FI102381B - Epstein-Barrin viruksen tuma-antigeeniin (EBNA) liittyviä synteettisiä polypeptidejä ja menetelmä anti-EBNA-vasta-aineiden tunnistamiseksi k udosnäytteessä - Google Patents

Description

102381

Epstein-Barrin viruksen tuma-antigeeniin (EBNA) liittyviä synteettisiä polypep-tidejä ja menetelmä anti-EBNA-vasta-aineiden tunnistamiseksi kudosnäytteessä - Syntetiska polypeptider, som hänfor sig tili Epstein-Barr-virusets nukleära antigen och forfarande for att identiflera anti-EBNA-antikroppar i ett vävnads-5 prov Tämä keksintö koskee polypeptidejä, menetelmiä ja systeemejä, joita voidaan käyttää Epstein-Barrin virukseen, sen tuma-antigeeniin ja sytomegalovirukseen liittyvien tautien tunnistamiseen.

10 Epstein-Banin virus (EBV) on eräs herpesvirusten ryhmään kuuluva virus ja se aiheuttaa tarttuvaa mononukleoosia (IM) ihmisissä. EBV:n on osoitettu myös olevan mukana synnyttämässä Burkittin lymfoomaa, nenänielun syöpää ja B-imusolukas-vaimia, joita esiintyy potilaissa, joiden immuunivaste on heikentynyt. Näyttöä on myös tämän viruksen mahdollisesta osuudesta sellaisiin ihmisen autoimmuunisaira- 15 uksiin, kuten nivelreumaan ja Sjögrenin syndroomaan.

EBV on erittäin yleinen ympäristötekijä, joka tarttuu 80-100 prosenttiin ihmisistä kaikkialla maailmassa. Alkuperäinen eli primaari-infektio voi olla akuutti tai oireeton. Tätä seuraa pitkä ajanjakso, jonka aikana EBV-infektio on latenttina B-lymfo-syyteissä, joita on verenkierrossa, imusolmukkeissa ja pernassa.

20 Latenssi on prosessi, jolla jokin virus on solunsisäisesti läsnä joko ei-ilmentyneenä tai osittain ilmentyneenä. Tällainen latentti virus voi aktivoitua uudelleen. Vaikka : isäntään liittyviä tekijöitä, jotka säätelevät viruksen piilevyyttä in vivo, ei juuri tun neta, on kuitenkin jonkinlaista aihetta olettaa, että yhden tai useamman immuunime-kanismin puuttuminen on eräs tärkeä tekijä.

25 EBV-immuunivasteen sytotoksisten ja suppressiivisten T-soluelementtien on raportoitu olevan erittäin tärkeitä akuutin EBV-infektion estämisessä IM:ssa. Ne ovat myös tärkeitä piilevästi EBV-infektoituneiden B-lymfosyyttien hallitsemattoman kasvun estäjinä.

T-soluestäjämekanismin puuttumisen on ajateltu olevan tärkeä tekijä, joka mahdol- 30 listaa Afrikassa esiintyvän Burkittin lymfooman, nenänielun syövän ja B-solulym-foomien, joita esiintyy elimen siirtojen yhteydessä esiintyvän hylkimisreaktion torjumiseksi käytettävän immuunivastetta heikentävän hoidon seurauksena, ja lymfoo-mien, joita esiintyy erilaisten autoimmuuni-sairauksien hoidon aikana, puhkeamisen.

2 102381

Epstein ja Achong toim. "The Epstein-Barr Virus", Spring-Verlag, Berlin, Heidelberg (1970) ja Crawford ym., Lancet, 1355 (1980). Lisäksi näiden T-solumekanis-mien puuttumisella ja siitä seuraavalla EBV-infektoituneiden lymfosyyttien liikakasvulla on ajateltu olevan osuutta nivelreumassa. Slaughter ym., J. Exp. Med., 5 148:1429 (1978); Depper ym., J. Immunology, 127:1899 (1981) ja Tosato ym., N.

Engl. J. Med., 305:1238 (1981).

Serologiset ja soluvälitteiset immuunivasteet, jotka seuraavat EBV-primääri-infek-tiota, ovat hyvin dokumentoituja ja ne heijastavat isäntäelimistön vastetta viruksen antigeenejä kohtaan, joita ilmestyy infektion kulun aikana. Näiden vasteiden profiili 10 samoin kuin kudoksissa olevien antigeenien tunnistaminen käyvät yhä hyödyllisem-miksi EBV:hen liittyvien tautien diagnosoinnissa.

Klassisesti primaari-infektio tunnistetaan vasta-aineen avulla viruskapsidi-antigeenia (VCA) vastaan ja toipilasvaihe tunnistetaan vasta-aineiden noususta EBV:n koodaamia tuma-antigeeneja vastaan [EBNA] [Henle ym., Hum Pathol., 5:551-565 15 (1974)]. EBNA-1, (jota toisinaan nimitetään tässä myös nimellä EBNA), ensimmäi nen tunnistettava tuma-antigeeni, on identifioitu 65 000 - 85 000 kilodaltonin (kD) proteiiniksi immunoblotting-tekniikalla [Stmad ym., J Virol., 38:990 (1981); Hennessey ym., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:5665-5669 (1983); ja Billings ym., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:7104 (1983).

20 EBNA-1-proteiinin koko on 65 000 - 85 000 erilaisissa B-solulinjoissa, noin 77 kD:n ollessa tyypillinen. Molekyylin koko korreloi EBV-DNA IR-3-alueen pituuden vaihteluun [Hennessey ym., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:5665-5669 (1983)]. IR-: 3-alue koodaa toistuvaa glysiini-alaniinisekvenssiä, joka on karakterisoitu EBNA-1- proteiinin pääepitoopiksi [Billings ym., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:7104 25 (1983)].

Vaikka tavallisesti käytetyissä analyyseissä tutkitaan VCA:ta ja sitten EBNA-l:tä, EBNA-1 on varhaisin EBV:hen liittyvä antigeeni, joka voidaan tunnistaa infektion .· jälkeen. EBNA on todettu latentisti infektoituneiden kasvu-transformoitujen B-lym- fosyyttien tumassa. EBNA on todettu myös Afrikassa esiintyvän Burkittin tuumorin 30 lymfoblastien tumassa ja anaplastisissa nenänielun syöpäsoluissa.

EBNA:n konsentraatio EBV-infektoituneiden B-lymfosyyttien solutumassa vaihte-lee solun lisääntymisjakson eri vaiheissa. EBNA:n uskotaankin jaksottaisesti synte-. tisoituvan ja hajoavan. Tällaisen hajoamisen tuloksena EBNA:n proteiinifragmentit (polypeptidit) menevät soluliman läpi ja niitä uskotaan olevan tai ilmentyvän solu- 3 102381 kalvolla. Spesifisiä EBNArn hajoamisesta peräisin olevia polypeptidejä ei ole kuitenkaan tähän mennessä identifioitu.

Uskotaan, että ollessaan ulommassa solukalvossa tai sen pinnalla EBNA:n hajoamisesta peräisin olevat polypeptidit stimuloivat merkittävästi isäntäelimistön T-lymfo-5 syyttejä ja initioivat immuunivasteen, jonka vaikutuksesta muodostuu anti-EBNA-vasta-aineita. Samoin uskotaan, että B-solujen, joiden pinnalla ilmenee EBNA:n hajoamisesta peräisin olevia polypeptidejä, spesifinen T-soluvaste saattaa omalta osaltaan olla synnyttämässä sytotoksisia ja suppressiivisia T-soluja, jotka ovat tärkeitä EBNA:a sisältävien (EBV-infektoitujen) B-lymfosyyttien kasvun rajoittami-10 sessa.

Niinpä analyysit sekä EBNA:n että anti-EBNA-vasta-aineiden tunnistamiseksi ovat tärkeitä monissa tavallisissa kliinisissä tilanteissa. Lisäksi rokote EBV-infektoituja B-lymfosyyttejä vastaan olisi sekin kliinisesti tärkeä.

Analyysit anti-EBNA-vasta-aineiden toteamiseksi suoritetaan yleensä käyttäen ikä-15 vää anti-komplementti-immunofluoresenssitekniikkaa (ACIF). Reedman ym., Int. J. Cancer, Π:499-520 (1973). Tässä analyysissä ihmisen EBV-transformoituja B-so-luja kiinnitetään objektilasille. Sitten kiinnitettyihin soluihin lisätään erilaisia laimennoksia potilaan seerumista. Koska anti-komplementaariset seerumit saattavat aiheuttaa vääriä negatiivisia reaktioita tai prototsoneja, kun niitä sekoitetaan komple-20 mentin kanssa (kaksivaiheinen menettelytapa), on tärkeää lisätä koesolupreparaat-teihin peräkkäin seerumi, komplementti ja anti-komplementti-fluoresenssi-konju-gaatti (kolmivaiheinen menettelytapa).

Tähän analyysiin liittyy useita ongelmia. Eräs on se, että analyysi on suhteellisen epäherkkä ja vaatii komplementtivälitteistä täydennystä. Lisäksi tämä analyysi ei ole 25 täysin spesifinen eikä sitä voida tulkita potilaissa, joiden seerumi sisältää vasta-aineita nisäkkäiden solutumaa vastaan. Lisäksi kvantitatiiviset tulokset, jotka saadaan käyttämällä anti-komplementti-immunofluoresenssianalyysiä, ovat vaikeasti toistettavissa. Näistä ja muista syistä anti-EBNA-vasta-aineita koskevat kokeet on yleensä annettu tehtäväksi harvoille erikoistuneille laboratorioille.

30 Edellä mainitut vaikeudet anti-EBNA-vasta-aineiden analyyseissä johtuvat siitä, ettei käytettävissä ole suhteellisen puhdasta EBNA:ta. EBNA:n puhdistaminen nisäkkäiden solukudosviljelmistä on monimutkaista antigeenin matalan konsentraation ja : sen polymorfologian vuoksi. Vaikka on helpompaa ja huokeampaa käyttää koko- 4 102381 soluja, joissa EBNA ilmentyy, kuten nykyään käytettävässä tekniikassa menetellään, kokosolujen käytöstä on suoraan seurauksena spesifisyys- ja toistettavuusongelmia.

Synteettisten peptidien, jotka sisältävät glysiini-alaniini-EBNA-l-alueen osia, on osoitettu reagoivan seerumien kanssa, jotka on saatu potilaista, joilla on EBV-IM. 5 [Rhodes ym., Herpesvirus, R. Rapp ed., Alan R. Liss, New York, s. 487-496 (1984); Rhodes ym., J. Immunology, 134:211-216 (1985); Smith ym., J. Infec. Dis., 154:885-889 (1986) ja Geltosky ym., J. Clin. Lab. Analysis, 1:153:162 (1987)]. Kuten US-patenttijulkaisussa 4 654 419 ja sen jälkeen muuallakin on osoitettu, P62:ksi nimettyä peptidiä voidaan käyttää ELISA-analyysissä EBV-IM:n akuutin 10 vaiheen erottamiseksi serologisesti IM:n toipilasvaiheesta ja paranemisvaiheesta [Smith ym., J. Infec. Dis., 154:885-889 (1986) ja Geltosky ym., J. Clin. Lab Analysis, 1:153:162(1987)].

Taudin akuutti vaihe voidaan tunnistaa IgM-vasta-aineiden esiintymisestä tätä peptidiä vastaan. Toipilasvaiheessa IgM-vasta-aineen filtteri laskee ja IgM-vasta-aine on 15 todettavissa [Smith ym., J. Infec. Dis., 154:885-889 (1986)]. Potilailla, joilla on kauan sitten ollut infektio, IgG-vasta-aineet peptidiä vastaan ovat hallitsevana im-munoglobuliiniluokkana.

Vasta-aineiden muodostuminen EBNA-1-proteiinia vastaan on erittäin epätavallista. Glysiini-alaniinipeptidin P62 tunnistavia IgM-vasta-aineita on todettavissa yhden 20 päivän kuluessa taudin alkamisesta [Smith ym., J. Infec. Dis., 154:885-889 (1986)]. Immunoblotting-tekniikalla tutkittaessa havaittiin, että nämä IgM-vasta-aineet tunnistavat EBNA-1-proteiinin samoin kuin enemmän kuin tusinan normaaleja solu-: proteiineja [Rhodes ym., J. Exp. Med., 165:1026-1040 (1987)]. Vasta-aineen sitou tuminen EBNA-l:een ja autoantigeeneihin voidaan estää peptidillä P62. Akuutti 25 EBV-infektio indusoi siis autovasta-aineita, jotka näyttävät jakavan EBNA-1 :n toistuvan glysiini-alaniinialueen epitoopin.

Sitä vastoin IgG-vasta-aineita EBNA-l:tä vastaan ilmestyy vasta usean kuukauden • : kuluttua taudin puhkeamisesta. ELISA-analyysillä mitattavia IgG-antipeptidi P62- « 4 vasta-aineita [Smith ym., J. Infec. Dis., 154:885-889 (1986) ja Geltosky ym., J. 30 Clin. Lab. Analysis, 1:153-162 (1987)], standardinmukaisella anti-komplementti-immunofluoresenssitekniikalla mitattavia anti-EBNA-1-vasta-aineita [Reedman ym., Int. J. Cancer, 11:499-520 (1973)] ja immunoblotting-tekniikalla mitattavia vasta-aineita EBNA-1-proteiinia vastaan esiintyy kaikkia rinnan. Nämä IgG-vasta-aineet voidaan myös estää peptidillä P62, mutta ne ovat spesifisiä EBNA-1-proteiinin suh-35 teen eivätkä enää reagoi soluautoantigeenien kanssa [Rumpold ym., J. Immunol., 5 102381 138:593-599 (1987); Rhodes ym., J. Exp. Med., 165:1026-1040 (1987) ja Dillner ym., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4652-4656 (1984)].

Sytomegalovirus (CMV) on eräs toinen herpesvirusten ryhmään kuuluva virus. CMV-infektiot immuunikompetenteilla potilailla eivät tavallisesti aiheuta merkittä-5 viä komplikaatioita ja yleensä ne muistuttavat EB V:n aiheuttamaa mononukleoosia.

Diagnoosi CMV-infektiosta potilaassa, jolla on IM:n tapaisia oireita, voidaan tehdä eristämällä virus suonileesioista. Vasta-aineet, joita muodostuu CMV-infektiossa, voidaan todeta neutralointi- (NT), komplementtikiinnitys- (CF), immuno-fluoresens-si- ja verihiutaleiden agglutinaatio- (PA) -menetelmillä. [Ks. Weller, N. Engl. J. 10 Med., 285:203 (1971)].

CMV-infektiot ovat myös latentteja, ja tauti esiintyy potilaissa, joille annetaan immuunivastetta heikentävää hoitoa, ja potilaissa, jotka ovat alttiita opportunisti-infektioille. CMV-infektiosta on tullut kaikkein tavallisin infektio potilailla, joille tehdään allogeeninen luuydinsiirto, ja se on ratkaiseva tekijä siirtoprosessin onnistumi-15 sessa tai epäonnistumisessa [Neiman ym., J. Infect. Dis., 136:754 (1977)].

Aikuisista, jotka saavat immuunivastetta heikentävää hoitoa munuaisen samalajiku-dossiirron jälkeen, yli 90 prosentilla kehittyy aktiivisia sytomegalovirus-vasta-ainei-ta. Likimain puolet seronegatiivisista potilaista infektoituu sen jälkeen immuunivastetta heikentävässä hoidossa. Seronegatiivisissa vastaanottajissa, jotka saavat munu-20 aisen seropositiiviselta luovuttajalta, kehittyy lähes aina leikkauksen jälkeinen infektio ja he ovat alttiita saamaan infektion oireita.

Vastustuskykyisillä henkilöillä eli henkilöillä, jotka eivät saa immuunivastetta heikentävää lääkitystä, ja henkilöillä, joilla ei ole immuunivastetta heikentäviä sairauksia, kuten ARC:tä tai AIDS:ia, CMV-mononukleoosi-infektioita (CMV-IM) tava-25 taan tyypillisesti lapsissa (vastasyntyneistä noin 2 vuoden ikäisiin) ja aikuisissa, so. henkilöissä, jotka ovat vanhempia kuin noin 30-35-vuotiaita. EBV:n aiheuttama in-: fektiöösi mononukleoosi (EBV-IM) todetaan yleensä henkilöissä, joiden ikä vaihte- *' lee teini-iästä noin 25 vuoteen, ja erityisesti henkilöissä, joiden ikä vaihtelee noin 15 vuodesta noin 25 vuoteen.

30 Molempia tauteja sairastavilla potilailla esiintyy epätyypillistä imusolujen runsautta, nielun oireita, epänormaalisuuksia maksan toimintaa kuvaavissa arvoissa, pernan suurentumista ja kuumetta. CMV-IM-potilaiden seerumi on heterofiili-negatiivista, kun taas useimpien EBV-IM-potilaiden seerumi on heterofiili-positiivista.

6 102381

Geeniteknologia ja synteettinen polypeptiditekniikka ovat viime aikoina tuottaneet ratkaisuja ongelmaan, joka liittyy proteiini- ja polypeptidiantigeenien tuottamiseen suurina määrinä. Kummatkin tekniikat ovat kuitenkin tehokkaita vain, jos luonnon proteiinin aminohappotähdesekvenssi tunnetaan.

5 Luonnonproteiinin aminohappotähdesekvenssi voidaan määrittää proteiinista itsestään, mutta se on usein vaikeata. Proteiinia koodaava geeninukleotidisekvenssi saattaa myös paljastaa proteiinin aminohappotähdesekvenssin. Kuitenkin kaikilla DNA-sekvensseillä on kolme mahdollista lukukehystä, joista jokaisella saadaan eri proteiini. Sen vuoksi oikea lukukehys on tunnettava, jotta proteiinin oikea aminohappo-10 tähdesekvenssi voidaan johtaa sen geenistä.

Jotakin proteiinia koodaavan DNA-sekvenssin oikea lukukehys ja siten siis proteiinin aminohappotähdesekvenssi voidaan määrittää vasta-aineita käyttämällä. Tässä strategiassa valmistetaan sarja proteiinifragmentteja tai polypeptidejä, joiden amino-happotähdesekvenssit vastaavat kolmesta mahdollisesta geenituotteesta saatuja sek-15 venssejä. Proteiinifragmentit tai polypeptidit, jotka synnyttävät vasta-aineita, jotka reagoivat immunologisesti geenin luonnollisen proteiinituotteen kanssa, identifioivat tällä tavoin geenin oikean lukukehyksen. Kääntäen taas jos vasta-aineet luonnon proteiinia vastaan tunnistavat valmistetut proteiinifragmentit tai polypeptidit, saadaan samoin selville geenin ja proteiinin välinen suhde.

20 Heller ym., J. Virol., 44:311-320 (1982) raportoivat EBV-genomin osalle DNA-sekvenssin, jonka todettiin sisältävän sisäisen alueen, IR3:n, joka muodostui yhden heksanukleotidisekvenssin ja kahden nonanukleotidisekvenssin suorasta jaksosta. * He mainitsivat todisteita, jotka antavat aihetta olettaa, että IR3:a ympäröivä ja sen sisältävä sekvenssi sisältää EBNA:ta koodaavan geenin. Koska ei kuitenkaan tie-25 detty, mikä kolmesta mahdollisesta DNA-sekvenssistä oli kysymyksessä, Heller ym., supra, eivät pystyneet ehdottoman varmasti päättelemään mahdollisen EBNA-proteiinin aminohapposekvenssiä.

Syyskuussa 1983 Hennessyjä Kieff, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 80:5665-5669 (1983) raportoivat määrittäneensä luonnollisen lukukehyksen Hellerin ym., supra, 30 raportoimalle EBV-DNA-sekvenssille. He todellakin eristivät IR3 DNA:n, pilkkoivat sen pieniksi satunnaiskappaleiksi ja insertoivat kappaleet E. colin ilmentämis-vektorin IacZ-geeniin, jolloin kaikki kolme EBNA-geenin lukukehystä saatiin ilmennetyiksi, kukin eri kloonissa. IacZ-geeni koodaa beta-galaktosidaasia, erästä baktee-: „ rientsyymiä. IR3-lacZ-geenin fuusiotuote ilmentyy E. colissa fuusioproteiinina, jolla 7 102381 on IR3-proteiinisekvenssi, joka on insertoitunut beta-galaktosidaasiproteiinimole-kyylin aminohappojen 7 ja 9 väliin (8 on poistettu rakentamisprosessissa).

Hennessyjä Kieff identifioivat IR3-lacZ-geenifiiusion, joka ilmensi IR3 DNA:n sen luonnollisessa lukukehyksessä seulomalla fuusioproteiinej a, jotka anti-EBNA-posi-5 tiiviset ihmisen seerumit tunnistivat. Tällä tavalla identifioitu plasmidi nimettiin pKH182-44:ksi.

Sen vahvistamiseksi, että pKH182-44:n ilmentämä proteiini sisälsi EBNA-spesifisiä antigeenideterminantteja, Hennessy ja Kieff, supra, synnyttivät kaniineissa anti-seerumia syanogeenibromidipilkottua (CNBr) IR3-galaktosidaasifuusioproteiinia 10 vastaan. CNBr-fragmentissa käytettiin immunogeeniä, joka sisälsi 53 EBNA:n kanssa homologista aminohappoa ja 89 beta-galaktosidaasille homologista aminohappoa. Nämä antiseerumit tunnistivat luonnollisen EBNA.n EBV-infektoiduissa soluissa käytettäessä epäsuoraa immunofluoresenssia.

Hennessyn ja Kieffin tulokset näyttävät olevan riippuvaisia EBNA IR3 -domeenin 15 toistettavuudesta. pKH182-44:n tuottama fiiusioproteiini sisältää suhteellisen pitkän segmentin, joka on homologinen IR3-domeenin kanssa (esim. 53 aminohappoa). Ei ole sen vuoksi yllättävää, että fiiusioproteiini ja sen CNBr-fragmentti sisälsivät antigeenisiä determinantteja. Lisäksi Hennessy ja Kieff eivät identifioineet, mitkä heidän fragmenteissaan toistuvista sekvensseistä toimivat antigeenisinä determinanttei-20 na.

Vaikka Hennessy ja Kieff pystyivät geneettisesti valmistamaan materiaalia, jonka : ihmisen seerumissa olevat anti-EBNA-vasta-aineet tunnistivat, sitä olisi hankala käyttää sairaalaolosuhteissa sen rakenteen vuoksi. Heidän fuusioproteiininsa 53 aminohappotähdettä käsittävä segmentti, joka on homologinen EBNA:n kanssa, on fysi-25 kaalisesti ja kemiallisesti osa beta-galaktosidaasiproteiinia. Sen immunologisiin ominaisuuksiin vaikuttavat sen vuoksi beta-galaktosidaasimolekyylin ne osat, joista sitä ei voida erottaa. Itse asiassa kaikki ihmisen seerumit, joita heidän tutkimukses-saan käytettiin, reagoivat beta-galaktosidaasin kanssa ja edellyttivät käsittelyä beta-galaktosidaasilla tämän reaktiivisuuden adsorboimiseksi ja poistamiseksi ennen spe-30 sifisyyskoetta geneettisesti valmistettua proteiinia kohtaan.

Toinen lähestymistapa toisiinsa liittyviin ongelmiin, joita esiintyy geenin oikean lukukehyksen määrittämisessä ja patogeenisten antigeenien (immunogeenien) valmis-: tamisessa suurina määrinä kliinisiin ja diagnostisiin tarkoituksiin, on käyttää syn teettistä polypeptidikemiaa. Tällä antigeenien (immunogeenien) valmistustavalla on 8 102381 eräs etu geeniteknologisiin valmistusmenetelmiin verrattuna. Synteettiset polypepti-diantigeenit eivät sisällä luonnon proteiinien sivutuotteita tai niiden fragmentteja ja sen vuoksi niitä käyttämällä saadaan eliminoiduksi epäsuotavan ristireaktiivisuuden mahdollisuus ja seeruminäytteiden esikäsittelyn tarve, kuten Hennessyn ja Kieffin 5 tutkimuksessa.

Vaikka synteettisten antigeenien (immunogeenien) valmistusta ja niiden käyttöä vasta-aineiden, joilla on ennalta määrätty spesifisyys, synnyttämiseksi on kuvattu yleisesti, tähän teknologiaan sisältyy vielä suuri alue, jota on edelleen mahdotonta ennakoida. Tähän on ainakin kaksi syytä. Ensiksikin synteettinen antigeeni (immu-10 nogeeni) ei välttämättä synnytä vasta-aineita, jotka reagoivat immunologisesti käsittelemättömän proteiinin kanssa sen luonnollisessa ympäristössä. Toiseksi isännän luonnolliset vasta-aineet jotakin luonnollisesti esiintyvää immunogeenia, kuten jotakin virusproteiinia vastaan reagoivat harvoin immunologisesti polypeptidin, joka vastaa immunogeenin aminohappotähdesekvenssin lyhyttä lineaarista osaa, kanssa.

15 Tämän viimeksi mainitun ilmiön uskotaan johtuvan lyhyistä lineaarisista polypepti-deistä, joilta puuttuvat vaaditut sekundaariset ja tertiaariset konformaatiorakenteet.

Paljon tutkimustyötä, joka on tehty koskien peptidin sitomista vasta-aineilla proteiineihin, on koottu E. Benjamini ym. katsaukseen julkaisussa Current Topics in Microbiology and Immunology, 58:85-134 (1972). Peptidirakenteen merkitystä 20 vasta-aineiden sitoutumisessa on korostanut J.W. Goodman, Immunochem, 6:139-149 (1969).

Useimpien tutkimuksista, jotka koskevat sitä, miten muutokset peptidien sekvenssis-·. sä vaikuttavat vasta-aineineiden sitoutumiseen, on tulkittu osoittavan, että vasta- aineen sitoutumispaikan rakenteella on siinä hallitseva osuus. Sekvenssin ja raken-25 teen muutosten vaikutukset ovat näissä tutkimuksissa sekoittuneet keskenään ja niitä on vaikea erottaa toisistaan. Jotkut näistä tutkimuksista voidaan yhtä hyvin selittää sitoutumiseen vaikuttavilla rakenteen muutoksilla antigeenissä, joka aikaansaa kiinnittymisen.

Vasta-ainevasteessa molekyylitasolla tapahtuu jonkin antigeenin, jolla on määrätty 30 sekvenssi (primaarirakenne), sitoutuminen ja tietyssä konformaatiossa (sekundaari-ja tertiaarirakenne). Immuunivasteen proteiinisiin antigeeneihin on perinteisesti tulkittu kohdistuvan suoraan proteiinin primaari-, sekundaari- tai tertiaarirakenteeseen.

9 102381 Tämä luokituskaava saattaa jossakin määrin päteä proteiineihin, joilla on hyvin määrätty yleisrakenne fysiologisissa lämpötiloissa ja liuoksissa. Sen päteminen peptidi-antigeeneihin, joilla on dynaamisempi rakenne, kuitenkin epäilyttää.

Useat ryhmät ovat raportoineet rakennetutkimuksista, jotka koskevat polymeerejä, 5 joissa on toistuva glysiini- ja alaniinisekvenssi tai glysiini- ja seriinisekvenssi ja jotka syntetisoitiin silkkifibroiinimalleina [Anderson ym., J. Mol. Biol., 67:459-468 (1972)] ja kollageenimalleina [Anderson ym., BBRC 39:802-808 (1970); Doyle ym., J. Mol. Biol., 51:47-50 (1970)]. Systemaattisin tutkimus oli tutkimus, jonka suorittivat Brack ym., Biopolymers, 11:563-586 (1972), jotka raportoivat blokki-10 homopolymeeripolypeptidisaijan, jossa homopolymeeriblokin toistuvilla yksiköillä oli kaava (Alax-Glyy), jossa kun x = 1, y = 1, 2 ja 3; kun x = 2, y = 1, 2 ja 3; ja kun x = 3, y = 3, synteesin.

Viimeksi mainitusta tutkimuksesta raportoidut tulokset olivat sellaiset, että kiinteässä tilassa blokkihomopolymeerit, jotka muodostuivat enimmäkseen alaniinista, oli-15 vat alfa-kierteisiä ja ne, jotka sisälsivät enimmäkseen glysiiniä, olivat epäjärjestyksessä. Liuoksessa polyalaniinin raportoitiin olevan alfa-kierteinen, mutta poly-(Ala2-Glyi):n raportoitiin olevan beta-antiparalleellimuodossa. Enemmän glysiiniä sisältävillä polymeereillä sanottiin olevan toinen kiinteä rakenne, jonka ei sanottu olevan alfa-kierre eikä beta-rakenne.

20 Brackin et ai. raportoimat glysiini- ja alaniinihomopolymeroidut blokit valmistettiin kondensaatiopolymeroimalla toistuvia kahden-kuudenarvoisia peptidiyksikköjä, joissa on karboksyylipääteryhmänä glysyylitähde aktiivisessa esterimuodossa. Poly-• (Ala2-Glyi):n polymeroitumisasteeksi raportoitiin 2-68.

Vaikka näissä tutkimuksissa käytetyt liuottimet eivät olleet fysiologisesti hyväksyt-25 täviä, eli vettä tai fosfaattipuskuroitua saliinia, tulokset kuvaavat kahta seikkaa: (1) rakenteessa saattaa tapahtua muutoksia polypeptidin sekvenssin muuttuessa ja (2) rakenteellisia muutoksia saattaa esiintyä myös liuoksesta kiinteään tilaan siirryttäessä.

Esillä oleva keksintö koskee CMV-homologista polypeptidiä. Polypeptidi sisältää 30 noin 6 - noin 40, mieluiten noin 15 - noin 40 aminohappotähdettä, joilla on sekvenssi, joka vastaa kuviossa 1 esitettyä CMV:n koodaaman polypeptidin sekvenssiä, ja tämä sekvenssi käsittää sekvenssin, jolla on kaava: -Gly-R^-Gly-R^Gly- 10 102381 jossa R1 ja R2 tarkoittavat aminohappotähteitä, jotka yksittäin tarkasteltuina ovat samoja tai erilaisia ja ovat Ala, Asn, Arg, Gly, Leu, Pro, Ser ja Thr, edellyttäen että R ja R eivät ole kumpikin Gly, sen farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja ja sen antigeenisesti läheisiä variantteja.

5 Erään toisen toteutusmuodon mukaan tämä keksintö koskee menetelmää anti-EBNA-vasta-aineiden tunnistamiseksi kudosnäytteessä. Menetelmässä potilaan kudosnäyte sekoitetaan tämän keksinnön mukaiseen CMV-homologiseen peptidiin. Tällä tavoin muodostettua immuunireaktioseosta ylläpidetään ennalta määrätty aika, joka riittävä, jotta näytteessä läsnä olevat anti-EBNA-vasta-aineet ehtivät reagoida 10 immunologisesti peptidin kanssa, jolloin muodostuu immunologinen reaktiotuote. Sen jälkeen määritetään mahdollisesti muodostunut tuote ja siis anti-EBNA-vasta-aineet näytteessä. Parhaaksi todetussa toteutusmuodossa menetelmä on immunoglo-buliiniluokkaspesifinen.

Esillä oleva keksintö koskee myös diagnostista systeemiä anti-EBNA-vasta-aineiden 15 tunnistamiseksi kudosnäytteessä. Systeemi sisältää eri pakkauksissa (a) CMV-homo-logisen polypeptidin ja (b) merkkiaineen polypeptidin ja ihmisen anti-EBNA-vasta-aineiden välisen immunologisen reaktion osoittamiseksi. Mieluiten merkkiaine on entsyymileimattu ihmisen Ig-luokkaspesifinen vasta-aine.

Tässä hakemuksessa on myös kuvattu multimeeri, joka sisältää useita toisiinsa liit-20 tyneitä toistuvia polypeptidiyksikköjä, joissa ainakin yksi toistuva yksikkö on edellä kuvatun kaltainen polypeptidi. Toistuvat polypeptidiyksiköt voivat liittyä toisiinsa pää-häntä-tyyppisesti amidisidoksilla. Vaihtoehtoisesti synteettiset polypeptidimo-nomeerit voivat liittyä toisiinsa muillakin kuin amidisidoksilla polymeerisen multi-meerin muodostamiseksi, kuten esim. käytettäessä molekyylinsisäisiä polypeptidin-25 sisäisiä kysteiinidisulfidisidoksia.

Keksintö koskee anti-EBNA-vasta-aineiden tunnistamismenetelmää, jossa käytetään edellä kuvattua polypeptidiä tai multimeeriä antigeeninä. Tämän menetelmän mukaan käytetään ihmisen kudosnestenäytettä ja se sekoitetaan edellä kuvattuun poly-peptidiin. Saatua immunoreaktioseosta ylläpidetään ennalta määrätty aika, joka riit-30 tää siihen, että mitkä tahansa näytteessä olevat anti-EBNA-vasta-aineet ehtivät reagoida immunologisesti polypeptidin kanssa ja muodostaa immunologisen reaktio-tuotteen. Sitten määritetään immunologinen reaktio. Erityisen hyväksi todetussa käytännössä immuunireaktio määritetään sekoittamalla anti-ihmis-raskasketjuvasta-aineita, kuten anti-IgG-, anti-IgM- tai anti-IgA-vasta-aineita immunologiseen reak-35 tiotuotteeseen, ylläpitämällä tätä toista immunoreaktioseosta ennalta määrätyn ajan, 11 102381 joka on riittävä, jotta anti-ihmis-vasta-aineet ehtivät reagoida immunologisessa reaktiotuotteessa läsnä olevien anti-EBNA-vasta-aineiden kanssa, jolloin muodostuu toinen immunologinen reaktiotuote, ja sitten määrittämällä tämä toinen immunologinen reaktiotuote ja kysymyksessä oleva ihmisen anti-EBNA-raskasketjuvasta-5 ainelaji.

Kaikkein mieluiten koe suoritetaan käyttämällä polypeptidiä tai multimeeriä, joka on kiinnitetty johonkin kiinteään matriisiin, jolloin muodostuu kiinteä alusta. Kudosnäyte, kuten veri, seerumi, plasma, sylki tai yskös, sekoitetaan kiinteään alustaan, jolloin muodostuu kiinteä/nestefaasi-immunoreaktioseos. Seosta ylläpidetään 10 kuten edellä, jolloin muodostuu kiinteään faasiin sidottu immunologinen reaktio-tuote, joka sisältää anti-EBNA-vasta-aineita, ja sen jälkeen kiinteä faasi ja nestefaasi erotetaan. Sitten määritetään kiinteään faasiin sidottu immunologinen reaktiotuote.

Edelleen keksintö koskee diagnostista systeemiä vasta-ainemolekyylien EBNAita vastaan tunnistamiseksi ihmisen kudoskomponenteissa. Tällainen systeemi käsittää IS jonkin tämän keksinnön mukaisen polypeptidin ja merkkiaineen polypeptidin ja an-ti-EBNA-vasta-ainemolekyylien välisen immuunireaktion osoittamiseksi. Eräässä vielä suositeltavammassa toteutusmuodossa tämä systeemi käsittää myös kiinteän alustan, joka muodostuu kiinteästä matriisista, johon polypeptidi on kiinnitetty. Tähän systeemiin voi sisältyä myös aine immunologisesti reagoivien vasta-ainemole-20 kyylien isotyypin identifioimiseksi.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

Kuvioissa, jotka muodostavat osan tämän keksinnön sisällöstä: - kuvio 1 on diagrammi, joka esittää polypeptidien (F), (B) ja (E) sirkulaaridikrois-mispektrejä. Näihin polypeptideihin viitataan tässä myös polypeptideinä P13, F62 ja 25 F12, vastaavasti. Kukin spektri on keskiarvo polypeptidin, joka on fysiologisessa liuoksessa (fosfaattipuskuroitu saliini) 1 milligramman/millilitra (mg/ml) konsent-raationa, 10 peräkkäisestä skannauksesta. Optinen rotaatio on ilmoitettu milliradiaa-neina ja piirretty polarisoituneen valon aallonpituutta vastaan, joka on ilmoitettu na-nometreinä (nm). Polypeptidin F (F 13) suhteellisen tasainen käyrä on osoitus satun-30 naiskonformaatiosta, mikä on tavallinen tulos tämän suuruusluokan peptideillä. Minimiarvoja ja piikkejä sisältävä spektri, joka saatiin polypeptidistä B (P62), on luonteenomainen suhteellisen stabiilille sekundaarirakenteelle tai konformaatiolle, luultavasti beta-laskosrakenteelle. Vaikka tuloksia ei olekaan tässä esitetty, polypepti-deillä P27, P60, F14 ja F15 on kovin samanlaiset spektrit, mikä osoittaa, että tämän 12 102381 keksinnön mukaiset parhaat polypeptidit ovat samanlaisina stabiileina konformaa-tioina fysiologisessa liuoksessa. Polypeptidin E (F 12) spektri osoittaa sillä olevan osittain tällainen konformaatio.

Kuvio 2 on valokuva EBV-muunnettujen WI-L2-solujen kokosoluekstraktien nitro-5 selluloosa-immunobloteista, joissa käytettiin kaniinin antipeptidi-antiseerumeja synteettisiä polypeptidejä C (P60) ja B (P62) vastaan. Ihmisen seerumia (potilaalta TJ), joka oli aikaisemin määritetty anti-EBNA-positiiviseksi eli anti-EBNA-vasta-aineita sisältäväksi, käytettiin positiivisena verrokkina raidassa A l:20-laimennoksena. Kaniinin anti-P60 (C) seerumi l:50-laimennoksena (raita B) ja kaniinin anti-P62 (B) 10 seerumi l:10-laimennoksena (raita D) reagoivat immunologisesti saman raidan kanssa kuin positiivinen verrokki osoittaen, että ne tunnistavat luonnollisen EBNA:n. Raidat A-G on identifioitu kuvion alaosassa.

Anti-P60-seerumin EBNA:n tunnistus estyi, kun l:50-laimennettua anti-P60-seeru-mia inkuboitiin 40 mikrogramman/millilitra (pg/ml) kanssa polypeptidiä P60 yhden 15 tuimin ajan ennen immunoblottausta (raita 3). Samalla tavoin anti-P62-seerumin EBNA:n tunnistus estyi, kun l:10-laimennettua anti-P62-seerumia inkuboitiin 40 pg:n/ml kanssa polypeptidiä P62 yhden tunnin ajan ennen immunoblottausta.

P60:n ja P62:n antigeeninen lähekkäisyys näkyy raidoista 6 ja 7. Raita 6 osoittaa anti-P62-seerumin, l:10-laimennoksena, reagoivan immunologisesti EBNA-raidan 20 kanssa. Raidassa 7 anti-P62-seerumin immunoreaktiivisuus EBNA-raidan kanssa estyi, kun sitä inkuboitiin 40 pm:n/ml kanssa polypeptidiä P60 tunnin ajan ennen immunoblottausta.

Kuvio 3 on graafinen esitys, joka kuvaa anti-P62-seerumin aktiivisuuden estymistä potilaan 1011 EBNA-positiivisessa seerumissa liuoksena olevan kilpailevan poly-25 peptidin vaikutuksesta. Suoritettiin ELISA-analyysi, jossa käytettiin polypeptidiä P62 kiinteäfaasikohteena, käyttäen potilaan 1011 seerumia, jota oli etukäteen inku-boitu tunnin ajan joko polypeptidin P27, P62, P60, P89 tai F16 kanssa ennen ELISA-analyysiä. Polypeptideihin P27, P62, P60, P89 ja P16 viitataan tässä myös nimillä polypeptidi A, B, C, D ja E. Anti-polypeptidiaktiivisuusprosentti on esitetty 30 ordinaatalla vastaan polypeptidin konsentraatio mikrogrammoina/millimetri (pg/ml).

Kuvio 4 on graafinen esitys, joka kuvaa EBNA:n vasta-aineiden (katkoviiva, avoimet ympyrät) ja polypeptidin P62 (yhtenäinen viiva, suljetut ympyrät) esiintymisen rinnakkaisia aikoja eräässä dokumentoidussa EBV-infektiöösi mononukleoosita- pauksessa (EBV-IM). Taudin kliinisen toteamisen jälkeen kerättiin peräkkäisiä see- • · 13 102381 raminäytteitä ja ne tiirattiin anti-EBNA-aktiivisuuden määrittämiseksi noudattaen menettelytapaa, joka on raportoitu julkaisussa Catalano ym., J. Clin. Invest., 65:1238-1242 (1980). Seeruminäytteet tutkittiin myös tämän keksinnön mukaisella ELISA-kokeella käyttäen polypeptidiä P62 kiinteäfaasikohteena, kuten vasemman-5 puoleisella ordinaatalla, jolla on kuvattu optinen tiheys 405 nanometrillä (OD405), on esitetty.

Kuvio 5 muodostuu kahdesta graafisesta esityksestä (kuviot 5A ja 5B), jotka kuvaavat vasta-aineiden polypeptidiä P62 vastaan (yhtenäinen viiva, suljetut ympyrät) varhaista toteamista verrattuna anti-EBNA:an (katkoviiva, avoimet ympyrät), käyt-10 täen klassisen menetelmän mukaista tunnistusmenetelmää, jota ovat kuvanneet G. Henle ym., J. Infect. Dis., 130:231 (1974). Peräkkäisiä seeruminäytteitä otettiin kahdelta potilaalta (#14 ylempi kenttä, kuvio 5A; #2, alempi kenttä, kuvio 5B), joilla oli kliinisesti dokumentoitu infektioosi mononukleoosi.

Seeruminäytteet titrattiin anti-EBNA-aktiivisuuden määrittämiseksi kuten ovat ra-15 portoineet Catalano ym., edellä mainittu julkaisu. Anti-polypeptidiaktiivisuus mitattiin käyttäen tämän keksinnön mukaista ELISA-koetta jossa käytettiin polypeptidiä P62 kiinteäfaasikohteena, ja aktiivisuus on raportoitu kuten kuviossa 4.

Kuvio 6 on graafinen kuvio, joka esittää peräkkäisten seeruminäytteiden, jotka otettiin potilaalta D.B., jolla oli akuutti EBV-IM-infektio, EBNA P62 ELISAlla suori-20 tettua analyysiä. Akuutin vaiheen IgM-vaste on osoitettu suljetuin ympyröin, toipilasvaiheen vaste on osoitettu avoimin ympyröin ja IgG/IgM-suhde on osoitettu suljetuin neliöin. EBNA-polypeptidi P62-koe suoritettiin kuten kappaleessa "Materiaaleja ja menetelmiä" kuvataan.

Kuviot 7 ovat valokuvia immunobloteista, jotka kuvaavat potilaasta D.B. otettujen 25 peräkkäisten seeruminäytteiden analyysiä. EBV-immortalisoitujen Wi-L2 (käytetään myös nimeä W1-L2) -solujen lysaatteja käytettiin EBNA-1-proteiinien lähteenä Moteissa. Blotin vasemmassa reunassa (kuvio 7A) käytettiin normaalia (NORM) VCA-positiivista näytettä verrokkina osoittamassa 77 kD:n EBNA-1-proteiinia. Blotit osoittavat IgG-vasta-aineiden viivästyneen vasteen 77 kD:n EBNA proteiineja vas-30 taan (vasemmalla) ja IgM-vasta-aineiden nopeaa nousua näitä proteiineja vastaan taudin akuutissa vaiheessa (oikealla, kuvio 7B). Taudin alkamisesta kuluneet päivät on osoitettu kunkin raidan alapuolella olevilla luvuilla, jotka on tarkoitettu luettaviksi pystysuoraan.

14 102381

Kuvio 8 on graafinen kuvio, joka kuvaa potilaasta, jolla oli ensin CMV-IM-infektio ja sen jälkeen toinen EBV-IM-infektio, otettujen peräkkäisten seeruminäytteiden analyysiä. Akuutin vaiheen IgM-vaste on osoitettu suljetuin ympyröin, toipilas-vaiheen IgG-vaste on osoitettu avoimin ympyröin ja IgG/IgM-suhde on osoitettu 5 suljetuin neliöin.

Kuviot 9 esittävät valokuvia immunoblottmg-tutkimuksesta, joka kuvaa potilaasta D.B. otettujen peräkkäisten seeruminäytteiden analyysiä immunoblotting-tekniikal-la. Blotin vasen puolisko (kuvio 9A) kuvaa potilaan seerumista saatua akuutin vaiheen IgM-vastetta EBNA-1-proteiineja vastaan. Blotin oikea puolisko (kuvio 9B) 10 kuvaa potilaan seerumin IgG-vastetta. Numerot kunkin raidan alapuolella ja tunnuksella NORM merkityn raidan alapuolella ovat kuten kuviossa 7. EBNA-1-proteiinit valmistettiin Wi-L2-solu-ekstrakteista, kuten kappaleessa "Materiaaleja ja menetelmiä" kuvataan.

Kuvio 10 on kaksiosainen graafinen kuvio (kuviot 10A ja 10B), joka esittää kahdes-15 ta potilaasta, joilla oli CMV-IM-infektio ja joilla oli aikaisemmin ollut EBV-infek-tio, otettujen peräkkäisten seeruminäytteiden polypeptidi P62 ELISA-analyysiä. Potilasta L.S. koskevassa kuviossa 10A IgM-vasta-ainevasteet on osoitettu avoimin ympyröin, IgG-vasteet on esitetty suljetuin ympyröin ja IgG/IgM-suhteet on esitetty suljetuin neliöin. Potilasta S.G. koskevassa kuviossa 10B IgM-vasteet on esitetty 20 avoimin ympyröin, kun taas IgG-vasteet on esitetty suljetuin ympyröin.

Kuvio 11 käsittää kaksi kuvaa (kuviot 1 IA ja 1 IB), jotka ovat valokuvia neljästä potilaasta, joilla oli akuutti EBV-IM, ja kuudesta potilaasta, joilla oli akuutti CMV-• IM, otetun neljän seerumin immunoblotting-analyysistä. Kuviossa A seerumien im muunireaktiot tutkittiin K562-soluekstrakteilla (EVB\ CMV) ja siinä osoitettiin 25 erityisesti IgM-vasta-aineet. Kuviossa B seerumien immuunireaktiot tutkittiin eks-trakteilla, jotka oli saatu myöhäisvaiheen CMV-infektoituneista ihmisen sidekudos-soluista, ja siinä tutkittiin IgG-vasta-aineita. Kaikkia seerumeita käytettiin 1:20-lai-mennoksina. Kiijainmerkinnät "E" ja "C" kunkin raidan yläpuolella tarkoittavat kysymyksessä olevassa raidassa käytettyä seerumia, jotka olivat peräisin vastaavasti 30 joko EBV-IM-potilaista tai CMV-IM-potilaista.

Kuvio 12 on valokuva immunoblotista, joka kuvaa IgM-ja IgG-vasta-aineiden sitoutumisen Wi-L2-soluista, jotka muodostavat erään EB\C B-solulinjan, saatuun ekstraktiin estymistä seeruminäytteissä, jotka oli otettu potilailta D.B., D.S. ja T.G. .. heidän tautinsa akuutin ja toipilasvaiheen aikana. Potilas G oli normaali 35 VCA+,EBNA-^-luovuttaja. Raidat 1 ja 2 käsittivät potilaalta D.B. otettuja seerumi- 15 102381 näytteitä, jotka oli otettu 15 päivää taudin puhkeamisen jälkeen, raidat 3 ja 4 seeruminäytteitä, jotka oli otettu 12 päivää taudin puhkeamisen jälkeen potilaasta D.S., raidat 5 ja 6 seeruminäytteitä, jotka oli otettu 4 päivää taudin puhkeamisen jälkeen potilaasta T.G., jolla oli akuutti IM, raidat 7 ja 8 seeruminäytteitä, jotka oli otettu 5 514 päivää taudin puhkeamisen jälkeen potilaasta D.B., raidat 9 ja 10 seeruminäyt teitä, jotka oli otettu 471 päivää taudin puhkeamisen jälkeen potilaasta D.S., ja raidat 11 ja 12 seeruminäytteitä, jotka oli otettu normaalilta luovuttajalta G. Kaikki seeruminäytteet laimennettiin suhteessa 1:50. Parittomilla luvuilla numeroidut raidat sisälsivät pelkkää seerumia ja ne on merkitty miinusmerkillä (-), kun taas parillisilla 10 numeroilla merkityt raidat sisälsivät seerumin plus polypeptidin P62 ja ne on merkitty plusmerkillä (+). Polypeptidin P62 konsentraatio oli 400 mikrogrammaa/millilitra (pg/ml) raidoissa 2, 4 ja 6 ja 50 pm/ml raidoissa 8, 10 ja 12. IgM-vasta-aineet määritettiin erityisesti raidoissa 1-6, kun taas IgG-vasta-aineet määritettiin erityisesti raidoissa 7-12.

15 Kuvio 13 kuvaa CMV:n koodaaman polypeptidiantigeenin aminohappotähdesek-venssiä, Straprausin ym., J. Virol., 57-591-602 (1986) kuvauksen mukaan. Kunkin tähteen numeerinen sijainti on osoitettu vasemmassa marginaalissa olevilla numeroilla. Tämän keksinnön mukaiset parhaat CMV-homologiset peptidit sisältävät aminohappotähdesekvenssin, joka vastaa kuviossa kuvattua sekvenssiä suunnilleen 20 tähdeasemasta 200 suunnilleen tähdeasemaan 220.

Kuvio 14 on graafinen kuvio, joka kuvaa EBV-homologisen peptidin P62 ja CMV-homologisten peptidien Cl ja C2 kykyä tunnistaa anti-EBNA-IgG-vasta-aineita (suljetut symbolit) tai anti-EBNA-IgM-vasta-aineita (avoimet symbolit) potilaan D.B. seerumissa EBV-infektion aikana. Infektion akuutin vaiheen aikana anti-25 EBNA-IgM-vasta-aineet tunnistettiin käyttäen EBV-homologinen peptidi P62-ELISA-analyysiä (kolmiot), CMV-homologinen peptidi Cl-ELISA-analyysiä (ympyrät) ja CMV-homologinen peptidi C2-ELISA-analyysiä (neliöt), jotka vahvistivat infektiöösin mononukleoosin läsnäolon. Toipilasvaiheen alkamisen osoittaa anti-EBNA-IgG-vasta-aineiden nousu ja samanaikainen IgM-vasta-aineiden lasku.

30 Kuvio 15 on graafinen kuvio, joka kuvaa EBV-homologisen peptidin P62 ja CMV-homologisten peptidien Cl ja C2 kykyä tunnistaa anti-EBNA-IgG-vasta-aineita (suljetut symbolit) tai anti-EBNA-IgM-vasta-aineita (avoimet symbolit) potilaan DS seerumissa CMV-infektion ja sen jälkeisen EBV-infektion aikana. Kummankin taudin akuutin vaiheen aikana anti-EBNA-IgM-vasta-aineet tunnistettiin käyttäen EBV-35 homologinen peptidi P62-ELISAa, CMV-homologinen peptidi C1 -ELISAa ja CMV- 16 102381 homologinen peptidi C2-ELISAa, jotka vahvistivat infektiöösin mononukleoosin kummankin akuutin sairauden alussa.

I. Johdanto

Ihmiset, jotka ovat saaneet Epstein-Barrin virusinfektion (EBV), kehittävät vasta-5 aineita viruksen tuma-antigeenia (EBNA) vastaan, jota on läsnä viruksen transfor-moimissa B-lymfosyyteissä. Traditionaaliset kliiniset menetelmät, joita käytetään EBNA:n ja anti-EBNA-vasta-aineiden toteamiseksi ihmisissä, ovat hankalia. Lisäksi nykyisin käytetetyt menetelmät EBNA:n puhdistamiseksi soluviljelmästä eivät ole helposti sovellettavissa massatuotantoon.

10 Tämä keksintö koskee synteettisen polypeptiditeknologian käyttöä nykyisten menetelmien eräiden ongelmien ratkaisemiseksi. Lyhyet synteettiset polypeptidit voivat jäljitellä immunologisesti antigeenisiä determinantteja luonnon proteiinissa ja niitä voidaan sen vuoksi käyttää synnyttämään määrätyn spesifisyyden omaavia vasta-aineita, jotka tunnistavat luonnon proteiinin.

15 Sanontaa "jäljitellä immunologisesti" käytetään tässä tarkoittamaan sitä, että tämän keksinnön mukainen immunogeeninen polypeptidi aikaansaa vasta-aineiden kehittymisen, jotka sitoutuvat tämän kehityksen aikaansaavaan polypeptidiin ja myös samankaltaiseen sekvenssiin käsittelemättömässä proteiinissa. Tätä ilmiötä voidaan käyttää hyväksi sekä kokeellisesti että kliinisesti.

20 Kokeellisesti vasta-aineita synteettisiä polypeptidejä vastaan voidaan käyttää määrittämään DNA-lukukehys ja siis jonkin kliinisesti tärkeän proteiinin, kuten EBNA:n aminohappotähdesekvenssi. Kliinisesti ennalta määrätyn spesifisyyden omaavia vasta-aineita synteettisiä polypeptidejä vastaan voidaan käyttää diagnostisiin ja terapeuttisiin tarkoituksiin.

25 Heller ym., J. Virol., 44:311-320 (1982) raportoivat DNA-nukleotidisekvenssin, jolla on ominaisuuksia, jotka osoittavat, että se voisi sisältää EBNA:a koodaavan geenin. He ennustivat, että jos DNA translatoitaisiin proteiiniksi, kolme mahdollista lukukehystä koodaisivat yli 200 aminohappotähteen, jotka muodostuvat vain (i) seniilistä, arginiinista ja glysiinistä, (ii) glysiinistä ja alaniinista tai (iii) glutamiinista, 30 glutamaatista ja glysiinistä, IR3-proteiinidomeenia, ilmentyneestä DNA-lukukehyk-sestä riippuen.

17 102381

Raportoidut EBNA-molekyylin kemialliset ominaisuudet, otettuna yhdessä mahdollisten stop-kodonien jakautuman kanssa EBNA-geenissä, osoittivat, että IR3 muodostui alunperin glysiini- ja alaniinitähteistä.

Tämän indikaation vahvistamiseksi syntetisoitiin lyhyitä polypeptidejä, joiden ami-5 nohappotähdesekvenssit olennaisesti vastaavat EBNA-proteiinin, jonka IR3 on glysiini-alamini-satunnaiskopolymeeri, sekvenssiä.

Kuten seuraavasta esityksestä selviää, näiden syntetisoitujen polypeptidien ja erityisesti yhden polypeptidin, joka nimettiin erityisesti tunnuksella P62, todettiin jäljittelevän immunologisesti EBNA:ta. Lisäksi erään näiden erityisen suositeltavien po-10 lypeptidien ryhmän, johon kuului myös polypeptidi P62, todettiin sitoutuvan ihmisen anti-EBNA-vasta-aineisiin. Näiden polypeptidien käyttöä erilaisiin analyysimenetelmiin käsitellään myös tuonnempana.

Tarkemmin sanottuna on kehitetty eräs analyysimenetelmä, joka toteutetaan mieluiten kiinteässä faasissa ja jossa käytetään erästä erityisen suositeltavaa polypeptidiä.

15 Tuon analyysin on todettu olevan kliinisesti luotettava tunnistettaessa infektiöösiä mononukleoosia (IM), jonka aiheuttaa EBV (EBV-IM), samoin kuin IM:a, jonka aiheuttaa CMV (CMV-IM), ja myös tunnistettaessa nenänielun syöpää (NPC), toista tautia, jonka aiheuttajaksi EBV on osoitettu. Spesifisiä tuloksia kutakin aluetta koskevista analyyseistä käsitellään tässä samoin kuin analyysimenetelmiä yleensä.

20 II Suositeltavat toteutusmuodot A. Synteettiset polypeptidit 1. Sekvenssit

Saija tässä tutkimuksessa käytettäviä pieniä synteettisiä polypeptidejä (pituus 5-21 aminohappotähdettä) syntetisoitiin käyttäen Merrifieldin kiinteäfaasimenetelmää. 25 Merrifield ym., J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963). Sekvenssit valittiin edustamaan eri alueita EBNA:n ehdotetun IR3-alueen sisältä ja aivan sen ulkopuolelta.

Termi "synteettinen" tarkoittaa tässä käytettynä sitä, että polypeptidimolekyyli tai polypeptidin toistuva yksikkö on rakennettu kemiallisesti eli se on kemiallisesti syntetisoitu eikä valmistettu biologisin keinoin, kuten geeniteknologian menetelmil-30 lä. Keksinnön kohteena olevat synteettiset polypeptidit eivät siis sisällä luonnossa esiintyviä proteiineja tai niiden fragmentteja.

.. Kemiallisesti syntetisoidut polypeptidit eroavat sen vuoksi myös luonnossa esiinty vien proteiinien hajoamistuotteista, kuten sellaisista, jotka on valmistettu antamalla 18 102381 syanogeenibromidin vaikuttaa proteiiniin. Tunnettu kemiallinen kiinteäfaasisynteesi, jossa suojattuja aminohappotähteitä lisätään sarjassa halutun polypeptidin aikaansaamiseksi, on paras synteesimenetelmä ja sitä käsitellään tuonnempana yksityiskohtaisemmin.

5 Kaikki tässä identifioidut aminohappotähteet ovat luonnollisessa eli L-konfiguraa-tiossa. Polypeptidien vakionimistön mukaisesti aminohappotähteiden lyhennykset ovat seuraavat:

Vastaavuustaulukko 10 Symboli Aminohappo 1-kirjaiminen 3-kirjaiminen Y Tyr L-tyrosiini G Gly glysiini F Phe L-fenyylialaniini 15 M Met L-metioniini A Ala L-alaniini S Ser L-seriini L Ile L-isoleusiini L Leu L-leusiini 20 T Thr L-treoniini V Vai L-valiini P Pro L-proliini K Lys L-lysiini H His L-histidiini 25 Q Gin L-glutamiini ; E Glu L-glutamiinihappo W Trp L-tryptofaani R Arg L-arginiini D Asp L-asparagiinihappo 30 N Asn L-asparagiini C Cys L-kysteiini

Keksintö koskee erään aspektinsa mukaan satunnaiskopolymeeristä polypeptidiä, joka sisältää noin 6 - noin 40 aminohappotähdettä, mieluiten noin 15 - noin 20 ami-35 nohappotähdettä, ja sisältää sekvenssin, jolla on seuraava kaava, joka luetaan vasemmalta oikealle ja suunnassa aminopäästä karboksyylipäähän

Gly-R1 -Gly-R2-Gly- 19 102381 jossa R ja R tarkoittavat aminohappotähteitä, jotka yksittäin tarkasteltuina ovat samanlaisia tai erilaisia ja ovat Ala, Asn, Arg, Gly, Leu, Pro, Ser tai Thr, edellyttäen, että R1 ja R2 eivät ole kumpikin Gly. Polypeptidi sisältää myös vähintään 25 mooliprosenttia glysiinitähteitä ja pystyy, kun se liitetään johonkin kantajaan ja in-5 sertoidaan tehokkaana määränä johonkin nisäkäsisäntään, aikaansaamaan vasta-aineiden, jotka reagoivat immunologisesti EBNA:n kanssa, tuotannon.

Erään suositeltavan toteutusmuodon mukaan R1 ja R2 ovat molemmat Arg, jolloin polypeptidi sisältää aminohappotähdesekvenssin: -Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-. Erään toisen suositeltavan toteutusmuodon mukaan R1 on Asn ja R2 on Leu, jolloin poly-10 peptidi sisältää aminohappotähdesekvenssin: -Gly-Asn-Gly-Leu-Gly-. Vielä erään suositeltavan toteutusmuodon mukaan R1 ja R2 ovat molemmat Ser, jolloin polypeptidi sisältää aminohappotähdesekvenssin: -Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-.

Parhaita aminohappotähdesekvenssejä ovat sekvenssit, joilla on vasemmalta oikealle ja aminopäästä karboksyylipäähän luettuna kaavat: 15 -Arg-Ala-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Glu-Lys-Arg-Pro-Met-; -Ile-Met-Ser-Asp-Glu-Gly-Pro-Gly-Thr-Gly-Asn-Gly-Leu-Gly-Glu-; -Pro-Gly-Ala-Pro-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Pro-; niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat ja niiden antigeenisesti läheiset variantit.

20 Vielä suositeltavammissa toteutusmuodoissa R1 ja R2 ovat Ala tai Gly. Esimerkiksi 1 Λ 1 Λ 1 R voi olla Ala ja R voi olla Ala, R voi olla Ala ja R voi olla Gly ja R voi olla * ^

Gly ja R voi olla Ala. Vielä suositeltavammat toteutusmuodot sisältävät siis viisi aminohappotähdesekvenssiä, joilla on kaava, joka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat 25 (i) -Gly-Ala-Gly-Ala-Gly- (ii) -Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-ja (iii) -Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-

Termiä "satunnaissekapolymeeri" käytetään tässä sen tavallisessa merkityksessä. 30 Polypeptidit ovat siis sekapolymeerejä, koska ne sisältävät joukon erilaisia toistuvia aminohappotähdeyksiköitä. Sekapolymeerit ovat satunnaissekapolymeerejä verrattuna vuorottaisiin tai lohkokopolymeereihin, koska polypeptidien yksittäiset aminohappotähteet eivät ole jossakin erityisessä toistuvassa sekvenssissä, kuten on asian- 20 102381 laita vuorottaisten sekapolymeerien tai homolohkosekapolymeerien, jollaisia ovat valmistaneet Anderson ym., Doyle et ai. tai Brack ym., supra, toistuvissa sekvensseissä.

Niinpä vaikka polypeptidi P62:ksi (taulukko 1) nimetty polypeptidi sisältää jaksot-5 taisesti toistuvan sekvenssin -Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-, se sisältää lisäksi -Ala-Gly-peptidin karboksyylipäässä. Ei siis ole olemassa aminohappotähde-sekvenssiä, joka toistuisi läpi koko polypeptidin, ja polypeptidi P62 tulee katsoa satunnaissekapolymeeriksi eikä homoblokkikopolymeeriksi, jollaisia ovat poly(Alax-Glyy)materiaalit, joita ovat valmistaneet Brack ym., tai poly(Ser-Gly)materiaalit, 10 joita ovat valmistaneet Anderson ym., joiden aminohappotähdesekvenssien samanlaiset ryhmät toistuvat läpi koko polymeerien.

Tämän keksinnön mukaisia satunnaisekapolymeeripolypeptidejä nimitetään tässä usein yksinkertaisesti "polypeptideiksi", "synteettisiksi polypeptideiksi" tai "peptideiksi". Tällainen käytäntö tapahtuu tekstin lyhentämiseksi.

15 Termiä "antigeenisesti lähekkäiset variantit" käytetään tässä tarkoittamaan erilaisen aminohappotähdeyleissekvenssin omaavia polypeptidejä, joilla ainakin osa yhdestä antigeenisestä determinantista on samanlainen ja jotka sen vuoksi reagoivat immu-nologisesti ristiin.

Termi "antigeeninen determinantti" tarkoittaa tässä käytettynä molekyylin rakenne-20 komponenttia, joka aikaansaa spesifisen vuorovaikutuksen vastaavien vasta-aine-(immunoglobuliini)molekyylien kanssa, jotka sama tai läheinen antigeeni tai immu-nogeeni on tuonut esiin.

Termi "immunogeeninen determinantti" tarkoittaa tässä käytettynä molekyylin rakennekomponenttia, joka aikaansaa sen, että isännässä syntyy vasta-aine, joka sisäl-25 tää vasta-aineen sitoutumispaikan (idiotyyppi), joka sitoutuu immunogeeniin, kun sitä käytetään antigeeninä.

:' Termi "antigeeni" kuvaa tässä käytettynä yksikköä, johon vasta-aine sitoutuu.

Termi "immunogeeni" kuvaa tässä käytettynä yksikköä, joka aikaansaa vasta-ainetuotannon isäntäeläimessä. Joissakin tapauksissa antigeeni ja immunogeeni ovat sa-30 ma yksikkö, kun taas toisissa tapauksissa nämä kaksi ovat eri yksikköjä.

Esimerkiksi, kuten tuonnempana kuvataan, polypeptidiä P62 käytettiin aikaansaamaan vasta-aineiden tuotanto kaniinissa ja sitä käytettiin siis immunogeeninä. Tällä 21 102381 tavoin aikaansaadut vasta-aineet sitoutuvat polypeptidiin P62, kun sitä käytetään antigeeninä. Polypeptidi P62 oli siten sekä immunogeeni että antigeeni. Anti-EBNA-vasta-aineet sitoutuvat sekä EBNA-immunogeeniin ja -antigeeniin että poly-peptidiin P62 antigeeninä.

5 Esillä olevan keksinnön suositeltavimpia toteutusmuotoja ovat satunnaissekapoly-meeriset polypeptidit P89, F12 ja F13, kuten on esitetty taulukossa 1 alla, farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat ja antigeenisesti läheiset variantit. Kukin näistä po-lypeptideistä sisältää aminohappotähdesekvenssin -Gly-R -Gly-R -Gly-, jossa R ja R2 ovat kuten edellä määriteltiin; kukin polypeptidi sisältää vähintään noin 25 moo-10 liprosenttia Gly:tä ja jokainen pystyy aikaansaamaan vasta-aineita, jotka sitoutuvat EBNAran, kuten edellä kuvattiin.

Taulukko 1

Synteettisten polypeptidien sekvenssit 15 Peptidi* Sekvenssi

P60(C) H-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-OH

P89(D) H-Arg-Ala-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Glu-Lys-Arg-Pro-Met-OH

F 12(E) H-Ile-Met-Ser-Asp-Glu-Gly-Pro-Gly-Thr-Gly-Asn-Gly-Leu-Gly-Glu-OH

20 F13(F) H-Pro-Gly-Ala-Pro-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Pro-OH

P27(A) H-Lys-Gly-Thr-His-Gly-Gly-Thr-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-

Ala-Gly-OH

:. P26(B) H-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-

Gly-Ala-Gly-OH

25 F14 H-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-OH

F15 Η-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-OH

F16(G) H-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly- Ala-Gly- Ala-Gly-Gly-

Ala-Gly-Ala-Gly-OH

30 * Suluissa olevia isoja kirjaimia käytetään tarkoittamaan vastaavaa polypeptidiä joissakin tässä esiintyvissä kuvioissa ja taulukoissa.

Tuloksia tutkimuksista, jotka koskevat polypeptidin/anti-polypeptidin reseptoriin sitoumista ja sitoutumisen estymistä, käsitellään tuonnempana kappaleessa Π D. Nämä tulokset kuvaavat ristiinreaktiivisuutta ja ristiinestovaikutuksia, jotka kulkevat 35 rinnan sekvenssihomologien määrän kanssa polypeptidien joukossa. Esimerkiksi 22 102381 polypeptidi P60 sisältää 10 aminohapon sekvenssin, joka on homologinen P62:n kanssa. Polypeptidi P27 sisältää 8 aminohapon sekvenssin, joka on homologinen polypeptidien P60, P62 ja Dl kanssa (taulukko 2). Polypeptidi D2 (taulukko 2) sisältää 7 aminohappotähteen sekvenssin, joka on homologinen polypeptidien P27, 5 P60, P62 ja Dl sekvenssien kanssa. Polypeptidi P89, joka ei merkittävästi reagoinut ristiin tutkimuksessa, ei sisällä sekvenssiä, joka olisi homologinen polypeptidien P27, P62 ja P60 kanssa.

Mikä vielä tärkeämpää, 8 aminohappotähteen sekvenssi, joka on yhteinen polypep-tideille P27, P62, P60 ja Dl, sisältää vähintään yhden antigeenisen determinantin, 10 joka on yhteinen kaikille kolmelle satunnaissekapolymeeiipolypeptidille, jolloin nämä kolme polypeptidiä ovat antigeenisesti lähekkäisiä variantteja. Lisäksi yhteinen segmentti sisältää kuuden aminohappotähteen sekvenssin -Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly- ja päällekkäisen sekvenssin, jota edustaa kaava -Gly-R1 -Gly-R2-Gly-, jossa R1 ja R2 15 ovat kumpikin Ala, eli -Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-.

"Päällekkäisellä sekvenssillä" tarkoitetaan, että toiseksi mainittu sekvenssi sisältyy osaan ensiksi mainittua sekvenssiä. Tätä aminohappotähdesekvenssin päällekkäisyyttä kuvaavat polypeptidin P62 osalta alla esitetyt päällekkäin menevät, "koteloidut" sekvenssiosat, joissa käytetään yksikirjaimista aminohappotähteen koodia: 20 G-G-G-A-G-G-A-G-A-G-G-G-A-G-G.

Satunnaissekapolymeeripolypeptidit, jotka sisältävät sekä yhteisen kuusi aminohappotähdettä sisältävän sekvenssin että päällekkäin menevät viisi aminohappotähdettä, muodostavat esillä olevan keksinnön erään erityisen suositeltavan toteutusmuodon. Tällaisissa erityisen suositeltavissa toteutusmuodoissa esillä olevan keksinnön mu-25 kainen satunnaissekapolymeeripolypeptidi sisältää noin 8 - noin 40 ja mieluiten noin 15 - noin 20 aminohappotähdettä ja sisältää edellä määritellyn aminohappotähdesek-venssin -Gly-R1-Gly-R2-Gly- lisäksi sekvenssin, jolla on vasemmalta oikealle ja aminopäästä karboksyylipäähän kirjoitettuna kaava: -Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly- 30 joka sisältää vähintään 50 mooliprosenttia Gly-tähteitä ja kykenee sekä (a) aikaansaamaan vasta-aineiden, jotka reagoivat EBNA:n kanssa, kun ne on kytketty johonkin kantajaan ja insertoitu tehokkaana määränä johonkin nisäkäsisäntään, tuotannon, 23 102381 että (b) reagoimaan immunologisesti luonnon EBNA:n aikaansaamien ihmisen vasta-aineiden kanssa.

Erityisen suositeltavat aminohappotähdesekvenssit ovat sekvenssejä, joilla on vasemmalta oikealle ja aminopäästä karboksyylipäähän luettuna kaavat: 5 (i) -Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg (ii) -Lys-Gly-Thr-His-Gly-Gly-Thr-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly- (iii) -Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly- 10 (iv) -Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-GLy-Ala-Gly- (v) -Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly- (vi) -Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly- (vii) -Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-15 (viii) -Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly- niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja ja antigeenisesti lähekkäisiä variantteja.

Huomattakoon, että viiva aminohappotähdesekvenssin alussa tai lopussa tarkoittaa 20 sidosta johonkin radikaaliin, kuten H- tai OH-radikaaliin, amino- tai karboksyyli-päissä, vastaavasti, tai jotakin yhden tai useamman aminohappotähteen lisäsekvens-siä aina kaikkiaan 40 aminohappotähteeseen saakka polypeptidiketjussa.

Samoin erityisen suositeltavia ovat vastaavat polypeptidit itse eli polypeptidit P60, P27, P62, F14, F15 ja F16, jotka on esitetty taulukossa 1, ja Dl ja D2, jotka on esi-25 tetty taulukossa 2, ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat ja niiden antigeenisesti lähekkäiset variantit. Polypeptidiä P62 käytetään tässä esimerkkinä erityisen hyvistä polypeptideistä. Polypeptidiä P62 nimitetään tässä toisinaan nimellä P62, peptidi P62, EBNA P62 ja senkaltaisilla nimillä, jolloin on ymmärrettävä, että mikä tahansa nimitys, johon sisältyy "P62", tarkoittaa tätä materiaalia. Sanoja "peptidi" ja 30 "polypeptidi" käytetään tässä toisiaan korvaamassa.

Sanonta "farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat" tarkoittaa tässä käytettynä ei-toksi-sia alkalimetalli-, maa-alkalimetalli- ja ammoniumsuoloja, joita käytetään lääketeollisuudessa, mukaan lukien natrium-, kalium-, litium-, kalsium-, magnesium- ja am-moniumsuolat ja senkaltaiset, joita valmistetaan alalla hyvin tunnetuin menetelmin.

24 102381

Sanonta sisältää myös ei-toksiset happoadditiosuolat, jotka yleensä valmistetaan antamalla tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden reagoida jonkin sopivan orgaanisen tai epäorgaanisen hapon kanssa. Edustavia suoloja ovat vetykloridi, vetybromi-di, sulfaatti, bisulfaatti, asetaatti, oksalaatti, valeraatti, oleaatti, lauraatti, boraatti, 5 bentsoaatti, laktaatti, fosfaatti, tosylaatti, sitraatti, maleaatti, fumaraatti, sukkinaatti, tartraatti ja senkaltaiset.

Erään toisen suositeltavan toteutusmuodon mukaan esillä oleva keksintö koskee polypeptidiä, joka sisältää vähintään noin 15 - enintään noin 40 aminohappotähdettä, joiden sekvenssi on homologinen (vastaa) EBNA.n sekvenssin tai CMV.n koo-10 daaman polypeptidin sekvenssin kanssa, joka on esitetty kuviossa 13, ja joka sisältää edellä kuvatun kaavan -Gly-R -Gly-R -Gly-, Tämän keksinnön mukaisten EBNA-homologisten ja CMV-homologisten peptidien tunnusmerkkinä on vielä, että ne pystyvät reagoimaan immunologisesti anti-EBNA-vasta-aineiden kanssa.

2. Koko 15 Tutkittiin mikä vaikutus on synteettisen polypeptidin koon muuttamisella sen kykyyn sitoutua anti-EBNA-vasta-aineisiin. Yleensä todettiin, että kun polypeptidin koko pienenee, myös sen kyky sitoa vasta-aineita heikkenee.

Polypeptidi P62 muodostuu 20 aminohappotähteestä, joista 9 ensimmäistä tähdettä aminopäästä lukien toistuvat suoraan, kuten taulukossa 2 on osoitettu käyttäen ami-20 nohappotähteistä yksikirjaimista koodia. Valmistettiin synteettisesti sarja P62:n kanssa homologisia polypeptidejä, joissa aminohappotähdetriadit poistettiin edeltävän peptidin aminopäästä, jolloin saatiin polypeptidit D1, D2 ja D3, jotka on esitetty seuraavassa taulukossa 2. P62:n sekvenssisymmetriasta puuttuu siis yhä useampia osia polypeptideistä Dl, D2 ja D3.

25 102381

Taulukko 2

Polypeptidin Aminohappotähdesekvenssi* nimitys

P62: AGAGGGAGG AGAGGGAGGAG

Dl: GGGAGGAGAGGGAGGAG

D2: AGGAGAGGGAGGAG

D3: AGAGGGAGGAG

A5 : G G G A G

A6 : A G G G A G

A7: GAGGGAG

A8: AGAGGGAG

A9: GAGAGGGAG

# Polypeptidisekvenssit, joissa on käytetty yksikirjaimista koodia, on esitetty suun-5 nassa vasemmalta oikealle ja aminopäästä karboksyylipäähän.

* 9-meerin suoraan toistuvan jakson liittymäkohta polypeptidissä P62.

Tutkittiin polypeptidien D-saijan kykyä reagoida immunologisesti 3 ihmisen anti-EBNA-seerumin ja kaniinin anti-P62-seerumin kanssa käyttäen polypeptidejä ELISAn kiinteässä faasissa, joka kuvataan tuonnempana. Vasta-aineen sitoutuminen 10 Dl .een oli lähes sama kuin lähtöpolypeptidin P62 kaikkien testattujen seerumien kohdalla. Sitä vastoin sitoutumista kiinteässä faasissa olevaan D3:een ei tapahtunut muissa kuin kaniinin anti-P62-seerumissa. D2:n kohdalla tulokset olivat välituloksia : _ ja riippuivat testattavana olevasta seerumista.

Polypeptidien tämän saijan vasta-aineiden tunnistuskyky siis kasvoi kun polypepti-15 din pituutta lyhennettiin 20 aminohappotähteestä 11 aminohappotähteeseen.

Se seikka, että vasta-aineen sitoutuminen heikkeni kaikkien antiseerumien kohdalla, sotii sitä mahdollisuutta vastaan, että jokin spesifinen antigeeninen determinantti poistettiin aminohappotähteitä jaksottaisesti poistettaessa, koska polypeptidit sisälsivät kaksi antigeenistä determinanttia, joista vain yhtä sekvenssien poistaminen 20 koski. Samoin P62:n sekvenssisymmetria takasi sen, että kaikki 4-8 aminohappotähteen sekvenssit, jotka olivat läsnä P62:ssa, olivat läsnä myös D3:ssa, lukuun ottamatta toistuvan jakson liitoskohdan toisella puolella olevia.

' ELISAssa kiinteään alustaan kiinnitettyjen polypeptidien konformatiossa tapahtu neet muutokset ovat saattaneet osaltaan olla poistamassa vasta-ainetunnistusta. Tätä 26 102381 mahdollisuutta tutkittiin estämällä usean seerumin sitoutumista (immuunireaktiota) kiinteään faasiin kiinnitettyyn P62:een käyttämällä vaihtelevia konsentraatioita kilpailevia polypeptidejä liuoksessa. Antiseerumit sekoitettiin ja niitä pidettiin (inku-boitiin) polypeptidin P62, Dl, D2 tai D3:n kanssa liuoksessa ennalta määrätyn ajan, 5 joka oli riittävä, jotta immuunireaktio (sitoutuminen) ehti tapahtua, ennen kuin ne lisättiin mikrotiitterilevylle, joka oli pinnoitettu P62:lla. Tämän tutkimuksen, joka suoritettiin viiden potilaan seerumilla, tulokset on koottu seuraavaan taulukkoon 3.

Taulukko 3

Kilpailevien poly peptidien konsentraatio, jolla saatiin 50 %:n estyminen vasta-aineen sitoutumisessa peptidiin P62*

Kilpaileva peptidi (mikrogrammaa/millilitra)

Seerumi P62 Dl D2 D3 TJ 0,05 0,05 0,1 200 VM 0,3 0,3 0,4 3 CV 0,1 0,1 0,1 10 N6 0,6 0,6 0,6 3 JC 111 500 10 * ELISA-menettelytavat, joita näissä määrityksissä käytettiin, kuvataan tuonnempana kappaleissa II E(2) ja III/D.

Polypeptidin Dl inhiboivan vaikutuksen vasta-aineen sitoutumiseen P62:een katsotaan olevan erottamattomissa P62:n itsensä estävästä vaikutuksesta. Tämä pätee 15 kaikkiin testattuihin seerumeihin.

Vielä kiinnostavampaa on se, että polypeptidi D3 inhiboi joissakin seerumeissa, VM ja N6, suunnilleen yhtä hyvin kuin suuremmat polypeptidit. Tämä voimakas inhi-: boiva vaikutus ilmeni huolimatta siitä, että kummassakaan näistä seerumeista ei esiintynyt sitoutumista D3:een, joka oli kiinnitetty kiinteään alustaan ELISAssa.

20 Näiden tulosten uskotaan osoittavan, että polypeptidillä tulee olla tietty minimipi-tuus, vähintään noin 15 aminohappotähdettä, jotta vaadittu sekundaarirakenne säilyisi, kun se kiinnitetään mikrotiitterilevyn muovipintaan. Siten kiinteäfaasikokeissa peptidipituus on mielellään noin 15 - noin 40 aminohappotähdettä, noin 15 - noin 20 ‘ tähteen pituuden ollessa vielä suositeltavampi.

27 102381

Antigeenin minimikokoa, joka tarvitaan tunnistamiseen, tutkittiin vielä käyttäen polypeptidejä A5, A6, A7, A8 ja A9. Kuten taulukossa 2 on osoitettu, polypeptidis-sä AS on viisi aminohappotähdettä, ja saijan A6-A9 kunkin jäsenen pituutta lisättiin yhdellä aminohappotähteellä edelliseen polypeptidiin verrattuna yhdeksään tähtee-5 seen saakka polypeptidissä A9. Mikään koestettavista antiseerumeista ei reagoinut immunologisesti näiden polypeptidien kanssa, kun ne olivat kiinnitettyinä mikrotiit-terilevyihin tuonnempana kuvattavassa ELISAssa.

Tulokset, jotka koskevat A-saijan polypeptidien kykyä inhiboida ihmisen anti-EBNA-vasta-aineiden sitoutumista kiinteässä faasissa olevaan P62:een, on esitetty 10 alla olevassa taulukossa 4.

Taulukko 4

Estyminen, joka saadaan aikaan 100 mikrogrammalla/milli-litra kilpailevaa polypeptidiä*, vasta-aineen sitoutumisessa peptidiin P62

Estovaikutus prosentteina

Seerumi AS A6 A7 A8 A9 TJ 96 80 91 74 31 VM 93 81 51 17 9 . CV 92 93 93 72 20 JC 94 92 60 88 74 S62 86 96 89 95 78 S60 106 109 93 84 53 * Nämä tutkimukset suoritettiin kuten taulukon 3 yhteydessä kuvattiin.

15 Estyminen toteutui A9:llä melkein kaikissa koestetuissa seerumeissa, vaikkakin erittäin korkeat pitoisuudet tarvittiin (yli 100 kertaa korkeammat kuin P62:n tai Dl:n pitoisuudet, jotka tarvittiin samanarvoiseen estoon). Lisäksi kolmessa seerumissa tapahtui immunologinen reaktio ja estyminen A8:n vaikutuksesta ja yhdessä A7:n vaikutuksesta. Estymistä ei tapahtunut missään seerumissa lyhyempien polypeptidien 20 A6 ja A5 vaikutuksesta.

28 102381

Niinpä immunoreaktiivisuuden aleneminen, joka kulkee rinnan polypeptidin koon pienenemisen kanssa, näyttää johtuvan kahdesta seikasta: (1) sen paikan häviämisestä antigeenistä, johon vasta-aine sitoutuu, minkä osoittivat A-saijan polypeptidit, ja (2) polypeptidin konformaatiossa tapahtuvasta muutoksesta sen koon pienentyessä, 5 minkä osoittivat D-sarjan polypeptidit.

3. Konformaatio Tämän keksinnön mukaisten polypeptidien konformaatioon liittyviä ominaisuuksia tutkittiin käyttäen sirkulaaridikroismispektroskopiaa (CD). Määritettiin polypeptidien P27, P60, P62, F13, F15 ja F16 CD-spektrit. Tulokset, jotka on osaksi esitetty 10 kuviossa 1, osoittavat, että tämän keksinnön mukaiset polypeptidit, jotka sisältävät molemmat suositeltavat aminohappotähdesekvenssit, eli -Gly-R1 -Gly-R2-Gly-, jossa R1 ja R2 ovat kuten edellä kuvattiin, ja -Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-, 15 omaksuvat suhteellisen stabiilin sekundaarirakenteen eli konformaation fysiologisessa liuoksessa 20 °C:ssa. Koska näiden polypeptidien hallitseva konformaatio on suhteellisen stabiili, uskotaan, että ihmisen anti-EBNA-vasta-aineaktiivisuus ilmenee vasteena tähän nimenomaiseen konformaatioon.

B, Multimeerit 20 Esillä oleva keksintö koskee myös multimeeripolypeptidiä (multimeeriä), joka sisältää joukon toisiinsa liittyneitä toistuvia satunnaissekapolymeerisiä polypeptidiyksik-köjä, joissa ainakin yksi toistuvista yksiköistä on jokin edellä kuvattu polypeptidi.

Tämän keksinnön mukaiset multimeerit pystyvät, yksinään tai johonkin kantajaan kiinnitettyinä ja kun ne insertoidaan tehokkaana määränä johonkin nisäkäsisäntään, 25 aikaansaamaan vasta-aineiden, jotka sitoutuvat EBNAihan, tuotannon. Erityisen suositeltavia multimeerejä ovat sellaiset, jotka sisältävät jonkin tämän keksinnön mukaisen CMV-homologisen polypeptidin, joka pystyy sitomaan ihmisen vasta-aineita, jotka EBNA indusoi.

Siten tämän keksinnön mukaiset multimeerit, kuten niiden aineosina olevat polypep-30 tiditkin, ovat immunogeenisiä ja antigeenisiä ihmisen anti-EBNA-vasta-aineille. Näitä multimeerejä voidaan siksi käyttää aikaansaamaan anti-EBNA-vasta-aineiden, 29 102381 jotka ovat käyttökelpoisia tuonnempana käsiteltävissä diagnostisissa menetelmissä ja systeemeissä, tuotannon ja niitä voidaan käyttää myös antigeeneinä sopivissa diagnostisissa menetelmissä ja systeemeissä.

Multimeerit, jotka sisältävät kaikkiaan vähemmän kuin noin 35 aminohappotähdettä, 5 kytketään yleensä johonkin kantajaan immunogeeninä käyttöä varten. Sellaiset multimeerit, jotka sisältävät kaikkiaan enemmän kuin noin 35 aminohappotähdettä, ovat yleensä tarpeeksi immunogeenisiä käytettäviksi ilman kantajaa.

Polypeptidimultimeerit voidaan valmistaa sitomalla yhteen polypeptidimonomeerit pää-häntä-sidoksella käyttäen edellä mainittua kiinteäfaasimenetelmää, so. yksi täy-10 dellinen polypeptidisekvenssi voidaan syntetisoida hartsiin ja sen jälkeen yksi tai useampi samaa tai erilaista polypeptidisekvenssiä, minkä jälkeen koko multimeeri-yksikkö pilkotaan hartsista ja käytetään kuten tässä kuvataan. Tällaiset pää-häntä-polypeptidimultimeerit sisältävät mieluiten noin 2 - noin 4 toistuvaa polypeptidiyk-sikköä.

15 Vaihtoehtoisesti multimeerit voidaan valmistaa polymeerinä, joka muodostuu satun-naissekapolymeerisistä polypeptideistä, joita käytetään monomeereinä. Tässä käytettynä termi "polymeeri" eri kieliopillisissa muodoissaan määritetään multimeeri-tyypiksi, joka sisältää useita toistuvia satunnaissekapolymeeripolypeptidiyksikköjä, jotka liittyvät toisiinsa muilla kuin peptidisidoksilla.

20 Eräs tämän keksinnön mukainen esimerkkipolymeeri voidaan syntetisoida käyttämällä tämän keksinnön mukaisia polypeptidimonomeerejä, jotka sisältävät lisättyjä :m kysteiinitähteitä sekä amino- että karboksyylipäissä (diCys-polypeptidi). DiCys-po- lypeptidimonomeerit voidaan sitoa toisiinsa molekyylinsisäisillä interpolypeptidi-kysteeinidisulfidisidoksilla käyttäen hapetusmenetelmää immunogeenisen antigeeni-25 sen polymeerin muodostamiseksi. Tällä tavoin valmistettu polymeeri sisältää useita tämän keksinnön mukaisia satunnaissekapolymeeripolypeptidejä toistuvina yksikköinä. Nämä toistuvat yksiköt on sidottu toisiinsa edellä mainituilla hapetetuilla kysteiini(kystiini)tähteillä.

«

Yhden tai useamman terminaalisen Cys-tähteen läsnäoloa tämän keksinnön mukai-30 sessa polypeptidissä polypeptidin sitomiseksi johonkin kantajaan tai polymeerin valmistamiseksi ei tule tulkita keksinnön mukaisten toistuvien polypeptidiyksikköjen aminohappotähdesekvenssin muuttamiseksi.

30 102381 C. Ympit

Erään toisen toteutusmuodon mukaan tämän keksinnön mukaisia polypeptidejä käytetään jossakin farmaseuttisesti hyväksyttävässä laimentimessa ympin tai rokotteen muodostamiseksi, joka tehokkaana määränä annettuna pystyy aikaansaamaan 5 vasta-aineita, jotka reagoivat immunologisesti EBNA.n kanssa.

Sanaa "ymppi" sen eri kieliopillisissa muodoissa käytetään tässä kuvaamaan koostumusta, joka sisältää tehoaineena jonkin tämän keksinnön mukaisen polypeptidin, jota käytetään vasta-aineiden valmistamiseen EBNA:a vastaan. Kun polypeptidiä käytetään vasta-aineiden synnyttämiseen, on selvää, että polypeptidiä voidaan käyt-10 tää yksinään, johonkin kantaj aan kytkettynä tai multimeerinä, mutta ilmaisun helpottamiseksi näitä vaihtoehtoja ei tässä aina tuoda julki.

Polypeptideille, jotka sisältävät vähemmän kuin noin 35 aminohappotähdettä, on parasta käyttää jotakin kantajaa, kun tarkoituksena on aikaansaada vasta-aineiden tuotantoa. Polypeptidiä, joka on kytketty johonkin kantajaan, käytetään tässä esimerk-15 kinä vasta-aineita valmistettaessa.

Ymppiä voidaan käyttää vasta-aineiden tuottamiseen käytettäväksi diagnostisissa kokeissa, joissa tunnistetaan EBNA.n ilmentäviä soluja. Ympin tuottamia vasta-aineita voidaan myös käyttää valmisteessa, joka on tarkoitettu aikaansaamaan passiivista immuniteettia B-lymfosyyttejä vastaan, joiden solupinnalle EBNA ilmentyy.

20 Sanaa "rokote" sen eri kieliopillisissa muodoissa käytetään tässä kuvaamaan ymppi-tyyppiä, joka sisältää tehoaineena jonkin tämän keksinnön mukaisen polypeptidin, jota käytetään aikaansaamaan aktiivisen immuniteetin isäntänisäkkäässä. Koska aktiiviseen immuniteettiin liittyy vasta-aineiden tuottaminen, rokote tai ymppi voivat siis sisältää samoja aineosia, mutta niiden käyttö on erilaista. Useimmissa tapauk-25 sissa rokotteen tai ympin aineosat ovat erilaisia, koska monia lisäaineita, joita voidaan käyttää eläimille tarkoitetuissa aineissa, ei voida käyttää ihmisille tarkoitetuissa aineissa.

Keksinnön mukainen ymppi tai rokote sisältää tehokkaan määrän jotakin tämän keksinnön mukaista polypeptidiä multimeerinä, kuten polymeerinä, joka muodostuu 30 yksittäisistä polypeptideistä, jotka on sidottu toisiinsa hapetetuilla polypeptidin terminaalisilla kysteiinitähteillä, tai konjugaattina, joka on kytketty johonkin kantajaan. Kuitenkin ilmaisun helpottamiseksi tämän keksinnön mukaisten polypeptidien • * 31 102381 eri toteutusmuotoihin viitataan tässä termillä "polypeptidi" ja sen eri kieliopillisilla muodoilla.

Polypeptidin tehokas määrä yksikköannosta kohti riippuu muun muassa eläinlajista, jolle ymppi on aiottu, eläimen ruumiinpainosta ja valitusta ymppäystavasta, kuten 5 alalla hyvin tiedetään. Ympit ja rokotteet sisältävät yleensä noin 10 mikrogramman -noin 500 milligramman polypeptidipitoisuuksia ymppäystä (annosta) kohti. Mainitut polypeptidimäärät tarkoittavat polypeptidin painoa ilman kantajan painoa, kun kantajaa käytetään. Tuonnempana kuvataan yksittäisiä esimerkkejä ympeistä ja niiden yhteydessä annetaan kantajan plus polypeptidin (konjugaatin) paino.

10 Termi "yksikköannos" tarkoittaa fyysisesti erotettavia yksiköitä, jotka sopivat yksit-täisannoksiksi eläimille, kunkin yksikön sisältäessä ennalta määrätyn määrän tehoainetta, jonka on laskettu tuottavan halutun terapeuttisen vaikutuksen liitettynä tarvittavaan laimentuneen, so. kantajaan tai kuljetinaineeseen. a) Tehoaineen ainutlaatuiset ominaisuudet ja kysymyksessä oleva saavutettava terapeuttinen vaikutus ja (b) 15 rajoitukset, jotka luonnostaan liittyvät tällaisen tehoaineen formulointiin terapeuttista käyttöä varten eläimille, sanelevat ja niistä riippuvat tämän keksinnön mukaista uutta yksittäisannosta koskevat ohjeet, jotka esitetään tässä selityksessä yksityiskohtaisesti, ja nämä seikat kuuluvat keksinnön alaan.

Ympit valmistetaan yleensä kuivatusta kiinteästä polypeptidikonjugaatista tai poly-20 peptidipolymeeristä suspendoimalla polypeptidikonjugaatti tai polypeptidipolymeeri johonkin fysiologisesti siedettyyn (hyväksyttävään) laimentuneen, kuten veteen, saliiniin tai fosfaattipuskuroituun saliiniin.

Ymppi voi sisältää myös jonkin lisäaineen. Sellaiset lisäaineet kuten Freundin täydellinen adjuvantti (CFA), Freundin epätäydellinen adjuvantti (IFA) ja aluna ovat 25 alalla hyvin tunnettuja lisäaineita ja ne ovat kaupallisesti saatavissa useista lähteistä.

D. Reseptorit

Vasta-aineet ja olennaisilta osiltaan kokonaiset vasta-aineet, jotka tämän keksinnön mukaiset polypeptidit synnyttävät (indusoivat) samoin kuin vasta-aineiden sitoutu-mispaikat, jotka on valmistettu tällaisista vasta-aineista, muodostavat vielä erään 30 tämän keksinnön toteutusmuodon. Näihin molekyyleihin viitataan tässä kollektiivisesti reseptoreina. Reseptoreja synnytetään nisäkäsisännissä, kuten hiirissä, kaniineissa, hevosissa ja senkaltaisissa immunisoimalla käyttäen edellä kuvattuja ymppe-jä- 32 102381

Sopivia monoklonaalisia reseptoreita, yleensä kokonaisia vasta-aineita, voidaan myös valmistaa hybridoomateknologialla, jota kuvaavat Niman et ai. julkaisussa Proc. Natl. Sei., USA, 80:4949-4953 (1983), joka kuvaus liitetään tähän viitteenä. Lyhyesti sanoen hybridoomien muodostamiseksi, josta monoklonaalinen reseptori 5 valmistetaan, myelooma- tai jokin muu jatkuvasti viljeltävä solulinja fuusioidaan lymfosyyttien kanssa, jotka on saatu jonkin nisäkkään, joka on hyperimmunisoitu jollakin tämän keksinnön mukaisella polypeptidillä, pernasta.

Myeloomasolulinja on mieluiten peräisin samasta lajista kuin lymfosyytit. Yleensä hiirikantaa 129 G1X+ pidetään parhaana nisäkäslajina. Tässä keksinnössä käytettä-10 viksi sopivia hiiren myeloomasolulinjoja ovat hypoksantiini-aminopteriini-tymidii-ni-sensitiiviset (HAT) solulinjat P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL 1580) ja Sp2/0-Agl4 (ATCC CRL 1581).

Pernasolut fuusioidaan yleensä myeloomasolujen kanssa käyttäen polyetyleenigly-kolia (PEG) 1500. Fuusioidut hybridit seulotaan niiden HAT-sensitiivisyyden perus-15 teella. Hybridoomat, jotka tuottavat tämän keksinnön mukaisia reseptorimolekyyle-jä, identifioidaan käyttämällä entsyymisidonnaista immuunisorbenttianalyysiä (ELISA), joka kuvataan tuonnempana kappaleessa "Materiaaleja ja menetelmiä", III D.

Monoklonaalisia reseptoreita ei tarvitse valmistaa ainoastaan hybridoomien supema-20 tanteista, vaan niitä voidaan saada myös yleensä väkevämmässä muodossa nisäkkäiden ascitesnesteestä, johon haluttu hybridooma on siirretty. Monoklonaalisten vasta-aineiden tuottaminen ascitesnestettä käyttämällä on hyvin tunnettua eikä sitä käsitellä tässä enempää.

Tämän keksinnön mukainen reseptori sitoutuu sekä polypeptidiin, jota vastaan se 25 synnytettiin, että vastaavaan EBNA-antigeeniseen determinanttipaikkaan, jota tämän keksinnön mukainen polypeptidi immunologisesti jäljittelee. Tämän keksinnön mukainen polypeptidi voi siten olla sekä immunogeeni että antigeeni.

i « Tämän keksinnön mukaiset reseptorit voidaan kuvata oligoklonaalisiksi verrattuna luonnossa esiintyviin polyklonaalisiin vasta-aineisiin, koska ne on kehitetty immu-30 nogeenia vastaan, jolla on suhteellisen vähän epitooppeja käsittelemättömän EBNA-molekyylin epitooppeihin verrattuna. Sen seurauksena tämän keksinnön mukaiset reseptorit sitoutuvat polypeptidin epitooppeihin, kun taas EBNA:a vastaan syntyneet luonnossa esiintyvät vasta-aineet sitoutuvat epitooppeihin läpi koko EBNA-mole-kyylin.

33 102381

Esimerkkien mukaisia reseptorimolekyylejä, jotka sisälsivät tämän keksinnön mukaisia taulukossa 1 esitettyjä polypeptidejä vastaan kaniineissa synnytettyjä vasta-aineiden sitoutumiskohtia tutkittiin immunoblotting-menetelmillä, joita kuvaavat Towbin et ai. julkaisussa Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 76:4350-4354 (1979) ja Bil-5 lings et ai. julkaisussa Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 80:7104-7108 (1983). Lisää yksityiskohtia esitetään materiaaleja ja menetelmiä koskevassa kappaleessa (III).

Todettiin, että kaikki tämän tutkimuksen polypeptidit synnyttivät kaniinin anti-poly-peptidivasta-aineita, kun ne oli kytketty johonkin proteiinikantajaan konjugaattina ja siirretty tehokkaina määrinä isäntäkaniineihin ympissä, kuten tuonnempana kuva-10 taan. Nämä reseptorimolekyylit tunnistivat käsittelemättömän EBNA-proteiinin, joka oli eristetty EBV-transformoiduista ihmisen B-lymfoblastisolulinjoista WI-L2, Raji ja Daudi. Näiden tutkimusten tulokset on esitetty osittain kuviossa 2. Vertailututkimuksissa proteiiniekstrakteista, jotka olivat peräisin B-lymfosyyteistä, jotka olivat negatiivisia EBV-infektiolle (BJAB-soluja; saatavilla Scripps Clinic and Re-15 search Foundationilta, La Jolla, CA) ei onnistuttu saamaan anti-polypeptidiseeru-mien kanssa reagoivia raitoja. Nämä tulokset osoittavat, että tämän keksinnön mukaiset esimerkkireseptorimolekyylit reagoivat immunologisesti EBV-infektiospesifi-sen proteiinin kanssa.

Lisäksi todettiin, että kaniinin anti-polypeptidivasta-aineiden immunoreaktiivisuus 20 käsittelemättömään puhtaaseen EBNA-proteiiniin nähden voitiin estää käyttämällä indusoivaa immunogeenistä polypeptidiä antigeeninä, mikä on myös esitetty kuviossa 2. Nämä tulokset osoittavat, että anti-polypeptidi-antiseerumien idiotyypit (vasta-aineiden sitoutumiskohdat) olivat spesifisiä EBNA-antigeenisille determinanteille.

Kaniinin anti-polypeptidi-vasta-ainetta polypeptidille P62 käytettiin vertailevassa 25 tutkimuksessa polypeptidien P27, P62, P60 ja P89 antigeenisen sukulaisuuden selvittämiseksi. Tämä vasta-aine reagoi laajasti ristiin konjugoitujen ja ei-konjugoitujen polypeptidien kanssa tuonnempana kuvattavassa ELISA-analyysissä. Anti-polypep-tidin P62 sitoutuminen polypeptidiin P62 kiinteässä faasissa estyi 98-prosenttisesti, kun vasta-ainetta ensin inkuboitiin polypeptidin P62 kanssa. Samalla tavoin anti-30 polypeptidin P62 sitoutuminen polypeptidiin P62 estyi 81-prosenttisesti polypepti-dillä P60 ja 36-prosenttisesti polypeptidillä P27. Polypeptidi P89 ei estänyt ollenkaan anti-polypeptidin P62 reaktiivisuutta.

Sen määrittämiseksi, tunnistivatko ihmisen EBV-immuuniseerumissa olevat vasta-aineet myös tämän antigeenisen determinantin, suoritettiin vertailukoe käyttäen 35 EBV-immuunin nivelreumapotilaan seerumia (seerumi 1011). Tulokset, jotka on 34 102381 esitetty kuviossa 3, olivat samanlaisia kuin ne, jotka saatiin anti-polypeptidiä P62 käytettäessä. Tämä osoittaa, että polypeptideille P27, P62 ja P60 yhteinen antigeeninen determinantti jäljittelee EBNA:n luonnossa esiintyvää immunogeenistä determinanttia.

5 E. Diagnostiset analyysisysteemit ja -menetelmät

Keksinnön mukaisia polypeptidejä, vasta-aineita ja vasta-aineiden sitoutumiskohtia (reseptoreja), jotka on synnytetty edellä kuvattuja polypeptidejä vastaan, ja menetelmiä voidaan käyttää myös diagnostisiin kokeisiin, kuten immuunikokeisiin. Tällaisia diagnostisia menetelmiä ovat esim. entsyymi-immunoanalyysi, entsyymi-10 multippeli-immunoanalyysi-tekniikka (EMIT), entsyymisidonnainen immunosor-benttitekniikka (ELISA), radio-immunoanalyysi (RIA), immunofluoresenssianalyy-si, joko yksinkertaiset tai kaksois-vasta-ainetekniikat ja muut menetelmät, joissa joko reseptori tai antigeeni merkitään jollakin tunnistettavalla liuskalla tai merkkiaineella. Ks. yleisesti Maggio, Enzyme immunoassay, CRC Press, Cleveland, Ohio 15 (1981) ja M. Goldman, Fluorescent Antibody Methods, Academic Press, New York, N.Y. (1980). Erityisesimerkkejä tällaisista analyysimenetelmistä ja -systeemeistä, joita voidaan käyttää näissä menetelmissä, käsitellään tuonnempana.

1. EBNA-analyysit Tässä tarkastellaan myös erästä menetelmää EBNA:n toteamiseksi kudosnäytteessä. 20 Eräässä yleismenetelmässä otetaan analysoitava kudosnäyte ja se sekoitetaan resep-torimolekyyleihin, jotka sisältävät vasta-aineen sitoutumiskohdan, joka on kehitetty tämän keksinnön mukaista satunnaissekapolymeeripolypeptidiä vastaan. Seosta pidetään yllä ennalta määrätyn ajan, joka on riittävä, jotta reseptorimolekyylit ehtivät reagoida immunologisesti kudosnäytteessä olevan EBNA:n kanssa. Immunologisen 25 reaktion määrä mitataan sitten sen määrittämiseksi, oliko koestettavassa kudosnäytteessä EBNA-molekyylejä.

Eräs esimerkki pakkausmuodossa olevasta diagnostisesta systeemistä, joka on eräs tämän keksinnön aspekteista ja jota voidaan käyttää EBNA:n tunnistamiseen kudosnäytteen alikvootissa sisältää tämän keksinnön mukaisia reseptorimolekyylejä, kuten 30 vasta-aineita, olennaisesti kokonaisia vasta-aineita tai vasta-aineiden sitoutumiskohtia kuten Fab- ja F(ab')2-vasta-aineosia, jotka on synnytetty tämän keksinnön mukaisia polypeptidejä vastaan, yhdessä pakkauksessa. Tämä systeemi sisältää myös merkkiaineen reseptorin ja antigeenin välillä tapahtuvan immunologisen reaktion osoittamiseksi.

35 102381

Tyypillisiä merkkiaineita ovat radioisotoopit, kuten 125I ja 131I, entsyymit, kuten al-kalinen fosfataasi, pipaijuuriperoksidaasi, beta-D-galaktosidaasi ja glukoosioksi-daasi, ja fhiorikromiväriaineet, kuten fluoreseiini ja rodamiini. Merkkiaineet voivat olla suoraan kytkettyinä tämän keksinnön mukaiseen reseptoriin. Merkkiaineet voi-5 vat olla myös kytketyt erilliseen molekyyliin, kuten johonkin toiseen vasta-aineeseen, vasta-aineen sitoutumiskohtaan tai Staphylococcus aureuksen (S. aureus) proteiini Arhan, joka reagoi tämän keksinnön mukaisen reseptorin kanssa (sitoutuu siihen). Eräs erityisesimerkki tällaisesta erilliseen molekyyliin kytketystä merkkiaineesta on 125I-leimattu S. aureuksen proteiini A.

10 Merkkiaineella voidaan tunnistaa immunologinen reaktiotuote ja se on pakattu erilleen reseptorista, kun sitä ei ole kytketty suoraan tämän keksinnön mukaiseen reseptoriin. Kun reseptorimolekyyli sekoitetaan johonkin kudosnäytteeseen, kuten asetonilla kiinnitettyyn perifeerisen veren lymfosyytin (PBL) sivelyvalmisteeseen, se reagoi immunologisesti EBNA:n kanssa, jolloin muodostuu immunologinen reaktiotuo-15 te ja tällöin läsnä oleva merkkiaine osoittaa immunologisen reaktiotuotteen muodostumisen.

Eräs EBNA-diagnostisen menetelmän toteutusmuoto on immunofluoresenssianalyy-si, johon sisältyy jokin vahvistusreagenssi. Tällaisessa analyysissä PBL-sivelyval-miste kiinnitetään asetonilla sileään objektilasiin. Alikvootti vasta-aineita, jotka on 20 synnytetty tämän keksinnön mukaisesti eli kaniineissa, yleensä noin 10 mikrogrammaa - noin 500 mikrogrammaa, saatetaan kosketukseen lasin kanssa käyttäen tunnettua tekniikkaa.

Kun tämän keksinnön mukaiset mahdollisesti ei immunologisesti reagoineet vasta-aineet on huuhdottu pois, mahdolliset ei-spesifiset tarttumiskohdat lasilla suojataan 25 yleensä härän seerumin albumiinilla (BSA), jos niin halutaan. Sitten koelasilla voidaan inkuboida jokin toinen reagenssi (vahvistusaine), kuten komplementti, tai anti-immunoglobuliinivasta-aineita, esim. marsukomplementti.

Tämän toisen inkuboinnin jälkeen mahdollisesti reagoimatta jäänyt vahvistusaine poistetaan huuhtomalla, jolloin jäljelle jää vain se, joka on tarttunut ensiksi mainit-30 tuihin vasta-aineisiin koelasilla. Kolmas reagenssi (merkkiaine), esim. vasta-aine, kuten vuohen anti-marsukomplementti, inkuboidaan sitten koelasilla. Kolmas reagenssi on leimattu kytkemällä se johonkin fluorikromiväriaineeseen kuten fluoreseii-ni-isotiosynaattiin (FITC), rodamiini-B-isotiosyanaattiin (RITC), tetrametyyliroda-miini-isotiosyanaattiin (TRITC), 4,4'-di-isotiosyanostilbeeni-2-2'-disulfonihappoon 35 (DIDS) ja senkaltaisiin, kuten alalla hyvin tiedetään.

36 102381

Mahdollisesti reagoimaton kolmas reagenssi huuhdotaan pois tämän kolmannen in-kuboinnin jälkeen, jolloin jäljelle jäävät mahdolliset FITC-leimatut vuohen anti-marsukomplementtivasta-aineet, jotka tarttuvat komplementtiin koelasilla. FITC-leimattu kolmas reagenssi voidaan tunnistaa käyttämällä fluoresenssimikroskooppia 5 ja näin saada merkki EB V-infektion olemassaolosta.

B-lymfosyyttejä, joiden tiedettiin olevan EBV:n infektoimia, tulkittiin EBNA:n toteamiseksi käyttäen immunofluoresenssianalyysimenetelmää, jota kuvattiin edellä ja kuvataan yksityiskohtaisemmin osassa "Materiaalit ja menetelmät", III. Jokaiselle taulukossa 1 esitetyistä polypeptideistä synnytetyt kaniinin vasta-aineet pystyivät 10 osoittamaan EBNA:n EBV-infektoidussa solulinjassa WI-L2.

Eräs suositeltava diagnostinen systeemi, joka on mieluiten pakkausmuodossa ja jota voidaan käyttää edellä mainitun analyysimenetelmän suorittamiseen, käsittää erikseen pakattuina (a) tämän keksinnön mukaisia reseptoreita (vasta-aineita), jotka reagoivat immunologisesti EBNA.n kanssa, (b) jonkin toisen vahvistavan reagenssin, 15 kuten jonkin komplementin, esim. marsukomplementin, anti-immunoglobuliini-vasta-aineita tai S. aureuksen proteiinin A, joka reagoi reseptorin kanssa, ja (c) jonkin merkkiaineen, joka voi olla kytketty suoraan vahvistusaineeseen tai olla jonkin erillisen molekyylin osa, kuten jokin vasta-aine tai vasta-aineen osa, joka reagoi vahvistusaineen kanssa. Merkkiaine antaa suoraan signaalin reseptorimolekyylin ja 20 EBNA:n välisestä reaktiosta vahvistusaineen välittämänä.

Tässä kuvattujen diagnostisten systeemien reseptorimolekyylit ja erilliset merkkiaineet, samoin kuin edellä kuvattu vahvistusaine voivat olla liuoksessa, kuten nestemäisenä dispersiona tai olennaisilta osiltaan kuivana jauheena, esim. lyofilisoidussa muodossa. Kun merkkiaine on vahvistusaineesta erillään oleva molekyyli, merkkiai-25 ne on mieluiten pakattu erikseen. Kun merkkiaine on jokin entsyymi, entsyymisub-straatti voidaan myös toimittaa erikseen pakattuna systeemissä. Jokin kiinteä kantaja, kuten edellä kuvattu objektilasi, yksi tai useampi puskuri ja asetoni voivat myös kuulua erikseen pakattuina tähän diagnostiseen analyysi systeemiin.

Tässä diagnostisten systeemien yhteydessä käsitellyt pakkaukset ovat diagnostisissa 30 systeemeissä tavallisesti käytettyjä pakkauksia. Tällaisia pakkauksia ovat lasi- ja muovipullot (esim. polyeteeni, polypropeeni, polystyreeni ja polykarbonaatti), ampullit, muovi- ja muovi-foliolaminaattikotelot ja senkaltaiset.

Kokonaisten, käsittelemättömien, biologisesti aktiivisten vasta-aineiden käyttö ei ole tarpeen monissa diagnostisissa systeemeissä, kuten edellä kuvatussa immunofluore- 37 102381 senssikoeessa. Sen sijaan voidaan käyttää pelkästään vasta-ainemolekyylin immuno-logisesti aktiivista, idiotyypin sisältävää antigeeniin tarttuvaa ja sen tunnistavaa re-septorikohtaa, so. vasta-aineen tartuntakohtaa. Esimerkkejä tällaisista vasta-aineen tarttumiskohdista ovat alalla hyvin tunnetut Fab- ja F(ab')2-vasta-aineosat, jotka val-5 niistetään proteolyysillä käyttäen papaiinia ja pepsiiniä, vastaavasti, kuten alalla hyvin tiedetään.

2. Analyysit anti-EBNA-vasta-aineiden tunnistamiseksi (a) Analyysit yleensä

Toinen tämän keksinnön mukainen diagnostinen menetelmä on jokin sellainen ana-10 lyysi kuten ELISA-analyysi, jolla tunnistetaan anti-EBN A-vasta-aine itä jossakin vasta-ainetta sisältävässä nestemäisessä kudosnäytteessä. Tässä käytetään jotakin tämän keksinnön mukaista EBV-homologista tai CMV-homologista polypeptidiä, kuten polypeptidiä P62, Cl, C2, C3, antigeeninä ja se on sidottu (adsorboitu) tai muulla tavoin kytketty tai kiinnitetty kiinteään matriisiin, kuten verkkoutettuun 15 dekstraaniin, jota on saatavissa kauppanimellä SEPHADEX Pharmacia Fine Chemi-calsilta (Piscataway, New Jersey), agaroosiin, lasihelmiin, polyvinyylikloridiin, po-lystyreeniin, verkkoutettuun akryyliamidiin, nitroselluloosaan, mikrotiitterilevyn kuoppiin tai mittatikkuun tai lusikkaan kiinteän alustan muodostamiseksi.

EBV- tai CMV-homologinen polypeptidi sekoitetaan testattavaan nestemäiseen ku-20 dosnäytteeseen. Näin muodostettua immunoreaktioseosta inkuboidaan ennalta määrätty aika, joka on riittävä, jotta mahdolliset kudosnäytteessä läsnä olevat anti-EBNA-vasta-aineet ehtivät reagoida immunologisesti polypeptidin kanssa. Sitten tämä immuunireaktio määritetään käyttäen merkkiainetta, joka osoittaa anti-EBNA-vasta-aineiden läsnäolon testattavassa kudosnäytteessä.

25 Eräässä ELISA-esimerkissä, jossa käytetään edellä kuvattua menetelmää, käytetään kiinteää alustaa, joka muodostuu jostakin tämän keksinnön mukaisesta EBV- tai CMV-homologisesta polypeptidistä, joka on adsorboitu (kiinnitetty) johonkin kiinteään alustaan, kuten polystyreenistä tai polyvinyylikloridista valmistetun 12- tai 96-kuoppaisen mikrotiitterilevyn kuoppiin, himmeän kaksikuoppaisen muovilusikan 30 kuoppiin, jollaista kuvataan tuonnempana kappaleessa "Materiaalit ja menetelmät", ja senkaltaisiin kiinteisiin alustoihin. Ei-spesifiset tarttumiskohdat kiinteällä matriisilla suojataan sitten tyypillisesti jollakin proteiinilla, joka ei sisällä sekvenssiä, johon anti-EBNA-vasta-aineet tarttuvat tai joiden kanssa ne reagoivat immunologisesti, kuten härän seerumin albumiinilla (BSA). Tarttumatta jäänyt polypeptidi ja BSA 35 poistetaan matriisista huuhtelemalla.

38 102381

Jokin kudosnäytteen, kuten ihmisen syljen, seerumin, veren tai plasman, alikvootti sekoitetaan edellä kuvattuun kiinteään alustaan, jolloin muodostuu immunoreaktio-seos, joka sisältää kiinteän ja nestemäisen faasin. Kiinteä/nestefaasiseosta inkuboi-daan tarpeeksi kauan (esim. 2-60 minuuttia), jotta mahdolliset anti-EBNA-vasta-5 aineet ehtivät reagoida immunologisesti polypeptidiantigeenin kanssa ja muodostaa kiinteään faasiin sidotun immunologisen reaktiotuotteen. Sen jälkeen kiinteä faasi ja nestefaasi yleensä erotetaan.

Sitten lisätään liuos, jossa on toinen, leimattu, merkkiainetta sisältävä vasta-aine, vasta-aineen sitoutumiskohta tai S. aureuksen proteiini A, joka reagoi ensiksi maini-10 tun anti-EBNA-vasta-aineen kanssa, kiinteään faasiin, jolloin muodostuu toinen kiinteä/nestefaasi-immunoreaktioseos. Eräs esimerkki toisesta vasta-aineesta on pi-parjuuriperoksidaasilla (HRPO) leimattu vuohen anti-ihmis-Ig-vasta-aine, jossa ensiksi mainitut vasta-aineet ovat peräisin ihmisen kudosnäytteestä. Käyttökelpoisia entsyymileimoja ovat lisäksi alkaliset fosfaasit, beta-D-galaktosidaasi ja glukoosi-15 oksidaasi. Seos, joka muodostuu kiinteästä faasista ja toisesta, leimatusta vasta-aineliuoksesta, säilytetään (inkuboidaan) ennalta määrätyn ajan (esim. 2-30 minuuttia), joka on riittävä, jotta muodostuu toinen, kiinteään faasiin sidottu immunologinen reaktiotuote ensiksi mainitun vasta-aineen ja merkkiainetta sisältävän yksikön välillä, kuten immunologinen reaktio kahden vasta-aineen välillä. Sen jälkeen kiin-20 teä faasi ja nestefaasi erotetaan.

Edellä kuvattu toinen vasta-aine voi myös olla spesifinen vain yhdelle immunoglo-buliiniluokista (esim. IgG, IgM, IgE, IgA tai IgD) ja reagoida sen kanssa, kuten muriini-anti-IgG, anti-IgM- tai anti-IgA-monoklonaaliset vasta-aineet tai niiden sitoutumiskohdan sisältävät osat. Tällaiset vasta-aineet antavat mahdollisuuden iden-25 tifioida kudosnäytteessä läsnä olevan anti-EBNA-vasta-aineen immunoglobuliini-luokan, kuten tuonnempana taulukoissa 6-10 on esitetty. Lisäksi toinen vasta-aine tai vasta-aineen tarttumiskohta voi olla spesifinen ja reagoida immunologisesti vain toisen kahdesta immunoglobuliini-kevytketjutyypistä (kappa tai lambda) kanssa. Nämä vasta-aineet antavat mahdollisuuden identifoida kudosnäytteessä läsnä olevan 30 immunoglobuliinimolekyylin isotyypin.

Sen jälkeen kiinteään faasiin lisätään liuos, joka sisältää entsyymileiman substraatin, kuten vetyperoksidin peroksidaasia varten, ja jonkin värjäytymisen aikaasaavan väriaineen prekursorin, kuten o-fenyleenidiamiinin tai p-nitrofenyylifosfaatin, alkalista fosfataasia varten, ja tätä seosta ylläpidetään vielä ennalta määrätty aika. Kun ennal-35 ta määrätty aika (esim. 60 minuuttia) on kulunut, voidaan sitten määrittää optinen 39 102381 tiheys ennalta valitulla aallonpituudella (esim. 490 tai 405 nanometrillä) ja verrata sitä verrokin optiseen tiheyteen sen määrittämiseksi, onko kudosnäytteessä läsnä anti-EBNA-vasta-aineita.

Edellä selitetyn kokeen eräässä toisessa toteutusmuodossa käytetään kahta kiinteää 5 alustaa. Kumpikin kiinteä alusta käsittää jonkin EBV-homologisen satunnaisseka-polymeeripolypeptidin kiinnitettynä johonkin kiinteään matriisiin.

Ensimmäinen alikvootti potilaan kudosnäytteestä, kuten verestä, plasmasta tai seerumista, lisätään ensimmäiseen kiinteään alustaan, jolloin muodostuu kiinteä/neste-faasiseos. Seosta ylläpidetään ennalta määrätty aika (esim. noin 2-30 minuuttia), jo-10 ka on riittävä, jotta näytteessä mahdollisesti läsnä olevat anti-EBNA-vasta-aineet ehtivät reagoida immunologisesti polypeptidin kanssa ja muodostaa kiinteään faasiin sidotun immunologisen reaktiotuotteen, joka sisältää anti-EBNA-vasta-aineita. Samanlaiset vaiheet suoritetaan potilaan nestemäisen kudosnäytteen toisella alikvoo-tilla ja toisella kiinteällä alustalla. Ensimmäinen ja toinen alikvootti voidaan tietysti 15 sekoittaa niiden vastaaviin kiinteäfaasialustoihin missä tahansa järjestyksessä ja olennaisesti samanaikaisesti.

Kun edellä mainituista sekoitus- ja ylläpitovaiheista saadut kiinteät ja nestemäiset faasit on erotettu, ensimmäinen kiinteä alusta ja mahdolliset sen immunologisessa reaktio-tuotteessa läsnä olevat kiinteään faasiin sitoutuneet anti-EBNA-vasta-aineet 20 sekoitetaan jossakin vesipitoisessa väliaineessa leimattuihin anti-ihmis-IgG-vasta-aineisiin. Tätä seosta ylläpidetään ennalta määrätty aika, joka on riittävä, jotta anti-IgG-vasta-aineet ehtivät reagoida immunologisesti mahdollisten läsnä olevien kiinteään faasiin sitoutuneiden ihmis-IgG-vasta-aineiden kanssa. Toinen kiinteä kantaja ja mahdollisesti läsnä olevat kiinteään faasiin sitoutuneet vasta-aineet sekoitetaan 25 samalla tavoin ja inkuboidaan leimattujen anti-ihmis-IgM-vasta-aineiden kanssa.

Sen jälkeen määritetään leimattujen anti-IgG-vasta-aineiden ja anti-IgM-vasta-ainei-den suhteelliset osuudet. Kuten tuonnempana taulukoiden 6-10 yhteydessä huomautetaan, se, että leimattuja anti-IgM-vasta-aineita on läsnä suhteellisesti suurempi määrä kuin anti-IgG-vasta-aineita, osoittaa, että potilas on EBV-IM-infektion akuu-30 rissa vaiheessa, kun taas se, että anti-IgG-vasta-aineita on läsnä suhteellisesti suurempi määrä kuin anti-IgM-vasta-aineita, osoittaa, että potilas on taudin toipilas-vaiheessa. Suunnilleen samat määrät anti-IgM-vasta-aineita ja anti-IgG-vasta-aineita osoittavat, että potilas on menossa akuutista vaiheesta toipumisvaiheeseen.

Λ 40 102381

Keksinnön eräs toinen toteutusmuoto käsittää pakkausmuodossa olevan diagnostisen systeemin, joka sisältää jonkin kiinteän alustan, joka muodostuu jostakin kiinteästä matriisista, kuten polystyreeniä olevasta 12-kuoppaisesta mikrotiitteriliuskasta tai 2-kuoppaisesta "lusikasta", ja jostakin tämän keksinnön mukaisesta EBV- tai CMV-5 homologisesta polypeptidistä, joka on absorboitu (sidottu) tai muulla tavoin kiinnitetty johonkin kiinteään matriisiin, kiinteän matriisin muodostamiseksi. Tämä systeemi sisältää mieluiten myös erikseen pakattuja anti-ihmis-Ig-vasta-aineita, joihin on kytketty merkkiaineita, kuten peroksidaasilla leimattuja vuohen anti-ihmis-Ig-vasta-aineita, ja se voi sisältää myös substraatin kytkettyjä merkkiaineita varten, 10 kuten vetyperoksidia, ja jotakin värin muodostavaa väriaineen prekursoria, kuten o-fenyleenidiamiinia, edelleen erillisissä pakkauksissa. Nämä anti-ihmis-Ig-vasta-aineet voivat olla vasta-aineita, jotka reagoivat immunologisesti spesifisesti vain ihmisen IgM-, IgG-, IgA- tai IgE-vasta-aineen kanssa tai kaikkien ihmisen vasta-aineiden kanssa, kuten edellä huomautettiin. Stabiloitua vetyperoksidia voi myös 15 olla mukana pakkauksessa tai se voidaan toimittaa loppukäyttäjälle. Puskurisuoloja, joita voidaan käyttää tätä systeemiä käyttävässä analyysissä, voi myös olla mukana yhdessä tai useammassa erillisessä pakkauksessa kuivassa tai nestemäisessä muodossa. Erillisiä pakkauksia, jotka sisältävät ihmisen anti-EBNA-vasta-aineita ja ihmisen vasta-aineita, joissa ei ole anti-EBNA-vasta-aineita, (ihmisen normaaleja 20 vasta-aineita), voi myös sisältyä pakkaukseen vastaavasti positiivisina tai negatiivisina verokkeina. Pakkaus sisältää edellä mainittuja aineosia määrät, jotka riittävät vähintään yhteen analyysiin, ja analyysi anti-EBNA-vasta-aineiden tunnistamiseksi jossakin kudosnäytteessä, kuten seerumissa, voidaan suorittaa tällä diagnostisella systeemillä käyttäen edellä kuvattua menetelmää.

25 (b) Analyysi EBV-IM:n tunnistamiseksi

Erästä ELISA-esimerkkianalyysiä, joka oli samanlainen kuin edellä kuvattu ja jota kuvataan yksityiskohtaisesti tuonnempana kappaleessa "Materiaaleja ja menetelmiä" (III), käytettiin anti-polypeptidi-immunoglobuliinin seulomiseksi 91 henkilön seerumista anti-EBNA-positiivisilla stereotyypeillä käyttäen edellä kuvattua anti-30 komplementti-immunofluoresenssimenetelmää (ACIF). Kim seerumit tutkittiin 1:20-laimennoksina, kaikki 91 osoittautuivat positiivisiksi (sitoutuivat) polypeptideille P27, P62, P60 ja F16, F14 ja F15. Suurempinakin laimennoksina 1:320 83 91:sta EBNA-positiivisesta seerumista reagoi immunologisesti polypeptidin P62 kanssa ELISA-analyysissä. Näyttää siis olevan erinomainen korrelaatio ACIF:11a todetun 35 anti-EBNA-vasta-ainetiitterin ja kunkin seerumin anti-peptidiaktiivisuuden välillä.

41 102381

Lisäksi tulokset osoittavat erinomaisen korrelaation AC IF -menetelmän ja keksinnön mukaisen ELISA-menetelmän, joka on yksinkertaisempi ja helpompi käyttää, välillä. Lisäksi tulokset osoittavat vielä tämän keksinnön mukaisten polypeptidien käyttökelpoisuuden diagnostisiin kokeiseen anti-EBNA-vasta-aineiden toteamiseksi.

5 Alla oleva taulukko 5 esittää kahdelta henkilöltä (SB ja MV) peräisin olevan seerumin reaktiivisuudet ennen ja jälkeen EBV:n indusoiman infektiöösin mononukleoosin (IM; so. EBV-IM). Molemmissa tapauksissa vasta-aineita, jotka sitoutuvat polypeptideihin P27, P62 ja P60, ei todettu ennen infektiota, mutta ne ilmestyivät myöhemmin. Sitävastoin kumpikaan näistä henkilöistä ei kehittänyt vasta-aineita, 10 jotka tarttuvat polypeptidiin P89.

Lisätutkimuksessa varastoituja seerumeita, jotka olivat peräisin 27 aikaisemmin raportoidulta ei-EBV-immuunilta donorilta [Catalano ym., J. Clin. Invest., 65:1238-1245 (1980)], seulottiin sen määrittämiseksi, tapahtuuko sitoutumista polypeptideihin P62 ja P60 edellä kuvatussa ELISAssa. Seerumien EBV-immuunitila määritet-15 tiin Epstein-Barrin viruksen kapsidi-antigeenin (VCA) läsnäolon tai puuttumisen avulla. Henkilöt, joiden seerumissa ei ole VCA:n vasta-aineita (VCA'), eivät olleet koskaan saaneet EBV-tartuntaa. VCA-positiiviset (VCA+) henkilöt olivat saaneet EBV-tartunnan ja heidän seerumissaan esiintyi yleensä pieni määrä anti-EBNA-vasta-aineita. Yksikään seerumeista ei osoittautunut merkittävän reaktiiviseksi mil-20 lekään polypeptidille, kuten alla olevasta taulukosta 5 näkyy.

Taulukko 5

Vasta-aineet EBNA-peptidejä vastaan ihmisen seerumeissa1

Potilas OD405XIO3, joka saatiin2 potilaiden vasta-aineilla peptidejä vastaan P27 P62 P60 P89 VCA+ normaali l3 155 958 154 23 VCA+normaali 23 516 819 145 16 SB ennen mononukleoosia 11 13 51 9 SB mononukleoosin jälkeen 33 514 115 23 MV ennen mononukleoosia 15 77 72 29 MV mononukleoosin jälkeen 105 631 162 25

VCA'normaaleja (n=27)4 67±235 ND6 45±18 ND

42 102381 1 Kaikki seerumit testattiin l:20-laimennoksina.

2 Optinen tiheys mitattuna 405 nanometrin valon aallonpituudella 30 minuutin kuluttua substraattien inkuboinnista.

3 VCA+-seerumit henkilöiltä, joilla ei ollut kliinisiä oireita EBVrhen liittyvästä 5 sairaudesta.

4 Seerumit 27 henkilöltä, joilla ei ollut kliinisiä oireita aikaisemmin sairastetusta tai nykyisestä EBV:hen liittyvästä taudista, koska heiltä puuttuivat vasta-aineet VCA:lle.

5 Keskimääräinen optinen tiheys ± yksi keskipoikkeama.

10 6 Ei suoritettu.

ELISAn ja ACIF-diagnostiikkamenetelmän korrelaation tutkimiseksi infektion kuluessa varastoituja college-ikäisten opiskelijoiden seerumeita, jotka oli kerätty jaksottaisesti infektiöösin mononukleoosin (IM) puhkeamisen jälkeen, tutkittiin edellä kuvatulla ELISA-testillä käyttäen polypeptidiä P62. Kaikissa opiskelijoissa kehittyi 15 anti-EBNA-tiittereitä 1 kuukauden - 1 vuoden kuluessa infektiosta klassisella menetelmällä eli ACIF:lla mitattuna.

Puolella henkilöistä anti-P62-vasta-aineet nousivat samansuuntaisesti vastaavan an-ti-EBNA-tiitterin kanssa, kuten potilaasta 15 on osoitettu kuviossa 4. Toisella puolella henkilöistä vasta-aineita polypeptidiä P62 vastaan todettiin ensimmäisen kuu-20 kauden kuluessa oireiden puhkeamisesta, kun taas nämä vasta-aineet todettiin myöhemmin ACIF-tekniikkaa käytettäessä. Nämä tulokset on esitetty potilaista 14 ja 2 kuviossa 5. Anti-P62-vasta-aineet olivat siis todettavissa tämän keksinnön mukaista ELISAa käyttäen ennen kuin anti-EBNA-vasta-aineet olivat todettavissa standardinmukaisella anti-komplementti-immunofluoresenssikokeella.

25 Sen immunoglobuliiniluokan erottelemiseksi, josta henkilön immuunivaste pääasiassa aiheutuu annettuna ajankohtana infektiöösin mononukleoosin aikana, ELISAssa käytettiin ihmis-IgG:lle tai ihmis-IgM:lle spesifisiä toisia (indikoivia) vasta-aineita, kuten osassa "Materiaaleja ja menetelmiä" (III) kuvataan. Taulukossa 6 esitetään ' tulokset tästä tutkimuksesta, jossa käytettiin kahden henkilön seerumeita, jotka oli 30 otettu EBV-infektion eri ajankohtina ja mitattiin polypeptidejä P62 vastaan ELISAssa.

Taulukko 6 43 102381

Anti-peptidiaktiivisuus, joka todettiin ELISAssa käyttäen polypeptidiä P62, mononukleoosi-infektion jälkeen

Aika infektion Potilas MV Potilas 15 jälkeen IgM1 IgG2 IgM1 IgG2

Ennen infektiota 1033 74 ND4 ND

1 viikko 245 80 152 113 1 kuukausi 87 37 225 118 3 kuukautta 136 60 208 118 12 kuukautta ND ND 249 375 21 kuukautta 145 600 185 994 5 1 Potilaan IgM-taso todettiin käyttäen toista ihmis-IgM:lle spesifistä vasta- ainetta.

2 Potilaan IgG-taso todettiin käyttäen toista ihmis-IgG:lle spesifistä vasta-ainetta.

3 Optinen tiheys mitattuna 405 nanometrin valon aallonpituudella.

10 4 Ei tehty.

Tätä ELISA-menetelmää käyttäen nousu, vaikka pieni, IgM-vasta-ainearvoissa on toistettavissa ja se todettiin kaikissa testatuissa peräkkäisissä seerumeissa. ELISA-analyysillä niitattu immuunivaste on normaali siinä suhteessa, että IgM ilmestyy tavallisesti ennen IgG:tä EBV-infektion aikana. IgM-vasta-aineiden ilmestyminen en-15 nen IgG-vasta-aineita näkyy erityisen hyvin potilaalla 15 taulukossa 6. Edellä olevat tulokset osoittavat jälleen, että EBV-infektio aiheuttaa vasta-aineiden, jotka reagoivat ainakin yhden tämän keksinnön mukaisen polypeptidin kanssa, tuotannon.

Laajemmassa anti-polypeptidi-ELISA-tutkimuksessa edellä kuvattu 19 VCA"-seeru-min saija seulottiin polypeptidejä P27, P62, P60, F12, F13, F14, F15 ja F16 vas-20 taan. Minkään VCA* -seerumeista ei todettu reagoivan positiivisesti. Tyypilliset tulokset on esitetty alla olevassa taulukossa 7. VCA-vasta-aineille positiivilta kliinisesti normaaleilta henkilöiltä saatuja seerumeita tutkittiin kahtena laimennoksena. Tyypilliset tulokset, jotka on esitetty alla olevassa taulukossa 7, osoittavat, että kaikki VCA+-henkilöt olivat positiivisia eli heillä oli vasta-aineita, jotka sitoutuivat 25 jokaiseen polypeptideistä.

44 102381

Joukon nivelreumapotilaita (RA) seerumit seulottiin myös ELISA-menetelmällä. Näistä tuloksista on myös yhteenveto taulukossa 7.

Taulukko 7 ELISAlla määritetyt keskimääräiset anti-peptiditasot ihmisen seerumeissa

Potilasryhmä Seerumin Keskimääräinen vasta-aineaktiivisuus poly- numero peptidejä vastaan1 P27 P62 P60 F12 F13 F16

Nor2 1/203 19 22 17 77 34 41 47

Nor+4 1/203 26 521 854 394 128 70 733

Nor+4 1/3203 48 90 223 70 37 37 166 A+5 1/203 28 597 999 564 118 113 843 RA+5 1/3203 48 126 348 122 50 50 231 5 1 Aktiivisuus mitattu optisena tiheytenä 405 nanometrin valon aallonpituudella 30 minuutin kuluttua seerumin inkuboinnista.

2 VCA-negatiivisia henkilöitä.

3 Laimennos, jona seerumit testattiin.

10 4 VCA-positiivisia henkilöitä.

5 Henkilöitä, joiden oli diagnosoitu potevan nivelreumaa.

Ero normaalien, VCA-positiivisten (verrokki) ja RA-potilaiden välillä voidaan parhaiten nähdä seerumin laimennoksella 1:320. Vasta-ainetasot olivat RA-potilailla merkittävästi korkeammat jokaisella testatulla polypeptidillä tällä laimennoksella, 15 kun analyysi suoritettiin käyttäen Wilcox Rank Sum -menetelmää (merkittävyystaso suurempi kuin 99 %).

Potilaita, joilla oli Sjögrenin syndrooma, systeeminen lupus erythematosus (SLE) ja progressiivinen systeeminen skleroosi (PSS) seulottiin myös sekä suurina että pieninä seerumilaimennoksina. Ainoa ero, joka havaittiin näiden potilasryhmien ja nor-20 maalien välillä oli PSS-potilaiden suhteellisen korkea keskitiitteri koskien polypep-tidejä P27, P62, P60, F16, F14 ja F15. Näiden tulosten uskotaan mahdollisesti johtuvan jostakin aikaisemmasta EBV:hen liittyvästä infektiosta tai EBV:n osallisuu-: desta noissa autoimmuunisairauksissa. Nämä tulokset eivät vähennä ELISAn käyttö kelpoisuutta diagnostisena menetelmänä.

45 102381

IgM- ja IgG-vasta-aineiden määrien suhdetta voidaan siis käyttää hyväksi määritettäessä sairauden kysymyksessä olevaa vaihetta jollakin henkilöllä (1) edellä kuvatun IgM-anti-EBNA-vasta-ainetuotannon, joka ensin nousee ja sitten laskee, ja jonka kanssa sitten menee päällekkäin ja seuraa aikanaan IgG-anti-EBNA-vasta-ainetuo-5 tannon nousu, vaiheittaisen vasteen ja (2) sen seikan valossa, että tämä vaiheittainen vaste noudattaa IgM-vasta-aineiden normaalia esiintymistasoa sairauden varhaisessa vaiheessa, jota seuraa IgG toipumisvaiheessa.

Taulukon 6 tulokset siis osoittavat, että taudin varhaisessa akuutissa vaiheessa anti-EBNA-IgM-vasta-aineita on suurempi määrä kuin anti-EBNA-IgG-vasta-aineita.

10 Sitten IgG:n taso alkaa nousta toipumisen aikana, kun taas IgM:n taso laskee molempien tason mennessä ristikkäin eli IgG-tason suhde IgM-tasoon on yksi jossakin pisteessä akuutin vaiheen ja paranemisvaiheen (toipilasvaiheen) välillä.

Nämä havainnot pitävät yhtä tavallisten havaintojen kanssa primaari-immunisaatioiden ja taudin vaiheiden kohdalla yleensä [ks. esim. Hood ym., Immunology, The 15 Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc., Menlo Park, CA (1978) sivut 39-46; Mims and White, Viral Pathogenesis and Immunology, Blackwell Scientific Publications, Boston (1984), sivut 105-106, ja Immunology, toinen painos, Bach ed., John Wiley & Sons, New York (1982), sivut 337-339]. Nämä havainnot ovat vastakkaisia anti-VCA-IgM- ja -IgG-vasta-aineita koskevalle tilanteelle, jossa IgG-20 vasta-aineita esiintyy enemmän infektion varhaisessa vaiheessa, esim. kahden päivän kuluttua, IgM-vasta-aineiden määrän noustessa, ollessa suurimmillaan ja laskiessa alhaisemmille tasoille noin kolmen kuukauden kuluessa ja kadotessa useiden kuukausien kuluttua taudin akuutin vaiheen jälkeen [Cecil, Textbook of Medicine, Beeson ym., toim., W.B. Saunders Co., Philadelphia, (1979), sivut 264-268], 25 Nämä havainnot ovat myös joissakin suhteissa vastakkaiset havainnoille Henle ym., J. Infect. Dis., 130:231-239 (1974). Nämä tutkijat raportoivat matalia anti-EBNA-vasta-aineiden tiittereitä noin 2-4 viikkoa taudin alkamisen jälkeen harvoista seerumeista ja matalia, mutta suhteellisesti korkeampia tiittereitä alkaen toisesta kuukaudesta taudin puhkeamisen jälkeen aina heidän tutkimuksensa päättymiseen eli 12 30 kuukauteen taudin puhkeamisen jälkeen aina vain useammista seerumeista mitä enemmän aikaa kului sairauden puhkeamisesta. Tekniikat, joita nämä tutkijat käyttivät, olivat suhteellisen epäherkkiä ja luultavasti niissä mitattiin vain IgG-vasta-ainei-ta. Siten vasta-aineiden todettavissa olevaa ilmenemistä paranemisvaiheessa voitiin odottaa. Myöhemmin Adniman ym., luku 33 julkaisussa Concepts in Viral Patho-35 genesis II, Notkins and Oldstone, toim., Springer-Verlag, New York (1986), sivu 46 102381 326, raportoivat vasta-aineluokkaa identifioimatta, että anti-EBNA-vasta-aineita alkaa tavallisesti ilmestyä kuukauden - kahden kuluttua infektion puhkeamisesta.

Taulukossa 6 esitetyt tulokset on lisätty osoittamaan vielä IgG- ja IgM-anti-EBNA-vasta-aineiden suhteellisten määrien vertailusta saatava teho EBV-IM:n vaiheen, so. 5 akuutin ja paranemisvaiheen, diagnosoinnissa käyttäen jotakin tämän keksinnön mukaista polypeptidiä antigeeninä näille vasta-aineille. Jotkin näistä tuloksista on esitetty julkaisussa Smith ym., J. Infect. Dis., 154:885-889 (1986, marraskuu), jonka sisältö liitetään tähän viitteenä. Taulukossa 8 on esitetty muutamia esimerkkituloksia tästä julkaisusta.

Taulukko 8 47 102381

Serologisia tuloksia potilaista, joilla on akuutti infektiöösi mononukleoosi Päiviä puhkeamisen OD 4901 Suhde

jälkeen IgG IgM IgG/lgM

Potilas l2 1 0,011 0,189 0,058 29 0,023 0,527 0,043 95 0,162 0,329 0,492 184 0,552 0,245 2,253 373 0,858 0,152 5,644

Potilas 22 17 0,125 0,682 0,183 28 0,167 0,674 0,247 68 0,112 0,459 0,244 194 0,233 0,596 0,390 404 0,674 0,665 1,013

Potilas 82 8 0,319 1,046 0,305 38 0,165 0,696 0,237 109 0,141 0,603 0,234 404 1,304 0,562 2,320

Potilas li3 2 0,005 0,055 0,091 23 0,016 0,702 0,023 372 0,878 0,643 1,365 1519 1,079 0,199 5,422 OD 490 = optinen tiheys 490 nanometrillä mitattuna kuten osassa "Materiaale- 5 ja ja menetelmiä", III K on selitetty.

2

Seerumeja heterofiili-negatiivisilta luovuttajilta.

3

Seerumi heterofiili-positiiviselta luovuttajalta.

48 102381

Taulukon 8 tulokset osoittavat jälleen IgM-anti-polypeptidi-vasta-aineiden lisääntyvän ja sitten ajan mittaan vähenevän ja IgM-vasta-aineiden vähenemisen vastaavan IgG-anti-polypeptidi-vasta-aineiden lisääntymistä sekä heterofiili-negatiivisilla että heterofiili-positiivisilla potilailla koeajan alussa. Vasta-aineita (IgM ja/tai IgG) 5 EBV:n kapsidi-antigeeneja vastaan oli kaikissa tutkituissa seerumeissa yhtä lukuunottamatta tutkimuksen kaikkiaan 13 potilaalla.

Yhden heterofiili-negatiivisen potilaan ja kahden kolmesta heterofiili-positiivisesta potilaasta seerumeissa oli suhteellisesti korkeammat IgG-anti-EBNA-polypeptidi-vasta-ainetasot vähän taudin puhkeamisen jälkeen. Kuitenkin IgG/IgM-suhde, joka 10 oli alunperin suurempi kuin 1, kasvoi ajan mittaan jokaisella potilaalla, ja seerumi-näytteet osoittivat IgG-anti-polypeptidi-vasta-ainetason yleistä alenemista, johon liittyi viivästynyt päällekkäinen IgG-anti-peptidi-vasta-ainetason nousu. Siten kaikissa tutkituissa seerumeissa IgG-anti-polypeptidi-vasta-aineen ja IgM-anti-polypep-tidi-vasta-aineen kasvava suhde oli merkkinä taudin paranemisvaiheesta, kun IgG-15 vasteiden todettiin olevan suurimmillaan.

Seeruminäytteitä hankittiin 19 henkilöltä, jotka joko oli kliinisesti diagnosoitu IM-potilaiksi tai joiden seerumissa, kun kliinisiä tuloksia ei ollut saatavilla, määritettiin esiintyvän heterofiilisiä vasta-aineita. Nämä näytteet tutkittiin käyttäen tämän keksinnön mukaista ELISA-analyysiä, jossa polypeptidiä P62 käytettiin kiinteään alus-20 taan sidottuna antigeeninä. Näistä seerumeista määritettiin IgG-, IgM- ja IgA-tasot ja anti-EBNA-IgG:n ja -IgM:n suhdetta verrattiin. IgA-tasoissa ei ollut mitään havaittavaa korrelaatiota. Tulokset tästä kokeesta on IgG:n ja IgM:n osalta esitetty taulukossa 9.

Taulukko 9 49 102381

Anti-EBNA-vasta-ainetasot heterofiili-positiivisissa seerumeissa Näyte n:o OD 4901 Suhde

IgG IgM IgG/IgM

1 0,018 0,609 0,029 22 0,055 1,074 0,051 3 0,133 0,412 0,322 4 0,035 0,545 0,064 5 0,087 0,491 0,177 62 0,319 1,046 0,305 7 0,016 0,388 0,041 8 0,315 1,245 0,253 9 0,118 1,255 0,094 10 0,300 0,753 0,039 li3 0,019 0,918 0,020 12 0,002 0,415 0,005 13 0,282 0,928 0,300 14 0,004 0,572 0,007 15 0,007 0,779 0,009 16 0,009 0,396 0,023 17 0,005 0,446 0,011 18 0,002 0,404 0,005 19 0,002 0,730 0,003 1 OD 490 = optinen tiheys 490 nanometrillä mitattuna kuten osassa "Materiaale- 5 ja ja menetelmiä", IIIK on selitetty.

2

Seerumissa oli suhteellisen korkeat IgA-tasot, so. suuremmat kuin 0,300 OD 490:llä.

Taulukon 9 tulokset osoittavat jälleen, että potilailta, jotka olivat taudin aktiivisessa 10 akuutissa vaiheessa, saaduissa seerumeissa IgM-anti-EBNA-vasta-aineiden, jotka sitoutuvat polypeptidiantigeeniin, tasot olivat suhteellisen korkeita verrattuna IgG-tasoihin. Nämä tulokset osoittavat myös korkeampia anti-EBNA-vasta-ainetasoja : verrattuna VCA' -potilailta saatuihin seerumeihin, jotka ovat taulukossa 5. Vähäisten 50 102381

IgG-anti-polypeptidi-vasta-ainetasojen olemassaolo on yhtäpitävä Henlen et ai. havaintojen kanssa julkaisussa J. Infect. Dis., 130:231-239 (1974).

Suunnilleen 10 prosentissa seerumeista, jotka koskevat akuutteja EBV-indusoituja IM-tapauksia, puuttuvat heterofiiliset vasta-aineet konventionaalisilla serologisilla 5 menetelmillä määritettynä. Koska heterofiilisten vasta-aineiden ja anti-EBNA-vasta- aineiden välillä ei pitäisi olla yhteyttä, tutkittiin taulukossa 9 käytetyllä analyysillä vielä joukko seerumeita, jotka oli hankittu heterofiili-negatiivisilta IM-potilailta. Näiden potilaiden oli vahvistettu joko kliinisesti tai tavanomaisilla EBV-serologi-silla menetelmillä sairastavan akuuttia IM:a. Jokaisesta seerumista todettiin positii-10 viset VCA-IgM- ja EBV-varhais-antigeeni-difEuusi(EA-D)tiitterit, joiden yhdessä negatiivisten EBNA-tiitterien kanssa katsotaan tavallisesti olevan akuutin IM:n tuntomerkkinä heterofiilisen vasta-aineen olemassaolosta riippumatta.

Taulukko 10

Anti-polypeptidi-EBNA-tasot heterofiili-negatiivisissa seerumeissa potilailta, joissa 15 oli akuutti tauti

Seerumi OD 4901 Suhde

n:o IgG IgM IgG/IgM

1 0,706 1,449 0,49 2 0,836 1,232 0,68 3 0,182 0,713 0,255 j 4 0,013 0,694 0,018 5 0,351 0,736 0,476 6 0,033 0,841 0,039 7 0,029 0,758 0,038 8 0,011 0,456 0,024 9 0,014 0,538 0,026 . 10 0,163 0,757 0,215 1 Katso taulukon 8 huomautus.

Jokainen seeruminäyte tutkittiin ja todettiin positiiviseksi VCA-IgM:n ja EA-D:n suhteen ja negatiiviseksi EBNA-vasta-aineiden suhteen ACIF:lla.

20 Kaikissa esitetyissä tapauksissa IgG/IgM-suhde oli anti-EBNA-polypeptidi-ELISAssa pienempi kuin 1,0 ja myös pienempi kuin 0,7. Näistä tuloksista on selvää, 51 102381 että anti-EBNA-polypeptidi P62-ELISAlla pystytään tunnistamaan IM heterofiili-negatiivisissa henkilöissä, kun ELISA-tuloksiin sovelletaan diskriminaattoriksi IgG/IgM-anti-polypeptidisuhdetta.

Vielä eräs esimerkki siitä, että heterofiilisten vasta-aineiden esiintyminen ja IgM-5 anti-polypeptidivasta-aineiden esiintyminen eivät kytkeydy toisiinsa, ja anti-poly-peptidien varhaisesta tunnistamisesta saatiin tämän keksinnön mukaisella analyysillä, joka on esitetty tuloksin taulukossa 11. Nämä tulokset täydentävät myös kuviossa 5 esitettyjä tuloksia koskien näiden vasta-aineiden varhaista tunnistamista käyttämällä tämän keksinnön mukaista koetta verrattuna ACIF-menetelmään.

10 Tässä tutkittiin kahdeksan Saijaa pariseerumeita konventionaalisella kaupallisella kokeella heterofiilisten vasta-aineiden toteamiseksi ja anti-polypeptidi P62-ELISAlla. Kaikissa tapauksissa ensimmäinen seerumiajo antoi negatiivisen tuloksen ensiksi mainitulla menetelmällä ja positiviisen tuloksen viimeksi mainitulla menetelmällä. Henkilöillä oli IM:n oireita ensimmäisen näytteen oton aikaan. Kuitenkin 15 näillä henkilöillä IgM-anti-polypeptidi P62-vasta-aineita ilmestyi seerumiin ennen heterofiilisiä vasta-aineita, mikä vahvistettiin konventionaalisella serologiamenetel-mällä. Taulukon kahdessa ensimmäisessä tapauksessa näytteiden ottojen väliset ajat olivat vastaavasti 14 ja 8 päivää.

«

Taulukko 11 52 102381

Anti-polypeptidi P62-vasta-aineita todetaan ennen heterofiilisiä vasta-aineita akuutissa IM:ssa

Potilas n:o OD 4901 Suhde Heterofiili3

IgG IgM IgG/IgM

1 0,122 0,489 0,25 0,399 0,940 0,42 + 2 0,064 0,512 0,125 0,749 1,10 0,68 + 3 0,013 0,364 0,036 0,04 0,592 0,068 + 4 0,009 0,597 0,015 0,038 0,696 0,055 + 5 0,007 0,472 0,015 0,079 0,624 0,13 + 6 0,014 0,363 0,04 0,086 0,937 0,09 + 7 0,009 0,447 0,02 0,021 0,584 0,04 + 8 0,023 0,466 0,05 !: 0,951 0,50 1,9 + 5 1 Katso taulukon 8 huomautus.

Ensimmäinen seerumiajo saatiin akuutin IM:n oireiden esiintyessä. Toinen ajo saatiin samalta henkilöltä vähän myöhemmin. Akuutin IM:n vahvisti kussakin tapauksessa heterofiilisten vasta-aineiden myöhempi läsnäolo.

^ . .

Heterofiilisten vasta-aineiden läsnäolo määritettiin käyttämällä kaupallista pak-10 kausta.

53 102381

Vaikka edellä kuvattuihin suhdeanalyyseihin sisältyykin kvalitatiivinen aspekti siinä mielessä, että niissä määritetään anti-P62-vasta-aineet, niitä käytetään ensisijassa kvantitatiivisesti vahvistamaan anti-P62-IgM- ja -IgG-vasta-aineiden suhteellisia määriä, jotka todettiin ihmisen kudosnäytteissä. Tämän ensisijaisesti kvantitatiivisen 5 analyysin suorittaminen vaatii normaalisti noin 2,5 tuntia sen jälkeen, kun kiinteä-faasialustat on valmistettu.

On kehitetty myös kvalitatiivisempi suhdeanalyysi, jonka suorittaminen vaatii hieman enemmän kuin noin 6 minuuttia kiinteäfaasialustan valmistamisen jälkeen. Tässä analyysissä käytetään samanlaista metodologiaa ja kemiaa kuin edellä kuvatuissa 10 analyyseissä, mutta siinä luotetaan edellä käsitellyillä merkkiaineilla ja substraatilla aikaansaatujen värien voimakkuuksien silmämääräiseen vertailuun anti-peptidi P62-IgG- ja -IgM-vasta-aineiden suhteellisten määrien arvioimiseksi ja siis sen arvioimiseksi, onko taudin vaihe akuutti, toipilasvaihe vai muuttumassa akuutista toipilas-vaiheeksi.

15 Suositeltavissa toteutusmuodoissa kiinteäfaasialusta muodostuu valkoisesta himme-ästä polystyreeni-"lusikka"-matriisista. Kiinteäfaasilusikkamatriisi rakennetaan sellaiseksi, että se käsittää kaksi vierekkäistä kuoppaa, joihin polypeptidi P62 kiinnitetään. Kuopat erottaa toisistaan koholla oleva valli, joka estää nestettä valumasta toisesta kuopasta toiseen.

20 Analyysit anti-IgM- ja anti-IgG-vasta-aineiden toteamiseksi suoritetaan erikseen kuten edellä yleisesti kuvattiin, mutta tässä ne suoritetaan mieluiten rinnakkain (yksi analyysi kutakin vasta-ainetyyppiä kohti kussakin kuopassa) ja olennaisesti saman-: aikaisesti. Lisäksi sen sijaan että määritettäisiin optiset tiheysarvot tai muut leimaa vat indiisiot mekaanisesti, käyttäjä vertaakin kunkin kuopan värin voimakkuuksia 25 silmämääräisesti.

Vaikka tämä analyysi vaatiikin vähemmän kuin noin kymmenesosan edellä kuvatun kokeen viemästä ajasta, se on osoittautunut erittäin spesifiseksi ja herkäksi. Lisäksi 1. sitä voidaan helposti soveltaa käytettäväksi lääkärin vastaanotolla ja potilas voi saa da kokeen tulokset vastaanotolla ollessaan.

30 Tästä kokeesta esitetään lisää yksityiskohtia osassa "Materiaaleja ja menetelmiä", III D.

54 102381 (c) Analyysit EBV-IM:n ja CMV-IM:n tunnistamiseksi

Epstein-Barrin tuma-antigeeni käsittää yli 200 aminohapon, jotka sisältävät ainoastaan aminohappoglysiiniä ja -alaniinia, muodostaman ainutlaatuisen sekvenssin. Näistä sekvensseistä valmistetut peptidit reagoivat immunologisesti VCA-positiivi-5 silta henkilöiltä otetun seerumin kanssa, kuten edellä osoitettiin. Lisäksi eräs tästä sekvenssistä saatu peptidi, P62, reagoi immunologisesti kaikkein voimakkaimmin seerumin kanssa, joka on otettu akuuttia EBV-infektiota sairastavilta potilailta [Rhodes ym., julkaisussa Herpesvirus, R. Rapp ed. Alan R. Liss, New York, s. 487-496 (1984); Rhodes ym., J. Immunology, 134:211-216 (1985); Smith ym., J. Infect 10 Dis., 154:885-889 (1986); Geltosky ym., J. Clin. Lab. Analysis 1:153-162 (1987)]. Potilailla, joilla on akuutti EBV-IM, on IgM-vasta-aineita EBNA-proteiineja kohtaan useissa EBV-positiivisissa solulinjoissa [Geltosky ym., J. Clin. Lab. Analysis 1:153-162 (1987); Rhodes ym., J. Exp. Med 165:1026-10401. mikä todettiin immu-noblotting-menetelmällä.

15 Tuonnempana käsiteltävät tulokset osoittavat, että peräkkäisissä seerumeissa ei ainoastaan potilailta, joilla on EBV-IM, vaan myös potilailta, joilla on sytomegalovi-ruksen (CMV) indusoima mononukleoosin kaltainen tauti (CMV-IM), on IgM-vasta-aineita, jotka suuntautuvat EBNA-P62-epitooppeja vastaan taudin akuutissa vaiheessa. Peräkkäin otetut seeruminäytteet 8 potilaalta, joilla oli akuutti CMV-20 infektio, osoittivat kaikki IgM-anti-P62-vasta-aineiden määrän nousevan jyrkästi taudin akuutissa vaiheessa. Tämä sama vaste oli havaittavissa sekä potilaissa, joilla oli ollut EBV-infektio, että yhdessä potilaassa, joka oli saanut CMV-infektion ennen EBV:tä. Sekä potilailta, joilla oli akuutti EBV-IM, että potilailta, joilla oli akuutti CMV-IM, saatujen seerumien immunoblottaus osoitti, että molemmat virukset indu-25 soivat saman sarjan IgM-vasta-aineita ja että vasta-aineet reagoivat useiden normaalien infektoitumattomissa soluissa olevien soluproteiinien kanssa. Siten näiden IgM-vasta-aineiden läsnäolo diagnosoi joko EBV- tai CMV-indusoidun akuutin infektion.

*: (i) EBV-IM-potilaan peräkkäisissä seerumeissa on IgM-vasta-aineita P62:a ja 30 EBNA-l:tä kohtaan taudin akuutissa vaiheessa

IgM-vasta-aineet, jotka tunnistavat peptidin EBNA P62, todetaan ELISA-analyy-sissä EBV-IM:n akuutin vaiheen aikana [Rhodes ym., julkaisussa Herpesvirus, R. Rapp ed. Alan R. Liss, New York, s. 487-496 (1984); Rhodes ym., J. Immunology, 134:211-216 (1985); Smith ym., J. Infect Dis., 154:885-889 (1986); Geltosky ym., 35 J. Clin. Lab. Analysis 1:153-162 (1987)]. Nämä havainnot vahvistuivat, kun 55 102381 D.B:ltä, potilaalta, jolla oli EBV-IM, otetut peräkkäiset näytteet analysoitiin niiden immunoreaktiivisuuden osalta EBNA P62 ELISA-analyysillä (kuvio 6).

Nämä tulokset osoittavat IgM-vasta-aineiden varhaisen nousun taudin akuutissa vaiheessa (tammi-maaliskuu 1985), mikä vastaa VCA-IgM- ja VCA-IgG-vasta-ainei-5 den (1:2) varhaista nousua ilman anti-EBNA:a traditionaalisella IFA-menetelmällä. Tämän potilaan seerumissa esiintyi IgG-vasta-aineiden P62:a kohtaan hidas nousu, jonka huippu oli maaliskuun - huhtikuun 1985 näytteissä taudin akuutin vaiheen jälkeen. IgG/IgM-suhde nousi yli 0,7:n toukokuussa 1985 otetussa näytteessä, kun potilas oli taudin myöhäisessä toipilasvaiheessa. Tuona ajankohtana anti-EBNA-10 tiitterit nousivat ja VCA-IgM-tiitterit olivat tuskin osoitettavissa konventionaalisella EBV-serologialla.

IgM-luokkaspesifisten vasta-aineiden dramaattinen nousu taudin akuutissa vaiheessa vahvistettiin immunoblotting-tekniikalla (kuvio 7). Samoja seeruminäyteitä, jotka olivat mukana ELISA-analyysissä, käytettiin immunoblottmg-tutkimuksissa EBV-15 transformoidussa B-solulinjassa läsnä olevien antigeenien tunnistamiseksi.

Kuten kuviosta 7 voidaan nähdä, potilaan seerumissa olevat IgM-vasta-aineet tunnistavat 8 suuremman ja pienemmän raidan muodostaman Saijan ekstraktissa. IgM-vasta-aineet suurinta osaa näitä proteiineja kohtaan nousevat kahdessa ensimmäisessä seeruminäytteessä, huippu on kolmannessa näytteessä ja lasku sen jälkeen. 20 Tämä on sama aikajakso, joka havaittiin peptidi-ELISAssa.

Proteiineja, joita IgM-vasta-aineet tunnistavat, ovat EBNA-1 77 kD:n kohdalla sa-: moin kuin saija normaaleja soluproteiineja (raidat 92, 82, 80, 69, 62 ja 58 kD:n kohdalla), jotka sisältävät epitooppeja, jotka liittyvät EBNA-l:n glysiini-alaniini-alueeseen [Rhodes ym., J. Exp. Med., 165:1026-1040 (1987)]. Proteiineja, joilla ei 25 ole EBNA-l:n kanssa yhteisiä sekvenssejä, vastaan suuntautuneiden vasta-aineiden 120 ja 29 kD:ssa [Rhodes ym., J. Exp. Med., 165:1026-1040 (1987)] huippuarvo näyttää osuvan aikaisempaan ajankohtaan. Synteettistä polypeptidiä P62 kohtaan :’· suuntautuvien IgM-vasta-aineiden ja IgM-vasta-aineiden majoriteetin välillä on siis hyvä korrelaatio Westem-blotting-tekniikalla tunnistettuna.

30 IgM-vasta-aineet EBNA-l:tä vastaan (77 kD) potilaassa D.B. ilmestyivät myöhään immunoblotting-analyysin tuloksissa (kuvio 7), havainto, joka käy yksiin EBNA P62 ELISA-analyysin tulosten kanssa. Kuvion 7 immunoblotin vasemmassa reunassa voimakas IgG-vaste 77 kD:n EBNA-raitaa kohtaan VCA-positiiviselta (VCA+), EBNA-1-positiiviselta (EBNA-Γ) henkilöltä on esitetty verrokkina. IgG-anti- 56 102381 EBNA-1-vasta-aineet todettiin bloteissa vasta 51 päivää taudin puhkeamisen jälkeen (neljäs aikapiste), samaan aikaan kuin IgG-vasta-aineet peptidiä vastaan alkoivat nousta.

(ii) Peräkkäiset seerumit potilaalta, jolla oli CMV-IM ja jossa sen jälkeen kehit-5 tyi EBV-IM

Peräkkäisiä seeruminäytteitä potilaalta D.S. tutkittiin myös EBNA P62 ELISAlla ja Westem-blotting-menetelmällä. Tätä potilasta koskevat kliiniset/serologiset tulokset on julkistettu ja klassisella serologialla osoitettiin, että hänellä oli akuutti CMV-infektio, jota seurasi kolme kuukautta myöhemmin akuutti EBV-tauti.

10 Tulokset anti-peptidi-ELISA-tutkimuksista, joissa käytettiin potilaalta D.S. peräjälkeen otettuja seerumeita, on esitetty kuviossa 8. Seerumissa, joka oli otettu potilaalta D.S. CMV-taudin akuutissa vaiheessa, oli korostunut IgM-vaste peptidiä P62 kohtaan ELISAlla määritettynä, juuri kuten potilaalla D.B. hänen akuutin EBV-infektionsa aikana. IgM-anti-peptidisignaali oli korkea kolmessa seeruminäytteessä, 15 jotka oli otettu ensimmäisen taudin aikana ja ne olivat myös koholla toisen sairauden lähtönäytteessä. Ei tiedetä, laskiko vasta-ainetaso kahden sairauden välillä. IgG-vasta-aineita polypeptidiä P62 kohtaan todettiin vasta viimeisessä seeruminäytteessä, joka otettiin vuoden kuluttua toisesta taudista.

Tästä potilaasta otettuja näytteitä tutkittiin myös immuno-blotting-menetelmällä 20 (kuvio 9). IgM-vasta-aineita proteiineja, joiden molekyylipainot olivat 82, 80-77, 69, 62 ja 58 kD, todettiin molemmissa infektioissa. Huomattakoon, että IgM-vasta-aineet tunnistavat samoja antigeenejä kummankin taudin aikana. Immunoblotting-kokeessa mitatut IgM-vasta-ainetasot olivat korkeimmillaan toisen infektion ensimmäisen ja alkuvaiheen aikana ja laskivat sitten, havainto, joka on samanlainen kuin 25 anti-peptidi P62 ELISAssa saatu. IgG-vasta-aine EBNA-l:tä kohtaan ilmestyi vasta viimeisessä ajankohdassa (heikko raita lähinnä normaalia VCA+, EBNA-1+ verrokkia oikeanpuoleisessa raidassa).

: Molemmilla potilailla oli varhainen IgM-anti-peptidi P62-vaste, joka korreloi IgM- vasta-aineiden kanssa useita Westem-blotting-analyysin tuloksissa näkyviä raitoja 30 kohtaan. IgG-anti-peptidi P62-vaste ilmestyi paljon myöhemmin ja se korreloi IgG-vasta-aineiden, jotka ovat spesifisiä EBNA-1-proteiinille, ilmestymiseen. Tämä käy yksiin aikaisemmin raportoidun kanssa [Rhodes ym., julkaisussa Herpesvirus, R. Rapp ed. Alan R. Liss, New York, s. 487-496 (1984); Rhodes ym., J. Immunology, 134:211-216 (1985); Smith ym., J. Infect Dis., 154:885-889 (1986); Geltosky ym., 57 102381 J. Clin. Lab. Analysis 1:153-162 (1987) ja Rhodes ym., J. Exp. Med., 165:1026-1040 (1987)].

Yllättävä havainto on, että CMV-infektio indusoi IgM-vasta-aineita, joilla on nämä samat ominaisuudet. Toisin sanoen IgM-vasta-aineet, joita esiintyy CMV-infektioi-5 den aikana, reagoivat useiden antigeenien kanssa, jotka ovat näennäisesti samankokoisia kuin EBV-infektion aikana esiintyvät antigeenit.

(iii) Seerumit 10 potilaalta, joilla oli akuutti CMV-IM

Kymmeneltä potilaalta saatuja seerumeita tutkittiin ELISAlla ja immunoblotting-menetelmällä sen määrittämiseksi, olivatko EBNA P62:a kohtaan suuntautuneet 10 IgM-vasta-aineet, jotka todettiin potilaan D.S. seerumista, ja immunoblotting-kokeessa saadut vasta-aineet ainutlaatuisia juuri tälle potilaalle vai voitaisiinko tämä vaste todeta myös muissa potilaissa, joilla oli CMV-IM. Kaikilla näillä potilailla oli aikaisemmin ollut EBV-infektio, minkä osoittivat positiiviset IgG-VCA-tiitterit ja positiiviset EBNA-l-tiitterit IFA:lla määritettyinä.

15 Edustavia anti-peptidi P62-tuloksia kahdesta näistä potilaista on esitetty kuvioissa 10A ja 10B. Kaikilla 10 potilaalla esiintyi korostunut IgM-anti-peptidi P62-vasta-aineiden nousu CMV-taudin akuutin vaiheen aikana. IgM-vasta-aineita oli edelleen yhden - kahden kuukauden ajan ja sitten ne palasivat taustatasolle.

Sitä vastoin IgG-anti-peptidi P62-vasta-aineet olivat aluksi positiivisessa arvossa 20 (koska potilaat olivat EBV*, VCA+, EBNA-Γ) ja muuttuivat vain vähän taudin edetessä. Itse asiassa seitsemällä potilaalla, joista oli peräkkäisiä seeruminäytteitä, neljällä esiintyi lievää nousua IgG-anti-peptidi P62-vasta-ainetasoissa (esim. kuvio 10B) yhdellä esiintyi laskua (kuvio 10A) ja kahdella ei tapahtunut muutosta.

Samat seerumit analysoitiin myös immunoblotting-menetelmällä. Kaikissa potilaissa 25 todettiin IgM-vasta-aineiden ohimenevä nousu monia antigeenejä vastaan sairauden akuutin vaiheen aikana samalla tavoin kuin kuvioissa 7 ja 9 esitetyissä. IgG-anti-• ‘ EBNA-1 -vasta-ainetasoissa voitiin todeta pieni, jos yleensä minkäänlainen, muutos.

Siten kaikilla tutkituilla akuuttia CMV-infektiota sairastavilla potilailla todettiin korostunut ohimenevä nousu IgM-anti-peptidi P62-vasta-aineissa ja pienempi ja vaih-30 televa muutos IgG-anti-peptiditasossa.

IgG/IgM-suhde on kätevä tapa osoittaa anti-peptidi P62-tulokset EBV-IM-potilaista. Kuten edellä havainnollistettiin, tämä suhde on pienempi kuin 1 taudin akuutin vai 58 102381 heen aikana ja kasvaa toipilasvaiheen aikana arvoon, joka on suurempi kuin 1 ja jossa se pysyy henkilön loppuiän [Rhodes ym., J. Exp. Med., 165:1026-1040 (1987)]. Etuna tässä suhteen analysointimenetelmässä on se, että siinä ei tarvitse määrittää tausta-ja raja-arvoja [Geltosky ym., J. Clin. Lab. Analysis 1:153-162 (1987)].

5 Suhdemenetelmällä analysoituna tämä tutkimus paljasti kaksi immuunivasteen yleis-tyyppiä polypeptidi P62 epitoopille. Esimerkiksi potilaasta L.S. (kuvio 10 A) saadut seerumit osoittivat hallitsevan vasteen. Tässä todettiin suhde, joka oli lähes 2, ennen sairautta otetuissa näytteissä. Tämä suhde putosi alle 1 (arvoon 0,661) taudin akuutin vaiheen aikana ja nousi sitten uudestaan toipumisvaiheen aikana. Kaikkiaan kah-10 deksasta potilaasta kymmenestä, joilla oli akuutti CMV-IM-infektio, saatiin positiivinen tulos EBNA P62 ELISAlla suhdeanalyysiä käyttäen.

Potilailla S.G. ja G.S. todettiin toisentyyppinen vaste P62:a kohtaan. Vaikka molemmissa todettiin IgM-vasta-aineiden lisääntyminen akuutin vaiheen aikana, maksimiarvot pysyivät IgG-tasojen alapuolella. Nämä seerumit todettiin negatiivisiksi 15 suhdeanalyysissä. Molemmissa tapauksissa väärät negatiiviset tulokset johtuivat voimakkaasta lähtö-IgG-signaalista. Siten vaikka aikaisempi CMV-infektio on suhteellisen harvinainen ikäryhmässä, jossa esiintyy EBV-IM, joitakin vääriä negatiivisia tuloksia saattaa esiintyä IgG/IgM-suhdeanalyysiä käytettäessä.

(iv) EBV-IM- ja CMV-IM-seerumeiden tunnistamien antigeenien suora vertailu 20 IgM-vasta-aineet tunnistavat varsin samanlaisen antigeeni-mallin akuuttien EBV- ja CMV-infektioiden aikana (vertaa kuvioita 7 ja 9). Näiden antigeenien suoraa vertailua varten potilailta, joilla oli jompikumpi näistä taudeista, saaduille seerumeille suoritettiin immunoblotting-koe rinnakkain samalla soluekstraktilla. Solut, joita ekstraktiin käytettiin, olivat K562 solulinjan soluja. On tärkeää huomata, että nämä 25 solut eivät sisällä EBV- tai CMV-sekvenssejä. Siten mahdolliset todetut antigeenit ovat normaaleja soluproteiineja.

Tulokset tästä tutkimuksesta, joka liittyy IgM-vasta-aineiden sitoutumiseen, on esitetty kuviossa 11 A. Raidat 1, 2, 9 ja 10 koestettiin seerumeilla, jotka oli saatu EBV-IM-potilailta, kun taas loput raidat koestettiin seerumeilla, jotka oli saatu potilailta, 30 joilla oli akuutti CMV-IM-infektio.

Kuten tästä kuviosta voidaan havaita, pääantigeeniraidat 92, 82-77, 69, 62 ja 58 kD:n kohdalla reagoivat samalla tavoin jommankumman viruksen infektoimien potilaiden seerumien kanssa. Jonkin verran vähemmän voimakkaita raitoja oli myös 59 102381 nähtävissä molemmissa potilasryhmissä. Suunnilleen 50 kD:n kohdalla oli raita, joka näyttää esiintyvän vain CMV-potilailla, mutta tämä on poikkeus. Kaikki muut raidat todettiin yhdessä tai useammassa seerumissa ja ne ovat yhteisiä kaikille seerumeille. Siten jommankumman viruksen indusoima infektio synnyttää IgM-vasta-5 aineita samaa proteiinijoukkoa kohtaan.

Sama seerumijoukko tutkittiin myös immunoblotting-analyysillä käyttäen CMV-infektoitunutta fibroblastiekstraktia. IgG-vasta-aine todettiin kuviossa 1 IB esitetyissä tutkimuksissa.

Mainitusta kuviosta voidaan nähdä, että kaikilla CMV-potilailla oli IgG-vasta-ainei-10 ta hallitsevaa antigeeniä, jonka koko oli 50 kD, kohtaan ja toista, jonka koko oli 64 kD, ja muita antigeenejä kohtaan, joita oli läsnä vain muutamissa CMV-potilaista. Vähäinen, jos yleensä minkäänlainen, reaktio oli havaittavissa EBV-infektoituneissa potilaissa. Käynnissä oleva tutkimus osoittaa, että kaikki tässä tutkimuksessa nähtävissä olevat raidat johtuvat virusta koodaavasta CMV-proteiinista.

15 Johtopäätöksenä on, että akuutti CMV- tai EBV-infektio indusoi yhteisen sarjan IgM-autovasta-aineita. Sitä vastoin IgG-vasta-aineet ovat spesifisiä proteiineille, jotka ovat peräisin viruksesta, joka aiheuttaa taudin ja nämä IgG-vasta-aineet eivät reagoi isäntäkomponenttien kanssa [Rhodes ym., J. Exp. Med., 165:1026-1040 (1987)].

20 (v) Vasta-aineen sitoutumisen estäminen peptidillä P62

Peptidin P62 on aikaisemmin osoitettu estävän vasta-aineen sitoutumisen joukkoon EBV:n indusoimia IgM-vasta-aineita [Rhodes ym., J. Exp. Med., 165:1026-1040 (1987)]. Tämä on osoitettu jälleen kuviossa 12, jossa kaksi EBV"-seerumia tutkittiin immunoblotting-analyysillä EBV*-B-solujen ekstraktilla.

25 Kuviossa 12 raita 1 sisälsi seerumia, joka saatu potilaasta D.B. 15 päivää taudin alkamisen jälkeen, ja raita 5 sisälsi erästä toista EBV-IM-seerumia. Raidat 2 ja 6 si- • · • sälsivät vastaavia seerumeita ja lisäksi 400 μιη/ml peptidiä P62. Nämä tutkimukset suoritettiin suuremmilla seerumin laimennoksilla kuin kuviossa 7 esitetyt, niin että ainoastaan kaikkein voimakkaimmin reagoivat raidat olisivat helposti näkyvissä.

30 Kuten kuviosta 12 voidaan havaita, että polypeptidi esti IgM-vasta-ainetta tarttumasta useisiin proteiiniraitoihin, helpoimmin nähtävissä ovat raidat, joissa molekyyli-paino on 82-77 kD. Käynnissä oleva tutkimus osoittaa, että tämä alue sisältää EBNA-l:tä ja yhtä tai useampaa soluproteiinia.

60 102381

Raita 3 sisälsi seerumia, joka oli saatu potilaasta D.S. 12 päivää CMV-taudin alkamisen jälkeen, kun taas raita 4 sisälsi samaa seerumia plus peptidiä P62, kuten edellä. Jälleen EBV-peptidi esti IgM.n reagoimisen 82-77 kD:n raitojen samoin kuin eräiden alueelle 58-62 kD sijoittuvien raitojen kanssa.

5 Blotting-kokeissa havaittujen IgG-vasta-aineiden estymistä tutkittiin myös. Raita 7 sisälsi seerumia, joka oli saatu potilaasta D.B. 514 päivää taudin alkamisen jälkeen, raita 9 sisälsi seerumia, joka oli saatu potilaasta D.S. 417 päivää hänen CMV-tau-tinsa puhkeamisen jälkeen, ja raita 11 koski normaalia aikuista, jolla oli ollut kauan sitten EBV-infektio. Raidat 8, 10 ja 12 sisälsivät vastaavia seerumeita ja 50 μπι/πιΐ 10 P62:a.

Ainoa todettu proteiini oli EBNA-l-raita 77 kD:n kohdalla. Peptidi esti sitoutumisen tähän proteiiniin kaikissa tapauksissa.

Johtopäätöksenä näistä tutkimuksista on, että CMV-infektio synnyttää IgM-autovas-ta-aineita, jotka tunnistavat peptidin EBV:n EBNA-1-alueelta. Nämä IgM-vasta-15 aineet tunnistavat saijan solun autoantigeenejä, jotka ovat liikkuvuudeltaan samanlaisia ja joilla on sama epitooppispesifisyys kuin EBV-infektion aikana syntyneillä.

(d) Koe nenänielun syövän (NPC) toteamiseksi

Kuten aikaisemmin huomautettiin, EBV:n on osoitettu aiheuttavan nenänielun syöpää (NPC). Nenänielun syöpä on yleisin syöpälaji Kiinassa, jossa sen esiintymisti-20 heys on niinkin korkea kuin 100 tapausta 100 000 asukasta kohti vuodessa.

Westem-blot-analyysit, joissa käytettiin EBV-infektoituja Wi-L2-soluekstrakteja ja seerumeja normaalilta VCA+-henkilöltä, potilaalta, jolla oli IM, ja kuudelta potilaalta, joilla oli NPC, osoittivat IgG:n immunologisen reaktion EBNA-proteiinin kanssa, IgM- ja IgG-vasteet EBNA-proteiinia kohtaan IM-potilaan seerumissa ja IgG-, IgM-25 ja IgA-reaktiot EBNA-proteiinia kohtaan NPC-potilaiden seerumeissa.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että seerumien IgG- ja IgA-vasta-aineiden tasot erilaisia EBV-antigeenejä kohtaan ovat merkittävän korkeat NPC-potilail-la. [Henle ym., Int. J. Cancer, 17:1-7 (1976); Desgranges ym., Int J. Cancer, 19:627-633 (1977) ja Pearson ym., Cancer, 51:260-268 (1983)]. Tarkemmin sanot-30 tuna Henle et ai. raportoivat korkeita IgA-seerumitiittereitä VCA- ja D(diffuusi)-antigeenejä kohtaan, jotka satunnaisesti sopivat yhteen IgG-tiittereiden kanssa näitä . antigeenejä kohtaan. Desgranges et ai. käyttivät sylkeä ja raportoivat todenneensa neutraloivia IgA- ja IgG-vasta-aineita VCA.ta ja EA:ta (varhainen antigeeni) koh- 61 102381 taan. Pearson et ai. raportoivat IgG-anti-EA-kokeeseen kytketyn IgA-anti-VCA-kokeen diagnostisen tehokkuuden. Näissä tutkimuksissa ei raportoitu tutkituissa näytteissä olleen IgA-anti-EBNA-vasta-aineita.

Useita seerumeita, jotka oli saatu potilailta, joiden tiedettiin sairastavan NPCitä, 5 analysoitiin kiinteäfaasi-ELISA-analyysillä käyttäen polypeptidiä P62, joka oli kiinnitetty kiinteään matriisiin kiinteän alustan muodostamiseksi, kuten edellä kuvattiin. Nämä seerumit tutkittiin myös serologisilla standardikokeilla. Tulokset on havainnollistettu taulukossa 12.

Taulukko 12 10 ELISA-arvot NPC-potilaiden seerumeista

Anti-EBV-tiitterit1 Anti-P62-tiitterit2

Näytteet VCA EA IgA IgA IgM IgG

1 320 120 60 0,617(+) 0,642 1,686 2 960 40 60 0,376(-) 0,541 1,570 3 640 120 15 0,737(+) 0,247 1,143 4 320 NT 30 0,289(-) 0,173 0,958 5 1920 320 240 0,871(+) 0,303 2,000 6 960 80 80 0,738(+) 0,334 0,915 7 640 320 10 0,675(+) 0,216 0,993 8 960 640 320 0,667(+) 0,478 1,160 9 480 NT 15 0,701(+) 0,417 1,324 10 640 60 20 0,024(-) 0,159 0,207 11 1280 240 80 0,466(+) 0,142 1,139 12 240 40 80 0,651(+) 0,725 1,360 13 1280 120 160 0,421(+) 0,190 1,566 NT = ei testattu 1 Anti-EBV-polypeptidi P62 ELISA tehtiin näistä seerumeista, kuten osassa "Materiaaleja ja menetelmiä" on kuvattu. Plus(+)-merkit tarkoittavat optisen 15 tiheyden arvoja, jotka katsotaan NPC-positiivisiksi, kun taas miinusmerkit tar koittavat optisen tiheyden arvoja, jotka katsotaan NPC-negatiivisiksi.

62 102381

Kuten edellä olevista tuloksista voidaan havaita, serologiset kokeet VCA:n, EA:n ja IgA:n toteamiseksi korreloivat hyvin suhteellisen korkeaan IgA-anti-peptidi P62-tiitteriin. Seerumissa läsnä olevat IgM- tai IgG-vasta-aineet eivät estäneet IgA-anti-peptidi P62-tiitteriä. Lisäksi IgM/IgG-suhteen voidaan katsoa osoittavan, että poti-5 lailla ei ollut akuuttia IM:a. Edelleen ACIFillä määritettyjen anti-EBNA-tiitterien ei katsottu liittyvän tautiin.

Tutkittaessa normaalien henkilöiden, joilla ei ole NPCitä, seerumeita, otettiin O.D.49o-arvo 0,3 vertailuarvoksi tässä IgA-kokeessa. Tässä nimenomaisessa koe-muodossa O.D.49o-arvo, joka oli merkittävästi korkeampi kuin 0,3, katsottiin NPC:n 10 positiiviseksi indikaattoriksi. Siten taulukossa 10 henkilöä 13:sta oli NPC-positiivi-sia ja nämä on siis merkitty plusmerkillä (+).

Aikaisemmin käsitellyn yleisanalyysimenetelmän anti-EBNA-vasta-aineiden tunnistamiseksi katsotaan olevan tehokas myös NPC:n toteamiseksi jossakin henkilössä. Tässä käytetään jotakin vasta-ainetta sisältävää kudosnäytettä, kuten seerumia, 15 plasmaa, sylkeä, ysköstä tai nieluhuuhdetta. Kudosnäyte lisätään kiinteäfaasialus-taan jossakin vesiväliaineessa kuten edellä kuvattiin. Tässä tutkitaan IgA-vasta-aineiden määrä, jolloin suhteellisesti korkeampi määrä vertailuarvoon verrattuna osoittaa NPC:n olemassaolon.

(e) EBV:hen ja CMV:hen liittyvien peptidien immunologinen ristiinreaktiivi-20 suus

Herpesviruksiin kuuluvan ihmisen sytomegaloviruksen (CNV) on osoitettu olevan . tärkeä patogeeni, joka saattaa aiheuttaa syntymävaurioita ja opportunisti-infektioita henkilöissä, joiden vastustyskyky on heikentynyt. CMV-virus aiheuttaa myös "mononukleoosin kaltaista" tautia (CMV-IM), joka on samankaltainen kuin EBV:n 25 aiheuttama infektioosi mononukleoosi (EBV-IM).

Kliinissä tutkimuksissa, joissa käytettiin polypeptidi P62-perustaista ELISAa anti-EBNA-vasta-aineiden toteamiseksi potilaissa, joilla on akuutissa vaiheessa oleva : EBV-IM, todettiin, että likimain 60-70 % heterofiili-negatiivisista CMV-IM-tapauk- sista osoittautui positiivisiksi P62-perustaisessa ELISAssa. Vasta-aineiden, jotka 30 kykenivät reagoimaan immunologisesti P62:n kanssa, läsnäolon CMV-IM-potilaissa ajateltiin johtuvan joko latentin EBV-infektion reaktivoitumisesta nykyisen CMV-infektion vaikutuksesta tai CMV-proteiinin, joka reagoi immunologisesti ristiin EBNA:n kanssa, tuotannosta.

63 102381

Sen mahdollisuuden selvittämiseksi, että CMV-infektoitujen henkilöiden seerumi sisältäisi P62-ristiinreagoivia vasta-aineita, jotka CMV:n koodaama antigeeni olisi indusoinut, syntetisoitiin kolme CMV:hen liittyvää polypeptidiä, jotka on esitetty taulukossa 13.

5 Taulukko 13

Peptidin nimi Aminohappotähdesekvenssi

Cl AGGGGGGGAGGGGGGGGSGG

C2 S S S SAGGGGGGGAGGGGGGGGSGG

C3 S S S SAGGGGGGGAGGGGGGGGSGGC

10 1. Peptidien Cl, C2 ja C3 aminohappotähdesekvenssit vastaavat kukin polypepti-din osaa, jonka odotetaan ilmentyvän 2,2 kiloemäksen CMV RNA:n eksonin 1 koodialueella, minkä raportoivat Stapraus ym., J. Virol., 57:591-602 (1986).

15 Seeruminäytteitä, jotka oli saatu IM:n aikana valituista potilaista, tutkittiin IgG-ja IgM-immunoreaktiivisuuden selvittämiseksi polypeptideille P62, Cl ja C2 käyttäen ELISAa, joka oli samanlainen kuin kappaleessa "Materiaaleja ja menetelmiä" III, D. Kuvio 14 havainnollistaa tulokset, jotka saatiin tästä tutkimuksesta, jossa käytettiin seeruminäytteitä, jotka oli saatu potilaasta (DB), jolla oli EBV-infektio, josta kehit-20 tyi akuutti IM ja sen jälkeen taudin toipumisvaihe. Tulokset havainnollistavat edellä kuvatun mallin anti-P62-IgM-vasta-aineiden toteamiseksi EBV-IM:n akuutin vaiheen aikana ja anti-P62-IgG-vasta-aineiden nousun (ja samanaikaisen anti-P62-• IgM:n laskun) toipilasvaiheessa.

Kuvio 14 havainnollista myös sen, että kun CMV.n kanssa lähekkäisiä peptidejä Cl 25 ja C2 käytettiin kiinteäfaasi(kohde)antigeeninä ELISAssa, samojen peräkkäisten näytteiden, jotka oli saatu potilaasta DB, todettiin sisältävän anti-Cl- ja anti-C2-vasta-aineita taudin akuutin vaiheen aikana. Kuitenkin vaikka IgM-anti-Cl-ja -C2-vasta-ainevaste putosi pois toipilasvaiheen alkaessa, anti-Cl- tai anti-C2-vasta-ai-neiden samanaikaista nousua ei todettu.

30 Peräkkäisiä seeruminäytteitä, jotka oli otettu toisesta potilaasta (DS), jolla oli primaarinen CMV-infektio, joka kehittyi akuutiksi CMV-IM:ksi, ja sen jälkeen sekun-daari-EBV-infektio, joka kehittyi akuutiksi EBV-IM:ksi, tutkittiin P62-, Cl-ja C2-ELISAlla kuten edellä kuvattiin. Kuten kuviossa 15 on havainnollistettu, jokaisessa 64 102381 ELISA-analyysissä todettiin IgM-anti-peptidi-vasta-aineita CMV- ja EB V-infektioi-den akuuttien vaiheiden aikana.

CMV:n kanssa lähekkäisten peptidien immunologista aktiivisuutta tutkittiin edelleen tutkimalla Cl:n, C2:n ja C3:n indusoimien vasta-aineiden kykyä reagoida immuno-5 logisesti EBNA:n kanssa. Kaniinin anti-peptidi-antiseerumien Cl:tä, C2:ta ja C3:a kohtaan annettiin kunkin reagoida immunologisesti EBNA.ta ilmentävien solueks-traktien kanssa käyttäen immunoblotting-menetelmää, joka oli samanlainen kuin kappaleessa "Materiaaleja ja menetelmiä" III, G kuvattu. Immunoblottauksen tulokset osoittavat, että anti-Cl-, anti-C2- ja anti-C3-kaniinin vasta-aineet reagoivat im-10 munologisesti EBNA:n kanssa.

Lisäksi, kun anti-Cl-, anti-C2- ja anti-C3-kaniinin vasta-aineita inkuboitiin niiden vastaavien peptidien kanssa ennen immunoblottausta, immuunireaktio EBNA-pro-teiinin kanssa estyi.

Sen vuoksi olisi huomattava, että vaikka polypeptidien Cl, C2 ja C3 aminohappo-15 tähdesekvenssit vastaavat CMV-genomin koodaamaa sekvenssiä, nämä polypeptidit ovat tämän keksinnön mukaisia polypeptidejä, koska ne sisältävät aminohappotäh-desekvenssin, jota edustaa kaava: -Gly-R^Gly-R^Gly- jossa R1 ja R2 tarkoittavat aminohappotähteitä, jotka erikseen tarkasteltuina ovat 20 samoja tai erilaisia ja on valittu ryhmästä, jonka muodostavat Ala, Arg, Gly, Leu, Pro, Ser ja Thr, edellyttäen, että R1 ja R2 eivät ole kumpikin Gly. Lisäksi edellä mainitut tulokset osoittavat, että polypeptidit C1, C2 ja C3 voivat reagoida immunologisesti EBNA:n indusoimien IgM-vasta-aineiden kanssa ja että näiden peptidien indu-soimat vasta-aineet reagoivat immunologisesti EBNA:n kanssa.

25 Sekä EBV että CMV aiheuttavat erästä hyvänlaatuista lymfoproliferatiivista tautia, jonka akuutille vaiheelle on luonteenomaista IgM-vasta-aineiden, jotka reagoivat immunologisesti tämän keksinnön mukaisen polypeptidin kanssa, tuotanto. Koska anti-EBNA-vasta-aineita ei yleensä tavata pahanlaatuisen valkosolujen lisääntymisen yhteydessä, esillä oleva keksintö koskee siksi diagnostista systeemiä ja menetel-30 mää viruksen indusoiman hyvänlaatuisen ja pahanlaatuisen valkosolujen lisääntymistä aiheuttavan taudin erottamiseksi toisistaan.

65 102381 3. Valmiste passiivisen immunisaation aikaansaamiseksi

Potilasta, jolla on latentisti infektoituneita B-lymfosyyttejä, jotka ekspressoivat EBNA:ta solujen pinnalla, voidaan hoitaa tämän keksinnön mukaisilla mieluiten kokonaisina vasta-aineina olevilla reseptoreilla, jotka on synnytetty tämän keksinnön 5 mukaisia synteettisiä polypeptidejä, jotka reagoivat EBNA:n kanssa, vastaan. Reseptorit annetaan yksikköannoksena, jossa on tehokas määrä reseptoreita dispergoituina johonkin farmaseuttisesti hyväksyttävään laimentuneen.

Tehokas määrä tällaisia vasta-aineita vaihtelee vasta-aineiden reaktiivisuudesta ja tyypistä riippuen. Yleensä noin 0,5 milligrammasta noin 25,0 milligrammaan vasta-10 ainetta potilaan kehon painokiloa kohti katsotaan tehokkaaksi. Vasta-aineet voidaan antaa suoneen, lihakseen tai vatsaonteloon useina antokertoina 3-20 päivän välein. Vasta-aineet voidaan myös antaa kirurgisen tai kemiallisen hoidon yhteydessä.

Vasta-aineet voidaan saada myös jonkin eläinlajin, joka on eri kuin hoidettava potilas, seerumista tai plasmasta synnyttämällä vasta-aineita tämän keksinnön mukaista 15 polypeptidiä kohtaan käyttämällä edellä kuvattua rokotetta. Vasta-aineet voidaan saada myös monoklonaalisista lähteistä, kuten ascites-nesteestä valmistamalla hyb-ridoomasolulinja alalla tunnettua tekniikkaa käyttäen. Kokonaiset vasta-aineet ovat parhaita sitoutumiskohtina, koska ne pystyvät aktivoimaan komplementtisysteemin, kun immuunikompleksi muodostuu.

20 III. Menetelmiä ja materiaaleja A. Polypeptidien synteesi Tämän keksinnön mukaiset polypeptidit syntetisoitiin kemiallisesti kiinteäfaasime-netelmillä, joita on kuvattu julkaisuissa Merrifield ym., J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963) ja Houghtenym., Int. J. Pept. Prot. Res., 16:311-320 (1980). 25 Polypeptidien kiinteäfaasinen synteesimenetelmä suoritettiin käyttämällä Beckma-nin mallia 990B olevaa polypeptidisyntetisaattoria, joka on kaupallisesti saatavissa Beckman Instrument Co:lta, Berkeley, CA, USA.

«

Polypeptideissä, joissa oli vähemmän kuin 35 tähdettä ja joita käytettiin ymppiin, lisättiin kysteiinitähde aminopäähän tai karboksyylipäähän auttamaan sitoutumista 30 proteiinikantajaan, kuten tuonnempana selitetään. Kaikkien polypeptidien koostumukset vahvistettiin aminohappoanalyysillä.

• Valmistettaessa tämän keksinnön mukaista synteettistä polypeptidiä edellä mainitul la kiinteäfaasimenetelmällä aminohappotähteet kytketään johonkin hartsiin (kiinteä 66 102381 faasi) esterisidoksella karboksiterminaalisesta tähteestä. Kun polypeptidi on määrä kytkeä kantajaan Cys-tähteen kautta tai polymeroida terminaalisten Cys-tähteiden kautta, on kätevää käyttää mainittua Cys-tähdettä karboksiterminaalisena jäännöksenä, joka on sidottu esterisillalla hartsiin.

5 Kunkin lisätyn aminohapon alfa-aminoryhmä suojataan yleensä jollakin tertiaaiisel-la butoksikarbonyyli(t-BOC)ryhmällä ennen kuin aminohappo lisätään kasvavaan polypeptidiketjuun. Sitten t-BOC-ryhmä poistetaan ennen seuraavan aminohapon lisäämistä kasvavaan polypeptidiketjuun.

Reaktiiviset aminohapposivuketjut suojattiin myös polypeptidien synteesien aikana. 10 Tavallisia sivuketjun suojaryhmiä käytettiin lopuille aminohappotähteille seuraavasti: 0-(p-bromibentsyylioksikarbonyyliä) tyrosiinille, O-bentsyyliä treoniinille, seriinille, asparagiinihapolle ja glutamiinihapolle, S-metoksibentsyyliä kysteiinille, dinitrofenyyliä histidiinille, 2-klooribentsoksikarbonyyliä lysiinille ja tosyyliä argi-niinille.

15 Suojatut aminohapot kiteytettiin uudelleen sopivista liuottimista, jolloin saatiin yksinkertaisia täpliä ohutkerroskromatografialla. Kytkennät suoritetaan yleensä käyttämällä kymmenkertaista mooliylimäärää sekä suojatusta aminohaposta että disyk-loheksyylikarbodi-imidistä yli alkuperäisen N-terminaalisen aminohapon milliekvi-valenttien lukumäärän. Kaksinkertaista mooliylimäärää molemmista reagensseista 20 voidaan myös käyttää. Asparagiinin kohdalla suojattuun aminohappoon lisättiin yhtä suuri moolimäärä N-hydroksibentsotriatsolia ja liuottimena käytettiin dimetyyli-formamidia. Kaikki kytkentäreaktiot olivat 99-prosenttisen täydellisiä pikriini-* happokokeella mitattuna, Gisin, Anal. Chem. Acta, 58-248-249 (1972).

Halutun polypeptidin valmistuksen jälkeen suojattu polypeptidi (noin 1 gramma) 25 käsiteltiin kahdella millilitralla anisolia ja noin 20 millilitraa vedetöntä vetyfluoridia kondensoitiin reaktioastiaan kuivajäälämpötilassa. Saatua seosta sekoitettiin noin 4 °C:ssa noin tunnin ajan suojaryhmien pilkkomiseksi ja polypeptidin erottamiseksi hartsista. Kun vetyfluoridi oli haihdutettu 4 °C:n lämpötilassa N2-virralla, jäännös uutettiin vedettömällä dietyylieetterillä kolme kertaa anisolin poistamiseksi ja jään-30 nös kuivattiin vakuumissa.

Vakuumikuivattu aine uutettiin 5 % etikkahappovesiliuoksella (3 kertaa 50 millilitraa) vapaan polypeptidin erottamiseksi hartsista. Uutteen sisältävä liuos lyofilisoitiin monomeerisen hapettamattoman polypeptidin aikaansaamiseksi.

67 102381

Valmistettua synteettistä polypeptidiä voidaan käyttää reagenssina entsyymisidon-naisessa immunosorbenttianalyysissä (ELISA) anti-EBNA-vasta-aineiden tunnistamiseksi. Synteettistä polypeptidiä voidaan käyttää myös ympin valmistamiseen, tavallisesti kytkemällä se johonkin kantaja-aineeseen konjugaatin muodostamiseksi 5 ja sitten dispergoimalla tehokas määrä konjugaattia johonkin fysiologisesti siedettyyn laimentuneen, kuten tuonnempana selitetään.

Huomattakoon myös, että tämän keksinnön mukainen synteettinen multimeeri voidaan valmistaa kiinteäfaasisynteesillä monista tämän keksinnön mukaisista poly-peptideistä, jotka on kytketty toisiinsa end-to-end-kytkennällä (pää-häntä) käyttä-10 mällä aminosidosta yhden polypeptidin karboksyyliterminaalisen tähteen ja toisen polypeptidin aminoterminaalisen tähteen välillä. Tällaiset synteettiset multimeerit syntetisoidaan mieluiten yksinkertaisena pitkänä polypeptidimultimeerina, mutta ne voidaan valmistaa myös yksittäisiksi polypeptideiksi, jotka kytketään toisiinsa niiden yksittäissynteesien jälkeen käyttäen jotakin karbodi-imidireagenssia, kuten l-(3-15 dimetyyliaminopropyyli)-3-etyyli-karbodi-imidihydrokloridia vedessä. Aminohappotähteiden kokonaislukumäärä multimeerissä, joka on valmistettu yksinkertaisena polypeptidiketjuna, on mieluiten pienempi kuin noin 50, jolloin enintään noin 80 tämän keksinnön mukaista polypeptidiä voidaan sisällyttää yksinkertaiseen pää-häntä-multimeeriketjuun, joka syntetisoidaan yksinkertaisena polypeptidinä. Syn-20 teettinen pää-häntä-multimeeri sisältää mieluiten kahdesta noin neljään ryhmää tämän keksinnön mukaisia kytkettyjä synteettisiä satunnaissekapolymeeripolypeptide-jä ja kaikkiaan vähemmän kuin noin 40 aminohappotähdettä.

B. Polymeerien valmistus

Keksinnön mukaiset polypeptidit voidaan kytkeä yhteen, jolloin muodostuu anti-25 geeninen ja/tai immunogeeninen polymeeri (synteettinen multimeeri), joka sisältää paljon toistuvia polypeptidiyksikköjä. Tällaisen polymeerin etuna on yleensä suurempi immunogeenisyys ja antigeenisyys. Lisäksi kantajaa ei yleensä tarvita, kun käytetään polymeeristä immunogeeniä. Kun polymeerin rakentamiseen käytetään erilaisia polypeptidimonomeerejä, saadaan kyky reagoida immunologisesti vasta-30 aineiden kanssa, jotka suuntautuvat useita EBNA-antigeenisiä determinantteja kohtaan. Vielä eräs etu on tällaisen polymeerin kyky, kun sitä käytetään ympissä, indusoida vasta-aineita, jotka reagoivat immunologisesti useiden EBNA:n antigeenisten determinanttien kanssa.

Tämän keksinnön mukainen polymeeri voidaan valmistaa syntetisoimalla polypepti-35 dejä, kuten edellä selitettiin, ja sisällyttämällä kysteiinitähteitä sekä amino- että kar- 68 102381 boksipäihin, jolloin muodostuu "diCys-terminaalinen" polypeptidi. Esimerkiksi kukin taulukon 1 polypeptideistä ja taulukon 2 polypeptidit Dl ja D2 voidaan syntetisoida siten, että ne sisältävät lisä-Cys-tähteen sekä aminopäässä että karboksipäässä, jolloin saadaan diCys-terminaalisia polypeptidejä niiden pelkistetyissä muodoissa.

5 Synteesin jälkeen tyypillisessä laboratoriovalmisteessa 10 milligrammaa diCys-polypeptidiä (joka sisältää kysteiinitähteitä hapettamattomassa muodossa) liuotetaan 250 millilitraan (ml) 0,1 moolista (M) ammoniumbikarbonaattipuskuria. Liuennut diCys-terminaalinen polypeptidi hapetetaan sitten ilmalla sekoittamalla saatua liuosta varovasti noin 18 tunnin ajan ilmassa tai kunnes jäljellä ei ole enää Ellman-testillä 10 tunnistettavaa vapaata merkaptaania. [Katso Ellman, Arch. Biochem. Biophys., 82:70-77 (1959)].

Tällä tavoin valmistettu polymeeri (synteettinen multimeeri) sisältää paljon toistuvia synteettisiä satunnaissekapolymeeripolypeptidiyksikköjä, jotka on sidottu toisiinsa hapettavilla kysteiini(kystiini)-tähteillä. Tällaiset polymeerit yleensä sisältävät tois-15 tuvat polypeptidiyksiköt toisiinsa sidottuina pää-häntä-systeemillä, so. kahden toistuvan polypeptidiyksikön aminopäät voivat olla sidotut toisiinsa yksinkertaisella kysteiinitähteellä kuten voivat myös kaksi karboksipäätäkin, koska kytkentäryhmät ovat molemmissa polypeptidipäissä samanlaiset.

C. Kytkentä kantajiin 20 Synteettiset polypeptidit kytkettiin kantaja-aineena olevaan avaimenreikäkotilohe-mosyaniiniin (KLH) menetelmällä, jota kuvataan julkaisussa Liu ym., Biochem, 80:690 (1979). Lyhyesti sanottuna 4 milligrammaa kantajaa aktivoitiin 0,51 mg:lla m-maleimidibentsoyyli-N-hydroksisukkinimidiesteriä ja sen jälkeen sen annettiin reagoida 5 mg:n kanssa polypeptidiä amino- tai karboksiterminaalisen kysteiinin 25 kautta, jolloin saatiin konjugaatti, joka sisälsi noin 10 - noin 35 painoprosenttia polypeptidiä.

Yksi tai useampia lisäaminohappotähteitä voidaan lisätä synteettisen polypeptidin . amino- tai karboksipäähän edistämään polypeptidin sitoutumista kantajaan. Kuten edellä selitettiin, synteettisen polypeptidin amino- tai karboksipäähän lisättyjen 30 kysteiinitähteiden on todettu olevan erityisen käyttökelpoisia muodostettaessa polymeerejä disulfidisidoksia käyttäen. Kuitenkin muitakin alalla hyvin tunnettuja menetelmiä konjugaattien valmistamiseksi voidaan käyttää. Esimerkiksi joihinkin lisäkyt-kentämenetelmiin sisältyy Michaelin additioreaktiotuotteiden, dialdehydien, kuten glutaarialdehydin ja senkaltaisten, käyttö, Klipstein ym., J. Infect. Dis., 147:318-326 35 (1983), tai karbodi-imiditeknologian käyttö, kuten esim. vesiliukoisen karbodi-imi- 69 102381 din käyttö amidikytkentöjen muodostamiseen kantajaan, kuten edellä käsiteltiin, ennen useiden polypeptidien kytkemistä yhteen synteettisen multimeerin muodostamiseksi.

Käyttökelpoiset kantajat tunnetaan alalla hyvin ja nekin ovat yleensä proteiineja. 5 Esimerkkejä tällaisista kantajista ovat avaimenreikäkotilohemosyaniini (KLH), edestiini, tyroglobuliini, albumiinit, kuten härän seerumin albumiini (BSA) tai ihmisen seerumin albumiini (HSA), veren punasolut, kuten lampaan erytrosyytit (SRBC), tetanustoksoidi, koleratoksoidi sekä polyamidohapot, kuten poly(D-lysii-ni.D-glutamiinihappo), ja senkaltaiset.

10 Kuten alalla myös tiedetään, on usein edullista sitoa synteettinen polypeptidi kantajaansa jonkin välikytkentäryhmän avulla. Kuten edellä huomautettiin, glutaraldehydi on eräs tällainen kytkentäryhmä. Kuitenkin kun käytetään kysteiiniä, välikytkentä-ryhmä on mieluiten m-maleimidibentsoyyU-N-hydroksisukkinimidi (MBS), kuten tässä käytettiin.

15 Lisäksi MBS voidaan lisätä ensiksi kantajaan esteri-amidivaihtoreaktiolla, kuten julkaisussa Liu ym., supra. Sen jälkeen voidaan lisätä jokin suojattu merkaptoryhmä, kuten tiolietikkahappo (CH3COSH) maleimidi-kaksoissidoksen toiselle puolelle. Kun estävä asyyliryhmä on pilkottu, muodostetaan disulfidisidos suojatun merkap-taanikytkentäryhmän ja synteettisen polypeptidin lisätyn kysteiinitähteen merkap-20 taanin väliin.

Kantajan valinta riippuu pikemminkin immunogeenin aiotusta käytöstä kuin immu-nogeenin determinanttiosasta ja se perustuu kriteereihin, jotka eivät erityisesti liity tähän keksintöön. Esimerkiksi jos ymppiä on määrä käyttää eläimiin, olisi valittava kantaja-aine, joka ei aiheuta epäsuotavaa reaktiota kysymyksessä olevassa eläimes-25 sä.

D. ELISA

Anti-peptidi-vasta-aineen sitoutumista ja estymistä koskevia tutkimuksia suoritettiin entsyymisidonnaisella immunosorbenttianalyysillä (ELISA), kuten edellä kuvattiin.

Lyhyesti sanottuna mikrotiitterikuopat (Costar, #3590, Cambridge, MA) pinnoitet-30 tiin tyypillisesti yksittäisillä antigeeneinä käytetyillä polypeptideillä lisäämällä 100 mikrolitraa (μΐ) BBS:ä [10 millimoolista (mM) natriumboraattia (pH 8,3), 150 mM NaCl], joka sisälsi polypeptidiä konsentraationa 10 mikrogrammaa/millilitra (pm/ml). Kosketusta kuoppien ja antigeeniä sisältävän liuoksen välillä pidettiin yllä 70 102381 ennalta määrätyn ajan, yleensä 15 minuuttia, ja 20 °C:ssa, jolloin muodostui anti-geenipinnoitteinen kiinteä faasi. Kiinteä ja nestemäinen faasi erotettiin ja kuopat pestiin kolme kertaa BBSillä.

Ei-spesifiset sitoutumiskohdat suojattiin sekoittamalla 200 mikrolitraa 1 % härän 5 seerumin albumiinia (BSA) kuhunkin kuoppaan toisen kiinteä/nestefaasiseoksen aikaansaamiseksi ja pitämällä tätä kiinteä/nestefaasiseosta 30 minuuttia 20 °C:ssa. Faasit erotettiin ja ylimääräinen tarttumatta jäänyt BSA poistettiin pesemällä kolmeen kertaan BBSillä.

Kaniinin ja ihmisen seerumeita (kudosnäytealikvootteja) tutkittiin anti-polypeptidi-10 aktiviteetin selvittämiseksi lisäämällä 100 mikrolitraa suhteessa 1:20 BBSiään laimennettua seerumia per kuoppa kiinteä/nestefaasiseoksen muodostamiseksi. Kosketusta laimennetun seerumin ja antigeenipinnoitteisen kiinteän faasin välillä pidettiin yllä ennalta määrätyn ajan, kuten 1 tunnin ajan, ja 20 °C:ssa immunologisen reaktio-tuotteen muodostamiseksi. Kiinteäfaasi ja nestefaasi erotettiin ja kiinteä faasi, so.

15 antigeenipinnoitteiset immunologisen reaktiotuotteen sisältävät kuopat pestiin sitten kolmeen kertaan BBS:llä.

Ihmisen seerumissa olevat vasta-aineet, jotka reagoivat immunologisesti adsorboituneen polypeptidin kanssa, tunnistettiin käyttämällä merkkiainetta, jona oli alkalinen fosfataasi-konjugoitu vuoden anti-ihmis-Ig-vasta-aine (Tago, Burlington, CA). Ka-20 niinin seerumissa olevat vasta-aineet, jotka reagoivat immunologisesti adsorboituneen polypeptidin kanssa, tunnistettiin käyttämällä merkkiainetta, jona oli alkalinen fosfataasi-konjugoitu vuohen anti-kaniini-Ig-vasta-aine (Kirkegard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD). Kummassakin tapauksessa 100 mikrolitraa merkki-vasta-ainetta laimennettuna suhteessa 1:300 BBS:ään lisättiin kuhunkin kuoppaan 25 jälleen toisen kiinteä/nestefaasiseoksen muodostamiseksi. Tätä kiinteä/nestefaasiseosta ylläpidettiin ennalta määrätyn ajan, yhden tunnin ajan, reaktiotuotteen aikaansaamiseksi kiinteään faasiin tarttuneiden ihmisen vasta-aineiden ja merkkiaineen välille ja 20 °C:ssa. Faasit erotettiin ja kiinteä faasi pestiin 3 kertaa BBSillä.

Polypeptidi-spesifiseen vasta-aineeseen sitoutunut alkalinen fosfataasi-konjugoitu 30 vasta-aine tunnistettiin spektrofotometrisesti määrittämällä p-nitrofenyylifosfaatin entsymaattinen hydrolyysi p-nitrofenoliin. Lyhyesti sanottuna 100 mikrolitraa p-nitrofenyylifosfaattia [1 milligramma/millilitra 2 mM MgCl2 (pH 9,8), 50 mM natriumkarbonaatti] lisättiin jokaiseen kuoppaan. Entsymaattisen reaktion annettiin olla ] käynnissä 1 tunnin ajan ja sitten määritettiin optinen tiheys 405 nm.llä TITERTEK- 71 102381 spektrofotometrillä, joka on kaupallisesti saatavissa Flow Laboratoriesilta, Inglewood, CA.

Lisäkokeet, joita käytettiin näissä tutkimuksissa, joissa määritettiin IgG/IgM-suhde EBV-indusoidun taudin vaiheen määrittämiseksi, suoritettiin kuten kuvataan julkai-5 suissa Smith ym., J. Infect Dis., 154:885-889 (1986) ja Geltosky ym., J. Clin. Lab. Analysis 1:153-162 (1987). Lyhyesti sanottuna kiinteäfaasimatriisina käytetyt mik-rotiitterikuopat pinnoitettiin 50 pl:lla liuosta, joka sisälsi 20 mikrogrammaa (pg) polypeptidiä P62/ml boraattipuskuroitua saliinia [BBS; 0,5 M natriumboraatti, 0,15 M NaCl ja 0,001 M MgCh, pH 8,3] 12 tuntia 4 °C:ssa kiinteän alustan muodostami-10 seksi, joka sisältää peptidiä kiinnitettynä kiinteäfaasimatriisiin.

Liuos kaadettiin sen jälkeen pois ja levyt blokeerattiin 300 pl:lla 10-prosenttista normaalia vuohen seerumia fosfaattipuskuroidussa saliinissa (PBS), jonka pH oli 7,3. 90 minuutin ylläpidon (inkuboinnin) jälkeen 37 °C:ssa kuopat tyhjennettiin ja niitä kuivattiin 60 minuuttia 37 °C:ssa.

15 Tällöin kuoppiin lisättiin 200 μΐ 10-prosenttista vuohen seerumia PBS:ssä. 10 μΐ potilaan seeruminäytettä lisättiin kuhunkin vuohen seerumia sisältävään kuoppaan kiinteä/nestefaasiseoksen muodostamiseksi. Tätä seosta ylläpidettiin yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa, jotta mahdolliset läsnä olevat vasta-aineet pääsisivät tarttumaan kiinteään alustaan ja muodostamaan kiinteään faasiin sidotun immunore-20 aktantin, joka sisältää näitä vasta-aineita.

Kun oli pesty viisi kertaa 350 piillä 0,05-prosenttista Tween-20:tä [polyoksietylee-•# ni(20)sorbitaanimonolauraatti] PBS:ssä kiinteän faasin ja nestefaasin erottamiseksi, jokaiseen kuoppaan lisättiin liuos, jossa oli 200 μΐ pipaijuuriperoksidaasi(HRPO)-konjugoitua hiiren monoklonaalista vasta-ainetta ihmis-IgG:tä tai -IgM:ää vastaan 25 (Ortho Diagnostic Systems, Raritan, NJ) toisen kiinteä/nestefaasiseoksen muodostamiseksi. Tätä kiinteä/nestefaasiseosta ylläpidettiin vielä yhden tunnin ajan, jotta ent-syymikytketyt vasta-aineet pääsivät sitoutumaan mahdollisiin ensimmäisessä kiin-' teä/nestefaasiseoksessa muodostuneisiin kiinteään faasiin sidottuihin vasta-aineisiin.

Kun kiinteä faasi ja nestefaasi oli erotettu ja kiinteä faasi pesty viiteen kertaan käyt-30 täen edellä mainittua Tween-20/PBS-liuosta, kehitettiin väri lisäämällä o-fenyleeni-diamiinia (OPD, 2 mg sitraattipuskuroitua tablettia liuotettuna 3 ml:aan vettä, Pitman-Moore, Washington Crossing, NJ) ja vetyperoksidia. Saatua liuosta pidettiin 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Reaktio sammutettiin lisäämällä 50 μΐ 2N HCl:a ja absorbanssi määritettiin 490 nm:llä (nm).

72 102381 ELISAn, jossa käytettiin polypeptidiä P62 antigeeninä, tulokset normalisoitiin kertomalla absorbanssiarvot positiivisella vertailusuhteella: positiivinen vertailusuhde = viiteabsorbanssiarvo/positiivisen verrokin keskiabsorbanssi.

Positiiviselle verrokille annettiin viiteabsorbanssiarvoksi (O.D.) 1,0. Viiteabsorbans-5 siarvo jaettiin positiivisen verrokin todetulla keskiabsorbanssiarvolla. Verrokkien ja kunkin testinäytteen absorbanssiarvot kerrottiin positiivisella vertailusuhteella, jolloin saatiin standardinmukainen ELISA-arvo. Raja-arvoja (keskimääräinen OD + SD) on kuvattu aikaisemmin [Geltosky ym., J. Clin. Lab. Analysis 1:153-162 (1987)]. Näissä standardinmukaisissa olosuhteissa ELISA-arvojen IgG/IgM-suhteet, 10 jotka olivat suurempia kuin 0,7, määritettiin terveessä oireettomassa populaatiossa. Alle 0,7 absorbanssiarvojen katsottiin edustavan EBV:n aiheuttamaa akuuttia infektiota [Smith ym., J. Infect Dis., 154:885-889 (1986)].

Vielä eräs toinen samanlainen, mutta paljon nopeampi koe on myös kehitetty ja sitä käytettiin tässä. Tässä kokeessa käytetty kiinteäfaasimatriisi oli niin kutsuttu 15 "lusikka".

Käytetyt erikoislusikat olivat himmeitä, valkoisia polystyreenivälineitä, joissa oli yleismuodoltaan litistetty yläosa (kuten tavallisesti käytetyssä), joka ulottui noin puoleen väliin lusikan pituutta ja oli muotoiltu pidettäväksi käyttäjän kädessä. Suunnilleen kaksi kolmannesta alaosan pituudesta (alempi puolisko) on kapeampi 20 kuin ylempi osa ja muotoiltu lieriömäiseksi.

Suunnilleen alin kolmannes lusikasta sisältää toisen litistetyn osan, joka on suunnilleen yläosan levyinen ja muodostaa kaksi astian muotoista syvennystä (kuoppaa), joiden läpimitta on hieman kapeampi kuin tämän litistetyn osan leveys. Mainitut kaksi astian muotoista syvennystä erottaa toisistaan harjanne, joka on suunnilleen 25 suorassa kulmassa syvennykset muodostaviin litistettyihin pintoihin. Harjanteen yläpinnassa, joka menee alaspäin syvennyksiä kohti, on sellaisia merkintöjä, kuten "M" tarkoittamassa IgM:ää ja "G" tarkoittamassa lgG:tä ja haijanteen pystysuorat seinät kunkin syvennyksen vieressä on muotoiltu käijiksi, jotka ovat toiseen tai toiseen syvennykseen päin. Käqet ja niiden vastaavat merkinnät haijanteen yläpäässä 30 yhdessä osoittavat, mitä kussakin syvennyksessä tutkitaan eli IgM:ää tai IgG:tä.

Edellä mainitut litistetyt osat ovat suunnilleen samanlevyisiä ja tuo leveys ja lusikan pituus on mitoitettu siten, että ne sopivat helposti koeputkeen ja tulevat ulos siitä, esim. 13x100 tai 16x160 millimetrin (mm) koeputkeen, laboratoriolasiin tai muuhun nestettä sisältävään laitteeseen. Yleensä tällaisen lusikan mitat ovat: leveys noin 10- 73 102381 12 mm, paksuus noin 2-4 mm ja kokonaispituus noin 130-160 mm, ja syvennyksiin mahtuu noin 200-250 μΐ nestettä.

Eräs hyväksi todettu lusikka sisältää yläosan suunnilleen kaikkein ylimmässä kolmanneksessa vielä leveämmän, yleensä litistetyn osan, jonka leveys on suurempi 5 kuin käytettävän koeputken läpimitta, esim. leveämpi kuin noin 16 mm, jolloin lusikka voidaan ripustaa koeputkeen lusikan pohjan koskettamatta putken pohjaa, jolloin se voi soveltua myös paremmin pitelyyn. Edelleen lusikassa on ulkonevat jalat, joiden pituus on yhtä kuin lusikan paksuus, lusikan sivuilla siinä päässä, jossa ei ole syvennyksiä, muodostamassa olennaisesti stabiilin, vaakasuoran jalustan, jonka valo rassa lusikka voi olla laboratoriotelineessä.

Saija tällaisten lusikoiden syvennyksiä pinnoitettiin polypeptidillä P62 lisäämällä niihin liuos, jossa oli 100 jim/ml polypeptidiä BBS:ssä, pH-arvon ollessa 8,3-8,5. Liuoksia pidettiin syvennyksissä noin 18-24 tuntia polypeptidin kiinnittämiseksi lusikoiden syvennysten muodostamaan matriisiin ja siten kiinteäfaasialustojen ήπιοί 5 dostamiseksi, ja sitten kiinteä faasi ja nestefaasi erotettiin.

Kiinteäfaasialustoihin tällä tavoin muodostuneet ei-spesifiset tarttumiskohdat suojattiin lisäämällä 10-prosenttinen BSA-liuos tai jokin muu ei-ihmisen proteiini PBS:ssä, pH-arvon ollessa 7,4, 90 minuutin ajaksi 37 °C:ssa. Mikäli lusikkaa ei ollut määrä käyttää heti, suojausliuokseen lisättiin 20-prosenttista glyserolia (v/v) 20 säilymisen parantamiseksi. Sen jälkeen kiinteä faasi ja nestefaasi erotettiin ja lusikoita kuivattiin 37 °C:n lämpötilassa tunnin ajan.

.· Niitä käytettäessä nestemäistä kudosnäytettä, kuten verta, plasmaa, seerumia tai syl keä, lisättiin 100 μ1:η lusikan jokaiseen syvennykseen. Yhden lusikan kuhunkin syvennykseen käytettiin yhdeltä henkilöltä saadun näytteen alikvootteja. Saatuja kiin-25 teä/nestefaasiseoksia pidettiin yllä kahden minuutin ajan vastaavien kiinteään faasiin sidottujen immunologisten reaktiotuotteiden muodostamiseksi.

Kiinteä faasi ja nestefaasi erotettiin ja pestiin kahdessa eri 13x100 mm:n koeputkessa, jotka molemmat sisälsivät 5 ml PBS:ää sisältävää 0,05 % Tween-20:tä. Vesijoh-tovesihuuhtelua on myös käytetty tehokkaasti tässä vaiheessa.

30 Sen jälkeen 100 μΐ HRPO-konjugoitua anti-ihmis-IgG-vasta-ainetta lisättiin edellä mainitulla "G"-merkinnällä varustetun syvennyksen kiinteään alustaan ja 100 μΐ HRPO-konjugoitua anti-ihmis-IgM-vasta-ainetta lisättiin edellä mainitulla "M"-mer-kinnällä varustetun syvennyksen kiinteään alustaan kahden toisen kiinteä/nestefaasi- 74 102381 seoksen muodostamiseksi. Saatuja seoksia ylläpidettiin huoneenlämpötilassa kahden minuutin ajan.

Kiinteä faasi ja nestefaasi erotettiin. Kiinteä faasi pestiin sen jälkeen kahdesti edellä kuvatulla PBS/Tween-20-liuoksella.

5 Tämän pesuvaiheen jälkeen kiinteisiin alustoihin lisättiin 100 μΐ jotakin väriä kehittävää liuosta, kuten edellä kuvattua OPD:tä sisältävää liuosta tai ABTS:ää, ja 3 % (v/v) vetyperoksidia edellä mainitussa puskurissa. Lusikat pantiin vaakasuoraan jalkojensa varaan laboratoriotelineeseen tätä vaihetta varten. Tällä tavoin muodostettua värin muodostavaa kiinteä/nestefaasiseosta ylläpidettiin vielä kahden minuutin ajan 10 huoneenlämpötilassa ja värinmuodostusreaktiot sammutettiin lisäämällä 50 μΐ 1-prosenttista natriumdodekyylisulfaattiliuosta tai 2N HCl-liuosta, kuten edellä kuvattiin.

Edellä kuvattu analyysi vie hieman yli kuusi minuuttia, kun kiinteät alustat on valmistettu. Tämä analyysi suoritetaan loppuun tutkimalla silmämääräisesti värin voi-15 makkuutta kussakin syvennyksessä. Siten kun väri on voimakkaampi IgG-kokeessa, potilas on toipumisvaiheessa, kun väri on voimakkaampi IgM-kokeessa, potilas on IM:n akuutissa vaiheessa ja kun värit ovat suunnilleen yhtä voimakkaat, akuutti vaihe on muuttumassa toipumisvaiheeksi.

Tuloksia, jotka saatiin edellä kuvatulla likimain kuusi minuuttia vievällä analyysillä, 20 verrattiin tuloksiin, jotka saatiin edellä kuvatulla mikrotiitterilevyllä suoritetulla analyysillä, jossa laskettiin vasta-aineiden suhde ja jonka suorittaminen vei noin 2,5 * tuntia. Verrattiin kolmeakymmentä seeruminäytettä kustakin henkilöryhmästä, jotka käsittivät (a) henkilöitä, joilla oli akuutti EBV-IM-infektio, (b) normaaleja laborato-riokoehenkilöitä, joilla oli ollut virus ja jotka olivat serologisesta VCA+, ja (c) kliini-25 seen laboratorioon annettuja näytteitä potilailta, joilla oli IM:n kaltainen sairaus.

Kaksikymmentä kahdeksan kolmestakymmenestä seerumista, jotka olivat potilailta, joiden oli kliinisesti tunnistettu olevan akuutissa vaiheessa, osoittautuivat akuuteiksi kummassakin kokeessa. Kaksi seerumia, joista ei saatu tulosta pitemmässä kokeessa, koska IgM-taso oli alle vaaditun minimiarvon, todettiin kuuluvan akuuttiin vaihee-30 seen lyhyemmässä kokeessa.

Yleinen yhtäpitävyys todettiin muissa seerumiryhmissä sekä lisäesimerkkejä siitä, että tulos saatiin lyhyemmässä visuaalisessa kokeessa sellaisesta seerumista, josta ei 75 102381 pitemmässä kvantitatiivisessa kokeessa saatu tulosta. Lisäksi oli muutamia tapauksia, joissa tulokset olivat erilaisia.

Myöhemmässä kliinisessä tutkimuksessa likimain kuuden minuutin analyysin spesifisyydeksi ja herkkyydeksi EBV-IM:n akuutin vaiheen toteamisessa todettiin noin 5 94-95 prosenttia.

£. Soluviljelyt Tämän keksinnön mukaisten reseptorimolekyylien kykyä reagoida immunologisesti soluissa syntyvän EBNA:n kanssa tutkittiin edellä kuvatulla tavalla käyttäen WI-L2-, Raji-, Daudi-ja RJAB-solulinjoja. WI-L2-solut (ATCC CRL 8155 W1L2-NS, 10 American Type Culture Collection, Bethesda, MD) ovat EBV-genomi-positiivinen ei-produktiivinen B-lymfoblastilinja, joka on johdettu ihmispotilaasta, jolla oli perinnöllinen sferosyyttinen anemia. Levy ym., Cancer, 22:517-524 (1969).

Raji-solut (ATCC CRL 86, American Type Culture Collection, Bethesda, MD) ovat EBV-genomi-positiivinen EBNA:a tuottava lymfoblastin kaltainen solulinja, joka on 15 peräisin Burkittin lymfoomaa sairastavasta potilaasta. Epstein, J. Nat. Cancer Inst., 34:231 (1965). Daudi-solut (ATCC CCL 213, American Type Culture Collection, Bethesda, MD) ovat myös EBNA:a tuottava solulinja. BJAB-solut ovat ei-EBNA:a tuottava lymfosyyttisolulinja, joka on saatavilla Scripps Clinic and Research Foun-dationilta, La Jolla, CA.

20 Edellä mainittuja solulinjoja viljeltiin RPMI 1640-väliaineessa [Moore, J. Am. Med. Assoc., 199:519-524 (1967) ja Morton, In Vitro, 6:89-100 (1970)], johon lisättiin 2 mM L-glutamiinia ja 10-prosenttista vasikan sikiön seerumia.

CMV-kannan AD-169-soluja saatiin lahjaksi Dr. D. Richmanilta, University of California, San Diego. Virus propagoitiin ihmisen fibroblastilinjassa GM-2504, joka 25 saatiin Human Genetic Mutant Cell Repositorystä (Camden, NJ). Solut kasvatettiin DMEM-väliaineessa, joka sisälsi 10-prosenttista vasikan sikiön seerumia ja ne in- « fektoitiin juuri ennen niiden yhtymistä kolme kertaa. Solut korjattiin yhdeksän päivän kuluttua pesemällä ne kahdesti PBS:llä ja ekstraktit valmistettiin lisäämällä 10 ml DEM.ää [2 % SDS, 2 % 2-merkaptoetanolia, 0,0004 % bromifenolisineä, 40 30 millimoolista (mM) Tris-HCl:a, pH 6,8, ja 15 % glyserolia)], joka sisälsi 10 μg/ml fenyylimetyylisulfonyylifluondia suoraan 150 cm kudosviljelmäastiaan, joka sisälsi takertuneet infektoituneet solut. Astia raaputettiin solukaapimella ja liuos poistettiin, sitä keitettiin kaksi minuuttia ja varastoitiin -20 °C:een.

76 102381 F. Kokosoluekstraktit EBNA:a tuottavista ja ei-tuottavista (verrokki) soluista valmistettiin ekstrakteja sen määrittämiseksi, voitiinko tämän keksinnön mukaisia reseptorimolekyylejä käyttää EBNA-ekspression diagnosointiin. Edellä kuvatuista viljelmistä peräisin olevia solu-5 ja pestiin fosfaatti-puskuroidussa saliinissa (PBS; 150 mM NaCl, 10 mM natrium-fosfaatti, pH 7,4), joka sisälsi 0,2 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, paisutettiin 5 minuuttia retikulosyytti-standardipuskurissa (RSB; 10 mM NaCl, 10 mM tris-HCl, pH 7,4, 1,5 mM MgCk, 0,2 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridi) ja hajotettiin äänikäsittelyllä 3-5 tilavuusmäärään RBS:ää, jonka NaCl-moolisuus (M) oli säädetty 10 arvoon 0,2-0,35. Kun äänikäsiteltyä materiaalia oli pidetty 30 minuuttia jään päällä, se sentrifugoitiin nopeudella 10 000 x g 15 minuuttia solujätteiden poistamiseksi.

G. Immunoblotting-menetelmät

Edellä saatuja soluekstrakteja tutkittiin EBNA:n tunnistamiseksi käyttäen ihmisen seerumia, jonka tiedettiin sisältävän anti-EBNA-vasta-aineita tai tämän keksinnön 15 mukaisia tyypillisiä reseptorimolekyylejä. Ekstraktit joko väkevöitiin seostamalla 2 tilavuudella etanolia -20 °C:ssa 18 tuntia ja liuotettiin sitten näytepuskuriin [SB; 10 % glyserolia, 2 % 2-merkaptoetanolia, 1 % natriumdodekyylisulfaattia (SDS), 0,002 % bromifenolisineä, 40 mM tris-HCl (pH 7,4)] tai se laimennettiin 1:6 näyte-puskuriin SDS-polyakryyliamidigeelieletroforeesia varten (SDS-PAGE). 7,5 % po-20 lyakryyliamidigeeliä valettiin ja ajettiin menetelmän mukaan, joka on kuvattu julkaisussa Laemmli, Nature, 277:680-685 (1970), käyttäen kaikkiaan 50-200 mikrogrammaa proteiinia raitaa kohti.

Elektroforeesin jälkeen proteiiniraidat siirrettiin SDS-polyakryyliamidigeelistä elektroforeettisesti nitroselluloosaliuskojen muodossa olevalle kiinteälle alustalle 25 (Schleicher ja Schuell, Detroit, MI) Towlinin et ai. menetelmällä, Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A., 76:4350-5354 (1979). Tämä suoritettiin käyttämällä Bio-Rad Trans-Blot-laitetta (Bio-Rad, Richmond, CA) 70 voltin jännitteellä 2-3 tuntia 12,5 mM .: Tris-hydroksidissa, 96 mM glysiinissä ja 20 % metanolissa.

Siirtämisen jälkeen nitroselluloosasuodattimia eli blotteja kyllästettiin tunnin ajan 30 joko 2-prosenttisessa BSA (v/v) PBS:ssä tai 2-prosenttisessa maitojauheessa (w/v) PBS:ssä ei-spesifisen tarttumisen rajoittamiseksi. Sitten blottien annettiin reagoida immunologisesti 0,1 ml:n kanssa joko EBNA-positiivista ihmisen seerumia ja kaniinin anti-polypeptidi-vasta-aineita 2 ml:ssa PBS:ää tai 2-prosenttista maitoa 1 tunnin ajan 37 °C:ssa.

77 102381 EBNA-proteiiniin sitoutuneet anti-peptidi-vasta-aineet tunnistettiin antamalla Mottien reagoida merkkiaineen kanssa. Tässä yhteydessä 20 ml 125I-leimattua [200 000 lukemaa/minuutti/milligramma cpm/ml), 106 lukemaa/minuutti/milligramma (cpm/mg)] S. aureuksen proteiini A:ta saatettiin kosketukseen immunologisen reak-5 tiotuotteen kanssa 30 minuutiksi 37 °C:ssa. Blotit pestiin PBSillä ja valotettiin Kodak XAR röntgen-filmille yön ajaksi -70 °C:ssa.

Eräässä vaihtoehtoisessa menettelytavassa soluproteiinia sisältävät ekstraktit pantiin 13 cm levyiselle kaistaleelle 7,5-prosenttista akryyliamidigeeliä ja suoritettiin elektroforeesi. Elektroforeesigeelin sisältö siirrettiin nitroselluloosapaperille kuten aikai-10 semmin on selostettu [Billings ym., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 80:7104-7108 (1983); Rumpold ym., J. Immunol., 138:593-599 (1987); Rhodes ym., J. Exp. Med., 165:1026-1040 (1987)]. Seerumit laimennettiin suhteessa 1:20 tai 1:50 maitojauhe-puskurissa (PM) (3 % maitojauhetta 0,05 M boraatissa, 0,15 M NaCLssa, pH 8,3) ja saatettiin kosketukseen liuskan kanssa 1 tunniksi huoneenlämpötilassa immunologi-15 sen reaktion aikaansaamiseksi seerumissa olevien vasta-aineiden ja proteiinien välillä. Sitten liuskat pestiin ja immunoreaktiivisuus määritettiin inkuboimalla liuoksella, jossa oli 0,6 pg/ml (PM.ssä) affmiteettipuhdistettua kaniinin anti-ihmis-IgM-vasta-ainetta (Jackson Laboratories, Avondale, PA) tai affmiteettipuhdistettua kaniinin anti-ihmis-IgG-vasta-ainetta, joka saatiin samasta lähteestä.

20 Pesun jälkeen liuskojen annettiin reagoida detektointiliuoksen kanssa, jossa oli l25I-vuohen anti-kaniini-IgG-vasta-ainetta, jota on kuvattu aikaisemmin [Rumpold ym., J. Immunol., 138:593-599 (1987); Rhodes ym., julkaisussa Herpesvirus, R. Rapp ed. Alan R. Liss, New York, s. 487-496 (1984); Rhodes ym., J. Immunology, 134:211-216 (1985); Smith ym., J. Infect Dis., 154:885-889 (1986); Geltosky ym., J. Clin. 25 Lab. Analysis 1:153-162 (1987) ja Rhodes ym., J. Exp. Med., 165:1026-1040 (1987)] ja raidat tunnistettiin autoradiografilla, kuten edellä kuvattiin.

Synteettiset peptidiestot suoritettiin laimentamalla seerumeja 1:50 PM:ään ja lisäämällä vapaata peptidiä, niin että lopullinen konsentraatio oli 400 pg/ml IgM-vasta-• ‘ aineen estämiseksi ja 20-50 pg/ml IgG-vasta-aineen estämiseksi. Tätä liuosta ylläpi- 30 dettiin (inkuboitiin) yön yli 4 °C:ssa ja sitten sitä käytettiin blottauskokeeseen, kuten edellä kuvattiin.

H. Immunisaatiot Tämän keksinnön mukaisia reseptorimolekyylejä ovat kokonaiset vasta-aineet, jotka on synnytetty nisäkkäissä immunisoimalla ne ympillä, joka sisältää jotakin edellä 78 102381 kuvattua polypeptidiä ja/tai multimeeriä. Sekä polypeptidejä että multimeerejä voidaan käyttää ympissä yksinään tai konjugoituina johonkin kantajaproteiiniin, kuten avaimenreikäkotilohemosyaniiniin (KLH). Polypeptidejä käytetään kuitenkin mieluiten konjugaatteina ja multimeerejä yksinään.

5 Kaniineja immunisoitiin ympillä, joka sisälsi 1,0 mg konjugaattia Freundin komple-tissa adjuvantissa (CFA) ja tehostettiin kuukautta myöhemmin 1,0 mg: 11a konjugaattia Freundin inkompletissa adjuvantissa (IFA). Kukin immunisointi käsitti yhden ihonalaisen injektion lonkkaan. Kaniineista otettiin verinäytteet 1 ja 2 kuukauden kuluttua tehosteesta.

10 Sitten verinäytteistä valmistettiin alalla tunnetuilla menetelmillä seerumit, jotka sisälsivät immunologisesti aktiivisia vasta-aineita. Nämä vasta-aineet reagoivat im-munologisesti yhden tai useamman tämän keksinnön mukaisen polypeptidin kanssa ja EBNA-antigeenisen determinantin kanssa. Niitä voidaan sitten käyttää analyysi-systeemissä EBNA:n tunnistamiseksi.

15 Erillisiä ymppejä valmistettiin käyttäen CFA:ta tai IFA:ta seuraavasti: konjugaattia liuotettiin riittävä määrä, jotta saatiin haluttu määrä polypeptidiä per ymppäys (esim. 1 mg), PBS:ään (noin 0,5 ml), pH:n ollessa 7,2. Samansuuruiset tilavuusmäärät CFA:ta tai IFA:ta sekoitettiin sitten konjugaattiliuoksiin, jolloin saatiin ymppi, joka sisälsi konjugaattia, vettä ja adjuvanttia, jossa vesi:öljy-suhde oli 1:1. Sen jälkeen 20 seos homogenoitiin ympin aikaansaamiseksi. Tällä tavoin valmistetun ympin tilavuus oli yleensä enemmän kuin 1 ml ja osa konjugaatista, PBS:stä ja adjuvantista menetettiin emulgoinnin aikana. Pääosiltaan koko talteenotettavissa oleva emulsio pantiin ruiskuun ja sitten se ruiskutettiin kaniineihin, kuten edellä selostettiin. Ka-niineihin ruiskutetun ympin määrän uskotaan olleen noin 90 prosenttia ympin mää- 25 rästä ennen emulgointivaihetta.

Edellä selitetyt ympin varastoliuokset ovat eräs esimerkki keksinnön mukaisista ym- peistä. Kuten tässä on osoitettu, niitä voidaan käyttää reseptorimolekyylien, jotka .: reagoivat immunologisesti EBNA-1 :n kanssa, tuottamiseen.

• · I. Immunofluoresenssimenetelmät 30 Eräässä toisessa esimerkkimenetelmässä EBNA:n toteamiseksi kudosnäytteessä käytetään tämän keksinnön mukaisia reseptorimolekyylejä ja fluorikromi-merkkiai-netta reseptori-EBNA-l-immunoreaktiotuotteen toteamiseksi.

79 102381 Tässä tutkimuksessa 2x104 WI-L2-soluja, joita oli kasvatettu, kuten edellä kuvattiin, levitettiin tasaiselle objektilasille käyttäen sytosentrifugia (CYTOSPIN, Shandon Southern, Astmoor, Runcorn, Cheshire, England). 5 minuutin ilmakuivauksen jälkeen 20 °C:ssa solut kiinnitettiin asetonissa 2 minuutin käsittelyllä, sitten niitä ilma-5 kuivattiin 2 minuuttia 20 °C:ssa. Lasit varastoitiin -20 °C:een käyttöön saakka.

Kiinnitetyt WI-L2-solut tutkittiin EBNA:n toteamiseksi käyttämällä kaniinin anti-polypeptidi-vasta-aineita (tämän keksinnön mukaisia reseptoreita), jotka oli synnytetty polypeptidejä P27, P60, P62 ja P89 vastaan. 50 μΐ kutakin kaniinin antiseerumia, l:20-laimennoksina VBS-puskurissa (120 mM barbitolia, pH 7,3, 144 mM 10 NaCl, 2,5 mM MgCl2 ja 0,75 mM CaCl2) inkuboitiin (saatettiin kosketukseen ja pidettiin kosketuksessa kiinnitettyjen solujen kanssa) 20 °C lasilla ennalta määrätyn ajan (esim. 30 minuuttia), joka oli riittävä vasta-aineiden ja EBNA:n väliselle immuunireaktiolle. Negatiivinen vertailuksi käsiteltiin samalla tavalla normaalilla kaniinin seerumilla.

15 Edellä mainitun inkuboinnin aikana osa anti-polypeptidi-vasta-aineista reagoi im-munologisesti kiinnitetyissä WI-L2-soluissa olevan EBNA:n kanssa. Sitoutumattomat vasta-aineet poistettiin pesemällä VBS:llä ja lasiin jätettiin vain EBNA-resep-tori-immunoreaktiotuote.

EBNA:aan sitoutuneet anti-polypeptidi-vasta-aineet tunnistettiin ensiksi inkuboimal-20 la 50 μΐ marsukomplementtia (Tago, Burlingame, CA) l:10-laimennoksena VBS:ssä kullakin lasilla riittävän pitkän ajan (30 minuuttia) komplementin sitoutumiseksi reseptoreihin. Sitten lasit pestiin VBS:llä mahdollisen kaniini-anti-polypeptidi-IgG- « - vasta-ameisim sitoutumattoman komplementin poistamiseksi.

Fluoreseiini-leimattua vuohen anti-marsu-C3:a (leimattuja anti-komplementti-vasta-25 aineita, Cappel Laboratories Cochranville, PA) käytettiin antigeeni-vasta-aine-komplementtikompleksien toteamiseksi. 50 μΐ merkkiantiseerumia l:20-laimennok-sena VBS:ssä inkuboitiin kuten edellä kullakin lasilla 30 minuuttia 20 °C:ssa. Sitou-tumaton vuohen anti-marsu-C3 pestiin pois lasilta VBSillä. Immunoreaktiotuotteita tarkasteltiin sitten fluoresenssimikroskoopilla.

30 J. Sirkulaaridikroismispektroskopia

Polypeptidien konformaatio-ominaisuuksia tutkittiin mahdollisen sekundaariraken-teen valaisemiseksi, joka saattaisi olla tarpeellinen polypeptidin immuunireaktiolle ihmis-anti-EBNA-vasta-aineiden kanssa. Polypeptidit laimennettiin konsentraatioon 80 102381 1 mg/ml fosfaattipuskuroitua saliinia (PBS). Spektrit ajettiin käyttäen 1 ml näytteitä Cary 61 spektropolarimetrissä (Cary Instruments, Applied Physics Corp., Monrovia, CA) liitettiin ja käsiteltiin automaattisesti Digital Equipment Corporation 11/02-tietokoneella (Digital Equipment Corporation, Maynard, MA). Kunkin polypeptidin 5 10 peräkkäisen skannauksen keskiarvosta piirrettiin kuviossa 1 esitetyt käyrät.

K. Näytelähteet ja serologia Tässä käytetyt seeruminäytteet saatiin erilaisista lähteistä. Eräs seerumisaija näitä kokeita varten saatiin 13 potilaalta, joilla oli EBV-indusoima IM. IM-spesifisiä hete-rofiilisiä vasta-aineita oli aikaisemmin todettu 10:llä 13 potilaasta käyttämällä hevo-10 sen solu-difFerentiaaliadsorptioputkitestiä. Heterofiilisiä vasta-aineita ei todettu kahdessa potilaassa siitä huolimatta, että kokeita tehtiin erilaisilla menetelmillä. Yhdellä henkilöllä esiintyi hevosen solu-agglutiniinien ei-diagnostisia alhaisia tasoja, jotka todettiin ainoastaan yhdessä näytteessä, joka otettiin hänen tautinsa akuutissa vaiheessa. Tämän potilaan katsottiin olevan heterofiili-negatiivinen tämän tutkimuksen 15 tarkoituksiin. Serologiset tulokset osoittivat käynnissä olevat primaariset EBV-infektiot kolmesta heterofiili-negatiivisesta potilaasta.

Tulokset kahdesta potilaasta 10 heterofiili-positiivisen potilaan joukosta ja kahdesta kolmen heterofiili-negatiivisen potilaan joukosta on julkaistu aiemmin [Horwitz ym., Am. J. Med., 63:947-957 (1977)]. Tätä tutkimusta varten tehtiin serologiset 20 kokeet aikaisemmin jäädytetyistä seeruminäytteistä epäsuoralla immunofluoresens-simenetelmällä kaupallisesti saatavilla testeillä IgG- ja IgM-vasta-aineiden toteamiseksi VCA:ta vastaan (Litton Bionetics, Inc. Charleston, SC).

Toista seerumiryhmää käytettiin EBV-IM-ja CMV-IM-tutkimuksiin. Tuossa näyte-ryhmässä yksi potilas (D.B.) oli tyypillinen heterofiili-positiivinen EBV-IM-tapaus, 25 jonka jälkeen seurasi tapaukseton kliininen toipuminen. Taudin akuutin vaiheen aikana hän kehitti korkeita anti-VCA-vasta-ainetiittereitä (IgM = 1:80 ja VCA-IgG 1:1280) ilman sitä seuraavia vasta-aineita anti-EBNA:a kohtaan (1:2). 174 päivän .· kuluttua taudin puhkeamisesta IgM-anti-VCA-vasta-aineita ei ollut enää todettavis sa, kun taas anti-EBNA oli kehittynyt 76 ja 111 päivän välillä. Vasta-aineita 30 CMV:lle ei ollut todettavissa sarjaseerumeissa komplementtikiinnityksellä (1:8). Eräällä toisella potilaalla (D.S.) oli alussa akuutti, luultavasti primaarinen sytomega-lovirus(CMV)infektio (CMV-IM), jota seurasi neljä kuukautta myöhemmin primaarinen EBV-infektio. Tässä potilaassa todettiin CMV-makroglobuliineja (1:256), nelinkertainen nousu vasta-aineissa anti-CMV:tä vastaan komplementtikiinnityksellä 35 (CMV-CF) mitattuna eikä vasta-ainevastetta mitään EBV.hen liittyvää antigeeniä 81 102381 kohtaan. Hänen toisen tautinsa aikana, joka alkoi 124 päivän kuluttua ensimmäisen taudin alkamisesta, ilmestyi primaarinen EBV-infektio, jolle olivat leimallisia anti-VCA-IgM-vasta-aineet (1:320) ja aluksi vasta-aineiden puuttuminen (1:2), mutta myöhemmin kehittyminen EBNA:a vastaan. IgM-vasta-aineet VCA:lle katosivat 5 saijakokeissa. Hänen toisen tautinsa aikana (EBV-IM) CMV-makroglobuliineja (CMV-IgM) ei enää ollut todettavissa, kun sen sijaan komplementtiin kiinnittyviä vasta-aineita CMV:lle oli yhä mukana stabiileina tasoina 1:28.

Seerumeita saatiin myös 10 muulta potilaalta, jotka otettiin CMV:n indusoiman mononukleoosin eri vaiheiden aikana. Heidän akuutin vaiheen seeruminsa osoittivat 10 huomattavia tiittereitä (= 1:32) CMV-makroglobuliineista ja anti-CMV:stä (CF) kaikissa tapauksissa. Nelinkertaisia tiitterin nousuja tai laskuja todettiin komplement-tikiinnityksellä kuudessa kymmenestä (6/10) potilaasta otetuissa näytesaijoissa. Kaikista kymmenestä potilaasta pystyttiin serologisesti osoittamaan vanhat EBV-infektiot kohtuullisilla anti-VCA(IgG)anti-EBNA:n vakiotasoilla (1:10) eikä lain-15 k aan vasta-aineita anti-VCA-(IgM):ää vastaan. Joitakin tuloksia viimeksi mainitusta yhdestätoista potilaasta sisältyi erääseen aikaisempaan raporttiin [Honvitz ym., Medicine, 65:124-133 (1986)].

Kokeita EBV:hen liittyvien vasta-aineiden VCA:ta (IgM ja IgG), varhaisia antigeenejä (EA) ja EBNA:a vastaan sekä CMV-makroglobuliinien (CMV-IgM) tunnista-20 miseksi suoritettiin standardinmukaisilla immunofluoresenssimenetelmillä (IFA) [Honvitz ym., Medicine, 65:124-133 (1986) ja Henle ym., Human Pathology, 5:551-565 (1974)]. Anti-CMV todettiin myös komplementtikiinnityksellä käyttäen kannan AD-169 virusta (Microbiological Associates, Bethesda, Maryland).

Edellä selostettu on tarkoitettu havainnollistamaan keksintöä, mutta ei sitä rajoitta-25 maan. Monia variaatioita ja muunnelmia voidaan tehdä poikkeamatta keksinnön uusien tunnusmerkkien hengestä ja alasta. On selvää, että tässä ei ole tarkoitus tehdä mitään rajoituksia tässä kuvattujen spesifisten polypeptidien, vasta-aineiden, niiden koostumusten ja käyttöjen suhteen eikä niitä tule tästä tehdä.

Claims (8)

82 102381

1. Polypeptidi, tunnettu siitä, että se sisältää 15 - noin 40 aminohappotähdettä, joiden sekvenssi vastaa CMV:n koodaaman polypeptidin sekvenssiä, joka on esitetty kuviossa 13, mainitun sekvenssin sisältäessä sekvenssin, jolla on kaava:

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että mainitulla 10 polypeptidillä on aminohappotähdesekvenssi, joka sisältää sekvenssin, joka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat: a) -Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly- ja b) -Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-

15 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että mainitulla polypeptidillä on sekvenssi, joka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat: a) H-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-OH, 20 b) H-Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-OH ja c) H-Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Cys-OH.

4. Menetelmä anti-EBNA-vasta-aineiden tunnistamiseksi kudosnäytteestä, : 25 tunnettu siitä, että menetelmässä: • ·. a) lisätään mainittuun kudosnäytteeseen jokin patenttivaatimuksen 1 mukainen polypeptidi immunoreaktioseoksen muodostamiseksi, b) ylläpidetään mainittua seosta ennalta määrätty aika, joka on riittävä, jotta mahdolliset mainitut anti-EBNA-vasta-aineet reagoivat immunologisesti mainitun 30 polypeptidin kanssa immunologisen reaktiotuotteen muodostamiseksi ja 83 102381 c) määritetään mainittu immunologinen reaktiotuote ja siten mainitut anti-EBNA-vasta-aineet mainitussa näytteessä.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu polypeptidi on valittu ryhmästä, jonka muodostavat: 5 a) H-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-OH, b) H-Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-OH ja c) H-Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-

10 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Cys-OH.

5 -Gly-R1 -Gly-R2-Gly- jossa R ja R tarkoittavat aminohappotähteitä, jotka yksitellen tarkasteltuina ovat samoja tai erilaisia ja ovat Ala, Asn, Arg, Gly, Leu, Pro, Ser ja Thr, edellyttäen että R1 ja R2 eivät ole kumpikin Gly, ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu vaihe c) käsittää vaiheet, joissa: i) sekoitetaan vaiheesta (b) saatu immunologinen reaktio-tuote anti-ihmis-IgM-entsyymi-leimattuihin vasta-ainemolekyyleihin toisen immunoreaktioseok- 15 sen muodostamiseksi ii) pidetään yllä toista immunoreaktioseosta ennalta määrätty aika, joka on riittävä mahdollisten läsnä olevien anti-EBNA-vasta-aineiden immunologista reaktiota varten mainittujen leimattujen vasta-ainemolekyylien kanssa leimatun immunologisen reaktiotuotteen muodostamiseksi ja 20 iii) määritetään mainittu leimattu immunologinen reaktiotuote ja siten anti-EBNA-IgM-vasta-aineet mainitussa näytteessä. •

7. Pakkausmuodossa oleva diagnostinen systeemi anti-EBNA-vasta-aineiden toteamiseksi kudosnäytteessä, tunnettu siitä, että se käsittää erillisissä pakkauksissa: 25 a) jonkin patenttivaatimuksen 1 mukaisen polypeptidin ja b) merkkiaineen mainitun polypeptidin immunoreaktion ihmis-anti-EBNA- « 1. vasta-aineiden kanssa osoittamiseksi.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen diagnostinen systeemi, tunnettu siitä, että mainittu polypeptidi on valittu ryhmästä, jonka muodostavat: 30 a) H-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly- . Gly-Ser-Gly-Gly-OH, 84 102381 b) H-Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-OH ja c) H-Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Cys-OH, 5 ja että mainittu merkkiaine on anti-ihmis-IgM-entsyymi-leimattu vasta-aine.