는 분무용 용액으로서 제조하도록 하고, 생체이용율을, 특히 경구로 개선되도록 한다. 본 발명의 트리옥소피리미딘-시클로덱스트린 복합체는 함께 존재하는 물을 제거하여 수득되는 분말 형태와 같은 것으로 사용될 수 있다. 물의 제거 방법의 예에는 동결건조 및 감압하에서의 건조가 포함된다. 동결건조로부터 수득된 분말 생성물이 특히 바람직하다.
본 발명의 트리옥소피리미딘-시클로덱스트린 복합체는 경구 투여 또는 비경구 투여를 통해 그 효과를 나타내고, 그것은 바람직하게는 비경구 투여용 제형, 특히 주사 제형 또는 국소 투여, 특히 에어로졸 제형으로 형성된다.
본 발명의 복합체의 투여량은 연령, 체중 및 환자의 증상의 중증도에 따라 적합하게 조정될 수 있고, 복합체는 단일 횟수 또는 분배된 방식으로 투여될 수 있다. 제형의 형태의 예에는 정제, 캡슐, 분말 및 과립이 포함된다. 이들은 부형제, 윤활제 및 결합제와 같은 전형적인 첨가제를 사용하여 공지된 기술을 통해 제조할 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 복합체를 환자에게 약학적 유효량으로 적용하는, 예를 들어, 특히 천식 및 만성 폐쇄 폐질환 (COPD) 과 같은 질환의 치료를 필요로 하는 숙주 포유동물에서의 기관지 염증 질환의 치료 방법에 관한 것이다. 천식은 알레르겐 노출에 관계된 또는 관계되지 않은 기관세지의 염증성 질환이다. 상기 염증은 기관지 평활근이 수축하도록 자극하고, 점액 분비를 향상시키고, 질환의 과정에 관련해 악화 인자라고 생각되는 기관지 형태학적 변화를 유도함으로써 환자에서 증상을 일이킨다. 기도 과민반응성은 질환의 특징이고, 대부분의 증상의 원인이다. 기관세지는 많은 세포 종류 (상피 세포, 평활근 세포, 염증 세포, 신경, 근육 생성 세포, 섬유아세포 등) 를 가진 매우 복합적인 조직이고, 주로 기관지벽 내에 세포외부 매트릭스 성분의 침착 및 점도 생성 세포의 증식으로 이루어진 많은 측면을 포함하는 기관지 재건 결과이다. 본 발명에 따른 복합체의 사용은 기관지 폐포세척 및 주변기관지 조직의 구획 중의 염증 세포 유입을 억제하고, 메타콜린과 같은 자극제에 대한 비정상 반응으로 정의되는 과민반응성을 억제한다. 상기 질환 및 현행 치료는 예를 들어 [GINA Workshop Report, Global Strategy for Asthma Management and Prevention (NIH Publication No. 02-3659)] 에 검토된다.
그러므로 본 발명은 또한 본 발명에 따른 복합체를 사용하여 만성 폐쇄 폐질환 치료를 필요로 하는 숙주 포유동물에서의 치료 또는 보호 방법에 관한 것이다. 상기 질환에서는, 기관지에 염증이 생기고, 점액선이 과대증식하고, 다량의 점액을 생성한다. 기관지벽은 비정상이고, 세포외부 매트릭스 성분의 비정상 축적이 기류에 대한 저항을 증가시킨다. 상기 질환 및 현행 치료는 예를 들어, [Fabbri, L.M., and Hurd, S.S., Eur. Respir. J. 22 (2003) 1-2] 에 기재된다.
그러므로 본 발명은 또한 본 발명에 따른 복합체를 사용하는 폐기종 치료가 필요한 숙주 포유동물에서의 치료 또는 보호 방법에 관한 것이다. 상기 질환에서는, 폐포벽은 단백질 분해 과정에 의해 파괴되고, 상기 파괴는 산소를 혈액으로 전달하는 것을 손상시킨다. 또한 호흡기 근육의 기능장애를 야기하여 환기의 비정상을 야기하는 유도된 과다팽창 때문에, 그리고 진행된 단계의 심장 부전을 유발하는 폐 동맥 내의 고혈압 때문에 생리학적 문제가 일어난다.
본 발명에 따르면, 트리옥소피리미딘-시클로덱스트린 복합체는 그러한 치료를 필요로 하는 환자에게, 바람직하게는 여러 달 또는 년에 걸쳐 투여된다. 상기 복합체는 바람직하게는 액체 또는 분말 제형의 에어로졸화에 의해, kg 및 일 당 μmol 내지 nmol 농도 범위의 비 독성 투여량으로 투여된다.
본 발명에 따른 복합체의 정확한 투여량은 다양할 것이나, 쉽게 결정될 수 있다. 일반적으로, 복합체의 일일 투여량은 1 μmol/kg 및 일 내지 100 nmol/kg 및 일 (복합체 중의 트리옥소피리미딘의 농도) 의 범위일 것이다.
약학 조성물은 바람직하게는 생리학적 적합성을 갖는 수성 조성물이다. 조성물에는 바람직하게는, 또한, 약학적으로 허용가능한 첨가제, 예를 들어 완충제, 방부제 및/또는 보조제 물질이 포함된다. 적합한 완충제 시스템은 나트륨 포스페이트, 나트륨 아세테이트 또는 나트륨 보레이트에 기초한다. 사용하는 동안 약학 조성물의 미생물 오염을 방지하기 위해 방부제가 필요하다. 적합한 방부제는, 예를 들어, 벤즈알코늄 클로라이드, 클로로부탄올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 페닐에틸 알코올, 소르브산이다. 그러한 방부제는 전형적으로 0.01 내지 1% 중량/부피의 양으로 사용된다.
적합한 보조제 물질 및 약학적 제제는 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., 1980, Mack Publishing Co., Oslo et al 출판] 에 기재된다. 전형적으로, 적합한 양의 약학적으로 허용가능한 염이 제형을 등장성으로 만들기 위해 제형 내에 사용된다. 약학적으로 허용가능한 물질의 예에는 식염수, 링거 (Ringer) 용액 및 덱스트로스 용액이 포함된다. 용액의 pH 는 바람직하게는 약 5 내지 약 8, 더욱 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5 이다.
L-라이신 또는 L-아르기닌이 복합체 형성을 위한 항원보강제로서 사용되는 경우, 용액의 pH 는 바람직하게는 약 6 내지 약 8.5, 더욱 바람직하게는 약 7.5 내지 약 8.5 이다.
본 발명에 따른 바람직한 제형은 바람직하게는 CD 및 트리옥소피리미딘으로부터 1 대 500 의 몰 비로 제조되는 주사가능한 또는 분무가능한 제형이다.
복합체는 물에 CD 를 용해시키고, 화학식 I 의 트리옥소피리미딘을 첨가하고, 이것이 완전히 용해될 때까지 수조에서 가열하여 제조된다. 바람직하게는 용액을 여과에 의해 멸균시킨다. 바람직하게는 용액은 200-400 의 삼투몰농도, 바람직하게는 약 300 mOs/kg 을 갖는다. pH 는 약 7.2 이다. 트리옥소피리미딘 및/또는 CD 의 농도는 필요의 함수로 변형될 수 있다. NaCl 의 첨가에 의해 삼투성을 조정하는 것이 바람직하다.
바람직한 분무용 제형은 트리옥소피리미딘, CD, NaCl 및 물을 함유한다. 특히 바람직한 것은 (200 ml 의 용액에 대해) 하기의 조합이다:
트리옥소피리미딘 0.05-0.2 g, 바람직하게는 0.1 g; 10-50 g CD, 바람직하게는 20 g CD, 바람직하게는 HPβCD; 염화나트륨 1.2-1.5 g, 바람직하게는 1.42 g (등장성) 및 물, 바람직하게는 피로겐이 없는 멸균된 정제수 ad 200 ml.
용액을 100 ml 의 정제수에 CD 를 용해하고, 트리옥소피리미딘 및 NaCl 을 첨가하고, 교반하여 이들을 용해시키고 물을 채워 200 ml 의 용액이 수득되도록 제조하였다. 바람직하게는 용액을 0.22 ㎛ 폴리프로필렌 막을 통해 여과 또는 증기 멸균법에 의해 멸균시킨다.
기타 바람직한 제형은 안과용 용도 제형, 경구용 용도 제형, 자궁내 장치이다. 또한, 예를 들어 나노- 또는 마이크로입자 또는 리포좀과 같은 다른 시스템과의 회합을 고려할 수 있다.
하기 실시예, 참조 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되는 것으로, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 청구의 범위에서 언급된다. 본 발명의 취지로부터 벗어나지 않으면서 언급되는 과정에서 변형이 이뤄질 수 있다는 것이 이해된다.
도 1 은 RMβCD 및 HP-β-CD 둘 다로부터 수득된 화합물 I 용해도를 나타낸다. 상 용해도 도표는 CD 가 화학량론 1:1 및 1:2 의 복합체를 형성하는 것을 의미하는 둘 다의 Ap 유형이다. 그 다음 안정성 상수를 계산하고, 그 값을 표 6 에 제시한다.
도 2 화합물 I 과 DIMEβCD 의 복합체의 NMR 스펙트럼 (윗부분) 및 DIMEβCD 단독의 NMR 스펙트럼 (아랫부분).
도 3 화합물 I 의 NMR 스펙트럼 (상부), DIMEβCD 의 NMR 스펙트럼 (오른쪽) 및 T-ROESY (중간).
도 4 화합물 I 현탁액의 복강내 주사의, BAL 호산구 수에 대한 효과 (도 2a) 및 주변기관지 염증 점수에 대한 효과 (도 2b). 대조군은 PBS 에만 노출되고 알레르겐에 노출되지 않은 마우스 (PBS) 및 흡입에 의해 ova 에, 복강내 주사에 의해 플라시보에 노출된 마우스 (OVA) 이다.
도 5 단기간 (5 일) 알레르겐 노출 모델에서 에어로졸에 의해 투여된 화합물 I-HP-β-CD 복합체, 플루티카손 및 플라시보 (PLAC) 의, BAL 호산구에 대한 치료적 효과 (5a), 주변기관지 염증 점수에 대한 치료적 효과 (5b), 및 조직 호산구 침윤 점수에 대한 치료적 효과 (5c).
도 6 장기간 (11 주) 알레르겐 노출 모델에서 에어로졸에 의해 투여된 화합물 I-HP-β-CD 복합체, 플루티카손 및 플라시보 (PBS) 의, BAL 호산구에 대한 치료적 효과 (6a), 주변기관지 염증 점수에 대한 치료적 효과 (6b), 및 조직 호 산구 침윤 점수에 대한 치료적 효과 (6c). 감작되나 알레르겐에 노출되지 않은 마우스 (PBS) 및 감작되고 OVA 에 노출된 마우스 (PLAC) 를 PBS 흡입에 의해 처리하였다.
도 7 정제수 (●), L-라이신 50 mM (x) 또는 L-라이신 500 mM (▲) 중의 화합물 I 과 HP-β-CD 상 용해도 도표.
도 8 양 (n = 6) 에게 정맥내 투여 (5 mg/kg) 후의 시간 곡선 대 평균 (± S.D.) 화합물 I 혈청 농도 (a) 또는 평균 화합물 I 혈청 농도의 대수 (b).
도 9 양에게 (용액에 대해서 n = 5, 현탁액에 대해서 n = 6) 용액 (▲) 및 현탁액 (●) 의 경구 투여 (15 mg/kg) 후 시간 곡선 대 평균 (± S.D.) 화합물 I 혈청 농도 (a) 또는 평균 화합물 I 혈청 농도의 대수 (b).
약어
CD 시클로덱스트린
βCD β-시클로덱스트린
γCD γ-시클로덱스트린
DIMEβCD 디메틸 β-시클로덱스트린
HPβCD 히드록시프로필 β-시클로덱스트린
RMβCD 랜덤 메틸화 β-시클로덱스트린
I.V. 정맥내
실시예 1
화합물 I 과 시클로덱스트린 ( CD ) 의 가용성 복합체의 제조
1.1 20 mg 의 화합물 I 을 중량을 잰다. HPβCD 200 mM 의 2 ml 의 용액을 첨가한다. 37 ℃ 에서 24 시간 동안 교반한다. Millipore 여과기 Millex HV 0.45 ㎛ 로 여과한다. 여과 후 수득된 용액은 용액 중에 복합체 화합물 I-CD 를 함유한다.
1.2. 2.5 mg 의 화합물 I 을 중량을 잰다. HPβCD 200 mM 의 2 ml 의 용액을 첨가한다. 37 ℃ 에서 24 시간 동안 또는 화합물 I 이 완전히 용해될 때까지 교반한다. 상기 방법으로 수득된 용액은 복합체 화합물 I-CD 를 함유한다.
실시예 2
상 용해도 연구
복합체 형성시, 실제적으로 물에 불용성인 (<0.6 ㎍/ml, MW: 485) 화합물 I 은 극적으로 가용화된다. 그러므로 화합물 I 의 용해도의 증가는 화합물 I 과 CD 간의 복합체 형성의 증거이다. 복합체 형성 및 평형의 달성은 1 일 후 20%, 4 일 후 40%, 및 7 일 후 100% 이다. 용해도 도표 (도. 1) 는 과량의 화합물 I 을 증가하는 농도의 CD 용액에 첨가하여 수행한다. 37 ℃ 의 자동 온도 조절 배쓰 (bath) 에서 7 일 동안 교반한 후, 상기 용액을 여과하고, 가용화된 화합물 I 양을 HPLC 로 적량한다. βCD 및 γCD 뿐 아니라 그들의 합성 유도체는 화합물 I 과 복합체를 형성하도록 한다. β-CD 및 HPβCD 는 ROQUETTE (프랑스) 로부터, RMβCD 및 γCD 는 Wacker (독일) 로부터 공급되었다.
CD 수용액의 제조:
- βCD: 2, 4, 8, 10, 12, 16 mM 을 함유하는 용액.
- HPβCD: 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200 mM 을 함유하는 용액.
- RMβCD: 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200 mM 을 함유하는 용액.
- γCD: 10, 25, 50, 100, 75, 150 mM 을 함유하는 용액.
복합체 형성:
화합물 I 및 시클로덱스트린을 함유하는 플라스크를 37 ℃ 의 자동 온도 조절 배쓰에서 7 일 동안 교반하도록 두어, 복합체화 평형에 도달하였다. 이 시간 후, 현탁액을 PVDF 의 밀리-포어 여과기 0.22 ㎛ 의 도움으로 여과하고, 여과물을 이동상 중의 DMSO 에 용해하여, 검정 선에 맞춰지는 농도 샘플을 수득하였다. 그 다음 이들은 하기 기술되는 검증된 HPLC 법에 의해 적량하였다.
화합물 I 의 적량: HPLC 법
장치:
펌프 Merck-Hitachi 모델 L-7100, 샘플러 Merck-Hitachi L-7200, 로 (furnace) Merck-Hitachi L-7350, 검출기 Merck-Hitachi Diode 배열 검출기 L-7455, 인터페이스 D-7000, 고정은 Merck-Hitachi 에 의해 공급되는 데이타 획득 소프트웨어 "Chromatography Data Station Software" 에 의해 조정된다.
고정상:
Lichrocart Column (125x4 mm d.i.) 을 옥틸실란 C8 LiChorspher® 60RP- Select B (5 ㎛) Merck 의 고정상으로 채웠다.
크로마토그래피 조건:
유동상: 포스페이트 완충제 0.05 M (pH=3) 및 메탄올의 혼합물 (30/70, v/v). 기체를 15 분 동안 초음파 통과, 배출: 1 ml/분, λ 의 U.V. 검출: 265 nm, 작동 온도: 30 ℃, 주사 부피: 20 ㎕ 에 의해 추출하였다.
화합물 I 의 HPLC 적량 결과를 각 시클로덱스트린에 대해 하기 표 (표 1 내지 4) 에 재연하였다. 시클로덱스트린 부재하에, 수득된 용해도는 0.56 ㎍/ml 이다.
표 1:
HP β CD 의 존재하에서의 화합물 I 의 용해도
CD 의 농도 (mM) 화합물 I 의 농도 (㎍/ml)
2 2.4
4 6.8
8 6.6
10 3.4
12 1.6
16 1.5
표 2:
HP β CD 의 존재하에서의 화합물 I 의 용해도
CD 의 농도 (mM) 화합물 I 의 농도 (㎍/ml)
10 187.8
25 213.4
50 235.8
75 1129.3
100 1664.6
150 3106.5
200 4962.1
표 3:
RM β CD 의 존재하에서의 화합물 I 의 용해도
CD 의 농도 (mM) 화합물 I 의 농도 (㎍/ml)
10 120.6
25 526.7
50 1529.2
75 3012.4
100 4677.2
150 8317.6
200 11962.5
표 4:
γ CD 의 존재하에서의 화합물 I 의 용해도
CD 의 농도 (mM) 화합물 I 의 농도 (㎍/ml)
10 1.3
25 3.2
50 11.4
75 13.6
100 19.5
200 29.1
화합물 I 은 용해도 증가가 관찰되기 때문에 모든 연구된 시클로덱스트린과 복합체를 형성한다. 또한 화합물 I 과 Rameb 간에 형성되는 복합체는 화합물 I 의 수용해도를 고려할만하게 그리고 완전히 예상치 않게 증가시킨다는 것을 직접 관찰할 수 있었다. 또한 상기 관찰은 HP-β-CD 에 대해 사실이다. 표 5 는 시험된 최대 농도에서 각 시클로덱스트린에 대해 수득된 용해도 결과를 요약한다. 용해도 증가는 0.56 ㎍/ml 에서 측정된 물 중의 (시클로덱스트린 부재) 화합물 I 의 용해도와 비교하여 계산된다.
이러한 결과에 기초해서, 상 용해도 도표를 [Higuchi, T., and Connors, K. A., Advances in Analytical Chemistry and Instrumentation 4 (1965) 117-212] 에 따라 작성하였다.
표 5:
각 시클로덱스트린에 대해 수득된 화합물 I 의 용해도의 최대 증가
각 CD 에 대한, 사용된 최대 농도 (mM) 최대 용해도 (㎍/ml) 용해도 증가
βCD 4 6.8 12.1
HPβCD 200 4962 8860x
RMβCD 200 11926.5 21296x
γCD 200 29.1 51.96x
표 6:
CD 화학량론 K1 :1[M-1] K1 :2[M-1]
βCD 1:1; 1:2 2092 -
γCD 1:1 346 -
HP-βCD 1:1; 1:2 12575 14.4
RMβCD 1:1; 1:2 27595 22.88
높은 값의 K1 :1 은, 정제수 중의, β-CD 유도체의 공동이 포접 내에 포함된 화합물 I 의 몰 비에 매우 적합하다는 것을 제시한다. 0 내지 4 mM βCD 농도는, 화합물 I 의 용해도를 증가시키고, 8 mM βCD 이하에서 정체상태에 도달된다. 8 mM βCD 초과의 농도는 더 낮은 용해도 (1.5 ㎍/ml) 로 1:2 화학량론 (Cpd. I:βCD) 의 추가 복합체를 형성한다. 그러므로 수득된 상 도표는 AL 도표이다. γ-CD, HP-βCD 및 RMβCD 에 대해, Ap 유형 도표가 수득된다. 계산된 안정성 상수 346M-1 는 CD 의 공동이 충분한 상호작용을 수득하기에 너무 크다는 것을 나타 낸다.
화합물 I 은 복합체 형태이든 아니든 상이한 용해도를 갖는다. 예를 들어, 화합물 I 은 아세토니트릴에서 양호한 용해도 (± 700 ㎍/ml) 를 나타내는 반면, HP-β-CD 및 화합물 I-CD 복합체는 상기 용매에서 불용성이다. 이러한 조건에서, 포함된 약물은 막혀서 남고, 용매에서 불용성이 된다. 유리상태 또는 복합체를 이룬 형태의 화합물 I 사이의 상이한 용해도의 상기 기술을 적용하여 복합체화의 백분율을 평가할 수 있다.
실시예 3
HP β CD 의 존재하에서의 다양한 트리옥소피리미딘의 용해도
용해도는 실시예 1 및 2 에 따라 조사하였다. 결과를 표 7 에 제시한다.
표 7:
농도 HP β CD [ mM ] 농도 [ mg / ml ]
화합물 III 화합물 II 화합물 IV 화합물 V
10 0.8 1.3 0.1 0.8
25 2.4 3.4 0.2 2.4
50 3.1 3.8 0.9 5.4
100 6.1 5.9 2.7 6.6
200 9.5 9.3 7.9 9.9
실시예 4
항원보강제로서 L-라이신 용액을 갖는 상 용해도 연구
[Higuchi, T., and Connors, K.A., Advances in Analytical Chemistry and Instrumentation 4 (1965) 117-212] 에 기재된 바와 같이 용해도 연구를 수행하였다. 과량의 화합물 I 을 5 ml 용해 매질, 정제수 또는 L-라이신 용액 (50 mM 또는 500 mM) 중에 증가하는 농도의 HP-β-CD (0 - 200 mM) 를 첨가하였다. 유리 용기를 밀봉하고, 복합체화 평형에 도달할 때까지 (7 일) 25 ℃ 의 수조에서 현탁액을 섞었다. 분취량을 0.45 ㎛ PVDF 막 여과기를 통해 여과하고, 검증된 액체 크로마토그래피 (LC) 법에 의해 화합물 I 함량을 검사하였다.
도. 7 은 정제수 중의, 50 mM L-라이신 용액 중의 및 500 mM L-라이신 용액 중의 HP-β-CD 의 존재하의 25 ℃ 에서 수득된 화합물 I 의 상 용해도 도표를 나타낸다. 3 가지 경우에서, 화합물 I 의 수용해도는 CD 농도의 함수로 증가한다. L-라이신의 부재하에서 수득된 용해도 도표는 상기 언급된 결과를 확인시킨다: 200 mM HP-β-CD 용액 중의 화합물 I 의 용해도는, 화합물 I 의 수용해도의 대략 10,000-배 증가에 해당하는 약 5.5 mg/ml (11 mM) 이다.
L-라이신의 존재하에서, HP-β-CD 용액 중의 화합물 I 용해도는 심지어 훨씬 더 높다. 200 mM HP-β-CD 용액 중의 용해도는 각각 50 mM 및 500 mM 의 L-라이신의 존재하에서 약 2 및 7 배 증가된다. 표 8 은 상이한 매질 중의 화합물 I 의 용해도 데이타를 나타낸다. 결과는 L-라이신 및 HP-β-CD 사이의 상승효과를 나타낸다. 500 mM L-라이신 및 200 mM HP-β-CD 모두의 존재하에서의 용해도 (38.14 mg/ml) 는 개별적으로 HP-β-CD 및 L-라이신의 효과를 첨가하여 기대되는 것 (5.53 mg/ml 및 0.09 mg/ml) 보다 더 높다. 상기 L-라이신 및 HP-β-CD 사이의 상승효과는 화합물 I 수용해도의 중요한 증가를 가능하게 한다 (500 mM 의 L-라이신 및 200 mM 의 HP-β-CD 로 70,000-배).
표 8:
HP -β- CD (200 mM ) 와 존재 또는 부재시, 정제수 중의 및 L-라이신 (50 mM 및 500 mM ) 중의 화합물 I 의 용해도 [ mg / ml ]
CD 부재시 용해도 [㎍/ml] HP-β-CD 존재시 용해도 [㎍/ml]
정제수 0.56 5530
L-라이신 50 mM 50 17080
L-라이신 500 mM 90 38140
실시예 5
NMR 연구
DIME-β-CD 용액을 D2O 중의 10 mM 농도로 제조하였다. 화합물 I 의 수용성이 너무 낮으므로, 화합물 I 단독 스펙트럼을 D2O 중에서 수행할 수 없었다. 양자의 지정을 위해, 화합물 I 의 NMR 스펙트럼을 DMSO 중에서 수행하였다. 모든 NMR 실험을 양자에 대해 500 MHz 에서 조작하는 Bruker DRX500 분광계에서 수행하였다. 온도를 298K 에 고정시켰다. HDO 의 제 2 참조로서 용매의 잔류 공명을 사용하여 검정을 달성하였다. T-ROESY 실험을 위해, 300 msec 혼합 시간을 사용하였다. 모든 과정은 Bruker 에 대한 WINNMR 프로그램을 사용하여 Silicon Graphics INDY data station 에서 수행하였다. 화합물 I NMR 스펙트럼 단독 및 과량의 DIMEβCD 의 존재 사이의 비교는 H-3 및 H-5 양자에 상응하는 신호가 필드를 상향 이동시키는 것을 알도록 한다. 상기 이동은 포접의 증거를 구성한다. T-ROESY 스펙트럼 분석은 CD 공동 중의 화합물 I 의 포접을 증명한다. 분자의 두 가지 상이한 부분이 CD 공동에 적합할 수 있다.
실시예 6
분자 모델링 연구
분자 모델링 계산은 Cambridge Data Base 의 β-CD 의 POBRON 결정학 구조를 사용하는 Gaussian 94 로 수행하였다. 화합물 I 의 2 가지 극한 공간 배열을 계산하였다. 수득된 결과는 포접이 효과적으로 적합하고, 매우 안정적이라는 것을 나타낸다. 상기 안정성은 산소와 바르비투르산 핵의 질소의 양자 및 CD 의 외부에 위치해 있는 알코올 간의 수소 결합의 형성에 의해 설명될 수 있다. 화합물 I 과 시클로덱스트린 (바람직하게는 βCD, γCD 및 그들의 합성 유도체) 을 복합체 형태로, 또는 회합으로 포함하는 모든 약학 조성물은, 그들의 형태 및 그의 치료적 용도에 상관없이, 본 발명의 범주내에서 예상된다. 사실, 심지어 화합물 I 과 CD 가 제형 중의 복합체 형태가 아닌 경우, 이것은 그 자리에서 형성될 수 있다.
실시예 7
약학 조성물
상이한 조성물의 제형이 예를 들어 고갈되지 않도록 제공된다.
주사 제형용의 바람직한 예는 다음과 같다:
- HP-βCD 200 mM; 화합물 I 1 mg/ml; 주사용 멸균 수 q.s.
25 ml 의 용액에 대해:
a) 용액의 제조:
6.77 g 의 HPβCD (4.2 % 의 H2O) 를 무게를 재고, 이들을 25 ml 의 물에 주 사에 의해 용해시킨다. 25 mg 의 화합물 I 을 첨가하고, 이것이 완전히 용해될 때까지 수조에서 가열한다. 용액을 여과에 의해 멸균시킨다.
b) 용액의 특성:
용액 삼투몰농도는 308 mOs/kg 이다. pH 는 7.2 이다.
화합물 I 및/또는 CD 의 농도는 필요의 함수로 변형될 수 있다. NaCl 을 첨가하여 삼투성을 조정하는 것이 바람직하다.
분무용으로 바람직한 제형은 다음과 같다:
200 ml 의 용액에 대해:
- 화합물 I 0.1 g (MW: 485)
- 피로겐이 없는 HPβCD 20.15 g (MW: 1,300)
- 염화나트륨 1.42 g (등장성)
- 피로겐이 없는 멸균 정제수 q.s. ad 200 ml
a) 20.15 g 의 피로겐이 없는 HPβCD (3.2 % H2O, ROQUETTE) 를 중량을 재고, 이들을 100 ml 의 정제수에 용해시킨다.
b) 0.1 g 의 화합물 I, 및 1.42 g 의 염화나트륨을 중량을 재고, 이들을 용액 (a) 에 첨가하고, 이들이 용해되도록 효과적으로 교반한다.
c) 물을 채워 200 ml 의 용액을 수득하였다.
d) 0.22 ㎛ 폴리프로필렌 막을 통해 여과에 의해 멸균시킨다.
실시예 8
생체이용율에 대한 약동학 연구
약동학 연구를 위한 용액을 생체적합성 pH 값을 갖는 높은 화합물 I 농도를 가능하게 하는 HP-β-CD 및 L-라이신의 조합으로 개발하였다.
투여 형태 제제
화합물 I/HP-β-CD 정맥내 용액을 주사용 HP-β-CD (200 mM), L-라이신 (20 mM) 및 물을 함유하는 용액에 화합물 I (10 mg/ml) 을 용해시켜 수득하였다. 상기 용액의 삼투몰농도 (약 325 mOsmol/kg) 및 pH (약 8.2) 값은 정맥내 주사에 적합하다. 상기 용액을 무균 조건하에서 멸균 0.20 ㎛ 셀룰로오스 아세테이트 여과기를 통해 멸균시켰다.
화합물 I/HP-β-CD 경구 용액을 HP-β-CD (200 mM), L-라이신 (50 mM) 및 물을 함유하는 용액에 화합물 I (15 mg/ml) 을 용해시켜 제조하였다.
화합물 I 현탁액은 화합물 I (15 mg/ml), 습윤제로서 폴리소르베이트 80 (0.1 mg/ml), 점도제로서 시말드레이트 (VEEGUM HV®, 1 % m/v) 및 메틸셀룰로오스 (METHOCEL A400®, 0.4 % m/v) 로 구성되었다.
동물 실험 프로토콜 및 약물 투여
체중이 45 내지 82 kg 의 범위인 건강한 양 6 마리 (2 마리 수컷 및 4 마리 암컷) 를 실험 동물로서 사용하였다. 시험 동안, 동물은 자유롭게 음식과 물을 섭취하였다.
표 9 의 도식을 따르는 것으로 이해되는 실험 연구에는, 정맥내 투여에 이은 경구 투여에 대한 랜덤화 2-방식 교차 고안이 포함되었다. 각 투여 사이에 3 주의 세정 기간을 두었다.
표 9:
화합물 I 을 함유하는 용액 및 현탁액의 투여를 위한 동물 실험 고안
양 제 1 상 제 2 상 제 3 상
1 경구 현탁액 경구 용액 I.V. 용액
2 경구 현탁액 경구 용액 I.V. 용액
3 경구 현탁액 경구 용액 I.V. 용액
4 경구 용액 경구 현탁액 I.V. 용액
5 경구 용액 경구 현탁액 I.V. 용액
6 경구 용액 경구 현탁액 I.V. 용액
경구 투여 형태에 대해, 각 동물은 두 가지 제형으로부터 15 mg/체중 kg 에 해당하는 화합물 I 투여량을 받았다. 투여 형태 부피를 적응시키기 위해 약물 투여한 날 양의 체중을 쟀다. 혈액 샘플을 경구 투여 전 및 경구 투여 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 28, 32, 48, 72, 96, 120, 144, 168 시간 후에 경정맥으로부터 취하였다.
정맥내 투여 형태에 대해, 모든 6 마리 양은 5 mg 의 화합물 I/체중 kg 을 받았다. 용액은 좌 경정맥을 통해 투여되고, 혈액 샘플을 정맥내 투여 전 및 정맥내 투여 시작 후 5, 10, 15, 20, 30, 45 분, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 24, 28, 32, 48, 72, 96, 120, 144, 168 시간에 우 경정맥으로부터 취하였다.
모든 혈액 샘플을 원심분리하고, 혈청을 분석할 때까지 -80 ℃ 에 보관하였다.
생체시료분석법 ( Bioanalysis method )
혈청 중의 상기 화합물의 LC 측정을 위해 완전히 자동화된 방법을 개발하였다. 컬럼-스위칭 기술에 의한 분석 컬럼에 대해, LiChrospher RP-8 ADS (알킬 디올 실리카) 로 불리는 제한된 접근 물질 (RAM) 로 채워진 전치컬럼의 온라인 커플링에 의해, 샘플 수거를 수행하였다. ADS 흡착제는 내부 표면 역상 지지체의 군에 속하고, LC 분석 전에 생물학적 샘플의 수거에 성공적으로 적용되었다 (Yu, Z., and Westerlund, D., Chromatographia 44 (1997) 589-594; Hubert, Ph., et al., S.T.P. Pharma Pratiques 9 (1999) 160-180; Souverain, S., et al., Journal of Chromatography B 801 (2004) 141-156). 조작 조건은 이전 문헌에 기재되어 있다 (Chiap, P., et al., Journal of Chromatography B 817 (2005), 109-117). 방법은 총 측정 오류를 고려한 정확한 프로파일에 기초한 신규 접근에 따라 충분히 검증되었다 (Hubert, P., et al., Analytica Chimica Acta 391 (1999) 135-148; Hubert, Ph., et al., S.T.P. Pharma Pratiques 13 (2003) 27-64; Hubert, Ph., et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 36 (2004) 579-586).
생체시료분석 연구를 위해, 본 방법의 투여 범위는 고 농도로 측정되어야 하기 때문에 50 ㎍/ml 까지 증가되어야 한다. 부분적 재검증이 수행되었고, 반응 함수, 참값, 정밀도, 정확도 및 선형도에 관련해 양호한 결과를 수득하였다.
약동학 및 통계 분석
정맥내 투여 연구를 위해, 약동학 매개 변수를 1 차 분포 및 제거를 가진 선형 2-구획 모델을 사용하여 각 동물에 대해 측정하였다 (Boroujerdi, M., Pharmacokinetics, Principles and Applications. McGrow-Hill Companies, USA, 2002). 샘플링 기간 동안 곡선 값 하의 면적 (AUCs 0-168) 을 선형 사다리꼴 법칙에 의해 계산하였다. 무한 값까지 외삽된 AUC (AUCs 0-∞), 전신 제거율 값 (Cl t), 생물학적 반감기 (T 1/2β) 및 분포의 전체 부피 (Vd t) 를 구획 분석과 관련된 통상적인 방정식을 사용하여 계산하였다 (Boroujerdi, M., Pharmacokinetics, Principles and Applications. McGrow-Hill Companies, USA, 2002).
경구 투여 연구를 위해, 1 차 입력 및 1 차 출력의 선형 1-구획 모델을 사용하여, 각 동물에 대해 그리고, 현탁액 및 용액 모두에 대해 약동학 매개 변수를 측정하였다 (Boroujerdi, M., Pharmacokinetics, Principles and Applications. McGrow-Hill Companies, USA, 2002). AUCs 0-168 을 상기 기재된 바와 같이 사다리꼴 합계에 의해 계산하였다. AUCs 0-∞ 를 하기 방정식 (방정식 1) 에 의해 측정하였다:
Figure 112006071794402-pct00002
(방정식 1)
(식 중, K 및 ka 는 각각 전체 제거율 상수 및 흡수율 상수이고, Co 는 초기에 외삽된 농도이다).
혈장 중의 약물의 최대 농도 (C max) 및 상응하는 시간 (T max) 을 두가지 상 이한 방식에 의해, 직접적으로 농도-시간 그래프 (C max experimental 및 T max experimental) 로부터 각 동물에 대해 측정하였고, 하기 방정식 (방정식 2 및 3) 을 사용하여 계산하였다 (C max calculated 및 T max calculated):
Figure 112006071794402-pct00003
(방정식 2)
Figure 112006071794402-pct00004
(방정식 3)
절대 생체이용율 (Fabsol) 을 다음 관계 (방정식 4) 를 사용하여 평가하였다:
Figure 112006071794402-pct00005
(방정식 4)
(식 중, D oral 및 D i.v. 는 각각 경구 및 I.V. 투여된 약물 양이다).
모든 약동학 매개 변수는 평균 AUC 0-∞ 로부터 계산된, 절대 생체이용율을 제외한 평균 ± 표준 편차로서 보고된다.
개별 AUC 값이 평균 ± 2 표준 편차 초과 또는 미만인 경우 데이타는 일탈되는 것으로 간주하였다. 상기에 기초해, 경구 용액 투여 후에 그리고 통계 분석 을 위해 한 마리의 양을 약동학 매개 변수 측정으로부터 배재하였다.
2 가지 경구 투여 형태에 대한 약동학 매개 변수의 비교를 다양성의 2-방식 분석 (2-방식 ANOVA) 으로 수행하였다. 분포를 표준화하기 위해 로그-변환 후, 각 계산된 매개 변수의 평균 값을 비교하였다. 결과는 5% 임계 수준에서 두드러지는 것으로 고려되었다 (p<0.05).
정맥내 투여 후 화합물 I 의 약동학
양에게 정맥내 용액의 단일 투여 (5 mg/kg) 후 수득된 평균 화합물 I 혈청 농도 대 시간 곡선은 도. 9a. 도 9b (평균 화합물 I 혈청 농도 대 시간 곡선의 대수) 에 보고되고, 화합물 I 약동학이 2-구획 모델을 따르는 것을 나타낸다. 상기 정맥내 투여 후 계산된 상이한 약동학 매개 변수를 표 10 에 나열한다.
표 10:
양에게 (n = 6) 정맥내 투여 (5 mg / kg ) 후 수득된 화합물 I 약동학 매개 변수 (평균 ± S.D.)
I.V. 용액
AUC 0-168h (㎍.h/ml) 858.11 ± 211.58
AUC 0-∞ (㎍.h/ml) 858.87 ± 212.08
Cl t (ml/h) 358.76 ± 67.47
Vd t (l) 8.18 ± 2.16
T 1/2β (h) 15.76 ± 2.34
분포 상은 짧으며 (약 30 분), 화합물 I 이 유기체 내에서 빠르게 분포되는 것을 나타낸다. 분포의 전체 부피는 작으며 (약 8 리터), 화합물 I 분포가 세포외부 유액에 제한될 수 있을 것이고, 조직으로의 화합물 I 확산이 매우 중요하지 는 않을 것이라는 것을 나타낸다. 반면, 화합물 I 생물학적 반감기는 길고 (약 15.5 h) 그래서, 약물 제거가 매우 느리다. 이것의 작은 분포 부피를 고려하면, 유기체 내의 축적은 저장 (예를 들어 지방으로) 이나, 단백질 또는 혈장의 다른 성분과의 강한 결합에 의해 영향을 받지 않을 것이다. 또한 전신 제거율을 계산하고, 약 358.5 ml/h 이다.
현탁액 및 용액의 경구 투여 후의 화합물 I 의 약동학
화합물 I 용액 및 현탁액의 단일 투여량의 경구 투여 (15 mg/kg) 후에 수득된 화합물 I 의 평균 혈청 농도 대 시간 프로파일을 도. 10a 에 제시한다. 평균 혈청 농도의 대수 변환 후, 경구 투여 후 약동학이 1-구획 모델을 따르는 것으로 보인다 (도. lOb). 약동학 매개 변수는 표 11 에 요약된다.
표 11:
양에게 경구 투여 (15 mg / kg ) 후에 수득된 화합물 I 약동학 매개 변수 (평균 ± S.D., F 제외)
경구 용액 (n=5) 현탁액 (n=6) p-값 (n=5)
AUC 0-168h (㎍.h/ml) 1848.66 ± 854.97 208.94 ± 103.82
AUC 0-∞ (㎍.h/ml) 2070.13 ± 943.79 214.65 ± 103.04 0.0035
C max experimental (㎍/ml) 51.84 ± 23.73 4.84 ± 1.95 0.0009
C max calculated (㎍/ml) 56.85 ± 24.67 5.34 ± 2.24 0.0010
T max experimental (h) 3.59 ± 1.52 12.34 ± 5.99 0.0094
T max calculated (h) 3.98 ± 0.57 10.42 ± 3.01 0.0046
Fabsol 0.80 0.08
용액의 투여 후 화합물 I 의 혈청 농도는 현탁액으로서 투여된 동일 투여량으로 수득된 것보다 확실히 더 높다. 용액으로 관찰되는 흡수 상 (약 4 h) 이 현탁액의 투여 후 달성되는 것 (약 10 h) 보다 더 짧다. 또한 용액 및 현탁액의 약동학 매개 변수는 뚜렷하게 상이하다 (p < 0.05) (표 11). 평균 화합물 I 혈청 피크 농도는 각각 용액 및 현탁액 투여 후 약 54 및 5 ㎍/ml 이다. 용액의 C max 는 현탁액의 것보다 약 10 배 더 높다. 현탁액으로 수득된 것 (약 11 h) 보다 3 배 더 빠른 T max 가 용액으로 수득된다 (약 3.8 h). AUC 값은 C max 값과 동일한 경향을 따른다: 용액의 투여 후 AUCs 는 현탁액의 투여 후의 것보다 약 10-배 더 높다. 따라서, I.V. 용액과 비교 후, 절대 생체이용율은 현탁액 (8%) 보다 용액 (80%) 이 훨씬 높다.
실시예 9
생체 내 실험 (혈관 신생의 억제)
복합체 화합물 I-시클로덱스트린의 잠재적인 효과를 연구하기 위해, 신생혈관증식의 모델을 사용하였다. 대동맥 고리를 자르고, 배양 배지 내에 두었다. 상기 배양 배지는 하기를 함유한다:
- 활성 원소가 없음
- 복합체 화합물 I-시클로덱스트린 (최종 농도 10-6M, 10-7M)
- DMSO 의 도움으로 DMSO 에 용해된 화합물 I (최종 농도 10-6, 10-7M).
매트릭스 메탈로프로테아제 억제제 화합물 I 의 부재하에, 신규 관의 형성 (혈관신생) 이 관찰된다. DMSO 중에 용해된 화합물 I 단독의 존재하에, 또는 시클로덱스트린 중의 포접 복합체의 형태로, 혈관신생이 뚜렷하게 억제된다.
실시예 10
천식 마우스 모델에서 알레르겐-유도된 기도 염증 및 기관지 과민반응성의 치료를 위한 화합물 I 및 HP β CD 를 함유하는 제형의 용도
물질
HP-β-CD (치환도 = 0.64) 는 Roquette (프랑스) 로부터 기원한다. 피로겐이 없는 인산 완충 식염수 (PBS) 를 Bio-Wittaker (Verviers, 벨기에) 로부터, 메타콜린을 Sigma-Aldrich (독일) 로부터 구입하였다. 모든 다른 물질은 분석 등급의 것이었다. 주사용 멸균수를 본 연구에 전반적으로 사용하였다. 멸균된 피로겐이 없고 등장성인 CD 용액을 20, 50 및 75 mM 로 제조하였다. 흡입용 시판되는 플루티카손 용액 (Flixotide® 1 mg/ml) 을 Glaxo-Smithkline (Genval, Belgium) 으로부터 구입하였다.
감작 , 알레르겐 노출 및 치료 프로토콜
화합물 I 의 복강내 주사에 의한 기도 염증의 조정을 연구하기 위해, 마우스를 0 및 7 일에 복막내로 주사된 알루민-흡수된 10 ㎍ 난백알부민 (aluminject, perbio, Erembodegem, 벨기에) 으로 감작시키고, 이어서 난백알부민 (OVA) 1% 또는 PBS 에어로졸에 21 내지 24 일까지 30 분 동안 노출시켰다. 복막내 주사를 OVA 흡입 전 30 분에 수행하였다. 상이한 주사 제형이 다음과 같았다: 크레모포르 10%-DMSO 10%-PBS 80%-화합물 I 30 mg/kg (현탁액); 크레모포르 10%-DMSO 10%-PBS 80%-화합물 13.75 mg/kg (용액); HPβCD 200 mM 화합물 I 7.5 mg/kg (용액); HPβCD 200 mM. 모든 결과를 OVA 로 감작되고, 복막내로 주사된 PBS 및 PBS 와 함께 OVA 에 노출된 마우스와 비교하였다. 흡입된 화합물 I 에 의한 기도 염증 조정을 연구하기 위해, 마우스를 상기 기재한 바와 같이 감작하였다. 단기 노출 접종 및 장기 노출 접종으로 언급되는 2 가지 프로토콜을 사용하였다. 단기 노출 접종에서, 마우스를 Plexiglas 노출 챔버 (30 x 20 x 15 cm) 에서 30 분 동안 21 내지 27 일까지 수용액 중의 활성 화합물의 0.03 및 0.3 mg/ml 농도에서 화합물 I-복합체의 에어로졸에 노출시켰다. 마우스를 23 내지 27 일까지 화합물 I 흡입 후 30 분, OVA 에어로졸에 노출시켰다. 소위 언급되는 장기 흡입 접종에서, 마우스를 수용액에서 HPβCD 와 복합체가 형성되는 화합물 I 의 에어로졸 0.03 및 0.3 mg/ml 의 농도에 30 분 동안 홀수 주 5 일, OVA 에어로졸에 11 주 동안 홀수 주 3 일 노출시켰다. 심지어 여러 주 동안에도 흡입이 수행되지 않았다.
다양한 진동 강도 및 환기 수준으로, 진동수가 2.4 MHz 인 초음파 분무기 SYSTAM (Systeme Assistance Medical, Le Ledat, 프랑스) 을 사용하여 에어로졸을 제조하였다. 진동 강도를 위치 6 으로 고정하였고, 환기 수준은 25 (υ 1/2) l/분이었다.
기도 반응성 측정
최종 알레르겐 노출 후 24 시간에, [Hamelmann, E., et al., Am. J Respir. Crit. Care Med. 156 (1997) 766-775] 에 의해 제안된 바와 같은 기압 체적변동기 록기를 사용하여 Penh 측정에 의해 기관지 과민반응성을 측정하였다. Penh 는 기준선, 및 증가하는 투여량 (25, 50, 75 및 100 mM) 의 메타콜린 (Mch) 의 흡입 후 5 분에 측정하였다.
기관지폐포 세척 ( BAL ) 및 조직학
기도 반응성의 측정 후 즉시, 마우스를 희생시키고, 이온화된 칼슘 및 마그네슘이 없으나, 0.05 mM 나트륨 EDTA 가 보충된 1 ml 의 PBS 를 기관 캐뉼러를 통해 4 번 서서히 주입하고, 완만한 수동 흡인에 의해 회수하였다. 회수된 기관지폐포 세척 유액 (BAL) 을 원심분리 (4 ℃, 1800 rpm 에서 10 분 동안) 하였다. 세포 펠렛을 2 번 세척하고, 마지막으로 1 ml 의 PBS 에 재현탁하였다. Thoma 챔버에서 총 세포수를 계산하고, Diff-Quick (Dade, 독일) 염색 후 표준 모양 범주를 사용하여, 세포원심분리 표본 상에서 400 개 이상에서 구별되는 세포 수를 계산하였다 (Cytospin 2; Cytospin, Shandon td., Runcorn, Cheshire, U.K.). BAL 후, 흉부를 열고, 왼쪽 주 기관지를 꽉 집어놓았다. 왼쪽 폐를 절제하고, 단백질 화학 및 mRNA 추출을 위해 액체 N2 중에서 즉시 동결시키는 반면, 오른쪽 폐를 조직학을 위해 조작하였다. 상기 기재한 바와 같이 (Cataldo, D.D., et al, Am. J. Pathol. 161 (2002) 491-498), 오른쪽 폐에 4% 파라포름알데하이드를 주입하고, 파라핀으로 함몰시켰다. 모든 엽으로부터의 5 ㎛ 두께의 섹션을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 주변기관지 침윤물의 정도를 염증 점수로 추정하였다. 슬라이드를 암호화하고, 주변기관지 염증을 그 밖에 기재된 재현가 능한 점수 시스템을 사용하여 블라인드 방식으로 등급을 매겼다 (Cataldo, D.D., et al., Am. J. Pathol. 161 (2002) 491-498). 점수화된 각 조직 섹션에 대해 범주 당 0 내지 3 의 값을 매겼다. 염증이 검출되지 않은 경우 0 의 값, 염증 세포로 간헐성 둘러싸이는 경우 1 의 값, 대부분의 기관지가 얇은 층의 (1 내지 5 개의 세포) 염증 세포에 의해 둘러싸이는 경우 2 의 값, 대부분의 기관지가 두꺼운 층 (>5 개의 세포) 의 염증 세포로 둘러싸이는 경우 3 의 값을 매겼다. 마우스 당 5-7 개의 랜덤 선택된 조직 섹션을 점수를 매겼으므로, 염증 점수는 동물 당 평균 값으로 표현될 수 있고, 그룹 간 비교할 수 있었다. 조직 호산구 침윤 점수로 언급되는, 특히 기관지 벽을 침윤하는 호산구의 양을 반영하는 다른 점수를 다음과 같이 측정하였다: 콩고 레드 염색 후, 마우스 당 7 개의 기관지를 연구하였다. 기도 벽 범위내에서 기관지주변의 호산구의 수를 세고, 상피세포 기저막의 주변을 측정하여, 결과를 호산구의 수/기저막의 mm 로 표현하였다. 왼쪽 폐를 액체 질소에서 스냅 동결시키고, Mikro-Dismembrator S (Braun Biotech International, Melsungen, 독일) 를 사용하여 분쇄하여, 추출물을 연구하기 전에 -80 ℃ 에 보관하였다. 신장을 절단하고, 파라핀 함몰시키고, 5 ㎛ 의 섹션을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 혈액을 심장 천공에 의해 샘플로 만들고, 혈청을 분석을 수행할 때까지 -80 ℃ 에서 보관하였다.
모든 생체 내 조작은 지방 수의사 윤리 위원회에 의해 승인되었다.
화합물 I 의 복강내 주사
화합물 I 의 복강내 주사 (용액 또는 침전물) 는 3.75 및 30 mg/kg 의 투여 량에서, BAL 중의 알레르겐-유도된 기도 호산구성 염증을 플라시보와 비교하여 저하시켰다 (도 4a). 또한 동일한 투여량에서, 주변기관지 염증 점수는 모든 시험된 제형의 효과와 동일하게 화합물 I 에 의해 뚜렷하게 저하되었다 (도 4b). 조직 호산구 침윤 점수는 7.5 및 25 mg/kg 의 투여량에서 화합물 I 의 복강내 주사에 의해 뚜렷하게 저하되었다.
화합물 I 및 화합물 I- HP β CD 복합체에 대한 흡입 노출
화합물 I 의 내재 활성을 첫째로 단기 노출에서 순수 DMSO 중의 화합물 I 40 mg/ml 의 용액을 사용하여 국소 활성 항염증제로서 평가하였다. DMSO 단독의 흡입과 비교하는 경우, 상기 제형의 흡입은 BAL 호산구 (p<0.005), 주변기관지 염증 점수 (p<0.01) 뿐 아니라, 기관지 과민반응성 (p<0.05) 의 뚜렷한 감소를 야기하였다.
단기 노출 프로토콜에서, 본 출원인들은 기도 염증 및 과민반응성에 대한 제형을 함유하는 HP-β-CD 화합물 I 복합체의 효과를 평가하였다. 제형을 함유하는 화합물 I-HPβCD 복합체의 흡입 효과를 참조 치료로서 사용되는 플라시보 (PBS) 또는 플루티카손 (1 mg/ml) 의 것들과 비교하였다. 화합물 I 을 함유하는 이러한 제형 0.03 및 0.3 mg/ml 의 투여량에서의 흡입은 플라시보와 비교하는 경우 플루티카손의 것에 비해 BAL 중의 호산구성 염증의 뚜렷한 감소를 유도하였다 (p<0.0001) (도 5a). 또한 주변기관지 염증 점수는 플라시보 (p<0.0001) 에 비해 저하되었으며 (도 5b), 조직 호산구 침윤 점수 (p<0.01) 도 저하되었다 (도 5c).
장기간 알레르겐 노출 후, 플루티카손의 것과 동일한 정도로 제형을 함유하는 화합물 I-HPβCD 의 흡입에 의한 처리 후 BAL 호산구가 뚜렷하게 감소하였다 (p<0.001) (도 6a). 또한 주변기관지 염증 점수는 제형을 함유하는 화합물 I-HPβCD 의 흡입뿐 아니라, 플루티카손 (p<0.0001) 에 의해서 뚜렷하게 감소하였다 (도 6b). 또한 조직 호산구 침윤 점수는 플루티카손 처리된 마우스 (p<0.01) 에 비교하여 화합물 I 흡입에 의한 처리 후 감소하였다 (도 6c).
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Claims (10)

  1. 트리옥소피리미딘 유도체 또는 그의 염 및 수용성 시클로덱스트린으로 형성되고, 상기 트리옥소피리미딘 유도체가 하기 화학식 (I) 에 의해 나타내지는 트리옥소피리미딘-시클로덱스트린 복합체:
    Figure 112006071794402-pct00006
    [식 중,
    R1 은 -S-, -O- 또는 -NH- 에 의해 한번 또는 여러번 임의로 삽입될 수 있는 C3-C20 알킬; 또는
    W-V 기이고, 여기서
    W 는 화학 결합 또는 페닐이고;
    V 는 페닐, 페닐옥시, 페닐티오, 페닐술피닐, 페닐술포닐 또는 페닐아미노 (페닐 부분은 할로겐, 히드록시, C1-C6-알킬, C1-C6-알콕시, C1-C6-알킬티오, C1-C6-알킬술피닐, C1-C6-알킬아미노, 시아노, 니트로 또는 C1-C6-알킬술포닐에 의해 한번 또는 여러번 치환 또는 미치환될 수 있음) 이고;
    R2 는 C1-C10 알킬 (알킬기는 히드록시 또는 아미노에 의해 한번 또는 2 번 치환 또는 미치환되고, -S-, -O- 또는 -NH- 에 의해 한번 또는 여러번 삽입될 수 있음);
    벤조일기 (할로겐, 히드록시, 니트로, C1-C6-알콕시, C1-C6-알킬아미노, C1-C6-알킬티오, C1-C6-알킬술피닐, C1-C6-알킬술포닐, 아미도술포닐, C1-C6-알킬아미도술포닐, 비스-C1-C6-알킬아미도술포닐에 의해 한번 또는 여러번 치환 또는 미치환될 수 있음);
    헤테로방향족 아실기; 또는
    페닐- 또는 헤테로아릴기 (할로겐, 히드록시, C1-C6-알콕시, C1-C6-알킬아미노, C1-C6-디알킬아미노, 시아노, C1-C6-알킬, C2-C6-알케닐, C2-C6-알키닐, C1-C6-아실, C1-C6-알킬티오, C1-C6-알킬술포닐, C1-C6-알킬술피닐, C1-C6-알킬아미노카르보닐, 아미노카르보닐, C1-C6-알킬아미도술포닐, 아미도술포닐, 비스-C1-C6-알킬아미도술포닐, 니트로, C1-C6-알콕시카르보닐, 카르복시에 의해 한번 또는 여러번 치환 또는 미치환될 수 있음) 임].
  2. 제 1 항에 있어서, L-라이신 또는 L-아르기닌이 항원보강제로서 첨가되는 트 리옥소피리미딘-시클로덱스트린 복합체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 트리옥소피리미딘 유도체가, 5-비페닐-4-일-5-[4-(4-니트로-페닐)-피페라진-1-일]피리미딘-2,4,6-트리온; 5-(4-페녹시-페닐)-5-(4-피리미딘-2-일-피페라진-1-일)-피리미딘-2,4,6-트리온; 5-[4-(4-클로로-페녹시)-페닐]-5-(4-피리미딘-2-일-피페라진-1-일)-피리미딘-2,4,6-트리온; 5-[4-(3,4-디클로로-페녹시)-페닐]-5-(4-피리미딘-2-일-피페라진-1-일)-피리미딘-2,4,6-트리온; 5-[4-(4-브로모-페녹시)-페닐]-5-(4-피리미딘-2-일-피페라진-1-일)-피리미딘-2,4,6-트리온 또는 그의 염인 트리옥소피리미딘-시클로덱스트린 복합체.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 수용성 시클로덱스트린이 β-시클로덱스트린인 트리옥소피리미딘-시클로덱스트린 복합체.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 수용성 시클로덱스트린이 히드록시프로필화 시클로덱스트린인 트리옥소피리미딘-시클로덱스트린 복합체.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 수용성 시클로덱스트린이 랜덤 메틸화 시클로덱스트린인 트리옥소피리미딘-시클로덱스트린 복합체.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 수용성 시클로덱스트린이 술포부틸-β-시클로덱스트린인 트리옥소피리미딘-시클로덱스트린 복합체.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 수용성 시클로덱스트린이 γ-시클로덱스트린인 트리옥소피리미딘-시클로덱스트린 복합체.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 트리옥소피리미딘-시클로덱스트린 복합체를 함유하는 약학적 제형.
  10. 제 9 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 첨가제를 함유하는 약학적 제형.
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