JPH03285692A - ヒト天然型腫瘍壊死因子の産生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ａ、産業上の利用分野 本発明は、ヒトから採取した血液を薬剤を加えてさらに
体外で培養することによりヒト腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏ
ｒ　　Ｎｅｃｒｏｓｔｓ　Ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ　
、以下これを’ＴＮＦ”と略称することがある）の産生
を促し、ＴＮＦを高濃度に含む血液成分（血漿や血清）
を入手し、ひいては天然にヒトの体で作られたＴＮＦを
入手する方法及びこうして得られた血液成分及び天然型
ＴＮＦに関するものである。

ｂ０発明の背景 ＴＮＦはマクロファージが産生ずるサイト力インの一種
で、カケクチンとも呼ばれ、極めて多様の生物学的活性
を有する蛋白質である。その活性は、広く体内の免疫系
の活性化に作用する。

ＴＮＦの産生は、マクロファージにエンドトキシンや細
菌菌体などが作用し１）、誘導されるが、インターリウ
キン１やガンマ・インクフエロンなどサイト力インによ
り調節されている２）、ＴＮＦはクラスエ主要組織適合
性抗原の特異的発現を促し３）、グラニュロザイトマク
ロファージコロニー刺激因子４）　、Ｉ　Ｌ−１５）の
産生を誘導し、リポ蛋白リパーゼ活性を減少させ６）、
腫瘍細胞７）及び血管内皮細胞８）を傷害し、内因性の
発熱因子９）として働くなど多くの活性を有している。

１）　　［Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｗｅｌｌ　ら、　Ｐ　
ｒｏｅ、　Ｎ　ａｔｅ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、　　７２．　３６６６（
１９７５）　　］２）　　［Ｒ、Ｐｈ１ｌｉｐら、　Ｎ
ａｔｕｒｅ　、　　３２３．８６（１９８６）］ ３）　　［Ｔ、　Ｃｏ１１ｔｎら、　ｐ　ｒｏｃ、　Ｎ
　ａ口、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、　　８３．　４４６（１９８６）　
　］４）　　［ｌ　、　ｌ−ｕら、　Ｊ、　　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、、　１４１．　２０１（１９８８）　　］ ５　）　　［Ｎ　ａｗｒｏｔｈら、　　Ｊ、ＥＸｐ、　
　Ｍｅｄ、１６３．　１３８３（１９８６）］ ６）［Ｂ、Ｂｅｕｔｌｅｒら、　　Ｎａｔｕｒｅ　　３
２０．　５８４（１９８７）］ ７）　　［＋−、Ｉ−ｌ　ｅｌｓｏｎら、　Ｎ　ａｔｕ
ｒｅ　　２５８．　７３１（１９７５）］ ８）　　［Ｎ、　５ａｔｏら、　Ｊ　、　Ｎａｔｌ、Ｃ
ａｎｃｅｒ　Ｉ　ｎｓｔ。

胆、１１１３（１９８６）］ ９）　　［Ｄ　１ｎａｒｅｌｌｏら、　　Ｊ、　　Ｅｘ
ｐ、　　Ｍｅｄ、　　１６３゜１４３３　（１９８６）
］ このように多様な活性を有するＴＮＦは、感染に対する
生体防御機構そして各種疾患にお【プる免疫系の作動に
おいて中心的役割を果たしている可能性が考えられ、そ
の血液等体液中の量の測定に大きな関心が寄せられてい
た。

ある種の病態において血液等体液中のＴＮＦ量が増加し
ているということは既に報告されはじめている。古川ら
は、川崎病において血清中ＴＮＦ量が増加しているのを
認め１０）　、［３ｅｕｔｌｅｒらはＴＮＦがエンドト
キシンショックのメデイエータであると報告した１１）
。またＢ　ｃｕｄｅｒｉらは原虫感染１２）　、ｊｙｊ
ａｕｒｙらは腎移植における拒絶反応１３）、Ｗ　ａａ
ｇｅらは髄膜炎１４）　、Ｂａｌｋｗｉｌｌらは悪性腫
瘍１５）で、ＴＮＦの血中レベルが上昇していることを
報告した。

１０）　　［Ｓ　、　Ｆ　ｕｒｕｋａｗａら、　ＣＩｉ
ｎ、　　Ｔ　ｍｍｕｎ。

Ｉｍｍｎｏｐａｔｈｏｌ、　４８．　２４７（１９８８
）　］１１）　　［Ｂ　、　　Ｂ　ｅｕｔｌｅｒら、　
　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３２０．　５８４（１９８６）
コ １２）　　［ｐ　、５ｃｕｄｅｒｉら、　　Ｔ　ｈｅ　
　Ｌ　ａｎｃｅｔ。

Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　１３．　　（１９８６）　ｐ、１３
６４］− １３）ＩＰ、Ｊ、Ｍａｕｒｙら、　　Ｊ、Ｅｘｐ、　　
Ｍｅｄ、、　　１６６゜１１３７　（１９８７）］ １４）　　［Ａ、　　Ｗａａｇｅら、　　Ｔｈｅ　　１
ａｎｃｅｔ、ＦｅｂｒｕａｒＶ１４、　　（１９８７）
Ｉ）、３５５　　］１５）　　［Ｆ　、　Ｒ、Ｂａｌｋ
ｗｉｌｌ　ら、　Ｔ　ｈｅ　　Ｌ　ａｎｃｅｔ。

（１９８７）ｉｔ、１２２９］ このようにＴＮＦは当初その強い抗腫瘍活性が注目され
、アミノ酸配列、遺伝子構造が解明され、いち早く組換
体が作製された。こうして得られた組換型のＴＮＦを用
いて様々な検討が行われた結果前述のような種々の生理
活性が認められ、その体内動態と病態との関連性が注目
されるに至った。

このような観点から組換型ＴＮＦを動物体に免疫して抗
体を入手すること及びモノクローナル抗体の作成が行わ
れ、これら抗体を用いてＴＮＦの免疫学的測定法が開発
されてきた。免疫学的測定法は、ＴＮＦ分子と抗体との
化学当量論的結合に基づく定量的測定法であるため、い
わゆるパイ副アッセイ法のような、夾雑物による影響や
、ＴＮ「の失活による測定値の変動といった問題の生じ
４− ない方法としてメリットがあった。したがって組換型Ｔ
ＮＦの定量や投与後の面中量の測定において、これら免
疫学的測定法は有意義であった。しかしながら、−歩進
めてこれら免疫学的測定法を血中に天然に含まれるＴＮ
Ｆを定量し病態との関連性をみようとした時−つの問題
が生じた。定量の基準となるべき、Ｔ’ＮＦを天然に大
量に含ｌυだ血液成分がないことであった。便宜的には
ＴＮＦを極微量にしか含まない血液成分中に組換型ＴＮ
Ｆを添加して代替することが行なわれてきた。しかしな
がら後から別個に添加したＴＮＦが、もともと天然に血
中に含有されるＴＮＦと同一の存在様式を有するいう保
証はない。ましてその添加したＴＮＦが組換体であった
時、天然に血中含有されるＴＮＦと同様に定量測定され
うるという可能性はさらに小さいと考えられた。

また、一般にリンパ球等から天然型の生理活性物質を産
生させる際には、リンパ球等の生理活性物質の産生能力
を保つため出来るだけ早くリンパ球等を血液から分離し
培養することが望ましいとされていた。このように分離
したリンパ球等を培地中で培養してＴＮＦを得ることも
出来るが、組ｆ！ｉｆ！ＴＮＦのように大量に得ること
は不可能でありまた、培地中に分泌されたＴＮＦが血液
中に分泌されたＴＮＦと物性及び構造が同一であるとい
う保訂はない。

Ｃ１発明の目的 したがって本発明は、前述のような技術的価値を有する
天然型ＴＮＦを産生させる方法、該方法により得られた
全血液を精製し天然型ＴＮＦを製造する方法、該ＴＮＦ
を含有する血漿成分の製造方法及び該血漿成分より精製
された天然型ＴＮＦを提供することを目的とする。

ｄ０発明の構成 本発明者らはこの基準となるべき天然にＴＮＦを高濃度
に含んだ血液成分を入手すべく検討を行なった。当初様
々な病態の患者検体を検索した。

しかしながらＴＮＦの血中温度が高い検体は比較的まれ
で、容易に入手することはできない上に均のロットを大
量に調製することは極めて困難であった。

この為、各種疾患患者からすでに高濃度にＴＮＦを含む
血液成分を入手するのではなく、健常者ボランティアよ
り血液を採取し、これを分離することなく全面のまま培
養することにより、血液中の細胞よりＴＮＦの産生放出
を促し、結果として高濃度にＴＮＦを含有する血液成分
を入手しうろことを見い出した。ざらにこの方法により
天然に血中に分泌され、ＴＮＦが得られることをも認め
本発明に至った。一般にリンパ球等から生理活性物質を
産生さぜるには、リンパ球等の生理活性物質産生能力を
保つため出来るだり早くリンパ球等を血液から分離し培
養することが望ましいとされていたが、本発明において
は意外にも全血のまま培養することによりＴＮＦが大量
に産生きせる点を特徴とする。

すなわち本発明は下記の発明を包含する。

１、　採取したヒト全血液を抗凝固剤及び刺激剤の存在
下で培養することを特徴とする腫瘍壊死因子の産生方法
。

７− ２、　上記の方法により得られたヒト全血液を精製し腫
瘍壊死因子を製造する方法。

３、　上記の方法により得られたヒト全血液から細胞成
分を除くことによる腫瘍壊死因子を含有する血漿成分の
製造方法。

４、　上記の血漿成分より精製した腫瘍壊死因子。

以下、本発明についてさらに詳細に説明する。

〈ヒト血液の採取〉 血液は通常行なわれる静脈血の採取方法を行えばよい。

ただし採取された血液はすみやかに必要充分量のクエン
酸ナトリウムやヘパリンなどの抗血液凝固剤と混和され
る必要がある。採取された血液は無菌性をできるだけ保
持した状態で保存し、できるだけすみやかに培養に移行
するのが望ましい。

く血液の培養〉 得られた血液はそのまま適当な培養器に移し適当な加温
インキュベータにて培養を開始する。この際温度は３７
℃前後に保つことが望ましい。この培養を開始する際に
一般によく知られたリンパ球８ とマクロファージに対する刺激物質を種々の濃度で添加
づ−ることにより、培養中に産生放出されるＴＮＦの量
は著しく増加する。刺激物質としては、例えば、各種細
菌の死菌体、細胞壁及びその構成成分、リポポリサッカ
ライド、及びそれらを用いた製剤、その他の免疫賦活作
用を有するとされる薬剤、ポリＩ：Ｃ，カラギーナン、
ビタミンＡ。

レチノイン酸、ビタミンＤ、フＡルボールエステル類、
　Ａ２３１８７などのカルシウムイオノフオア、さらに
リンフォ力イン、ザイトカイン類くただしＴＮＦ−α、
βは除く）など多種多様なものが例示されつるが、これ
らに限られるものではない。

またこれらの混合物でもよい。

添加し７ｊ物質による血液中に放出されたＴＮＦの増量
効果を検討して、添加すべぎ物質の種類と量及び組合せ
、さらに培養時間を個々のケースで規定することができ
る。いづれにせよ、何らかのＩ！ｌＪ激により血液中に
含まれるｍ　ＩＪ２１を活性化し、ＴＮＦの産生を結果
的に促すことが高濃度にＴＮＦを含む血液成分を寄る上
で必須である。

　１０ 培養終了後は、遠心操作やその他の方法で、細胞成分と
液性成分を分離し、液性成分を採取する。

これをそのままＴＮＦ含有血漿として保存してもよい。

またプロタミンなどの抗血液凝固剤の作用を打消す物質
を必要充分示加えて、血液凝固を促し自消成分を得るこ
とも可能である。

このようにして得られた血液成分はただちにＴＮＦの分
離精製に用いるのが望ましい。保存する場合には、すみ
やかに凍結して保存することが望ましい。

＜ＴＮＦの分離、精製〉 ＴＮＦの分離、精製は、すでに培養細胞から放出された
ＴＮＦの培養液からの分離精製法や、大腸菌濁液からの
組換型ＴＮＦの分離、精製法などについて多くの成帯や
論文に報告されている方法に準拠して行なえばよい。そ
れらの報告の例としては、Ａｇｇａｒｗａｌ　Ｂ　、　
ＢらＪ　、　Ｂ　ｉｏｌ、ｃｈｅｍ、　２６０２３４５
−２３５４（１９８５）　、　５ｈｉｒａｉ　Ｔ、らＮ
ａｔｕｒｅユ１３８０１−８０６　　（１９８５）など
が挙げられる。またすでに報告されているＴＮＦの物性
に基づいて、ＨＰ　Ｌ　Ｃや等電点電気泳動、クロマト
フオーカシングなどの手法を用いるこもできる。あるい
はＴＮ「に対する抗体を利用してアフィニティークロマ
トグラフフィーなどの方法を用いて精製することも可能
である。

ｅ１発明の効果 本発明によれば天然にヒト体内で生産されたＴＮＦを、
ヒト血液中に本来存在している、あるがままの形で高濃
度に含んだ血液成分の入手が可能になり、またここから
天然のＴＮＦが入手可能となった。これらを用いること
により、従来から行なわれているＴＮＦの測定において
、ヒ１〜体液中のＴＮＦの測定において標準物質を与え
ることが可能となった。またこの天然型ＴＮＦは抗腫瘍
活性などを利用した組換型ＴＮＦの医薬品としての開発
においても、本来のＴＮＦの特性を与えるものとして標
準品を与えるものである。さらにこの天然型のＴＮＦは
人体にあるがままのＴＮＦとしてその医薬品として組換
型ＴＮＦでは代替しえない価値を与えるものである。

　１　− ｆ、実施例 以下、実施例を掲げて、本発明について詳細に説明する
が、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

（ＴＮＦを高濃度含有する血液の製造）健常人ボランテ
ィアより静脈血を約４５ｄ、あらかじめヘパリン５　、
０００　ＬＪの入ったシリンジにとり、ゆっくりと混和
した。これを一部２−づつ２４ウエルプレー１〜（Ｃｏ
ｓｔａｒ　）に分注し、また一部は７５ｃｔＪ培養フラ
スコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に分注した。そして大腸菌０５
５　：　８５株由来のりポポリサッカライド（［）　１
ｆｃｏ）を最終濃度０．１．１０μび／ｄとなるように
添加して、３７℃で約５時間静置した。これを遠心管に
移し３０００回転で２５分間室温で遠心し、上清を分注
して一４０〜８０℃でただちに凍結して保存した （ＴＮＦ含有量の測定） 得られた血漿画分中のＴＮＦ含有量の測定は、組換型Ｔ
ＮＦ−αを標準物質として、先に出願された特許（特願
平１−１４６６５７号：平成１年６月１２日１２− 出願：発明の名称”　Ｔ　Ｎ　Ｆ−αの測定方法、キッ
ト及び診断方法″）に記載の方法によって行なった。結
果は表１の如く添加したりポポリサツカライドの吊に依
存して含有ＴＮ　Ｆｆｉ）が増加した。

表１　リポポリザラカライド添加培養血漿中のＴＮＦＩ
Ｉ度（ＴＮＦ活性の測定） ＴＮＦ活性の測定はマウスＬ細胞に対する細胞障害性を
見ルｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性測定法［Ｒｕｆｆ　、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　１２６２３５（１９８１）　］に
準じて行なった。

すなわち得られた血漿画分を順次培地で希釈した試料１
００μ隻と、４　Ｘ　１０５個／ｄの濃度のマウス１−
−９２９繊維芽細胞（ＡＴＣＣＣＣ＋−９２９）懸濁液
１００μ隻を、９６大の組織培養用マイクロプレート（
］−スター）内で混合した。なおこの際に、最終′ｆａ
度１μｇ／ｌｄのアクチノマイシンＤ（コスメゲン、萬
有製薬）を添加しておく。培地としては、５％（ｖｏｌ
／ｖｏｌ　）のウシ胎児血清を含むイーグルのミニマム
・■ツセンシャル培地（日永製薬）を用いた。上記マイ
クロプレー１〜を、５％炭酸ガスを含む空気中、３７°
Ｃで１８〜２０時間培養した後、クリスタル・バイオレ
ット溶液［５％（ｖｏｌ／■０１）メタノール水溶液に
、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ　）のクリスタル・バイオレ
ットを溶解させたちの］を用いて生細胞を染色した。余
分なりリスタル・バイオレットを洗い流し乾燥した後、
残ったクリスタル・バイオレットを１００μρの０，５
％ＳＤＳ水溶液で抽出し、その５９５ｎｍにおける吸光
度をＥＬ　Ｉ　Ｓ△アナライザー（東洋測器、ＥＴＹ−
９６型）で測定した。この吸光度は、生き残った細胞数
に比例する。そこで、培地のみを加えた対照の吸光度の
５０％の値に相当する試料の希釈倍率をグラフ（たとえ
ば第１図）によって求め、その希釈倍率をユニットと定
義する。

第１図より血漿画分中のＴＮＦ活性は５．８×１０３Ｕ
／ｄと求められ、前記の如く求めたＴＮＦ濃度１２．８
ｎ（］／ｄより、比活性は４．５ｘ　１０８Ｕ　／　ｍ
９と算出された。

また本ＴＮＦ活性は、特開平２−１５５２号公報（特願
昭６３−１００１８６号：昭和６３年４月２５日出願：
発明の名称゛被検者の病態の判定のための検出方法。

モノクローナル抗体および検出キット″）に記載のＴ　
Ｎ　Ｆに対するマウスモノクローナル抗体１１Ｄ７Ｇ４
０．１μｇ／ｄと共存さぜることにより、その活性を完
全に中和されることから、本血漿画分中に存在するＴＮ
Ｆに由来することが明らかとなった。

（血漿中ＴＮＦの精製〉 このＴＮＦを含む血漿から、高速液体クロマトグラフィ
ーを用いてＴＮＦ−αの精製を行なった。

ゲルロ適用カラムＴＳＫ　　Ｇ３０００ＳＷ　（７，５
ｘ６０ＯＮｎ、　Ｔ　ＯＳ　Ｏ）を用いた。０．４Ｍ　
　ＮａＣＲ。

５ ０．１％アジ化す［−リウムを含む１０　ｍＭリン酸ナ
トリウムバッファー（１）ｌ−１７，５）でゲルを平衡
化し試料を添加して、流出液を逐次分画した。この分画
の２８０ｎｍの波長にお（プる吸光度を測定し、また同
じ分画中のＴＮ　Ｆｌｉｔ度を前記の先に出願された特
許出願（特願平１−１４６６５７号：平成１年６月１２
日出願：発明の名称”　Ｔ　Ｎ　Ｆ−αの測定方法、キ
ラ１〜及び診断方法″）に記載の方法によって測定した
。結果は第２図の如り３４キロダルトンの分子量に相当
する分画に、Ｔ　Ｎ　Ｆは単一のピークとして精製され
た。

（ＴＮＦ測定における標準物質どしての利用）前記のＴ
ＮＦを含む血漿を順次バッファーで希釈して、前記の方
法でＴＮＦを測定した。その結果は第３図の如く、組換
型ＴＮＦの希釈曲線と全く同様の希釈曲線を得ることが
できた。このことはこの血漿もしくは精製ＴＮＦが、Ｔ
ＮＦ測定特定時準物質として利用できることを示してい
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は血漿中に含まれる王Ｎ［の活性を測定１６− した結果を、第２図はＴＳＫ　　Ｇ３０００ＳＷカラム
による同血漿の分画の吸光度とＴＮＦ濃度のフラクショ
ンパターンをそれぞれ示したものである。 第３図は、組換型ＴＮＦと同血漿の順次希釈液中のＴＮ
　Ｆｌｔ１度の測定結果、すなわち希釈曲線を示したも
のである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、採取したヒト全血液を抗凝固剤及び刺激剤の存在下
   で、培養することを特徴とする腫瘍壊死因子の産生方法
   。 ２、請求項１に記載の方法により得られたヒト全血液を
   精製し腫瘍壊死因子を製造する方法。 ３、請求項１に記載の方法により得られたヒト全血液か
   ら細胞成分を除くことによる腫瘍壊死因子を含有する血
   漿成分の製造方法。 ４、請求項３に記載の血漿成分より精製した腫瘍壊死因
   子。