DK175828B1

DK175828B1 - CMV-relateret polypeptid, fremgangsmåde og diagnostisk system i form af et prövesæt til afprövning for anti-EBNA-antistoffer

Info

Publication number: DK175828B1
Application number: DK199100211A
Authority: DK
Inventors: Richard S Smith; Gary Rhodes
Original assignee: Scripps Clinic Res
Priority date: 1988-08-09
Filing date: 1991-02-07
Publication date: 2005-03-14
Also published as: DE68925819T2; PT91397B; ATE134648T1; DE68925819D1; WO1990001495A1; EP0428629B1; EP0428629A4; US5717065A; FI102381B; DK21191A; FI910587A0; EP0428629A1; ES2018909A6; CA1340446C; GR890100501A; AU643188B2; NO910479L; NO910479D0; DK21191D0; FI102381B1

Description

DK 175828 B1 i

Teknisk område.

Den foreliggende opfindelse angår et CMV-relateret polypeptid, samt en fremgangsmåde og et diagnostisk system i form af et prøvesæt til afprøvning for anti-EBNA-antistof-5 fer.

Opfindelsens baggrund.

Epstein-Barr-virus (EBV) er et medlem af herpesvirus-familien og er årsagen til smitsom mononucleose (IM) hos 10 mennesker. EBV har også været impliceret i pathogenesen af Burkitt's lymphoma, nasopharyngealt carcinoma og B-lymphocyt-neoplasmer, som udvikler sig hos immunoundertrykte patienter.

Udførligt bevismateriale har også angivet en mulig rolle for dette virus ved human autoimmunsygdom, såsom rheumatoid 15 arthritis og Sjogren's syndrom.

EBV er yderst almindelig i miljøet og inficerer 80--100% af individerne verden over. Den indledende eller primære infektion kan være akut eller subklinisk. Dette efterfølges af en lang periode, i hvilken EBV-infektionen er 20 latent i de B-lymphocyter, som er til stede i det cirkulerende blod, lymfeknuder og milt.

Latens er den proces, ved hvilken et virus er til stede intracellulært i en ikke-eksprimeret eller delvist eksprimeret tilstand. Denne latens kan reaktiveres. Selv. om 25 de værtsfaktorer, som kontrollerer latens in vivo, kun er dårligt kendte, er der noget bevismateriale, som antyder, at svigt af en eller flere immunmekanismer er en vigtig faktor.

Cytotoksiske og undertrykkende T-celleelementer i 30 immunreaktionen imod EBV er blevet rapporteret som værende meget vigtige til undertrykkelse af akut infektion af EBV ved IM. De er også vigtige ved forhindring af den ukontrol- ;

lerede vækst af B-lymphocyter, som er latent inficeret med I

i EBV.

3 5 Svigt hos T-celleundertrykkelsesmekanismer antages at være vigtig til tilladelse af udbrud af afrikansk Burkitt- t DK 175828 B1 2 > -lymphoma, nasopharyngealt carcinoma og B-cellelymphomaer, ' som udvikler sig som en konsekvens af immunoundertrykkende : terapi, som er anvendt til forhindring af afstødning af | organtransplantater, og lymphomaer, som udvikler sig under 5 behandlinger af forskellige autoimmuntilstande, jfr. Epstein og Achong udg., "The Epstein-Barr Virus.", Spring-Verlag,

Berlin, Heidelberg (1970); og Crawford et al., Lancet, 1355 (1980). Desuden antages det, at svigt hos disse T-celleme-kanismer og deraf følgende overvækst af EBV-inficerede lym- 10 phocyter spiller en rolle ved rheumatoid arthritis, jfr.

Slaughter et al., J. Exp. Med., 148, 1429 (1978); Depper et al., J. Immunology, 127, 1899 (1981); Tosato et al., N. Engl.

J. Med. 305, 1238 (1981) .

De serologiske og cellemedierede immunreaktioner, 15 som følger efter primær infektion af EBV, er godt dokumenteret og genspejler værtens reaktion på de virusantigener, som eksprimeres under forløbet af infektionen. Profilen af disse reaktioner samt påvisningen af antigenerne i væv bliver i i stigende grad værdifuld ved diagnosen af EBV-associerede 20 sygdomme.

Klassisk påvises den primære infektion ved hjælp af antistof mod viruscapsidantigenet (VCA), og bedringsfasen bemærkes ved udviklingen af antistoffer mod de EBV-kodede kerneantigener (EBNA), jfr. Henle et al., Hum. Pathol., 5, 25 551-565 (1974) . EBNA-1 (i nærværende beskrivelse også under tiden betegnet EBNA), det første kerneantigen, som er blevet erkendt, er blevet identificeret som et protein på fra 65.000 til 85.000 kilodalton (kD) ved immunopletningsteknikken, jfr. Strand et al., J. Virol., 38, 990 (1981); Hennessey et 30 al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 5665-5669 (1983); Billings et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 7104-7108 (1983) .

Størrelsen af EBNA-1-proteinet varierer fra 65.000 til 85.000 i forskellige B-cellelinier, idet ca. 77 kD er 35 typisk. Molekylets størrelse har korrelation med variation i længden af IR-3-regionen i EBV-DNA, jfr. Hennessey et al., 3 DK 175828 B1

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 5665-5669 (1983). IR-3-re-gionen koder gentaget glycin-alanin-sekvens, som er blevet karakteriseret som værende hovedepitopen i EBNA-l-proteinet, jfr. Billings et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 7104-5 -7108 (1983).

Selv om de sædvanligvis anvendte afprøvninger sonderer VCA og derefter EBNA-l, er EBNA-l det tidligste, EBV-as-socierede antigen, som kan påvises efter infektion. EBNA er blevet påvist i kernen hos latent inficerede, væksttransfor-10 merede B-lymphocyter. EBNA er også blevet påvist i kernerne af afrikansk Burkitt-tumorlymphoblaster og anaplastiske, nasopharyngeale carcinomaceller.

Koncentrationen af EBNA i cellekerner i EBV-inficerede B-lymphocyter svinger under forskellige faser af cellens 15 reproduktionscyklus. Derfor antages det, at EBNA cyclisk syntetiseres og sønderdeles. Som et resultat af en sådan sønderdeling traverserer proteinfragmenter (polypeptider) af EBNA cellecytoplasmaet og antages at eksistere eller være eksprimeret på ydermembranen. Specifikke EBNA-sønderdelings-20 proteiner er imidlertid ikke blevet identificeret indtil nu.

Det antages, at EBNA-sønderdel i ngspo lypeptider, medens de er i eller på celleydermembranen, udgør en signifikant stimulans for værtens T-lymphocyter og initierer den immunreaktion, som resulterer i produktionen af anti-EBNA-anti-25 stoffer. Det antages også, at den specifikke T-cellereaktion på B-celler, som eksprimerer EBNA-sønderdelingspolypeptider på deres overflader, eventuelt kan bidrage til skabelsen af cytotoksiske og undertrykkende T-celler, som er vigtige ved begrænsning af væksten af EBNA-holdige (EBV-inficerede) 30 B-lymphocyter.

Derfor er afprøvninger for tilstedeværelsen af både EBNA og anti-EBNA-antistoffer af vigtighed i adskillige, gængse, kliniske situationer. Desuden ville en vaccine imod EBV-inficerede B-lymphocyter også være af klinisk vigtighed.

35 Anti-EBNA-antistoffer afprøves typisk ved anvendelse af den langsommelige anti-komplement-immunofluorescensteknik DK 175828 B1 4 (ACIF) , jfr. Reedman et al., Int. J. Cancer, 11, 499-520 (1973) . Denne afprøvning indebærer, at EBV-transformerede, humane B-celler fikseres til et mikroskopobjektglas- Forskellige fortyndinger af en patients serum sættes derefter 5 til de fikserede celler. Da antikomplementære sera kan give falsk-negative reaktioner eller prozoner, når de blandes med komplementet (en totrinsproces) , er det essentielt at belaste forsøgscelleudtværingerne i rækkefølge med serum, komplement og antikomplement-fluorescens-konjugatet (en 10 tretrinsproces).

Der er adskillige problemer med denne afprøvning.

Disse omfatter den kendsgerning, at afprøvningen er forholdsvis ufølsom og kræver forstærkning medieret gennem komplement. Desuden er denne afprøvning ikke helt specifik, 15 og den kan ikke fortolkes hos patienter, hvis serum indeholder antistoffer mod pattedyrcellekerner. Endvidere er kvan-titave resultater opnået ved anvendelse af en anti-komplement -immunofluorescensafprøvning vanskelige at reproducere.

Som en konsekvens af disse og andre grunde har afprøvninger 20 for anti-EBNA-antistoffer i almindelighed været begrænset til nogle få, specialiserede laboratorier.

Ovennævnte vanskeligheder ved afprøvning for anti--EBNA-antistoffer stammer fra manglen på relativt rent EBNA.

Rensning af EBNA fra pattedyrcellevævskulturer er kompleks 25 på grund af antigenets lave koncentration og polymorphologi.

Selv om det er lettere og mindre kostbart at anvende hele celler, som eksprimerer EBNA, som ved den her omhandlede teknik, er problemerne med specificitet og reproducerbarhed et direkte resultat af anvendelse af hele celler.

30 Det er også blevet vist, at syntetiske peptider in deholdende dele af glycin-alanin-EBNA-l-regionen er reaktive med sera fra patienter med EBV-IM, jfr. Rhodes et al., i Herpesvirus, R. Rapp udg. , Alan R. Liss, New York, side 487-496 (1984); Rhodes et al., J. Immunology, 134, 211-216 35 (1985); Smith et al., J. Infec. Dis., 154, 885-889 (1986); og Geltosky et al., J. Clin. Lab. Analysis, 1, 153-162 5 DK 175828 B1 (1987). Som vist i US patentskrift nr. 4.654.419 og derefter andetsteds kan det peptid, som betegnes P62, anvendes ved en ELISA-afprøvning til serologisk at skelne den akutte fase af EBV-IM fra bedringsfasen og helbredelsesfasen af 5 IM, jfr. Smith et al., J. Infec. Dis., 154, 885-889 (1986); og Geltosky et al., J. Clin. Lab. Analysis, 1, 153-162 (1987)

Den akutte fase af sygdommen kan påvises ved tilsynekomsten af IgM-antistoffer mod dette peptid. Under bed-10 ringsfasen falder IgM-antistoftiteren, og IgG-antistof kan påvises, jfr. Smith et al., J. Infec. Dis., 154, 885-889 (1986). Patienter med en lang efterinfektion har IgG-antistof fer mod peptidet som den overvejende immunoglobulinklas-se.

15 Antistofproduktion imod EBNA-1-proteinen er højst usædvanlig. IgM-antistoffer, som erkender glycin-alanin-pep-tidet P62, påvises i løbet af én dag, efter at sygdommen er brudt ud, jfr. Smith et al., J. Infec. Dis., 154, 885-889 (1986). Ved analyse ved immunopletning har det vist sig, at 20 disse IgM-antistoffer erkender EBNA-1-proteinet samt mere end et dusin normale celleproteiner, jfr. Rhodes et al., J.

Exp. Med., 165, 1026-1040 (1987). Antistofbinding til EBNA-1 og til autoantigenerne kan inhiberes af peptidet P62. Derved tilskynder akut EBV-infektion syntesen -af autoantistoffer, 25 som synes at dele en epitop med relation til glycin-alanin--gentagelsesregionen i EBNA-1.

I modsætning hertil viser IgG-antistoffer mod EBNA-1 sig ikke indtil adskillige måneder efter sygdomsudbrudet. IgG-anti-peptid-P62-antistoffer målt ved ELISA-afprøvningen, 30 jfr. Smith et al. J. Infec. Dis., 154, 885-889 (1986); og Geltosky et al., J. Clin. Lab. Analysis, 1, 153-162 (1987), anti-EBNA-l-antistoffer målt ved anti-komplement-standard-immunofluorescensen, jfr. Reedman et al., Int. J. Cancer, 11, 499-520 (1973), og IgG-antistoffer mod EBNA-1-proteinet 35 målt ved immunopletning viser sig alle sideløbende. Disse IgG-antistof fer kan også inhiberes af peptidet P62, men er DK 175828 B1 6 specifikke for EBNA-1-proteinet og reagerer ikke mere med celle-autoantigenerne, jfr. Rumpold et al., J. Immunol., 138, 593-599 (1987); Rhodes et al., J. Exp. Med., 165, 1026--1040 (1987); Diliner et al., Proc. Natl. , Acad. Sci. USA, 5 82, 4652-4656 (1984) .

Cytomegalovirus (CMV) er et andet medlem af herpes-virusfamilien. CMV-infektioner i immunokompetente personer er sædvanligvis uden signifikante komplikationer og ligner typisk EBV-forårsaget mononucleose.

10 Diagnose af en CMV-infektion hos en patient med I.M- -agtige symptomer kan fastslås ved virusisolering fra vas-culære læsioner. Antistoffer produceret som reaktion på en CMV-infektion kan påvises ved neutralisations- (NT), komplementfiksering- (CF) immunofluorescens- og blodpladeaggluti-15 neringsmetoder (PA), jfr. Weller, N. Engl. J. Med., 285, 203 (1971) .

CMV-infektioner er også latente, og sygdommen viser sig hos patienter på immunoundertrykkende terapi og hos dem, som er udsat for lejlighedsvise infektioner. CMV-infek-20 tion er blevet den mest almindelige infektion hos patienter, som får allogen knoglemarvstransplantation, og er en vigtig determinant for succes eller svigt hos transplantationsprocessen, jfr. Neiman et al., J. Infect. Dis., 136, 754 (1977).

Blandt voksne mennesker, som får immunoundertrykkende 25 terapi efter nyrehomotransplantation, udvikler over 90% aktive cytomegalovirusantistoffer. Ca. halvdelen af de seronegative patienter bliver efterfølgende inficeret på immunoundertrykkende terapi. Seronegative recipienter, som får en nyre af en seropositiv donor, udvikler næsten altid 30 en infektion efter operation og udvikler sandsynligvis symptomer på infektionen.

For immunokompetente personer, dvs. personer, som ikke indtager immunoundertrykkende medikamenter, og personer, som er fri for immunokompromitterende sygdomme, såsom ARC 35 og AIDS, findes CMV-mononucleoseinfektioner (CMV-IM) typisk hos børn (fra fødslen til en alder på ca. 2 år) og hos vok- 7 DK 175828 B1 sne, dvs. personer, som er ældre end fra ca. 30 til ca. 35 år. Smitsom mononucleose forårsaget af EBV (EBV-IM) findes almindeligvis hos personer i teenagealderen op til en alder på ca. 25 år, især hos personer med en alder fra ca. 15 til 5 ca. 25 år.

Patienter med begge sygdomme udviser atypisk lym-phocytose, pharyngeale symptomer, unormale leverfunktionsprøver, splenomegali og feber. Sera fra CMV-IM-patienter er heterofil-negative, medens sera fra de fleste EBV-IM-patien-10 ter er heterofil-positive.

Genetisk konstruktion og syntetisk polypeptidteknologi har i den senere tid givet løsninger på problemet med fremstilling af store mænger af protein og polypeptidantigener.

Begge teknikformer er imidlertid kun effektive, hvis amino-15 syrerestsekvensen i det native protein er kendt.

Aminosyrerestsekvensen i et naturligt protein kan bestemmes ud fra selve proteinet, men dette er ofte vanskeligt. Den gennucleotidsekvens, som koder for proteinet, kan også afsløre proteinets aminosyrerestsekvens. Alle DNA-se-20 kvenser har imidlertid tre mulige læserammer, som hver især giver et forskelligt protein. Derfor skal den korrekte læseramme være kendt for at aflede den korrekte aminosyrerestsekvens i et protein ud fra dets gen.

Den korrekte læseramme i en DNA-sekvens, som koder 25 for et protein, og derfor proteinets aminosyrerestsekvens, kan bestemmes ved anvendelse af antistoffer. Denne strategi indebærer, at der fremstilles en række af proteinfragmenter eller polypeptider, hvis aminosyrerestsekvenser svarer til de sekvenser, som opnås ud fra de tre mulige genprodukter.

30 De proteinfragmenter eller polypeptider, som frembringer antistoffer, som immunoreagerer med genets naturlige proteinprodukt, identificerer derved genets korrekte læseramme.

Hvis antistoffer mod det naturlige protein erkender de fremstillede proteinfragmenter eller polypeptider, er relationen 35 mellem gen og protein omvendt ligeledes fastslået.

Heller et al., J. Virol., 44, 311-320 (1982), har DK 175828 B1 8 rapporteret DNA-sekvensen for en del af EBV-genomet, som har vist sig at indeholde en intern region, betegnet IR3, bestående af direkte gentagelser af en hexanucleotid- og to nonanucleotidsekvenser. De har citeret bevismateriale, som 5 antyder, at den sekvens, som omgiver og omfatter IR3, indeholder det gen, som koder for EBNA. Da det imidlertid ikke var kendt, hvilken af de tre mulige DNA-sekvenslæserammer, som er blevet translateret, har Heller et al., supra, ikke været i stand til definitivt at aflede aminosyresekvensen 10 for det mulige EBNA-protein.

I september 1983 har Hennessey og Kieff, Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 80, 5665-5669 (1983), rapporteret fastlæggelsen af den naturlige læseramme for den EBV-DNA-sekvens, som er beskrevet af Heller et al., supra. Essentielt har de 15 isoleret IR3-DNA, spaltet det i små, tilfældige stykker og indsat stykkerne i lacZ-genet i en E. coli-ekspressionsvektor, således at alle tre EBNA-genlæserammer er blevet eks-primeret, hver især i en forskellig klon. lacZ-genet koder for β-galactosidase, et bakterieenzym. IR3-lacZ-genfusions-20 produktet eksprimeres i E. coli som et fusionsprotein med IR3-proteinsekvensen indsat mellem aminosyrerne 7 og 9 (8 er udeladt ved konstruktionsprocessen) i S-galactosidasepro-teinmolekylet.

Hennessy og Kieff har identificeret en IR3-lacZ-gen-25 fusion, som eksprimerer IR3-DNA i dens naturlige læseramme, ved screening for fusionsproteiner, som erkendes af anti--EBNA-positive, humane sera. Et således identificeret plasmid har fået betegnelsen pKH182-44.

For at bekræfte, at det protein, som eksprimeres af 30 pKH182-44, indeholder EBNA-specifikke antigendeterminanter, har Hennessy og Kieff, supra, frembragt antisera i kaniner imod cyanogenbromidspaltet (CNBr) IR3-galactosidasefusions-protein. Det som immunogen anvendte CNBr-fragment har indeholdt 53 aminosyrer homologe til EBNA og 89 aminosyrer 35 homologe til β-galactosidase. Disse antisera har erkendt naturligt EBNA i EBV-inficerede celler ved anvendelse af * 9 DK 175828 B1 indirekte immunofluorescens.

Resultaterne hos Hennessy og Kieff ser ud til at være afhængige af gentagelsesnaturen hos EBNA-IR3-domænet.

Det fusionsprotein, som er produceret af pkH182-44, indehol-5 der et relativt langt segment, som er homologt med IR3-domænet (f.eks. 53 aminosyrer). Det er derfor ikke overraskende, at fusionsproteinet og CNBr-fragmentet deraf har indeholdt antigendeterminanter. Endvidere har Hennessy og Kieff ikke identificeret, hvilken af de i deres fragment 10 gentagne sekve'nser, der har virket som antigendeterminanter.

Selv om Hennessy og Kieff har været i stand til genetisk fremstilling af et materiale, som erkendes af anti-EBNA--antistoffer i humant serum, ville det være besværligt at anvende ved en klinisk bestemmelse på grund af dets konstruk-15 tion. Det segment på 53 aminosyrerester i deres fusionsprotein, som er homologt til EDNA, er fysisk og kemisk en del af β-galactosidaseproteinet. Derfor øves der indflydelse på dets immunologiske egenskaber af de dele af β-galactosida-semolekylet, hvorfra det ikke kan adskilles. Faktisk har 20 alle de humane sera, som er anvendt ved deres studium, reageret med β-galactosidase og har krævet behandling med β--galactosidase til adsorption og fjernelse af denne reaktivitet, før der afprøves for specificitet imod det genetisk fremstillede protein.

25 En anden tilnærmelse til de indbyrdes beslægtede problemer med bestemmelse af et gens korrekte læseramme og fremstilling af store mængder af pathogenrelaterede antigener (immunogener) til kliniske og diagnostiske formål er anvendelsen af syntetisk polypeptidkemi. Denne metode til frem-30 stilling af antigener (immunogener) har en fordel i forhold til de ovenfor beskrevne, genetiske konstruktionsmetoder. Syntetiske polypeptidantigener indeholder ikke naturlige proteinbiprodukter eller fragmenter deraf, og derved eliminerer anvendelsen af dem muligheden for uønsket krydsreak-35 tivitet og behovet for forbehandling af serumprøver som ved studiet ifølge Hennessy og Kieff.

DK 175828 B1 10

Selv om den almene idé med fremstilling af syntetiske ! antigener (immunogener) og anvendelse af disse til frembrin- : gelse af antistoffer med forudbestemt specificitet er blevet I beskrevet, er der stadigvæk et stort område af denne tekno- 5 logi tilbage, som fortsat unddrager sig forudsigelighed.

Der er mindst to grunde til dette. For det første frembringer et syntetisk antigen (immunogen) ikke nødvendigvis antistoffer, som immunoreagerer med intakt protein i dets native miljø. For det andet immunoreagerer en værts naturlige anti-10 stoffer mod et naturligt forekommende immunogen, såsom et virusprotein, sjældent med et polypeptid, som svarer til en kort, lineær del af immunogenets amminosyrerestsekvens.

; Dette sidstnævnte fænomen formodes at være resultatet af, I at korte, lineære polypeptider mangler nødvendige, sekundære 1 15 og tertiære konformationsstrukturer.

Meget af arbejdet med binding af peptid ved hjælp af antistof fremstillet mod proteiner er opsummeret i en oversigt af E. Benjamini et al., Current Topics in Microbiology and Immunology 58, 85-134 (1972). Peptidstrukturens rolle 20 ved antistofbinding .er blevet understreget af J.W. Goodman, Immunochem. 6, 139-149 (1969).

De fleste af de studier, som har beskæftiget sig med, hvorledes ændringer i sekvensen af peptider påvirker antistofbinding, er blevet fortolket som visende, at struk-25 turen af det antistofkombinerende sted spiller en overvejende rolle. Virkningen af sekvens- og strukturændringer ved disse studier er indbyrdes blandet og vanskelig at skelne. Nogle af disse studier kan lige så godt forklares ved hjælp af strukturændringer i antigenet, som bevirker bindingen.

30 Antistofreaktion på molekylniveau indebærer binding af et antigen med en defineret sekvens (primær struktur) og i en defineret konformation (sekundær og tertiær struktur). Immunreaktion imod proteinantigener er traditionelt blevet fortolket som værende rettet imod proteinets primære, sekun-35 dære eller tertiære struktur.

Dette klassifikationsskema kan have en vis gyldighed DK 175828 B1 n for proteiner, som har en veldefineret, samlet struktur ved fysiologiske temperaturer og opløsninger. Dets gyldighed er imidlertid tvivlsom for peptidantigener, som har en mere dynamisk struktur.

5 Adskillige grupper har rapporteret strukturstudier af polymere med gentagen sekvens af glycin og alanin eller I glycin og serin, hvilke polymere er blevet syntetiseret som i modeller for silkefibroiner, jfr. Anderson et al., J. Mol.

Biol. 67, 459-468 (1972); og collagen, jfr. Anderson et 10 al., BBRC 39, 802-808 (1970); Doyle et al., J. Mol. Biol.

51, 47-59 (1970). Det mest systematiske studium har været det ifølge Brack et al., Biopolymers 11, 563-586 (1972), som har rapporteret syntese af en række blokhomopolymere polypeptider, hvori de homopolymere, gentagne blokenheder 15 har haft formlen (Alax-Glyy), hvor y er 1, 2 eller 3, når x er 1, y er 1, 2 og 3, når x er 2, og y er 3, når x er 3.

De resultater, som er rapporteret fra dette sidstnævnte studium, har været, at de blokhomopolymere, som for størstedelens vedkommende har været sammensat af alanin, 20 har været a-spiralsnoede i fast tilstand, medens de, som for størstedelens vedkommende har indeholdt glycin, har været uordnet. I opløsning er polyalanin blevet rapporteret som værende α-spiralsnoet, men poly-(Ala2-Gly1) er blevet rapporteret som værende i β-antiparallel form. Det er blevet sagt, 25 at de mere glycinrige polymere har en anden fikseret struktur, som er blevet rapporteret som hverken α-spiral- eller S-strukturen.

De homopolymeriserede blokke af glycin og alanin, som er rapporteret af Brack et al., er blevet fremstillet 30 ved kondensationspolymerisation af de gentagne di- til hexa-peptidenheder, som har en carboxyterminal glycylrest i aktiv esterform. Polymerisationsgrader fra 2 til 68 er blevet rapporteret for poly-(Ala-Gly2).

Selv om de opløsningsmidler, som er blevet anvendt 35 ved disse studier, ikke har været fysiologisk acceptable, f.eks. vand eller phosphatpufret saltopløsning, illustrerer DK 175828 B1 12 resultaterne to ting: (1) strukturændringer kan indtræde, efterhånden som sekvensen i et polypeptid ændres, og (2) strukturændringer sker ligeledes under overgangen fra opløsning til fast tilstand.

5

Resumé af opfindelsen.

Den foreliggende opfindelse angår et CMV-relateret polypeptid omfattende en aminosyrerestsekvens udvalgt fra den gruppe, som består af 10 a) -Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly- -Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly- og b) -Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly--Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-, og farmaceutisk acceptable salte deraf, hvor polypeptidet 15 immunoreagerer med anti-EBNA-antistoffer.

Den foreliggende opfindelse angår også en fremgangsmåde til afprøvning for anti-EBNA-antistoffer i en legemsprøve, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at den omfatter, at man 20 a} blander legemsprøven med et polypeptid ifølge krav 1 til dannelse af en immunoreaktionsblanding, b) holder blandingen i et forudbestemt tidsrum, som er tilstrækkeligt til, at de nævnte anti-EBNA-antistoffer immunoreagerer med polypeptidet til dannelse af en immuno- 25 reaktant, og c) påviser tilstedeværelsen af den nævnte immunoreak-tant og herved tilstedeværelsen af de nævnte anti-EBNA-anti-stoffer i prøven.

Ved en foretrukket udførelsesform er fremgangsmåden 30 specifik for immunoglobulinklassen.

Den foreliggende opfindelse angår ligeledes et diagnostisk system i form af et prøvesæt til afprøvning for tilstedeværelsen af anti-EBNA-antistoffer i en legemsprøve, hvilket system er ejendommeligt ved, at systemet i separate .35 pakninger omfatter: 13 DK 175828 B1 a) et polypeptid ifølge opfindelsen og b) et indikatormiddel til signalering af immunoreak-tionen af polypeptidet med humane anti-EBNA-antistoffer.

Fortrinsvis er indikatormidlet et enzymmærket, humant, 5 for Ig-klassen specifikt antistof.

Polypeptidet ifølge opfindelsen kan være en multimer indeholdende flere sammenknyttede polypeptidgentagelsesen-heder, hvori mindst én af gentagelsesenhederne er et polypeptid som ovenfor beskrevet. Polypeptidgentagelsesenhedeme 10 kan være sammenknyttet hoved-til-hale ved hjælp af amidbindinger. Alternativt kan de syntetiske polypeptidmonomere være sammenknyttet ved hjælp af andet end amidbindinger til dannelse af en polymer multimer, såsom ved anvendelsen af intramolekylære interpolypeptidcysteindisulfidbindinger.

15 Ved en fremgangsmåde til afprøvning for tilstedevæ relsen af anti-EBNA-antistoffer ved anvendelse af et ovenfor beskrevet polypeptid eller en multimer som antigen tilvejebringes der en flydende, human legemsprøve, som blandes med det ovenfor beskrevne polypeptid. Den resulterende immuno-20 reaktionsblanding holdes i et forudbestemt tidsrum, som er tilstrækkeligt til, at eventuelle, i prøven tilstedeværende anti-EBNA-antistoffer immunoreagerer med polypeptidet og danner en immunoreaktant. Derefter påvises tilstedeværelsen af immunoreaktionen. Ved en især foretrukket udøvelse påvises 25 tilstedeværelsen af en immunoreaktion ved, at anti-human-tungkæde-antistoffer, såsom anti-lgG-, -IgM- eller -IgA-antistoffer, blandes med immunoreaktanten, den anden immunoreakt ionsblanding holdes i et forudbestemt tidsrum, som er tilstrækkeligt til, at anti-human-antistofferne immuno-30 reagerer med de i immunoreaktanten tilstedeværende anti-EBNA-antistof fer til dannelse af en anden immunoreaktant, hvorefter tilstedeværelsen af den anden immunoreaktant og af den specielle, humane anti-EBNA-tungkæde-antistoftype, som er til stede, påvises.

35 Særlig foretrukket gennemføres afprøvningen ved an vendelse af polypeptidet eller multimeren fæstnet til en DK 175828 B1 14 fast matrix til dannelse af en fast bærer. Legemsprøven, såsom blod, serum, plasma, spyt eller opspyt, blandes med den faste bærer til dannelse af en immunoreaktionsblanding med fast/flydende fase. Blandingen holdes som ovenfor til 5 dannelse af en fastfasebundet immunoreaktant, som indeholder anti-EBNA-antistofferne, hvorefter den faste og den flydende fase adskilles. Derefter påvises tilstedeværelsen af den fastfasebundne immunoreaktant.

Ved en foretrukket udførelsesform for det diagnosti-10 ske system ifølge opfindelsen indeholder dette også en fast bærer udgjort af en fast matrix, hvortil polypeptidet er fæstnet. Et middel til identifikation af isotypen af de immunoreagerede antistofmolekyler kan også være medtaget i systemet.

15

Kortfattet beskrivelse af tegningen.

På tegningen, som udgør en del af beskrivelsen af den foreliggende opfindelse, er følgende vist.

Fig. 1 viser en afbilding af de cirkulære dichrois-20 mespektre af polypeptiderne (F), (B) og (E). Disse polypep- tider er i nærværende beskrivelse også betegnet som polypeptiderne henholdsvis F13, F62 og F12. Hvert spektrum er gennemsnittet af ti successive scanderinger af et polypeptid i fysiologisk opløsning {phosphatpufret saltopløsning) i en 25 koncentration på 1 mg/ml. Den optiske drejning er udtrykt som milliradianer og er afbildet imod bølgelængden af det polariserede lys, udtrykt i nanometer. Den relativt udtryks- ' løse afbilding for polypeptid F (F13) angiver en tilfældig konformation, som er det sædvanlige resultat, som opnås med 30 peptider af denne størrelse. Spektret med bølgedal og spidser, som udvises af polypeptid B (F62), er karakteristisk for en relativt stabil, sekundær struktur eller konformation, sandsynligvis β-fold. Selv om disse data ikke er vist, har polypeptiderne P27, P60, F14 og F15 meget lignende spektre, 35 hvilket viser, at de mere foretrukne polypeptider ifølge opfindelsen eksisterer som tilsvarende, stabile konformatio~ 15 DK 175828 B1 ner i fysiologisk opløsning. Spektret for polypeptid E (F12) viser delvis formodning om en sådan konformation.

Fig. 2 viser et fotografi af nitrocelluloseimmuno-pletninger af helcelleekstrakter af EBV-transformerede WI-5 -L2-celler ved anvendelse af kanin-antipeptid-antisera mod syntetiske polypeptider C (P60) og B (P62). Et humant serum (fra patient T.J.) , som tidligere er defineret som anti-EBMA--positivt, dvs. indeholdende anti-EBNA-antistoffer, er blevet anvendt som en positiv kontrol i kolonne A i en fortynding 10 på 1:20. Kanin-anti-P60-serum (C) i en fortynding på 1:50 (kolonne B) og kanin-anti-P62-serum (B) i en fortynding på 1:10 (kolonne-D) immunoreagerer med samme bånd som den positive kontrol, hvilket viser, at de erkender naturligt EBNA. Kolonnerne A-G er identificeret forneden i figuren.

15 Erkendelse af EBNA af anti-P60-serum inhiberes ved inkubering af anti-P60-serum fortyndet 1:50 med 40 Mg/ml af polypeptid-ΡβΟ i 1 time før immunopletning (kolonne C). På tilsvarende måde inhiberes erkendelse af EBNA af anti-P62--serum ved inkubering af anti-P62-serum fortyndet 1:10 med 20 40 ^g/ml af polypeptid P62 i 1 time før immunopletning.

Den antigene beslægtethed af P60 og P62 er vist i kolonnerne F og G. Kolonne F viser anti-P62-serum fortyndet 1:10, som immunoreagerer med EBNA-båndet. I kolonne G er immunoreaktiviteten af anti-P62-serum med EBNA-båndet in-25 hiberet ved en inkubering med polypeptid-P60 i 40 μ$/τη1 i l time før immunopletning.

Fig. 3 viser kurver, som illustrerer inhiberingen af anti-P62-serumaktivitet i EBNA-positivt serum fra patient 1011 ved hjælp af et konkurrerende polypeptid i opløsning.

30 En ELISA, som anvender polypeptid P62 som fastfasemålet, gennemføres ved anvendelse af serum fra patient 1011 forinkuberet i 1 time med et af polypeptiderne P27, P62, P60, P89 eller F16 før anvendelse i ELISA. Polypeptiderne ?27, P62, P60, P89 og P16 er i nærværende beskrivelse også beteg-35 net som polypeptiderne henholdsvis A, B, C, D og G. Den procentvise anti-polypeptidaktivitet er afbildet som or- 16 DK 175828 B1 dinaten imod koncentrationen af det konkurrerende polypeptid i pg/ml.

Fig. 4 viser kurver, som illustrerer det parallelle tidsforløb for tilsynekomsten af antistoffer mod EBNA (stip-5 let linie, åbne cirkler) og mod polypeptid P62 (ubrudt linie, udfyldte cirkler) i et tilfælde med dokumenteret EBV-smitsom mononucleose (EBV-IM)- Sekventielle sera er blevet indsamlet efter klinisk udbrud og er blevet titreret for anti-EBNA--aktivitet ved at følge den metode, som er beskrevet i Cata-10 lano et al., J. Clin. Invest., 65, 1238-1242 (1980), på ordinaten i højre side. Serumprøverne er også blevet afprøvet ved ELISA ifølge opfindelsen ved anvendelse af polypeptid P62 som fastfasemålet, således som det er vist på ordinaten i venstre side, hvor den optiske tæthed ved 405 nm (OD405) 15 er afbildet.

Fig. 5 viser to kurver (fig. 5A og 5B), som illustrerer den tidlige påvisning af antistoffer mod polypeptid P62 (ubrudt linie, udfyldte cirkler) sammenlignet med anti-EBNA (stiplet linie, åbne cirkler) ved anvendelse af påvisning 20 ved den klassiske AClF-metode beskrevet af G. Henle et al., J. Infect. Dis., 130, 231-239 (1974). Sekventielle sera indsamles fra 2 patienter (nr. 14 øverste plade, fig. 5A; nr. 2 nederste plade, fig. 5B) med klinisk dokumenteret, smitsom mononucleose. Disse sera titreres for anti-EBNA-ak-25 tivitet som rapporteret i Catalano et al., ovenfor. Anti--polypeptidaktivitet måles ved anvendelse af ELISA ifølge opfindelsen ved anvendelse af polypeptid P62 som fastfase-målet, idet aktiviteten er rapporteret som i fig. 4.

Fig. 6 viser en kurve, som viser en analyse af se-30 kventielle sera fra patient D.B., som har haft en akut EBV--IM-infektion, afprøvet ved EBNA-P62-ELISA. IgM-reaktionen i den akutte fase er vist ved udfyldte cirkler, IgG-reak-tionen under bedring er vist ved åbne cirkler, og forholdet IgG/IgM er vist ved udfyldte firkanter. EBNA-polypeptid-P62-35 -afprøvningen er blevet gennemført som beskrevet i afsnittet materialer og metoder.

17 DK 175828 B1

Fig. 7 viser fotografier af immunopietter, som illustrerer en analyse af sekventielle sera fra patient D.B. Lysater af EBV-immortaliserede Wi-L2-celler (også betegnet som WI-L2) er blevet anvendt som kilden til EBNA-1-proteiner 5 til pletterne. På venstre side af pletten (fig. 7A) er der blevet anvendt en normal (NORM), VCA-positiv prøve som en kontrol for at vise EBNA-1 -proteinet på 77 kD. Pletterne viser den forsinkede reaktion (venstre side) af IgG-anti-stofferne på EBNA-proteinerne på 77 kD og den hurtige stig-10 ning i IgM-antistofferne mod disse proteiner i den akutte fase af sygdommen (højre side, fig. 7B). Døgn efter sygdommens udbrud er vist ved tallene under hver enkelt kolonne, og disse tal skal læses lodret.

Fig. 8 viser en kurve, som illustrerer en analyse af 15 sekventielle sera fra patent D.S. med en første infektion, som skyldes CMV-IM, efterfulgt af en anden infektion, som skyldes EBV-IM. IgM-reaktionen i den akutte fase er vist ved udfyldte cirkler, IgG-reaktionen under bedring er vist ved åbne cirkler, og forholdet IgG/IgM er vist ved udfyldte 20 firkanter.

Fig. 9 viser fotografier af et immunopietstudium, som illustrerer en analyse af sekventielle sera fra patient D.S. ved immunopletningsteknikken. Venstre side af pletten (fig. 9A) illustrerer IgM-reaktionen i den akutte fase på 25 EBNA-1-proteiner af patientens sera. Højre side af pletten (fig. 9B) illustrerer IgG-reaktionen fra patientens sera. Tallene under hver enkelt kolonne og den kolonne, som er betegnet NORM, er som i fig. 7. EBNA-1-proteinerne er blevet fremstillet ud fra Wi-L2-celleekstrakter som beskrevet i 30 afsnittet materialer og metoder.

Fig. 10 viser en kurve i to dele (fig. 10A og 10B), som illustrerer en polypeptid-P62-ELISA-analyse af sekventielle serumprøver fra 2 patienter med CMV-IM-infektioner, som har haft forudgående EBV-infektioner. I fig. 10A for 35 patient L.S. er IgM-antistofreaktioner vist som åbne cirkler, IgG-reaktioner er vist som udfyldte cirkler, og forholdet 18 DK 175828 B1

IgG/IgM er vist som udfyldte kvadrater. I fig. 10B for patienten S. G. er IgM-reakt ionerne vist som åbne cirkler, I medens IgG-reaktionerne er vist som udfyldte cirkler.

! Fig. 11 indeholder to plader (fig. 11A og 11B) , som 5 er fotografier af immunopletanalyser af fire sera fra 4 patienter med akut EBV-1M og 6 patienter med akut CMV-IM. I plade A er disse sera blevet immunoplettet på ekstrakter fra K562-celler {EBV-, CMV), idet IgM-antistoffer er blevet specifikt påvist. I plade B er disse sera blevet plettet på 10 ekstrakter fra humane fibroblastceller med sen CMV-infektion, idet IgG-antistoffer er blevet påvist. Alle sera er blevet anvendt i en fortynding 1:20. Bogstavbetegnelserne "E" og "C" ovenover hver kolonne betegner de sera, som er anvendt 1 disse kolonner, som stammende fra patienter med henholdsvis 15 EBV-IM og CMV-IM.

Fig. 12 viser et fotografi af en immunopiet, som illustrerer inhibering af binding af IgM og IgG fra serumprøver, som er udtaget fra patienterne D.B., D.S. og T.G. under det akutte trin og bedringstrinet af deres sygdom, 20 til ekstrakter fra Wi-L2-celler, en EBV+-B-cellelinie. Patient G er en normal VCA+-, EBNA-1+-donor. Kolonnerne 1 og 2 indeholder serumprøver fra patient D.B. opnået 15 døgn efter sygdomsudbrud (pod), kolonnerne 3 og 4 er fra patient D.S. 12 døgn pod, kolonnerne 5 og 6 er fra patient D.B. med 25 akut IM udtaget 4 døgn pod, kolonnerne 7 og 8 er fra patient D.B. 514 døgn pod, kolonnerne 9 og 10 er fra patient D.S.

471 døgn pod, og kolonnerne 11 og 12 er fra den normale donor G. Alle serumprøver er fortyndet 1:50. Kolonnerne med ulige numre indeholder kun serum og er betegnet med minustegn 30 (-), medens kolonnerne med lige numre indeholder serum plus polypeptid P62 og er betegnet med plustegn (+). Koncentrationen af polypeptid P62 er 400 μ3/τη1 i kolonnerne 2, 4 og 6 og 50 Mg/ml i kolonnerne 8, 10 og 12. IgM-antistoffer er blevet specifikt påvist i kolonnerne 1-6, medens IgG-anti-35 stoffer er blevet specifikt påvist i kolonnerne 7-12.

Fig. 13 viser aminosyrerestsekvensen i CMV-kodet 19 DK 175828 B1 polypeptidantigen, som beskrevet af Strapraus et al., J.

Virol., 57, 591-602 (1986). Den numeriske stilling af hver rest i sekvensen er vist ved tallene i venstre margin. Foretrukne, CMV-homologe peptider ifølge opfindelsen omfatter 5 en aminosyrerestsekvens, som svarer til den sekvens, som er vist i figuren fra ca. resten i stilling 200 til ca. resten i stilling 220.

Fig. 14 viser en kurve, som illustrerer evnen hos det EBV-homologe peptid P62 og de CMV-homologe peptider Cl 10 og C2 til påvisning af anti-EBNA-IgG (åbne symboler) eller IgM-antistoffer (udfyldte symboler) i serum fra patient D.B. under forløbet af en EBV-infektion. Under den akutte fase af infektionen er anti-EBNA-IgM-antistoffer blevet påvist ved anvendelse af ELISA'er med det EB-homologe peptid 15 P62 (trekanter) , det CMV-homologe peptid Cl (cirkler) og det CMV-homologe C2 (firkanter) , hvilket bekræfter tilstedeværelsen af smitsom mononucleose. Indtræden af bedring er vist ved stigningen i anti-EBNA-IgG-antistoffer og et ledsagende fald i IgM-antistof fer.

20 Fig. 15 viser en kurve, som illustrerer evnen hos det EBV-homologe peptid P62 og de CMV-homologe peptider Cl og C2 til påvisning af anti-EBNA-IgG (åbne symboler) eller IgM-antistoffer (udfyldte symboler) i serum fra patient D.S. under forløbet af en CMV-infektion efterfulgt af en 25 EBV-infektion. Under den akutte fase af begge sygdomme er anti-EBNA- IgM-antistof fer blevet påvist ved anvendelse af ELISA'er med det EB-homologe peptid P62 (trekanter) , det CMV-homologe peptid Cl (cirkler) og det CMV-homologe C2 (firkanter), hvilket bekræfter tilstedeværelsen af smitsom 30 mononucleose ved udbruddet af hver akut sygdom.

35 20 DK 175828 B1

Detaljeret beskrivelse af opfindelsen.

I. Introduktion.

Mennesker inficeret med Epstein-Barr-virus (EBV) 5 udvikler antistoffer imod et viruskerneantigen (EBNA), som er til stede i virustransformerede B-lymphocyter. Traditionel klinisk teknik, som anvendes til afprøvning for EBNA og anti-EBNA-antistoffer hos mennesker, er besværlige. Desuden er gængse metoder til rensningen af EBNA fra cellekulturer 10 ikke lette at tilpasse til masseproduktion.

Ved den foreliggende opfindelse anvendes syntetisk polypeptidteknologi til overvindelse af nogle af problemerne ved de gængse metodologier. Korte, syntetiske polypeptider kan immunologisk efterligne antigendeterminanter på et na-15 turligt protein og kan derfor anvendes til frembringelse af antistoffer med forudbestemt specificitet, som erkender det naturlige protein.

Vendingen "immunologisk efterligner" er her anvendt i den betydning, at et immunogent polypeptid ifølge opfin-20 delsen tilskynder produktion af antistoffer, som binder til i det tilskyndende polypeptid og ligeledes til cognatsekvensen i det intakte protein. Dette fænomen kan anvendes både eksperimentelt og klinisk.

Eksperimentelt kan antistoffer mod syntetiske poly-25 peptider anvendes til fastlæggelse af DNA-læserammen og derudfra aminosyrerestsekvensen i et klinisk vigtigt protein, såsom EBNA. Klinisk kan antistoffer med en forudbestemt specificitet frembragt imod syntetiske polypeptider anvendes til diagnostiske og terapeutiske formål.

30 Heller et al., J. Virol., 44, 311-320 (1982), har rapporteret en DNA-nucleotidsekvens med karakteristika, som antyder, at den eventuelt kunne indeholde det gen, som koder for EBNA. De har forudsagt, at de tre mulige læserammer, hvis DNA translateres til protein, ville kode for et IR3-35 -proteindomæne på mere end 200 aminosyrerester sammensat af udelukkende (i) serin, arginin og glycin, (ii) glycin og 21 DK 175828 B1 alanin eller (iii) glutamin, glutamat og glycin, afhængigt af den eksprimerede DNA-læseramme.

De rapporterede, kemiske egenskaber af EBNA-molekylet har, når de tages sammen med fordelingen af mulige stop-5 codoner i EBNA-genet, antydet, at IR3 primært er sammensat af glycin- og alaninrester.

1 Til vurdering af denne antydning er der blevet syn- i tetiseret korte polypeptider, hvis aminosyrerestsekvenser i alt væsentligt har svaret til sekvensen i et EBNA-protein, 10 hvis IR3 er en tilfældig glycin-alanin-copolymer.

Som det vil fremgå af den efterfølgende diskussion, har det vist sig, at disse syntetiserede polypeptider, og især et polypeptid med betegnelsen P62, immunologisk efterligner EBNA. Desuden har det vist sig, at en gruppe af disse 15 især foretrukne polypeptider, herunder polypeptid P62, binder humane anti-EBNA-antistoffer. Anvendelsen af disse polypeptider i forskellige afprøvningsmetoder er ligeledes diskuteret i det følgende.

Mere specifikt er der, hvad angår sådanne afprøvninger 20 blevet udviklet en afprøvning, fortrinsvis i fast fase, som udnytter et især foretrukket polypeptid. Denne afprøvning har vist sig at være klinisk pålidelig ved påvisning af smitsom mononucleose (IM) forårsaget af EBV (EBV-IM) samt IM frembragt af CMV (CMV-IM) og ligeledes til påvisning af 25 nasopharyngealt carcinoma (NPC) , en anden sygdom, hvori EBV har været impliceret. Specifikke resultater med afprøvninger inden for hvert enkelt område er diskuteret, og dette gælder også afprøvningsmetoderne alment.

22 DK 175828 B1 II. Foretrukne udførelsesformer.

A. Syntetiske polypeptider.

1. Sekvenser.

Den ved dette studium anvendte række af små, synte-5 tiske polypeptider (med en længde på 5-21 aminosyrerester) er blevet syntetiseret ved anvendelse af fastfasemetoden ifølge Merrifield, jfr. Merrifield et al., J. Am. Chem.

Soc. , 85, 2149-2154 (1963). Sekvenserne er blevet udvalgt således, at de repræsenterer forskellige områder inden i og 10 umiddelbart uden for den foreslåede IR3-region i EBNA.

Som her anvendt betyder udtrykket "syntetisk", at polypeptidmolekylet eller polypeptidgentagelsesenheden er blevet opbygget ad kemisk vej, dvs. syntetiseret kemisk, i stedet for at være fremstillet ad biologisk vej, såsom ved 15 genetisk konstruktionsteknik. Derfor er de syntetiske polypeptider, som er omfattet af den foreliggende opfindelse, fri for naturligt forekommende proteiner og fragmenter deraf.

Derfor afviger de kemisk syntetiserede polypeptider også fra sønderdelingsprodukter af naturligt forekommende 20 proteiner, således som disse fremstilles ved indvirkningen af cyanogenbromid på proteinet. Den velkendte, kemiske fast-fasesyntese, ved hvilken blokerede aminosyrerester adderes i rækkefølge til opnåelse af det ønskede polypeptid, er den foretrukne syntesemetode, og den er diskuteret mere detal-25 jeret i det følgende.

Alle her identificerede aminosyrerester er i den naturlige konfiguration eller L-konfigurationen. I overensstemmelse med standardpolypeptidnomenklatur er forkortelser for aminosyrerester som følger: 30 35 23 DK 175828 B1

Tabel over korrespondance.

Symbol Aminosyre 5 —------ - 1 bogstav 3 bogstaver y Tyr L-tyrosin 10 G Gly glycin F Phe L-phenylalanin M Met L-methionin A Ala L-alanin S Ser L-serin 15 L Ile L-isoleucin L Leu L-leucin T Thr L-threonin V Val L-valin P Pro L-prolin 20 K Lys L-lysin H His L-histidin Q Gin L-glutamin E Glu L-glutaminsyre W Trp L-tryptophan 25 R Arg L-arginin D Asp L-asparaginsyre N Asn L-asparagin C Cys L-cystein 30 Polypeptidet betegnet P62 (tabel I) indeholder den sekventielle gentagelsessekvens -Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly- og indeholder yderligere et Ala-Gly-peptid ved carboxyl terminus. Som følge heraf er der ingen aminosyrerest-sekvens, som gentages gennem hele polypeptidet, og polypeptid 35 P62 må betragtes som værende en tilfældig copolymer og ikke en homoblokcopolymer, således som det er tilfældet med de af Brack et al., fremstillede poly- (Alax-Glyy) -materialer eller de af Anderson et al. fremstillede poly-(Ser-Gly)-materialer, hvis identiske blokke af specielle aminosyrerestsekvenser 24 DK 175828 B1 gentages gennem hele længden af deres polymere.

De tilfældige copolymerpolypeptider er i nærværende beskrivelse ofte simpelthen betegnet som "polypeptider", som "syntetiske polypeptider" eller som "peptider". Dette 5 sker for kortheds skyld.

Udtrykket "antigenisk beslægtede varianter" er i nærværende beskrivelse anvendt som betegnelse for polypeptider, som har afvigende, total aminosyrerestsekvens, men som deler i det mindste en del af én antigendeterminant, og 10 som derfor er immunologisk krydsreaktive.

Udtrykket "antigendeterminant" betegner som her anvendt den strukturkomponent i et molekyle, som er ansvarlig for specifik vekselvirkning med tilsvarende antistofmolekyler (immunoglobulin) udløst af det samme eller et beslægtet 15 antigen eller immunogen.

Udtrykket "immunogen determinant" betegner som her anvendt den strukturkomponent i et molekyle, som er ansvarlig for tilskyndelsen i en vært af et antistof indeholdende et antistofkombinerende sted (idiotype), som binder med im-20 munogenet, når det anvendes som et antigen.

Udtrykket "antigen" betyder som her anvendt en helhed, som bindes af et antistof.

Udtrykket "immunogen" beskriver som her anvendt en helhed, som tilskynder til antistofproduktion i værtsdyret.

25 I visse tilfælde er antigenet og immunogenet samme helhed, medens de to helheder i andre tilfælde er forskellige.

F.eks. er polypeptidet P62 som beskrevet i det følgende blevet anvendt til tilskyndelse af produktion af antistoffer i en kanin og er derfor blevet anvendt som et im-30 munogen. De således tilskyndede antistoffer binder til po-lypeptid P62, når det anvendes som antigen. Derfor er poly-peptid P62 både et immunogen og et antigen. Anti-EBNA-antistoffer binder til EBNA som både immunogen og antigen samt til polypeptid P62 som antigen.

35 De tilfældige copolymerpolypeptider P89, F12 og F13, som er vist i nedenstående tabel I, de farmaceutisk accep- 25 DK 175828 B1 table salte deraf og antigenisk beslægtede varianter deraf er i stand til at tilskynde antistoffer, som binder til EBNA, som ovenfor beskrevet.

5 Tabel I

Sekvenser i syntetiske polvneptider Peptid1 Sekvens P60 (C) H-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala- 10 -Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-OH, P89 (D) H-Arg-Ala-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Glu- -Lys-Arg-Pro-Met-OH, F12 (E) Η-I le-Met - Ser-Asp-Glu-Gly-Pro-Gly-Thr-Gly-Asn- -Gly-Leu-Gly-Glu-OH, i 15 F13 (F) H-Pro-Gly-Ala-Pro-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Pro-OH, F27 (A) H-Lys-Gly-Thr-His-Gly-Gly-Thr-Gly-Ala-Gly-Ala- 1 -Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-OH, P62 (B) H-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly- -Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-OH, 20 F14 H-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala- -Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-OH, F15 H-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala- -Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-OH, F16 (G) H-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly- 25 -Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-OH.

Store bogstaver i parantes er anvendt til betegnelse af det tilsvarende polypeptid i nogle af figurerne på tegningen og tabellerne i beskrivelsen.

30

Resultaterne af polypeptid/anti-polypeptid-receptor-bindings- og -bindingsinhiberingsstudier er diskuteret i det følgende i afsnit IID. Disse resultater viser krydsreaktiviteter og krydsinhiberingsvirkninger, som er parallelle 35 til mængden af sekvenshomologi mellem polypeptiderne. F.eks. indeholder polypeptid P60 et segment på 10 aminosyrer homologe med P62. Polypeptid P27 indeholder et segment på 8 ami- 26 DK 175828 B1 nosyrer homologe til polypeptiderne P60, P62 og Dl (tabel II) . Polypeptid D2 (tabel II) indeholder et segment på 7 aminosyrerester homologe til segmenter af polypeptiderne P27, P60, P62 og Dl. Polypeptid P89, som ikke har krydsrea-5 geret signifikant ved studiet, indeholder ingen sekvensho-mologi med polypeptid P27, P62 og P60.

Vigtigere er, at den sekvens på 8 aminosyrerester, som deles af polypeptider P27, P62, P60 og Dl, indeholder mindst én antigenisk determinant fælles for alle disse til-10 fældige copolymerpolypeptider, hvorved disse tre polypeptider gøres til antigenisk beslægtede varianter. Desuden omfatter det delte segment sekvensen på 6 aminosyrerester -Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly- 15 og en overlappende sekvens repræsenteret ved formlen -Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-.

Med "overlappende'1 menes, at den anden nævnte sekvens er indeholdt i en del af den førstnævnte sekvens. Denne 20 overlapning af aminosyrerestsekvens er for polypeptid P62 illustreret ved de overlappende, "indrammede" sekvensdele, som er vist nedenfor, og hvori aminosyrerestkoden på ét bogstav er anvendt.

25 G-G-G-A-G-G-A-G-A-G-G-G-A-G-G

Tilfældige copolymerpolypeptider, som indeholder både sekvensen indeholdende de delte 6 aminosyrerester og den overlappende sekvens på 5 aminosyrerester, indeholder 30 fra ca. 8 til ca. 40, fortrinsvis fra ca. 15 til ca. 20, aminosyrerester og omfatter den sekvens, som skrevet fra venstre til højre og i retning fra aminoterminus til carboxyl terminus er repræsenteret ved formlen 35 -Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-, » 27 DK 175828 B1 indeholder mindst ca. 50 mol% Gly-rester og er i stand til både (a) tilskynde produktionen af antistoffer, som immuno-reagerer med EBNA, når den er bundet til et bærestof og indført i en effektiv mængde i en pattedyrvært, og (b) im-5 munoreagere med humane antistoffer tilskyndet af naturligt EBNA.

Aminosyrerestsekvenser omfatter især de sekvenser, som taget fra venstre mod højre og i retning fra aminoter-minus mod carboxylterminus er repræsenteret ved formlerne: 10 (i) -Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly--Gly-Gly-Arg-, (ii) -Lys-Gly-Thr-His-Gly-Gly-Thr-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala--Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-, 15 (iii) -Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly--Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-, (iv) -Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly--Gly-Ala-Gly-, (v) -Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly- 20 -Ala-Gly-Gly-, (vi) -Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala--Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-, (vii) -Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala--Gly-Ala-Gly-, 25 (viii) -Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala--Gly-; farmaceutisk acceptable salte deraf og antigenisk beslægtede varianter deraf.

30 Det skal bemærkes, at en streg ved begyndelsen eller afslutningen af en aminosyrerestsekvens angiver en binding til en gruppe, såsom H og OH, ved henholdsvis amino- og carboxylterminus eller en yderligere sekvens på en eller flere aminosyrerester op til i alt 40 aminosyrerester i 35 polypeptidkæden.

De tilsvarende polypeptider, dvs. polypeptiderne 28 DK 175828 B1 P60, P27, P62, F14, F15 og F16 er vist i tabel I og Dl og D2 vist i tabel II. Polypeptid P62 er i nærværende beskrivelse anvendt illustrativt som et eksempel på polypeptideme. Poly-peptid P62 betegnes undertiden også P62, peptid P62, EBNA-5 P62 og lignende, idet det er underforstået, at enhver beteg nelse, som omfatter "P62", refererer til dette materiale. Ordene "peptid" og "polypeptid" anvendes i nærværende beskrivelse ombyttelige.

Vendingen "farmaceutisk acceptable salte" refererer 10 som her anvendt til ikke-toksiske alkalimetal-, jordalkali-metal- og ammoniumsalte anvendt i den farmaceutiske industri, herunder f.eks. natrium-, kalium-, lithium-, calcium-, magnesium- og ammoniumsaltene, som fremstilles ved metoder, som er velkendt på området. Vendingen omfatter ligeledes 15 ikke-toksiske syreadditionssalte, som alment fremstilles ved omsætning af forbindelserne ifølge opfindelsen med en egnet, oganisk eller uorganisk syre. Repræsentative salte omfatter f.eks. hydrochloridet, hydrobromidet, sulfatet, bisulfatet, acetatet, oxalatet, valeratet, oleatet, lauratet, 20 boratet, benzoatet, lactatet, phosphatet, tosylatet, citratet, maleatet, fumaratet, succinatet og tartratet.

Ved en anden foretrukket udførelsesform angår den foreliggende opfindelse et polypeptid indeholdende mindst ca. 15 og ikke over ca. 4 0 aminosyrerester med en sekvens ho-25 molog {svarende) til sekvensen i EBNA eller det CMV-kodede polypeptid, som er vist i fig. 13. EBNA-homologe og CMV--homologe peptider ifølge opfindelsen er endvidere karakteriseret ved at have evnen til immunoreaktion med anti-EBNA--antistoffer.

30 2. Størrelse.

Virkningen af en ændring af størrelsen af det syntetiske polypeptid på dets evne til at blive bundet af an-ti-EBNA-antistoffer er blevet studeret. Det har i almin-35 delighed vist sig, at polypeptidets evne til at blive bundet af antistoffer falder, efterhånden som polypeptidstørrelsen 29 DK 175828 B1 ligeledes falder.

Polypeptid P62 består af 20 aminosyrerester, hvoraf de første 9 rester fra aminoterminus er direkte gentaget, som vist i tabel II ved anvendelse af aminosyrerestkoden på 5 1 bogstav. Der er blevet syntetiseret en række polypeptider homologe til P62, hvori aminosyreresttriader er blevet udeladt fra aminoterminus i det forudgående peptid til tilvejebringelse af polypeptider Dl, D2 og D3, som er vist i nedenstående tabel II. Voksende dele af sekvenssymmetrien i P62 10 mangler derfor i poiypeptiderne Dl, D2 og D3.

Tabel II

Polypeptid- Aminosyrerestsekvens9^ betegnelse 15 -

P62 : AGAGGGAG G*A GAGGGAGGAG

Dl: GGGAGGAGAGGGAGGAG

D2 : AGGAGAGGGAGGAG

20 D3: A G A G G G A G G A G

A5: G G G A G

A6 : A G G G A G

A7: G A G G G A G

25 A8: AGAGGGAG

I A9: GAGAGGGAG

a) Polypeptidsekvenser ved anvendelse af enkeltbogstavskoden er vist i retning fra venstre mod højre og fra aminoter-30 minus mod carboxylterminus.

* Forbindelse mellem en direkte 9-mergentagelse i polypeptid P62 .

Evnen hos D-rækken af polypeptider til immunoreaktion 35 med 3 humane anti-EBNA-sera og kanin-anti-P62-serum er blevet studeret ved anvendelse af poiypeptiderne i den faste fase af ELISA som beskrevet i det følgende. Antistofbinding til 30 DK 175828 B1

Dl er næsten den samme som til stampolypeptidet P62 for alle afprøvede sera. I modsætning hertil er der ingen binding til fastfase-D3 for noget serum med undtagelse af kanin-an-ti-P62. Resultaterne for D2 ligger derimellem og afhænger 5 af det afprøvede serum. Derfor falder antistoferkendelsen af denne række af blodpeptider, efterhånden som polypeptid-længden forkortes fra 20 til 11 aminosyrerester.

Den kendsgerning, at antistofbinding falder for alle antisera, taler imod den mulighed, at en specifik antigen-10 determinant er blevet udeladt ved den sekventielle eliminering af aminosyrerester, da polypeptiderne indeholder to antigendeterminanter, hvoraf kun den ene er påvirket af sekvensudeladelserne. Sekvenssymmetrien af P62 har ligeledes sikret, at alle sekvenser på 4-8 aminosyrerester, som er 15 til stede i P62, også er til stede i D3 med undtagelse af dem tværs over forbindelsen mellem gentagelserne.

Konformationelle ændringer i polypeptiderne bundet til den faste bærer ved ELISA kan have bidraget til undertrykkelsen af antistoferkendelse. Denne mulighed er blevet 20 studeret ved inhibering af bindingen (immunoreaktionen) af nogle sera til fastfasebundet P62 ved anvendelse af varierende koncentrationer af konkurrerende polypeptider i opløsning. Disse antisera blandes og holdes (inkuberes) med po-lypeptid P62, Dl, D2 eller D3 i opløsning eller i et forud-25 bestemt tidsrum, som er tilstrækkeligt til, at der sker immunoreaktion (binding), før de sættes til en mikrotiter-plade overtrukket med P62. Resultaterne af dette studium med sera fra 5 patienter er opsummeret i nedenstående tabel III .

30 35 a DK 175828 B1 i 1 31

Tabel II

Koncentration af konkurrerende polvpeptider. som tilvejebringer 50% inhibering af antistofbindinq til peptid P62* 5 Konkurrerende peptid (^g pr. ml)

Sera P62 Dl D2 D3 TJ 0,05 0,05 0,1 200 VM 0,3 0,3 0,4 3 10 CV 0,1 0,1 0,1 10 N6 0,6 0,6 0,6 3 i JC 1 1 1 500 * De ELISA-metoder, som er anvendt til disse bestemmelser, 15 er beskrevet nedenfor i afsnittene II-E(2) og III-D.

: Inhiberingsvirkningen af polypeptid Dl på antistof binding til P62 betragtes som værende ikke til at skelne fra inhiberingsvirkningen af selve P62. Dette gælder for 20 alle afprøvede sera.

Mere interessant er, at polypeptid D3 inhiberer nogle af disse sera, VM og N6, næsten lige så godt som de større polypeptider har gjort. Denne stærke inhiberingsvirkning er indtrådt til trods for den omstændighed, at ingen af disse 25 sera har vist nogen binding til D3 bundet til den faste bærer i ELISA. Disse data synes at angive, at polypeptidet skal have en vis minimumlængde, mindst ca. 15 aminosyrere-ster, for at opretholde en nødvendig, sekundær struktur, når det er bundet til plastoverfladen på mikrotiterplade.

30 Til fastfaseafprøvninger foretrækkes derfor en peptidlængde fra ca. 15 til ca. 40 rester, idet en længde fra ca. 15 til ca. 20 rester især er foretrukket.

Den minimale antigenstørrelse, som er nødvendig til erkendelse, er blevet yderligere studeret ved anvendelse af 35 polypeptiderne A5, A6, A7, A8 og A9. Som vist i tabel II har polypeptidet A5 5 aminosyrerester, og hvert medlem af rækken A6-A9 er forøget i længde med én aminosyre udover 32 DK 175828 B1 det forudgående polypeptid op til de 9 rester, som er til stede i A9. Intet afprøvet antiserum har immunoreageret med disse polypeptider, når de har været bundet til mikrotiter-plader ved den nedenfor beskrevne ELISA.

5 Data for evnen hos A-rækken af polypeptider til in- hibering af binding af humane anti-EBNA-antistoffer til i fastfase-?62 er vist i nedenstående tabel IV.

Tabel IV

10 Inhiberina af antistofbinding til peptid P62 af 100 ua or. ml konkurrerende peptid*

Procent af ikke-inhiberet aktivitet

Sera A5 A6 A7 A8 A9 15 TJ 96 80 91 74 31 VM 93 81 51 17 9 CV 92 93 93 72 20 JC 94 92 60 88 74 S62 86 96 89 95 78 20 S60 106 109 93 84 53 * Disse studier er blevet gennemført som beskrevet for tabel III.

25 Næsten alle afprøvede sera er blevet inhiberet af A9, selv om meget høje koncentrationer har været påkrævet (mere end 100 gange højere end de koncentrationer af P62 eller Dl, som er nødvendige til ækvivalent inhibering). Desuden har 3 ! sera immunoreageret med og er blevet inhiberet af A8 og ét i 30 af A7. Ingen er blevet inhiberet af de kortere polypeptider I A6 og A5.

i

Den nedgang i immunoreaktivitet, som løber parallelt med en nedgang i polypeptidstørrelse, ser derfor ud til at skyldes to virkninger: (1) virkningen af udeladelse af det 35 sted på antigenet, hvortil antistoffet binder, som vist ved polypeptiderne i A-rækken, og (2) ændringen i konformationen af polypeptidet, efterhånden som dets størrelse falder, som » 33 DK 175828 B1 vist ved polypeptiderne i D-rækken.

3. Konformation.

Konformat ionsegenskaberne hos polypeptideme er blevet 5 studeret ved anvendelse af cirkulær dichroismespektroskopi (CD). CD-spektrene af polypeptideme P27, P60, P62, F13, F15 og F16 er blevet bestemt. Disse data, som er vist delvist i fig. 1, viser, at de polypeptider, som omfatter 10 -Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly- antageren relativt stabil, sekundær struktur eller konformation i en fysiologisk opløsning ved 20°C. Da den dominerende konformation af disse polypeptider er relativt stabil, 15 antages det, at human anti-EBNA-antistofaktivitet fremkommer som reaktion på denne specielle konformation.

B. Multimere.

Den foreliggende opfindelse angår ligeledes et mul-20 timert polypeptid (en multimer) indeholdende flere sammenknyttede, tilfældige copolymerpolypeptidgentagelsesenheder, hvori mindst én af gentagelsesenhederne er et polypeptid, som her beskrevet.

Multimerene ifølge opfindelsen, alene eller bundet 25 til et bærestof, er, når de indføres i en effektiv mængde i en pattedyrvært, i stand til at tilskynde produktionen af antistoffer, som binder til EBNA. Især foretrukne multimere er dem, som indeholder et CMV-homologt polypeptid ifølge opfindelsen, som kan binde humane antistoffer frembragt af 30 EBNA.

Derfor er multimerene ifølge opfindelsen, ligesom deres polypeptidbestanddel, immunogene, og de er antigene mod humane anti-EBNA-antistoffer. Derfor kan disse multimere anvendes til tilskyndelse af produktionen af anti-EBNA-an-35 tistoffer, som er anvendelige ved de nedenfor diskuterede, diagnostiske metoder og systemer, og de kan ligeledes anven- i 34 DK 175828 B1 des som et antigen i hensigtsmæssige, diagnostiske metoder og systemer.

Multimere, som indeholder færre end ca. 3 5 aminosyre -rester i den totale multimer, er typisk bundet til et bære-5 stof til anvendelse som et immunogen. De multimere, som indeholder mere end i alt ca. 35 aminosyrerester, er typisk tilstrækkeligt immunogene til, at de kan anvendes uden et bærestof.

Polypeptidmultimere kan fremstilles, ved at polypep-10 tidmonomerene bindes sammen på en hoved-til-hale-måde ved anvendelse af den ovenfor omtalte fastfasemetode, dvs. én komplet polypeptidsekvens kan syntetiseres på harpiksen efterfulgt af en eller flere af samme eller forskellige polypeptidsekvenser, idet hele multimerenheden derefter 15 spaltes fra harpiksen og anvendes som her beskrevet. Sådanne hoved-til-hale-polypeptidmultimere indeholder fortrinsvis fra ca. 2 til ca. 4 polypeptidgentagelsesenheder.

Alternativt kan multimere fremstilles som en polymer af tilfældige copolymerpolypeptider anvendt som monomere.

20 Som her anvendt er udtrykket "polymer" i dets forskellige grammatikalske former defineret som en type multimer, som indeholder flere polypeptidgentagelsesenheder af en tilfældig copolymer, hvilke enheder er knyttet sammen ved andet end peptidbindinger.

25 Et eksempel på en polymer ifølge opfindelsen kan syntetiseres ved anvendelse af de her omhandlede polypeptid-monomere, som indeholder adderede cysteinrester ved både amino- og carboxylterminus (di-Cys-polypeptid). Di-Cys-po-lypep tidmonomer ene kan være bundet sammen ved hjælp af in-30 tramolekylære interpolypeptidcysteindisulfidbindinger ved anvendelse af en oxidationsproces til dannelse af en immunogen, antigen polymer. Den således fremstillede polymer indeholder flere af de tilfældige copolymerpolypeptider ifølge opfindelsen som gentagelsesenheder. Disse gentagel-35 sesenheder er bundet sammen ved hjælp af de ovenfor diskuterede, oxiderede cysteinrester (cystin).

35 DK 175828 B1

Tilstedeværelsen af en eller to terminale Cys-rester i et polypeptid ifølge opfindelsen med det formål at binde polypeptidet til et bærestof eller til fremstilling af en polymer skal ikke betragtes som en ændring af aminosyrese-5 kvensen i polypeptidgentagelsesenheder ifølge opfindelsen.

C. Inokula.

Polypeptiderne ifølge opfindelsen kan i et farmaceutisk acceptabelt fortyndingsmiddel anvendes til dannelse af 10 et inokulum eller en vaccine, som efter indgivelse i en 1 effektiv mængde er i stand til at frembringe antistoffer, som immunoreagerer med EBNA.

Ordet "inokulum" er i dets forskellige grammatikalske former anvendt her til beskrivelse af et middel indeholdende 15 et polypeptid ifølge opfindelsen som en aktiv ingrediens anvendt til fremstilling af antistoffer imod EBNA. Når et polypeptid anvendes til frembringelse af antistoffer, må det forstås, at polypeptidet kan anvendes alene, bundet til et bærestof eller som en multimer, men for nemheds skyld 1 20 vil disse alternativer ikke altid være nævnt i det følgende.

For polypeptider, som indeholder færre end ca. 35 aminosyrerester, foretrækkes det at anvende et bærestof med det formål at tilskynde produktionen af antistoffer. Et polypeptid bundet eller knyttet til et bærestof vil i nær-25 værende beskrivelse blive anvendt illustrativt, hvor der fremstilles antistoffer.

Inokulet kan anvendes til produktion af antistoffer til anvendelse ved en diagnostisk afprøvning, som påviser celler, som eksprimerer EBNA. De af inokulet producerede 30 antistoffer kan også anvendes i et præparat til frembringelse af passiv immunitet imod B-lymphocyter, som på deres celleoverflader eksprimerer EBNA.

Ordet "vaccine" er i dets forskellige grammatikalske former her anvendt til beskrivelse af en type inokulum in-35 deholdende et polypeptid ifølge opfindelsen som en aktiv ingrediens, som anvendes til frembringelse af aktiv immunitet 36 DK 175828 B1 hos et værtspattedyr. Da aktiv immunitet indebærer produktionen af antistoffer, kan en vaccine eller et inokulum således indeholde identiske ingredienser, men deres anvendelser er forskellig. I de fleste tilfælde er ingredienserne 5 i en vaccine og i en inokulum forskellige, fordi mange hjælpestoffer, som kan anvendes hos dyr, ikke kan anvendes hos ; mennesker.

Det her omhandlede inokulum eller vaccinen indeholder en effektiv mængde af et polypeptid ifølge opfindelsen som 10 en multimer, såsom en polymer af individuelle polypeptider bundet sammen gennem oxiderede polypeptidterminalcystein-rester eller som et konjugat bundet til et bærestof. For nemheds skyld refereres der her kollektivt til de forskellige udførelsesformer for polypeptiderne ifølge opfindelsen ved 15 hjælp af udtrykket "polypeptid" og dets forskellige grammatikalske former.

Den effektive mængde polypeptid pr. enhedsdosis afhænger bl.a. af den dyreart, som inokuleres, dyrets legemsvægt og det valgte inokuleringsskema, således som det er vel-20 kendt på området. Inokula og vacciner indeholder typisk polypeptidkoncentrationer fra ca. 10 til ca. 500 mg pr. inokulering (dosis). De angivne mængder polypeptid refererer til vægten af polypeptidet uden vægten af bærestof, når der anvendes et bærestof. Specifikt er der i det følgende be-25 skrevet eksempler på inokula, hvor vægten af bærestof plus polypeptid (konjugat) er angivet.'

Udtrykket "enhedsdosis" refererer til fysisk adskilte enheder, som er egnede som enhedsdoseringer til dyr, idet hver enhed indeholder en forudbestemt mængde aktivt materia-30 le, som er beregnet til frembringelse af den ønskede terapeutiske virkning i associering med det nødvendige fortyndingsmiddel, dvs. bærestof eller grundmasse. Specifikationerne for denne enhedsdosis er dikteret af og er direkte afhængig af (a) de særegne karakteristika hos det aktive 35 materiale og den specielle terapeutiske virkning, som skal opnås, og (b) de begrænsninger, som følger med teknikken 37 DK 175828 B1 til compoundering af et sådant aktivt materiale til terapeutisk anvendelse i dyr, således som det er detaljeret beskrevet i beskrivelsen.

Inokula fremstilles typisk ud fra det tørrede, faste 5 polypeptid-konjugat eller polypeptidpolymeren, ved at poly-peptid-konjugatet eller polypeptidpolymeren suspenderes i et fysiologisk egnet (acceptabelt) fortyndingsmiddel, såsom vand, saltopløsning eller phosphatpufret saltopløsning.

Inokula kan også omfatte et hjælpestof. Sådanne hjæl-10 pestoffer som Freund's komplette adjuvans (CFA), Freund's ukomplette adjuvand (IFA) og alun er materialer, som er velkendt på området, og som er kommercielt tilgængelige fra adskillige kilder.

i j ! 15 D. Receptorer.

Antistoffer og praktisk taget hele antistoffer frembragt imod (tilskyndet af) polypeptiderne ifølge opfindelsen samt antistofkombinerende steder fremstillet ud fra sådanne antistoffer er her kollektivt omtalt som receptorer. Recep-20 torer frembringes hos pattedyrværter, f.eks. mus, kaniner og heste, ved immunisering ved anvendelse af de ovenfor beskrevne inokula.

Egnede, monoklonale receptorer, typisk hele antistoffer, kan også fremstilles ved anvendelse af hybridomatekno-25 logi beskrevet af Niman et al., Proc. Natl. Sci., USA, 80, 4949-4953 (1983), til hvilken beskrivelse der her skal henvises. Til dannelse af det hybridoma, ud fra hvilket den monoklonale receptor produceres, fusioneres kort fortalt et myeloma eller en anden, selvbevarende cellelinie med lym-30 phocyter opnået fra milten fra et pattedyr hyperimmuniseret med et polypeptid ifølge opfindelsen.

Det foretrækkes, at myelomacellelinien er fra samme art som lymphocyterne. Typisk er en mus af stammen 129 G1X+ det foretrukne dyr. Egnede musemyelomaer til anvendelse 35 ifølge den foreliggende opfindelse omfatter de hypoxanthin--aminopterin-thymidin-følsomme (HAT) cellelinier P3X63- 38 DK 175828 B1 -Ag8.653 {ATCC CRL 1580) og SP2/0-Agl4 (ATCC CRL 1581).

Splenocyter fusioneres typisk med myelomaceller ved anvendelse af polyethylenglycol (PEG) 1500. Fusionerede hybrider udvælges ved hjælp af deres følsomhed for HAT.

5 Hybridomaer, som producerer receptormolekyleme, identificeres ved anvendelse af den enzymbundne immunosorbentafprøvning (ELISA), som er beskrevet i nedenstående afsnit III-D materialer og metoder.

Monoklonale receptorer behøver ikke udelukkende at 10 blevet opnået ud fra ovenstående hybri doma væsker, men kan også opnås i almindeligvis mere koncentreret form ud fra ascitesfluidum fra pattedyr, i hvilke det ønskede hybridoma er blevet indført. Produktion af monoklonale antistoffer ved anvendelse af ascitesfluidum er velkendt og skal ikke 15 beskrives yderligere i nærværende beskrivelse.

En receptor binder både til det polypeptid, imod hvilket den er frembragt, og binder ligeledes til det tilsvarende EBNA-antigendeterminantsted, som polypeptidet ifølge opfindelsen efterligner immunologisk. Et polypeptid ifølge 2 0 opfindelsen kan således være både et immunogen og et antigen.

Receptorerne kan beskrives som værende oligoklonale sammenlignet med naturligt forekommende, polyklonale antistoffer, da de er frembragt imod et immunogen, som har relativt få epitoper sammenlignet med epitoperne i et intakt 25 EBNA-molekyle. Følgelig binder receptorerne epitoper i polypeptidet, medens naturligt forekommende antistoffer frembragt imod EBNA binder til epitoper gennem hele EBNA-molekylet.

Eksempler på receptormolekyler indeholdende antistofkombinerende steder frembragt i kaniner imod de polypeptider, 30 som er vist i tabel I, er blevet studeret ved anvendelse af immunopletningsmetoderne ifølge Towbin et al., Proc. Natl.

Acad. Sci., USA, 76, 4350-4354 (1979) og Billings et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 7104-7108 (1983). Yderligere detaljer findes i afsnittet materialer og metoder (III).

35 Det har vist sig, at alle polypeptider i dette studium har frembragt kanin-anti-polypeptidantistoffer, når de er 39 DK 175828 B1 bundet til et proteinbærestof som et konjugat og indført i en effektiv mængde i kaninværter i et inokulum som beskrevet i det følgende. Disse receptormolekyler har erkendt intakt EBNA-protein isoleret fra de EBV-transformerede, humane 5 B-lymphoblastcellelinier WI-L2, Ra j i og Daudi. Data fra disse studier er delvist vist i fig. 2. Ved kontrolstudier har proteinekstrakter af B-lymphocyter, som er negative for EBV-infektion (BJAB-celler, tilgængelige hos Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, CA) ikke givet reaktive 10 bånd med anti-polypeptidantisera. Disse data viser, at disse eksempelvise receptormolekyler immunoreagerer med et EBV-infektionsspecifikt protein.

Desuden har det vist sig, at immunoreaktiviteten for kanin-anti-polypeptidantistofferne for intakt EBNA-protein 15 har kunnet blokeres af det tilskyndende, immunogene polypep-tid anvendt som et antigen, således som det ligeledes er vist i fig. 2. Disse resultater viser, at ideotyperne (antistofkombinerende steder) i anti-polypeptid-antisera er specifikke for EBNA-antigendeterminanter.

20 Kanin-anti-polypeptidantistoffet mod polypeptid P62 er blevet anvendt ved et konkurrencestudium til undersøgelse af antigenbeslægtetheden af polypeptiderne P27, P62, P60 og P89. Dette antistof har krydsreageret ekstensivt med de konjugerede og ikke-konjugerede polypeptider ved den i det 25 følgende beskrevne ELISA. Bindingen af anti-polypeptid P62 til polypeptid P62 i den faste fase er blevet inhiberet 98%, ved at antistoffet først inkuberes med polypeptid P62.

På samme måde er bindingen af anti-polypeptid P62 til polypeptid P62 blevet inhiberet 81% af polypeptid P60 og 36% af 30 polypeptid P27. Polypeptid P89 inhiberer slet ikke anti--polypeptid P62-aktiviteten.

Til bestemmelse af, om antistofferne i humant EBV--immunserum også erkender denne antigendeterminant eller ej, er der blevet gennemført et konkurrencestudium ved an-35 vendelse af serum fra en EBV-immun patient med rheumatoid arthritis (serum 1011). Resultaterne, som er vist i fig. 3, 40 DK 175828 B1 er mage til dem, som er opnået, når anti-polypeptid P62 er blevet anvendt. Dette viser, at den antigendeterminant, som deles af polypeptiderne P27, P62 og P60 efterligner en naturligt forekommende immunogendeterminant i EBNA.

5 E. Diagnostiske afprevningssvstemer og -metoder.

De polypeptider, antistoffer og antistofkombinerende steder (receptorer), som er frembragt imod de ovenfor beskrevne polypeptider, og fremgangsmåder ifølge opfindelsen 10 kan også anvendes til diagnostiske afprøvninger, såsom im-munoafprøvninger. Sådanne .diagnostiske teknikformer omfatter f.eks. enzymimmunoafprøvning, enzymmultipleret immunoafprøv-ningsteknik (EMIT), enzymbundet immunosorbentafprøvning (ELISA), radioimmunafprøvning (RIA), f luorescensimmunafprøv-15 ning, enten enkelt eller dobbelt antistofteknik og andre teknikformer, i hvilke enten receptoren eller antigenet er mærket med en eller anden påviselig etiket eller indikerende middel, se alment Maggio, Enzyme Immonoassay, CRC Press, Cleveland, Ohio (1981); og M. Goldman, Fluorescent Antibody 20 Methods, Academic Press, New York, N.Y., (1980). Specifikke eksempler på sådanne afprøvningsmetoder og systemer, som kan anvendes ved gennemførelse af disse metoder, er diskuteret i det følgende.

25 1. Afprøvninger for EBNA.

En metode til afprøvning for tilstedeværelsen af EBNA i en legemsprøve er også omfattet af opfindelsen. Ved en almen metode tilvejebringes der en legemsprøve, som skal afprøves, og som blandes med receptormolekyler, som indehol-30 der et antistofkombinerende sted frembragt imod et poly-peptid ifølge opfindelsen. Blandingen holdes i et forudbestemt tidsrum, som er tilstrækkeligt til, at receptormolekylerne immunoreagerer med EBNA, som er til stede i legemsprøven. Mængden af denne immunoreaktion måles derefter for 35 at bestemme, om EBNA-molekyler har været til stede eller ikke har været til stede i den afprøvede legemsprøve.

DK 175828 B1 I 41 i ' Et illustrativt, diagnostisk system i prøvesætform, som udgør et aspekt af den foreliggende opfindelse, som er anvendeligt til påvisning af EBNA til stede i en portion af en legemsprøve, indeholder receptormolekyler, såsom antistof-5 fer, praktisk taget hele antistoffer eller antistofkombine-rende steder, såsom Fab- og F(ab')2_antistofportioner frembragt imod et polypeptid ifølge opfindelsen, i én pakning.

Dette system omfatter også et indikerende middel til signalering af tilstedeværelsen af en immunoreaktion mellem 10 receptoren og antigenet.

Typiske, indikerende midler omfatter radioisotoper, såsom 125I og 131I, enzymer, såsom alkalisk phosphatase, peberrodperoxidase, β-D-galactosidase og glucoseoxidase, og fluorochromfarvestoffer, såsom fluorescein og rhodamin. Det 15 indikerende middel kan være knyttet direkte til receptoren.

Det indikerende middel kan også være bundet til et separat ! molekyle, såsom til et andet antistof, til et antistofkom- binerende sted eller til protein A fra Staphylococcus aureus (S. aureus), som reagerer med (binder til) receptoren ifølge 20 opfindelsen. Et specifikt eksempel på et sådant indikerende middel i form af et separat molekyle er -mærket protein A fra S. aureus.

Det indikerende middel tillader, at immunoreaktions-produktet påvises, og er emballeret separat fra receptoren, 2 5 når det ikke er knyttet direkte til en receptor. Blandet med en legemsprøve, såsom en acetonefikseret udtværing af lymphocyter fra perifert blod (PBL), immunoreagerer receptormolekylet med EBNA til dannelse af en immunoreaktant, og det tilstedeværende, indikerende middel signalerer derefter 30 dannelsen af immunoreaktionsprodukt.

En udførelsesform for en diagnostisk EBNA-metode er en immunofluorescensafprøvning, som omfatter et forstærkningsreagens. Ved en sådan afprøvning acetonefikseres en PBL-udtværing til et almindeligt mikroskopobjektglas. En 35 portion af antistoffer frembragt som beskrevet, f.eks. frembragt i kaniner, almindeligvis fra ca. 10 /ig til ca. 500 42 DK 175828 B1 μg, bringes i kontakt med objektglasset ved anvendelse af velkendt teknik.

Efter at eventuelt ikke-immunoreagerede antistoffer er skyllet bort, blokeres eventuelle ikke-specifikke bin-5 dingssteder på objektglasset om ønsket typisk med et protein, såsom okseserumalbumin (BSA). Et andet reagens (forstærkningsreagens) , såsom komplement eller anti-immunoglobulin-antistoffer, f.eks. marsvinekomplement, kan derefter inkuberes på forsøgsobjektglasset.

10 Efter denne anden inkubering fjernes eventuelt uomsat forstærkningsreagens, f.eks. ved skylning, hvilket kun efterlader det, som er bundet til de førstnævnte antistoffer på afprøvningsobjektglasset. Et tredje reagens (indikerende middel), f.eks. antistof, såsom gede-anti-marsvine-komple-15 ment, inkuberes derefter på forsøgsobjektglasset. Det tredje reagens er mærket, ved at det er bundet til et fluorochrom-farvestof, f.eks. fluoresceinisothiocyanat (FITC), rhodamin B-isothiocyanat (RITC), tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC) og 4,4' -diisothiocyanostilben-2,2'-disulfonsyre 20 (DIDS), således som det er velkendt på området.

Eventuelt uomsat tredje reagens skylles bort efter denne tredje inkubering, hvilket efterlader eventuelle FITC-mærkede gede-anti-marsvine-komplementantistoffer, som binder til komplementet på forsøgsobjektglasset. Tilstedeværelsen 25 af det FlTC-mærkede tredje reagens kan påvises ved anvendelse af fluorescensmikroskopi og derved signalere tilstedeværelsen af EBV-infektion.

B-lymphocyter, som vides at være inficeret med EBV, er blevet afprøvet for tilstedeværelsen af EBNA ved anven-30 delse af den immunof luorescensafprøvningsmetode, som er beskrevet ovenfor og beskrevet mere detaljeret i afsnit III, materialer og metoder. Kaninantistoffer frembragt imod hvert af de i tabel I viste polypeptider har været i stand til at påvise EBNA i den EBV-inficerede cellelinie WI-L2.

3 5 Et foretrukket diagnosesystem i form af et prøvesæt, som kan anvendes til gennemførelse af ovenstående afprøv- 43 DK 175828 B1 ningsmetode, omfatter, i separate pakninger, (a) receptorer (antistoffer), som immunoreagerer med EBNA, (b) et andet i forstærkningsreagens, såsom komplement, f.eks. marsvinekom- plement, anti-immunoglobulinantistoffer, eller protein A 5 fra S. aureus, som reagerer med receptoren, og (c) et in-• dikatormiddel, som kan være bundet direkte til forstærknings- midlet eller kan være en del af et separat molekyle, såsom et antistof eller en antistofdel, som reagerer med forstærkningsreagenset. Indikatormidlet signalerer indirekte immu-10 noreaktionen af receptormolekylet og EBNA ved medieringen af forstærkningsreagenset.

Receptormolekyler og separate indikatormidler i et vilkårligt, her beskrevet diagnosesystem, samt det ovenfor beskrevne forstærkningsreagens, kan være tilvejebragt i op-15 løsning, som en flydende dispersion eller som et praktisk taget tørt pulver, f.eks. i lyofiliseret form. Når indikatormidlet er et andet molekyle end forstærkningsreagenset, foretrækkes det, at indikatormidlet er emballeret separat.

Hvor indikatormidlet er et enzym, kan enzymets substrat 20 også være tilvejebragt i en separat pakning i systemet. En fast bærer, såsom det ovenfor beskrevne mikroskopobjektglas, en eller flere puffere og acetone kan også være medtaget som separat emballerede elementer i dette diagnostiske afprøvningssystem .

25 De pakninger, som her er diskuteret i relation til diagnosesystemer, er dem, som er gængs anvendt i diagnosesystemer. Sådanne pakninger omfatter f.eks. flasker og hætteglas af glas og plast (f.eks. polyethylen, polypropylen, polystyren og polycarbonat) og indpakninger af plast og 30 plastfolielaminat.

Anvendelsen af hele, intakte, biologisk aktive antistoffer er ikke nødvendig i mange diagnosesystemer, såsom den ovenfor beskrevne immunofluorescensafprøvning. Snarere kan der anvendes udelukkende det immunologisk aktive, idio-35 typholdige antigenbindende og erkendende receptorsted, dvs. det antistof kombinerende sted, i antistofmolekylet. Eksempler 44 DK 175828 B1 på sådanne antistofkombinerende steder er dem, som er kendt i teknikken som Fab- og F (ab' ) 2-antistofdele, som fremstilles ved proteolyse ved anvendelse af henholdsvis papain og pepsin, således som det er velkendt på området.

5 2. Afprøvninger for anti-EBNA-antistoffer.

(a) Afprøvninger alment.

En anden diagnosefremgangsmåde ifølge opfindelsen er en afprøvning, såsom ELISA, som påviser anti-EBNA-antistoffer 10 i en antistofholdig, flydende legemsprøve. Her anvendes et EBV-homologt eller CMV-homologt polypeptid ifølge opfindelse som antigen, og det er fortrinsvis bundet på (adsorberet til) eller på anden måde knyttet eller fæstnet til en fast grundmasse, såsom den tværbundne dextran, som er tilgængelig 15 under handelsnavnet 11 Sephadex®" fra Pharmacia Fine Chemicals {Piscataway, New Jersey), agarose, glasperler, polyvinylchloride polystyren, tværbundet acrylamid, nitrocellulose, hullerne i en mikrotiterplade eller overfladen på en neddyp-ningsstang eller ske, til dannelse af en fast bærer.

20 Det EBV- eller CMV-homologe polypeptid blandes med den flydende legemsprøve, som skal afprøves. Den således dannede immunoreaktionsblanding holdes i et forudbestemt tidsrum, som er tilstrækkeligt til, at eventuelle anti-EBNA--antistoffer, som er til stede i legemsprøven, immunoreagerer 25 med polypeptidet. Tilstedeværelsen af denne immunoreaktion påvises derefter, såsom med et indikatormiddel, til signalering af tilstedeværelsen af anti-EBNA-antistoffer i den afprøvede legemsprøve.

Et eksempel på ELISA, som anvender ovenstående metode, 30 anvender en fast bærer, som udgøres af et EBV- eller CMV-homologt polypeptid ifølge opfindelsen adsorberet (fæstnet) på en fast grundmasse, enten som hullerne i en mikrotiterplade med 12 eller 96 huller fremstillet af polystyren eller polyvinylchlorid eller i en opak plastske med dobbelthuller, 35 således som den er beskrevet i det følgende i afsnittet materialer og metoder. Ikke-specifikke bindingssteder på i 45 DK 175828 B1 den faste grundmasse blokeres derefter typisk med et protein, som ikke inkluderer en sekvens, hvortil anti-EBNA-antistoffer binder eller immunoreagerer, såsom okseserumalbumin (BSA). Ubundet polypeptid og BSA fjernes fra grundmassen, f.eks.

5 ved skylning.

En portion af en legemsprøve, såsom humant spyt, serum, blod eller plasma, blandes med den ovenfor beskrevne, faste bærer til dannelse af immunoreaktionsbiandingen indeholdende faste og flydende faser. Blandingen af fast/fly-10 dende fase holdes i et tidsrum (f.eks. 2-60 minutter), som er tilstrækkeligt til, at eventuelle anti-EBNA-antistoffer i legemsprøven immunoreagerer med polypeptidantigenet og danner en fastfasebundet immunoreaktant. Derefter adskilles de faste og flydende faser almindeligvis.

15 En opløsning af et andet, mærket, indikatormiddelhol- digt antistof, antistofkombinerende sted eller protein A fra S. aureus, som reagerer med førstnævnte anti-EBNA-antistof, blandes derefter med den faste fase til dannelse af en anden immunoreaktionsblanding med fast/flydende fase. Et 20 eksempel på et andet antistof er et peberrodperoxidasemærket (HRPO-mærket) gede-anti-humant-Ig-antistof, hvor de førstnævnte antistoffer er fra en human legemsprøve. Andre, anvendelige enzymmærkninger omfatter alkalisk phosphatase, β-D-galactosidase og glucoseoxidase. Blandingen dannet ud 25 fra den faste fase og den anden, mærkede antistofopløsning holdes (inkuberes) i et forudbestemt tidsrum (f.eks. 2-30 minutter), som er tilstrækkeligt til dannelse af en anden, fastfasebundet immunoreaktant mellem førstnævnte antistof og den indikatormiddelholdige helhed, såsom en immunoreakt ion 30 mellem de to antistoffer. Derefter adskilles de faste og flydende faser.

Det ovenfor beskrevne, andet antistof kan også være specifikt for og kun immunoreagere med én af immunoglobulin-i klasserne (f.eks. IgG, IgM, IgE, IgA eller IgD), såsom mo- ! 35 noklonale muse-anti-IgG-, -anti-IgM- eller -anti-IgA-anti- stoffer eller dele deraf indeholdende det kombinerende sted.

! 46 DK 175828 B1 Sådanne antistoffer tilvejebringer evnen til identifikation af immunoglobulinklassen af anti-EBNA-antistof, som er til stede i legemsprøven, således som det er vist i nedenstående tabeller VI-X. Desuden kan det andet antistof eller anti-5 stofkombinerende sted være specifikt for og immunoreagere med kun en af de to typer af lette immunoglobul i nkæder (f.eks. k eller λ). Disse antistoffer tilvejebringer evnen til identifikation af isotypen af det immunoglobulinmolekyle, som er til stede i legemsprøven.

' 10 En opløsning indeholdende et substrat for enzymmærk ningen, såsom hydrogenperoxid for peroxidase og et farvedan-nende farvestofforstadium, såsom o-phenylendiamin eller p-nitrophenylphosphat, for alkalisk phosphatase, blandes derefter med den faste fase, og denne blanding holdes i et 15 andet, forud valgt tidsrum. Den optiske tæthed ved en i forvejen valgt bølgelængde (f.eks. henholdsvis 490 eller 405 nanometer) kan derefter bestemmes, efter at det forudbestemte tidsrum (f.eks. 60 minutter) er forløbet, og sammenlignes med den optiske tæthed af en kontrol til bestemmelse af, om 20 der har været anti-EBNA-antistoffer til stede i legemsprøven.

Ved en anden udførelses form for ovenstående afprøvning anvendes der to faste bærere. Hver enkelt fast bærer omfatter et EBV-homologt polypeptid af tilfældig copolymer fæstnet til en fast grundmasse.

25 En første portion af en patients flydende legemsprøve, såsom blod, plasma eller serum, blandes med den første, faste bærer til dannelse af en blanding med fast/flydende fase. Blandingen holdes i et forudbestemt tidsrum (f.eks. fra ca. 2 til ca. 30 minutter), som er tilstrækkeligt til, 30 at eventuelle anti-EBNA-antistoffer, som er til stede i prøven, immunoreagerer med polypeptidet og danner en fast-‘ fasebundet immunoreaktant indeholdende anti-EBNA-antistof- ferne. Analoge trin gennemføres med en anden portion af patientens flydende legemsprøve og den anden, faste bærer.

35 Naturligvis kan den første og den anden portion blandes med deres respektive fast fasebærere i en vilkårlig rækkefølge 47 DK 175828 B1 eller praktisk taget samtidigt.

Efter adskillelse af de faste og flydende faser, som er resultatet af ovenstående blanding- og opretholdelsestrin, blandes den første, faste bærer og eventuelle, fastfasebundne 5 anti-EBNA-antistoffer, som er til stede i dens immunoreak-tant, i et vandigt, flydende medium med mærkede anti-humant IgG-antistoffer. Denne blanding holdes i et tidsrum, som er tilstrækkeligt til, at anti-IgG-antistofferne immunorea-gerer med eventuelle, fastfasebundne, human IgG-antistoffer, 10 som er til stede. Den anden, faste bærer og eventuelle, fastfasebundne antistoffer, som er til stede, blandes og holdes på tilsvarende måde med mærkede anti-humant IgM-an-tistoffer.

Derefter bestemmes de relative mængder af mærkede 15 anti-IgG- og anti-IgM-antistoffer. Som anført i det følgende i forbindelse med tabellerne VI-X viser tilstedeværelsen af en relativt større mængde mærket anti-TgM end anti-IgG, at patienten er i det akutte stadium af EBV-IM-infektion, medens en relativt større, tilstedeværende mængde mærket anti-IgG 20 end anti-IgM viser, at patienten er i sygdommens bedringsstadium. Omtrent lige store mængder af anti-IgM og anti-IgG viser, at patienten er ved at gå fra det akutte stadium til bedringsstadiet.

En anden udførelsesform for opfindelsen omfatter et 25 diagnosesystem i prøvesætform, som omfatter en fast bærer udgjort af en fast grundmasse, såsom en polystyrenmikroti-terstrimmel med 12 huller eller en "ske" med dobbelthul, og et EBV- eller CMV-homologt polypeptid ifølge opfindelsen absorberet (bundet) eller på anden måde fæstnet til den 30 faste grundmasse til dannelse af en fast grundmasse. Dette system omfatter ligeledes fortrinsvis separat emballerede anti-humant Ig-antistoffer med et bundet indikatormiddel, såsom peroxidasemærkede gede-anti-humant Ig-antistoffer, og omfatter ligeledes substrat for det bundne indikatormiddel, 35 såsom hydrogenperoxid og et farvedannende farvestofforstadium, såsom o-phenylendiamin, i yderligere, separate paknin- 48 DK 175828 B1 ger. Disse anti-humant Ig-antistoffer kan være antistoffer, som immunoreagerer specifikt med udelukkende humant IgM-,

IgG-, IgA- eller IgE-antistof eller med alle humane antistoffer, således som det er nævnt ovenfor. Stabiliseret 5 hydrogenperoxid kan også være medtaget i prøvesættet, eller det kan tilvejebringes af den endelige bruger. Puffersalte, som kan anvendes ved en afprøvning, som udnytter dette system, kan også være medtaget i en eller flere, separate pakninger i tør eller flydende form. Separate pakninger 10 indeholdende humane anti EBNA-antistof fer og humane antistoffer, som er fri for anti-EBNA-antistoffer {normale, humane antistoffer) , kan også være medtaget som henholdsvis positive og negative kontroller. Mængder af ovennævnte ingredienser, som er tilstrækkelige til gennemførelse af mindst én afprøv-15 ning, medtages i sættet, og en afprøvning for tilstedeværelsen af anti-EBNA-antistoffer i en legemsprøve, såsom serum, kan gennemføres med dette diagnosesystem ved anvendelse af den ovenfor beskrevne metode.

20 (b) Afprøvning for EBV-IM.

Et eksempel på ELISA, mage til den ovenfor beskrevne og detaljeret beskrevet i nedenstående afsnit materialer og metoder (III) , er blevet anvendt til screening for tilstedeværelsen af anti-polypeptidimmunoglobulin i sera fra 91 25 mennesker med anti-EBNA-positive serotyper fastslået ved anvendelse af den ovenfor beskrevne anti-komplementimmuno-fluorescens (ACIF). Når disse sera afprøves i en fortynding på 1:20, er alle 91 positive imod {bundet til) polypeptiderne P27, P62, P60 og F16, F14 og F15. Selv ved den højere for-30 tynding på 1:320 immunoreagerer 83 af de 91 EBNA-positive sera med polypeptid P62 ved ELISA. Der ser således ud til at være en fortrinlig korrelation mellem den anti-EBNA-an-tistoftiter, som fastlægges ved hjælp af ACIF, og antipep-tidaktiviteten af hvert enkelt serum.

35 Desuden illustrerer resultaterne en fortrinlig kor relation mellem ACIF-metoden og den her omhandlede ELISA- » 49 DK 175828 B1 -teknik, som er simplere og lettere at anvende. Desuden illustrerer resultaterne anvendeligheden af polypeptider ifølge opfindelsen til en diagnoseafprøvning for anti-EBNA-antistoffer.

5 Nedenstående tabel V viser reaktiviteterne af sera opnået fra to individer (S-B. og M.V.) før og efter kontakt med EBV-tilskyndet, smitsom mononucleose (IM; dvs. EBV-IM).

I begge tilfælde er antistoffer, som binder til polypepti-derne P27, P62 og P60, fraværende før infektion, men viser 10 sig efter. I modsætning hertil er der ikke af noget af disse individer blevet produceret antistoffer, som binder til polypeptid P89.

Ved et yderligere studium er opbevarede sera fra et ' tidligere beskrevet panel af 27 EBV-ikke-immune donorer 15 [Catalano et al., J. Clin. Invest., 65, 1238-1242 (1980)] blevet screenet for binding til polypeptiderne P62 og P60 ved den ovenfor beskrevne ELISA. EBV-immunstatus af de anvendte sera er blevet defineret ved tilstedeværelsen eller fraværelsen af capsidantigen fra Epstein-Barr-virus (VCA).

20 Individer, som ikke har serumantistoffer imod VCA (VCA") , har aldrig været inficeret med EBV. VCA-positive (VCA+) individer har haft EBV-infektioner og bærer typisk et lavt niveau af anti-EBNA-antistoffer. Intet af disse sera udviser ; signifikant reaktivitet over for noget af polypeptiderne, 25 således som det ses af nedenstående tabel V.

i j i 50 DK 175828 B1

Tabel V

Antistoffer imod EBNA-peptider i humane sera-ί OD4Q5 x 103 opnået2 med

Patient patentantistoffer imod: 5 - P27 P62 P60 £89 VCA+, normal l3 155 958 154 23 VCA+, normal 23 516 819 145 16 S.B. før mononucleose 11 13 51 9 10 S.B. efter mononucleose 33 514 115 23 M.V. før mononucleose 15 77 72 29 M.V. efter mononucleose 107 631 162 25

VCA", normale (n=27)4 67±235 ND6 45±18 ND

15 Alle sera er blevet afprøvet ved en fortynding på 1:20.

2 Optisk tæthed målt ved en lysbølgelængde på 405 nanometer efter 30 minutters substratinkuberinger.

3 VCA+-sera fra individer, som ikke udviser kliniske tegn på tilstedeværende EBV-relateret sygdom.

20 4 Sera fra 27 individer, som ikke udviser nogen kliniske tegn på EBV-relateret sygdom, tidligere eller nuværende, som angivet ved fraværet af antistoffer mod VCA.

5 Gennemsnitlig optisk tæthed + én standardafvigelse.

6 Ikke gennemført.

25

Til undersøgelse af korrelationen mellem ELISA- og ACIF-diagnoseteknikken under forløbet af infektionen er opbevarede sera fra 8 studenter med collegealder, indsamlet sekventielt efter udbrud af smitsom mononucleose (IM) , blevet 30 undersøgt ved den ovenfor beskrevne ELISA ved anvendelse af polypeptid P62. Alle studenter har udviklet anti-EBNA-titere fra 1 måned til 1 år efter infektion, som målt ved den klassiske metode, dvs. ACIF, jfr. G. Henle et al., J. Infect.

Dis., 130, 231-239 (1974).

35 I halvdelen af individerne har anti-P62-antistoffer vokset parallelt med den tilsvarende anti-EBNA-titer, således som det er vist for patient 15 i fig. 4. I den anden halvdel 51 DK 175828 B1 er antistoffer imod polypeptid P62 blevet påvist i løbet af den første måned efter udbrud af symptomer, medens disse antistoffer er blevet påvist til senere tidspunkter ved anvendelse af ACIF-teknikken. Disse resultater er vist for 5 patienterne 14 og 2 i fig. 5. Anti-P62-antistoffer har derfor kunnet påvises ved anvendelse af ELISA ifølge opfindelsen, før anti-EBNA-antistoffer har kunnet påvises ved anti-kom-plement-standardimmunofluorescensafprøvningen.

Til differentiering af den immunoglobulinklasse, som 10 overvejende er ansvarlig for et individs immunreaktion på et givet tidsrum under forløbet af smitsom mononucleose, er der blevet anvendt sekundære (indikerende) antistoffer, som er specifikke for humant IgG eller IgM, ved ELISA som beskrevet i afsnittet metoder og materialer (III) . Nedenstående 15 tabel VI viser resultaterne af dette studium med sera fra to individer fra forskellige tidspunkter under EBV-infektion målt imod polypeptid P62 ved ELISA.

Tabel VI

20 Polypeptid P62-bundet, ELISA-påvist fremkomst af antipeptidaktivitet efter mononucleoseinfektion Tid efter Patent M.V. Patent 15 infektion IgM1 IgG2 IgM1 . IgG2

25 Før infektion 1033 74 ND4 ND

1 uge 245 80 152 113 1 måned 87 37 225 118 3 måneder 136 60 208 118 12 måneder ND ND 24 9 375 30 21 måneder 145 600 185 994

Patient-IgM-niveau påvist ved anvendelse af et andet antistof, som er specifikt for humant IgM.

2

Patient-IgG-niveau påvist ved anvendelse af et andet 35 antistof, som er specifikt for humant IgG.

3 1 Optisk tæthed målt ved en lysbølgelængde på 4 05 nanometer.

4

Ikke gennemført.

52 DK 175828 B1

Ved anvendelse af denne ELISA-metode er stigningen i IgM-antistofværdier, selv om den er lille, gentagelig og findes i alle afprøvede, sekventielle sera. Den ved ELISA-5 -afprøvningen målte immunreaktion er normal, idet IgM klassisk viser sig før IgG under EBV-infektion. Tilsynekomsten af IgM-antistoffer før IgG-antistoffer er især godt påvist for patient 15 i tabel VI. Ovenstående resultater viser igen, at infektion med EBV bevirker produktionen af antistoffer, 10 som reagerer med mindst ét polypeptid ifølge opfindelsen.

Ved et større anti-polypeptid-ELISA-studium er et panel på 19 ovenfor beskrevne VCA"-sera blevet screenet imod polypeptiderne P27, P62, P60, F12, F13, F14, F15 og F16. Intet af disse VCA'-sera har vist sig at reagere posi-15 tivt. Typiske data er vist i nedenstående tabel VII. Sera fra klinisk normale individer, som er positive for VCA-an-tistoffer, er blevet afprøvet ved to fortyndinger. Typiske resultater, vist i nedenstående tabel VII, viser, at alle VCA+-individerne er positive for, dvs. har antistoffer, som 20 binder til, hver enkelt af polypeptiderne.

Sera fra en række patienter med rheumatoid arthritis (RA) er også blevet screenet ved ELISA. Disse resultater er ligeledes opsummeret i tabel VII.

li 53 DK 175828 B1

Tabel VII

ELISA-påviste, gennemsnitlige antioeptidniveauer i humane sera

Patient- Gennemsnitlig antistof - 5 gruppe Antal sera aktivitet imod polypeptider1 P27 P62 P60 F12 F13 F16

Nor"2 1/203 19 22 17 77 34 41 47

Nor+4 1/203 26 521 854 394 128 70 733 10 Nor+4 1/3203 48 90 223 70 37 37 166 A+5 1/203 28 597 999 564 118 113 843 RA+5 1/3203 48 126 348 122 50 50 231 1 Aktivitet målt som optisk tæthed ved en lysbølgelængde på 15 405 nanometer efter 30 minutters seruminkubering.

2 VCA-negative individer.

3 Fortynding, ved hvilken sera er blevet afprøvet.

4 VCA-positive individer.

5 Individer diagnosticeret som havende rheumatoid arthritis.

20

Forskellen mellem de normale patienter, de VCA-positive patienter (kontrol) og RA-patienterne kan bedst ses ved serumfortyndingen 1:320. Antistofniveauerne i RA-patien-ter er signifikant højere for hvert afprøvet polypeptid ved 25 denne fortynding, når de analyseres ved anvendelse af Wilcox--Rank-opsummeringsmetoden (signifikansniveau over 99%) .

Patienter med Sjogren's syndrom, systemisk lupus erythematosus (SLE) og progressiv systemisk sclerose (PSS) er også blevet screenet ved både høje og lave serumfortyn-30 dinger. De eneste forskelle, som er fundet mellem disse patientgrupper og normale, er en relativt højere gennemsnitlig titer af PSS-patienterne for polypeptider P27, P62, P60, F16, F14 og F15. Det antages, at disse resultater mu ligvis skyldes en forudgående, EBV-beslægtet infektion, 35 eller at EBV er involveret i disse autoimmunsygdomme. Disse data nedsætter ikke anvendeligheden af ELISA som en diagnoserne t ode .

54 DK 175828 B1

De relative mængder af IgM- og IgG-antistoffer kan således udnyttes til bestemmelse af det relative stadium af sygdommen hos et individ. I betragtning af (1) den ovenfor illustrerede fasereaktion af igM-anti-EBNA-antistofproduk-5 tion, som bygges op og derefter falder, dvs. overlappes og efterfølges i tidens løb af opbygningen af IgG-anti-EBNA-an-tistofproduktion, og (2) den omstændighed, at denne fasereaktion følger de normale forekomstniveauer af IgM på et tidligt stadium af en sygdom efterfulgt af IgG i bedrings-10 stadiet.

Data i tabel VI viser derfor, at der under det tidlige, akutte stadium af sygdommen er en større mængde an-ti-EBNA-IgM-antistof til stede end anti-EBNA-IgG-antistof. Derefter begynder niveauet af IgG at stige under bedring, 15 medens niveauet af IgM falder, idet niveauerne af begge krydses, dvs. forholdet mellem IgG og IgM er 1, på et tidspunkt mellem det akutte stadium og bedringsstadiet.

Disse fund er i overensstemmelse med de gængse fund for primære immuniseringer og sygdomstilstande alment, se 20 f. eks. Hood et al., Immunology, The Benj amin/Cummings Publishing Co., Inc., Menlo Park, CA (1978), side 39-46;

Mims og White, Viral Pathogenesis and Immunology, Blackwell Scientific Publications, Boston (1984), side 105-106; og Immunology, 2. udg., Bach udg., John Wiley & Sons, New York 25 (1982), side 337-339. Disse fund er i modstrid med situatio nen for anti-VCA-IgM- og -IgG-antistoffer, hvor disse igG-antistoffer er til stede i større mængder tidligt i infektionen, f.eks. efter 2 døgn, idet IgM-antistofferne stiger, topper og falder til mindre niveauer i løbet af en periode 3 0 på ca. 3 måneder, idet de forsvinder nogle måneder efter den akutte sygdom, jfr. Cecil, Textbook of Medicine, Beeson et al., udg., W.B. Saunders Co., Philadelphia (1979) side 264-268.

Disse fund er også i visse henseender i modstrid med 35 fundene ifølge G. Henle et al., J. Infect. Dis., 130, 231-239 (1974). Disse forskere har rapporteret tilsynekomsten af en DK 175828 B1 i 1 55 lav titer af anti-EBNA-antistoffer ca. 2-4 uger efter udbrud af sygdom for nogle få sera, idet lave, men relativt højere titere viser sig fra den anden måned efter udbrud helt til afslutningen af deres studium 12 måneder efter udbrud for 5 flere og flere af disse sera, efterhånden som tiden fra udbruddet vokser. Den teknik, som er anvendt af disse forfattere har været relativt ufølsom og har sandsynligvis kun målt IgG-antistoffer. Derfor har den påviselige tilsynekomst af antistoffer under bedringsstadiet kunnet forventes. Senere 10 har Adniman et al., kapitel 33 i Concepts in Viral Pathogenesis II, Notkins og Oldstone, udg., Springer-Verlag,

New York (1986), side 326, rapporteret, uden at identificere antistofklassen, at anti-EBNA-antistoffer sædvanligvis begynder at vise sig 1-2 måneder efter infektion.

15 De i tabel VI viste resultater er blevet forstærket for yderligere at vise effektiviteten af sammenligning af de relative mængder af IgG- og IgM-anti-EBNA-antistoffer til tilvejebringelse af en diagnose for stadiet af EBV-IM, dvs. akut eller bedring, ved anvendelse af et polypeptid 20 ifølge opfindelsen som et antigen for disse antistoffer.

Nogle af disse resultater i vist i Smith et al., J. Infec.

Dis., 154, 885-889 (november 1986), hvortil der her skal 1 henvises. Nogle eksempelvise data fra denne artikel er vist nedenfor i tabel VIII.

25 j DK 175828 B1 1 56

Tabel VIII

Serologiske data fra patienter med akut, smitsom mononucleose

Dage efter OD 4 901 Forhold

5 udbrud IgG IgM IgG/IgM

Patient l2 1 0,011 0,189 0,058 29 0,023 0,527 0,043 10 95 0,162 0,329 0,492 184 0,552 0,245 2,253 373 0,858 0,152 5,644

Patient 22 17 0,125 0,682 0,183 15 28 0,167 0,674 0,247 68 0,112 0,459' 0,244 194 0,233 0,596 0,390 404 0,674 0,665 1,013 20 Patient 82 8 0,319 1,046 0,305 38 0,165 0,696 0,237 109 0,141 0,603 0,234 404 1,304 0,562 2,320 25

Patient li2 2 0,005 0,055 0,091 23 0,016 0,702 0,023 372 0,878 0,643 1,365 30 1,519 1,079 0,199 5,422 OD 490 = optisk tæthed ved 490 nanometer målt som diskuteret i materialer og metoder, afsnit III K.

2

Sera fra heterofil-negative donorer.

35 2 Serum fra en heterofil-positiv donor.

57 DK 175828 B1

Resultaterne i tabel VIII illustrerer igen stigningen og faldet i tidens løb af IgM-anti-polypeptidantistoffer, og idet IgM-faldet korresponderer med stigningen i IgG-anti--polypeptid-antistoffer for patienter, som er både hetero-5 fil-negative og -positive ved påbegyndelsen af afprøvningsperioden. Antistoffer (IgM og/eller IgG) mod viruscapsidan-tigenet i EBV (VCA) er til stede i alle de undersøgte serumprøver undtagen én for de i alt 13 patienter i studiet.

Sera fra en af de heterofil-negative patienter og to 10 af de tre heterofil-positive patienter har relativt højere IgG-anti-EBNA-polypeptidantistoffer kort efter udbruddet af sygdommen. Forholdet mellem EgG og IgM, selv om det til at begynde med er større end 1, stiger imidlertid i tidens løb for hver enkelt patient, og serumprøverne udviser en almen 15 sænkning af IgM-anti-polypeptid-antistofniveauet koblet med en forsinket, overlappende stigning i IgG-anti-peptidanti-stofniveau. I alle de studerede patientsera har et stigende forhold mellem tilstedeværende IgG-anti-polypeptidantistof og igM-antipolypeptidantistof derfor varslet bedringsfasen 20 for sygdommen, når de maksimale IgG-reaktioner iagttages.

Serumprøver er opnået fra 19 individer, som enten er blevet klinisk diagnostiseret som havende IM, eller som, hvor kliniske data ikke har været til rådighed, er blevet bestemt som indeholdende heterofilantistoffer i deres sera.

25 Disse prøver er blevet afprøvet ved anvendelse af en ELISA--afprøvning ifølge opfindelsen, hvor polypeptid P62 er blevet anvendt som det fastfasebundne antigen. IgG-, IgM- og IgA--niveauerne i disse sera er blevet bestemt, og niveauerne af anti-EBNA-IgG og -IgM er blevet sammenlignet som et for-30 hold. IgA-niveauerne har ikke udvist nogen skelnelig korrelation. Resultaterne af denne afprøvning for IgG og IgM er vist i nedenstående tabel IX.

58 DK 175828 B1

Tabel IV

Anti-EBNA-antistofnuveauer i heterofil-positive sera

Prøve- QD 4901 Forhold

nummer IgG IgM IgG/IgM

5 - 1 0,018 0,609 0,029 i 22 0,055 1,074 0,051 3 0,133 0,412 0,322 4 0,035 0,545 0,064 10 5 0,087 0,491 0,177 62 0,319 1,046 0,305 7 0,016 0,388 0,041 8 0,315 1,245 0,253 9 0,118 1,255 0,094 15 10 0,300 0,753 0,039 li3 0,019 0,918 0,020 ; 12 0,002 0,415 0,005 13 0,282 0,928 0,300 14 0,004 0,572 0,007 20 15 0,007 0,779 0,009 16 0,009 0,396 0,023 17 0,005 0,446 0,011 18 0,002 0,404 0,005 19 0,002 0,730 0,003 25 - - OD 490 = optisk tæthed ved 490 nanometer målt som diskuteret i materialer og metoder, afsnit III K.

2 Sera har relativt forhøjede IgA-niveauer, dvs. over en OD 94 på 0,300.

30

Data i tabel IX viser igen, at sera fra patienter med den aktive, akutte sygdom indeholder relativt forhøjede niveauer af IgM-anti-EBNA-antistoffer, som binder til poly-peptidantigenet, sammenlignet med niveauerne af IgG. Disse 35 data viser også forhøjede niveauer af anti-EBNA-antistoffer sammenlignet med sera fra VCA'-patienter som vist i tabel V. Tilstedeværelsen af negligerbare niveauer af IgG-anti- 59 DK 175828 B1 -polypeptid-antistoffer er i overensstemmelse med iagttagelserne af G. Henle et al., J. Infect. Dis., 130, 231-239 (1974) .

Sera fra ca. 10% af akutte, EBV-fremkaldte tilfælde 5 af IM mangler heterofilantistoffet, som bestemt ved konventionel serologi. Da heterofilantistoffet og anti-EBNA-an-tistofferne burde være uden relation, er en række yderligere sera fra heterofil-negative IM-patienter blevet analyseret ved den i tabel IX anvendte afprøvning. Resultaterne er 10 vist i nedenstående tabel X. Det er enten klinisk eller ved konventionel EBV-serologi blevet bekræftet, at disse patienter har akut IM. Hvert serum har positive VCA-IgM- og EBV-tidligt antigen-diffuse (EA-D) titere, hvilket i forbindelse med negative EBNA-titere (ved ACIF) sædvanligvis be-15 tragtes som holdepunkter for akut IM, uanset tilstedeværelsen af heterofilantistof.

60 DK 175828 B1

Tabel X

Anti-polypeptid-EBNA-niveauer i heterofil-negative sera fra patienter med akut sygdom

Serum OD 490·^· Forhold

5 nummer^ IgG IgM IgG/lgM

1 0,706 1,449 0,49 2 0,836 1,232 0,68 3 0,182 0,713 0,255 10 4 0,013 0,694 0,018 5 0,351 0,736 0,476 6 0,033 0,841 0,039 7 0,029 0,758 0,038 8 0,011 0,456 0,024 15 9 0,014 0,538 0,026 10 0,163 0,757 0,215 1 OD 490 = optisk tæthed ved 490 nanometer målt som diskuteret i materialer og metoder, afsnit III K.

20 2 Hver enkelt serumprøve er blevet afprøvet og har vist sig positiv for VCA-IgG og EA-D og negativ for EBNA--antistoffer ved ACIF.

I alle de viste tilfælde er forholdet mellem IgG og 25 IgM ved anti-EBNA-polypeptid-ELISA under 1,0 og ligeledes under 0,7. Det er tydeligt ud fra disse data, at anti-EBNA-polypeptid P62-ELISA er i stand til at påvise IM i hetero-fil-negative individer, når IgG/IgM-anti-polypeptidforholds-diskriminatoren anvendes på disse ELISA-data.

30 En yderligere illustration af den manglende kobling mellem tilstedeværelsen af heterofilantistoffer og IgM-anti-polypeptidantistoffer og den tidlige påvisning af anti-po-lypeptider, som en afprøvning ifølge opfindelsen giver, er vist ved data i nedenstående tabel XI. Disse data supplerer 35 også de i fig. V viste data, hvad angår den tidlige påvisning af disse antistoffer ved anvendelse af en afprøvning ifølge opfindelsen i sammenligning med ACIF.

61 DK 175828 B1

Her er 8 sæt parrede sera blevet afprøvet ved en konventionel, kommerciel afprøvning for heterofilantistoffer og ved anti-polypeptid P62-ELISA. I hvert enkelt tilfælde har den første serumprøve været negativ ved førstnævnte 5 afprøvning, men positiv ved sidstnævnte. Individerne har udvist symptomer på IM på tidspunktet for den første åreladning. I disse individer har IgM-anti-polypeptid P62-anti-stoffer derfor vist sig i sera før heterofilantistofferne, som vurderet ved konventionel serologi. I de første to til-10 „ fælde i tabellen er tidsrummene mellem åreladningsdatoerne henholdsvis 14 og 8 døgn.

62 DK 175828 B1

Tabel XI

Anti-polypeotid P62-antistoffer påvises før heterofilantistoffer ved akut IM Patient Forhold Hetero- 5 nummer3 IgG IgM IgG/lgM fil3 1 0,122 0,488 0,25 0,399 0,940 0,42 + 2 0,064 0,512 0,125 10 0,749 1,10 0,68 + 3 0,013 0,364 0,036 0,04 0,592 0,068 + 4 0,009 0,597 0,015 0,038 0,696 0,055 + 15 5 0,007 0,472 0,015 0,079 0,624 0,13 + 6 0,014 0,363 0,04 0,086 0,937 0,09 + 7 0,009 0,447 0,02 20 0,021 0,584 0,04 + 8 0,023 0,466 0,05 0,951 0,50 1,9 + 1 OD 490 = optisk tæthed ved 490 nanometer målt som dis-25 kuteret i materialer og metoder, afsnit III K.

3 Den første serumprøve er opnået, når symptomer på akut IM viser sig. Den anden prøve er opnået fra samme individ kort tid senere. Akut IM er i hvert enkelt tilfælde blevet bekræftet ved den endelige tilstedeværelse af heterofil-30 antistoffer.

3 Tilstedeværelsen af heterofilantistoffer er blevet bestemt ved anvendelse af et kommercielt prøvesæt.

De ovenfor beskrevne mængdeforholdsafprøvninger an-35 vendes, selv om de har et kvalitativt aspekt, idet tilstedeværelsen af anti-P62-antistoffer bestemmes, primært kvantitativt til fastlæggelse af de relative mængder af anti- 63 DK 175828 B1 -P62-IgM- og IgG-antistoffer, som er til stede i den humane legemsprøve. Denne primært kvantitative afprøvning kræver normalt ca. 2,5 timer til gennemførelse, efter at fastfase-bærerne er fremstillet.

5 Et mere kvalitativt forhold, som kræver lidt mere end 6 minutter til gennemførelsen efter fremstilling af fastfasebæreren, er også blevet udviklet. Denne afprøvning anvender tilsvarende metodologi og kemi som de ovenfor beskrevne afprøvninger, men sætter sin lid til en visuel sam-10 menligning af farveintensiteter produceret ved hjælp af et ovenfor diskuteret indikatormiddel og substrat til vurdering af de relative mængder af anti-peptid-P62-IgG- og IgM-anti-stoffer, som er til stede i den afprøvede prøve, og derfor vurderer, om sygdommens tilstand er akut, bedring eller ved 15 at gå fra akut til bedring.

Ved foretrukne udførelsesformer udgøres fastfasebæ-reren af en hvid, opak polystyren-"ske"-grundmasse. Fastfase- "ske" -grundmassen er konstrueret til at indeholde to tilstødende huller, hvortil polypeptid P62 fæstnes. Hullerne 20 er adskilt af en ophøjet spærring, som virker til at forhindre, at væske fra det ene hul kommer ind i det andet.

Afprøvninger for anti-IgM- og anti-IgG-antistoffer gennemføres separat som alment beskrevet ovenfor, men gennemføres her fortrinsvis side om side (en analyse for hver 25 af antistoftyperne i hvert hul) og praktisk taget samtidigt.

1 stedet for at bestemme optiske tæthedsværdier eller andre mærkningstegn mekanisk sammenligner brugeren desuden blot farveintensiteterne af hvert hul med øjnene.

Selv om denne afprøvning kræver mindre end ca. l/lO 30 af tiden for den ovenfor beskrevne afprøvning, udviser den en yderst høj specificitet og følsomhed. Desuden tilpasses den let til anvendelse i en læges klinik, således at lægen og patienten kan vide resultaterne af afprøvningen, medens patienten er i klinikken.

35 Yderligere detaljer ved denne afprøvning er tilveje bragt i materialer og metoder, afsnit III D.

64 DK 175828 B1 (c) Afprøvninger for EBV-IM og CMV-IM.

Epstein-Barr-kerneantigenet indeholder en særegen sekvens på over 200 aminosyrer, som kun indeholder aminosy-5 rerne glycin og alanin. Peptider fremstilles ud fra disse sekvenser er immunoreaktive med sera fra VCA-positive individer som vist ovenfor. Endvidere er et peptid fra denne sekvens, P62, det mest immunoreaktive med sera fra patienter med akut EBV-infektion, jfr. Rhodes et al., i Herpesvirus, 10 R. Rapp udg., Alan R. Liss, New York, side 487-496 (1984);

Rhodes et al., J. Immunology, 134, 211-216 (1985); Smith et al., J. Infec. Dis., 154, 885-889 (1986); og Geltosky et al., J. Clin. Lab. Analysis, 1, 153-162 (1987). Patienter med akut EBV-IM har IgM-antistoffer mod EBNA-proteiner i 15 adskillige EBV-positive cellelinier, jfr. Geltosky et al., J. Clin. Lab. Analysis, 1, 153-162 (1987); Rhodes et al., J.

Exp. Med., 165, 1026-1040 (1987), påvist ved immunopletning.

De i det efterfølgende diskuterede resultater illustrerer, at sekventielle sera fra ikke alene EBV-IM, men 20 også fra cytomegalovirusfremkaldte (CMV), mononucleaseagtige sygdomme (CMV-IM) har IgM-antistoffer rettet mod EBNA-P62--epitoperne i sygdommens akutte fase. Sekventielle serumprøver udtaget fra 8 patienter med akut CMV-infektion viser alle en skarp stigning af IgM-anti-P62-antistoffer under 25 den akutte sygdom. Den samme reaktion ses i både patienter med en overstået EBV-infektion samt i et individ, som har været inficeret med CMV før EBV. Immunopletning af serummet fra både med akut EBV og med akut CMV indifcerede IM-patien-ter viser, at samme sæt af IgM-antistoffer tilskyndes af 30 begge vira, og at antistoffer reagerer med en række normale celleproteiner, som er til stede i uinficerede celler. Derfor er tilstedeværelsen af disse IgM-antistoffer diagnostisk for akut infektion med enten EBV eller CMV.

65 DK 175828 B1 (i) Sekventielle sera fra en patient med EBV-IM har IgM-antistoffer mod P62 og EBNA-1 i den akutte sygdomsfase.

IgM-antistoffer, som erkender peptid-EBNA-P62 påvises 5 ved en ELISA-afprøvning under den akutte fase af EBV-IM, jfr. Rhodes et al., i Herpesvirus, R. Rapp udg., Alan R.

Liss, New York, side 487-496 (1984); Rhodes et al., J. Immunology, 134, 211-216 (1985); Smith et al., J. Infec. Dis., 154, 885-889 (1986); og Geltosky et al., J. Clin. Lab. Ana-10 lysis, 1, 153-162 (1987). Disse iagttagelser er blevet bekræftet, når sekventielle sera fra D.B., en patient med EBV-IM, er blevet analyseret for immunoreaktivitet ved EBNA--P62-ELISA (fig. 6).

Disse data viser en tidlig stigning af IgM-antistoffer 15 i sygdommens akutte fase (januar-marts 1985), hvilket svarer til den tidlige stigning af VCA-IgM- og -IgG-antistoffer (1:2) uden anti-EBNA ved den traditionelle IFA-metode. Sera fra denne patient har en langsom stigning i IgG-antistoffer mod P62, hvilken stigning når toppen i prøverne fra marts-20 -april 1985 efter sygdommens akutte fase. IgG/lgM-forholdet overstiger 0,7 i prøven fra maj 1985, da patienten er i den sene bedringsfase af sygdommen. På dette tidspunkt udvikles anti-EBNA-titere, og VCA-IgM-titere kan kun lige påvises ved konventionel EBV-serologi.

25 Den dramatiske stigning i antistoffer, som er speci fikke for IgM-klassen, under sygdommens akutte fase er blevet bekræftet ved immunopletningsteknikken (fig. 7) . De samme serumprøver, som er anvendt til ELISA, er blevet anvendt ved immunopletningsstudier til påvisning af antigener, som 30 er til stede i en EBV-transformeret B-cellelinie.

Som det kan ses af fig. 7, erkender de i patientse-rummet tilstedeværende IgM-antistoffer en række på 8 større og flere mindre bånd i ekstrakten. IgM-antistofferne mod de fleste af disse proteiner vokser i de første to serumprøver, 35 topper ved den tredje prøve og falder derefter. Dette er den samme tidssekvens, som er iagttaget ved peptid-ELISA.

66 DK 175828 B1

De proteiner, som erkendes af IgM-antistofferne, omfatter EBNA-1 ved 77 kD samt en række normale celleprotei-, ner (bånd ved 92, 82, 80, 69, 62 og 58 kD) , som indeholder j epitoper med relation til glycin-alanin-regionen i EBNA-l, 5 jfr. Rhodes et al., J. Exp. Med., 165, 1026-1040 (1987).

Antistoffer mod proteinerne ved 120 og 29 kD, som ingen sekvenser har fælles med EBNA-1, jfr. Rhodes et al., J.

Exp. Med., 165, 1026-1040 (1987), synes at toppe tidligere.

Der er således en god korrelation mellem IgM-antistofferne 1 10 mod det syntetiske peptid P62 og hovedparten af IgM-anti stof fer påvist ved Western-pletning.

IgG-antistofferne mod EBNA-1 (77 kD) hos patent D.B. viser sig sent på immunopletterne (fig. 7), en iagttagelse, som er i overensstemmelse med data fra EBNA-P62-ELISA. På 15 venstre side af pletten i fig. 7 er den stærke IgG-reaktion på EBNA-båndet på 77 kD fra et VCA-positivt (VCA+) , EBNA-i -1-positivt (EBNA-1+) individ vist som kontrol. IgG-anti- -EBNA-1-antistoffer påvises først i pletterne 51 dage efter udbruddet af sygdommen (fjerde tidspunkt), det samme tids-20 punkt, hvor IgG-antistoffer mod peptidet begynder at stige.

(ii) Sekventielle sera fra en patient med CMV-IM, som senere udvikler EBV-IM.

Sekventielle serumprøver fra patient D.S. er også I 25 blevet analyseret ved EBNA-P62-ELISA og Western-pletning.

I De klinisk/serologiske data fra denne patient er blevet offentliggjort, og ved klassisk serologi er det blevet vist, at han har haft en akut CMV-infektion efterfulgt tre måneder senere af en akut EBV-sygdom.

30 Resultaterne af anti-peptid-ELISA-studierne ved an vendelse af sekventielt udtagne sera fra patient D.S. er vist i fig. 8. Sera fra patient D.S. har i sygdommens akutte CMV-fase en udtalt IgM-reaktion på peptidet P62 påvist ved ELISA, ligesom patient D.B. har haft under hans akutte EBV-35 -infektion. IgM-anti-peptidsignalet er højt for de tre serumprøver opnået under den første sygdom og er også forhøjet 67 DK 175828 B1 i den første prøve fra den anden sygdom. Det vides ikke, om antistof niveauet er gået ned mellem de to sygdomme. IgG-anti-stofferne mod polypeptid P62 er ikke blevet påvist før den sidste serumprøve, som er opnået ét år efter den anden syg-5 dom.

Prøver fra denne patient er også blevet analyseret ved immunopletning (fig. 9) . IgM-antistoffer mod proteiner med molekylvægte 82, 80-77, 69, 62 og 58 kD er blevet fundet under begge infektioner. Man må også lægge mærke til, at 10 IgM-antistofferne erkender de samme antigener under begge sygdomme. De IgM-antistofniveauer, som er målt i pletterne, er på deres højeste niveauer under den første og den indledende del af den anden infektion og falder derefter, et fund, som er mage til det, som ses ved anti-peptid P62-ELISA.

15 IgG-antistof mod EBNA-1 viser sig kun på det sidste tidspunkt (svagt bånd ved siden af en normal VCA+, EBNA-1+ kontrol i højre kolonne).

Begge patienter har vist en tidlig IgM-anti-peptid P62-reaktion, som korrelerer med IgM-antistoffer mod en 20 række bånd, som ses i Western-pletterne. IgG-anti-peptid P62-reaktionen indtræder langt senere og er korreleret med tilsynekomsten af IgG-antistoffer, som er specifikke for EBNA-1-proteinet. Dette er i overensstemmelse med det, som tidligere er blevet rapporteret, jfr. Rhodes et al., i Her-25 pesvirus, R. Rapp udg., Alan R. Liss, New York, side 487-496 (1984); Rhodes et al., J. Immunology, 134, 211-216 (1985);

Smith et al., J. Xnfec. Dis., 154, 885-889 (1986); og

Geltosky et al., J. Clin. Lab. Analysis, 1, 153-162 (1987); og Rhodes et al., J. Exp. Med., 165, 1026-1040 (1987).

30 Det overraskende fund er, at CMV-infektion tilskynder

IgM-antistoffer med disse ens egenskaber. Det vil sige IgM--antistoffer, som viser sig under CMV-infektioner, reagerer med en række antigener med en størrelse, som tilsyneladende er identisk med størrelsen af dem, som forekommer under 35 EBV-infektion.

68 DK 175828 B1 j (iii) Sera fra 10 patienter med akut CMV-IM.

Sera fra 10 patienter med CMV-IM er blevet studeret ved ELISA og ved immunopletter til bestemmelse af, om IgM--antistofferne mod EBNA-P62 påvist i sera fra patient D.S.

5 og dem i immunopietterne er særegne for denne patient, eller om denne reaktion kan påvises i sera fra andre patienter med CMV-IM. Alle disse patienter har haft en tidligere EBV--infektion som vist ved positive IgG-VCA-titere og positive EBNA-l-titere ved IFA.

10 Repræsentative anti-peptid-P62-data fra to af disse patienter er vist i figurerne 10A og 10B. Alle 10 patienter har vist en udtalt stigning i IgM-anti-peptid P62-antistoffer under CMV-sygdommens akutte fase. IgM-antistofferne vedvarer i 1-2 måneder og vender derefter tilbage til baggrundsni-15 veauer.

I modsætning hertil starter IgG-anti-peptid P62-antistoffer på en positiv værdi (da patienterne er EBV+, VCA+, EBNA-1+) og viser ringe ændring under sygdomsforløbet. Ud af 7 patienter med sekventielle serumprøver har faktisk 4 20 vist svage stigninger i IgG-anti-pepti-P62-antistofniveaueme (f.eks. fig. 10B) , én har vist et fald (fig. 10A) , og to har ingen ændring vist.

De samme sera er også blevet analyseret ved immuno-pletning. Alle patienterne har vist en forbigående stigning 25 i IgM-antistoffer mod en række antigener under sygdommens akutte fase mage til dem, som ses i fig. 7 og 9. Kun en ringe, om overhovedet nogen, ændring har kunnet påvises i IgG-anti-EBNA-1-antistofniveauerne.

Således har alle patienter undersøgt med akutte CMV-30 -infektioner vist en udtalt, forbigående stigning i IgM-an-ti-peptid P62-antistoffer med en mindre og variabel ændring i IgG-anti-peptidniveauet.

Forholdet mellem IgG og IgM er en bekvem måde til at udtrykke anti-peptid-P62-data fra EBV-IM-patienter. Som 35 tidligere illustreret er dette forhold under 1 under sygdommens akutte fase og stiger under bedringen til en værdi 69 DK 175828 B1 på over 1, hvor det forbliver i resten af individets levetid, jfr. Rhodes et al., J. Exp. Med., 165, 1026-1040 (1987).

Fordelen ved denne forholdsanalysemetode er, at den undgår at skulle definere baggrundsværdier og afskæringsværdier, 5 jfr. Geltosky et al., J. Clin. Lab. Analysis, 1, 153-162 (1987) .

Analyseret ved forholdsmetoden har dette studium afsløret to almene typer af immunreaktioner mod polypeptid P62-epitopen. F.eks. har sera fra patient L.S. (fig. 10A) 10 vist den dominerende reaktion. Her iagttages der et forhold på næsten 2 i prøver før sygdommen. Dette forhold falder til under 1 (til 0,661) under den akutte sygdom og stiger derefter igen under bedringen. I alt 8 ud af 10 patienter med en akut CMV-IM-infektion har scoret positivt ved EBNA-15 -P62-ELISA ved forholdsanalysen.

Patienterne S.G. og G.S. har vist en anden type reaktion på P62. Selv om de begge har udvist en stigning i IgM--antistoffer under den akutte sygdom, forbliver den maksimale værdi under IgG-niveauerne. Disse sera scorer negativt ved 20 forholdsanalysen. I begge tilfælde skyldes det falske, negative resultat et højt begyndelses-IgG-signal. Selv om en forudgående CMV-infektion er relativt sjælden i den aldersgruppe af individer, som pådrager sig EBV-IM, kan der således forekomme nogle falske, negative resultater ved anvendelse 25 af IgG/IgM-forholdsmetoden.

(iv) Direkte sammenligning af de antigener, som erkendes af IBV-IM- og CMV-IM-sera.

Et meget ens mønster af antigener erkendes af IgM-an-30 tistoffer under akutte EBV- og CMV-infektioner (sammenlign fig. 7 og 9). Til direkte sammenligning af disse antigener er sera fra patienter med hver af sygdommene blevet immuno-plettet side om side med samme celleekstrakt. De til ekstrakten anvendte celler har været cellelinien K562. Det er 35 vigtigt at lægge mærke til, at disse celler ingen EBV- eller CMV-sekvenser indeholder. Eventuelt påviste antigener er 70 DK 175828 B1 således normale celleproteiner.

Data fra dette studium med relation til binding af IgM-antistoffer er vist i fig. 11A. Kolonnerne 1, 2, 9 og 10 er blevet sonderet med sera fra EBV-IM-patienter, medens 5 de øvrige kolonner er blevet sonderet med sera fra patienter med akutte CMV-IM-infektioner.

Som det kan ses af denne figur, har hovedantigenbån-dene ved 92, 82-77, 69, 62 og 58 kD identiske reaktiviteter med sera fra patienter inficeret med hvert af disse vira.

10 Nogle mindre intense bånd ses også i begge patientgrupper.

Der er et bånd ved ca. 50 kD, som ser ud til kun at findes i CMV-patienterne, men dette er en undtagelse. Alle andre bånd findes enten i et eller nogle få sera eller er fælles for alle sera. Infektion med et vilkårligt af disse vira 15 har således tilskyndet IgM-antistoffer mod samme sæt af proteiner.

Det samme sæt af sera er også blevet plettet ved anvendelse af en ekstrakt af CMV-inficerede fibroblaster. IgG-antistof er blevet påvist ved de studier, som er vist i 20 fig. 11B.

I denne figur kan det ses, at alle CMV-patienter har haft IgG-antistoffer mod et prominent antigen på 50 kD, et andet ved 64 kD og andre, som kun har været til stede i nogle få af CMV-patienterne. Ringe, om overhovedet nogen, 25 reaktion ses i de EBV-inficerede patienter. Arbejde under udførelse antyder, at alle de bånd, som ses ved dette studium, skyldes viralt kodede CMV-proteiner.

Konklusionen er, at akut infektion med CMV eller EBV tilskynder et fælles sæt af IgM-autoantistoffer. I modsætning 30 hertil er IgG-antistofferne specifikke for proteiner fra det virus, som forårsager sygdommen, og disse IgG-antistoffer har ingen reaktivitet med værtskomponenter, jfr. Rhodes et al., J. Exp. Med., 165, 1026-1040 (1987).

71 DK 175828 B1 (v) Inhibering af antistofbinding med peptid P62 .

Det er tidligere blevet vist, at peptid P62 inhiberer antistofbinding til en række IgM-antistoffer tilskyndet af 5 EBV, jfr. Rhodes et al., J. Exp. Med., 165, 1026-1040 (1987).

Dette er igen vist i fig. 12, hvor E3V+-sera er blevet plettet på en ekstrakt af EBV+-B-celler.

I fig. 12 indeholder kolonne 1 serum fra patient D.B. 15 dage efter sygdomsudbrud, og kolonne 5 indeholder 10 et andet serum fra akut EBV-IM. Kolonnerne 2 og 6 har de respektive sera, som yderligere indeholder 4 00 /^g/ml af peptidet P62. Disse studier er blevet foretaget ved højere serumfortyndinger end dem, som er vist i fig. 7, således at kun de stærkest reaktive bånd ville være let synlige.

15 Som det kan ses af fig. 12, har polypeptidet inhiberet

IgM-antistofbinding til flere proteinbånd, og de letteste at se er båndene ved 82-77 kD. Igangværende arbejde antyder, at dette areal indeholder EBNA-1 og et eller flere celleproteiner.

20 Kolonne 3 indeholder serum fra patient D.S. 12 døgn efter udbruddet af hens CMV-sygdom, medens kolonne 4 er samme serum plus peptid P62 som før. Igen er IgM-reaktiviteter med båndene på 82-77 kD samt nogle i området 78-62 kD blevet inhiberet af EBV-peptidet.

25 Inhiberingsstudier af de IgG-antistoffer, som ses ved pletningsforsøg, er også blevet gennemført. Kolonne 7 indeholder serum fra patient D.B. 514 døgn efter sygdomsudbrud, kolonne 9 indeholder serum fra patient D.S. 417 døgn efter udbrud af hans CMV-sygdom, og kolonne 11 er fra 30 en normal voksen person med en forlængst overstået .EBV-in-fektion. Kolonnerne 8, 10 og 12 indeholder de respektive sera med 50 μ9/τη1 P62.

Det eneste påviste protein er EBNA-1-båndet ved 77 kD. Binding til dette protein er inhiberet af peptidet i 35 alle tilfælde.

Konklusionen af disse studier er, at CMV-infektion 72 DK 175828 B1 producerer IgM-autoantistoffer, som erkender et peptid fra EBNA-1-regionen i EBV. Disse IgM-antistoffer erkender en række celleautoantigener, som er identiske i mobilitet og deler en epitopspecificitet med dem, som produceres under 5 EBV-infektion.

(d) Afprøvning for nasopharyngeal carcinoma (NPC).

Som ovenfor nævnt har EBV været impliceret som årsagen 10 til nasopharyngeal carcinoma (NPC). Nasopharyngeal carcinoma er en hovedform for kræft i Kina med en hyppighed så høj som 100 pr. 100.000 personer pr. år.

Western-pletanalyser ved anvendelse af EBV-inficerede Wi-L2-celleekstrakter med sera fra en normal VCA+-person, 15 en patient med IM og 6 patienter med NPC har vist en IgG-im-munoreaktion med EBNA-proteinet, IgM- og IgG-reaktioner på EBNA-proteinet med serummet fra IM-patienten og IgG-, IgM-og IgA-reaktioner på EBNA-proteinet fra NPC-patienterne.

Nylige studier har vist, at serumniveauer af IgG- og 20 IgA-antistoffer mod en mangfoldighed af EBV-antigener er signifikant forhøjet hos NPC-patienter, jfr. Henle et al.,

Int. J. Cancer, 17, 1-7 (1976); Desgranges et al., Int. J. Cancer, 19, 627-633 (1977); Pearson et al.. Cancer, 51, 260-268 (1983). Mere specifikt har Henle et al. rapporteret 25 høje IgA-serumtitere mod VCA- og D-antigenerne (diffuse), hvilke titere lejlighedsvis har svaret til IgG-titerne mod disse antigener. Desgranges et al. har anvendt spyt og har rapporteret fund af neutraliserende IgA- og IgG-antistoffer mod VCA og EA (tidligt antigen) . Pearson et al. har rap-30 porteret den diagnostiske effektivitet af en IgA-anti-VCA--afprøvning koblet med en IgG-anti-EA-afprøvning. Disse studier har ikke rapporteret tilstedeværelsen af IgA-anti--EBNA-antistoffer i de prøver, som de har undersøgt.

En række sera fra patienter, som vides at have NPC 35 er blevet afprøvet ved anvendelse af en fastfase-ELISA med polypeptid P62 fæstnet til den faste grundmasse til dannelse 73 DK 175828 B1 af en fast bærer som ovenfor diskuteret. Disse sera er også blevet afprøvet ved serologiske standardprøver. Resultaterne er vist i nedenstående tabel XII.

5 Tabel XII

ELISA-værdier på sera fra NPC-patienter Anti-EBV-titere·*· Anti-P62-titere^

Prøver VCA ΞΑ IgA IgA IgM IgG

10 1 320 120 60 0,617(+) 0,642 1,686 2 960 40 60 0,376(-) 0,541 1,570 3 640 120 15 0,737(+) 0.247 1,143 4 320 NT 30 0,289(-) 0,173 0,958 5 1920 320 240 0,871(+) 0,303 2,000 15 6 960 80 80 0,738(+) 0,334 0,915 7 640 320 10 0,675(+) 0,216 0,993 8 960 640 320 0,667(+) 0,478 1,160 9 480 NT 15 0,701(+) 0,417 1,324 10 640 60 20 0,024(-) 0,159 0,207 20 11 1280 240 80 0,466(+) 0,142 1,139 12 240 40 80 0,651(+) 0,725 1,360 13 1280 120 160 0,421(+) 0,190 1,566 NT = ikke afprøvet.

25 1 Anti-EBV-polypeptid P62-ELISA er blevet gennemført på disse sera som beskrevet i afsnittet materialer og metoder. Plustegn (+) angiver optiske tæthedsværdier, som betragtes som positive for NPC, medens minustegn angiver optiske værdier, som betragtes som negative 30 for NPC.

Som det kan ses af ovenstående data, har de serologiske afprøvninger for VCA, EA og IgA korreleret godt med en relativt forhøjet IgA-anti-peptid P62-titer. IgA-anti-35 -peptid P62-titeren er ikke blevet inhiberet af nærværelsen af IgM- eller IgG-antistoffer, som er til stede i serummet. Desuden kan det ses, at forholdet mellem IgM og IgG viser, 74 DK 175828 B1 at patienterne ikke har akut IM. Desuden har anti-EBNA-ti-tere, som bestemt ved ACIF, vist sig at være uden relation til sygdommen.

Ved studium af sera fra normale personer, som har 5 NPC, er en OD490-værdi på 0,3 blevet fundet som kontrolværdien for denne IgA-afprøvning. Ved dette specielle afprøv- ningsskema er en OD^Q-værdi signifikant over 0,3 blevet taget som en positiv indikator for NPC. 1 ovenstående tabel har 10 ud af 13 sera således været positive for NPC og er 10 angivet ved hjælp af et plustegn (+).

Den ovenfor diskuterede, almene afprøvningsmetode til påvisning af anti-EBNA-antistof fer ses også at være effektiv ved påvisning af tilstedeværelsen af NPC hos en person. En antistofholdig legemsprøve, såsom serum, plasma, 15 spyt, opspyt eller en strubevask, anvendes. Legemsprøven blandes med fastfasebæreren i et vandigt medium som ovenfor beskrevet. Her afprøves mængden af IgA-antistoffer, idet en relativt forhøjet mængde over en kontrol angiver tilstedeværelsen af NPC.

20 (e) Immunologiske krvdsreaktivitet af EBV- og CMV-relaterede peptider.

Herpesviruset humant cytomegalovirus (CMV) har været impliceret som et vigtigt pathogen, som kan forårsage fød-25 selsdefekter og opportunistisk infektion hos immunounder-trykte individer. CMV-virus forårsager også en "mononucleo-seagtig" sygdom (CMV-IM) mage til smitsom mononucleose forårsaget af EBV (EBV-IM).

Under kliniske studier af anvendelsen af en på poly-30 peptid P62 baseret ELISA til påvisning af tilstedeværelsen af anti-EBNA-antistoffer hos patienter med EBV-IM i den akutte fase, er det blevet iagttaget, at ca. 60-70% af de heterofil-negative tilfælde af CMV-IM har scoret positivt ved den P62-baserede ELISA. Tilstedeværelsen hos CMV-IM-35 -patienterne af antistofferne, som kan immunoreagere med P62, formodes at være resultatet af enten reaktivering af 75 DK 175828 B1 den latente EBV-infektion af den øjeblikkelige CMV-infektion eller resultatet af produktionen af et CMV-protein, som er immunologisk krydsreaktivt med EBNA.

Til undersøgelse af den mulighed, at serummet fra 5 CMV-inficerede individer indeholder P62-krydsreaktive antistoffer tilskyndet af et CMV-kodet antigen, er der blevet syntetiseret tre CMV-beslægtede polypeptider, som er vist i tabel XIII.

10 Tabel XIII

Peptid- sekvens Aminosyresekvens

Cl AGGGGGGGAGGGGGGGGSGG

15 C2 SSSSAGGGGGGGAGGGGGGGGSGG

C3 S S S S A G G G G GGGAGGGGGGGGSGGC

-1. Aminosyrerestsekvensen i peptiderne Cl, C2 og C3 svarer hver især til en del af et polypeptid, om hvilket det er 20 forudsagt, at det eksprimeres af en kodende region i exon 1 i den CMV-RNA på 2,2 kilobase, som er beskrevet af Stapraus et al., J. Virol., 57, 591-602 (1986).

Serumprøver opnået under forløbet af IM fra udvalgte 25 patienter er blevet afprøvet for IgG- og IgM-immunoreak-tivitet mod polypeptiderne P62, Cl og C2 ved anvendelse af en ELISA mage til den, som er beskrevet i metoder og materialer, afsnit HID. Fig. 14 illustrerer resultaterne af dette studium ved anvendelse af de serumprøver, som er opnået 30 fra en patient (D.B.) med en EBV-infektion, som resulterer i udviklingen af akut IM efterfulgt af sygdommens bedringsfase. Disse resultater illustrerer det ovenfor beskrevne mønster med påvisning af anti-P62-IgM-antistoffer under den akutte fase af EBV-IM og stigningen i anti-P62-IgG-antistof-35 fer (og et ledsagende fald i anti-P62-IgM) under bedring.

Fig. 14 illustrerer ligeledes, at de samme sekventielle prøver opnået fra patient D.B. viser sig at indeholde 76 DK 175828 B1 anti-Cl- 09 anti-C2-IgM-antistoffer under sygdommens akutte fase, når CMV-beslægtede peptider Cl og C2 anvendes som fastfaseantigen (mål) ved ELISA. Medens IgM-anti-Cl- og -anti-C2-antistofreaktionen falder, når bedringen sætter 5 ind, er der imidlertid ikke blevet påvist nogen ledsagende | stigning i anti-Cl- eller anti-C2-IgG-antistof.

Sekventielle serumprøver fra en anden patient (D.S.) med·en primær CMV-infektion, som resulterer i akut CMV-IM, efterfulgt af en sekundær EBV-infektion, som resulterer i 10 akut EBV-IM, er blevet afprøvet som ovenfor beskrevet ved P62-, Cl- og C2- ELISA. Som illustreret i fig. 15 har hver enkelt af disse ELISA'er påvist IgM-anti-peptidantistoffer under de akutte faser af CMV- og EBV-infektionerne.

Den immunologiske aktivitet af de CMV-beslægtede J 15 peptider er blevet yderligere undersøgt ved et studium af evnen hos antistoffer tilskyndet af Cl, C2 og C3 til im-munoreaktion med EBNA. Kanin-anti-peptidantisera mod Cl, C2 og C3 er hver især blevet immunoreageret med ekstrakter af celler, som eksprimerer EBNA, ved anvendelse af en immuno-20 pletningsmetode mage til den, som er beskrevet i metoder og materialer, afsnit HIG. Resultaterne af immunopletningsstu-diet viser, at anti-Cl-, anti-C2- og anti-C3-kaninantistoffer immunoreagerer med EBNA.

Endvidere blokeres immunoreaktionen med EBNA-protein, 25 når anti-Cl- og anti-C2-kaninantistofferne holdes sammen med deres respektive peptider før immunopletning.

Desuden viser ovenstående resultater, at polypep-tiderne Cl, C2 og C3 kan immunoreagere med IgM-antistoffer fremkaldt af EBNA, og at antistoffer fremkaldt af disse 30 peptider immunoreagerer med EBNA.

Både EBV og CMV producerer en godartet, lymphoproli-ferativ sygdom, hvis akutte fase er karakteriseret ved produktet af IgM-antistof fer, som immunoreagerer med et polypep-tid ifølge opfindelsen. Da anti-EBNA-antistoffer typisk 35 ikke findes i forbindelse med ondartet lymphoproliferativ sygdom, tilvejebringer den foreliggende opfindelse derfor 77 DK 175828 B1 et diagnosesystem og en diagnosemetode til skelnen mellem virusfremkaldt, godartet og ondartet, lymphoproliferativ sygdom.

5 3. Præparat til passiv immunisering.

En patient med latent inficerede B-lymphocyter, som eksprimerer EBNA på deres celleoverflader, kan behandles med receptorer, fortrinsvis som hele antistoffer, frembragt imod de syntetisk polypeptider ifølge opfindelsen, som im-10 munoreagerer med EBNA. Receptorerne indgives i en enhedsdosis med en effektiv mængde receptorer dispergeret i et farmaceutisk acceptabelt fortyndingsmiddel.

En effektiv mængde af sådanne antistoffer varierer afhængigt af reaktiviteten og typen af antistofferne. Almin-15 deligvis anses fra ca. 0,5 mg til ca. 25,0 mg antistof pr. kg patientlegemsvægt for effektiv. Antistofferne kan indgives intravenøst, intramuskulært eller intraperitonealt, idet flere indgivelser gives med mellemrum på 3-20 døgn. Antistofferne kan også indgives i forbindelse med kirurgisk 20 eller kemisk behandling.

Antistofferne kan fås fra sera eller plasma fra en dyreart, som er forskellig fra den patient, som skal behandles, ved frembringelse af antistoffer mod polypeptidet ifølge opfindelsen ved anvendelse af de ovenfor beskrevne 25 inokula. Antistofferne kan også fås fra monoklonale kilder, ! såsom ascitesfluidum, ved fremstilling af en hybridomacel- lelinie ved anvendelse af teknik, som er kendt på området.

Hele antistoffer foretrækkes som det kombinerende sted, da de er i stand til at aktivere komplementsystemet, når der 30 dannes et immunkompleks.

III. Metoder oa materialer.

A. Syntese af polypeptider.

Polypeptiderne ifølge opfindelsen er blevet kemisk 35 syntetiseret ved fastfasemetoder, som beskrevet i Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc., 85, 2149-2154 (1964), og Houghten 78 DK 175828 B1 et al., Int. J. Pept. Prot. Res. 16, 311-320 {1980). Fast-fasemetoden til polypeptidsyntese er blevet praktiseret ved anvendelse af en "Beckman " polypeptidsyntetisator model 990B, kommercielt tilgængelig fra Beckman Instrument Co., 5 Berkeley, CA, US.

For polypeptider med færre end 35 rester, som anvendes i inokula, adderes der en cysteinrest til aminoterminus eller til carboxylterminus for at assistere ved kobling til et proteinbærestof som nedenfor beskrevet. Sammensætningerne 10 af alle polypeptider er blevet bekræftet ved aminosyreana-lyse.

Ved fremstilling af et syntetisk polypeptid ifølge opfindelsen ved ovennævnte fastfasemetode bindes aminosyre-resterne til en harpiks (fast fase) gennem en esterbinding i 15 fra den carboxyterminale rest. Når polypeptidet skal bindes til et bærestof via en Cys-rest eller polymeriseres via terminale Cys-rester, er det hensigtsmæssigt at anvende denne Cys-rest som den carboxyterminale rest, som esterbindes til harpiksen.

20 or-Aminogruppen i hver enkelt adderet aminosyre er typisk beskyttet ved hjælp af en tertiær butoxycarbonylgruppe (t-BOC), før aminosyren adderes ind i den voksende polypep-tidkæde. Derefter fjernes t-BOC-gruppen før addition af den ! næste aminosyre til den voksende polypeptidkæde.

25 Reaktive aminosyresidekæder beskyttes ligeledes under syntese af polypeptiderne. Gængse sidekædebeskyttelsesgrupper er blevet anvendt for de resterende aminosyrerester som følger: 0-(p-brombenzyloxycarbonyl) for tyrosin; O-benzyl for threonin, serin, asparaginsyre og glutaminsyre; S-meth-30 oxybenzyl for cystein,- dinitrophenyl for histidin; 2-chlor-benzoxycarbonyl for lysin; tosyl for arginin.

Beskyttede aminosyrer er blevet omkrystalliseret fra hensigtsmæssige opløsningsmidler til opnåelse af enkelte pletter ved tyndtlagschromatografi. Koblinger er typisk 35 blevet gennemført ved anvendelse af et tidobbelt molært overskud af både beskyttet aminosyre og dicyclohexylcarbo- 79 DK 175828 B1 diimid i forhold til antallet af milliækvivalenter af indledende, N-terminal aminosyre. Et to molært overskud af begge reagenser kan også anvendes. For asparagin adderes en ækvimolær mængde N-hydroxybenzotriazol til den beskyttede 5 aminosyre, og dimethyl formamid anvendes som opløsningsmiddel.

Alle koblingsreaktioner er mere end 99% fuldstændige ved picrinsyreprøven ifølge Gisin, Anal. Chem. Acta. 58, 248- 249 (1972) .

Efter fremstilling af et ønsket polypeptid behandles 10 en portion af det resulterende, beskyttede polypeptid (ca.

1 g) med 2 ml anisol, og vandfrit hydrogenfluorid, ca. 20 ml, kondenseres ind i reaktionsbeholderen ved tøristemperatur. Den resulterende blanding omrøres ved ca. 4°C i ca.

1 time til spaltning af beskyttelsesgrupperne og til fjer-15 nelse af polypeptidet fra harpiksen. Efter afdampning af hydrogenfluoridet ved en temperatur på 4°C med en strøm af N2 ekstraheres remanensen med vandfri diethylether tre gange til fjernelse af anisolet, og remanensen tørres i vakuum.

Det vakuumtørrede materiale ekstraheres med 5%'s 20 vandig eddikesyre (3 x 50 ml) til adskillelse af det frie polypeptid fra harpiksen. Den ekstraktholdige opløsning lyofiliseres til tilvejebringelse af et monomert, ikke-oxi-deret polypeptid.

Det producerede, syntetiske polypeptid kan anvendes 25 som et reagens ved en enzymbundet immunosorbentafprøvning (ELISA) til påvisning af anti-EBNA-antistoffer. Det syntetiske polypeptid kan også anvendes til fremstilling af et inokulum, sædvanligvis ved at det bindes til et bærestof til dannelse af et konjugat, hvorefter en effektiv mængde 30 af konjugatet dispergeres i et fysiologisk .acceptabelt fortyndingsmiddel, således som det er diskuteret i det følgende.

Man må også lægge mærke til, at en syntetisk multimer ifølge opfindelsen kan fremstilles ved fastfasesyntesen af flere af polypeptiderne ifølge opfindelsen bundet sammen 35 ende-til-ende (hoved-til-hale) ved hjælp af en amidbinding mellem den carboxyterminale rest i det ene polypeptid og 80 DK 175828 B1 den aminoterminale rest i et andet polypeptid. Sådanne syntetiske multimere syntetiseres fortrinsvis som en enkelt, lang polypeptidmultimer, men kan også fremstilles som individuelle polypeptider, som bindes sammen efter deres in-5 dividuelle synteser ved anvendelse af et carbodiimidreagens, såsom 1- (3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-hydro-chlorid, i vand. Det totale antal aminosyrerester indeholdt i en multimer fremstillet som en enkelt polypeptidkæde er fortrinsvis under ca. 50, således at op til ca. 8 polypep-10 tider ifølge opfindelsen kan være inkorporeret i en enkelt hoved-til-hale-multirnerkæde, som syntetiseres som et enkelt 1 polypeptid. En syntetisk hoved-til-hale-multimer indeholder 1 mere foretrukket fra ca. 2 til ca. 4 blokke af sammenknyt tede, syntetiske, tilfældige copolymerpolypeptider ifølge i 15 opfindelsen og i alt under ca. 40 aminosyrerester.

i B. Fremstilling af polymere.

Polypeptiderne ifølge opfindelsen kan være forbundet sammen til dannelse af en antigen og/eller immunogen polymer 20 (syntetisk multimer) omfattende flere af polypeptidgentagelsesenhederne . En sådan polymer har typisk fordelen af forøget immunogenicitet og antigenicitet. Desuden er et bærestof typisk ikke nødvendigt, når der anvendes et polymert immunogen. Hvor der anvendes forskellige polypeptidmonomere 25 til opbygning af polymeren, opnås evnen til immunoreaktion med antistoffer mod flere EBNA-antigendeterminanter. En yderligere fordel er evnen hos en sådan polymer, når den anvendes i et inokulum, til frembringelse af antistoffer, som immunoreagerer med adskillige antigendeterminanter i 30 EBNA.

En polymer ifølge opfindelsen kan fremstilles ved at syntetisere polypeptiderne som ovenfor diskuteret og medtage cysteinrester ved både amino- og carboxyterminus til dannelse af et "diCys-afsluttet" polypeptid. F.eks. kan hvert enkelt 35 af polypeptiderne i tabel I og polypeptiderne Dl og D2 i tabel II syntetiseres, således at de indeholder en yderligere 81 DK 175828 B1

Cys-rest ved hver enkelt amino- og carboxyterminus til tilvejebringelse af diCys-afsluttede polypeptider i deres reducerede former. Efter syntese, ved en typisk laboratorie-fremstilling, opløses 10 mg af diCys-polypeptidet (indehol-5 dende cysteinrester i ikke-oxideret form) i 250 ml 0,1 molær (M) ammoniumbicarbonatpuffer. Det opløste, diCys-afsluttede polypeptid oxideres derefter med luft ved omrøring af den resulterende opløsning svagt i et tidsrum på ca. 18 timer i luften, eller indtil der ikke er nogen påviselig, fri mer-10 captan ved Ellman-prøven, jfr. Ellman, Arch. Biochem. Bio-phys., 82, 70-77 (1959).

Den således fremstillede polymer (syntetisk multimer) indeholder flere af de syntetiske polypeptidgentagelsesen-heder af tilfældig copolymer, som er bundet sammen af oxi-15 derede cysteinrester (cystin). Sådanne polymere indeholder typisk deres polypeptidgentagelsesenheder bundet sammen på en hoved-til-hale-måde samt på hoved-til-hoved- og hale--til-hale-måde, dvs. aminotermini i to polypeptidgentagelsesenheder kan være bundet sammen gennem en enkelt cystin-20 rest, og det samme kan to carboxyltermini, da de forbindende grupper ved begge polypeptidtermini er identiske.

C. Kobling til bærstoffer.

De syntetiske polypeptider er blevet koblet til nøg-25 lehullimpethæmocyanin (KLH) som bærestof ved den metode, som er beskrevet af Liu et al., Biochem., 80, 690 (1979).

Kort fortalt aktiveres 4 mg af bærestoffet med 0,51 mg m-ma-leidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester og omsættes derefter emd 5 mg af polypeptidet gennem et amino- eller carboxyter-30 minalt cystein til tilvejebringelse af et konjugat indeholdende fra ca. 10 til ca. 35 vægt% polypeptid.

En eller flere yderligere aminosyrerester kan adderes til amino- eller carboxyterminus i det syntetiske polypeptid for at hjælpe med ved binding af polypeptidet til et bære- 35 stof. Som ovenfor diskuteret har det vist sig, at cystein rester adderet ved amino- eller carboxyterminus i det syn- 82 DK 175828 B1 tetiske polypeptid er særligt anvendelige til dannelse af polymere via disulfidbindinger. Andre metoder, som er velkendte på området til fremstilling af konjugater, kan imidlertid også anvendes. Eksempler på yderligere bindingsmetoder 5 omfatter anvendelse af Michael-additionsreaktionsprodukter, dialdehyder, såsom glutaraldehyd, jfr. Klipstein et al., J. Infect. Dis., 147, 318-326 (1983), eller anvendelsen af carbodiimidteknologi som ved anvendelsen af et vandopløseligt carbodiimid til dannelse af amidbindinger til bærestoffet, 10 som ovenfor diskuteret til sammenknytning af flere polypep-tider til dannelse af en syntetisk multimer.

Anvendelige bærestoffer er velkendte på området og er almindeligvis selv proteiner. Eksempler på sådanne bærestoffer er nøglehullimpethæmocyanin (KLH), edestin, thyroglo-15 bulin, albuminer, såsom okseserumalbumin (BSA) eller humant serumalbumin (HSA), røde blodlegemer, såsom fåreerythrocyter (SRBC), tetanustoxoid, koleratoxoid samt polyaminosyrer, såsom poly-(D-lysin:D-glutaminsyre).

Som det også er velkendt på området, er det ofte 20 gavnligt at binde et syntetisk polypeptid til dets bærestof ved hjælp af en mellemliggende, forbindende gruppe. Som ovenfor nævnte er glutaraldehyd en sådan forbindende gruppe.

Når der anvendes cystein er den mellemliggende, forbindende gruppe imidlertid fortrinsvis et m-maleimidobenzoyl-N-hy-25 droxysuccinimid (MBS), således som det her er blevet anvendt. Desuden kan MBS først adderes til bærestoffet ved hjælp af en ester-amid-vekselvirkningsreaktion som beskrevet af Liu et al., supra. Derefter kan additionen efterfølges af addition af en blokeret mercaptogruppe, såsom thioleddikesyre 30 (CH3COSH), tværs over maleimidodobbeltbindingen. Efter fra-spaltning af acylblokeringsgruppen dannes en disulf idbinding mellem den afblokerede, forbindende mercaptangruppe og mer-captanen i den adderede cysteinrest i det syntetiske polypeptid .

35 Valget af bærestof er mere afhængigt af slutanvendel sen af immunogenet end af determinantdelen i immunogenet og 83 DK 175828 B1 er baseret på kriterier, som ikke er specielt involveret i den foreliggende opfindelse. Hvis f.eks. et inokulum skal anvendes i dyr, må der udvælges et bærestof, som ikke frembringer en uheldig reaktion hos det specielle dyr.

5 D- ELISA.

Anti-peptid-antistofbindings- og -inhiberingsstudier er blevet gennemført ved en enzymbundet immunosorbentafprøv-ning (ELISA) som nedenfor beskrevet.

10 Kort fortalt er mikrotiterhuller (Costar, nr. 3590,

Cambridge, MA) typisk blevet overtrukket med individuelle polypeptider som antigener ved tilsætning af 100 μΐ borat-pufret saltopløsning (BBS) [10 mmolær (mM) natriumborat (pH 8,3) , 150 mM NaCl] indeholdende polypeptid i en koncentration 15 på 10 μg pr. ml ^g/ml) . Kontakt mellem hullerne og antigen-holdig opløsning opretholdes i et forudbestemt tidsrum, typisk 15 minutter, ved 20°C, til dannelse af en antigen-overtrukket, fast fase. De faste og flydende faser adskilles, og hullerne vaskes tre gange med BBS.

20 Ikke-specifikke bindingssteder blokeres ved tilblan- ding af 200 μΐ 1%'s okseserumalbumin (BSA) i hvert hul til dannelse af en anden blanding med fast/flydende fase og opretholdelse af denne blanding af fast/flydende fase i 30 minutter ved 20 °C. Faserne adskilles, og overskydende, ikke-25 bundet BSA fjernes ved vask tre gange med BBS.

Kaninserum og humant serum (legemsprøveportioner) afprøves for anti-polypeptidaktivitet ved tilsætning af 100 μΐ af et serum fortyndet 1:20 i BBS pr. hul til dannelse af et materiale med fast/flydende fase. Kontakt mellem de for-30 tyndede sera og den antigenovertrukne, faste fase opretholdes i et forudbestemt tidsrum, såsom 1 time, ved 20°C, til dannelse af en immunoreaktant. De faste og flydende faser adskilles, og den faste fase, dvs. antigenovertrukne, immuno-reaktantholdige huller, vaskes derefter tre gange emd BBS.

35 De antistoffer i humane sera, som immunoreagerer med et adsorberet polypeptid, påvises ved anvendelse af et in- 84 DK 175828 B1 dikatormiddel omfattende alkalisk phosphatasekonjugeret gede-anti-humant-Ig-antistof (Tago, Burlington, CA). De antistoffer i kaninsera, som immunoreagerer med et adsorberet polypeptid, påvises ved anvendelse af et indikatormiddel 5 omfattende alkalisk phosphatasekonjugeret gede-anti-kanin--Ig-antistof (Kirkegård & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) . I begge tilfælde tilsættes 100 μΐ af indikatorantistoffet fortyndet 1:300 i BBS pr. hul til dannelse af et yderligere materiale med fast/flydende fase.

10 Dette materiale med fast/flydende fase holdes i et forudbestemt tidsrum, 1 time, til dannelsen af et reaktionsprodukt mellem de humane antistoffer bundet til den faste fase og indikatormidlet ved 20°C. Faserne adskilles, og den faste fase vaskes tre gange med BBS.

15 Alkalisk phosphatasekonjugeret antistof bundet til polypeptidspecifikt antistof påvises ved spektrofotometrisk måling af den enzymatiske hydrolyse af p-nitrophenylphosphat til p-nitrophenol. Kort fortalt sættes 100 μΐ p-nitrophenyl-phosphat (1 mg/ml i 2 mM MgCl2 (pH 9,8), 50 mM natriumcar-20 bonat) til hvert enkelt hul. Den enzymatiske reaktion får lov at skride frem i 1 time, hvorefter den optiske tæthed ved 405 nM bestemmes i et "TITERTEK®" spektrofotometer tilgængeligt fra Flow Laboratories, Inglewood, CA.

Yderligere afprøvninger, som er anvendt ved disse 25 studier, og hvor forhold mellem IgG og IgM er blevet bestemt til vurdering af tilstanden af EBV-fremkaldt sygdom, er blevet gennemført som beskrevet i Smith et al., J. Infect.

Dis., 154, 885-889 (1966) og Geltosky et al., J. Clin. Lab. Analysis, 1, 153-162 (1987) . Kort fortalt er mikrotiterhuller 30 som fastfasegrundmasse blevet overtrukket med 50 μΐ af 20 μg polypeptid P62 pr. ml i boratpufret saltopløsning (BBS; 0,5 M natriumborat, 0,15 M NaCl og 0,001 M MgCl2, pH 8,3) i 12 timer ved 4°C til dannelse af en fast bærer indeholdende peptidet fæstnet til fastfasegrundmassen.

35 Derefter kasseres opløsningen, og pladerne blokeres med 300 μΐ 10%'s normalt gedeserum i phosphatpufret salt- 85 DK 175828 B1 opløsning (PBS) ved pH 7,3. Efter 90 minutters opretholdelse (inkubering) ved 37°C tømmes hullerne og tørres i 60 minutter I ved 37°C.

i ! På dette tidspunkt sættes 200 μΐ 10%'s gedeserum i 5 PBS til hullerne. Et volumen på 10 μΐ patientprøveserum blandes til hvert enkelt, gedeserumholdigt hul til dannelse af en fast/flydende faseblanding. Denne blanding holdes i et tidsrum på 1 time ved stuetemperatur for at tillade binding af eventuel tilstedeværende antistoffer til den faste 10 bærer og til dannelse af en fastfasebundet immunoreaktant indeholdende disse antistoffer.

Efter vask fem gange med 350 μΐ 0,05%'s nTween®-20" (polyoxyethylen(20)sorbitanmonolaurat) i PBS til gennemførelse af adskillelse af de faste og flydende faser blandes 15 en opløsning af 200 μΐ peberrodperoxidasekonjugeret (HRPO--konjugeret), monoklonalt museantistof mod humant IgG eller IgM (Ortho Diagnostic Systems, Raritan, NJ) til hvert enkelt hul til dannelse af en anden, fast/flydende faseblanding.

Denne anden, fast/flydende blanding holdes i yderligere i 20 et tidsrum på 1 time for at tillade, at de enzymbundne antistoffer binder til eventuelle, fastfasebundne antistoffer, som er dannet i den første, fast/flydende faseblanding.

Efter adskillelse af de faste og flydende faser og vask af den faste fase fem gange ved anvendelse af ovennævnte ' 25 "Tween®-20"/PBS-opløsning fremkaldes farve ved tilblanding I af o-phenylendiamin (OPD; 2 mg af en citratpufret tablet opløst i 3 ml vand; Pitman-Moore, Washington Crossing, NJ) og hydrogenperoxid. Den resulterende opløsning holdes i 30 minutter ved stuetemperatur. Reaktionen standses ved til-30 blanding af 50 μΐ 2 N HC1, og absorptionen bestemmes ved 490 nm.

Resultaterne af ELISA med polypeptid P62 som antigen normaliseres ved multiplikation af absorptionsværdierne med et positivt kontrolforhold: 35 Positivt kontrolforhold = referenceabsorptionsværdi/- gennemsnitlig absorption af positiv kontrol.

! 86 DK 175828 B1

Den positive kontrol tildeles en referenceabsorptions-værdi (O.D.) på 1,0. Referenceabsorptionsværdien divideres med den iagttagne, gennemsnitlige absorptionsværdi for den positive kontrol. Absorptionsværdien for kontrollerne og 5 for hver forsøgsprøve multipliceres med det positive kontrolforhold til opnåelse af en standardiseret ELISA-værdi. Afskæringsværdier (gennemsnitlig O.D. plus standardafgivelse) er tidligere blevet beskrevet, jfr. Geltosky et al., J.

Clin. Lab. Analysis, 1, 153-162 (1987). Med disse standar- 10 diserede er der blevet bestemt mængdeforhold af ELISA-værdier mellem IgG og IgM på over 0,7 i en sund befolkning uden symptomer. Absorptionsværdier på under 0,7 er blevet betragtet som repræsenterende en akut infektion på grund af EBV, jfr. Smith et-al., J. Infec. Dis., 154, 885-889 (1986).

15 En anden, tilsvarende, men langt hurtigere afprøvning er også blevet udviklet og anvendt her. Her er den anvendte fastfasegrundmasse en såkaldt "ske".

De specielt anvendte skeer er opake, hvide polystyrenindretninger med en almindeligvis affladet, øvre del 20 (som normalt anvendt) , som strækker sig over ca. halvdelen af skeens længde, og som er tilpasset til at blive holdt ved hjælp af en brugers fingre. Ca. 2/3 af længden af den nedre del (nedre halvdel) er smallere end den øvre del og er cylinderformet.

25 Den nederste ca. 1/3 af skeen indeholder en anden, af fladet del, som omtrent har bredden af den øvre del og afgrænser to skålformede fordybninger (huller), som i diameter er en lille smule mindre end bredden af denne affladede del. De to skålformede fordybninger er adskilt af en forhøj-30 ning, som strækker sig tilnærmelsesvis vinkelret på den affladede overflade, som afgrænser fordybningerne. Topoverfladen af forhøjningen bærer, når der ses nedad imod fordybningerne, tegn, såsom "M" for IgM og "G" for IgG, og de lodrette vægge i forhøjningen stødende op til hver fordybning 35 er formgivet til punkter, som vender mod den ene eller den anden fordybning. Punkterne og deres tilsvarende tegn på 87 DK 175828 B1 toppen af forhøjningen angiver kombineret, hvad der afprøves i hver enkelt fordybning, IgM eller IgG.

De ovenfor nævnte, affladede dele har praktisk taget samme bredde, og denne bredde og skeens længde har sådanne 5 proportioner, at de let passer ind i og strækker sig ud fra et reagensglas, såsom et 13 x 100 eller et 16 x 160 mm reagensglas, bægerglas eller et andet, væskeholdigt apparatur. Typiske dimensioner for en sådan ske er en bredde på ca.

10-12 mm, en tykkelse på ca. 2-4 mm og og en samlet længde 10 på ca. 130-160 mm med fordybninger, som kan rumme ca. 200-250 μΐ væske.

En foretrukket ske omfatter endvidere på den øverste ca. 1/3 af den øvre, almindeligvis affladede del en endnu bredere del, hvis bredde er større end diameteren af et 15 reagensglas, som skal anvendes, f.eks. bredere end ca. 16 mm, således at skeen kan ophænges i reagensglasset, uden at skeens bund berører glassets bund, og skeen kan tilpasses bedre til fastholdelse. Ydermere findes der på den side af skeen, som er modsat fordybningerne, fremspringende ben, 20 med en omtrentlig længde som skeens tykkelse, til tilvejebringelse af en praktisk taget stabil, vandret basis, hvorpå en ske kan hvile på et laboratoriebord.

En række af fordybningerne på sådanne skeer overtrækkes med polypeptid P62 ved tilblanding af en opløsning in-25 deholdende 100 ^g/ml polypeptid i BBS ved en pH-værdi på 8,3- 8,5. Opløsningerne holdes i fordybningerne i et tidsrum på ca. 18-24 timer til fæstnelse af polypeptidet til den grundmasse, som er tilvejebragt af fordybningerne i skeen, og derved til dannelse af fastfasebærere, og de faste og fly-30 dende faser adskilles.

De ikke-specifikke bindingssteder på de således dannede fastfasebærere blokeres ved tilblanding af en opløsning af 10% BSA eller et andet, ikke-humant protein i PBS ved en pH-vaerdi på 7,4 i et tidsrum på 90 minutter ved 37°C. Når 35 en ske ikke skal anvendes øjeblikkeligt, medtages der i blokeringsopløsningen 20% glycerol (vol/vol) for at hjælpe 88 DK 175828 B1 med ved opbevaring. Derefter adskilles de faste og flydende faser, og skeerne tørres ved en temperatur på 37°C i 1 time.

Ved brug sættes der til hver fordybning i skeen 100 μΐ af den flydende legemsprøve, såsom blod, plasma, serum 5 eller spyt. Portioner af prøven fra et individ anvendes i hver fordybning på en enkelt ske. De resulterende, faste/-flydende blandinger holdes i et tidsrum på 2 minutter til dannelse af de respektive, fastfasebundne immunoreaktanter.

De faste og flydende faser adskilles og vaskes i to 10 separate 13 x 100 mm reagensglas, som hver især indeholder 5 ml PBS indeholdende 0,05% "Tween®-20". En skylning med ledningsvand er også blevet anvendt effektivt til dette trin.

Derefter blandes 100 μΐ HRPO-konjugeret anti-humant IgG-antistof med den faste bærer i den fordybning, som er 15 betegnet med det ovenfor omtalte "G", og 100 μΐ HRPO-kon-jugeret anti-humant IgM-antistof blandes med den faste bærer i den fordybning, som er betegnet med det ovenfor omtalte "M", til dannelse af de to blandinger med fast/flydende fase. De resulterende blandinger holdes ved stuetemperatur 20 i et tidsrum på 2 minutter.

De faste og flydende faser adskilles.·Derefter vaskes den faste fase to gange med den ovenfor beskrevne opløsning af PBS/11 Tween®-2 0”.

Efter dette vasketrin blandes 100 μΐ af en farvefrem-25 kaldende opløsning, såsom den ovenfor beskrevne indeholdende OPD, eller ABTS og 3% hydrogenperoxid (vol/vol) i den ovenfor beskrevne puffer med de faste bærere. Til dette trin anbringes skeerne vandret på deres ben på et laboratoriebord. Den således dannede, farvedannende, faste/flydende blanding 30 holdes i et tidsrum på yderligere 2 minutter ved stuetemperatur, og de farvedannende reaktioner standses ved tilblan-ding af 50 μΐ af en 1%'s opløsning af natriumdodecylsulfat eller en 2 N HCl-opløsning som ovenfor beskrevet.

Den ovenfor beskrevne afprøvning tager lidt mere end 35 6 minutter, når først de faste bærere er fremstillet. Den resulterende afprøvning afsluttes ved en visuel undersøgelse 89 DK 175828 B1 af farveintensiteten i hver enkelt fordybning. Hvor farven er mere intens ved IgG-afprøvningen, er patienten således i bedring, hvor farven er mere intens ved IgM-afprøvningen, er patienten i den akutte fase af IM, og hvor farverne har 5 omtrent samme intensitet, er IM i den akutte fase ved at gå over i bedring.

Resultater ved anvendelse af ovenstående afprøvning på ca. 6 minutter er blevet sammenlignet med resultater opnået ved en afprøvning med beregnet forhold i mikrotiter-10 plade som ovenfor beskrevet, hvilket kræver ca. 2,5 timer til afslutning. 30 serumprøver er hver især blevet sammenlignet ud fra paneler med (a) akutte, primære EBV-IM-infek-tioner (b) normale laboratoriemedarbejdere, som har været udsat for viruset, og som er serologisk VCA+, og (c) prøver 15 sendt til et klinisk laboratorium fra patienter med en IM--agtig sygdom.

28 af de 30 sera fra patienter, som klinisk er blevet identificeret som værende i det akutte stadium, er blevet bedømt som akutte ved begge afprøvninger. To sera, som ved 20 den længerevarende afprøvning er blevet bedømt som værende resultatløse på grund af et IgM-niveau under det nødvendige minimum, er også blevet bedømt som værende sera fra den akutte fase ved den korterevarende afprøvning.

Generel overensstemmelse er blevet noteret med de 25 andre grupper af sera med yderligere eksempler på et resultat noteret for et serum ved den kortvarige, visuelle afprøvning, hvor der intet resultat noteres for den længerevarende, kvalitative afprøvning. Desuden er der også nogle få tilfælde, hvor resultaterne har været forskellige.

30 Ved et efterfølgende klinisk studium har afprøvningen på ca. 6 minutter vist sig at have en specificitet og følsomhed for EBV-IM i akut fase på ca. 94-95%.

E. Cellekulturer.

35 Evnen hos receptormolekylerne ifølge opfindelsen til immunoreaktion med EBNA produceret i celler er blevet stu- 90 DK 175828 B1 deret som ovenfor beskrevet ved anvendelse af cellelinierne WI-L2, Raji, Daudi og BJAB. WI-L2-celler (ATCC CRL 8155 W1L2-NS, American Type Culture Collection, Bethesda, MD) er en EBV-genompositiv, ikke-producerende B-lymphoblastlinie, 5 stammende fra en human patient med arvelig sfærocytisk anæmi, jfr. Levy et al., Cancer 22, 517-524 (1968).

Raji-celler (ATCC CCL 86, American Type Culture Collection, Bethesda, MD) er en EBV-genompositiv, EBNA-produ-cerende, lymphoblastagtig cellelinie fra en Burkitt-lynphoma, 10 jfr. Epstein, J. Nat. Cancer Inst. 34, 231 (1965). Daudi- -celler (ATCC CCL 213, American Type Culture Collection, Bethesda, MD) er også en EBNA-producerende cellelinie. BJAB--celler er en lymphocyt cel lelinie, som ikke producerer EBNA, og som er tilgængelig hos Scripps Clinic og Research 15 Foundation, La Jolla, CA.

Ovennævnte cellelinier er blevet dyrket i medium RPMI 1640, jfr. Moore, J. Am. Med. Assoc. 199, 519-524 (1967), og Morton, In Vitro 6, 89-100 (1970), suppleret med 2 mM L-glutamin og 10% kalvefosterserum.

20 Celler af CMV stamme AD-169 var en gave fra Dr. D.

Richman hos University of California, San Diego. Viruset er blevet formeret i den humane fibrolastikslinie GM-2504 opnået fra Human Genetic Mutant Cell Repository (Camden, NJ) . Cellerne er blevet dyrket i DMEM-medium indeholdende 25 10% kalvefosterserum og er blevet inficeret lige før sam menløb ved en multiplicitet på 3. Cellerne er blevet høstet efter 9 døgn ved vask to gange med PBS, og ekstrakter er blevet fremstillet ved tilsætning af 10 ml DEM (2% SDS, 2% 2-mercaptoethanol, 0,0004% bromphenolblåt, 40 mM Tris-HCl, 30 pH 6,8, og 15% glycerol) indeholdende 10 /^g/ml phenylmethyl-sulfonylfluorid direkte til en 150 cm3 vævskulturkolbe indeholdende de adhærerende, inficerede celler. Kolben er blevet skrabet med en celleskraber, og opløsningen udtages, koges i 2 minutter og opbevares ved -20“C.

35 91 DK 175828 B1 F. Helcelleekstrakter.

i Ekstrakter af EBNA-producerende og -ikke-producerende (kontrol) celler fremstilles til bestemmelse af, om molekyler i ifølge opfindelsen er anvendelige til diagnosticering af 5 EBNA-ekspression. Celler fra ovenfor beskrevne kulturer vaskes i phosphatpufret saltopløsning (PBS; 150 tnM NaCl, 10 ! mM natriumphosphat, pH 7,4) indeholdende 0,2 mM phenylmeth- j ylsulfonylfluorid, opkvældes i 5 minutter i reticulocytstan-

i dardpuffer (RSB; 10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1,5 mM

1 10 MgCl2, 0,2 mM phenylmethylsulfonylfluorid) og lyseres ved sonikering i 3-5 volumener RSB indstillet til 0,2-0,35 M NaCl. Efter 30 minutter på is centrifugeres sonikatet ved 10.000 x g i 15 minutter til fjernelse af cellerester.

15 G. Immunooletningsmetoder.

Celleekstrakter opnået ovenfor er blevet afprøvet for EBNA ved anvendelse af humane sera, som vides at indeholde anti-EBNA-antistoffer eller eksempler på receptormolekyler. Ekstrakterne koncentreres enten ved udfældning 20 med 2 volumener ethanol ved -20°C i ca. 18 timer og opløses derefter i prøvepuffer [SB; 10% glycerol, 2% 2-mercaptoetha-nol, 1% natriumdodecylsulfat (SDS), 0,002% bromphenolblåt, 40 mM Tris-HCl (pH 7,4)], eller dé fortyndes 1:5 i prøvepuffer til SDS-polyacrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) . 7,5%'s 25 polyacrylamidgeler udstøbes og køres ifølge metoden ifølge Laemmli, Nature, 277, 680-685 (1970), idet der påføres 50-i 200 μ% totalt protein pr. kolonne.

Efter elektroforese overføres proteinbåndene fra SDS-polyacrylamidgelerne elektroforetisk til en fast bærer 30 i form af nitrocelluloseark (Schleicher og Schuell, Detroit, MI) ved metoden ifølge Towbin et al., Proc. Natl. Acad.

Sci., USA, 76, 4350-4354 (1979). Dette gennemføres ved anvendelse af et "Bio-Rad"-Trans-Blot-apparat (Bio-Rad,

Richmond, CA) ved 70 volt i 2-3 timer i 12,5 mM Tris-hydrox-35 id, 96 mM glycin og 20% methanol.

Efter overføring mættes nitrocellulosefiltrene eller 92 DK 175828 B1 ! pletterne i 1 time i enten 2% BSA (vægt/vol) i PBS eller 2% mælkepulver (vægt/vol) i P3S til nedsættelse af ikke-specifik binding. Derefter immunoreageres pletterne med 0,1 ml af enten EBNA-positivt, humant serum eller kanin-anti-polypep-5 tidantistoffer i 2 ml PBS eller 2% mælk i 1 time ved 37°C.

Anti-peptid-antistoffer bundet til EBNA-protein er blevet påvist ved omsætning af pletterne med et indikatormiddel. I dette tilfælde er 20 ml 125i-mærket [200.000 tællinger pr. minut pr. ml (cpm/ml), 10^ tællinger pr. minut 10 pr. mg (cpm/mg)] protein A fra S. aureus (Calbiochem, La Jolla, CA) blevet bragt i kontakt med immunoreaktionsproduktet i 30 minutter ved 37°C. Pletterne vaskes med PBS og eksponeres på "Kodak® XAR"-røntgenstrålefilm natten over ved - 70 °C.

15 Ved en alternativ metode er de celleproteinholdige ekstrakter blevet fyldt på en 13 cm bred spalte i en 7,5%'s acrylamidgel og elektroforeseret. Indholdet af den elektro-foreserede gel overføres til nitrocellulose som ovenfor beskrevet, jfr. Billings et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

20 USA, 80, 7104-7108 (1983), Rumpold et al., J. Immunol., 138, 593-599 (1987); Rhodes et al., J. Exp. Med., 165, 1026-1040 (1987). Sera fortyndes 1:20 eller 1:50 i en mælkepul verpuffer (PM) (3% mælkepulver i 0,05 M borat, 0,15 M NaCl, pH 8,3) og bringes i kontakt med strimlen i 1 time ved stue-25 temperatur til immunoreaktion af antistoffer i disse sera med proteinerne. Derefter vaskes strimlerne, og immunoreak-tiviteten bestemmes ved inkubering med en opløsning af 0,6 Ag/ml (i PM) affinitetsrensede kanin-anti-humant IgM-(Jackson Laboratories, Avondale, PA) eller affinitetsrensede 30 kanin-anti-humant IgG-antistoffer fra samme kilde.

Efter vask omsættes strimler med en påvisningsopløsning af 125I-gede-anti-kanin-IgG-antistof som tidligere beskrevet, jfr. Rumpold et al., J. Immunol., 138, 593-599 (1987), Rhodes et al., i Herpesvirus, R. Rapp udg., Alan R.

35 Liss, New York, side 487-496 (1984); Rhodes et al., J. Immunology, 134, 211-216 (1985); Smith et al., J. Infec. Dis., 93 DK 175828 B1 154, 885-889 (1986); og Geltosky et al., J. Clin. Lab. Analysis, 1, 153-162 (1987), og Rhodes et al., J. Exp. Med., 165, 1026-1040 (1987), og bånd påvises ved autoradiografi som ovenfor beskrevet.

5 Inhiberinger af syntetisk peptid er blevet gennemført ved fortynding af sera 1:50 i PM og tilsætning af frit peptid til en slutkoncentration på 400 pg/ml til inhibering af IgM-antistof og 20-50 /xg/ml til inhibering af IgG-antistof.

Denne opløsning holdes (inkuberes) natten over ved 4°C og 10 anvendes derefter til pletning som ovenfor beskrevet.

H. Immuniseringer.

Receptormolekyler omfatter hele antistoffer frembragt hos pattedyr ved immunisering af disse med inokula omfattende 15 et polypeptid og/eller multimer som ovenfor beskrevet. Både polypeptider og multimere kan anvendes medtaget i inokula enten alene eller konjugeret til et bærestofprotein, såsom nøglehullimpethæmocyanin (KLH). Polypeptider anvendes imidlertid fortrinsvis som et konjugat, og multimere anvendes 20 fortrinsvis alene.

Kaniner immuniseres med inokula indeholdende 1,0 mg konjugat' i Freund's komplette adjuvans (CFA) og forstærkes 1 måned senere med 1,0 mg konjugat i Freund's ukomplette adjuvans (IFA). Hver immunisering består af en subcutan 25 injektion på baghoften. Der tages blodprøver fra kaninerne 1 og 2 måneder efter forstærkningen.

Derefter fremstilles der ud fra blodprøverne sera indeholdende immunologisk aktive antistoffer ved metoder, som er kendt på området. Disse antistoffer immunoreagerer 30 med et eller flere af polypeptiderne ifølge opfindelsen og en EBNA-antigendeterminant. De kan derfor anvendes i et system til afprøvning af EBNA.

Individuelle inokula er blevet fremstillet med CFA eller IFA som følger: En mængde konjugat, som er tilstræk-35 kelig til tilvejebringelse af den ønskede mængde polypeptid pr. inokulering (f.eks. 1 mg), opløses i PBS (i ca. 0,5 ml) s 94 DK 175828 B1 ved pH 7,2. Lige store volumener af CFA eller IFA blandes derefter med konjugatopløsningerne til tilvejebringelse af et inokulum indeholdende konjugat, vand og adjuvans, hvori forholdet mellem vand og olie er 1:1. Derefter homogeniseres 5 blandingen til tilvejebringelse af inokulet. Volumen af et således fremstillet inokulum har typisk været over 1 ml, og noget af konjugatet, PBS og adjuvans er gået tabt under emulgeringen. Praktisk taget al den emulsion, som har kunnet udvindes, fyldes på en sprøjte og indføres derefter i kani-10 nerne som ovenfor diskuteret. Den mængde inokulum, som indføres i kaninerne, formodes at have været ca. 90% af den mængde, som har været til stede forud for emulgeringstrinet.

Ovenstående inokulumstamopløsninger er illustrative for inokula, der som her vist kan anvendes til frembrin-15 gelse af receptormolekyler, som immunoreagerer med EBNA-I.

Immunofluorescensmetoder.

En anden illustrativ metode til afprøvning af EBNA i en legemsprøve anvender receptormolekyler og et fluorochro-20 matisk indikatormiddel til påvisning af produktet fra en receptor-EBNA-immunoreaktion.

Ved det omhandlede studium er 2 x 104 WI-L2-celler, dyrket som ovenfor beskrevet, blevet udspredt på et almindeligt mikroskopobjektglas ved anvendelse af cytocentrifuge 25 (CYTOSPIN, Shandon Southern, Astmoor, Runcorn, Chesire, GB) . Efter lufttørring i 5 minutter ved 20°C er cellerne blevet fikseret i acetone i 2 minutter og derefter lufttørret i 2 minutter ved 20°C. Objektglassene er blevet opbevaret ved -20°C indtil brugen.

30 De fikserede WI-L2-celler er blevet afprøvet for EBNA ved anvendelse af anti-polypeptid-antistoffer (receptorer) frembragt imod polypeptiderne P27, P60, P62 og P89.

50 μΐ af hvert kaninantiserum, fortyndet 1:.10 i VBS-puffer (120 mM barbitol, pH 7,3, 144 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2 og 0,75 35 mM CaCl2), er blevet inkuberet (bragt i kontakt og holdt i kontakt med de fikserede celler) ved 20°C på et objektglas 95 DK 175828 B1 i et forudbestemt tidsrum (f.eks. 30 minutter), som er tilstrækkeligt til, at antistofferne og EBNA immunoreagerer.

Et negativt kontrolobjektglas er blevet behandlet på identisk i måde med normalt kaninserum.

' 5 Under ovennævnte inkubering har en del af anti-poly- peptid-antistofferne immunoreageret med EBNA, som er til j stede i de fikserede Wl-L2-celler. Ubundne antistoffer fjernes ved vask med VBS, hvilket på objektglasset udelukkende efterlader EBNA-receptor-immunoreaktionsproduktet.

10 Anti-polypeptidantistoffer bundet til EBNA er blevet påvist ved, at der først inkuberes 50 μΐ marsvinekomplement (Tago, Burlingame, CA) fortyndet 1:10 i VBS på hvert objektglas i et tidsrum (30 minutter), som er tilstrækkeligt ! til, at komplementet binder til receptorerne. Derefter vaskes 15 objektglassene med VBS til fjernelse af eventuelt komplement, \ som ikke er bundet til kanin-anti-polypeptid-IgG.

Fluoresceinmærket gede-anti-marsvine-C3 (mærkede anti-komplementantistoffer, Cappel Laboratories, Cochran-. ville, PA) er blevet anvendt til påvisning af antigen-anti- 20 stofkomplement-komplekserne. 50 μΐ af det indikerende an tiserum, fortyndet 1:20 i VBS, inkuberes som ovenfor beskrevet på hvert objektglas i 30 minutter ved 20°C. Ubundet gede-anti-marsvine-Cj vaskes af objektglasset med VBS. Derefter gøres immunoreakt ionsprodukter synlige ved fluorescens-25 mikroskopi.

J. Cirkulær dichroismespektroskooi.

Polypeptidernes konformat ionsegenskaber er blevet undersøgt til belysning af en eventuel sekundær struktur, 30 som kunne være nødvendig for polypeptidimmunoreaktion med humane anti-EBNA-antistoffer. Polypeptiderne opløses i en koncentration på 1 mg/ml i phosphatpufret saltopløsning (PBS). Spektre optages ved anvendelse af 1 ml prøver i et "Cary® 61"-spektropolarimeter (Cary Instruments, Applied 35 Physics Corp., Monrovia, CA) forsynet med grænseflader og automatiseret med en 11/02-computer fra Digital Equipment i 96 DK 175828 B1 : Corporation (Digital Equipment Corporation, Maynard, MA) .

Gennemsnittet af 10 successive scanderinger for hvert poly-peptid er afbildet som vist i fig. 1.

5 K. Prøvekilder og serologi.

De her anvendte serumprøver er opnået fra en mangfol-: dighed af kilder. ET sæt sera til disse studier er opnået i j fra 13 patienter med EBV-fremkaldt IM. Heterofilantistoffer, j som er specifikke for IM, er tidligere blevet identificeret 10 hos 10 af 13 patienter ved anvendelse af en prøve med dif-ferentialadsorption af hesteceller i reagensglas. Heterofilantistoffer er ikke blevet påvist hos to patienter til trods I for afprøvning ved en mangfoldighed af metoder. Et individ har haft ikke-diagnosticerbare, lave niveauer af hestecel-15 leagglutininer, som kun er påvist i en enkelt prøve udtaget under den akutte fase af hendes sygdom. Denne patient er blevet betragtet som værende heterofil-negativ til dette studiums formål. Serologiske data har vist beviser på igangværende, primære EBV-infektioner fra de tre heterofil-nega-20 tive patienter.

i

Data fra to af de ti heterofil-positive og to af de tre heterofil-negative patienter er tidligere blevet publiceret, se Horwitz et al., Am. J. Med. 63, 947-957 (1977). Til det foreliggende studium er de serologiske EBV-afprøvninger 25 blevet gennemført på tidligere frosne serumprøver ved indirekte immunofluorescens med kommercielt tilgængelige prøver for IgG- og IgM-antistoffer mod VCA (Litton Bionetics, Inc., Charleston, SC).

En anden gruppe sera er blevet anvendt til EBV-IM- og 30 CMV-IM-studierne. I denne gruppe af prøver har én patient (D.B.) en typisk episode af heterofil-positiv EBV-IM efterfulgt af en begivenhedsløs, klinisk bedring. Under den akutte fase af sygdommen har han udviklet høje titere af antistoffer mod VCA (IgM = 1:80 og VCA-IgG = 1:1280) uden ledsagende 35 antistoffer mod anti-EBNA (1:2). 174 dage efter udbruddet er IgM-anti-VCA-antistoffer ikke mere påviselige, medens 97 DK 175828 B1 anti-EBNA er udviklet mellem 76 og 111 dage. Antistoffer mod CMV er ikke blevet påvist i seriesera ved komplement fiksering (1:8). En anden patient (D.S.) har en til at begynde med aktiv, sandsynligvis primær cytomegalovirusinfektion (CMV-5 -IM), som 4 måneder senere efterfølges af en primær EBV-infektion. Denne patient har udvist CMV-makroglobuliner (1:256) , en stigning på fire gange i antistoffer mod anti-CMV ved komplementfiksering (CMV-CF) og ingen antistofreaktioner mod nogen EBV-beslægtede antigener. Under hans anden sygdom, 10 som begynder 124 dage, efter at den første er brudt ud, sker der en primær EBV-infektion karakteriseret ved IgM-an- ti-vCA (1:320) og et indledningsvis fravær (1:2), men senere udvikling af antistoffer mod EBNA. IGM-antistofferne mod VCA forsvinder med serieafprøvning. Under hans anden sygdom 15 (EBV-IM) har CMV-makroglobuliner (CMV-IgM) ikke mere kunnet påvises, medens komplementfikserende antistoffer mod CMV stadigvæk er til stede på stabile niveauer på 1:128.

Sera har også været tilgængelige fra ti andre patienter og er udtaget under de forskellige faser af CMV-frembragt 20 mononucleose. Sera fra deres akutte fase har vist signifikante titere (= 1:32) af CMV-makroglobuliner og anti-CMV (CF) i alle tilfælde. Stigninger eller nedgange i titer på fire gange er blevet bemærket ved komplementfiksering hos seks af de ti (6/10) patienter med prøver udtaget i serie.

25 Alle ti patienter har vist serologiske tegn på gamle EBV-in-fektioner med moderate, konstante niveauer af anti-VCA- (IgG) --anti-EBNA (1:10) og ingen antistoffer imod anti-VCA-(IgM).

Nogle data fra de sidstnævnte elleve patienter har været medtaget i en tidligere rapport, se Horwitz et al., Medicine, 30 65, 124-133 (1986).

Afprøvninger for EBV-beslægtede antistoffer mod VCA (IgM og IgG) , tidlige antigener (EA) og EBNA samt CMV-makroglobuliner (CMV-IgM) er blevet gennemført ved indirekte immunofluorescensstandardmetoder (IFA), jfr. Horwitz et 35 al., Medicine, 65, 124-133 (1986), og Henle et al., Human

Pathology, 5, 551-565 (1974). Anti-CMV er også blevet påvist 98 DK 175828 B1 ved komplementfiksering ved anvendelse af virusstammen AD-169 (Microbiological Associates, Bethesda, Maryland).

99 DK 175828 B1

Patentkrav.

1. CMV-relateret polypeptid omfattende en aminosyre-restsekvens udvalgt fra den gruppe, som består af a) -Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly~Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-5 -Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly- og b) -Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly--Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-, og farmaceutisk acceptable salte deraf, hvor polypeptidet immunoreagerer med anti-EBNA-antistoffer.

10 2. Polypeptid ifølge krav 1, hvor polypeptidet har sekvensen a) H-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly--Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-OH, 15 b) H-Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly- -Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-OH, eller c) H-Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly--Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Cys-OH.

20 3. Polypeptid med fra 20 til 40 aminosyrerester, hvor polypeptidet har en aminosyrerestsekvens svarende til aminosyrerestsekvensen af CMV-kodet polypeptid-antigen som følger: met asp leu pro thr thr val val arg lys tyr trp thr phe ala ΑΞΝ PRO asn arg ile leu his gln ser val asn gln thr phe asp val arg

25 GLN PHE VAL PHE ASP THR ALA ARG LEU VAL ASN CYS VAL ASP GLY ASP

GLY LYS VAL LEU HIS LEU ASN LYS GLY TRP LEU CYS ALA THR ILE MET

GLN HIS GLY GLU ALA SER ALA GLY ALA LYS THR GLN GLN GLY PHE MET

SER ILE ASP ILE THR GLY ASP GLY GLU LEU GLN GLU HIS LEU PHE VAL

ARG GLY GLY ILE VAL PHE ASN LYS SER VAL SER SER VAL VAL GLY SER

SER GLY PRO ASN GLU SER ALA LEU LEU THR MET ILE SER GLU ASN GLY

ASN LEU GLN VAL THR TYR VAL ARG HIS TYR LEU LYS ASN HIS GLY GLU

SER SER SER GLY GLY GLY GLY CYS GLY ALA ALA SER THR ALA SER ALA

30 VAL CYS VAL SER SER LEU GLY GLY SER GLY GLY THR ARG ASP GLY PRO

SER ALA GLU GLU GLN GLN ARG ARG ARG GLN GLU GLN ARG HIS GLU GLU

ARG ARG LYS LYS SER SER SER SER ALA GLY GLY GLY GLY GLY GLY GLY

ALA GLY GLY GLY GLY GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLN HIS SER SER

ASP SER ALA ASN GLY LEU LEU ARG ASP PRO ARG LEU MET ASN ARG GLN

LYS GLU ARG ARG PRO PRO PRC SER SER GLU ASN ASP, hvorved polypeptidet indeholder en sekvens valgt blandt: 35 a) -Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-

Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly- og DK 175828 B1 100 b} -Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-

Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-, ; og farmaceutisk acceptable salte eraf, hvorved polypeptidet immunoreagerer med anti-EBNA-antistoffer.

5 4. Fremgangsmåde til afprøvning for anti-EBNA-antistof fer i en legemsprøve, kendetegnet ved, at den omfatter, at man a) blander legemsprøven med et polypeptid ifølge 10 krav 1 til dannelse af en immunoreaktionsblanding, b) holder' blandingen i et forudbestemt tidsrum, som er tilstrækkeligt til, at de nævnte anti-EBNA-antistoffer immunoreagerer med polypeptidet til dannelse af en immuno-reaktant, og 15 c) påviser tilstedeværelsen af den nævnte immunoreak- tant og herved tilstedeværelsen af de nævnte anti-EBNA-antistof fer i prøven.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendete g- 20 net ved, at polypeptidet er udvalgt fra den gruppe, som består af a) H-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly--Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-OH, b) H-Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-25 -Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-OH, og c) H-Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly--Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Cys-OH. 1

Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendete g- 30 net ved, at trin c) omfatter trinene, at man i) blander immunoreaktanten fra trin b) med enzymmærkede anti-humant IgM-antistofmolekyler til dannelse af en anden immunoreaktionsblanding, ii) holder den anden immunoreaktionsblanding i et 35 forudbestemt tidsrum, som er tilstrækkeligt til, at tilstedeværende anti-EBNA-antistoffer immunoreagerer med de mærkede 101 DK 175828 B1 antistofmolekyler til dannelse af en mærket immunoreaktant, og iii) påviser tilstedeværelsen af den mærkede immunoreaktant og derved tilstedeværelsen af anti-EBNA-IgM-anti-5 stoffer i prøven.

7. Diagnostisk system i form af et prøvesæt til afprøvning for tilstedeværelsen af anti-EBNA-antistoffer i en legemsprøve, kendetegnet ved, at systemet i se-10 parate pakninger omfatter: a) et polypeptid ifølge krav 1 og b) et indikatormiddel til signalering af immunoreak-tionen af polypeptidet med humane anti-EBNA-antistoffer.

15 S. Diagnostisk system ifølge krav 7, kendeteg ne t ved, at polypeptidet er udvalgt fra den gruppe, som består af a) H-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly--Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-OH, 20 b) H-Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly- -Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-OH, og c) H-Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly--Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Cys-OH, og at indikatormidlet er et enzymmærket anti-humant-IgM-an-25 tistof.

DK 175828 B1

FIG. I

+2i------- o-j-- iPeptid fJT j

h Peptid BfJ

"15| /

j I Peptid E

-20'—Λ-1-*- 200 220 240 260 BØLGELÆNGDE (nm) 1 t DK 175828 B1 FIG. 2

PEPTID

ANTISERA EBNA C C B B B B

INHIBITOR - — C — B - C

L-, 1 * I-1-I I I I " I 1 1

ABC 0 E F G

DK 175828 B1 o _ o \/ o o

C CD O Q lu O

. o Ό U Ό Ό Ό / _ •i-J ·Η ·Η Ή *H / 4J 4J 4J 4J jj /

Q) Qj Di Oi CU M

<D U) <U 0) <L) a Οι D< Eij ftj / O · φ « S' ^

S^ / o *DJ

° i. O 2.

/ z ro | yX 1

o i« / ..i I

li- / / ω V /g / /05 h /1 r / - i> s / r

>4 - O

>y »· / «

I_i-1 .........,:-1-1-—i--1- O

= «=> o <=> cs =» “r-

Cvj C3 as U5 -» ^ DBDTAT^M^P'Road-T^uv DK 175828 B1 1 1,0 r #15 . η 160 o T ω ^ 0,8 - / - 80 2

0 I V

FIG.41 o,6 - / p - 40 s 1 μ- J/ -»1 cm f \ m -H / X / <c S o,2 - // * - 10 9 t y 6 1 0 Ig—·-1 --1- ‘--1—!<10 0 20 40 60 100 1 2 3 4 5 —Døgn År q Tid efter udbrud ol,0-i^14 r 160 +·

4J

S 0,B- -80 I

'3 0/6· / -40 S

FIG.5A ? / ,, i

!*./ .·» I

5 0-[“O—r°—Q-i—/Ar// r?^i -r <10 9 10 20 40 60 100 1 2 3 4 5 5 Døgn År

Tid efter udbrud -S 1,2-j-#2 r320 * g 10- >0-160 3 U—J / ✓· u-f *- ^ ^ · ° % 0,8- p' / “80 «

JJ * / 4J

FIG.5B ί °'6- / / -40 I

5 0,4- / / “20 ?

r) ' / *H

O, , / 4-> ω ' _/ c J 0/2- M0 *

4J P

« 0 4-^0—rO-Q—//-r/A-j—i—i—1—h <10,

1 20 40 60 100 1 2 3 4 5 O

Døgn År

Tid efter udbrud DK 175828 B1

2 r = IgG/lgM

• =lgM

O —i-1-1_-j-1 1-L_//_i

JAN FEB MAR APR MAJ JUN JUL JUN

FIG.6

= IgG/lgM

o · =lgM

2 - o -JgG

1 II /X

p; * 1. sygdom 1 2. sygdom / C /

Udbrud af CMV/IM Udbrud af EBV/IM / 5 1-^\_.

R ^ \/ / oL-o-οΐ—1—i—--1

SEP OK-T NOV DEC JAN DEC

PIG 8 1981 1982 DK 175828 B1 I *©«» m 5 < J_ ftfwt*.» ί"ϊ. ·····.'·,;.· ; · }.:*$$&&§ *·«β g 05 I ο: z μ «.·-! ··:·-. ;>:r ^v<kS£SSB o »ij > w- & '*f ϊ: •-Λ.*·· Q — > ^ Η **;, dø U- “ί Z" III I ·

IO se ID O

OK© ^ CM

5 5$ r; ».· *** {7 □ < '·*»' *4*'i*A :*-.* -· · °· i i.i i ·

id r~- tt> iD O

O) t- CD Tt <N

I l I I * io k © © o>

0> h- CD < CM

fj < i- ® ^$13^::’:' n £ £ S * tef:lf;: · ®-Silligi ΪΪ i o

# ZOflCS

Ilt i > © K © li) 05

σ> K CD ^ CM

DK 175828 B1

Jo _ 9

V

O =>C3S

/ ^ “ Se® · 11

rsi *— O

O

li.

CO

+ n — v \ / g cn ^ τβΑ s 7\\ q

/ \\ S

/ \\ σι · O ~ >

O * i “gS

_ t _i_ ° ^ rsi ·— cd d

£ uju Q6t7 G'O

DK 175828 B1 i 2 o o o Ξ ^ jc -* .η ps. co ir> > r-* co

I I I

u* ° 4, " 05 « cj - ·***·**£» oo | i in uf I? * β *'<ί*βΜβΙ r*» «

s . r° u| 4M I "I

nru» t,rf

§ ^ ·» «-S

§ s o i Mil co s u, M^pp^ftJawV " CQ uj «— o U- [A o o o 3 JC JÉ J>c μ Ρ>» CD ΙΟ •η Γ— CO ·ςρ·

> III

!

O

LL

DK 175828 B1 WIL2 -EKSTRAKT DB2 DS2 TG1 DB8 DS7 G6

IgM IgG

PEPTID P62 -+- + -+-+-+- + 1 234567» 9111 0 12 FIG. I2 DK 175828 B1 ο» e n ιλ o> m ~~ N (Τ' Π O* V O' ir* o *o — ry ry m m *r cr* ut o |- ot o o t-| < o el K o o x t- u υ no >- u n o I·- κ o i- o o to« x h- tu t~ j o tu h-iu tu o

h O O < < ·. h J υ O O J υ|Λ Μ H

i— κ o ft.

o o o o »- jo n o «co s o k υ i- o o rei_> < η »— κ -jo j κ u υ

o o o o. o >o x o ko o o rt H

κ o η o o k μ tu o no ko >- o j o

O I- O »O K X I- IU I- UU -JO Κ H

O O H *< < b H -JO to H OO > O

Κ Κ I— κ o V- < o ko -JO κι- ft. o k υ κ κ o -Jo j κ κι- jo οκ ω υ

H I- o -< O oo > O K O KO to H

< < υ « «c o tu »- oo v) o no o to <

H Κ O XI- KO >- « -I < JO >- K

I- H* I- ft. I- K O J K oo OO J K

I- κ o o h o « h -Jo b υ >- o ko *o < o o x o κ j o -jo x o ok i- m o t- κ > o oo o o i- κ κ κ »—<<♦—

O O Η ft. O a. O ft. »- too IU I- UU

«< I- O KO OK IO < »-* K JI-* ΧΙΟ «6 O Η·*- KO K O X O m < 0-1-

O o O

o < K KO tu O >- O «io ft. O JO

-C <C o >- K XI- JO J < « < Κ Ι ο < O I— I— ft. H oo oo «co > o *— o κ ι-οοοκκι-β.οι— o tu »— uio o H> o >- κ x o to«e tu i— j|- ji-

_ o O O J K I— K «CO X < M < *-» K

I- O H-

Io o o ok ko jo ω H k i— >-· i—

o o KO JK K i— Jl- tuo JO

o o o ko o o >o »-tK i/; h oo r*J o o o o o O JO Kl- too KO i-o >*o

O K K K h to K >- o XO UH JO

Λ *- «- o > o K K O I— I— K X K oo * o o o C *J O o H JO JO XO Kl- UJO oo

«—» o t- O KV- K I— lOKt—JO XI— KO

Il O I— o >- o >o K K »— KO ft- I— KO

·"*-* 1-0 0 XJ

O I— I- ko KO JOClOU >— O JK

K o O XO tuo K I— ··— >— O JO KH- o O K l-K to K >0X01- o o > o o o o t— η o κι- kk no no xo u> t— H- O O XO JK UJI— UJ H JK XI— t- t- O H-K oo JO JO OO O- I— K t— o o η* o oi- to i- o i— o-o xo no

O o o KO *— K Xo KO JK tu Ιο I— o 0-0 XO KO l·- H- OO JO

Η H h t- o o no no ko >- o ko io o

O O o tu t— U H JO JO XO *— K

o K O JO JO KO OO i— K xo o o o k t- o o- t— tuo ko tn o o o no

I- O o OK J h- XO >— K " ►* K JK

o O t— KO *— K »— K JK JK o o K I- o

K o I- I- O OO Cl i— KO KO k o I

k o o tul- ko ok o k jo j <

o o O X K KO Ko KK K o o o I

< W h O

O O t- ·*· O

o Æ o o ►“Μ o o e* i— i/> rn —- OKI—·— ·— r> *T* N σ' DK 175828 B1 σ' m h *— ιλ σ' ro rw » — vo γμ s ro oo η s e

vo \o r— t— co cd σ· O' Q O

o o o d o 3 «c M u d < k υ K· υ o o o. u| < j κ j κ h o ~j κ u υ jo ku to k| o oo oo oh oo to h oo o- o ko o KO H O JO 30 K o H O L Η X Z U o u υ -J o κ h j κ ω υ jo to κ E to κ o

•OH OO H O OO ΙΟ H OO K O «> Κ K O

flO K

UJ H to o < U «CO to o HO OO OO O

JH *-* K JO JO H K JO KO J K O

*-· K X O «CO K O J K OO «CO oo K

o

HO ae O DC o CCH to K HH 3 O eeo O

ui h to κ ω υ y υ h < JO ujh uj o o

X «c «C < tOH IOH J K OO JO tOH O

K

K U to K Κ H OH o o HO 3p KO H

XO H < JO KO KO JO UJH U) O O

H K J K «C O Cl. O KO OO JO tOH O

O

30 30 KO HO OO HH HK OO O

U> H UJH XO JO KO JO JO KO H

JO JO H < OO K O OO OO 0-0 O

O

30 KO DC H 0-0 3 K HH XO OH O

Η Η H K U O tO K J K JO tO K KO «Cl

JO HH ΙΟ H KO OO OO < < 0.0 OI

Hl

KO OH KO OJ 3 K «C H KO OO O

JO ►« K JO KO JK JO JO KO O

KO XO K O KO OO KO KO 0.0 H _ .

o OJ

KO OO KO KH OO HO KO OO K , tu O ko JO XO »-t K JO UJO KO o ( ok ko ko hk xo oo oh ko o

H fO

30 JO HO HO OH HO 0.0 OO O * JK KH JO JO KO JO OK KO K .·_» OO P* O OO OO KO OO KO KO o o · X H KO OO HO XO HO Ko 30 O f ^ O K HK HO JO JK JO UJO J K Η V7 KK HH OH OO OO OO OH OO H | (

O O KH HH KO 3 K HK KO OO O

KO XO JO UJO JK JO UJO HK O

o HK OO to K OO OO tO H JK H

O

HK JO HH HO XO HH tOO XO O

JO KH JO JO JK JO ►— K JK O

OO HO oo oo oo OO XO oo K

o

ko XK HO HH OO HH XO OO H

HO JK JO JO KO JO JK KO o to K o o OO OO KK oo oo ko o o

KO 30 HK 30 OK HH HH XO O

UJO UJH JO UJH KO JO JO tO K H

tOH Jh oo jo ko OO OO KK O

o

HO XH KO KO OO KO HO HO H

JO tOK UJO UJO KO JO JO UJH O

OO KK tOK tOH KO KO OO XK o o

JO HH KO KO XK KH KO 30 O O

KH JO uio ujo jk uio ujo ujh O O

HO OO tO H tO H OO tO Η lOK JH O H

O H

Jo XO KO JO XO KO HO OO o o

KH tOK UJO KH JK UIO JO KO Η H

HO KK tOH >0 OO to H OO KO O O

K o o o

CT' f— tT> ro OHtnHO

O c* tr Ό co Ol *— ro O K

— — — — — r\i ru o o DK 175828 B1

Test af sekventielle sera fra IM-patient

EBNA p62 ELISA ▼ -IgG V-|gM

2 Γ CMV-peptid ELISA

_ HCMV ft 1

f\ ·-IgG

/ o=|gM

/ \ hcmv n E Γ \ O ./ \ D-lgM ---—▼ 5 1 - J, /V ’

Jan Feb Mar Apr Maj Jun Jul Jun 1985 1986

Udtagningsdatoer D.B.

FIG. 14

Test af sekventielle sera fra CMV/IM-patient

2r EBNA p62 ELISA

▼=I0G

I 1. sygdom il 2. sygdom I V=lgM

Γ ~ f--—---j CMV-peptid ELISA

Udbrud sf CMV/XM Udbrud 3f EBV/IM

E *=,gG

æ rx 0=lgM

5 ! _ v^\ hcmv n

R

Sep Okt Nov Dec Jan Dec 1981 1982

Udtagningsdatoer D.S.

FIG. 15 DK 175829B1 Batch : N0507412

Date : 16/03/2005

Number of pages : 16

Previous document : DK 175828B1

Next document : DK 175830B1

f I

(19) DANMARK nu DK 175829 B1

W rø PATENTSKRIFT

Patent- og

Varemærkestyrelsen (51) Int.CI7.: A47B 13/08 (21) Patentansøgning nr: PA 1997 01350 (22) Indleveringsdag: 1997-11-25 (24) Løbedag: 1997-11-25 (41) Aim. tilgængelig: 1999-05-26 (45) Patentets meddelelse bkg. den: 2005-03-14 (73) Patenthaver: Jesper Madvig Jørgensen, Lindevej 2, Strøby Egede, 4600 Køge, Danmark (72) Opfinder: Jesper Madvig Jørgensen, Lindevej 2, Strøby Egede, 4600 Køge, Danmark (74) Fuldmægtig: Holme Patent A/S, Vesterbrogade 20,1620 København V, Danmark (54) Benævnelse: Møbelplade og fremgangsmåde til fremstilling af denne (56) Fremdragne publikationer: US A 5452666 (57) Sammendrag:

En fremgangsmåde tjener til at fremstille en møbelplade (i), som langs et kantområde (2) er forsynet med en hulkehlliste (3;4), der på indersiden er udformet med en langsgående hul-kehlflade (5) . Til fremgangsmåden anvendes frie udgangslister (19;2 o), som har et rektangulært profil, der omslutter den kommende hulkehlflade (5). Udgangslisterne (X9;20) fastgøres i møbelpladens (1) kantområde (2), hvorefter hulkehlfladen {5) frilægges ved successivt at fjerne materiale fra udgangslisten (19;20) . Ved hjælp af fremgangsmåden kan der hurtigt og nemt fremstilles møbelplader (1), som har hulkehllister (3;4) med hulkehlf lader (5! , der går fuldstændigt jævnt og glat over i møbelpladens (1) overside (7), samtidig med at hulkehlfladerne (5) i et hjørne går over i hinanden langs en dobbeltkrum flade.

fortsættes DK 175829 B1 is? <<> -v-i g -\j- <o 22 1WF! r^j DK 175829 B1

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til at fremstille en møbelplade, såsom en bordplade, som langs et kantområde er forsynet med mindst én hulkehlliste, der på indersiden er , udformet med en langsgående hulkehlflade.

5

Hulkehllister anvendes til at danne én i designmæssig henseende tiltalende overgang mellem eksempelvis en bordplade på et kokkenbord og de tilstødende vægge. Samtidig tjener hulkehllisterne et hygiejnisk formål, idet de bygger bro over 10 de skarpe, indadvendende hjørner mellem bordpladens overside og væggen, således at -overgangen undgår at blive samlingssted for snavs og urenheder og let lader sig rengøre.

Konventionelt fremstilles en sådan bordplade på den måde, at 15 hulkehlen på forhånd udformes på løse lister, der dernæst som færdige hulkehllister fastgøres manuelt langs kantområdet. Det er imidlertid overordentligt vanskeligt og tidsrøvende at få sådanne lister til at passe godt nok til bordpladen, og det færdige resultat er' i de fleste tilfælde ikke i 20 tilfredsstilende.

Ved overgangen kan en liste således nogle steder rage lidt op over bordpladen og andre steder ligge lidt under. Derved opstår der ujævnheder i form af eksempelvis smalle spalter, 25 der virker som lommer for snavs og urenheder, og som nærmest er umulige at rengøre. Ujævnhederne skæmmer desuden et ellers smukt design.

Ved den konventionelle - fremgangsmåde skæres hulkehllister i 3 0 gering ved et hjørne og samles med en skarp overgang, der medfører, at hjørnet kommer til at lide af samme hygiejniske og synsmæssige mangler som nævnt ovenfor.

Fra US 5,452,666 kendes en bordplade med et bagstykke, der 35 tjener til at afskærme væggen, som bordpladen støder op til.

Dette bagstykke er udformet med en integreret hulkehl, der har DK 175829 B1 2 et langsgående federparti til at nedsænkes i ét i bordpladen udformet notparti. Da not og feder ikke nøjagtigt passer sammen, er det med denne konstruktion vanskeligt at opnå en tætsluttende og fuldstændig glat overgang mellem hulkehl og 5 bordplade.

Formålet med opfindelsen er at anvise en fremgangsmåde af den indledningsvis nævnte art, hvormed der hurtigt og nemt kan fremstilles en møbelplade med hulkehllister, hvis 10 hulkehlflader har en jævnere og glattere overgang til møbelpladens overside end hidtil kendt og i et hjørne går over i hinanden langs en dobbeltkrum flade.

Det nye og særegne ifølge opfindelsen, hvorved dette opnås, 15 består i, at der på kantområdet fastgøres mindst én udgangsliste, som helt eller delvist omslutter én i listen iboende hulkehlflade, og at hulkehllisten frilægges ved eksempelvis med en fræser successivt at fjerne materiale fra den mindst ene udgangsliste. Derved falder den konventionelle 20 fremgangsmådes møjsommelige og kostbare tilpasningsarbejde væk, og der opnås samtidig en fuldstændig jævn og glat overgang mellem hulkehlfladerne og møbelpladens overside og dobbeltkrumme hulkehlflader i hjørnerne. Derved sættes møbelpladen i stand til at leve op til den krævede hygiejniske 25 standard, og den lader sig hurtigt og nemt rengøre. Designet ødelægges desuden heller ikke længere af skæmmende ujævnheder mellem hulkehllisterne og møbelpladens overside.

Når hulkehllisten dannes ved fræsning, kan der anvendes en 30 computerstyret fræsemaskine, f.eks. en NC maskine, som er programmeret til styring af fræseren langs rummets tre akser x, y, z, hvor z-aksen står vinkelret på møbelpladen.

Styringen langs z-aksen kan fordelagtigt finde sted ved hjælp 35 af en detektor, som løbende registrerer fræserens z-akse position og afgiver signaler, der repræsenterer den målte 3 DK 175829 B1 værdi, til computeren. Detektoren kan eksempelvis fungere ved hjælp af en laserstråle, ultralyd eller lignede middel til at sikre et nøjagtigt måleresultat og deraf følgende præcist fræsearbejde.

5

Fræseren kan også positioneres langs z-aksen ved hjælp af et afstandsstykke, som har en glidefod og er anbragt på fræserens fræsehoved. Afstandsstykket sørger automatisk for, at fræserens nederste område nøje kommer til at følge 10 møbelpladens overside. Denne metode er enkel og samtidig meget sikker, da foden under passagen af bordpladens overside selv skubber spåner, som ville kunne være årsag til fejlregistrering af afstanden til møbelpladen, til side.

15 For at undgå hæmmende friktion mellem møbelpladen og afstandsstykket, kan dettes fod med fordel være indrettet til at glide på en luftpude, der samtidig tjener til at blæse spåner væk fra foden.

20 Opfindelsen angår også en møbelplade, såsom en bordplade med et kantområde, der er forsynet med en hulkehlliste, som har en hulkehl flade, der i tværsnit har form af en bue, medens bordpladens overside i tværsnit har form af en linie, der ved kantområdet tangerer nævnte bue. Samtidig kan hulkehlfladerne 25 på to lister, der mødes i et hjørne, gå jævnt og glat over i hinanden via en dobbeltkrum flade. Derved bliver møbelpladen hygiejnisk at anvende og rengøre, og den opnår et smukt design.

30 Ved en særlig hensigtsmæssig udførelsesform kan den dobbeltkrumme hulkehlflade i et hjørne, hvor to lister mødes, ligge i en omdrejningsflade, hvorved skæringskurven mellem denne dobbeltkrumme hulkehlflade og et plan, der indeholder omdrejningsfladens akse, kan være kongruent med skæringskurven 35 mellem den langsgående hulkehlflade og et plan, som står vinkelret på denne flade.

4 DK 175829 B1

Opfindelsen forklares nærmere nedenfor, idet der beskrives alene eksempelvise udførelsesformer og angives yderligere fordelagtige egenskaber og virkninger under henvisning til tegningen, hvor 5

Fig. 1 viser, set i perspektiv skråt oppefra, et brudstykke af en møbelplade ifølge opfindelsen,

Fig. 2 viser, set fra siden, delvis i snit, et første 10 procestrin ved fremstilling af den i fig. 1 viste møbelplade,

Fig. 3 viser, set fra siden, delvis i snit, et andet procestrin ved fremstilling af den i fig. 1 viste møbelplade, 15 Fig. 4 viser, set fra siden, delvis i snit, et tredie procestrin ved fremstilling af den i fig. 1 viste møbelplade, hvor en hulkehlliste fræses ved hjælp af en fræser,

Fig. 5 viser i mindre målestok et blokdiagram, der skematisk 20 illustrerer en elektronisk styring af fræserens z-akse position,

Fig. 6 viser i større målestok en mekanisk styring af fræserens z-akse position, 25

Fig. 7 viser, set oppefra, fræseren under fræsning af en første hulkehlliste,

Fig. 8 viser, set oppefra, fræseren under fræsning af en 30 dobbeltkrum hulkehlflade i et hjørne, hvor den første hulkehlliste støder sammen med en anden,

Fig. 9 viser, set oppefra, fræseren under fræsning af den anden hulkehlliste.

35 I fig. 1 er møbelpladen ifølge opfindelsen i sin helhed 5 DK 175829 B1 angivet med henvisningstallet 1. En bordplade 8 er langs et kantområde 2 forsynet med en første og anden hulkehlliste 3, 4 som hver har en langsgående hulkehlflade 5, der går jævnt og glat over i bordpladens overside 7. Hvor de to lister 3, 4 5 mødes i det viste hjørne, går de jævnt og glat over i hinanden via en dobbeltkrum hulkehlflade 6. I det viste tilfælde er bordpladen beklædt med et laminat 22 på begge sider.

Fig. 2 illustrerer et første procestrin ved fremstilling af 10 den i fig. 1 viste møbelplade. En udgangsliste 9 omslutter med et rektangulært profil den kommende hulkehlflade 5, som er antydet med punkteret streg. I figuren føres den frie udgangsliste i pilens retning hen mod bordpladen 8's kantområde 2.

15 I fig. 3 er listen 9 bragt til anlæg mod bordpladen 8, og i fig. 4 med et eventuelt mellemliggende limlag (ikke vist) sømmet fast på bordpladen med søm 18. En fræser 10 har dernæst fræset så meget af udgangslisten 9, at hulkehlf laden 5 er 20 blevet frilagt.

Det bemærkes, at listen kan være fastgjort på bordpladen på en hvilken som helst anden egnet måde, f.eks. med skruer eller alene ved hjælp af limning.

25

Det i fig. 4 viste procestrin er nærmere illustreret i fig. 5, hvor fræseren 10 er monteret i et fræsehoved 23 i en fræsemaskine (ikke vist), som er udstyret med en computer 15. Fræserens styring langs z-aksen finder sted ved hjælp af en 30 detektor 17, som følger med fræseren 10's fræsehoved 23 og herunder løbende registrerer dettes øjeblikkelige afstand fra bordpladens overside. Herunder afgiver detektoren et signal, som repræsenterer den registrerede afstand, til computeren 15, som dernæst sammenligner værdien med en referanceværdi fra en 35 referenceenhed 16. Ved afvigelser sender computeren via en forstærker 24 signal til et manøvreorgan 25 om at regulere 6 DK 175829 B1 fræserens z-akse position således, at værdien af fræserens afstand fra bordpladens overside bliver lig med referenceværdien. Da fræserens nederste område derved tvinges til nøje at følge bordpladens overside, dannes mellem denne og 5 hulkehlfladen 5 den ønskede fuldstændige jævne og glatte overgang.

Fig. 6 viser en anden mulighed for justering af fræseren 10's z-akse position. I dette tilfælde anvendes der et 10 afstandsstykke 11, som er monteret på manøvreorganet 25, og som har en fod 12 til glidende at støtte mod bordpladen 8's overside 7. Glidefoden 12's underside ligger i samme niveau som fræseren 10's underside, og fræsehovedet 23 er anbragt frit forskydelig i aksial retning på fræseren 10. Under 15 fræsningen holder afstandsstykket 11 derved stedse fræserens underside i samme niveau som bordpladens overside, således at der også i dette tilfælde opnås en fuldstændig jævn og glat overgang mellem hulkehlfladen 5 og bordpladens overside 7.

Denne metode er enkel og desuden meget sikker, fordi foden 12 20 selv skubber generende spåner til side.

I fig. 7, 8 og 9 illustreres den successive fræsning af hulkehlfladerne i en første og anden udgangsliste 19; 20, som er fastgjort langs et kantområde 2 på en bordplade 8. Som vist 25 overlapper listerne hinanden i hjørnet 21.

I fig. 7 føres fræseren under fræsning af en hulkehlflade 5 i den første udgangsliste 19 i pilens retning hen mod hjørnet 21.

30 I fig. 8 er fræseren nået hen til hjørnet 21, hvor den fræser en dobbeltkrum overflade med én til fræserens yderside svarende komplementær form, som nærmere er defineret ved, at skæringskurven mellem den dobbeltkrumme overflade og et plan, 35 som indeholder omdrejningsfladens akse, er kongruent med skæringskurven mellem den langsgående hulkehlflade og et plan, 7 DK 175829 B1 som står vinkelret på denne.

I fig. 9 føres fræseren under fræsning af en hulkehlflade 5 i den anden udgangsliste 20 i pilens retning bort fra hjørnet : 5 21.

t 8 DK 175829 B1

Patentkrav 1. Fremgangsmåde til at fremstille en møbelplade (1), såsom en bordplade (8), som langs et kantområde (2) er forsynet 5 med mindst én hulkehlliste <3;4), der på indersiden er udformet med en langsgående hulkehlflade (5), kendetegnet ved, at der på kantområdet (2) fastgøres mindst én udgangsliste (9;19;20) , som helt eller delvist omslutter én i listen (9;19;20) iboende hulkehlflade (5), og at 10 hulkehlfladen {5) frilægges ved successivt at fjerne materiale fra udgangslisten (9) .

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at materialet fjernes ved hjælp af en fræser (10).

15 3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, og hvor kantområdet (2) omfatter et hjørne (21), hvor to kanter mødes, kendetegnet ved, at der på hver sin af de to kanter anbringes en udgangsliste (19;20), som i hjørnet (21) 20 omslutter én i listerne (19;20) iboende dobbeltkrum hulkehlflade (5) , og at denne hulkehlflade (5) frilægges ved successivt at fjerne materiale fra udgangslisterne (19;20) .

25 4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 2 eller 3, kendetegnet ved, at materialet fjernes med en fræser (10) i en fræsemaskine med en computer (15), som er programmeret til at styre fræseren (10) langs rummets tre akser x, y, z, hvor z-aksen står i hovedsagen vinkelret på møbelpladen (8).

30 5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at fræserens (10) styring langs z-aksen finder sted ved med en detektor (17), som følger med fræseren (10), løbende at registrere dennes øjeblikkelige afstand fra bordpladens (8) overside 35 (7) og afgive et signal, som repræsenterer denne afstand til computeren (15), som dernæst sammenligner værdien med 9 DK 175829 B1 en referenceværdi og sender signal til ét til fræsemaskinen hørende manøvreorgan (25) om at regulere fræserens (10) z-akse position således, at værdien af fræserens (10) afstand fra bordpladens (8) overside (7) 5 bliver lig med referenceværdien.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 4 eller 5, kendetegnet ved, at fræserens (10) z-akse position fastlægges af et afstandsstykke (11), som følger med fræseren (10) og har 10 en fod (12) til at støtte mod møbelpladens (8) overside (7).

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at afstandsstykkets (11) fod (12) støtter mod møbelpladens 15 (8) overside (7) via en luftpude.

8. Møbelplade (1), såsom en bordplade (8) som langs et kantområde er forsynet med mindst én liste, som har en langsgående hulkehlflade som i tværsnit har form af en 20 bue, og hvor bordpladens (8) overside (7) har form af en linie, der ved kantområdet tangerer nævnte bue, kendetegnet ved, at de langsgående hulkehlflader (5) på hver sin af to lister (19;2Q), der mødes i et hjørne (21), går jævnt og glat over i hinanden via en dobbeltkrum 25 hulkehlflade (6).

9. Møbelplade (1) ifølge krav 8, kendetegnet ved, at den dobbelt krumme hulkehl flade (6) ligger i en omdrejningsflade, og at skæringskurven mellem denne 30 dobbeltkrumme hulkehlflade (6) og et plan, som indeholder omdrejningsfladens akse, er kongruent med skæringskurven mellem den langsgående hulkehlflade (5) og et plan, som står vinkelret på denne flade (5).

35 DK 175829 B1 δ ^\\ FIG.2 V/}////^( ^

m·3 Y/////M

se^T^ \/J^·5 n6i y//7^ék

K6 V/S

ri6 _[J1 r^u—T^l5 ' — “ -i r 1 1 1-1—-Π-1 K- 23 π-'t TE-d yy/'s'^r??v // v /77 / >4 s S s-s / s / / / 44 > v yy^ FI6.5 DK 175829 B1 lo

Os, -V-, g rvj

-^QO

cz> wii ^

r^J

DK 175829 B1 \ o <d l C: \ Uf

~ ^-7-^l S

i Ær 00 f~i co c: CS4 A-^

Ί L

.Τ' ^

c-, CO

f ___ ^ _ ______-;~- — *o DK 175830B1 Batch : N0507412

Date : 15/03/2005

Number of pages : 14

Previous document : DK 175829B1

Next document : DK 175831B1 (19) DANMARK ου DK 175830 B1 <g|g>

lp (12) PATENTSKRIFT

Patent- og

Varemærkestyrelsen (51) lnt.CI7.: A 01 G 13/02 (21) Patentansøgning nr: PA 2002 01331 (22) Indleveringsdag: 2002-09-10 (24) Løbedag: 2002-09-10 (41) Aim. tilgængelig: 2004-03-11 (45) Patentets meddelelse bkg. den: 2005-03-14 (73) Patenthaver: Peder Weje Borup, Ravnsnæsvej 54,3460 Birkerød, Danmark dohan Adam Linneballe, Ry vangs Allé 6,2100 København 0, Danmark Thomas Barfoed Randrup, Linnesgade 26,3. tv., 1361 København K, Danmark (72) Opfinder: Johan Adam Linneballe, Ryvangs Allé 6,2100 København 0, Danmark Peder Weje Borup, Ravnsnæsvej 54,3460 Birkerød, Danmark Thomas Barfoed Randrup, Linnesgade 26,3. tv., 1361 København K, Danmark (74) Fuldmægtig: Chas. Hude MS, H.C. Andersens Boulevard 33,1780 København V, Danmark (54) Benævnelse: Skærmindretning til beskyttelse af planter mod vejsalte, støv, sand, slud m.v.

(56) Fremdragne publikationer: DE A1 3326454 WO A1 9946975 (57) Sammendrag:

En skærmindretning til beskyttelse af planter mod vejsalte, støv, sand, slud m.v. omfatter en skærm og hertil hørende stolper (14) til fastgørelse af skærmen (1). Skærmen (1) er af et massivt plademateriale og har, set i tværgående snit, en i det væsentlige første bueformet del (2), som strækker sig fra en til anlæg imod jorden beliggende første endedel (5) til en i niveau overjorden placerbar anden endedel (9), og som har en hulhed, der er indrettet til atvendevækfraplanteme.Skærmen(l)harmidler(ll, 12,13) til fastgørelse af stolperne (14).

fortsættes DK 175830 B1 !^11 4-—i —16 c9 \ 2— 14 8 f3

Vj^ N

6" ^ ! j

I I

I I I I I I I I

- I I

I I I I

Fig. 1 i i a ιΛ-17 DK 175830 B1

Opfindelsen angår en skærmindretning til beskyttelse af planter mod vejsalte, støv, sand og andre forureningsmidler i fast eller flydende form, og som omfatter en skærm og hertil hørende stolper til fastgørelse af skærmen, hvilken skærm er af et massivt pla-< demateriale og har, set i tværgående snit, en i det væsentlige første bueformet del, som 5 strækker sig fra en til anlæg imod jorden beliggende første endedel til en i niveau over jorden placerbar anden endedel, og som har en hulhed, der er indrettet til at vende væk fra planterne.

Det er kendt at beskytte planter mod vejsalt ved hjælp af halmmåtter, som fastgøres 10 langs vejkanterne eller rundt om de planter, der skal beskyttes. Virkningen af halmmåtter er ikke fuldt ud tilfredsstillende, hvilket blandt andet skyldes, at halmmåtteme har tendens til at opsamle saltet, der så løber ned i jorden lige omkring de træer eller planter, der skal beskyttes, eller direkte ned i det pågældende bed. Halmmåttemes virkning afhænger naturligvis af, om de står på en belægning uden for bedet eller direkte i bedet.

15 Halmmåttemes virkning aftager derudover i løbet af sæsonen antagelig på grund af, at måtterne ødelægges, forskydes eller skubbes ud af deres oprindelige placering eller form.

Fra tysk offentliggørelsesskrift nr. 33 26 454 kendes en kegleformet skærmindretning, 20 der kan bruges til at beskytte vej- og gadetræer over for mekaniske beskadigelser af barken som følge af maskiner, såsom græsslåmaskiner. Denne skærmindretning omfatter en keglestubformet skærm, som er indrettet til at blive anbragt omkring en træstamme med overlappende dele. Den øvre del af beskyttelseskeglen er perforeret for at ' sikre, at træstammen kan fa tilført lys og ånde. Denne skærm er ikke velegnet til brug 25 til beskyttelse over for vejsalt på grund af disse perforeringer. Ved brug til beskyttelse af vejsalt vil vejsaltet i øvrigt også blive kanaliseret ned til det rodsystem, der vokser ud i den omgivende jord, hvor de pågældende maskiner skal kunne komme til. Den pågældende skærmindretning hindrer således ikke vejsaltet i at trænge ned i bedet.

30 WO 99/46975 angår en skærmindretning til beskyttelse af især unge planter over for andre vækster og over for vejr og vind og skadelige dyr. Skærmindretningen omfatter 2 DK 175830 B1 en skærm, som består af to halvdele, og som i samlet tilstand har en bølgeformet overflade. Det drejer sig ikke om en skærmindretning til beskyttelse over for vejsalt, og vejsalt som eventuelt kastes op imod en sådan skærm, vil falde ned i det omgivende bed.

y 5 Formålet med opfindelsen er at tilvejebringe en skærmindretning, som sikrer bedre afskærmning af de pågældende bed, og samtidig så vidt mulig konstant virkning al den tid, den er opstillet.

Dette opnås ifølge opfindelsen ved, at den første bueformede del følger en kurve, som 10 har en imellem enderne værende tangent, som i brugsstillingen er lodret placeret, at skærmens første endedel er indrettet til at ligge an imod en eller flere kantsten eller et andet fast underlag, som afgrænser det pågældende plantebed, og er indrettet til at ligge an herimod, og at skærmen har midler til fastgørelse til stolperne.

15 Det massive, pladeformede materiale sikrer effektiv afvisning og eventuel tilbagekastning af saltet, idet den specielle bueformede form indebærer, at saltet kastes tilbage væk fra det område, der skal beskyttes imod saltet. Skærmens form sikrer endvidere, at den kan placeres med sin nederste første endedel ragende ind over de fliser eller kantsten, som afgrænser det pågældende bed med planter, således at vejsaltet hindres i at 20 havne i bedet og trænge ned til planternes rødder. Tilstedeværelsen af midler til fastgørelse af stolperne sikrer mulighed for hurtig og ensartet montering af skærmen.

Særlig effektiv tilbagekastning af saltet opnås, hvis ifølge opfindelsen den første bueformede del følger en kurve, som har en imellem enderne værende tangent, som i ' 25 brugsstillingen er lodret placeret.

Endvidere kan skærmens første bueformede del udgøre en del af en, set i tværgående snit, i det væsentlige S-formet form, idet den anden endedel går over i en anden bueformet del, hvis hulhed er indrettet til at vende ind imod planterne, hvorved skærmen 30 får et tiltalende ydre med en pæn afrundet form foroven.

DK 175830 B1 3

Desuden kan ifølge opfindelsen skærmen imellem den første og den anden endedel af den første bueformede del, set i langsgående snit, være bølgeformet, hvorved skærmen kan tildannes særlig stabil af et forholdsvis tyndt materiale.

5 Desuden kan ifølge opfindelsen skærmen, set i langsgående snit, være bueformet, således at den om ønsket kan anbringes omkring et afrundet hjørne eller rundt om et træ ved sammensætning af skærme.

Særligt hensigtsmæssigt kan stolperne have form af store søm med hoved, skaft og 10 spids, eller store klamper med ben og spidser, ligesom skærmen kan have et antal sæt af hver tre huller, hvor hvert sæt af huller er indrettet til i brugsstillingen at ligge på linie med hinanden med henblik på optagelse af en stolpe. Herved opnås, at en skærm kan monteres på forholdsvis let og stabil måde blot ved at hamre stolperne ned i jorden.

15 Endelig kan skærmen ifølge opfindelsen være tildannet af et elastisk eftergiveligt materiale, fortrinsvis plast, hvorved skærmen kan fastgøres med en passende forspænding.

Opfindelsen beskrives nærmere nedenfor under henvisning til tegningen, hvor 20 fig. 1 viser en foretrukken udførelsesform for en skærmindretning ifølge opfindelsen, set fra enden, i brugsstillingen, fig. 2 samme, set forfra, med dele for tydeligheds skyld fjernet og koblet sammen med en tilstødende skærmindretning, 25 fig. 3 et langsgående snit igennem dele af to sammenkoblede skærmindretninger ligeledes med dele for tydeligheds skyld fjernet og set i større målforhold, fig. 4 to skærmindretninger, som er koblet sammen og strækker sig vinkelret på hinan-30 den, set ovenfra, 4 DK 175830 B1 fig. 5 skematisk en skærmindretning med en klampeformet stolpe, set fra enden i mindre målestoksforhold, og fig. 6 fire bueformede skærmindretninger koblet sammen til afdækning af et bed om- ^ 5 kring et træ.

Den i figur 1 viste skærmindretning omfatter en pladeformet skærm 1, som, set i lodret tværsnit i brugsstillingen, har en S-formet form, idet den har en nedre bueformet del 2, hvis hulhed vender væk fra et bed 3, der skal afdækkes, og en øvre bueformet del 4, 10 hvis hulhed vender ind imod det bed 3, der skal beskyttes.

En nedre endedel af den nedre bueformede del 2 er indrettet til at ligge an imod jorden omkring bedet 3 og i det foreliggende tilfælde en kantsten 6 langs en vejbane 7. Den nedre endedel er til dette formål tildannet med en krumning 8, således at den kan ligge 15 tætsluttende an omkring den øvre side af kantstenen 6. En øvre endedel 9 af den nedre bueformede del står i forbindelse med den øvre bueformede del 4 og er placeret længere væk fra den pågældende vejbane 7 end den nedre endedel 5. Imellem den nedre endedel 5 og den øvre endedel 9 følger den nedre bueformede del 2 en kurve, som i den pågældende stilling har en lodret tangent i et område imellem de to endedele 5 og 9.

20

Den øvre bueformede del 4 ender opadtil i et i alt væsentligt vandret stykke 10.1 dette vandrette stykke 10 er der tildannet et hul 11, og i den nedre bueformede del 2 er der tildannet to hullet 12 og 13, som i den viste stilling ligger på linie med hinanden og med hullet 11 og nærmere bestemt langs en lodret linie i brugsstillingen. De nævnte 1 25 huller 11, 12 og 13 er af en sådan størrelse, at de kan optage en stolpe 14, der har form af et stort søm med et hoved 15, et skaft 16 og en spids 17. Ved hjælp af denne stolpe 14 sidder skærmen 1 stabilt fast i bedet.

figur 2 ses skærmen 1 fra vejsiden koblet sammen med en tilsvarende skærm Γ ved 30 hjælp af en fælles stolpe 14. Som antydet ved hjælp af tynde lodrette linier i figur 2 er den nedre bueformede del 2 af skærmen 1 tildannet bølgeformet, hvilket er vist tydeli- DK 175830 B1 5 gere i figur 3, som viser et langsgående vandret snit igennem de to skærme 1, Γ i overlapningsområdet. De to skærme 1, Γ er på ikke nærmere vist måde tildannet, således at overlapning let lader sig koble sammen med en fælles stolpe 14, f.eks. ved hjælp af lettere forsatte dele. Skærmene kan være tildannet retlinede i længderetningen og være 5 skråt afskåret ved enderne, således at de, f.eks. som antydet i figur 4, kan kobles eller svejses sammen til dækning af et retvinklet hjørne. Ved hjælp af punkterede linier er kantstenene 6 antydet. Skærmene 1, Γ er fastgjort ved hjælp af hver sin stolpe 14, 14', hvoraf naturligvis kun hovedet kan ses.

10 Skærmene kan naturligvis også kobles eller svejses således sammen, at de dækker andre ikke-retvinklede hjørner, eventuelt ved brug af passende ikke-viste udfyldningselementer, som sikrer skærmenes sammenhængende forløb omkring et hjørne.

I figur 5 er skærmindretningen vist med en anden udførelsesform for stolpe 18. Denne 15 stolpe 18 har form som en U-formet klampe eller nål, hvis ene ben er ført igennem hullerne 11, 12 og 13 i selve skærmen 1.

Skærmindretningen kan anvendes til beskyttelse af bede og planter over for salte, støv, sand, slud m.v. langs vejbaner. Den kan imidlertid også anvendes mange andre steder, 20 hvor der spredes salt, f.eks. på fortove og pladser. Til dette formål kan skærmene være tildannet med en hertil passende form. For eksempel, som vist i figur 6, kan skærmene være bueformede og indrettet til at blive koblet sammen, således at de danner en lukket krans omkring f.eks. et træ. Langs den nedre endedel 5 kan skærmene være tildannet, således at de ligger tæt an imod den pågældende flisebelægning.

25

En foretrukken udførelsesform for skærmen er tildannet af 4 mm genbrugsplast. Det i enkelte skærmelement vejer ca. 3,6 kg og har en længde på 190 cm og en højde på 70 cm. Skærmene kan i øvrigt fremstilles i forskellige farver afpasset efter de forskellige i anvendelsformål. Som nævnt er skærmen hensigtsmæssigt tildannet med et bølgefor-30 met midterområde. Disse bølger løber jævnt ud med det øvrige plademateriale langs j den nedre og den øvre del, således at der kan opnås god tætning langs fliser og kant- j 6 DK 175830 B1 sten. Den valgte fonn gør skærmen velegnet til at kunne rengøres og stables, således at den også er let at transportere og opbevare på pladsbesparende måde.

Den beskrevne skærmindretning er først og fremmest beregnet til brug som saltskærm, 5 men den kan antagelig også benyttes til trafikregulering, f.eks. i forbindelse med forskellige midlertidige arrangementer. I så fald kan skærmene være påmalet henvisninger med mere til at lede trafikstrømmen.

Opfindelsen er blevet beskrevet under henvisning til en foretrukken udførelsesform.

10 Der kan foretages mange ændringer, uden at man herved afviger fra opfindelsens ide.

For eksempel kan den være fremstillet af andre materialer, såsom glasfiberarmeret plast eller metal, og tildannet med en anden formgivning end den viste med den vandret pla-cerbare del 10 foroven. I stedet for det nævnte og viste bølgeformede tværsnit kan skærmen naturligvis også have mange andre tværsnitsformer lige fra en fuldstændigt 15 retlinet form til forskellige former for bølger. Tværsnitsformen kan også være sammensat af retlinede partikler og forsatte partier. Stolperne kan f.eks. i stedet for at være lange og spidse til neddrivning i jorden være indrettet til optagelse i en fod eller holder, som eventuelt kan fjernes igen.

7 DK 175830 B1

PATENTKRAV

1. Skærmindretning til beskyttelse af planter mod vejsalt, og som omfatter en skærm (1, 1') og hertil hørende stolper (14,14’, 18) til fastgørelse af skærmen (1, Γ), k e n d e t 5 egnet ved, at skærmen (1, Γ) er af et massivt plademateriale og har, set i tværgående snit, en i det væsentlige første bueformet del (2), som strækker sig fra en til anlæg imod jorden beliggende første endedel (5) til en i niveau overjorden placerbar anden endedel (9), og som har en hulhed, der er indrettet til at vende væk fra planterne, og at skærmen (1, Γ) har midler (11,12,13) til fastgørelse til stolperne (14,14', 18).

10 2. Skærmindretning ifølge krav 1,kendetegnet ved, at den første bueformede del (2) Mger en kurve, som har en imellem enderne værende tangent, som i brugsstillin-gen er lodret placeret.

3. Skærmindretning ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at skærmens (1, Γ) første bueformede del (2) udgør en del af en, set i tværgående snit, i det væsentlige S-for- 15 met form, idet den anden endedel (9) går over i en anden bueformet del (4), hvis hulhed er indrettet til at vende ind imod planterne.

4. Skærmindretning ifølge krav 1,2 eller 3, kendetegnet ved, at skærmen (1, Γ) imellem den første og den anden endedel (5, 9) af den første bueformede del (2), set i langsgående snit, er bølgeformet 20 5. Skærmindretning ifølge krav 1,2,3 eller 4, kendetegnet ved, at skærmens (1, Γ) første endedel (5) er tildannet med en form svarende til formen af den eller de kantsten (6) eller anden afgrænsning, som den skal ligge an imod.

8 DK 175830 B1 6. Skærmindretning ifølge krav 1,2,3,4 eller 5, kendetegnet ved, at skærmen (1, Γ), set i langsgående snit, er bueformet.

7. Skærmindretning ifølge krav 1,2,3,4, 5 eller 6, kendetegnet ved, at stolperne (14, 14’, 18) har form af store søm med hoved (15), skaft (16) og spids (17) eller store 5 klamper (18) med ben og spidser, og at skærmen (1,1') har et antal sæt af hver tre huller (11,12 og 13), hvor hvert sæt af huller (11,12 og 13) er indrettet til i brugsstillingen at ligge på linie med hinanden med henblik på optagelse af en stolpe.

8. Skærmindretning ifølge krav 7, kendetegnet ved, at skærmen (1, Γ) er tildannet af et elastisk eftergiveligt materiale.

10 DK 175830 B1 10; &1 4-—^ -16 (9 \ \^—12 2—''"li ___r3 7 6-—j j

I I i I I I I I

- , I

I I ! I

Fig. 1 i i y VM7 DK 175830 B1 \ C11 l i; i ful i

i-O—I

I I

Fig. 6 DK 175831B1 Batch : N0507412

Date : 15/03/2005 /Ό f ^

Number of pages /64 J \£) Previous document : DK 17583OBI

Next document : DK 175832B1 (19) DANMARK ου DK 175831 B1 ds>

I® ug PATENTSKRIFT

'«•dj/

Patent- og

Varemærkestyrelsen (51) Int.CI7.: C 12 N 15/31 A 61 K 39/00 C 07 K 14/22 (21) Patentansøgning nr: PA 1990 01284 (22) Indleveringsdag: 1990-05-23 (24) Løbedag: 1988-11-23 (41) Aim. tilgængelig: 1990-07-06 (45) Patentets meddelelse bkg, den: 2005-03-14 (86) International ansøgning nr: PCT/US88/04225 (86) International indleveringsdag: 1988-11-23 (85) Videreførelsesdag: 1990-05-23 (30) Prioritet: 1987-11-24 US 124727 1988-09-09 US 242758

(73) Patenthaver: The University of North Carolina, Chapel Hill, NC 27514, USA

(72) Opfinder: Nicholas H. Carbonetti, 1102A East Franklin Street, Chapel Hill, NC 27514, USA Frederich P. Sparling, 303 Weaver Road, Chapel Hill, NC 27514, USA

(74) Fuldmægtig: Budde, Schou & Ostenfeld A/S, Vester Søgade 10,1601 København V, Danmark (54) Benævnelse: Neisseria gonorrhoeae-relaterede nucleinsyrer, rekombinantvektorer, værtsorgaismer, encellede organismer, polypeptidfremstillingsmetoder, polypeptidsammensætninger, vaccinepræparater, DNA-sonder, påvisningsmetoder og diagnostiske prøvesæt, samt Neisseria gonorrhoeae-stamme (56) Fremdragne publikationer:

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, bind 80 (1983), side 31-5 Proc. Natl. Acad. Sci.USA, bind 84 (1987), side 9084-8 Journal of Infectious Diseases bind 150(1984) side 44-8 Infection and Immunity bind36 (1982) side 1050-1 Infection and Immunity bind36 (1982) side 277-83 Proc. Natl. Acad. Sci.USA, bind 78 (1981), side 6613-7 Infection and Immunity bind 55(1987), side 253-7 1 " (57) Sammendrag: • Den foreliggende opfindelse angår en gensekvens, som koder for protein I i Neisseria gonorrhoeae, og en kloningsvektor og værtsorganismer indeholdende denne. Der beskrives ligeledes oligonucleotider, som er anvendelige som diagnostiske sonder til påvisning af infektion af N. gonorrhoeae.

fortsættes DK 175831 B1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 )tein Asp - Val - Thr -Leu - Tyr - GIy-Ala -Ile -Lys-Ala- Gly - Val WA 5’ GAU GUU ACU CUU UAU GGU GCU AUU AAA GCU GGU GU 3'

C C CUCCCCCGCC A A A AAA A A

G G G G G 6 6 oligo NCI--3* CGG TAG TTT CGG CCG CA 5' 5' GAT 67T ACC CIG TAT GG 3'—-oligo (s) NC2

C C C

A G

FIG.l » DK 175831 B1 i

Den foreliggende opfindelsen angår Neisseria gonor-rhoeae-relaterede nucleinsyrer, rekombinantvektorer, værtsorganismer, encellede organismer, polypeptidfremstillings-metoder, polypeptidsammensætninger, vaccinepræparater, DNA-5 sonder, påvisningsmetoder og diagnostiske prøvesæt, samt en Neisseria gonorrhoeae-stamme.

1. INTRODUKTION

Gonorre er for øjeblikket en af de mest udbredte, 10 veneriske sygdomme verden over, idet der alene i USA optræder flere millioner tilfælde hvert'år. Årsagen til sygdommen er gonococcen Neisseria gonorrhoeae, en bakterie, som gennem hele sin historie har udviklet resistens både mod traditionel antibiotikumbehandling og i en vis udstrækning imod den 15 baktericide aktivitet af normalt humant serum. Den øjeblikkelige mangel på evne til at kontrollere infektionen ad traditionel vej har gjort udviklingen af en vaccine, som effektivt kan forhindre infektionen, af den yderste vigtighed. Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en DNA-20 -sekvens, som koder for et specifikt protein i ydermembranen i N. gonorrhoeae, og det klonede produkt af denne specielle DNA-sekvens tilvejebringer en egnet basis for en sådan vaccine. Den foreliggende opfindelse tilvejebringer ligeledes artsspecifikke oligonucleotidsekvenser, som kan anvendes 25 som diagnostiske sonder til påvisningen af gonorreinfektion.

2. OPFINDELSENS BAGGRUND

2.1. Vacciner.

Frembringelsen af en beskyttende immunreaktion mod et 30 givet smitstof hos hvirveldyr afhænger indledningsvis af tilvejebringelsen af den hensigtsmæssige stimulans af værtens immunsystem. Selve den smitsomme organisme tilvejebringer typisk talrige stimulerende forbindelser, eller antigener, på grund af selve naturen af dens cellemembransammensætning 35 eller på grund af de stofskifteprodukter, som den frigiver i værtens legeme. Disse stoffer, sædvanligvis større mole- 2 DK 175831 B1 kyler, såsom proteiner, lipopolysaccharider eller glycopro-teiner, erkendes af immunsystemet som fremmede og provokerer én eller flere forskellige typer af reaktion fra værten i et forsøg på at fjerne eller inaktivere den invaderende 5 organisme. Antigenet kan forårsage produktion af sensibiliserede lymphocyter (T-celler), som tilvejebringer en cellemedieret immunitet. Alternativt kan et antigen stimulere syntesen og frigivelsen af frit antistof i blodet og andre legemsvæsker (humoral immunitet). Udviklingen af legemets 10 beskyttende immunreaktion afhænger af, at der opnås et tærskelniveau for stimulering af det ene eller begge disse systemer .

En midlertidig immunitet imod infektion kan i mange tilfælde tilvejebringes, ved at et individ får indgivet i 15 forvejen dannede antistoffer fra et andet individ af samme eller en anden art. Dette er kendt som passiv immunitet. Et eksempel på en sådan immunitet er den beskyttelse, som et foster og en nyfødt får ved placentaoverføring af antistoffer fra moderen samt overføring af antistoffer gennem moder-20 mælken. Et andet eksempel er det forenede τ-globulin fra voksne, som ofte anvendes til forhindring eller modifikation af virkningerne af udsættelse for mæslinger, skoldkopper, hepatitis, kopper og tetanus. Disse erhvervede antistoffer udnyttes imidlertid gradvis ved vekselvirkning med antigenet 25 eller katabolisers af legemet, og derfor går denne beskyttelse til sidst tabt.

En mere permanent form for beskyttelse tilvejebringes ved aktiv immunisering. Vaccination giver en aktiv, beskyttende immunitet ved anvendelse af en uskadelig eller ikke-30 -virulent form af antigenet (f.eks. en dræbt eller genetisk ændret bakterie eller et isoleret glycoprotein fra cellevæggen) som en primær stimulans af immunsystemet. Dette fremkalder en temmelig langsom reaktion i antistofproduktion, som når et maksimum og synker. Legemet er imidlertid blevet 35 alarmeret om antigenets eksistens, og næste gang udsættelsen sker, formodentlig med den levende, virulente organisme, » 3 DK 175831 B1 iagttages der en sekundær reaktion med en langt hurtigere og rigelig produktion af antistoffer. Denne sekundære reaktion vil typisk være tilstrækkelig til at forhindre mikroorganismen i at etablere sig i tilstrækkelig grad til at 5 være i stand til at bevirke en fuldt udviklet infektion.

En vaccine kan antage ‘ en mangfoldighed af former, hvoraf nogle er mere effektive end andre til bibringelse af den ønskede beskyttel sesvirkning. Historisk er mange vacciner blevet fremstillet ved at dræbe eller inaktivere den mikro-10 organisme, som forårsager den sygdom, som har interesse, og anvende de dræbte celler som det aktive, immunogene middel. Vacciner af denne type er blevet anvendt imod tyfus, cholera og poliomyelitis (Salk-vaccine). Problemet med denne type vaccine er, at den behandling, som er nødvendig til udryd-15 delse af mikroorganismerne, såsom formaldehyd, hyppigt kan ændre eller ødelægge mikroorganismens værdifulde antigener, og derfor kan der opnås dårlig eller ufuldstændig immunitet.

En alternativ form for vaccine er den, som anvender svækkede mikroorganismer. En svækket mikroorganisme er en, 20 som stadig er i live, og som er i stand til at formere sig i legemet efter indgivelse, men som enten er blevet modificeret på en eller anden måde, således at den er blevet avirulent, eller det er en stamme, som er virulent i andre mikroorganismer, men avirulent hos mennesker. Den fordel, som 25 opnås ved anvendelse af en svækket organisme, er, at svækkelsen sædvanligvis ikke påvirker dens antigenicitet, hvorved der tilvejebringes en mere effektiv stimulans af immunsystemet. Svækkede vacciner mod mæslinger, røde hunde og poliomyelitis (Sabin-vaccine) har opnået vidtstrakt anvendelse.

30 Svækkelse opnås typisk ved at ændre mikroorganismens vækstbetingelser eller i den senere tid ved genetisk modifikation af organismens virulens. Selvom de i almindelighed er mere effektive end dræbte vacciner, er der imidlertid en fare involveret i den mulighed, at de levende organismer vender 35 tilbage til virulens, hvorved de forårsager sygdomssymptomer.

På grund af de problemer, som er forbundet med vac- i DK 175831 B1 | 4 i ! ; ciner med hele organismer, er det i de senere år blevet mere gængs praksis at anvende individuelle beskyttelsesantigener som det aktive middel i vaccinepræparater. Selvom isolering og identifikation af de specielle antigener i en organisme, 5 som faktisk stimulerer en beskyttelsesreaktion, ikke altid er simpel, tilvejebringer denne metode, når først identifikationen har fundet sted, et effektivt alternativ til vacciner med hele organismen uden de ledsagende ulemper.

Eksempler på antigentyper, som typisk kan anvendes 10 til dette formål, er rensede celle- eller capsidkomponenter, såsom bakterietoxiner (som skal være detoxificeret til opnåelse af et toxoid) , bakterie- eller virustoxinunderehheder, cellevægspolysaccharider eller capsidglycoproteiner. Disse komponenter er ofte yderst effektive til frembringelse af 15 immunitet, men der opstår vanskeligheder ved rensningen i praksis. Det er kritisk, at det antigen, som har interesse, er isoleret mere eller mindre fuldstændigt fra udefra kommende cellematerialer, hvis tilstedeværelse hyppigt kan bevirke en uheldig, immunologisk eller metabolisk reaktion 20 sideløbende med den ønskede, immunitetsfrembringende reaktion. De nødvendige rensningsprocesser er hyppigt komplekse, langstrakte og overdrevent kostbare, og resultaterne er ikke altid fuldstændigt forudsigelige. Dette problem kan i visse tilfælde undgås ved syntetisk fremstillelse af små 25 peptidsekvenser, som svarer til epitoper på et mikroorganismeantigen. Der er under visse omstændigheder ulemper ved denne teknik, idet konformat ionen, selvom aminosyresekvensen svarer til sekvensen i den naturlige epitop, kan være for lidt mage til den i stamantigenet til at fremkalde den hen-30 sigtsmæssige immunreaktion.

Mange af de ulemper, som knytter sig til de ovenfor omtalte vaccinetyper, kan undgås ved anvendelse af rekom-binant-DNA-teknologi. Muligheden for kloning af gener, som koder for hele et vigtigt mikroorganismeantigen eller en 35 del deraf, tilvejebringer en relativt økonomisk og bekvem kilde til større mængder af det nødvendige, immunogene mate- DK 175831 B1 ! 5 ' riale, praktisk taget frit for forurenende, proteinholdigt eller genetisk materiale. Kort fortalt indebærer denne metode til fremstilling af rensede antigener indsættelsen af den l specifikke DNA-sekvens, som koder for antigenet, i en DNA- i ' 5 -vektor til dannelse af et rekombinant-DNA-molekyle, som kan replikeres af en værtscelle. Der findes nu en overflod af metoder, ved hvilke rekombinant-DNA-molekyler kan fremstilles. En af de bedre kendte teknikformer er den, som er beskrevet i US'patentskrift nr. 4.237.224, hvortil der her 10 skal henvises. Ved denne metode fremstilles rekombinantplas-mider ved anvendelse af restriktionsenzymer og ligation, hvorefter de resulterende plasmider anbringes i en encellet værtscelle, som derved transformeres og begynder på replika-tion af den fremmede DNA. En anden metode, som anvender 15 bakteriophagvektorer, er beskrevet i US patentskrift nr. 4.304.863, hvortil der også skal henvises. Kloningsmetoden tilvejebringer det største potentiale til at gøre hensigtsmæssige, økonomiske kilder til vaccinefremstilling let tilgængelige, men den er imidlertid ikke uden vanskeligheder, 2 0 da det rigtige gen for et antigen, som vides at være im-munogent, først skal isoleres og sekvenseres, indsættes i et plasmid på en sådan måde, at rigtig replikation, trans-kription og translation sikres, hvorefter det skal indsættes i en forenelig værtscelle.

25 Potentialet for, at ekspressionen af det ønskede genprodukt svigter, er umådeligt, hvis en vilkårlig af trans-kriptionen af genet, translationen af RNA eller den efter-translationelle behandling og kompartmentalisation af poly-peptidet ikke udføres korrekt. For at en klonet indsættelse 30 kan transkriberes, er det nødvendigt, at der er en promotor til stede, som værtens RNA-polymerase kan erkende. Rigtig translation kræver, at RNA har et ribosombindingssted. Post- 1 translationel modifikation af proteiner indebærer ofte fra- spaltning af en signalsekvens, som fungerer til at dirigere 35 proteinet ud gennem cellemembranen. Sønderdeling af det fremmede protein, som værtsmikroorganismen producerer, kan 6 DK 175831 B1 også ske, hvis konfigurationen eller aminosyresekvensen ikke beskytter dem mod indvirkningen af værtens intracel-lulære protéaser. Selv om denne teknik må tænkes at være den ideelle måde til i den sidste ende at konstruere en Neis-5 seria-vaccine, har den derfor ikke tidligere været anvendt til vaccinefremstilling imod gonorre.

2.2. Gonococantiaener.

Nogle antigener i Neisseria gonorrhoeae er blevet 10 ekstensivt studeret og klassificeret. F.eks. har gonocochår vist sig at være antigene (Buchanan et al., J. Clin. Invest.

52, 2896-2909, 1973), idet de primært består af en protein-underenhed med en molekylvægt på ca. 20.000. En syntetisk form af dette materiale er blevet formuleret til et vac-15 cinepræparat (Schoolnik et al., Prog. Allergy 33, 314-331, 1983) . Lipopolysaccharidet i N. gonorrhoeae er også antigent, idet de β-1,4-bundne galactose-glucose-rester er hoveddeter- : minanten. Den største koncentration af studium på dette ! område i de senere år har imidlertid sandsynligvis været ; 20 fokuseret på proteinerne i den ydre membran, et kompleks af i proteiner, hvis rolle i immunogenicitet endnu ikke forstås fuldstændigt. Sammensætningen af proteinet i den ydre membran vides at variere noget fra stamme til stamme, og på denne base er der blevet identificeret mindst seksten forskellige 25 serotyper (Johnston et al., J. Exp. Med. 143, 741-758, 1976).

En række vaccinepræparater, som anvender dele af gonococ-membranen, er tidligere blevet beskrevet, f.eks. i US patentskrifterne nr. 4.203.971, 4.288.557 og 4.681.761. De fleste af disse præparater indeholder imidlertid en blanding af 30 protein og andet materiale, og de kræver alle temmelig arbejdskrævende rensningsprocesser til isolering og adskillelse af de aktive komponenter fra bakteriecellen. Derfor kan disse vacciner eventuelt ikke have den ønskede immunospecifi-citet, og de kræver ligeledes en umådelig mængde mikroor-35 ganismekildemateriale til fremstilling af kommercielle mængder af produktet.

7 DK 175831 B1 2.2.1. Gonococprotein I.

Som en mulig kandidat som basis for et vaccinepræparat er der også blevet foreslået det specifikke protein i den ydre membran, som er kendt som protein I, eller PI. PI er 5 hovedproteinet i den ydre membran hos N. gonorrhoeae, idet det fungerer som et porin (Douglas et al., FEMS Microbiology Letters 12, 305-309, 1981), et protein, som antages at virke i cellen ved at kanalisere stoffer med lav molekylvægt igennem den hydrofobe, ydre lipidmembran. Der er en række fak-10 torer, som gør PI til et interessant fokus for opmærksomhed:

For det første er det i det mindste delvis ansvarligt for serotypespecificiteten i Neisseria, og der er et relativt lille antal antigenserotyper af protein I. Ligeledes har en række gonococcer, som har specielle PI-serotyper, været 15 forbundet med komplicerede gonococinfektioner. Endvidere ser det ud til at være overfladeblottet i sin native tilstand, og det ser også ud til at stimulere produktionen af opsoniner (Sarafian et al., J. Infect. Dis. 148, 1025-1032, 1983). Opsoniner er antistoffer, som binder til overfladen 20 af en smitsom organisme, hvilket gør det lettere for phago-cyter at opsluge organismen. Dets immunogenpotentiale er allerede blevet påvist i vaccinerede mus (Jiskoot et al.. Infect. Immun. 54, 333-338, 1986).

To forskellige hovedtyper af PI-molekyler er blevet 25 påvist i gonococcer, PIA og PIB (Barrera et al., Infect. Immun. 44, 565-568, 1984), baseret på peptidkortlægning og følsomhed for proteolyse (Blake et al., Infect. Immun. 33, 212-222, 1981) . Denne opdeling har vist sig at korrelere med serogruppemønstre (Sandstrum et al.. Infect. Immun. 35, 30 229-239, 1982; Sandstrum et al., Infect. Immun. 38, 462- -470, 1982) og pathogenese. Gonococcer, som eksprimerer protein IA, er forbundet med systemiske infektioner, medens dem med protein IB er forbundet med lokal infektion (Buchanan et al., Infect. Immun. 32, 985-994, 1981; Hildebrandt et 35 al., Infect. Immun. 20, 267-273, 1978).

Til trods for al den opmærksomhed, som er blevet 8 DK 175831 B1 ofret på udvikling af PI som en potentiel vaccinekandidat, er der indtil nu ikke blevet fremstillet en effektiv vaccine baseret på PI. Endvidere har der ikke indtil nu været nogen belysning af den gensekvens, som kontrollerer dets produk-5 tion, og der vides kun lidt om proteinets struktur. Den foreliggende opfindelse tilvejebringer den første beskrivelse af en fuld PI-gensekvens, sekvensen for PIA-strukturgenet, samt et klonet genprodukt. Der er ligeledes beskrevet en hidtil ukendt PIB-gensekvens samt særegne PIA-PIB-chimere 10 afledt fra disse sekvenser. Sidstnævnte chimere er værdifulde ved epitopkortlægning, ligesom de er en basis for vaccineudvikling .

2.3. Diagnostiske sonder.

15 Et andet aspekt ved den vidt udbredte natur af denne sygdom er vigtigheden af tidlig påvisning og diagnose. Der er naturligvis bakteriologiske standardprøver til rådighed til diagnose af gonorre, men sådanne prøver beror på væksten af bakterier i kultur, hvilket kan være tidkrævende, og 20 som i almindelighed tillige er ret ikke-specifikke. Det er kendt, at Neisseria gonorrhoeae har forskellige serotyper, som kan angive meget forskellige mønstre for sygdommen, som omtalt i det foregående afsnit. Til gennemførelse af den hensigtsmæssige behandling for sygdommen, er det kritisk, 25 at diagnosen ikke alene er hurtig, men også så nøjagtig som mulig.

Udviklingen af DNA- og RNA-sondeteknologien har tilvejebragt en løsning på mange af disse problemer ved diagnose. En sonde er typisk en radiomærket, enkelt streng af 30 DNA eller RNA, som er komplementær til hele det specielle gen, som er af interesse, eller en del deraf, og den vil derfor, når den udsættes for en enkelt streng af den komplementære nucleinsyre, hybridisere til denne. Sonder anvendes ved en teknik, som er kendt som Southern pletdannelse, hvor 35 DNA-fragmenter fra en prøve, som er mistænkt for at indeholde det gen, som er af interesse, adskilles i agarosegeler, 9 DK 175831 B1 denatureres til frembringelse af enkelte strenge og derefter overføres til nitrocellulosefiltre. Her inkuberes til de mærkede, i forvejen udvalgte sonder, som vil hybridisere til en komplementær streng og derved identificere, ved hjælp 5 af sin mærkning, tilstedeværelsen af det ønskede gen. Sådanne sonder kan også værdifuldt anvendes ved identifikationen af en speciel klon, som indeholder et gen, som er af interesse, fra et genombibliotek etableret ved kloning af DNA-fragmentet af et helt genom i værtsceller.

10 Der er ikke tidligere blevet et hensigtsmæssigt og yderst nøjagtigt sondesystem udviklet i forbindelse med Neisseria gonorrhoeae. Den foreliggende opfindelse tilvejebringer imidlertid den første udvikling af adskillige oligo-nucleotidsonder for N. gonorrhoeae, hvoraf visse vil hybri-15 disere generelt til protein I i N. gonorrhoeae, men ikke til andre bakterier, og andre, som er specifikke for N. gonorrhoeae-serotyper, som kun eksprimerer PIA-antigenet.

Der er derfor tilvejebragt en pålidelig diagnostisk metode til påvisning af gonococininfektion samt identifikation af 20 den specielle kategori af serotype, med hvilken et individ kan være inficeret.

3. RESUMÉ AF OPFINDELSEN.

Den komplette nucleotidsekvens for proteinet IA og 25 for proteinet IB i Neisseria gonorrhoeae er beskrevet sammen med deres forudsagte aminosyresekvenser. Der er ligeledes beskrevet metoder og materialer til kloning og ekspression af PIA- og PIB-genet i en enkeltcellet værtsorganisme samt kloning og ekspression af chimere PIA-PIB-proteinprodukter.

30 Også metoder til dyrkelse af den hidtil ukendte værtsor- ; ganisme samt til fremstilling af genprodukterne er beskrevet. Produkterne fra de anvendte rekombinant-DNA-metoder er egnede til anvendelse som en helhed eller i antigendelen som im-munogener i vaccinepræparater til forhindring af gonorre.

35 PIA- og PIB-generne er blevet isoleret fra bakterie- genomet ved hybridisering af DNA-fragmenter med hidtil u- 10 DK 175831 B1 kendte oligonucleotidsonder. Når nucleotidsekvensen først er lokaliseret i et specifikt segment af DNA, bestemmes den, og aminosyresekvensen forudsiges. Derefter indsættes hvert enkelt gen i en plasmidkloningsvektor, som fungerer 5 som enheden til replikation af genet. Derefter anvendes rekombinantplasmidet til transformation af en forenelig værtscelle, hvorved genproduktet eksprimeres. Der er også her beskrevet metoder, som tillader isoleringen af de eks-primerede produkter og formuleringen af hvert enkelt til et 10 vaccinepræparat. Specielt er der også foreslået vaccine-præparater omfattende et hybrid-PIA/PlB-protein. Baseret på bestemmelsen af nucleotidsekvenser i PIA- og PIB-genet tilvej ebringer den foreliggende opfindelse ligeledes sekvensen i oligonucleotidsonder, som er anvendelige ved påvisningen 15 og diagnosen af gonococinfektion. I denne henseende omfatter opfindelsen tillige diagnostiske prøvesæt omfattende en eller flere af de her beskrevne oligonucleotidsonder.

4. BESKRIVELSE AF TEGNINGEN.

2 0 Fig. 1 viser aminosyresekvensen for resterne 1-12 i PI fra stammen R10, den kodende mRNA-sekvens, herunder de-generatbaser, og de syntetiserede oligonucleotider. Hvor der sker degenerering, er der udvalgt sekvenser baseret på codonanvendelsesdata fra andre, sekvenserede gonococgener.

25 Fig. 2 viser Sau3AI- og Taql-fragmenter af FA19-genom- -DNA, herunder dele af PI-genet. Fragmenterne er blevet klonet ind i vektorplasmidet pGEM-2, hvilket har resulteret i rekombinantplasmider med de her viste betegnelser. Den relative stilling af den Pi-kodende region på genomet er 30 vist ved den åbne kasse øverst (den skraverede kasse svarer til den N-terminale signalsekvens), og den relative stilling af oligonucleotidsonderne er vist under fragmenterne.

Fig. 3 viser DNA-sekvensen af PI-genet i FA19. Den forudsagte aminosyresekvens er vist over DNA-sekvenserne 35 (-35 og -10), og ribosombindingsstedet (RBS) er vist, og det samme gælder de Taql- og Sau3AI-steder og det HaelII- 11 DK 175831 B1 -sted, som er anvendt ved konstruktionen af pUNC7. Det sidste basetal for hver linie er vist til højre.

Fig. 4 viser hydropatimønstre for de ydre hovedrnem-branproteiner i N. gonorrhoeae, PI, PI I og PIII, samt E.

5 coli-porinerne OmpF og OmpC, sp = signalpeptid, a.a. = amino-syrerester.

Fig. 5 viser et skema over konstruktionen af pUNC7.

Et bekvemt Haelll-sted mellem regionerne -35 og -10 i PI--genpromotoren har tilladt fjernelsen af sekvensen fra region 10 -35 og imod strømmen efterfulgt af rekonstruktionen af PI- -genet under kontrol af phag-T7-promotoren på vektorplasmidet pGEM-2. Den tykke linie repræsenterer pGEM-2-DNA og den tynde linie FA19-DNA. PI’ = en del af Pi-genet (den brudte linie viser retningen for det manglende segment af genet), 15 Ρ·ρ7 = phag-T7-promoter, MCS = multipel kloningssted, restriktionsenzymsteder: S = Sau3AI, H = Haelll, B = BamHI, (H) = Haelll/HincIl-forbindelse (ikke et sted), T = Taql.

Fig. 6 viser ekspression af PI-genet på pUNC7 i BL21 (DE3). A. NaDodS04-polyacrylamid-gelelektrophorese af hel-20 cellelysater på en 15%'s gel, farvet med "Coomassie® blue". Mærkestofproteinstørrelserne er vist til venstre. PI er angivet, og pilen i midten angiver et protein, som tilsyneladende mangler i kolonne 4. B. Autoradiografi af en Western plet af gelen i A sonderet med 5 PIA MAbs. Kolonnerne er: 25 1. FA19; 2. BL21(DE3)pUNC7 dyrket 16 timer uden IPTG; 3.

BL21(DE3)pUNC7 dyrket 3 timer med IPTG; 4. BL21(DE3)pUNC7 dyrket 16 timer med IPTG; 5. BL21(DE3)pGEM-2 dyrket '16 timer uden IPTG; 6. BL21(DE3)pGEM-2 dyrket 16 timer med IPTG.

CAT

Fig. 7 viser indsættelse af mTn3-CAT ( ^ ) stødende 30 op til PI-strukturgenet i FA19. Den tykke linie repræsenterer DNA fra vektoren pHSS6. mTn3-CAT har en længde på 1,66 kb og er ikke tegnet i det rigtige målestoksforhold. Stillingen af Pi-genet på genomet i FA19-CAT-D1 er vist ved kassen over linien, idet den skraverede kasse betegner signalsek-35 vensen. PI1: Del af PI-genet til stede i de klonede konstruktioner. Restriktionsenzymsteder: N = NotI; B = BamHI, S = 12 DK 175831 B1

Sau3AI.

Fig. 8 viser fragmenter af MS11-DNA klonet til sekvensering af Pi-genet. Stillingen af Pi-genet er vist ved kassen over linien, og den skraverede kasse angiver signal-5 sekvensen. Placeringen af sekvenserne i oligonucleotiderne NC1 og NC12 er vist. Det større fragment er blevet klonet ind i vektorplasmidet pGEM-3, og det mindre fragment er klonet ind i Xgtll, til opnåelse af konstruktioner med de viste betegnelser. Restriktionsenzymsteder: Hf = HinfI; K = 10 Kpnl ; S = Sau3AI; He = Hindi.

Fig. 9 viser DNA-sekvensen i PI3-genet fra MS11. Den forudsagte aminosyresekvens er vist over DNA-sekvensen med signalpeptidet angivet. De formodede promotorsekvenser (-35 og -10) og ribosombindingsstedet (RBS) er vist, og det samme 15 gælder de relevante restriktionsenzymsteder. Det sidste basetal i hver linie er vist til højre. Til angivelse af forskelle fra PIB-sekvensen i R10 (Gotschlich et al., PNAS USA 94, '8135-8139, 1987) er baser (bortset fra dem, som omfatter et restriktionsenzymsted) understreget, og amino-20 syrer er vist i cirkel.

Fig. 10 viser en sammenligning af aminosyresekvenseme i FA19-PIA og MS11-PIB og strukturen af hybrid-PI-gener. PIA-gensekvensen er vist ved den lyse kasse og PIB ved den mørke kasse. Over og under Pi-generne findes sammenlignin-25 gerne af aminosyresekvens, idet en lodret linie svarer til en enkelt forskel, og en mørk blok svarer til en sammenhængende strækning med forskelle. Nummeret på aminosyreresterne er vist på skalaen ovenover og baseparnumrene på skalaen underneden. De til analyse af hybriderne anvendte oligo-30 nucleotider er vist mellem generne, idet den brudte linie angiver den ækvivalente stilling på det andet gen. Hybridgenstrukturerne (klasserne 1-9) er vist nedenunder, og regioner mellem oligonucleotidsekvenser, hvor der forekommer en overkrydsning, er vist ved de skrå placeringer. PI-serovaren 35 af de forskellige hybridklasser er vist i tabel I.

Fig. 11 viser ekspression af PIB-genet på pUNCH25 i 13 DK 175831 B1 BL2MDE3) som påvist ved SDS-polyacrylamidgelelektrophorese af helcellelysater på en 15%'s gel, farvet med "Coomassieå blue". PI-proteinbåndet er vist. Kolonnerne er: 1. MS11; 2. BL2MDE3) pUNCH25 dyrket uden PITG; 3-5. BL21 (DE3) pUNCH25 5 dyrket med IPTG. IPTG (50 μ9/π\1) sættes til den voksende kultur i følgende celletætheder: 3. 5 x 108 celler/ml, 4.

109 celler/ml, 5. 2 x 109 celler/ml. Ekspressionen af PI er størst, når kulturen induceres tidligt i vækstcyclusen.

10 5. BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN.

Den foreliggende opfindelse angår anvendelsen af PIA-, PIB- og chimere PIA/PIB-proteiner fra N. gonorrhoeae, som er anvendelige ved fremstillingen af et vaccinepræparat til forhindring af gonorreinfektion. Disse proteiner kan 15 fremstilles ved rekombinant-DNA-teknik eller kemisk synteseteknik. Selvom det tidligere har været muligt at anvende kemisk isoleringsteknik ud fra en hensigtsmæssig stamme af N. gonorrhoeae, kan dette sidste resultere i forurening med visse andre gonococproteiner, som fremkalder blokerende 20 (antibeskyttende) antistoffer efter vaccination. Da det er kendt, at PI-proteiner stimulerer produktionen af antistoffer, er det muligt at anvende hele proteinerne eller en vilkårlig, immunogen del deraf som immunogener, som effektivt vil beskytte modtageren mod infektion af N. gonorrhoeae.

25 De her beskrevne rekombinantplasmider muliggør produk tionen i en værtscelle af store mængder af PI-proteinerne, som er stabile og modstandsdygtige mod værtscellesønderdeling, hvorved der tilvejebringes en rigelig kilde af egnet materiale til vaccinepræparater. Dette præparat er 30 frit for forurening af andre, antibeskyttende gonococproteiner. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen diskuteres i det følgende i flere, individuelle trin, som kun har til formål at beskrive: 1) identifikation og isolering af PIA-genet eller -genfragmentet, 2) indsættelse af genet eller genfrag-35 mentet i en egnet kloningsgrundmasse, som anvendes til transformation af en forenelig værtscelle, 3) identifikation og 14 DK 175831 B1 vækst af de transformerede værtsceller, som replikerer og eksprimerer genet, og 4) identifikation og rensning af genproduktet. Ifølge opfindelsen kan PI-proteiner fremstilles ved indsættelse af den klonede sekvens vist i fig. 3 eller 5 fig. 9 eller hybrider deraf i en hensigtsmæssig klonings/-ekspressions-vektor, transformation af hensigtsmæssige værtsceller og identifikation og rensning af genproduktet. Alternativt kan dele af den afledte aminosyresekvens i fig. 3 eller fig. 9, eller hybrider, syntetiseres ved anvendelse 10 af kemisk synteseteknik, som er velkendt på området. Der er her også beskrevet oligonucleotider baseret på PIA- og PIB--sekvenserne, hvilke oligonucleotider kan anvendes ved identifikation og diagnose af infektion af N. gonorrhoeae ved hybridiseringsteknik, såsom Southern pletdannelse, prikplet-15 ter eller spaltepletter.

Den foreliggende opfindelse angår i enkeltheder følgende : 1. En renset nucleinsyre, som er karakteriseret ved, at den koder for protein IA eller koder for protein IB i 20 Neisseria gonorrhoeae eller en vilkårlig del, mutant eller rekombinant deraf, som koder for et polypeptid med en imrnuno-reaktiv og antigenisk determinant i protein IA eller i protein IB, fortrinsvis en sekvens som den, som er vist i henholdsvis fig. 3 eller i fig. 9.

25 2. En rekombinant vektor, som er karakteriseret ved, at den omfatter sekvensen defineret under pkt. 1.

3. En værtsorganisme, som er karakteriseret ved, at den indeholder sekvensen defineret under pkt. 1.

4. En encellet organisme, som er karakteriseret ved, 30 at den indeholder vektoren defineret under pkt. 2.

5. En fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid med en immunoreaktiv og antigenisk determinant fra Neisseria gonorrhoeae protein IA eller fra Neisseria gonorrhoeae protein IB, hvor polypeptidet er frit for andre Neisseria go- 35 norrhoeae-proteiner, som er karakteriseret ved, at man a) indfører en rekombinantvektor i en værtsorganisme.

15 DK 175831 B1 hvilken vektor omfatter en DNA-sekvens, som koder for et polypeptid med en immunoreaktiv 09 antigenisk determinant i protein IA eller i protein IB, og som kan replikeres, tran-skriberes og translateres i værten, 5 b) dyrker den encellede organisme indeholdende re- kombinantvektoren og c) isolerer polypeptidet fra kulturen.

6. En PI-Polypeptidsammensætning, som er karakteriseret ved, at den er fri for andre ikke-PI-Neisseria 10 gonorrhoeae-proteiner og er fremstillet ved fremgangsmåden defineret under pkt. 5.

7. En polypeptidsammensætning, som er karakteriseret ved, at den er fri for andre Neisseria gonorrhoeae-proteiner og er som vist i fig. 3 eller i fig. 9 eller er en 15 homolog, analog eller aktiv del deraf.

8. En renset nucleinsyre, som er karakteriseret ved, at den koder for et hybrid-PIA/PIB-protein i Neisseria gonor-rhoeae eller en vilkårlig del, mutant eller rekombinant deraf, som koder for et polypeptid med en immunoreaktiv og 20 antigenisk determinant i protein IA og protein IB.

9. En rekombinantvektor, som er karakteriseret ved, at den omfatter sekvensen defineret under pkt. 8.

10. En værtsorganisme, som er karakteriseret ved, at den indeholder sekvensen defineret under pkt. 8.

25 11. En encellet organisme, som er karakteriseret ved, at den indeholder vektoren defineret7under pkt. 9.

12. En polypeptidsammensætning, som er karakteriseret ved, at den omfatter mindst én immunoreaktiv og antigenisk determinant i både protein IA og protein IB og er fri for 30 andre Neisseria gonorrhoeae-proteiner.

13. Et vaccinepræparat til forhindring eller behandling af infektion af Neisseria gonorrhoeae, som er karakteriseret ved, at det omfatter en immunogenisk effektiv mængde af et polypeptid defineret under pkt. 6 eller 7 i 35 kombination med et farmaceutisk acceptabelt bærestof, hvor sammensætningen er fri for andre Neisseria gonorrhoeae-poly- 16 DK 175831 B1 peptider.

14. DNA-sonde, som kan anvendes til identifikation af Neisseria gonorrhoeae, og som er karakteriseret ved, at den omfatter en DNA-sekvens, som er komplementær til en del 1 5 af DNA-sekvensen i Neisseria gonorrhoeae, som koder for protein I, og som kan hybridisere dermed.

15. Fremgangsmåde til påvisning af Neisseria gonorrhoeae i en prøve, som er mistænkt for at indeholde denne, som er karakteriseret ved, at man 10 a) bringer en sonde, som er komplementær til en del af DNA-genomet i Neisseria gonorrhoeae, som koder for protein I, i kontakt med prøven under betingelser, som fremmer dannelsen af DNA-DNA-hybrider, og b) påviser eventuelt dannede hybrider, hvorved tills stedeværelsen af Neisseria gonorrhoeae i prøven påvises.

16. Et diagnostisk prøvesæt, som er karakteriseret ved, at det omfatter mindst én sonde som defineret under pkt. 14 .

17. En stamme af Neisseria gonorrhoeae, som er karak-20 teriseret ved, at den har identifikationskarakteristika som ATCC 53808.

5.1. Identifikation, isolering og sekvens af PIA-qenet.

25 Nucleotidkodesekvensen for PlA-proteinet er vist i fig. 3. Som ovenfor nævnt produceres PlA-proteinet ikke af alle typer N. gonorrhoeae, idet en given stamme vil producere enten PIA eller PIB, men ikke dem begge. Tilstedeværelsen af PIA er korreleret med gonococserogruppe I, serotype 1-3, 30 og derfor kan en vilkårlig af de stammer, som er associeret med serotyperne 1-3, anvendes som kilde for PIA-DNA. Blandt de kendte stammer af N. gonorrhoeae, som er karakteriseret ved PIA, er FA19, FA130, W-Ue, B-2, G-7, 5029, R-ll, E-5, D-4 og V-15 (Knapp et al., J. Inf. Dis. 150, 44-48, 1984).

35 Ved udøvelse af opfindelsen kan den i fig. 3 viste sekvens fås på flere måder. F.eks. er det, når først en egnet, PIA- 17 DK 175831 B1 -holdig stamme er påvist, nødvendigt at isolere organismens DNA, frembringe DNA-fragmenter og identificere de fragmenter, som indeholder PIA-gensekvensen. Alternativt kan genet eller segmenter af genet syntetiseres.

5 DNA fra N. gonorrhoeae kan fragmenteres på en række forskellige måder. Den mest foretrukne metode er ved behandling med restriktionsenzymer, som hver især spalter DNA ved en specifik sekvens. Andre metoder omfatter behandling af DNA med DNase i nærværelse af magnesium eller fysisk itu-10 brydning, såsom ved sonikering. Når der anvendes restriktionsenzymer, kan der anvendes ét enzym eller en kombination af enzymer til behandling af DNA. Det eneste krav er, at digereringen af nucleinsyren ikke ødelægger den region, som koder for antigenstedet eller -stederne i PIA. Efter frag-15 mentering adskilles de individuelle fragmenter af lineær DNA dernæst efter størrelse ved en vilkårlig af en række kendte teknikformer, såsom polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE), agarosegeler eller kolonnechromatografi. Isolerede fragmenter tilvejebringer det genetiske materiale til plas-20 midfremstilling og transformation.

Identifikation af de DNA-fragmenter, som indeholder den gensekvens, som er af interesse, kan opnås på en række måder. F.eks. kan der anvendes immunologiske reagenser, såsom monoklonale antistoffer. En række monoklonale anti-25 stoffer mod PIA er blevet frembragt (Tam et al., Infect. Immuno. 36, 1042-1053, 1982), og disse kan anvendes til afprøvning af de produkter, som er produceret af hver enkelt af de værtsceller, som er transformeret med de forskellige DNA-fragmenter. Et produkt, som reagerer med det monoklonale 30 PIA-antistof, identificerer den celle, som er blevet transformeret med fragmentet indeholdende Pi-genet. Alternativt tillader sekvensering af DNA-fragmenterne forudsigelsen af en aminosyresekvens i hver, og sammenligninger kan derefter foretages med alle kendte, partielle aminosyresekvenser til 35 identifikation af det fragment, som indeholder den tilsvarende DNA-sekvens. En anden populær teknik er Southern plet- 18 DK 175831 B1 dannelse {Southern, J. Mol. Bio. 78, 503, 1975). Ved denne metode denatureres restriktionsfragmenterne i stilling på en gel og overføres til et fast substrat, typisk et nitrocellulosefilter, ved pletdannelse. Derefter udsættes filteret 5 for radiomærkede oligonucleotider indeholdende en kendt eller formodet, delvis DNA-sekvens for proteinet. De DNA--pletter, som er komplementære til det udvalgte nucleotid, vil hybridisere dertil, hvorved størrelsen af det DNA-fragment , som indeholder PI-genet, identificeres.

10 I de detaljerede eksempler i det følgende er det gen,, som koder for PIA, blevet identificeret og isoleret ved hybridisering med to hidtil ukendte oligonucleotider. Baseret på den kendte sekvens (Blake et al., Infect. Immun.

36, 277-285, 1982; Blake i The Pathogenic Neisseria, G.

15 Schoolnik, ed., 251-258, 1985, Amer. Soc. Microbiol., Wash.) af en lille del af de N-terminale aminosyrer i PIB og codon-anvendelsesregler, som er impliceret i forskellige andre gonococproteiner med kendte DNA-sekvenser, er der blevet gjort et forsøg på at udlede anvendelige oligonucleotider.

20 Specielt er der blevet konstrueret to sekvenser, betegnet NCi og NC2, som følger: NCI: 5' AC GCC GGC TTT GAT GGC 3' 25 NC2: 5' GAT GTT ACC CTG TAT GG 3'

C C C

A G

30 Anvendt ved en Southern plethybridisering er oven stående oligomere blevet anvendt til screening af DNA-res-triktionsfragmenter opnået fra gonococgenomet, og begge sonder har været resultatrige til identifikation af DNA-- fragmenter indeholdende PIA-genet. Verifikation af det 35 identificerede gen som PIA-genet er foretaget ved sammenligning af genproduktets molekylvægt med den i det native 9 19 DK 175831 B1 protein og ved dets immunoreaktivitet med PIA-specifikke, monoklonale antistoffer. Ud over denne anvendelighed er det imidlertid også blevet påvist, at hvert enkelt af disse oligonucleotider har evnen til hybridisering med både PIA-5 og PIB-stammer af gonococcer. Disse normale forbindelser kan derfor også anvendes som diagnostiske sonder ved en Southern plethybridisering til påvisningen og identifikationen af infektion af N. gonorrhoeae i angrebne individer.

Identifikation af de fragmenter, som indeholder PI-10 -genet, efterfølges af sekvensering af den relevante del ifølge Sanger-metoden (Sanger et al., PNAS USA 74, 5463- 5467, 1977). Sanger-metoden anvender enzymatisk syntese af en komplementær streng af DNA ud fra et DNA-templat. Syntesen af den komplementære streng afsluttes af inkorporeringen af 15 et dideoxynucleotid (ddNTP). Der gennemføres fire separate omsætninger, som hver indeholder ddATP, ddCTP, ddGTP eller ddTTP, således at der frembringes fire sæt DNA-fragmenter, og hver enkelt i et givet sæt vil ende med det specifikke dideoxynucleotid. DNA-fragmenterne adskilles derefter på en 20 polyacrylamidgel, og sekvensen bestemmes ved viden om identiteten af det sidste nucleotid i hvert fragment og aflæsning fra det korteste til det længste fragment.

De enkeltstrengede DNA-former, som anvendes som tem-plater, kan tilvejebringes ved kemiske behandlinger af dob-25 beltstrenget DNA med exonucleaser. Det er imidlertid effektivt at anvende M13mp-kloningsvektorerne som udviklet af Messing et al. (Nucleic Acids Res. 9, 309, 1981) som klo ningsvektor. M13 er en han-specifik, filamentøs bakteriophag fra E. coli, som indeholder en enkeltstrenget (+) DNA. (+)-30 -strengen anvendes som templat til syntesen af den komplementære (-)-streng. Den dobbelt strengede form af DNA er replika-tionsformen, eller RF, som forstærkes til ca. 200 kopier pr. celle. Denne dobbeltstrengede form kan isoleres fra celler og anvendes som kloningsvektor. Når først forstærk-35 ningen standser, fortsætter kun en af de to strenge med at blive produceret, og en enkelt streng inkorporeres i phag- 20 DK 175831 B1 partiklerne. Heri ligger fordelen ved M13, nemlig at partiklerne har en enkelt streng af DNA, som er homolog til en af de klonede strenge, og som derfor kan anvendes som templatet ved Sanger-metoden. Op til 350 baser kan sekvenseres ud fra 5 en enkelt klon, og sekvensering af længere fragmenter kan opnås ved sekvensering af overlappende fragmenter.

Anvendelse af ovenstående teknik har tilvejebragt den nucleotidsekvens i PIA-genet, som er vist i fig. 3. 1 fig. 3 er ligeledes tilvejebragt den forudsagte aminosyre-10 sekvens.

Sekvenseringen af PIA-genet, som er opnået ved separat sekvensering af overlappende fragmenter, har også tilladt identifikationen og fremstillingen af to andre oligonucleo-tidsonder. Begge sonder er oligomere på 17 nucleotider med 15 følgende sekvenser.

NC8: 5' GCGTTAAAACCGCTACC 31 NC11: 5’ CGGTGTCGGTCTGCGCC 3’ 20

Disse sonder er begge specifikke for PIA-gener alene, og de hybridiserer ikke med PIB-DNA-sekvenser. Derfor kan hver enkelt af disse sonder anvendes ved diagnostisk afprøvning til differentiering mellem infektioner med PIA-organis-25 mer og PIB-organismer. Som ovenfor nævnt er hvert af disse proteiner indikativt for et specifikt mønster af gonorreinfektion, enten systemisk eller lokal, og de kan derfor være yderst vigtige ved planlægning af et behandlingsprogram for det angrebne individ.

30 Det isolerede gen, eller en kemisk syntetiseret DNA- -sekvens, kan anvendes til frembringelse af yderligere kopier af genet ved vækst af transformerede værtscelleorganismer, isolering af rekombinant-DNA fra de transformerede celler og udvinding af det indsatte gen ud fra den isolerede rekom-35 binant-DNA.

21 DK 175831 B1 5.2. Identifikation, isolering og sekvens af PIB--qenet.

En nucleotidsekvens for et PIB-protein er vist i fig. 9. Den viste sekvens er isoleret fra N. gonorrhoeae, 5 stamme MS11. Tilstedeværelsen af PIB er korreleret med sero-grupperne 4-9, og enhver stamme, som er associeret med disse serogrupper, kan anvendes som en kilde til PIB-DNA. Blandt disse kendte gonorrestammer, som er karakteriseret ved tilstedeværelsen af PIB, er MS11, FA6140, F62 og RIO. Teknikken 10 til fremstilling, identifikation og sekvensering af PIB- -proteinet er praktisk taget identiske med dem, som er anvendt for PIA-proteinet som beskrevet ovenfor i afsnit 5.1.

Den specifikke identifikation af PIB-genet fremhjælpes ved anvendelsen af NC1- og NC12-sonderne (51-GATACGGCGAAGGCACT-15 -3') og identifikation af et Kpnl-restriktionssted i PIB- -delen af et hybrid-PI-protein {Danielsson et al., Infect. Immun. 52, 529-533, 1986). Kloning af genet opnås, ligesom for PIA, ved separat kloning af overlappende sekvenser i en kloningsvektor.

20 5.3. Produktion af PIA-. PIB- eller PIA/B-hvbrider ved rekombinant-DNA-teknik.

Nucleotidkodesekvensen for PIA er vist i fig. 3. Nucleot idkodesekvensen for PIB er vist i fig. 9. Ved udøvelse 25 af fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan enten nucleotid-sekvensen, eller dens funktionelle ækvivalent, indbygges i rekombinantmolekyler, som vil dirigere ekspresionen af hhv.

PIA- eller PIB-produktet. Hybridsekvenser afledt ud fra både fig. 3 og fig. 9 kan også konstrueres til fremstillingen 30 af hybrid-PIA/B-proteiner.

På grund af degenerationen af nucleot i dkodesekvenseme kan andre DNA-sekvenser, som koder praktisk taget samme aminosyresekvenser som vist i fig. 3 eller fig. 9, anvendes ved udøvelse af den foreliggende opfindelse til kloning og 35 ekspression af henholdsvis PIA eller PIB. Sådanne ændringer af nucleotidsekvensen i fig, 3 eller fig. 9 omfatter ude- 22 DK 175831 B1 ladeiser, tilføjelser eller ombytninger af forskellige nu-cleotidrester, hvilket resulterer i en sekvens, som koder samme eller et funktionelt ækvivalent genprodukt. Genproduktet kan indeholde udeladelser, tilføjelser eller ombytninger 5 af aminosyrerester. Ombytninger kan foretages på basis af ligheder i polaritet, ladning, opløselighed, hydrofobicitet, hydrofilicitet og/eller den amphipatiske natur af de involverede rester. F.eks. omfatter negativt ladede aminosyrer asparaginsyre og glutaminsyre, positivt ladede aminosyrer 10 omfatter lysin og arginin, og aminosyrer med uladede, polære hovedgrupper eller ikke-polære hovedgrupper med tilsvarende hydrofilicitetstal omfatter leucin, isoleucin og valin; glycin og alanin; asparagin og glutamin; serin og threonin samt phenylalanin og tyrosin.

15 5.3.1. Fremstilling af en PI-gen-kloninas/ekspres-sions-vektor.

Den i fig. 3 viste PIA-gensekvens eller den i fig. 9 viste PIB-sekvens samt hybrid-PIA/B-sekvenser, eller funk-20 tionelle ækvivalenter dertil, kan indsættes i en egnet kloningsekspressionsvektor.

For i den sidste ende af opnå transkription og translation af det indsatte gen, skal genet anbringes under kontrol af en promotor, som er forenelig med den valgte værts-25 celle. En promotor er en region i DNA, ved hvilken RNA-poly-merase tilknyttes og initierer transkription. Den udvalgte promotor kan være en vilkårlig, som er blevet isoleret fra værtscelleorganismen. F.eks. har E. coli, et almindeligt anvendt værtssystem, talrige promotorer, såsom lac- eller 3 0 recA-promotoren, associeret med sig selv, sine bakteriophager eller sine plasmider. Ligeledes kan syntetiske eller rekom-binantfremstillede promotorer, såsom k-pLag-P^- og -Pj^-pro-motorer, anvendes til dirigering af produktion i højt niveau af de segmenter af DNA, som støder op dertil.

35 Et initieringssignal er også nødvendigt til opnåelse af effektiv transkription og translation af genet. I f.eks.

I DK 175831 B1 23 mRNA fra E. coli omfatter et ribosombindingssted den transla-tionelle startcodon (AUG eller GUG) og en anden sekvens komplementær til baserne i 3'-enden af 16S-ribosomal-RNA.

Nogle af disse sidstnævnte sekvenser (Shine-Dalgarno eller 5 S-D) er blevet identificeret i E. coli og andre, egnede værtscelletyper. Enhver SD-ATG-sekvens, som er forenelig med værtscellesystemet, kan anvendes. Disse omfatter, men er ikke begrænset til, cro-genet eller N-genet i coliphag-λ eller E. coli-generne tryptophan-E, -D, -C, -B eller -A.

10 Der eksisterer en række metoder til indsættelsen af DNA-fragmenter i kloningsvektorer in vitro. DNA-ligase er et enzym, som forsegler enkeltstrengede indsnit mellem tilstødende nucleotider i en duplex-DNA-kæde, og dette enzym kan derfor anvendes til covalent sammenknytning af de ud-15 glødede, cohæsive ender, som frembringes af visse restriktionsenzymer. Alternativt kan DNA-ligase anvendes til katalysering af dannelsen af phosphodiesterbindingen mellem stumpendede fragmenter. Endelig kan enzymet terminal deoxy-nucleotidyltransferase anvendes til dannelse af homopolymere 20 31-enkeltstrengede haler ved fragmenternes ender, og ved addition af oligo-(dA)-sekvenser til 3 '-enden i én population og oligo-(dT)-blokke til 3'-enderne i en anden population kan de to typer af molekyler udglødes til dannelse af dimere cirkler. Enhver af disse metoder kan anvendes til ligatering 25 af gensegmentpromotoren og andre kontrolelementer ind i specifikke steder i vektoren. Det gen, som koder for PI--proteinerne, ligateres således ind i den udvalgte vektor i en specifik relation i forhold til vektorpromotoren og -kontrolelementerne, således at sekvensen er i den korrekte 30 læseramme med hensyn til vektor-ATG-sekvensen. Den anvendte vektor vil typisk have en mærkestoffunktion, såsom ampicil-linresistens eller tetracyclinresistens, således at transformerede celler kan identificeres. Den anvendte metode kan være en vilkårlig af de kendte ekspressionsvektorer eller 35 deres derivater, og blandt de hyppigt anvendte er plasmid-vektorer, såsom pBR 322, pAC 105, pVA 5, pACYC 177, PKH 47, 24 DK 175831 B1 pACYC 184, pUB 110, pmB9, pBR325, Col El, pSCIOl, pBR313, pML21, RSF2124, pCRl eller RP4, bakteriophagvektorer, såsom X-gtll-X-gt-WES-X-B, Charon 28, Charon 4A, X-gt-l-X-BC, X--gt-1-λ-Β, M13mp7, M13.mp8, M13mp9, SV40 og adenovirusvek-5 torer samt gærvektorer.

5.4. Identifikation og rensning af PIA- oa PIB-aen-produkterne.

Som allerede nævnt er de gensegmenter, som koder for 10 PIA og PIB, oprindeligt blevet identificeret ved hybridise-ring med de ovenfor beskrevne, hidtil ukendte oligonucleo-tidsekvenser. Identiteten af det udvalgte fragment som det strukturgen, som koder for PIA, er blevet verificeret både ved molekyl vægt sammenligning med nativt PIA og ved produktets 15 reaktion med alle seks afprøvede, monoklonale PlA-antistoffer ved en koloniradioimmunoafprøvning. Identiteten af PIB-pro-duktet er også blevet verificeret ved reaktion med PIB-speci-fikke, monoklonale antistoffer. E. coli-værtsceller, som eksprimerer det klonede PIA- eller PIB-gen, producerer rige-20 ligt PI-protein, som reagerer med de hensigtsmæssige, monoklonale antistoffer. En rensningsmetode for PIA-proteinet er detaljeret beskrevet af Teerlink et al, (i The Pathogenic Neisseria, G. Schoolnik, ed., 259-264, 1985, Amer. Soc.

Microbiol., Wash.) 25 5.5. Fremstilling af PIA/B-hvbrider.

I forbindelse med den foreliggende opfindelse er der også blevet skabt en række hybrid-PIA/B-gensekvenser og -proteiner. Hybridgenerne er blevet konstrueret ved anven-30 delse af metoden med pendulmutagenese modificeret ifølge Seifert al al. (Genetic Engineering, Principles and Methods, bind 8, side 123-134, Settin et al., udg., Plenum Press, 1986; PNAS USA 83, 735-739, 1986), til indsættelse af et udvælgeligt mærkestof umiddelbart op til PI-genet i en PIA-35 -producerende stamme. I dette tilfælde har det udvælgelige mærkestof været chloramphenicolacetyltransferasegenet (CAT), 25 DK 175831 B1 som giver en udvælgelig chloramphenicolresistens (Cmr).

PIA-stammen indeholdende CAT-DNA anvendes derefter som en DNA-donor til transformation af en PIB-holdig recipientstamme. Den reciprokke krydsning gennemføres ligeledes. Formodede 5 hybrider identificeres ved udvælgelse for Cmr, og bedømmes for PI ved immunopletning. Transformanter, hvori (1) donor--DNA er til stede, eller (2) recipient-DNA er tilbageholdt, eller (3) DNA er forskellig fra den i begge forældre, iagttages alle. Produktionen af sande hybrid-PIA/B-stammer sker 10 i begge typer af krydsninger med en rimelig høj frekvens, idet en række forskellige serovarer kan identificeres. Tilgængeligheden af disse hybridgener og -proteiner har muliggjort analyse af placeringen af epitoperne for de kendte, monoklonale antistoffer og tillader også identifikation og 15 til sidst syntetisk konstruktion af PIA/B-hybridproteiner, som indeholder epitoper, som vides at igangsætte produktionen af beskyttelsesantistoffer, og som derfor er af den største interesse ved udviklingen af en anvendelig vaccine. Den detaljerede beskrivelse af konstruktionen og identifikationen 20 af disse hybrider findes i nedenstående afsnit 7.

5.6. Produktion af PIA-, PIB- og hvbridproteiner ved syntetisk teknik.

Ved en alternativ udførelsesform kan de proteiner, 25 som kodes af gensekvensen, som vist i fig. 3 og 9, samt chimere proteiner indeholdende dele af hver af dem, let syntetiseres kemisk ved teknik, som er velkendt på området (J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 361, 1986). I den afsluttende praksis, efter identifikation af beskyttelsesepitoperne i 30 proteinsekvensen, tilvejebringer peptidsyntese af de isolerede, aktive regioner i molekylet en simpel og relativt prisbillig metode til fremstilling af det grundlæggende materiale til vaccinefremstilling. Anvendelsen af peptidsyntese tilvejebringer også et bekvemt middel til konstruk-35 tionen af et hybrid-PIA/PIB-protein eller fortrinsvis et syntetisk peptid, som omfatter beskyttelsesepitoper fra 26 DK 175831 B1 både PIA- og PIB-proteinerne. Den foreliggende opfindelse omfatter derfor både rekombinantfremstillede og syntetisk fremstillede proteiner i overensstemmelse med de beskrevne sekvenser. Også fragmenter af hele proteinet er omfattet, 5 især fragmenter, som har bevaret antigeniciteten i stam-proteinmolekylet, og ganske specielt fragmenter, som indeholder epitoper, som udløser produktion af beskyttende antistoffer. Det vil også forstås, at det er muligt at foretage ombytninger i hele proteinet og peptidfragmentsekvenserne 10 ved erstatning af én eller flere, aminosyrerester i sekvensen med en kemisk ækvivalent aminosyre, f.eks. kan negativt ladede rester, såsom asparaginsyre og glutaminsyre, ombyttes indbyrdes, og det samme gælder positivt ladede rester, såsom lysin eller arginin. Hydrofobe rester omfatter tryptophan, 15 phenylalanin, leucin, isoleucin, valin og alanin. Det er også muligt at foretage visse udeladelser fra eller tilføjelser til den kendte sekvens og stadigvæk opretholde den ønskede antigenaktivitet. Med den foreliggende information angående sekvensen af, de to proteiner er det muligt for en 20 fagmand på området at foretage hensigtsmæssige ændringer i molekylet og at bestemme, om aktiviteten er bibeholdt. Derfor angår den foreliggende opfindelse tillige homologe, analoge og fragmenter af de omhandlede proteiner, uanset om de er klonede eller syntetisk fremstillede, hvori antigeniciteten 25 af stammolekylet i alt væsentligt er bibeholdt.

5.7. Formulering af en vaccine.

Genproduktet i renset form eller det synetiske PIA--peptid er anvendeligt ved fremstilling af et vaccinepræparat i 30 til forhindring af gonorreinfektion. Enten hele PlA-protei- j net, eller enhver aktiv del deraf, kan anvendes som det 1 immunogene middel i et sådant præparat. Hvis genproduktet er blevet eksprimeret som en del af et fusionsprotein, kan proteinet som en helhed anvendes, eller værtscelleproteinet 35 kan spaltes til opnåelse af det ufusionerede PIA-protein.

PIA-proteinet fremstillet ved rekombinant-DNA-teknik

V

27 DK 175831 B1 kan isoleres fra værtscellerne ved standardproteinisolerings-teknik. Det rensede protein forenes derefter med et vilkårligt af de gængse anvendte, farmaceutisk acceptable bærestoffer, såsom vand, fysiologisk saltopløsning, ethanol, 5 polyoler, såsom glycerol eller propylenglycol, eller vegetabilske olier, samt vilkårlige af de vaccinehjælpestoffer, som er kendt på området. PIA-produktet kan også inkorporeres i liposomer til anvendelse ved en vaccinefremstilling. Som 1 her anvendt skal udtrykket "farmaceutisk acceptable bære- 10 stoffer" forstås som omfattende ethvert og alle opløsningsmidler,. ;dispersionsmedier, overtræk, antibakterielle og anti-fungale midler, isotoniske og absorptionsforsinkende midler og lignende. Anvendelsen af sådanne midler til farmaceutisk aktive stoffer er kendt teknik. Medmindre et vilkårligt, 15 konventionelt medium er uforeneligt med den aktive ingrediens, er dets anvendelse i det terapeutiske præparat medomfattet. Supplerende, aktive ingredienser kan også inkorporeres .

En specielt værdifuld udførelsesform for den forelig-20 gende opfindelse er en vaccine, hvori det aktive immunogen er et hybrid-PIA/PIB-protein. Eksperimentelt fremkaldte gonococcer, som eksprimerer epitoper af både PIA og PIB, er blevet rapporteret i litteraturen (Danielsson et al., Infect.

Immun. 52, 529-533, 1986), men strukturen af det chimere 25 protein er ikke blevet identificeret, og der har ikke været nogen antydning af en mulig anvendelse af proteinet i en vaccine. En sådan vaccine ville give den fordel, at den ville være i stand til at immunisere et individ imod begge typer af gonorreinfektion, dvs. systemiske infektioner for-30 bundet med stammer indeholdende protein IA og lokale infektioner forbundet med stammer indeholdende protein IA eller IB. Med tilgængeligheden af de specifikke sonder, som er beskrevet i forbindelse med den foreliggende opfindelse, kan opnåelse af et sådant hensigtsmæssigt hybridprotein let 35 gennemføres ved anvendelse af teknik, som er kendt for fagfolk på området.

i i i i 28 DK 175831 B1 I princippet kan et chimert gen konstrueres, ved at man først isolerer generne for de individuelle proteiner.

En metode til isolering af PIA-genet ved anvendelse af de PIA-specifikke oligonucleotidproteiner ifølge opfindelsen 5 er allerede blevet beskrevet ovenfor. Tilsvarende metoder kan følges til isolering og identifikation af PIB-genet.

Der er blevet identificeret en række stammer, som kun producerer PIB-proteinet, f.eks. MS11, RIO, FA6140, F62 og mange andre. De ikke-PIA-specifikke DNA-sekvenser, som er 10 beskrevet ovenfor, kan hensigtsmæssigt anvendes til isolering af restriktionsfragmenter indeholdende en PI-sekvens fra den PIB-specifikke stamme, ud fra et genbibliotek over PIB--stammer. Verifikation af ekspressionen af det korrekte produkt kan opnås ved transformation og ekspression af det 15 formodede PIB-fragment ved hjælp af en mi kroorgan isme vært og identifikation af det eksprimerede produkt ved omsætning med en vilkårlig af de kendte, PIB-specifikke, monoklonale antistoffer (R.C. Nowinski, J.S. Knapp, M.R. Tara og J. San d-strom, Infect, Dis., 150, 44-48, 1984). Når først hvert 20 enkelt af de individuelle genfragmenter er blevet isoleret, kan de let klones og samles ved en vilkårlig af de metoder, som er kendt på området. Dele af PIA-sekvensen ligateres derefter til dele af PIB-sekvensen på en sådan måde, at et chimert protein kodes i en transkriberbar og translaterbar 25 form, dvs. ikke afbrudt af translationstermineringssekvenser. Derefter kan hele den chimere sekvens ligateres ind i en vektor indeholdende et udvælgeligt mærkestof og kontrol-elementer. Vektoren kan dernæst anvendes til transformation af en mikroorganismevært, som kan eksprimere udvindelige 30 mængder af genproduktet. Alternativt kan man naturligvis som udgangspunkt simpelthen anvende en vektor, som allerede indeholder PIA-genet, såsom det plasmid, som er indeholdt i E. coli NRRL B-18263. PIB-sekvensen isoleres som ovenfor beskrevet og ligateres helt eller delvis ind i plasmidet, 35 umiddelbart op til eller inden i PIA-genet, således at trans-kription og translation af det ønskede, chimere gen tillades.

29 DK 175831 B1 a ί !

Fortrinsvis kan konstruktion af PIA/B-hybrider imidlertid opnås som beskrevet ovenfor i afsnit 5.6., hybridgenet isoleres derfra og anvendes til skabelse af en vektor til transformation. Den således konstruerede vektor anvendes igen 5 til transformation af en mikroorganismevært. Ekspression af genproduktet tilvejebringer således en kilde for det chimere protein, som let kan inkorporeres i en vaccineformulering på samme måde som PIA- eller PIB-proteinerne alene.

Ved en alternativ udførelsesform fremstilles et hy-10 bridprotein, som kan anvendes i en vaccineformulering, imidlertid syntetisk ved isolering og identifikation af de beskyttende epitoper på de nu kendte proteinsekvenser. Som ovenfor anført har den lette tilgængelighed af chimere re-kombinantproteiner gjort det muligt lettere at identificere 15 de epitoper, som har interesse, og derved i den sidste ende tillade konstruktion af et "strømliniet" hybrid indeholdende kun de dele af hybridproteinet, som er nødvendige til frembringelse af immunitet ved syntetiske metoder.

i I 20 6. Eksempel 1: PIA-Genidentifikation. -isolering og -ekspression.

Ifølge fremgangsmåden ifølge opfindelsen er PIA-gen-sekvensen blevet påvist ved opnåelse af fragmenter af gono-coc-DNA, kloning af individuelle fragmenter separat og der-25 efter rekonstruktion af genet med en fremmed, tilskyndelig promotor. To formodede fragmenter indeholdende dele af PIA--gensekvensen er blevet identificeret ved hybridisering med oligonucleotidet NC1 som tidligere beskrevet. De relevante restriktionsfragmenter ligateres derefter hver især ind i 30 en pGEM-2-plasmidvektor og transformeres i en hensigtsmæssig vært. Transformanter, som hybridiserer til oligo-NCl, isoleres. Plasmid-DNA fremstilles ud fra disse kloner, digereres med det hensigtsmæssige restriktionsenzym og sonderes igen med NC1. De individuelle fragmenter, som hybridiserer til 35 NC1, religateres derefter separat ind i pGEM-2-piasmider, hvilket resulterer i to separate plasmider, pUNC3 og pUNCll.

30 DK 175831 B1

Identiteten af DNA-sekvensen i et fragment på 750 bp bestemmes ved underkloning af mindre restriktionsfragmenter derfra ind i M13 mpl8RF-DNA, hvorefter der sekvenseres ved Sanger-metoden· (Sanger et al., PNAS USA 74, 5463-5467, 1977).

5 Ud fra denne sekvens syntetiseres der et nyt oligonucleotid.

Det nye oligonucleotid, betegnet NC8, anvendes til identifikation et at fragment på 850 bp stødende op til et allerede klonet fragment på 900 bp, og dette fragment klones ind i pGEM-2 til opnåelse af pUNC15 og sekvenseres ved San-10 ger-metoden (supra). Detaljerne ved de metoder, som er involveret i plasmidfremstilling, sekvensering, hybridisering og transformation er beskrevet i det følgende.

6-1.Almene metoder anvendt til fremstilling af plas- 15 miderne.

De efterfølgende underafsnit beskriver den almene metode, som er anvendt til DMA-isolering, enzymreaktioner, isolering af fragmenter og ligationsreaktioner.

20 6.1.1. Betingelser for restriktionsenzym.

De ved de her beskrevne forsøg anvendte restriktionsenzymer er opnået fra New England Biolabs, Inc., Beverly, Massachusetts, medmindre andet er angivet. N. gonorrhoeae--kulturer dyrkes i GC-basismedium (DIFCO) indeholdende 25 Kellogg's supplementer I og II (J. Bacteriol. 85, 1274-1279, 1963) i en 5%'s CO2-atmosfære. Den til digereringen nødvendige DNA isoleres fra gonococstammen FA19 som beskrevet af Maness et al. (J. Infect. Dis. 128, 321-330, 1973), i overensstemmelse med metoden ifølge Stern er al. (Cell 37, 447-30 456, 1984). Det er kendt, at denne stamme producerer protein IA.

Alle digereringer gennemføres under følgende betingelser: En DNA-prøve på ca. 20 μΐ inkuberes ved 37°C i 1-3 timer i et overskud på 2-10 gange af restriktionsenzym.

35 Undtagelserne fra disse betingelser er en temperatur på 65°C for Taql og 30°C for Smal, 31 DK 175831 B1 6.1.2. Restriktionsenzvmpuffere.

De puffere, som anvendes til digereringer med Accl,

Mspl og Rsal, består af: 50 mM Tris-HCl og 10 mM MgCl2 ved pH 8.

5 Den puffer, som anvendes til digerering med Aval,

Haelll, Hindlll og Taql, består af: 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2 og 50 mM NaCl ved pH 8.

Den puffer, som anvendes til digerering med BamHl,

EcoRI og Sall, består af: 10 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2 og 100 mM NaCl ved pH 8.

Den puffer, som anvendes til digerering med Hindi, Sau3AI og Smal, består af: 20 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2 og 50 mM KCl ved pH 7,4.

Reaktionerne standses ved tilsætning af 0,5 M EDTA 15 (pH 7,5) til en slutkoncentration på 10 mM.

6.1.3. Identifikation af relevante restriktions-fragmenter.

Indledende forsøg på kloning af PIA i pBR322 på andre 20 vektorplasmider i E. coli stamme HB101 (Maniatis et al.. Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982) har konsekvent været negative. Derfor blev det besluttet at forsøge at identificere fragmenter indeholdende PIA-genet eller en del deraf ved hybridisering 25 med oligonucleotidsonder. To sonder er blevet udtænkt baseret på den kendte, N-terminale aminosyresekvens i PIB fra N. gonorrhoeae stamme R10 (Blake et al.. Infect. Immun. 36, 277-285, 1982). I forbindelse med en begrænset mængde af codonanvendelsesdata opnået ud fra gensekvenserne i pilin 30 (Meyer et al., PNAS USA 81, 6110-6114, 1984) og PH, to andre gonococproteiner, er denne information blevet anvendt til konstruktion af et par oligonucleotider, betegnet som NC1 og NC2, vist i fig. 2. NC1 er en særegen sekvens, og NC2 er en blandet population af nucleotider, som tilsigtes 35 anvendt til forøgelse af sandsynligheden for identifikation af den korrekte sekvens. Ved kolonihybridiseringsafprøvninger 32 DK 175831 B1 hybridiserer begge disse oligonucleotider til FA19, men de hybridiserer ikke til HB101 indeholdende enten pBR322 eller pGEM-2.

Restriktionsendonucleasedigereret DNA køres på aga-5 rosegeler og overføres fra gelerne til et nitrocellulosefilter ved pletteknikken ifølge Southern {J. Mol. Biol. 98, 503-517, 1978). NC1- og NC2-oligosonderne mærkes med -ATP (ICN Radiochemicals, Irvine, Calif.) ved anvendelse af polynucleotidkinase ved metoden ifølge Maniatis et al.

10 (supra). Slutmærkning gennemføres i følgende puffer: Tris-HC1 (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 5 mM DTT (dithiothreitol) , 0,1 mM spermidin og 0,1 mM EDTA. Hybridisering af mærkede oligonucleotider til DNA på nitrocellulosefiltre gennemføres natten over i 4 X SSPE (0,18 M NaCl, 10 mM NaH2P04 [pH 7,4), 15 1 mM EDTA) , 2 x Denhardt1 s opløsning (1 X = 0,02% okseserum-albumin, 0,02% "Ficoll®", 0,02% polyvinylpyrrolidin), 20 mM natriumpyrophosphat, 0,2% natriumdodecylsulfat og 50 ^g/ml laksesperma-DNA, med 10^ cpm mærket oligo pr. ml hybridisering. Filtrene vaskes i 1 X SSC (0,15 M NaCl, 0,015 M na-20 triumcitrat), 5 mM natriumpyrophosphat og 0,1% natriumdo- decylsulfat. Hybridiserings- og vasketemperaturerne er 46°C og 40°C for hhv. NC1 og NC2. Filtrene vaskes i 5 X SSC, tørres og eksponeres på "Kodak®"-røntgenstrålefilm. Hybridisering til et enkelt fragment sker i hvert enkelt tilfælde, 25 og de relevante fragmenter er: EcoRI-10kb, Sall-5,5 kb,

Sau3Al-900 bp og TaqI-750 bp. Identiske resultater opnås med både NCl og NC2.

6.1.4. Kloning af fragmenter.

30 Når biblioteker af kolonier af HC101 indeholdende

EcoRI- eller SalI-digereret DNA klonet ind i pBR322 sonderes med oligonucleotidet NCl ved kolonihybridisering, iagttages ingen positive kolonier. Dette understøtter tidligere iagttagelser, som antyder, at PI eventuelt er dødbringende 35 for E. coli. De mindre fragmenter af FA19-DNA, dvs. Sau3AI-og Taql-digereringer, som hybridiserer med oligonucleoti - i 33 DK 175831 B1 derne, formodes ikke at indeholde hele PI-genet, og de udvælges som kandidater til kloning.

Praktisk taget samme metode følges for hvert fragment.

For Sau3AI-fragmentet digereres total FA19-DNA til fuldstæn-5 dighed med Sau3Al. Plasmid-pGEM-2-DNA (opnået fra Promega Biotec, Madison, wis.) digereres med BamHI og ligateres med Sau3AI- fragmenterne. Ligation af DNA-fragmenter gennemføres med T4-DNA-ligase (New England Biolabs, Beverley, Mass.) ved 4°C i 16 timer i følgende puffer: 50 mM Tris-HCl (pH

10 7,6) 10 mM MgCl2, 5% (vægt/vol) polyethylenglycol 8000, 1

mM ATP, 1 mM DTT. Rekombinantplasmiderne transformeres ind i E. coli HB101 ved calciumchloridmetoden ifølge Mandel og Higa (J. Mol. Biol. 53, 154, 1970). Kort fortalt suspenderes j bakteriecellerne i en iskold, steril opløsning af 50 mM

i 15 CaCl2 og 10 mM Tris-Cl, pH 8, og blandes derefter med plas- ' mid-DNA i ligationspuffer.

I Der udvindes ca. 2000 transformanter, og bakterie kolonierne overføres på nitrocellulosefiltre, som er fremstillet ved hybridisering ved metoden ifølge Grunstein og 20 Hogness (PNAS USA 82, 3961-3965, 1975), og der iagttages hybridisering med oligo-NCl. En enkelt koloni hybridiserer faktisk med oligonucleotidet. Plasmid-DNA forstærkes, høstes, digereres med Sau3AI og sonderes med oligo-NCl ved den allerede beskrevne Southern-hybridiseringsmetode. Et enkelt 25 fragment på 900 bp hybridiserer med oligonucleotidet, samme størrelse som det Sau3AI-genomfragment i FA19, som er identificeret ved tidligere Southern-hybridisering. Dette fragment udskæres og elektroelueres fra en agarosegel og religateres ind i et BamHI-digereret pGEM-2-plasmid til skabelse af 30 rekombinantplasmidet pUNC3 (fig- 2).

Praktisk taget samme metode som den netop beskrevne er blevet gennemført med Taql-fragmentet på 750 bp fra FA19, som hybridiserer med oligo-NCl. Taql-fragmentet ligateres imidlertid ind i AccI-digereringsstedet i pGEM-2, hvilket 35 resulterer i rekombinantplasmidet pUNCll (fig. 2).

34 DK 175831 B1 6.1.5. Underkloning oo sekvensering af fragmenter.

Før sekvensering digereres Taql- fragmentet på 750 bp yderligere til mindre restriktionsfragmenter på under 300 bp med enzymerne Rsal og Mspl. Derefter repareres fragment-5 enderne og ligateres ind i Smal-stedet i M13 mpl8 RF-DNA som beskrevet af Norrander et al. (Gene 26, 101-106, 1983).

Den af denne kloningsvektor producerede, enkeltstrengede i DNA anvendes derefter som et templat, som skal sekvenseres ved Sanger-metoden (Sanger et al., PNAS USA 74, 5463-5467, 10 1977).

. Dideoxynucleotider kan fremstilles efter de metoder, som er beskrevet af Sanger, supra, og litteraturhenvisningerne deri (BRL, Gaithersburg, Md.). Fire separate huller sættes op for hver DNA-prøve, et for hver af dideoxynucleo-15 tiderne ddA, ddT, ddC og ddG. Til hvert hul sættes 2 μΐ templat-DNA og 2 μΐ grunderblanding bestående af 11 μΐ (22 ng) M13-17-basisgrunder fra BRL, 11 μΐ TM (100 mM Tris + 50 mM MgCl2, pH 8,5) og 66 μΐ H2O (til 10 kloner). Disse centrifugeres, dækkes med et plastomslag og inkuberes ved 56°C 20 i 50-60 minutter.

Efter inkubering sættes 2 μΐ af den hensigtsmæssige NTP-blanding til hvert hul: Hver blanding vil indeholde 10--500 μΜ ddNTP og 6,25 μΜ af hver af de regulære dNTP'er.

Efter tilsætning af NTP-blandingen sættes der til hvert 25 enkelt hul 2 μΐ Klenow-blanding, som består af: 11 μΐ Klenow (fortyndet til 1 enhed/μΐ); 11 μΐ 0,1 M dithiothreitol, 4,4 μΐ 35S-dATP og 61,6 μΐ H20. Blandingen centrifugeres, dækkes med et plastomslag og inkuberes ved 30°C i 15 minutter. Til hvert hul sættes 2 μΐ forfølgelsesblanding (0,25 mM af alle 30 fire dNTP'ser), centrifugeres og inkuberes igen ved 30°C i 15 minutter. Derefter sættes der til hvert hul 2 μΐ formamid-farvestof, og der inkuberes dernæst ved 80°C i 15 minutter, udækket.

Dette punkt er blandingerne klar til overføring på 35 geler, eller de kan emballeres og opbevares ved -80°C. De ved metoden anvendte geler har følgende sammensætning: 35 DK 175831 B1

Ekstensionsgel (80%) 40% acrylamid 16 ml

Urinstof 40 g 10 X TBE* 8 ml 5 H20 24 ml 10%'s APS (ammoniumpersulfat) 1 ml TEMED (tetramethylethylendiamin) 20 μΐ *Tris-borat-elektrophoresepuffer; 89 mM Tris + 89 mM borsyre.

10 Gelerne køres ved 60 Watt, konstant strømstyrke, i 3-4 timer og fikseres derefter i 10%·'s eddikesyre og 10%'s methanol i 15 minutter, hvorefter de tørres på papir og i eksponeres med "Kodak®"-røntgenstrålefilm.

: Et nyt oligonucleotid, NC8, er blevet skabt baseret 15 på den sekvens, som er bestemt for Taql- fragmentet. Dette i. nye oligonucleotid, som har sekvensen 5'GCGTTAAAACCGCTACC3', anvendes ved en Southern-hybridisering til identifikation et at fragment på 850 bp Sau3AI-fragment stødende op til et allerede klonet fragment på 900 bp, og dette fragment klones 20 ind i pGEM-2 til opnåelse af plasmidet pUNC15 (fig. 2) og sekvenseres på den netop beskrevne måde. Hele sekvensen i Pi-genet er vist i fig. 3. Den eneste store, åbne læseramme i denne sekvens ligger mellem baserne 84 og 1062, hvilket svarer til et protein på 326 aminosyrer. Ud fra den offent-25 liggjorte, N-terminale aminosyresekvens i forskellige PI--proteiner (Blake, supra) er den første rest i det modne protein formodentlig asparaginsyre ved base 141, hvilket giver et modent protein på 307 aminosyrer og et signalpeptid på 19 aminosyrer. Den forudsagte størrelse af proteinet er 30 33.786 dalton, hvilket ligger tæt på den tilsyneladende molekylvægt på 34.000 for PI i FA19. Signalpeptidet ser ud til at have de fælles karakteristika, som er forbundet med sådanne sekvenser (Von Heijne, J. Mol. Biol. 184, 99-105, 1985) , med en strækning med hydrofobe aminosyrer, en overflod 35 af alaninrester og et Ala-X-Ala-spaltningssted. Der er også formodede promotorsekvenser -35 og -10, som i sekvens og 36 DK 175831 B1 adskillelse ligger tæt på sammenhængen for disse sekvenser i E. coli (Harley et al., Nuel. Acid Res. 15, 2343-2361, 1987} og et Shine-Dalgarno-ribosombindingssted umiddelbart imod strømmen fra den første rest i signalsekvensen. Den 5 forudsagte, N-terminale aminosyresekvens passer sammen med den, som er bestemt ved aminosyresekvensering af et formodet PIA-protein (Blake i The Pathogenic Neisseria, G. Schoolnik, ed., 251-258, 1985, Amer. Soc. Microbiol., Wash.), og er meget lig den, som findes i PIB-proteinet i RIO. Hydropati-10 profilen i det forudsagte protein er typisk for den i et porinprotein i den ydre membran og har en gunstig sammenligning med hovedporiner i E. coli, OmpF og OmpC (fig. 4), karakteriseret ved lange, hydrofile regioner uden nogen væsentlige hydrofobe strækninger. Der er ringe korrelation 15 med hydropatiprofilerne af andre, sekvenserede proteiner i den ydre gonococmembran.

6.2. Genekspression.

Forsøg på udvinding af en intakt PI-genklon ved liga-20 tering af de to portioner af genet i Sau3AI-fragmenterne i pUNC3 og pUNC15 har konsekvent slået fejl, hvilket har ført til den konklusion, at gonococ-PI er dødbringende for E. coli. Derfor er der blevet konstrueret et rekombinantplasmid, således at en del af PI-genpromotoren er blevet fjernet, og 25 PI-genet er blevet anbragt med strømmen i forhold til phag--T7-promotoren på pGEM-2. Da celler af E. coli sædvanligvis ikke indeholder T7-polymerase, som transkriberer gener med strømmen fra T7-promotoren, opretholdes plasmidet stabilt.

Det således konstruerede plasmid er pUNC7, og det 30 fremstilles ifølge det i fig. 5 viste skema. Et bekvemt Haelll-sted mellem regionen -35 og -10 i PI-genpromotoren muliggør en let fjernelse af regionen -35 og sekvensen imod strømmen. Den resterende del af genet indsættes derefter i pGEM-2 under kontrol af T7-promotoren. HB101 transformeret 35 med pUNC7 eksprimerer intet påviseligt PI ved en koloniradio-immunoafprøvning. Plasmid pUNC7 transformeres derefter ind 37 DK 175831 B1 i E. coli BL21 (DE3), et lysogen, hvori phag-T7-polymerase-genet er til stede, men under kontrol af lac UV5-promotoren (Studier et al., J. Mol. Biol. 189, 113-130, 1986). Dyrket på medium uden isopropyl-S-D-thiogalactopyranosid (IPTG) 5 producerer BL21 (DE3) rummende plasmid pUNC7 intet påviseligt PI, men når IPTG er til stede i mediet, hvilket tilskynder T7-polymeraseproduktion, påvises Pi-genet ved hjælp af mono-klonle PIA-antistoffer ved en kolonipletradioimmunoafprøv-ning.

10 Det eksprimerede protein eksporteres tilsyneladende effektivt gennem den indre membran i E. coli-klonen, da produktet er påviseligt ved koloniradioimmunoafprøvning uden lyse af celler. Proteinet har en ækvivalent, tilsyneladende molekylvægt ved sammenligning med FA19-PI som påvist 15 ved SDS-PAGE (fig. 6A) og Western pletdannelse (fig. 6B) , og det er tilsyneladende også det rigeligste protein, som produceres af klonen under vækst natten over i nærvær af IPTG. Produktion af proteinet er dødbringende for denne specielle stamme af E. coli, idet der ingen stabile celler 20 kan genvindes. Plasmid pUNC7 indeholdende Pi-genet kan imidlertid opretholdes stabilt i denne stamme, forudsat at der ikke tilskyndes nogen ekspression ved vækst på IPTG-holdigt medium. En biologisk ren kultur af stamme BL21 (DE3) rummende plasmid pUNC7 er den 13. november 1987 blevet deponeret hos 25 Northern Regional Reseach Laboratory (NRRL) under accessionsnummeret NRRL nr. B-18263. 1

Eksempel 2: Identifikation, isolerino, sek vensering og ekspression af PIB-gen oo konstruk-30 tion og ekspression af PIA/B-hvbrider.

Identifikationen og isoleringen af både PIB-genet og PIA-B-hydrider er resultatet af et forsøg på at vise, at nmp-stedet er det strukturelle PI-gen, og at PIA- og PIB--proteiner er alleler. Begivenhedssekvensen har i alminde-35 lighed involveret indsættelsen af et udvælgeligt mærkestof i en PIA-holdig stamme efterfulgt af transformation af en 38 DK 175831 B1 PIB-producerende stamme. Disse metoder er beskrevet detaljeret i det følgende.

7.1. Indsættelse af et udvæloeligt mærkestof i PI-5 -genet.

Sau3AI- fragmentet på 90 0 bp fra pUNC3, beskrevet ovenfor, indeholdende de første 45 codoner af PI-genet i FA19 (en PIA-producerende stamme) og sekvenser imod strømmen ligateres med BamHI-digereret pHSS6 til dannelse af plasmidet 10 pNCS2 (fig. 7) . Dette plasmid underkastes derefter pendul-mutagenese, Pendulmutagenese gennemføres ved anvendelse af en modifikation af metoder ifølge Seifert et al., supra. Mål-DNA underklones ind i pHSS6 og indføres i E. coli stamme RDP146 (pTCA) ved transformation efterfulgt af indføring af 15 pOX38::mTn3Cm-3 (fra S. coli W3110polA) ved konjugation. Transkonjuganter dyrkes natten over ved 30°C for at tillade, at der sker transposition, efterfulgt af nogle timers vækst ved 37°C. En "pulje" af transkonjugater (ca. 1000 kolonier) resuspenderes og anvendes som donoren i konjugation med E.

20 coli NS2114Sm, hvori plasmid-cointegrater, dannet som et mellemprodukt ved transpositionsbegivenheder i målplasmidet, spaltes (Seifert et al., supra). Den derved indsatte trans-poson er stabil, da transposasefunktionen, som tilvejebringes in trans på plasmid pTCA, ikke længer er til stede. Den i 25 dette tilfælde anvendte mini -transposon er mTn3Cm-3, hvori bla-genet i Tn3 er erstattet af chloramphenicolacetyltrans-ferasegenet (CAT).

Efter kortlægning af mTn3Cm-3- indsættelsesstederne i Sau3AI-fragmentet på 900 bp af pNCS2 digereres fem sådanne 30 konstruktioner med mTn3Cm-3 på forskellige steder med NotI, som frigør den totale indsats som et lineært fragment, og anvendes til transformation af FA19. Kun et digereret plasmid, pNCS32 (fig. 7), transformerer FA19 til Cmr, med en frekvens på ca. 1 x 10“1. Indsættelsesstedet for mTn3Cm-3 i 35 pNCS32 er ca. 300 bp imod strømmen fra PIA-genpromotorsek- venserne, medens indsættelsesstederne i de andre fire plas- i 39 DK 175831 B1 mider alle er nærmere ved, men ikke inde i, PI-genet. Placeringen af mTn3Cm-3 i genomet i transfektanten FA19 CAT Dl (fig. 7) bekræftes ved Southern hybridisering.

Tidligere studier (Cannon et al., J. Bacteriol. 143, 5 847-851, 1980; Infect. Immun. 32, 547-552, 1981) har vist,

at nmp-stedet, som påvirker molekylvægten af antigeniciteten af PI, på gonococgenomet er nært knyttet til antibiotikum-resistensmærkestofferne str og spe, i rækkefølgen str-spe--nmp, med cotransformationsfrekvenser på 5% for str og nmp 10 og ca. 23% for spe og nmp. For at bestemme, om CAT-mærke-stoffet i FA19 CAT Dl, stødende op til PI-strukturgenet, viser samme bindingsmønster som nmp-stedet, er der blevet gennemført reciprokke krydsninger mellem stammerne FA130 (Strr Spcr Cms; Sarubbi et al., J. Bacteriol. 120, 1284-15 -1292, 1974) og FA19 CAT Dl (Strs Spcs Cmr). Når FA130-DNA

anvendes til transformation af FA19 CAT Dl, under udvælgelse for enten Strr eller Spcr, er cotransformationsfrekvenserne 26% (99/383) for spe og CAT og 7,5% (40/537) for str og CAT. I de reciprokke krydsninger, under udvælgelse for Cmr, 20 er cotransformationsfrekvenserne 10% (11/111) for spe og CAT og 1% (l/lll) for str og CAT. Analyse af overkrydshings-klasser har bekræftet, at genrækkefølgen er str...spe...CAT.

Disse data viser, at CAT-genet er bundet til str- og spe-mærkestofferne på samme måde som nmp-steder,· hvilket giver 25 et stærkt bevis for, at nmp-stedet er strukturgenet for PI.

Ved en anden krydsning anvendes FA19 CAT Dl-DNA til transformation af PIB-stammen MS11, udvalgt for Cmr. Blandt 45 transformanter har 24 opnået donor-PIA, 13 har beholdt recipient-PIB, og 8 har eksprimeret hidtil ukendte hybrid-30 -PIA/PIB-proteiner, som påvist ved koloniimmunopletning. Ombytningen af recipient-PIB med PIA i donoren, når der udvælges for det nært forbundne CAT-gen, har bekræftet disse geners alleliske natur, og den hyppige forekomst af hybridproteiner har antydet, at sekvenshomologien mellem de to 35 alleler har tilladt, at der sker intragenrekombination. Detaljeret analyse af disse PI-hybridstammer afhænger af 40 DK 175831 B1 kendskab til PIB-sekvensen i MS11, som derfor er blevet klonet og sekvenseret.

7.2. Kloning, sekvensering og ekspression af PIB-5 -genet.

Da intakte gonococ-PI-gener tilsyneladende ikke kan klones i E. coli, er den strategi, som er beskrevet ovenfor for PIA, nemlig kloning af fragmenter, som tilsammen indeholder den komplette gensekvens, blevet valgt til MS11-PI-10 -genet. Et DNA-fragment fra Pi-genet i stammen FA6149, som tidligere er karakteriseret som havende et hybrid-PI (Danielsson et al., Infect. Immun. 52, 529-533, 1986), er blevet klonet og sekvenseret og har afsløret tilstedeværelsen af et Kpnl-sted i PIB-delen af sekvensen, ca. 300 bp fra 15 starten af genet. Oligonucleotider NC12 (fig. 8), afledt af PIB-gensekvensen med strømmen fra Kpnl-stedet, og NC1 {fig.

1), afledt af gensekvensen svarende til N-terminus i proteinet, er blevet anvendt som sonder ved Southern hybridise-ring til bekræftelse af tilstedeværelsen af KpnI-stedet i 20 MSll-PI-genet. HB101-kolonier indeholdende Kpnl/HincII-dige-reret MS11-DNA klonet ind i vektorplasmidet pGEM-3 sonderes med disse oligonucleotider, og kolonier, som hybridiserer med NC12, påvises og viser sig at indeholde et plasmid med et Kpnl-Hindi-fragment på 1,8 kb, som hybridiserer med 25 NC12. Dette plasmid er blevet betegnet pUNCH22 (fig. 8).

Til trods for gentagne forsøg er. der imidlertid ikke blevet påvist nogen kolonier, som hybridiserer med NCI. Da NC1 hybridiserer med et Kpnl-Hindi-fragment på 750 bp af MS11--genom-DNA ved Southern-hybridisering, har problemet til-30 syneladende ikke været et størrelsesproblem, men mere sandsynligt har ekspressionen af PI-gendelen af dette fragment, som, i en vektor med højt kopiantal, været dødbringende for HB101. Af denne grund er den resterende del af MS11-PI--genet blevet isoleret som et HinfI-fragment på 540 bp i 35 Xgtll ved anvendelse af oligonucleotidet NC1 som sonde.

Denne klon er blevet betegnet Agtll.NCl (fig. 8). HinfI- 41 DK 175831 B1 -fragmentet i Agtll.NCl og Kpnl-Sau3AI- fragmentet på 750 bp i pUNCH22 er blevet yderligere digereret, underklonet og sekvenseret. Sekvensen er vist i fig. 9 og forudsiger et protein på 350 aminosyrer, hvoraf de første 19 er det for-5 modede signalpeptid. En sammenligning af PI-gensekvenserne i FA19 og MS11 afslører 80% nucleotidsekvenshomologi. En sammenligning mellem de forudsagte aminosyresekvenser i PIA (FA19) og PIB (MS11) er vist i fig. 10 og viser en række regioner med signifikant forskel afbrudt af lange regioner 10 med homologi. Nogle af regionerne med forskelle· svarer formodentlig til overfladeblottede, antigene dele af proteinet, da Pi-specifikke, monoklonale antistoffer dyrket imod hele gonococceller aldrig er krydsreaktive mellem PIA og PIB {Knapp et al., J. Inf. Dis. 150, 44-48, 1984).

15 Ekspression af et komplet PIB-gen er blevet opnået ved anvendelse af samme strategi som for PIA (afsnit 6.2.).

Et fragment af Agtll.NCl-indsætnings-DNA, fra Ncil-stedet mellem regionerne -35 og -10 i PIB-genpromotoren til Kpnl-- stedet inden i genet, ligateres med Kpnl-Sau3AI-fragmentet 20 på 750 bp fra pUNCH22 ind i vektoren pGEM-2 digereret med Hindi og BamHI. Dette resulterer i en komplet PIB-kodesek-vens uden sin egen promotor, men umiddelbart med strømmen fra T7-promotoren på plasmidvéktoren. Når denne konstruktion (pUNCH25) indføres i BL2KDE3) og dyrkes med IPTG, er PIB-25 -ekspression påviselig (fig. 11).

En biologisk ren kultur af E. coli stamme BL21(DE3) rummende plasmidet pUNCH25 er blevet deponeret hos American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, under accessionsnummeret 67775.

30 7.3. Konstruktion og analyse af PlA/B-hybridstammer.

Yderligere PIA/B-hybrider er blevet konstrueret ved transformation (Biswas et al., J. Bacteriol. 129, 983-992, 1977) af MS11 med FA19 CAT Dl-DNA, udvælge Cmr og holde 35 regnskab med PI ved immunopletdannelse. Ved en reciprok krydsning anvendes DNA fra en Cmr-transformant af MS11, som 42 DK 175831 B1 har bibeholdt sin PIB, til at transformere FA19, udvælge for Cmr og bedømme PI som før. Celler inkuberes for pheno-typisk ekspression af antibiotikumresistens i 5 timer i enten GC-basismedium før anbringelse på plade eller i GC-5 -basisagar før tilsætning af et toplag af blød agar indeholdende antibiotiket. Når FA19 anvendes som recipient, og der udvælges for Cmr, anvendes der 1 μ9/ιη1, medens der, når MSI 1 er recipient, anvendes 10 μ%/τη1. Bakteriestammer afprøves for binding af monoklonale antistoffer ved anvendelse 10 af en modifikation af metoden ifølge Cannon et al. En koncentreret suspension af celler i GC-basismedium overføres til nitrocellulose ved anvendelse af et filtreringsforgreningsrør og lyseres i chloroformdamp. Filteret gennemvædes i TBS (10 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl) indeholdende 5% 15 tørmælk, inkuberes i TBS indeholdende det hensigtsmæssige antistof og vaskes derefter i TBS. Efter inkubation i anti--muse-IgG-alkalisk phosphatase-konjugeret, sekundært antistof (Sigma) og yderligere vask fremkaldes filtret ved anvendelse af nitrobluetetrazolium og 5-brom-4-chlor-3-indolylphosphat 20 (Bethesda Research Laboratories) efter fabrikantens anvisninger. De anvendte, monoklonale antistoffer er 4A12, 4G5, 2F12, 6D9, 5G9, 5D1 (10), 1D3 (26) og SM101 (27), som alle er PIA-specif ikke, og 1F5, 3C8, 2D4 og 2H1 (10) , som er PIB-specifikke. Alle antistoffer undtagen SM101 er venligst 25 blevet leveret i ascites af M. Tam (Genetic Systems) og er blevet anvendt i fortyndinger på fra 1:2000 til 1:10.000.

SmlOl er venligst blevet leveret af J. Heckels (University of Southampton).

Blandt 300 transformanter med FA19 som recipient har 30 3 haft et hybrid-PI. Blandt de 13 hybridstammer er der blevet identificeret 5 forskellige hybrid-PI-serovarer (tabel I). Hybridstammerne analyseres derefter ved kolonihybridisering ved anvendelse af en række PIA- og PIB-specifikke oligonu-cleotider (tabel II og fig. 10) til fastlæggelse af, hvilke 35 dele af hybrid-PI-generne der er PIA-sekvenser, og hvilke der er PIB-sekvenser, og 9 forskellige klasser er blevet 43 DK 175831 B1 påvist ved denne metode (fig. 10). Ved analyse af serovaren i hybrid-PI-gener med kendt struktur har den omtrentlige placering af epitoperne for disse monoklonale antistoffer derefter kunnet fastlægges.

DK 175831 B1 44

TABEL I

Reaktiviteter (serovarer) af hybrid-PI-stammer med Pl-speci-fikke, monoklonale antistoffer 5

Hybridklasse (fig. 10)

Monoklonalt -- antistof 1-4 5 6 7-8 9 FA19 MS11 10 4G5 + + + - + + 2F12 + + + — Ί· + — SM101 + ---+ + 6D9 + + + + 4 Al 2 ----+ + 15 5G9 ----+ + 5D1 ----++ 1D3 + + 1F5 + - + 3C8 + + - - + - + 20 2D4 + + - + 2H1 + + - + TABEL II 25

Oligonucleotider anvendt til analyse af Pl-hvbrider

Oligo- Sekvens PI- Placering nucleotid (5' -> 3') specificitet (rest nr) * 30 - - - - NC8 GCGTTAAAACCGCTACC A 27-32 NC9 TCGAACCCAAATCAGCG A 34-40 NC11 CGGTGTCGGTCTGCGCC A 299-305 NC12 GATACGGCGAAGGCACT B 182-187 35 NC13 CAAGGTGCCTCCGTCGC B 61-66 NC14 AAGTGCGCGTCGGCCGT A 87-92 NC15 GACTTGGCGCAACGATA A 213-219 NC16 GCAGCGTACAATACGCAC B 144-150 NC18 GCAACATTGCCCAACCC A 116-121 4 0 NC19 AGGCACTGTTGATAGTGC B 273-279 * Placeringen refererer til aminosyrerestnumrene (hvor nr. 1 er den første rest i det modne protein) kodet helt eller delvis af sekvensen af oligonucleotidet.

45 45 DK 175831 B1

Epitoperne for de PIA-specifikke, monoklonale antistoffer 4G5, 2F12 og SM101, som reagerer med klasse 1-hybri-det, skal være placeret nær N-terminus i proteinet, indenfor de første 60 rester. Sammenligning af hybridklasserne 1, 5 5 og 6 antyder, at epitopen for SM101 i det mindste delvis ligger i regionen mellem resterne 34 og 60. De N-terminale 60 rester indeholder signifikant forskel mellem PIA og PIB (fig. 3, 9, 10), som kunne gøre rede for specificiteten af disse antistoffer. Epitopen for 6D9 (PIA-specifik), som 10 reagerer med hybridklasserne 6-9, ligger i regionen i proteinet mellem resterne 187 og 250, som også omfatter regioner med signifikant forskel mellem PIA og PIB. Epitoperne for 4A12, 5G9, 5D1 og 1D3 (alle PIA-specif ikke) er kun blevet påvist i hybridproteinet i klasse 9 og er derfor formodentlig 15 komplekse epitoper, som involverer både N-terminale og C--terminale dele af proteinet. Dette understøttes af den iagttagelse, at disse antistoffer ikke reagerer godt med PI ved en Western pletdannelse, hvor proteinet er relativt denatureret.

20 Blandt de fire antistoffer, som reagerer med PIB i i MSll, er epitopen for 1F5, som reagerer med hybridklasser 7 og 8, placeret indenfor de N-terminale 60 rester, medens epitoperne for 3C8, 2D4 og 2H1 tilsyneladende ligger i en central del af proteinet, mellem resterne 150 og 270, som 25 omfatter en lang strækning med forskellig sekvens. Epitopen for 3C8 er placeret lidt imod strømmen for sekvenserne for 2D4 og 2H1, da hybridproteinet fra klasse 9 kun reagerer med 3C8. Disse epitoper kan imidlertid være relativt komplekse, da 2D4 og 2H1 ikke reagerer med PIB ved en Western 30 pletdannelse. En biologisk ren kultur af den transformerede mikroorganisme FA6248, som indeholder et hybrid-PIA/B-gen, og som eksprimerer et hybrid-PIA/B-protein, er blevet deponeret hos American Type Culture Collection, Rockville, MD, under accessionnummeret 53808.

46 DK 175831 B1 7.4. Diskusion.

Nærværende studium, hvor et reportergen er blevet indsat tæt på PI-strukturgenet, viser, at PIA- og PIB-struk-turgener er alleler af samme sted, som tidligere er blevet 5 identificeret som nmp (Cannon et al., J. Bacteriol. 143, 847-851, 1980). Tilstedeværelsen af et enkelt Pi-gen på gonococgenomet er i overensstemmelse med den iagttagelse, at naturligt forekommende stammer har enten et PIA- eller et PIB-protein, men aldrig dem begge, og at deres PI-serotype 10 opretholdes stabilt. En sammenligning af PIA- og PIB-genet og de afledte aminosyresekvenser har afsløret en høj grad af homologi, men der er identificeret regioner med signifikant sekvensforskel. Selvom PI-hybrider ikke forekommer i naturen, har de her konstruerede Pi-hybrider overlevet sta-15 bilt in vitro. Den relativt sjældne dannelse af et hybrid--PI med en PIB-N-terminus og den overraskende hyppige forekomst af flere overkrydsninger i PI-genet antyder imidlertid, at visse klasser af hybrid-PI kan være begunstiget af gono-coccer, som vokser in vitro.

20 Konstruktionen og analysen af PI-hybrider har tilladt en bestemmelse af den omtrentlige placering af nogle af de overfladeblottede dele af proteinerne og har tilvejebragt en vis indsigt i deres mulige sekundære og tertiære strukturer. De N-terminale regioner i både PIA og PIB er til-25 syneladende overfladeblottede sammen med mindst én anden region i den centrale del af hvert protein. Foldningen af PIA i den ydre membran kan være en sådan, at N-terminale og C-terminale dele er nært associerede på overfladen, da epi-toper for en række PIA-specifikke, monoklonale antistoffer 30 kun er blevet identificeret, når begge disse dele er til stede i et hybrid-PI. Disse modeller for konformationen af PI i den ydre membran stemmer overens med nogle aspekter i tidligere modeller baseret på proteolytisk spaltning af PI i intakte gonococcer (Blake et al., Infect. Immun. 33, 212-35 -222, 1981; Judd et al. Infect. Immun. 54, 408-414, 1986} men afviger fra tidligere antydninger om, at kun N-terminus

Claims

47 DK 175831 B1 af PIA og en central del af PIB er overfladeblottet (Blake et al., supra; Teerlink, J. Exp. Med. 166, 63-76, 1987).

1. Renset nucleinsyre, kendetegnet ved, at den koder for protein IA eller koder for protein IB i Neisseria gonorrhoeae eller en vilkårlig del, mutant eller re- 5 kombinant deraf, som koder for et polypeptid med en immuno-reaktiv og antigenisk determinant i protein IA eller i protein IB, fortrinsvis en sekvens som den, som er vist i henholdsvis fig. 3 eller i fig. 9.

2. Rekombinantvektor, kendetegnet ved, at 10 den omfatter sekvensen ifølge krav 1.

3. Rekombinantvektor ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den er et plasmid, fortrinsvis stammende fra plasmid pGEM-2, især plasmidet pUNC-3, pUNC-7, pUNC-15 eller pUNC-25. 15

4. Værtsorganisme, kendetegnet ved, at den indeholder sekvensen ifølge krav 1.

5. Encellet organisme, kendetegnet ved, at den indeholder vektoren ifølge krav 2, hvorhos plasmidet fortrinsvis er pUNC-15 eller pUNC-25.

5 Nedenstående stammer af E. coli, som bærer de angivne plasmider, er blevet deponeret hos Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL) eller hos American Type Culture Collection, (ATCC), Rockville, MD, og er blevet tildelt de angivne accessionsnumre: 10 E- coli-stamme Plasmid Accessionsnummer BL 21 (DE3) pUNC7 NRRL B-18263 BL 21 (DE3) pUNCH25 ATCC-67775 N. gonorrhoeae FA6248 ATCC-53808 15 Den foreliggende opfindelse skal ikke være begrænset i omfang af de deponerede stammer, som har til formål at være enkelte illustrationer af et aspekt af opfindelsen, og alle cellelinier, som er funktionelt ækvivalente, falder 20 inden for opfindelsens rammer. Faktisk vil forskellige modifikationer af opfindelsen, udover de her viste og beskrevne, være indlysende for fagfolk på området ud fra ovenstående beskrivelse. Sådanne modifikationer skal forstås som værende inden for rammerne af de tilhørende patentkrav.

25 Det må også forstås, at alle størrelser i basepar angivet for nucleotider er omtrentlige og anvendt med det formål at beskrive. 48 DK 175831 B1 PATENTKRAV.

6. Encellet organisme ifølge krav 5, kendeteg net ved, at den har identifikationskarakteristika som NRRL nr. B-18263 eller som ATCC 67775.

7. Fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid med en immunoreaktiv og antigenisk determinant fra Neisseria 25 gonorrhoeae protein IA eller fra Neisseria gonorrhoeae protein IB, hvor polypeptidet er frit for andre Neisseria go-norrhoeae-proteiner, kendetegnet ved, at man a) indfører en rekombinantvektor i en værtsorganisme, hvilken vektor omfatter en DNA-sekvens, som koder for et 30 polypeptid med en immunoreaktiv og antigenisk determinant i protein IA eller i protein IB, og som kan replikeres, tran-skriberes og translateres i værten, b) dyrker den encellede organisme indeholdende re-kombinantvektoren og 35 c) isolerer polypeptidet fra kulturen.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendete g- j 49 DK 175831 B1 net ved, at vektoren er et plasmid, hvilket plasmid fortrinsvis omfatter sekvensen som vist i fig. 1 eller fig. 3 eller en del, mutant eller rekombinant deraf, fortrinsvis et plasmid stammende fra pGEM-2, især plasmidet pUNC-7 eller 5 pUNC-25.

8. Deponering af mikroorganismer.

9. PI-Polypeptidsammensætning, kendetegnet ved, at den er fri for andre ikke-PI-Neisseria gonorrhoeae--proteiner og er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge krav 7 eller krav 8.

10. Polypeptidsammensætning, kendetegnet ved, at den er fri for andre Neisseria gonorrhoeae-proteiner og er som vist i fig. 3 eller i fig. 9 eller er en homolog, analog eller aktiv del deraf.

11. Renset nucleinsyre, kendetegnet ved, 15 at den koder for et hybrid-PIA/PIB-protein i Neisseria gonorrhoeae eller en vilkårlig del, mutant eller rekombinant deraf, som koder for et polypeptid med en immunoreaktiv og antigenisk determinant i protein IA og protein IB.

12. Rekombinantvektor, kendetegnet ved, 20 at den omfatter sekvensen ifølge krav 11.

13. Værtsorganisme, kendetegnet ved, at den indeholder sekvensen ifølge krav 11.

14. Encellet organisme, kendetegnet ved, at den indeholder vektoren ifølge krav 12.

15. Polypeptidsammensætning, kendetegnet ved, at den omfatter mindst én immunoreaktiv og antigenisk determinant i både protein IA og protein IB og er fri for andre Neisseria gonorrhoeae-proteiner.

16. Vaccinepræparat til forhindring eller behandling 30 af infektion af Neisseria gonorrhoeae, kendetegnet ved, at det omfatter en immunogenisk effektiv mængde af et polypeptid ifølge krav 9 eller 10 i kombination med et farmaceutisk acceptabelt bærestof, hvor sammensætningen er fri for andre Neisseria gonorrhoeae-polypeptider.

17. DNA-sonde, som kan anvendes til identifikation af Neisseria gonorrhoeae, kendetegnet ved, at