PT91397B

PT91397B - Processo de preparacao de polipeptideos sinteticos e de anticorpos relacionados com o antigenio nuclear do virus de epstein-barr

Info

Publication number: PT91397B
Application number: PT91397A
Authority: PT
Inventors: Gary Rhodes
Original assignee: Scripps Clinic Res
Priority date: 1988-08-09
Filing date: 1989-08-07
Publication date: 1995-05-04
Also published as: DE68925819D1; EP0428629A4; US5717065A; NO910479L; WO1990001495A1; ES2018909A6; NO910479D0; FI102381B1; DK21191D0; PT91397A; DE68925819T2; ATE134648T1; AU4400089A; EP0428629A1; CA1340446C; FI910587A0; AU643188B2; DK175828B1; FI102381B; EP0428629B1

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

Esta é uma continuação em parte do pedido com o NR de S£ rie 029860 apresentado em 27 de março de 1987» 0 qual era, por sua vez, uma continuação do pedido com o NR de Série 638 726, agora Patente dos EUA N? . 4 654 419, cujas revelações são aqui incorporadas por referência.

ÂMBITO TÉCNICO presente invento refere-se aos processos de preparação de imunogénios, antigénios, inoculados, anticorpos, métodos e si£3 temas úteis no tratamento e diagnóstico de doenças envolvendo o vi. rus de Epstein-Barr, o seu antigênio nuclear, eo citomegalovírus.

ANTECEDENTES DO INVENTO vírus de Epstein-Barr (EBV) ê um membro da família dos vírus do herpes e é o agente causal da mononucleose infecciosa (MI) nos humanos. 0 EBV também foi implicado na patogénese do linfoma de Burkitt, carcinoma nasofaríngeo e neoplasmas de linf£ eitos B surgindo em doentes imunossuprimidos. Uma prova circunstancial também indicou um possível papel para este vírus na doença autoimune humana, tal como a artrite reumatóide e o síndroma de Sjogren.

EBV é um agente ambiental extremamente comum, infectando 80-100% dos indivíduos em redor do mundo. A infecção inicial ou primária pode ser aguda ou subclínica. Esta é seguida por um período longo durante o qual a infecção pelo EBV está latente nos linfócitos B presentes no sangue circulante, gânglios linfáticos, e baço.

A latência é o processo pelo qual um vírus está presente intracelularmente num estado não expresso ou parcialmente exprejs so. A latência pode ser reactivada. Apesar de os factores do ho£3 pedeiro que controlam a latência in vivo serem pouco conhecidos, existem alguns indícios que sugerem que a falha de um ou mais me. canismos imunes é um factor importante.

Os elementos citotóxicos e supressivos das células T da

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resposta imune ao EBV estão descritos como sendo muito importan tes na supressão da infecção aguda pelo EBV na MI. São também importantes no impedimento da proliferação incontrolada de linfócitos B infectados de forma latente pelo EBV.

Pensa-se que a falha dos mecanismos supressores das célia las T seja importante ao permitir a emergência do linfoma de Burkitt Africano, do carcinoma nasofaríngeo, dos linfornas de cé_ lulas B surgindo como consequência da terapia imunossupressora utilizada para prevenir a rejeição de transplantes de orgãos, e linfomas como os que surgem durante os tratamentos de várias d£ enças auto-imunes. Epstein e Achong ed., The Epstein-Barr Virus Spring-Verleg, Berlin, Heidelberg (1970); e Crawford e colab., Lancet,1355 (1980). Além disso, pensa-se que a falha destes meca nismos das células T e a proliferação excessiva consequente dos linfócitos infectados pelo EBV jogue um papel na artrite reumató de. Slaughter e colab., J. Exp. Med., 148:1429 (1978); Depper e colab., J. Immunology, 127:1899 (1981) e Tosato e colab., N. Engl. J. Med. 305:1238 (1981).

As respostas imunes serológica e mediada por células que se seguem à infecção primária pelo EBV estão bem documentadas e refletem a resposta do hospedeiro aos antigénios virais expressos durante o curso da infecção. 0 perfil destas respostas assim como a detecção dos antigénios nos tecidos estão a tornar-se cada vez mais úteis no diagnóstico de doenças associadas com o EBV

Da forma clássica, a infecção primária é detectada pelo anticorpo para o antigénio da cápside virai (VCA) e a fase conva lescente é marcada pela elevação dos anticorpos para os antigénios nucleares codificados pelo EBV ££EBNA_7 /gHenle e colab., Hum. Pathol., 5.:551-565 (1974)J7· ⁰ EBNA-1 (também aqui referido por vezes, como EBNA), o primeiro antigénio nuclear a ser reconhecido, foi identificado cjomo uma proteína de 65 000 a 85 000 quilodaltons (KD) pela técnica da imunomancha. /Strnad e colab., J Virol., 38:990 (1981); Hennessey e colab., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:5665-5669 (1983); e Billings e colab., Proc. Natl.

Acad. Sei. USA, 80:7104 (1983).

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tamanho da proteína EBNA-I varia de 65 000 a 85 000 nas várias linhas de células B, com cerca de 77KD sendo típico. 0 ta manho da molécula está correlacionada com a variação do comprimento da região IR-3 do ADN do EBV /Hennessey e colah., Proc♦ Natl. Acad. Sei. USA, 80:5665-5669 (1983)/7. A região IR-3 codifica para uma sequência de glicina-alanina repetitiva, que foi caracterizada como sendo o epítopo maior da proteína EBNA-I //Billings e colab., Proc. Natl. Acad. Sei, USA, 8():7104 (1983)_7

Embora os ensaios geralmente utilizados investiguem o VCA e, em seguida, o EBNA-1, o EBNA-1 é o antigénio associado com o EBV mais precoce que pode ser detectado após a infecção. 0 EBNA foi detectado no núcleo de linfócitos B transformado no crescimento infectados de forma latente. 0 EBNA também foi detectado nos núcleos dos linfoblastos do tumor de Burkitt Africano e nas células do carcinoma nasofaríngeo anaplástico.

A concentração de EBNA nos núcleos celulares dos linfócitos B infectados pelo EBV fluctua durante as várias fases do ciclo reprodutivo das células. Assim, acredita-se que o EBNA seja ciclicamente sintetizado e degradado. Como resultado de tal degra dação, os fragmentos proteicos (polipéptidos) do EBNA atravessam o citoplasma celular e acredita-se que existam ou que sejam expressos na membrana exterior. Contudo, não foram identificados até à data polipéptidos específicos da degradação do EBNA.

Acredita-se que, enquanto dentro ou sobre a membrana celjj lar exterior, os polipéptidos da degradação do EBNA constituem um estímulo significativo para os linfócitos T do hospedeiro, e que iniciam a resposta imune que resulta na produção de anticorpos anti-EBNA. Acredita-se também que a resposta celular T específica às células B que expressam os polipéptidos da degradação do EBNA nas suas superfícies pode contribuir para a geração de células T citotóxicas e supressoras importantes na limitação da proliferação dos linfócitos B (infectados pelo EBV) contendo o EBNA.

Assim, ensaios para detectar a presença de EBNA e de anti^ corpos anti-EBNA são importantes em diversas situações clínicas

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EPG:11-SCRF 45.2 comuns. Além disso, uma vacina contra os linfócitos B infectados pelo EBV seria também de importância clínica.

Os anticorpos anti-EBNA são tipicamente analisados utilizando a tediosa técnica da imunofluorescência anti-complemento (ACIF). Reedman e colab., Int. J. Câncer, 11:499-520 (1973). Este ensaio envolve a fixação das células B humanas transformadas pelo EBV a uma lâmina de microscópio. Várias diluições do soro de um doente são então adicionadas às células fixadas. Dado que os soros anti-complementares podem originar reacções falsas-nega tivas ou pró zonas quando são misturados com o complemento (um prc> cedimento em duas etapas), é essencial carregar os esfregaços das células em teste consecutivamente com soro, complemento e o conjugado anticomplemento-fluorescência (um procedimento em três etapas).

Existem diversos problemas com este ensaio. Estes incluem o facto do ensaio ser relativamente insensível e requerer amplificação mediada através do complemento. Além disso, este ensaio não é inteiramente específico e não pode ser interpretado em doentes cujo soro contém anticorpos para núcleos celulares de mamíferos. Para além do mais, os resultados quantitativos obtidos utilizando um ensaio de imunofluorescência anti-complemento são difíceis de reproduzir. Como consequência desta e doutras razões, os ensaios para os anticorpos anti-EBNA foram geralmente confinados a alguns laboratórios especializados.

As dificuldades acima expostas para analisar os anticorpos anti-EBNA deriva da falta de EBNA relativamente puro. A purificação de EBNA a partir de culturas de tecido de células de mamíferos é complexa dada a baixa concentração e polimorfologia do antigénio. Embora seja mais fácil e menos oneroso utilizar c£ lulas inteiras expressando o EBNA, tal como na técnica usual, os problemas de especificidade e de reprodutibilidade são o resulta do directo da utilização de células inteiras.

Demonstrou-se que os péptidos sintéticos, contendo porções da região do EBNA-1 glicina-alanina, são reactivos com o s£ ro de doente com MI por EBV //Rhodes e colab., em Herpesvirus,

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-6R. Rapp ed., Alan R. Liss, New York; pág. 487-496 (1984); Rhodes e colab., J. Immunology, 134:211-216 (1985); Smith e colab.,

J. Infe. Die., 154:885-889 (1986) e Geltosky e colab., J. Clin, Lab Analysis, 1:153-162 (1987)/7· Como mostrado na Patente dos E.U.A. N9. 4 654 419, e posteriormente noutros locais, o péptido denominado P62 pode ser utilizado num ensaio de ELISA para distinguir sorológicamente a fase aguda, da MI por EBV da fase convalescente e da fase de recuperação da MI /$Smith e colab.,

J. Infec. Dis., 154:885-889 (1986) e Geltosky e colab., J. Clin. Lab Analysis, 1:153-162 (1987)_Z7·

A fase aguda da doença é detectada pelo aparecimento de anticorpos IgM para este péptido. Durante a fase convalescente, o título de anticorpo IgM cai e o anticorpo IgG pode ser detectado //Smith e colab., J. Infec. Dis., 154:885-889 (1986)~7.

Os doentes com uma infecçâo muito antiga têm anticorpos IgG para 0 péptido como a classe de imunoglubolina predominante.

A produção de anticorpos contra a proteína EBNA-1 é altamente incomum. Os anticorpos IgM reconhecendo o péptido P62 de glicina-alanina são detectados dentro de um dia após o início da doença //Smith e colab., J. Infec. Dis., 154:885-889 (1986)/7Quando analisados por imunomancha, descobriu-se que estes anticorpos IgM reconhecem a proteína EBNA-1 assim como mais do que uma dúzia de proteínas celulares normais //Rhodes e colab., J. Exp. Med., 165:1026-1040 (1987)//· θ anticorpo que se liga ao EBNA-1 e aos autoantigénios pode ser inibido pelo péptido P62. Assim, a infecçâo aguda pelo EBV induz a síntese de autoanticor pos que parecem partilhar um epitopo relacionado com a região de repetição da glicina-alanina do EBNA-1.

Em contraste, os anticorpos IgG para o EBNA-1 não surgem até diversos meses após o início da doença. Os anticorpos IgG antipéptido P62 medidos pelo ensaio de ELISA //Smith e colab.,

J, Infec. Dis., 154:885-389 (1986) e Geltosky e colab., J. Clin. Lab Analysis, 1:153-162 (1987)/7» ⁰³ anticorpos anti-EBNA-1 medidos por imunofluorescência anti-complemento padrão //Reedman e colab., Int. J. Câncer, 11:499-520 (1973)//» θ os anticorpos

IgG para a proteína EBNA-1 medidos por imunomancha, aparecem to

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-7dos simultâneamente. Estes anticorpos IgG também podem ser inibidos pelo péptido P62, mas são específicos para a proteína ER NA -1 e já não reagem com os autoantigénios celulares /7^RumP°lá ^ecolab., J. Immunol., 138:593-599 (1987); Rhodes e colab., J. Exp, Med., 165:1026-1040 (1987); e Dillner e colab., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:4652-4656 (1984)37.

citomegalovírus (CMV) é um outro membro da família do vírus do herpes. As infecções pelo CMV em pessoas imunocompetentes decorrem geralmente sem complicações significativas e asseme lham-se tipicamente à mononucleose causada pelo EBV.

diagnóstico de uma infecção pelo CMV num doente com si£ tomas semelhantes aos da MI pode ser estabelecido pelo isolamento do vírus a partir de lesões vasculares. Os anticorpos produz.i dos em resposta a uma infecção pelo CMV podem ser detectados por procedimentos de neutralização (NT), fixação do complemento (PC), imunofluorescência e aglutinação de plaquetas (AP), 3/7θ^Γ> Weller, N. Engl. J. Med., 285:203 (1971)3⁷.

As infecções pelo CMV também são latentes, e a doença ocorre em doentes sob terapia imunossupressora e naqueles sujeitos a infecções oportunísticas. A infecção pelo CMV tornou-se a infecção mais comum em doentes que receberam transplantes alogénicos de medula óssea e é uma determinante importante do sucesso ou fracasso do processo de transplante /Neiman e colab,, J. Infect. Dis., 136:754 (1977)3⁷.

Entre os adultos submetidos a terapia imunossupressora após homotransplante renal, mais de 90$ desenvolvem anticorpos activos para o citomegalovírus. Aproximadamente metade dos doentes seronegativos tornam-se subsequentemente infectados sob tera pia imunossupressora. Os receptores seronegativos recebendo um rim dum dador seropositivo desenvolvem quase sempre uma infecção pós-operatória e é provável que desenvolvam os sintomas da infe£ ção.

Em pessoas imunocompetentes, isto é, pessoas que não estão a tomar drogas imunossupressoras e naquelas livres de doenças que comprometem a imunidade, tais como os ARC e o SIDA, as

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EPG:'11-SCRP 45-2 infecções de mononucleose pelo CMV (CMV-MI) encontram-se típica mente em crianças (do nascimento até cerca dos 2 anos de idade), e em adultos, isto é, pessoas com mais do que cerca de 30 a 35 anos. A mononucleose infecciosa causada pelo EBV (EBV-MI) é geralmente encontrada em pessoas desde a adolescência até cerca dos 25 anos de idade, e particularmente em pessoas de cerca dos 15 até cerca dos 25.

Os doentes com ambas as doenças exibem linfocitose atípi. ca, sintomas faríngeos, testes de função hepática anormais, esplenomegália e febre. Os soros de doentes com CMV-MI são negati. vos para o heterófilo, enquanto que os soros da maioria dos doentes com EBV-MI são positivos para o heterófilo.

A engenharia genética e as tecnologias de polipéptidos sintéticos forneceram recentemente soluções para o problema da produção de grandes quantidades de antigénios polipéptidicos e proteína. Contudo, ambas as técnicas são eficazes apenas se a sequência de resíduos de aminoácidos da proteína nativa é conhe_ cida.

A sequência de resíduos de aminoácidos de uma proteína natural pode ser determinada a partir da própria proteína, mas isto é muitas vezes difícil. A sequência de nucleótidos do gene que codifica para a proteína pode também revelar a sequência de resíduos de aminoácidos da proteína. Contudo, todas as sequências de ADN têm três quadros de leitura possíveis, cada um dos quais produz uma proteína diferente. Portanto, deve ser conhecido o quadro de leitura correcto a fim de deduzir a sequência correcta de resíduos de aminoácidos de uma proteína a partir do seu gene.

quadro de leitura correcto de uma sequência de ADN que codifica para uma proteína, e, portanto, a sequência de resíduos de aminoácidos da proteína, pode ser determinado através da utilização de anticorpos. Esta estratégia envolve a manufactura de uma série de fragmentos proteicos ou polipéptidos cujas sequências de resíduos de aminoácidos correspondem às sequências obti das a partir dos três produtos possíveis do gene. Os fragmentos proteicos ou polipéptidos que induzem os anticorpos que imunorea

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EPG:11-SCRF 45.2 _Q_ gem com o produto proteico natural do gene identificam, desse modo, o quadro de leitura correcto do gene. De modo oposto, se os anticorpos para a proteína natural reconhecem os fragmentos proteicos ou polipéptidos manufacturados, também é estabelecida a relação entre o gene e a proteína.

Heller e colab., J, Virol·., 44:311-320 (1982), relataram a sequência de ADN para uma porção do genoma do EBV que se descobriu conter uma região interna, designada IR3, consistindo em repetições directas de uma sequência hexanucleótidica e duas se_ quências nonanucleótidicas. Eles citaram indícios sugerindo que a sequência circundando e incluindo a IR3 contém o gene que codifica para o EBNA. Contudo, dado que não era conhecido qual dos três quadros de leitura possíveis da sequência de ADN foi transladado, Heller e colab., acima, não foram capazes de deduzir definitivamente a sequência de aminoácidos para a proteína EBNA possível.

Em Setembro de 1983, Hennessy e Kieff, Proc. Natl. Acad. Sei, U.S.A., 80:5665-5669 (1983) relataram o estabelecimento do quadro de leitura natural para a sequência de ADN do EBV descri^ ta por Heller e colab., acima. Essencialmente, eles isolaram o ADN da IR3, clivaram-no aleatóriamente em pequenas peças e inse_ riram as peças no gene lacZ de um vector de expressão da E. Coli de modo que todos os três quadros de leitura do gene EBNA fo· ram expressos, cada um deles num clone diferente. 0 gene lacZ codifica para a beta-galactosidase, um enzima bacteriano. 0 prc> duto do gene de fusão lacZ-IR3 ê expresso na E. Coli como uma proteína de fusão com a sequência proteica da IR3 inserida entre os aminoácidos 7 e 9 (sendo o 8 deleccionado no processo de con£ trucção) da molécula proteica da beta-galactosidase.

Henessy e Kieff, identificaram um gene de fusão IR3-lacZ que expressava o ADN da IR3 no seu quadro de leitura natural por pesquisa de proteínas de fusão que foram reconhecidos por soro humano anti-EBNA positivo. Um plasmídeo identificado deste modo foi designado pKHl82-44.

Para confirmar que a proteína expressa pelo pKHl82-44 con

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-10tinha as determinantes antigénicas específicas do EBNA, Hennessy e Kieff, acima , produziram anti-soro em coelhos contra a proteína de fusão IR3-galactosidase clivada pelo brometo de cia nogénio (CNBr). 0 fragmento de CNBr utilizou um imunogénio contendo 53 aminoácidos homólogos ao EBNA e 89 aminoácidos homólogos à beta-galactosidase. Estes anti-soros reconheceram o EBNA natural em células infectadas pelo EBV utilizando imunofluorescência indirecta.

Os resultados de Hennessy e Kieff parecem ser dependentes da natureza repetitiva do domínio IR3 do EBNA. A proteína de fusão produzida pelo pKHl82-44 contém um segmento relativamente longo homólogo com o domínio IR3 (por ex., 53 aminoácidos). Não é, portanto, surpreendente que a proteína de fusão e o seu fragmento de CNBr contenham determinantes antigénicas. Além disso, Hennessy e Kieff não identificaram quais das sequências repetidas no seu fragmento actuaram como determinantes antigénicas.

Apesar de Hennessy e Keiff terem sido capazes de produzir genéticamente um material reconhecido pelos anticorpos anti-EBNA no soro humano, este seria incómodo de utilizar numa montagem clínica por causa da sua concepção. 0 segmento de 53 resíduos de aminoácidos da sua proteína de fusão que é homólogo ao EBNA é fi. sicamente e quimicamente parte da proteína beta-galactosidase.

As suas propriedades imunológicas são, portanto, influenciadas por aquelas porçSes da molécula de beta-galactosidase da qual ele não pode ser separado. Com efeito, todo o soro humano utilizado no seu estudo reagiu com a beta-galactosidase, e requereu tratamento com a beta-galactosidase para adsorver e remover esta reactividade antes de testar quanto à especificidade contra a proteína manufacturada genéticamente.

Uma outra aproximação aos problemas, inter-relacionados, de determinar um quadro de leitura correcto do gene e de produzir grandes quantidades de antigénios relacionados com o agente patogénico (imunogénios) para fins clínicos e diagnósticos, é a utilização química do polipéptido sintético. Este método de produção de antigénios (imunogénios) tem uma vantagem sobre os mét£ dos de engenharia genética descritos acima. Os antigénios polip£

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-11ptídicos sintéticos não contêm subprodutos da proteína natural ou fragmentos da mesma, e, consequentemente, a sua utilização elimina a possibilidade de reactividade cruzada e a necessidade de prétratar as amostras de soro como no estudo de Hennessy e Kieff.

Enquanto que o conceito geral da preparação dos antigéni. os sintéticos (imunogénios) e da sua utilização para induzir ari ticorpos de especificidade pré-determinada foi descrita, permanece uma grande área desta tecnologia que continua a desafiar as previsões. Existem pelo menos duas razões para isto. Primeiro, um antigénio sintético (imunogénio) não induz necessáriamen. te os anticorpos que imuno-reagem com a proteína intacta no seu ambiente nativo. Segundo, os anticorpos naturais de um hospedei, ro para um imunogénio ocorrendo naturalmente, tal como uma proteína virai, raramente imuno-reagem com um polipeptido que corresponde a uma porção linear curta da sequência de resíduos de aminoácidos do imunogénio. Acredita-se que este último fenómeno seja o resultado de 03 polipéptidos lineares curtos serem deficientes nas estruturas conformacionais secundárias e terciárias necessárias.

Muito do trabalho sobre a ligação do pêptido pelo anticor po feito para proteínas está sumarizado numa revisão por Benjamjí ni, E., e colab., Current Topics in Microbiology and Immunology 58:85-134 (1972). 0 papel da estrutura do pêptido na ligação do anticorpo foi realçado por Goodman, J. W., Immunochem 6^:139-149 (1969).

modo

A maior parte dos estudos relacionados com /como as alterações na sequência dos pêptidos operam sobre a ligação do anticorpo, foram interpretados como indicando que a estrutura do local de combinação do anticorpo joga um papel predominante. 0 efei. to das alterações estruturais e na sequência nestes estudos é intermisturado e difícil de segregar. Alguns destes estudos podem ser igualmente bem explicados por alterações estruturais no antigénio operando a ligação.

A resposta do anticorpo ao nível molecular envolve a liga69 762

EPG':11-SCRF 45.2 /⁷ ção de um antigénio de sequência definida (estrutura primária) e numa conformação definida (estrutura secundária e terciária).

A resposta imune aos antigénios proteicos tem sido tradicionalmente interpretada como sendo dirigida contra a estrutura primá ria, secundária ou terciária da proteína.

Este esquema de classificação pode ter alguma validade para proteínas que têm uma estrutura global bem definida em tem peraturas e soluções fisiológicas. Contudo, esta validade fica incerta para antigénios peptídicos que têm uma estrutura mais di^ nâmica.

Diversos grupos relataram estudos estruturais de polímeros de sequência de repetição de glicina ealanina ou glicina e serina que foram sintetizados como modelos de fibroina da seda 77Ànderson e colab., J. Mol. Biol. 67:459-468 (1972)77 e colagé_ neo ^Ànderson e colab., BBRC 39:802-808 (1970); Doyle e colab., J. Mol. Biol. 51:47-59 (1970)77· 0 estudo mais sistemático foi o de Brack e colab., Biopolymers, 11:563-586 (1972), que relatou a síntese de uma série de polipéptidos homopoliméricos em bloco nos quais as unidades de repetição dos blocos homopoliméricos ti^ nham a fórmula (Ala - Gly ) em que, quando x=l, y=l, 2 e 3; quan x y do x=2, y=l, 2 e 3; e quando x=3, y=3.

Os resultados relatados por este último estudo foram que, < no estado sólido os homopolímeros em bloco constituídos principalmente por alanina eram alfa-helicoidais, e aqueles contendo principalmente glicina eram desordenados. Em solução, a polialanina foi descrita como sendo alfa-helicoidal, mas a poli-(Ala2~ Gly-^) foi descrita como estando na forma beta-antiparalela. Os polímeros mais ricos em glicina foram referidos como tendo outra estrutura fixa que foi relatada como nem alfa-hélice nem beta-e£ trutura.

Os blocos homopolimerizados de glicina e alanina descritos por Brack e colab., foram preparados por polimerização por condensação das unidades de repetição de di- até hexapeptídicas, possuindo um resíduo, glicilo no carboxilo terminal na forma de éster activa. Foram descritos graus de polimerização de 2 até 68

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para a poli(Ala-Gly^ ).

Embora os solventes utilizados naqueles estudos não fossem fisiológicamente aceitáveis, por exemplo água ou solução sa lina tamponada com fosfato, os resultados ilustram dois pontos: (1) as alterações estruturais podem ocorrer à medida que a sequê cia de um polipéptido se modifica; e (2) as alterações estruturais também ocorrem durante a transição da solução para o estado sólido.

SUMÁRIO DO INVENTO presente invento refere-se ao processo para a preparação de um polipéptido homólogo ao CMV. 0 referido polipéptido contém de cerca de 6 a cerca de 40, preferivelmente de cerca de 15 a cerca de 40, resíduos de aminoàcidos tendo uma sequência correspondente à sequência do polipéptido codificado pelo CMV apresentada na Figura 1, incluindo a referida sequência a sequên cia Ka definida pela fórmula:

-Gly-AGly-R^Gly1 2 em que R e R designam resíduos de aminoàcidos, os quais, quan do tomados individualmente são iguais ou diferentes e são Ala,

2

Asn, Arg, Gly, leu, Pro, Ser e Thr, desde que R e R não sejam, ambos, Gly, os seus sais farmacêuticamente aceitáveis e as suas variantes antigénicamente afins.

Noutra concretização, o presente invento refere-se ao pro. cesso de determinação da presença de anticorpos anti-EBNA, numa amostra corporal. 0 processo compreende misturar uma amostra cor poral do doente com um péptido homólogo ao CMV de acordo com este invento. A mistura imuno-reaccional assim formada é conservada durante um período de tempo pré-determinado, suficiente para que todos os anticorpos anti-EBNA presentes na amostra imuno-rea jam com o péptido para formar um produto da imuno-reacção. A pre_ sença de qualquer produto formado é então determinada, e, deste modo, a presença de anticorpos anti-EBNA. Na concretização pref£ rida, o método é específico para a classe de imunoglobulina.

presente invento também fornece um sistema diagnóstico

EPGill-SCRF 45.2 ./,..

S/ S

-14para determinar a presença de anticorpos anti-EBNA numa amostra corporal. 0 sistema inclui, em embalagens separadas, (a) um polipéptido homólogo ao CMV, e (b) um meio indicador para assinalar a presença de uma imuno-reacção entre o polipéptido e anticorpos anti-EBNA humanos. Preferivelmente, o meio indicador é um anticorpo para a classe de Ig humana marcado com um enzima.

presente invento refere-se ainda ao processo de preparação de um multímero contendo uma pluralidade de unidades de repetição polipéptidicas reunidas, em que pelo menos, uma das unidades de repetição é um polipéptido tal como descrito acima. As unidades de repetição polipéptidicas podem ser reunidas cab£ ça-à-cauda por ligações amida. Alternativamente, os monómeros polipeptídicos sintéticos podem ser reunidos por outras ligações que não amida para formar um multímero polimérico, tais como através da utilização de ligações dissulfeto da cisteína interpo lipeptidica, intra molecular.

Ê também fornecido, pelo presente invento, um processo para determinar a presença de anticorpos anti-EBNA utilizando o multímero ou polipéptido, aqui descrito anteriormente, como anti_ génio. De acordo com este processo, uma amostra corporal humana líquida é fornecida e é misturada com o polipéptido anteriormente descrito. A mistura imuno-reaccional resultante é mantida durante um período de tempo pré-determinado suficiente para que t£ dos os anticorpos anti-EBNA presentes na amostra imuno-reajam com o polipéptido e formam um imuno-reagente. A presença da imuno-reacção é então determinada. Numa concretização prática parti_ cularmente preferida, a presença de uma imuno-reacção é determinada misturando anticorpos anti-cadeias pesadas humanas, tais co mo anticorpos anti-IgG, -IgM ou -IgA, com o imuno-reagente, mantendo essa segunda mistura imuno-reaccional durante um período de tempo pré-determinado suficiente para que os anticorpos anti-humanos imuno-reajam com os anticorpos anti-EBNA presentes nos imuno-reagentes para formar um segundo imuno-reagente, e, em seguida, determinar a presença do segundo imuno-reagente, e da espécie particular de cadeia pesada do anticorpo anti-EBNA humano presente.

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Mais preferivelmente, o ensaio é efectuado utilizando o polipéptido ou multímero afixado a uma matriz sólida para for mar um suporte sólido. A amostra corporal, tal como sangue, so ro, plasma, saliva ou expectoração, é misturada com o suporte sólido para formar uma mistura imuno-reaccional de fase sólida/ /líquida. Essa mistura é mantida como acima, para formar um imu no-reagente de ligação de fase sólida que contém os anticorpos anti-EBNA, e as fases sólida e liquida são, em seguida, separadas. Ê então determinada a presença do imuno-reagente de ligação de fase sólida.

E ainda abrangido, pelo presente invento, um sistema de diagnóstico para determinar a presença de moléculas de anticorpo para o EBNA num componente corporal humano. Tal sistema compreende um polipéptido de acordo com o presente invento e um meio indicador para assinalar a imuno-reacção do polipéptido com as moléculas de anticorpo anti-EBNA. Numa concretização mais preferida, este sistema também contém um suporte sólido constituído por uma matriz sólida à qual o polipéptido está afixado. Pode também estar incluído no sistema um meio para identificar o iso_ tipo das moléculas de anticorpo que imuno-reagiram.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Nas Figuras que formam uma parte da descrição deste invein to :

A Figura 1 é um diagrama dos espectros do dicroismo circjj lar dos polipéptidos (F), (B) e (E). Estes polipéptidos são também aqui referidos como polipéptidos F13, F62 e F12, respectivamente. Cada espectro é a média de 10 explorações sucessivas de um polipéptido em solução fisiológica (solução salina tamponada com fosfato), a uma concentração de 1 miligrama/mililitro (mg/ /ml). A rotação óptica é expressa em mili-radianos, e é marcada contra o comprimento de onda da luz polarizada, expresso em nano metros (nm). 0 traçado relativamente incaracterístico para o polipéptido F(F13) é indicativo de uma conformação aleatória, que é o resultado habitual obtido com péptidos deste tamanho. 0 espectro em depressões e picos demonstrado pelo polipéptido B

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-16c 'v (P62) é característico de uma conformação ou estrutura secundária relativamente estável, provávelmente-beta-pregueada. Embora os dados não sejam apresentados, os polipéptidos P27, P60, F14 e F15 têm espectros muito semelhantes, indicando que os polipéptidos de acordo com este invento mais preferidos ocorrem com conformações estáveis semelhantes em solução fisiológica. 0 espectro do polipéptido E(F12) indica a aceitação parcial da refe_ rida conformação.

A Figura 2 é uma fotografia das imunomanchas em nitrocelulose dos extractos de célula inteira das células WI-L2 transformadas pelo EBV utilizando anti-soros antipéptido de coelho para os polipéptidos sintéticos C(P6O) e B(P62). Um soro humano (do doente TJ) anteriormente definido como anti-EBNA positivo, isto é, contendo anticorpos anti-EBNA, foi utilizado como um con trolo positivo, na faixa A, a uma diluição de 1:20. 0 soro anti-P60(C) de coelho a uma diluição de 1:50 (faixa B) e o soro anti^ -P62(B) de coelho a 1:10 (faixa D) imuno-reagiram com a mesma banda que o controlo positivo indicando que eles reconhecem o EBNA natural. As faixas A-G estão indicadas no fundo da Figura.

reconhecimento do EBNA pelo soro anti-P60 foi inibido pela incubação do soro anti-P60 diluído a 1:50 com 40 microgramas/mililitro (Mg/ml) do polipéptido P60, durante uma hora antes da imunomancha ser efectuada (faixa 3). De forma semelhante, o reconhecimento do EBNA pelo soro anti-P62 foi inibido pela incubação do soro anti-P62 diluído a 1:10 com 40/x g/ml do polipéptido P62, durante uma hora antes da imunomancha ser efectuada.

relacionamento antigénio de P60 e P62 é demonstrado nas faixas 6 e 7. A faixa 6 apresenta o soro anti-P62 diluído a 1:10 imuno-reagindo com a banda EBNA. Na faixa 7, a imuno-reactividade do soro-anti-P62 com a banda EBNA foi inibida por incubação com o polipéptido P60 a 40^ g/ml, durante uma. hora antes da imunomancha ser efectuada.

A Figura 3 é um gráfico ilustrando a inibição da actividade do soro anti-P62 no soro positivo para o EBNA do doente 1011 por um polipéptido competidor em solução. Um ELISA utilizan

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-17Ζ' do ο polipéptido Ρ62 como ο alvo de fase sólida foi executado utilizando soro do doente 1011 pré-incubado, durante uma hora, com qualquer um dos polipéptidos P27, P62, P60, P89 ou F16 antes da utilização do ELISA. Os polipéptidos P27, P62, P60, P89 e F16 são também aqui referidos como polipéptidos A, B, C, D e G, respectivamente. A actividade anti-polipéptido em percentagem é marcada como a ordenada versus a concentração do polipéptido competidor em microgramas por mililitro (/Ág/ml).

A Figura 4 é um gráfico que ilustra o curso paralelo no tempo do aparecimento de anticorpos para o EBNA (linha tracejada, círculos abertos) e para o polipéptido P62 (linha sólida, círculos fechados) num caso de mononuleose infecciosa pelo EBV (EBV-MI) documentada. Soros sequenciais foram colhidos após o início clinico e foram titulados quanto à actividade anti-EBNA seguindo o processo descrito em Catalano e colab., J. Clin, Invest., 65:1238-1242 (1980), na ordenada do lado direito. As amostras de soro foram também analisadas no ELISA de acordo com este invento utilizando o polipéptido P62 como o alvo de fase sólida, tal como é mostrado na ordenada do lado esquerdo, onde a densidade óptica a 405 nanometros (ΡΟ^θ^) é marcada.

A Figura 5 é composta por dois gráficos que ilustram a detecção precoce de anticorpos para o polipéptido P62 (linha só_ lida, círculos fechados) quando comparados com anti-EBNA (linha tracejada, círculos abertos) utilizando a detecção pelo método ACIF clássico descrito por Henle, G. e colab., J. Infect. Pis., 130:231 (1974). Soros sequenciais foram colhidos de dois doentes (#14 painel superior, $2 painel inferior) com mononucleose infecciosa clínicamente documentada. Os soros foram titulados quanto à actividade anti-EBNA, como relatado em Catalano e colab acima. A actividade anti-polipéptido foi medida utilizando o

ELISA de acordo com este invento, utilizando o polipéptido P62 como o alvo de fase sólida, com a actividade sendo exposta como na Figura 4.

A Figura 6 é um gráfico mostrando uma análise dos soros sequenciais do doente D.B., que teve uma infecção EBV-MI aguda,

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-18analisada pelo ELISA EBNA P62. A resposta IgM da fase aguda é apresentada pelos círculos fechados, a resposta IgG convalescen. te é indicada pelos círculos abertos, e a razão de IgG/IgM é as. sinalada por quadrados fechados. 0 ensaio EBNA polipéptido P62 foi executado como descrito na secção Materiais e Métodos.

A Pigura 7 é uma fotografia de imunomancha que ilustra uma análise de soros sequenciais do doente D.B. Os lisados de células Wi-L2 (também referidas como WI-L2) imortalizadas pelo EBV foram utilizados como fonte de proteínas EBNA-1 para as man. chas. Do lado esquerdo da mancha, uma amostra positiva para o

C VCA, normal (NORM) foi utilizada como um controlo para indicar a proteína EBNA-1 de 77 KD. As manchas mostram a resposta retar dada (lado esquerdo) dos anticorpos IgG às proteínas EBNA de 77 KD, e a rápida elevação dos anticorpos IgM a estas proteínas na fase aguda da doença (lado direito). Os dias após o início da doença estão indicados por numerais abaixo de cada faixa, devendo estas ser lidas verticalmente.

A Figura 8 é um gráfico que ilustra uma análise de soros sequenciais do doente D.S., com uma primeira infecção devida a CMV-MI seguida por uma segunda infecção devida a EBV-MI. A resposta IgM da fase aguda é representada pelos círculos fechados, a resposta IgG convalescente é indicada pelos círculos abertos, e a razão IgG/IgM é mostrada pelos quadrados fechados.

A Figura 9 θ uma fotografia de um estudo de imunomancha que ilustra uma análise de soros sequenciais do doente D.S. pela técnica de imunomancha. 0 lado esquerdo da mancha ilustra a resposta IgM da fase aguda às proteínas EBNA-1 pelos soros do dq ente. 0 lado direito da mancha ilustra a resposta IgG dos soros do doente. Os numerais abaixo de cada faixa e a faixa designada NORM são tal como na Figura 7. As proteínas EBNA-1 foram preparadas a partir de extractos das células Wi-L2, tal como descrito na secção Materiais e Métodos.

A Figura 10 é um gráfico em duas partes que ilustra uma análise por ELISA polipéptido P62 de amostras de soro sequenciais de dois doentes com infecções CMV-MI que tiveram infecções prévias pelo EBV. Na Figura 10A para o doente L.S., as respostas

762 • EPG:11-SCRF 45.2

-19do anticorpo IgM estão representadas pelos círculos abertos, as respostas IgG estão representadas pelos círculos fechados, e as razões IgG/lgM estão representadas pelos quadrados fechados. Na Figura 10B para o doente S.G., as respostas IgM estão representadas pelos círculos abertos, enquanto que as respostas IgG estão representadas pelos círculos fechados.

A Figura 11 contém dois painéis (A e B) que são fotografias de análise da imunomancha de quatro soros de quatro doentes com EBV-ΜΙ aguda e de seis doentes com CMV-MI. No painel A, os soros foram submetidos a imunomancha em extractos de células K562 (EBV , CMV ), com os anticorpos IgM sendo especificamente detectados. No painel B, os soros foram submetidos a mancha em extractos de células de fihroblasto humano infectadas pelo CMV tardio, com os anticorpos IgG sendo detectados. Todos os soros foram utilizados numa diluição de 1:20. As designações com as le. tras E e C no cimo de cada faixa designam os soros utilizados nessas faixas como sendo de doentes quer com EBV-ΜΙ, quer com CMV-MI, respectivamente.

A Figura 12 é uma fotografia de uma imunomancha que ilus tra inibição da ligação de IgM e IgG de amostras de soro, colhi das dos doentes D.S., D.S. e T.G. durante os estágios agudo e convalescente das suas doenças, com os extractos de células Wi-L2, uma linha celular B EBN⁺. 0 doente G era um dador EBNA-1⁺, VCA⁺ normal. As faixas 1 e 2 continham amostras de soro do doen te D.B. obtidas 15 dias após o início da doença (aid), as faixas 3 e 4 eram do doente D.S. 12 dias aid, as faixas 5 e 6 eram do doente T.G. com MI aguda colhidas 4 dias aid, as faixas 7 e 8 eram do doente D.S. 514 dias aid, as faixas 9 e 10 eram do doente D.S. 471 dias aid, e as faixas 11 e 12 eram do dador G normal. Todas as amostras de soro foram diluídas a 1:50. As faixas com números ímpares continham apenas soro e são designadas por sinais menos (-), enquanto que as faixas com números pares conti nham soro mais polipéptido P62 e são designadas por sinais mais (+). A concentração do polipéptido P62 era de 400 microgramas por mililitro (ug/ml) nas faixas 2, 4 e 6 e era de 50 gig/ml nas faixas 8, 10 e 12. Os anticorpos IgM foram especificamente detec

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-20tados nas faixas 1-6, enquanto que os anticorpos IgG foram esp£ cificamente detectados nas faixas 7-12.

A Pigura 13 ilustra a sequência de resíduos de aminoácidos do antigénio polipéptidico codificado pelo CMV, tal como descrito por Strapaus e colab., J. Virol., 57:591-602 (1936). A posição numérica de cada resíduo na sequência está indicada pelos números na margem esquerda. Os péptidos homólogos ao CMV, de acordo com este invento, preferidos incluem uma sequência de resíduos de aminoácidos que corresponde à sequência apresentada na figura desde cerca da posição do resíduo 200 até cerca da posição do resíduo 220.

A Pigura 14 é um gráfico que ilustra a capacidade do péptido P62 homólogo ao EBV e dos péptidos Cl e C2 homólogos ao CMV para detectar anticorpos IgG (símbolos abertos) ou IgM (sím bolos fechados) anti-EBNA no soro do doente D.B. durante o decur so de uma infecção pelo EBV. Durante a fase aguda da infecção, os anticorpos IgM anti-EBNA foram detectados utilizando os ELISAs com o péptido P62 homólogo ao EBV (triângulos), o péptido Cl homó_ logo ao CMV (círculos) e o péptido C2 homólogo ao CMV (quadrados), confirmando a presença da mononucleose infecciosa. 0 início da convalescença é indicado por uma elevação nos anticorpos IgG anti-EBNA, e uma queda concomitante nos anticorpos IgM.

A Pigura 15 é um gráfico que ilustra a capacidade do péptido P62 homólogo ao EBV e dos péptidos Cl e C2 homólogos ao CMV para detectar os anticorpos IgG (símbolos abertos) e IgM (sím bolos fechados) anti-EBNA no soro do doente DS durante o decurso da infecção pelo CMV seguida por uma infecção pelo EBV. Durante a fase aguda de ambas as doenças, os anticorpos IgM anti-EBNA foram detectados utilizando os ELISAs com o péptido P62 homólogo EBV, o péptido Cl homólogo CMV e o péptido C2 homólogo CMV, confirmando a presença da mononucleose infecciosa no início de cada doença aguda.

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DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO I. INTRODUÇÃO

Humanos infectados com o vírus de Epstein-Barr (EBV) desenvolvem anticorpos contra um antigênio nuclear virai (EBNA), que está presente em linfócitos B transformados pelo vírus. As técnicas clínicas tradicionais utilizadas para detectar o EBNA e os anticorpos anti-EBNA em humanos sao incómodas. Além disso, os processos habituais para a purificação do EBNA a partir de culturas de células não são prontamente adaptáveis 3. produção em massa.

presente invento refere-se à utilização da tecnologia de polipéptidos sintéticos para ultrapassar alguns dos problemas das metodologias correntes. Os polipéptidos sintéticos curtos podem imitar imunológicamente as determinantes antigénicas numa proteína natural e podem, portanto, ser utilizados para dar origem a anticorpos de especificidade pré-determinada que reconhecem a proteína natural.

A frase imita imunológicamente é aqui utilizada para significar que um polipéptido imunogénico de acordo com este invento induz a produção de anticorpos que se ligam ao polipéptido indutor e também à sequência cognata na proteína intacta. Este fenómeno pode ser utilizado quer experimentalmente quer clínicamente .

Experimentalmente, os anticorpos para os polipéptidos sin. téticos podem ser utilizados para determinar o quadro de leitura do ADN, e, por conseguinte, a sequência de resíduos de aminoácidos de uma proteína clinicamente importante, tal como o EBNA. Clínicamente, os anticorpos de especificidade pré-determinada ocasionados pelos polipéptidos sintéticos, podem ser utilizados para fins diagnósticos e terapêuticos.

Heller e colab., J♦ Virol♦, 44:311-320 (1982) descreveram uma sequência de nucleótidos de ADN com características que indõ^ cavam que poderia conter o gene que codifica para o EBNA. Eles predizeram que, se o ADN fosse transladado para proteína, os trê; quadros de leitura possíveis codificariam para um domínio da pro69 762

EPG;11-SCR? 45.2

-22teína IR3 de mais de 200 resíduos de aminoácidos composto por apenas (i) serina, arginina e glicina; (ii) glicina e alanina; ou (iii) glutamina, glutamato e glicina, dependendo do quadro de leitura do ADN expresso.

As propriedades químicas descritas para a molécula de EBNA, quando tomadas em conjunto com a distribuição dos possíveis codões de paragem no gene EBNA, indicavam que o IR3 era primáriamente composto por resíduos de glicina e alanina.

Para avaliar essa indicação, foram sintetizados polipéptidos curtos cujas sequências de resíduos de aminoácidos corres; pondiam substancialmente às da proteína EBNA cujo IR3 é um copolímero aleatório de glicina-alanina.

Como será visto na discussão que se segue, descobriu-se que aqueles polipéptidos sintetizados, e em particular um polipéptido denominado P62, imitavam imunológicamente o EBNA. Além disso, descobriu-se que um grupo desses polipéptidos particular mente preferidos, incluindo o polipéptido P62, se ligavam aos anticorpos anti-EBNA humanos. A utilização desses polipéptidos em vários processos de ensaio é também aqui discutida seguidamen te .

Mais especificamente em relação aos referidos ensaios, foi desenvolvido um ensaio, preferivelmente na fase sólida, que utiliza um polipéptido particularmente, preferido. Verificou-se que esse ensaio é clínicamente fidedigno na detecção da mononucleose infecciosa (MI) causada pelo EBV (EBV-MI), assim como da MI induzida pelo CMV (CMV-MI), e também na detecção do carcinoma nasofaríngeo (CN?), outra doença na qual o EBV foi implicado.

Os resultados específicos com ensaios em cada área são aqui discutidos, assim como são discutidos, na generalidade, os métodos dos ensaios.

762

EPG:11-SCRF 45.2

9-f

-23II. CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS

A. Polipéptidos sintéticos 1. Sequências

As séries de pequenos polipéptidos sintéticos (5-21 resí_ duos de aminoácidos de comprimento) utilizadas neste estudo foram sintetizadas utilizando o método de fase sólida de Merrifield. Merrifield e colab., J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963). As sequências foram escolhidas para representarem áreas diferentes no exterior e imediatamente fora da região IR3 proposta do EBNA.

termo sintético, tal como aqui utilizado, significa que a molécula do polipéptido ou a unidade de repetição do poli_ péptido foi construída por meios químicos, isto é, sintetizada quimicamente, em vez de ter sido preparada por um meio biológico, tal como por técnicas de engenharia genética. Assim, os polipéptidos sintéticos que concretizam o presente invento estão livres de proteínas que ocorrem naturalmente e dos seus fragmen_ tos.

Os polipéptidos sintetizados quimicamente também diferem, por conseguinte, dos produtos de degradação das proteínas ocorrendo naturalmente dado que são preparados pela acção de brometo de cianogénio sobre a proteína.A bem conhecida sintese quími ca de fase sólida na qual os resíduos de aminoácidos bloqueados são adicionados de uma forma seriada para obter o polipéptido desejado, é o processo de sintese preferido e é discutido em s£ guida com maior detalhe.

Todos os resíduos de aminoácidos aqui identificados estão na configuração natural ou L. De harmonia com a nomenclatura padrão para os polipéptidos, as abreviaturas para os resíduos de aminoácidos são como se seguem:

762 s.

EPG : 11-SCRF 45.2 J?- ΛA

	SÍMBOLO	TABELA DE	CORRESPONDÊNCIA AMINOÁCIDO
1-Letra	3-	-Letras
Y		Tyr	L-tirosina
G		Gly	glicina
F		Phe	L-fenilalanina
M		Met	L-metionina
A		Ala	L-alanina
S		Ser	L-serina
L		Ile	L-isoleucina
L		Leu	L-leucina
T		Thr	L-treonina
V		Vai	L-valina
P		Pro	L-prolina
K		Lys	L-lisina
H		His	L-histidina
Q		Gin	L-glutamina
E		Glu	ácido L-glutâmico
W		Trp	L-triptofano
R		Arg	L-arginina
D		Asp	ácido L-aspártico
N		Asn	L-asparagina
C		Cys	L-cisteína

Um aspecto deste invento refere-se ao processo para a pre. paração de um polipéptido de copolimero aleatório contendo de cerca de 6 a cerca de 40 resíduos de aminoácidos, preferivelmente de cerca de 15 a cerca de 20 resíduos de aminoácidos, e inclu indo a sequência pela fórmula, escrita da esquerda para a direita e na direcção do terminal amino para o terminal carboxilo

-Gly-Í^-Gly-Í^-Gly1 2 em que R e R designam resíduos de aminoácidos, os quais quando tomados individualmente são iguais ou diferentes e são Ala, Asn, 1 2

Arg, Gly, Leu, Pro, Ser e Thr, desde que R e R não sejam, ambos, Gly. 0 polipéptido também contém, pelo menos, 25 mole % de

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EPG:11-SCRF 45.2

-25»>^τ'· resíduos de glicina, e é capaz, quando ligado a um transportador e introduzido, numa quantidade eficaz, num hospedeiro mamífero, de induzir a produção de anticorpos que imuno-reagem com o EBNA.

2

Numa concretização preferida, R e R são ambos Arg de mo do que o polipéptido inclua a sequência de resíduos de aminoácidos: -Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-. Noutra concretização preferida, R^ é 2

Asn e R 'Leu de modo que o polipéptido inclua a sequência de re_ síduos de aminoàcidos: -Gly-Asn-Gly-Leu-Gly-. Ainda noutra con1 2 cretização preferida, R e R são ambos Ser de modo que o polip£ ptido inclua a sequência de resíduos de aminoàcidos: -Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-.

As sequências de resíduos de aminoàcidos preferidas inclu em as sequências, tomadas da esquerda para a direita e na direcção do terminal amino para o terminal carboxilo, representadas pelas fórmulas:

-Arg-Ala-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Glu-Lys-Arg-Pro-Met;

-Ile-Met-Ser-Asp-Glu-Gly-Pro-Gly-Thr-Gly-Asn-Gly-Leu-Gly-Glu-;

-Pro-Gly-Ala-Pro-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Pro-;

os seus sais farmacêuticamente aceitáveis, e as suas variantes antigénicamente afins.

2

Em concretizações mais preferidas, R e R são Ala ou Gly.

2 1 Por exemplo, R pode ser Ala e R pode ser Ala; R pode ser Ala

12 e R pode ser Gly; e R pode ser Gly e R pode ser Ala. As concre_ tizações mais preferidas incluem, deste modo, uma sequência de cinco resíduos de aminoàcidos, representada por uma fórmula sele£ cionada a partir do grupo constituído por:

(i) -Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-;

(ii) -Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-; e (iii) -Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-.

termo copolímero aleatório é aqui utilizado com o seu significado habitual. Assim, os polipéptidos são copolímeros por69 762

EPG-:ll-SCRF 45.2 que eles contêm, uma pluralidade de unidades de repetição de resíduos de aminoácidos diferentes. Os copolimeros são aleatórios quando comparados com copolimeros alternados ou em bloco, dado que os resíduos de aminoácidos individuais não estão presentes numa sequência de repetição particular, tal como são encontrados nas sequências de repetição de um copolímero alternado ou dos copolimeros em homobloco preparados por Anderson e colab., Doyle e colab., ou Brack e colab., acima.

Assim, ainda que o polipéptido denominado P62 (Tabela 1) contenha a sequência de repetição sequencialmente -Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-,esse polipéptido contém adicionalmente um péptído -Ala-Gly- no terminal carboxilo. Como consequência, não existe nenhuma sequência de resíduos de aminoácidos que se re_ pita ao longo de todo o polipéptido, e o polipéptido P62 deve ser encarado como sendo um copolímero aleatório e não um copolímero em homobloco como são os materiais poli(Ala -Gly ) preparados por ^x y

Brack e colab., ou os materiais poli(Ser-Gly) preparados por Anderson e colab., cujos blocos idênticos de sequências de resíduos de aminoácidos particulares se repetem ao longo de todo o comprimento dos seus polímeros.

Os polipéptidos de copolimeros aleatórios de acordo com este invento são muitas vezes aqui designados simplesmente como polipéptidos, como polipéptido sintéticos, ou como péptidos Essa utilização é para concisão.

termo variantes antigénicamente afins é aqui utilizado para designar polipéptidos cujas sequências de resíduos de aminoácidos diferem na globalidade mas que partilham, pelo menos, uma porção de uma determinante antigénica e que são, portanto, imunológicamente reactivos de forma cruzada (Cross-reactive).

termo determinante antigénica, tal como aqui utilizado, designa o componente estrutural de uma molécula que é respon sável pela interacção específica com as moléculas de anticorpo (imunoglobulina) correspondentes induzidas pelo mesmo antigénio ou imunogénio ou por um antigénio ou imunogénio relacionado.

termo determinante imunogénica, tal como aqui utiliza

762

EPG:11-SCRE 45.2

Xá' ' ^r

-27do, designa o componente estrutural de uma molécula que é respo sável pela indução num hospedeiro de um anticorpo contendo um 1 cal de combinação do anticorpo (idiotipo) que se liga ao imunog£ nio quando utilizado como um antigénio.

termo antigénio, tal como aqui utilizado, significa uma entidade que é ligada por um anticorpo.

termo imunogénio, tal como aqui utilizado, descreve uma entidade que induz a produção de anticorpos no animal hospedeiro. Em alguns casos, o antigénio e o imunogénio são a mesma entidade, enquanto que em outros casos, as duas entidades são diferentes.

Por exemplo, tal como é descrito daqui em diante, o polipéptido P62 foi utilizado para induzir a produção de anticorpos num coelho e, deste modo, foi utilizado como um imunogénio. Os anticorpos assim induzidos ligam-se ao polipéptido P62 quando utilizado como um antigénio. 0 polipéptido P62 foi, portanto, quer um imunogénio quer um antigénio. Os anticorpos anti-EBNA ligam-se quer ao imunogénio EBNA quer ao antigénio EBNA, assim como ao polipéptido P62 como antigénio.

Concretizações preferidas do presente invento são os poli péptidos de copolímeros aleatórios P89, P12, F13, tal como mostrado na Tabela 1 abaixo, os seus sais farmacêuticamente aceitáveis e as suas variantes antigénicamente afins. Cada um daqueles polipéptidos contém uma sequência de resíduos de aminoácidos 12 12

-Gly-R -Gly-R -Gly-, onde R e R sao tal como antes definidos; cada polipéptido contém, pelo menos, cerca de 25 mole % de Gly; e cada um deles é capaz de induzir anticorpos que se ligam ao EBNA, tal como antes descrito.

c| o|

762

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-28T ABE LA I

SEQUÊNCIAS DE POLIPÉPTIDOS SINTÉTICOS

Pêptido³⁶ Sequência

P6O(C) H-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-GlyAla-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-OH;

P89(D) H-Arg-Ala-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-GlyGlu-Lys-Arg-Pro-Met-OH;

F12(E) H-Ile-Met-Ser-Asp-Glu-Gly-Pro-Gly-Thr-GlyAsn-Gly-Leu-Gly-Glu-OH;

F13(F) H-Pro-Gly-Ala-Pro-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-GlyPro-OH;

P27(A ) H-Lys-Gly-Thr-Kis-Gly-Gly-Thr-Gly-Ala-GlyAla-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-OH;

P62(B) H-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-AlaGly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-AlaGly-OH;

F14 H-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-GlyAla-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-OH;

F15 H-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-GlyAla-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-OH;

F16(G) H-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-AlaGly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-AlaGly-OH;

As letras maiusculas entre parênteses são utilizadas para designar o polipéptido correspondente em algumas das Figuras e Tabelas aqui apresentadas.

Os resultados dos estudos de ligação ao receptor polipéptido/anti-polipêptido e de inibição da ligação são discutidos daqui em diante na secção II D. Esses resultados ilustram efeitos de reacção cruzada e de inibição cruzada que correspondem à quan_ tidade de homologia da sequência entre os polipéptidos. Por exem

762

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pio, o polipéptido P60 contém um segmento de 10 aminoácidos homólogos ao P62. 0 polipéptido P27 contém um segmento de 8 amino, ácidos homólogo aos polipéptidos P60, P62 e Dl (Tabela 2). 0 po. lipéptido D2 (Tabela 2) contém um segmento de sete resíduos de aminoácidos homólogo a segmentos dos polipéptidos P27, P60, P62 e Dl. 0 polipéptido P89 o qual, neste estudo, não apresenta reacção cruzada significativa, não contém homologia de sequência com os polipéptidos P27, P62 e P60.

De modo mais importante, a sequência de 8 resíduos de 'ami. noácidos partilhada pelos polipéptidos P27, P62, P60 e Ll contém, pelo menos, uma determinante antigénica comum a todos os três po. lipéptidos de copolímero aleatório, deste modo tornando aqueles três polipéptidos variantes antigénicamente afins. Além disso,o segmento partilhado inclui a sequência de seis resíduos de amino. ácidos.

-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Glye uma sequência de sobreposição representada pela fórmula -Gly-R¹-Gly-R²-Gly- em que R¹ e R² são, ambos, Ala, isto é -Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-.

Sobreposição significa que a sequência nomeada em segu_n do lugar está contida em parte da sequência nomeada em primeiro lugar. Esta sobreposição da sequência de resíduos de aminoácidos é ilustrada para o polipéptido P62 pelas porções da sequência de sobreposição, compartimentada, (Boxed), apresentada abaixo na qual foi utilizada o código de letra única para os resíduos de aminoácidos.

G-G-G-A-G-G-A-G-A-G-G-G-A-G-G

Os polipéptidos de copolímero aleatórios que contêm quer a sequência contendo os seis resíduos de aminoácidos partilhada quer a sequência de cinco resíduos de aminoácidos de sobreposição, constituem uma concretização deste invento ainda mais parti, cularmente preferida. Nas referidas concretizações particularmeia te preferidas, o polipéptido de copolímero aleatório de acordo com o presente invento contém de cerca de 8 a cerca de 40, e pre. ferívelmente de cerca de 15 a cerca de 20, resíduos de aminoáci^{69 762} /?

EPtt:ll-SCRF 45.2 /£' f -.- —---⁵

-30dos e inclui, para além da sequência de resíduos de aminoácidos 1 2

-Gly-R -Gly-R -Gly- anteriormente definida, a sequência, escrita da esquerda para a direita e na direcção do terminal amino para o terminal carboxilo, representada pela fórmula,

-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-, contém, pelo menos, cerca de 50 mole % de resíduos de Gly e é capaz de (a) induzir a produção de anticorpos que imuno-reagem com o EBNA ligado ao transportador e introduzido numa quantidade eficaz no hospedeiro mamífero, e (b) de imuno-reagir com os anticorpos humanos induzidos pelo EBNA natural.

Sequências de resíduos de aminoácidos particularmente pre. feridas incluem as sequências, tomadas da esquerda para a direita e na direcção do terminal amino para o terminal carboxilo, re. presentadas pelas fórmulas:

(i) -Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-AlaGly-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-;

(ii) -Lys-Gly-Thr-His-Gly-Gly-Thr-Gly-AlaGly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-;

(iii) -Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-GlyAla-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-GlyAla-Gly-;

(iv) -Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-AlaGly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-;

(v) -Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-GlyGly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-;

(vi) -Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-GlyAla-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-GlyAla-Gly-;

(vii) -Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-AlaGly-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-;

(viii) -Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-GlyAla-Gly-Ala-Gly-;

os seus sais farmacêuticamente aceitáveis e as suas variantes an

762

EPG:11-SCRF 45-2

-31tigénicamente afina.

Observou-se que um traço no início ou no fim de uma sequência de resíduos de aminoácidos indica uma ligação a um radi cal, tal como H e OH, nos terminais amino ou carboxilo, respectivamente, ou uma sequência adicional de um ou mais resíduos de aminoácido, até um total de quarenta resíduos de aminoácidos na cadeia polipéptidica.

Também particularmente preferidos são os próprios polipé_ ptidos correspondentes, isto é, os polipéptidos P60, P27, P62,

F14, F15 θ F16, apresentados na Tabela 1, e Dl e D2 apresentados na Tabela 2, e os seus sais farmacêuticamente aceitáveis e as suas variantes antigénicamente afins. 0 polipéptido P62 é aqui ilustrativamente utilizado como um exemplo dos polipéptidos par ticularmente preferidos. 0 polipéptido P62 é também, por vezes, designado P62, péptido P62, EBNA P62, e similares, com a comprç ensão que qualquer designação que inclui P62 se refere aquele material. As palavras péptido e polipéptido são aqui utilizadas de forma permutável.

A frase sais farmacêuticamente aceitáveis, tal como aqui utilizada, refere-se aos sais de metal alcalino, metal alcalino-terroso ou amónio não-tóxicos utilizados na indústria farmacêutica, incluindo os sais de sódio, potássio, lítio, cálcio, magné^ sio e amónio, e similares, que são preparados por processos bem conhecidos na especialidade. A frase também inclui os sais de adição de ácido não tóxicos, que são geralmente preparados por reacção dos compostos de acordo com este invento com um ácido or gânico ou inorgânico adequado. Os sais representativos incluem cloridrato, bromidrato, sulfato, bi-sulfato, acetato, oxalato, valerato, oleato, laurato, vorato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, f umarato, succinato, tartarato e simi. lares.

Numa outra concretização preferida, o presente invento re fere-se a um polipéptido contendo, pelo menos, de cerca de 15 até não mais que 40 resíduos de aminoácidos tendo uma sequência homóloga (correspondente) à sequência do EBNA ou do polipéptido codificado pelo CMV apresentado na Figura 13 e incluindo a fórmu

762

EPG:11-SCRF 45.2

-321 2 la anteriormente descrita -Gly-R -Gly-R -Gly-. Os péptidos homó logos ao CMV e homólogos ao EBNA de acordo com o presente inven. to são adicionalmente caracterizados como tendo a capacidade de imuno-reagir com os anticorpos anti-EBNA.

2. Tamanho

Foi estudado o efeito da alteração do tamanho do polipéptido sintético na sua capacidade de se unir aos anticorpos anti-EBNA. Descobriu-se que, na generalidade, à medida que o tama nho do polipéptido diminui, a sua capacidade para se ligar aos anticorpos também diminui.

polipéptido P62 consiste em 20 resíduos de aminoácidos, dos quais os primeiros nove resíduos do terminal amino são dire£ tamente repetidos, como apresentado na Tabela 2 utilizando o código de letra única para os resíduos de aminoácidos. Foi sintet/ zada uma série de resíduos de aminoácidos homólogos ao P62, nos quais foram deleccionadas tríades de resíduos de aminoácidos a partir do terminal amino do péptido precedente para fornecer os polipéptidos Dl, D2 e D3 como são apresentados na Tabela 2, abai, xo. Porções crescentes da simetria de sequência do P62 estão, portanto, ausentes nos polipéptidos Dl, D2 e D3.

762

EPGzll-SCRF 45.2

-33TABELA 2

Sequência dos Resíduos de Aminoácidos^

Designação do Polipéptido

P62:

AGAGGGAG G*A G

GGGAGGAGA A G G A G A

AGA

A5

A6

A7

AÔ

A9

G G G A G A G G G A G

G A G G G A G AGAGGGAG GAGAGGGAG

As sequências dos polipéptidos são apresentadas, utilizando o código de letra única, na direcção da esquerda para a direita e do terminal amino para o terminal carboxilo.

Junção de 9-mero directo repetido no polipéptido P62.

Foi estudada a capacidade da série D de polipéptidos para imuno-reagir com 3 soros anti-EBNA humanos e soro anti-P62 de coelho utilizando os polipéptidos na fase sólida do ELISA, descrito daqui em diante. A ligação dos anticorpos ao Dl foi prá ticamente igual à ligação ao polipéptido P62 original, para todos os soros testados. Em contraste, não houve ligação ao D3 na fase sólida para todos os soros excepto o anti-P62 de coelho.

Os resultados para o D2 foram intermédios e foram dependentes do soro testado. Assim, o reconhecimento pelos anticorpos desta série de polipéptidos descreveu à medida que o comprimento do polipéptido encurtou de 20 para 11 resíduos de aminoácidos.

facto de a ligação ao anticorpo ter decaído para todos os anti-soros argumenta contra a possibilidade de uma determina^ te antigénica específica ter sido deleccionada pela eliminação

762

EPG:11-SCRF 45.2 — 34“ Ó.

sequencial de resíduos de aminoácidos dado que os polipéptidos continham duas determinantes antigénicas, das quais apenas uma foi afectada pelas delecções da sequência. Além disso, a simetria da sequência do P62 assegurava que todas as sequências de quatro a oito resíduos de aminoácidos que estavam presentes no P62 também estavam em D3, com a excepção daquelas sobre a junção da repetição .

Alterações conformacionais na ligação dos polipéptidos ao suporte sólido no ELISA podem ter contribuído para a supressão do reconhecimento pelo anticorpo. Esta possibilidade foi estudada inibindo a ligação (imuno-reacção) de diversos soros ao P62 ligado à fase sólida pela utilização de várias concentrações de polipéptidos competidores em solução. Os anti-soros foram misturados e mantidos (incubados) com o polipéptido P62, Dl, D2, ou D3 em solução, durante um período de tempo pré-determinado suficiente para que a imuno-reacção (ligaçãc) ocorra antes de serem adicionados a uma placa de microtitulação revestida com ο P62.

Os resultados deste estudo com soros de cinco doentes estão resumidos na Tabela 3, abaixo.

TABELA 3

Concentração dos Polipéptidos Competidores Fornecendo 50^ de Inibição da Ligação dos Anticorpos ao Péptido P62

Competidor Péptido (microgramas por mililitro)

Soros	P62	Dl	Ό2	D3
TJ	0,05	0,05	0,1	200
VM	0,3	0,3	0,4	3
CV	0,1	0,1	0,1	10
N6	0,6	0,6	0,6	3
JC	1	1	1	500

x Os processos do ELISA utilizados para estas determinações sâo descritos aqui, em seguida, nas secções II E(2) e III/D.

762

EPG:11-SCRE 45.2

A acção inibitória do polipéptido Ll sobre a ligação dos anticorpos ao P62 é considerada indistinguível do efeito inibitório do próprio P62. Isto é verdadeiro para todos os soros tejs tados.

De forma mais interessante, o polipéptido L3 inibiu alguns do3 soros VM e N6, quase tão bem como os polipéptidos maiores o fizeram. Este forte efeito inibitório ocorreu apesar do facto de nenhum daqueles soros apresentar qualquer ligação ao D3 ligado ao suporte no ELISA. Acredita-se que estes dados indiquem que o polipéptido deve ter um certo comprimento mínimo, pelo menos de cerca de 15 resíduos de aminoácidos, para manter a estrutura secundária necessária quando ligado à superfície plástica da placa de microtitulação. Assim, para ensaios de fase sólida, é preferi, do um comprimento do péptido de cerca de 15 a cerca de 40 resíduos, com um comprimento de cerca de 15 a cerca de 40 sendo mais preferido.

tamanho mínimo do antigénio necessário para reconhecimento foi adicionalmente estudado utilizando os polipéptidos A5, A6, A7, A8 e A9· Como mostrado na Tabela 2, o polipéptido A5 tem cinco resíduos de aminoácidos, e cada membro da série A6-A9 foi aumentado no comprimento por um resíduo de aminoàcido em relação ao polipéptido precedente, até nove resíduos presentes no A9· Nenhum anti-soro testado imuno-reagiu com estes polipéptidos quan. do eles foram ligados às placas de microtitulação no ELISA descri^ to aqui, em seguida.

Os dados quanto à capacidade dos polipéptidos da série A inibirem a ligação dos anticorpos anti-EBNA humanos ao P62 na fase sólida são apresentados na Tabela 4, abaixo.

762

EPG:11-SCRF 45.2

-36TABELA 4

Inibição da Ligação do Anticorpo ao Péptido P62 por 100 microgramas por mililitro de Péptido Competidor

Percentagem da Actividade Não Inibida

Soros	A5	A6	A7	A8	A9
TJ	96	80	91	74	31
Vftl	93	81	51	17	9
cv	92	93	93	72	20
JC	94	92	60	88	74
S62	86	96	89	95	78
S60	106	109	93	84	53
*Este s	estudos foram levados	a cabo como descrito para a Tabela
3.
	Quase todos	os soros	testados foram	inibidos	pelo A9» ape
sar de	terem sido	necessárias concentrações	elevadas	; (mais do
que 100	> vezes mais	elevadas	que as concentrações de	P62 ou Dl ne

cessárias para inibição equivalente). Além disso, três soros imu no-reagiram com, e foram inibidos pelo A8 e um pelo A 7. Nenhum foi inibido pelos polipéptidos mais curtos A6 e A5 .

Assim, a diminuição na imuno-reactividade que é paralela à diminuição no tamanho do polipéptido parece ser devida a dois efeitos: (1) o efeito da delecção do local no antigênio ao qual o anticorpo se liga, como mostrado pelos polipéptidos da série A e, (2) a mudança na conformação do polipéptido à medida que o seu tamanho decresce, como mostrado pelos polipéptidos da série

D.

3. Conformação

As propriedades conformacionais dos polipéptidos de acordo com este invento foram estudadas utilizando a espectroscopia de dicroísmo circular (BC). Os espectros de DC dos polipéptidos P27, P60, P62, F13, F15 e F16 foram determinados. Os dados, par69 762

EPG:11-SCRF 45.2

Ζ*, / *

-37cialmente apresentados na Figura 1, indicam que os polipéptidos de acordo com este invento, que incluem ambas as sequências de residuos de aminoácidos preferidas, isto é,

-Gly-pJ-Gly-R^Gly1 2 em que R e R são tal como antes descritos, e

-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Glyadoptam uma estrutura secundária ou conformação relativamente estável numa solução fisiológica a 20^0. Dado que a conformação predominante desses polipéptidos é relativamente estável, acredita-se que a actividade dos anticorpos anti-EBNA humanos ocorre em resposta a esta conformação particular.

B. Multimeros presente invento também se refere ao processo de preparação de um polipéptido multimérico (multímero) contendo uma plu ralidade de unidades de repetição de polipéptido de copolímero aleatório reunidas, em que pelo menos uma das unidades de repeti_ ção é um polipéptido tal como aqui descrito.

Os multimeros de acordo com este invento, só ou ligados a um transportador, quando introduzidos, numa quantidade eficaz, no hospedeiro mamífero, são capazes de induzir à produção de anticorpos que se ligam ao EBNA. Multimeros particularmente preferidos são aqueles que contêm um polipéptido homólogo ao CMV de acordo com este invento capaz de se ligar aos anticorpos humanos induzidos pelo EBNA.

Assim, os multimeros de acordo com este invento, tal como os seus constituintes polipeptídicos, são imunogénicos, e são an tigénicos para os anticorpos anti-EBNA humanos. Esses multimeros podem, portanto, ser utilizados para induzir a produção de anticorpos anti-EBNA que são úteis nos sistemas e métodos/cliagnósticos discutidos aqui, em seguida, e podem também ser utilizados como um antigénio em sistemas e métodos de diagnóstico apropriados.

Os multimeros que contêm menos do que cerca de 35 resíduos de aminoácidos no multímero total estão tipicamente ligados a um

762

EPGí^l-SCRP 45.2 ά'

-33transportador para utilização como um imunogénio. Aqueles multí meros que contêm mais do que um total de cerca de 35 resíduos de aminoácidos são tipicamente suficientemente imunogénicos para serem utilizados sem um transportador.

Os multímeros de polipéptidos podem ser preparados ligan. do, em conjunto, os monómeros de polipéptidos duma forma cabeça -à-cauda utilizando o método de fase sólida antes mencionado, isto é, uma sequência polipéptidica completa pode ser sintetiza da sobre uma resina, seguida por uma ou mais das sequências polipéptidicas iguais ou diferentes, com a unidade multimérica in. teira sendo, em seguida, clivada da resina e utilizada como aqui descrito. Os referidos multímeros de polipéptido cabeça-à-cauda contêm preferivelmente cerca de 2 a cerca de 4 unidades de repetição de polipéptidos.

Alternativamente, os multímeros podem ser preparados como um polímero de polipéptidos de copolímero aleatório utilizados como monómero. Como aqui utilizado, o termo polímero nas suas várias formas gramaticais é definido como um tipo de multímero que contém uma pluralidade de unidades de repetição de polipépti. do de copolímero aleatório que sao reunidas umas às outras por ligações outras que não péptidicas.

Um polímero ilustrativo deste invento pode ser sintetizado utilizando os monómeros de polipéptido de acordo com este invento que contêm resíduos de cisteína adicionados a ambos os ter minais amino e carboxilo (polipéptido diCys). Os monómeros do p£ lipéptido diCys podem ser unidos uns aos outros por ligações dis sulfeto da cisteína interpolipeptídicas intramoleculares utilizando um processo de oxidação para formar um polímero imunogénico, antigénico. 0 polímero assim preparado contém uma pluralidade de polipéptidos de copolímeros aleatórios de acordo com este invento como unidades de repetição. Essas unidades de repetição são unidas umas às outras pelos resíduos de cisteína oxidada (cis^ tina) acima discutido.

A presença de um ou dois resíduos de Cys terminais num p<o lipéptido de acordo com este invento com a intenção de ligar o

-,

762

E?G:11-SCRF 45.2

-39- *polipéptido a um transportador ou de preparar um polímero não é para ser interpretada como uma alteração na sequência de aminoácidos das unidades de repetição de polipéptido de acordo com este invento.

C. Inoculos

Numa outra concretização, os polipéptidos de acordo com este invento são utilizados, num solvente farmacêuticamente acei^ tável, para formar um inoculado ou vacina que, quando administra do numa quantidade eficaz, é capaz de induzir anticorpos que imu_ no-reagem com o EBNA.

A palavra inoculo nas suas várias formas gramaticais é aqui utilizada para descrever uma composição contendo um polipéptido de acordo com este invento como um ingrediente activo utilizado para a preparação de anticorpos contra o EBNA. Quando é utilizado um polipéptido para induzir anticorpos, deve compreender-se que o polipéptido pode ser utilizado só, ligado a um tran^ portador ou como um multímero, mas para facilidade de expressão, estas alternativas não serão sempre aqui expressas.

Para polipéptidos que contêm menos de cerca de 35 resíduos de aminoácidos, é preferível utilizar um transportador com o fim de induzir a produção de anticorpos. Um polipéptido unido ou ligado a um transportador será aqui ilustrativamente utilizado onde os anticorpos estão a ser preparados.

inoculo pode ser utilizado para produzir anticorpos para uso em ensaios diagnósticos que detectam células que expressam o EBNA. Os anticorpos produzidos pelo inoculado podem também ser utilizados numa preparação para induzir imunidade passiva contra linfócitos B que expressem EBNA nas suas superfícies celu lare s.

termo vacina nas suas várias formas gramaticais é uti. lizado para descrever um tipo de inoculado, contendo um polipéptido de acordo com este invento como ingrediente activo, que é utilizado para induzir imunidade activa num mamífero hospedeiro. Dado que a imunidade activa envolve a produção de anticorpos, uma vacina ou inoculo pode, deste modo, conter ingredientes idênti69 762

EPG:11-SCRP 45.2

cos, mas as suas utilizações são diferentes. Na maioria dos casos, os ingredientes de uma vacina e de um inoculo são diferentes porque muitos adjuvantes úteis em animais não podem ser uti lizados em humanos.

presente inoculo ou vacina contém uma quantidade eficaz de um polipéptido de acordo com este invento, como um multímero, tal como um polímero de polipéptidos individuais ligados uns aos outros através dos resíduos de cisteina terminais do polipéptido, oxidados, ou como um conjugado ligado a um transportador. Contudo, para facilidade de expressão, as várias concretizações dos polipéptidos de acordo com este invento são colectivamente aqui referidas pelo termo polipéptido e as suas várias formas grama ticais.

A quantidade eficaz de polipéptido por dose unitária depende, entre outras coisas, da espécie de animal inoculado, do peso corporal do animal e do regime de inoculação escolhido, como é bem sabido na especialidade. Os inoculos e as vacinas contêm, tipicamente, concentrações de polipéptido de cerca de 10 microgramas a cerca de 500 miligramas por inoculação (dose). As quantidades estabelecidas de polipéptido referem-se ao peso do polipéptido sem o peso do transportador, quando o transportador é utilizado. Os inoculos ilustrativos e específicos são aqui de£ critos sendo dado o peso do transportador mais do polipéptido (conjugado).

termo dose unitária refere-se a unidades fisicamente distintas, adequadas como dosagens unitárias para animais, cada unidade contendo uma quantidade pré-determinada do material act£ vo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o diluente exigido, isto é, transportador ou veículo. As especificações para a nova dose unitária de acordo com e£ te invento são ditadas por, e são directamente dependentes (a) das características únicas do material activo e do efeito terapêutico particular a ser alcançado, e (b) das limitações inerentes na arte da composição do material activo para utilização terapêutica em animais, tal como revelados em detalhe na especificação, sendo estas características do presente invento.

762

EPG:11-SCRF 45.2

Os inoculos são tipicamente preparados a partir do polímero de polipéptidos ou do conjugado de polipéptidos sólido seco, por suspensão do polímero de polipéptidos ou do conjugado de polipéptidos num diluente fisiológicamente tolerável (aceitá vel), tal como água, solução salina ou solução salina tamponada com fosfato.

Os inoculos também podem incluir um adjuvante. Os adjuvan_ tes, tal como o adjuvante de Freund completo (CFA), o adjuvante de Freund incompleto (IFA) e o alúmen, são materiais bem conheci, dos na especialidade, e são comercialmente disponíveis a partir de diversas fontes.

D. Receptores

Os anticorpos e os anticorpos substancialmente completos ocasionados (induzidos) pelos polipéptidos de acordo com este in. vento, assim como os locais de combinação do anticorpo preparados a partir dos referidos anticorpos, constituem ainda uma outra concretização deste invento. Estas moléculas são colectivamente aqui referidas como receptores. Os receptores são originados em hospedeiros mamíferos, tais como ratinhos, coelhos, cavalos e similares, por imunização utilizando o inoculo aqui ant£ riormente descrito.

Os receptores monoclonais adequados, tipicamente anticorpos completos, podem também ser preparados utilizando a tecnologia de hibridoma descrita por (Niman e colab., Proc. Natl. Sei., U.S.A., 80:4949-4953 (1983), cuja descrição é aqui incorporada por referência. Resumidamente, para formar o hibridoma a partir do qual o receptor monoclonal é produzido, uma linha celular de mieloma ou outra de auto-perpetuação é fundida com linfócitos obtidos a partir do baço de um mamífero hiperimunizado com um po. lipéptido de acordo com este invento.

É preferido que a linha celular do mieloma seja da mesma espécie que os linfócitos. Tipicamente, um ratinho da estirpe' 129 GIX⁺ é o animal preferido. Mielomas de ratinhos adequados pa ra utilização no presente invento incluem as linhas celulares sensíveis à hipoxantina, aminopterina e timidina (HAT), P3X6369 762

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-42-Ag8.653 (ATCC CRL 1580), e Sp2/0-Agl4 (ATCC CRL 1581).

Os esplenocitos são tipicamente fundidos com as células de mieloma utilizando polietilenoglicol (PEG) 1500. Os híbridos fundidos são seleccionados pela sua sensibilidade ao HAT. Os hi bridomas produtores das moléculas de receptor de acordo com este invento são identificados utilizando o ensaio do enzima liga do ao imuno-sorvente (ELISA), descrito aqui, em seguida, na sec ção IIID, de Materiais e Métodos.

Os receptores monoclonais podem não só ser obtidos a par tir dos sobrenedantes de hibridoma, mas também podem ser obtidos, numa forma geralmente mais concentrada, a partir do fluído ascítico de mamíferos nos quais o hibridoma desejado foi introduzido. A produção de anticorpos monoclonais utilizando fluído ascítico é bem conhecida e não será aqui adicionalmente tratada.

Um receptor de acordo com este invento liga-se quer ao po. lipéptido para o qual ele foi originado quer ao sítio da determi. nante antigénica do EBNA correspondente que o polipéptido de acor do com este invento imunologicamente imita. Assim, um polipéptido de acordo com este invento pode ser ambos, um imunogénio e um antigénio.

Os receptores de acordo com este invento podem ser descri tos como sendo oligoclonais quando comparados com anticorpos policlonais ocorrendo naturalmente, dado que eles são originados para um imunogénio que tem relativamente poucos epítopos quando comparados com os epítopos de uma molécula do EBNA intacta.

Consequentemente, os receptores de acordo com este invento ligam-se aos epítopos do polipéptido, enquanto que os anticorpos que ocorrem naturalmente originados para o EBNA se ligam a epítopos em todas as partes da molécula do EBNA.

Moléculas de receptor ilustrativas contendo locais de com binação do anticorpo de acordo com este invento, originadas em coelhos para os polipéptidos apresentados na Tabela 1, foram estudadas utilizando os processos de imuno-mancha de Towbin, e colab., Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A., 76:4350-4354 (1979) θ Billings, e colab., Proc. Natl. Acad. Sei. , U.S.A., 30:7104-7108

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-43(1993). Detalhes adicionais são fornecidos na secção Materiais e Métodos (III).

Descobriu-se que todos os polipéptidos de acordo com este estudo fazem surgir anticorpos anti-polipéptido de coelho, quando ligados a um transportador proteico como um conjugado e introduzidos, em quantidades eficazes, em hospedeiros-coelhos sob a forma de um inoculo , tal como aqui anteriormente descri, to. Estas moléculas de receptor reconheceram a proteína EBNA in. tacta isolada a partir das linhas celulares de linfoblastos B humanos transformados pelo EBV WI-L2, Raji e Daudi. Os dados des. tes estudos são parcialmente apresentados na Figura 2. Em estudos de controlo, os extractos proteicos de linfócitos B negativos para a infecção pelo EBV (células BJAB; disponíveis Scripps Clinic e Research Foundation, La Jolla, CA) foram incapazes de produzir bandas reactivas com os soros anti-polipéptido. Estes dados indicam que as moléculas de receptor ilustrativas, de acor do com este invento, imuno-reagem com uma proteína específica da infecção pelo EBV.

Além disso, descobriu-se que a imuno-reactividade dos anticorpos anti-polipéptido de coelho para a proteína EBNA intacta pode ser bloqueada pelo polipéptido imunogénico e indutor utilizado como um antigénio, como também é apresentado na Figura 2. Estes resultados demonstram que os idiotipos (locais de combinação do anticorpo) dos soros anti-polipéptido eram específicos pa ra as determinantes antigénicas do EBNA.

anticorpo anti-polipéptido de coelho para 0 polipéptido P62 foi utilizado num estudo de competição para examinar o relacionamento dos polipéptidos P27, P62, P60 e P89. Este anticorpo reagia extensivamente de forma cruzada com os polipéptidos conjugados e não-conjugados no ELISA, aqui descrito em seguida. A ligação do anti-polipéptido P62 ao polipéptido P62, na fase sólida, foi inibida em 98$ ao incubar primeiro o anticorpo com o polipéptido P62. Da mesma forma, a ligação do anti-polipéptido P62 ao polipéptido P62 foi inibida em 81% pelo polipéptido P60, e em 36% pelo polipéptido P27. 0 polipéptido P89 não inibiu nada a reactividade do anti-polipéptido P62.

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Para determinar se os anticorpos no soro imune para o EBV humanos reconheceram ou não a determinante antigenica, foi efectuado um estudo de competição utilizando o soro de um doente com artrite reumatóide imune ao EBV (soro 1011). Estes resul tados, apresentados na Figura 3, foram semelhantes àqueles obti. dos quando foi utilizado o anti-polipéptido P62. Isto indica que a determinante antigénica partilhada pelos polipéptidos P27, P62 e P60 imita a determinante imunogénica do EBNA que ocorre naturalmente .

E. Métodos e Sistemas de Ensaios Diagnósticos

Os polipéptidos, anticorpos e locais de combinação dos anticorpos (receptores) originados para os polipéptidos anterior mente descritos, e os processos de acordo com o presente invento, podem também ser utilizados para testes diagnósticos, tais como imuno-ensaios. As referidas técnicas diagnósticas incluem, por exemplo, imuno-ensaio de enzima, técnica do imuno-ensaio múltiplo de enzima (EMIT), imuno-sorvente ligado a enzima (ELISA) radio imuno-ensaio (RIA), ensaio de imunofluorescência, técnicas de anticorpo quer único quer duplo, e outras técnicas nas quais quer o receptor quer o antigênio estão marcados com algumas etiquetas detectáveis ou meios indicadores. Ver, na generalidade, Maggio, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Gleveland, Ohio (1981); e Goldman, Μ., Fluorescent Antibody Methods, Academic Press, New York, N.Y. (1980). Exemplos específicos dos referidos sistemas e métodos de ensaios úteis na execução desses métodos são aqui seguidamente discutidos.

1. Ensaios para o EBNA

Um método para determinar a presença do EBNA numa amostra corporal é tamhém aqui referido. Num método geral, é fornecida uma amostra corporal a ser analisada, e é misturada com moléculas do receptor que contêm um local de combinação do anticorpo originado para um polipéptido de copolímero aleatório de acordo com este invento. A mistura é mantida, durante um período de tem po pré-determinado suficiente para que as moléculas do receptor imuno-reajam com o EBNA presente na amostra corporal. A quantida.

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de dessa imuno-reacção é então medida para determinar se as moléculas do EBNA estavam presentes ou ausentes na amostra corporal analisada.

Um sistema diagnóstico ilustrativo sob a forma de equipa

mento/conjuníio concretizando um aspecto do presente invento, que é útil para detectar o EBNA presente numa alíquota de uma amostra corporal, contém moléculas do receptor de acordo com este invento, tais como anticorpos, anticorpos substancialmente completos, ou locais de combinação do anticorpo, como as porções Fab e F(ab')₂ do anticorpo, originadas para um polipéptido de acordo com este invento, numa embalagem. Este sistema também in. clui um meio indicador para assinalar a presença de uma imuno-reacção entre o receptor e o antigénio.

Os meios indicadores típicos incluem os radioisótopos co mo o ¹²⁵I e o os enzimas como a fosfatase alcalina, a peroxidase de rábano-de-cavalo, a beta-D-galactosidase e a glucose oxidase, e os corantes de fluorocromo como a fluoresceína e a rodamina. Os meios indicadores pode ser indirectamente ligados ao receptor de acordo com este invento. Os meios indicadores tam bém podem ser ligados a uma molécula separada, como a um segundo anticorpo, a um local de combinação do anticorpo, ou à proteína A do Staphylococcus aureus (5. aureus), que reage com (liga-se a) o receptor de acordo com este invento. Um exemplo específico do referido meio indicador ligado a uma molécula separada é a 125 proteína A de S. aureus marcada com 1.

meio indicador permite que o produto imuno-reaccional seja detectado, e é embalado separadamente do receptor quando não está directamente ligado a um receptor de acordo com este i vento. Quando misturado com uma amostra corporal, tal como um e fregaço de linfócitos do sangue periférico (LSP) fixados com ace tona, a molécula do receptor imuno-reage com o EBNA para formar um imuno-reagente, e o meio indicador presente assinala então a formação do produto imuno-reaccional.

Uma concretização de um método diagnóstico do EBNA é um ensaio de imunofluorescência que inclui uai reagente amplificador |ω |3

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A A

-46No referido ensaio, um esfregaço de LSP é fixado pela acetona a uma lâmina de microscópio simples. Uma alíquota de anticorpos originados de acordo com este invento, por exemplo, originados em coelhos, geralmente de cerca de 10 microgramas a cerca de 500 microgramas, é colocada em contacto com a lâmina utilizando técnicas bem conhecidas.

Após remover por lavagem quaisquer anticorpos de acordo com este invento que não imuno-reagiram, todos os sítios de ligação não específicos sobre a lâmina estão tipicamente bloqueados com uma proteína, como a albumina sérica bovina (BSA), se desejado. Um segundo reagente (reagente amplificador), tal como o complemento, ou anticorpos anti-imunoglobulina, por exemplo, complemento de cobaia, pode então ser incubado na lâmina do tes^ te.

Após esta segunda incubação, todo o reagente amplificador que não reagiu é removido, como por lavagem, deixando apenas aque. le que está ligado aos anticorpos primeiramente nomeados na lâmina do ensaio. Um terceiro reagente (meio indicador), por exemplo, anticorpo, como complemento anti-cobaia de cabra, é então incubado na lâmina do teste. 0 terceiro reagente é marcado ao ser ligado a um corante de fluorocromo, como isotiocianato de fluoresceína (PITC), isotiocianato de rodamina B (RITC), isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC), ácido 4,4'-diisotiocianostilbeno-2,2'-di-sulfónico (DIDS), e similares, como são bem conhecidos na especialidade.

Qualquer terceiro reagente que não reagiu é removido por lavagem após esta terceira incubação, deixando todos os anticorpos do complemento anti-cobaia de cabra marcados com o PITC que se ligam ao complemento na lâmina do teste. A presença do tercei, ro reagente marcado com o PITC pode ser detectada utilizando microscopia de fluorescência e, deste modo, assinalar a presença de infecção pelo EBV.

Linfócitos B que se sabe estarem infectados com o EBV foram testados quanto à presença do EBNA utilizando o método do eri saio de imunofluorescência descrito acima e com maior detalhe na

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V-47-

secção III de Materiais e Métodos. Os anticorpos de coelho originados para cada um dos polipéptidos apresentados na Tabela 1 foram capazes de detectar o EBNA na linha celular infectada pelo EBV, WI-L2.

Um sistema diagnóstico preferido, preferivelmente sob a forma de equipamento (Kit), útil para executar o método de en saio acima inclui, em embalagens separadas, (a) receptores (anticorpos) de acordo com este invento que imuno-reagem com o EBNA, (b) um segundo reagente amplificador, tal como o complemento, como complemento de cobaia, os anticorpos anti-imunoglobulina ou a proteína A de S. aureus, que reage com o receptor, e (c) um meio indicador que pode ser directamente ligado ao meio amplificador ou pode ser uma porção de uma molécula separada,como um anticorpo ou porção de anticorpo, que reage com o reagente amplificador. 0 meio indicador assinala indirectamente a imu no-reacção da molécula do receptor e do EBNA através da mediação do reagente amplificador.

As moléculas do receptor e o meio indicador separado de qualquer sistema diagnóstico aqui descrito, assim como o reagen te amplificador acima descrito, podem ser fornecidos em solução, como uma dispersão líquida ou como um pó substancialmente seco, por ex., sob a forma liofilizada. Onde o meio indicador é uma mo. lécula separada do reagente amplificador, é preferido que o meio indicador seja embalado separadamente. Onde o meio indicador é um enzima, o substracto do enzima também pode ser fornecido numa embalagem separada do sistema. Um suporte sólido, tal como a lâmina do microscópio antes descrita, um ou mais tampões e acetona também podem ser incluídos como elementos embalados separadamente neste sistema de ensaio diagnóstico.

As embalagens aqui discutidas em relação aos sistemas dia.

gnósticos são aquelas habitualmente utilizadas nos sistemas diagnósticos. As referidas embalagens incluem garrafas de vidro e plástico (por exemplo, polietileno, polipropileno, polistireno e policarbonato), frascos, envelopes laminados de plástico ou fo. lha de plástico, e similares.

762

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A utilização de anticorpos biológicamente activos comple

tos, intactos, não é necessária em muitos sistemas diagnósticos, tal como o ensaio de imunofluorescência descrito acima. Antes, apenas deve ser utilizado o local receptor de ligação e reconhecimento do antigénio, contendo o idiotipo e imunológicamente activo, isto é, o local de combinação do anticorpo, da molécula do anticorpo. Exemplos dos referidos locais de combinação do anticorpo são aqueles conhecidos na especialidade como porções Fab e F(ab')2 do anticorpo, que são preparadas por proteólise utili. zado papaína e pepsina, respectivamente, como é bem sabido na especialidade.

2. Ensaios para os Anticorpos Anti-EBNA (a) Ensaios na Generalidade

Um outro método diagnóstico de acordo com este invento é um ensaio, como um ELISA, que detecta anticorpos anti-EBNA numa amostra corporal líquida contendo anticorpos. Aqui, um polipépti. do homólogo ao EBV ou homólogo ao CMV de acordo com este invento, tal como o polipéptido P62, Cl, C2, C3, é utilizado como um antigénio, e é preferivelmente unido sobre (adsorvido a) ou doutra forma ligado ou afixado a uma matriz sólida, tal como o dextrano reticulado disponível sob a marca registada SEPHADEX de Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, New Jersey), agarose, pérolas de vidro, cloreto de polivinilo, polistireno, acrilamida reticulado, nitrocelulose, os poços de uma placa de microtitulação ou a superfície de uma vareta de imersão ou colher, para formar um su porte sólido.

polipéptido homólogo ao EBV- ou ao CMV- é misturado com a amostra corporal líquida a ser analisada. A mistura imuno-reac cional assim formada é mantida durante um período de tempo pré-determinado suficiente para que todos os anticorpos anti-EBNA presentes na amostra corporal imuno-reajam com o polipéptido. A presença dessa imuno-reacção é então determinada como com um meio indicador para assinalar a presença de anticorpos anti-EBNA na amostra corporal analisada.

Um ELISA ilustrativo utilizando o método acima usa um su69 762

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-49porte sólido, constituído por um polipéptido homólogo ao EBV ou ao CMV de acordo com este invento adsorvido (afixado) a uma matriz sólida, cada/como os poços de uma placa de microtitulação de doze ou noventa e seis poços feita de polistireno ou cloreto de polivinilo, de uma colher plástica de poços duplo opaco tal como é descrita aqui na secção Materiais e Métodos, e similares. Os sítios de ligação não específicos na matriz sólida são, em se. guida, tipicamente bloqueados com uma proteína que não inclua uma sequência à qual os anticorpos anti-EBNA se liguem ou imuno-reajam, tal como a albumina sérica bovina (BSA). 0 polipéptido não ligado e a BSA são removidos da matriz por lavagem.

Uma aliquota de amostra corporal, tal como plasma, sangue soro ou saliva humana, é misturada com o suporte sólido acima de crito para formar uma mistura imuno-reaccional contendo fases só lidas e líquidas. A mistura de fase sólida/líquida é mantida durante um período de tempo (por exemplo, 2-60 minutos) suficiente para que todos os anticorpos anti-EBNA na amostra corporal imuno. -reajam com o antigénio polipéptidico e formem um imuno-reagente ligado à fase sólida. As fases sólida e líquida são, em seguida, geralmente separadas.

Uma solução de um segundo anticorpo local de combinação do anticorpo ou proteína A de S. aureus, contendo meio indicador z—v marcado, que reage com o anticorpo anti-EBNA primeiramente nomea do, é então misturada com a fase sólida para formar uma outra ou segunda mistura imuno-reaccional de fase sólida/líquida. Um segundo anticorpo ilustrativo é um anticorpo anti-Ig humana de cabra marcado com peroxidase de rábano-de-cavalo (HrPO), onde os anticorpos primeiramente nomeados são de uma amostra corporal hu. mana. Outros marcadores enzimáticos úteis incluem a fosfatase a.1 calina, a beta-D-galactosidase e a glucose oxidase. A mistura formada a partir da fase sólida e da segunda solução de anticorpo marcado, é mantida (incubada) durante um período de tempo pr£ -determinado (por exemplo, 2-30 minutos) suficiente para formar um segundo imuno-reagente ligado à fase sólida, entre o anticorpo primeiramente nomeado e a entidade contendo o meio indicador, tal como uma imuno-reacção entre os dois anticorpos. As fases só

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-50lida e líquida são, em seguida, separadas.

segundo anticorpo descrito acima pode também ser específico para, e imuno-reagir apenas com uma das classes de imuno_ globulina (por exemplo, IgG, IgM, IgE, IgA ou IgD), tais como os anticorpos monoclonais anti-IgG, anti-IgM ou anti-IgA murinos, ou as suas porções contendo o local de combinação. Os referidos anticorpos fornecem a capacidade para identificar a classe de imu noglobulina do anticorpo anti-EBNA presente na amostra corporal, tal como apresentado nas Tabelas 6-10, em seguida. Além disso, o segundo anticorpo ou local de combinação do anticorpo pode ser específico para, e imuno-reagir apenas com um dos dois tipos de cadeias leves de imunoglobulina (por exemplo, Kapa ou lambda). Estes anticorpos fornecem a capacidade para identificar o isotipo da molécula de imunoglobulina presente na amostra corporal.

Uma solução contendo um substrato para o marcador enzima tico, tal como o peróxido de hidrogénio para a peroxidase, e um precursor do corante formador de cor, tal como a O-fenilenodiami na, ou o fosfato de jo-nitrofenilo para a fosfatase alcalina é, em seguida, misturado com a fase sólida, e essa mistura é manti da durante outro período de tempo pré-seleccionado. A densidade óptica a um comprimento de onda pré-seleccionado (por ex., 490 ou 405 nanometros, respectivamente) pode ser então determinada, após o período de tempo pré-determinado ter terminado (por ex., 60 minutos), e comparada com a densidade óptica de um controlo para determinar se anticorpos anti-EBNA estavam presentes na amostra corporal.

Numa outra concretização do ensaio acima, são utilizados dois suportes sólidos. Cada suporte sólido compreende um polipéptido de copolimero aleatório homólogo ao EBV afixado à matriz sólida.

Uma primeira alíquota de uma amostra corporal líquida do doente, tal como sangue, plasma ou soro, é misturada com o primei_ ro suporte sólido para formar uma mistura de fase sólida/líquida. A mistura é mantida durante um período de tempo pré-determinado (por ex., cerca de 2 a 30 minutos), suficiente para que todos os

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.<7

-51anticorpos anti-EBNA presentes na amostra imuno-reajam com o po lipéptido e formem um imuno-reagente ligado à fase sólida conte£ do os anticorpos anti-EBNA. São realizados passos análogos com uma segunda alíquota da amostra corporal líquida do doente e o segundo suporte sólido. Claro que a primeira e segunda alíquota podem ser misturadas com os seus respectivos suportes de fase sólida em qualquer ordem ou mesmo simultâneamente.

Após a separação das fases sólida e líquida que resultam dos passos de mistura e manutenção acima, o primeiro suporte sólido e todos os anticorpos anti-EBNA ligados à fase sólida presentes no seu imuno-reagente são misturados num meio líquido aquoso com anticorpos anti-IgG humana marcados. Essa mistura é mantida durante um período de tempo suficiente para que os anti corpos anti-IgG imuno-reajam com todos os anticorpos ligados à fase sólida presentes. 0 segundo suporte sólido e todos os anti. corpos ligados à fase sólida presentes são misturados de forma semelhante e mantidos com anticorpos anti-IgM humana marcados.

Em seguida, são determinadas as quantidades relativas de anticorpos anti-IgG e anti-IgM marcados. Como é observado em seguida em relação às Tabelas 6-10, a presença de uma quantidade relativamente maior da anti-IgM marcado do que de anti-IgG indi_ ca que o doente está no estado agudo da infecção pelo EBV, enquanto que uma quantidade relativamente maior de anti-IgG marca do presente do que de anti-IgM indica que o doente está no esta do convalescente da doença. Quantidades aproximadamente iguais de anti-IgM e anti-IgG indicam que o doente está a passar do es tado agudo para o convalescente.

Uma outra concretização deste invento compreende um sistema diagnóstico sob a forma de equipamento em conjunto que inclui um suporte sólido constituido por uma matriz sólida, tal como uma tira de microtitulação de doze poços de polistireno ou uma colher de poço duplo, e por um polipéptido homólogo ao EBV ou ao CMV de acordo com este invento, absorvido (ligado) ou doutra forma afixado à matriz sólida para formar uma matriz sólida. Este sistema também inclui, preferivelmente, anticorpos anti-Ig humana, embalados separadamente, tendo um meio indicador ligado, oeroxi

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Ά

-52tal como anticorpos anti-Ig humana de cabra marcados com dase, e também pode incluir substracto para o meio indicador li gado, tal como peróxido de hidrogénio, e um precursor do corante formador da cor, tal como a O-fenilenodiamina, em embalagens separadas adicionais. Esses anticorpos anti-Ig humana podem ser anticorpos que imuno-reagem específicamente apenas com IgM, IgG, IgA ou IgE humana, ou com todos os anticorpos humanos, como anteriormente observado. Peróxido de hidrogénio estabilizado pode também ser incluído no equipamento em conjunto ou pode ser fornecido pelo utente final. Sais tampões úteis num ensaio utilizan. do este sistema podem também ser incluídos numa ou mais embalagens separadas, sob a forma seca ou líquida. Embalagens separadas contendo anticorpos anti-EBNA humanos e anticorpos humanos livres de anticorpos anti-EBNA (anticorpos humanos normais) podem também ser incluídas como controlos positivos e negativos, respecti. vamente. São incluídas no equipamento em conjunto quantidades dos ingredientes acima mencionados suficientes para realizar, pe. lo menos, um ensaio, e pode ser efectuado um ensaio para determl nação da presença de anticorpos anti-EBNA numa amostra corporal, tal como soro, com este sistema diagnóstico utilizando o método acima descrito.

(b) Ensaio para a EBV-MI

Um ELISA ilustrativo, semelhante aquele anteriormente des. crito e descrito em detalhe na secção (III) Materiais e Métodos, foi utilizado para investigar quanto à presença de imunoglobulina anti-polipéptido nos soros de 91 indivíduos com serotipos positivos para o anti-EBNA determinados utilizando a imunofluorescência anti-complemento (ACIF) aqui anteriormente descrita. Quan. do os soros foram analisados a uma diluição de 1:20, todos os 91 foram positivos contra (ligavam-se a) os polipéptidos P27, P62, P60 e P16, F14 e F15 . Mesmo a uma diluição mais alta de 1:320, dos 91 soros positivos para o EBNA imuno-reagem com o polipéptido P62 no ELISA. Assim, parece haver uma excelente correlação entre o título do anticorpo anti-EBNA determinado por ACIF e a actividade anti-peptído de cada soro.

Além disso, os resultados ilustram uma excelente correla69 762

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X’

-5 3ção entre o método da ACIF e a presente técnica do ELISA, a qual é mais simples e fácil de utilizar. Ainda mais, os resultados ilustram a utilidade dos polipéptidos de acordo com este invento para um ensaio diagnóstico para anticorpos anti-EBNA.

A Tabela 5, abaixo, mostra as reactividades de soros obti. dos de dois indivíduos (SB e MV) antes e depois de contraírem mo nonuclease infecciosa induzida pelo EBV (MI, isto é, EBV-ftlI). Em ambos os casos, os anticorpos que se ligam aos polipéptidos P27, P62 e P60 estavam ausentes antes da infecção, mas apareceram em seguida. Em contraste, não foram produzidos, por nenhum destes indivíduos, anticorpos que se liguem ao polipéptido P89.

Num estudo adicional, soros armazenados de um painel ante, riormente descrito de 27 dadores não-imunes ao EBV /fCatalano e colab., J. Clin. Invest. , 65.:1238-1245 (1980)_7 foram examinados quanto à ligação aos polipéptidos P62 e P60 no ELISA anteriormen. te descrito. 0 estado imune ao EBV dos soros utilizados foi defi^ nido pela presença ou ausência do antigênio da cápside do vírus de Epstein-Barr (VCA). Os indivíduos que não possuem anticorpos séricos para o VCA (VCA^-) nunca foram infectados com o EBV. Os indivíduos para o VCA (VCA⁺) tiveram infecçoes pelo EBV e possuem, tipicamente, um nível baixo de anticorpos anti-EBNA. Nenhuns dos soros apresentava reactividade significativa para qualquer dos po. lipéptidos, tal como é observado a partir da Tabela 5, abaixo.

Tabela 5

Anticorpos para Péptidos EBNA em Soros·¹· Humanos 3 2

DO.^r-xlO obtida com 4<Jp

Anticorpos do Doente

DOENTE _para:_

	P27	P62	P60	P89
Normal VCA⁺ l³	155	958	154	23
Normal VCA⁺ 2³	516	819	145	16
SB pré-mononucleose	11	13	51	9
SB pós-mononucleose	33	514	115	23
MV pré-mononucleose	15	77	72	29
MV pós-mononucleose	107	631	162	25

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2

DO^q^xIO obtida com

Anticorpos do Doente para:

-54Tabela 5 (Cont.)

DOENTE

P89

Normais VCA (n=27)⁴

P27

P62

P60

Todos os soros foram testados a uma diluição de 1:20.

Densidade óptica medida a um comprimento de onda da luz de 405 nanometros, após incubações do substracto de 30 minutos.

Soros VCA ⁺ de indivíduos não apresentando sinais clínicos de doença relacionada com o EBV presente.

Soros de 27 indivíduos não apresentando sinais clínicos de doença relacionada com o EBV, presente ou passada, como i£ dicado pela ausência de anticorpos para o VCA.

Densidade óptica média - um desvio padrão.

Não efectuado.

Para examinar a correlação entre o ELISA e a técnica dia gnóstica da ACIF no decurso da infecção, os soros armazenados de 8 estudantes em idade escolar, colhidos sequencialmente após o início da mononucleose infecciosa (MI), foram examinados com o ELISA anteriormente descrito utilizando o polipéptido P62. To. dos os estudantes desenvolveram títulos anti-EBNA a partir de um mês a um ano, anos infecção, medida pelo método clássico; i.e., ACIF. Henle, e colab., J. Infect. Dis., 130:213-239 (1974).

Em metade dos indivíduos, os anticorpos anti-P62 elevaram -se em paralelo com o título de anti-EBNA correspondente, tal co mo é mostrado para o doente 15 na Figura 4. Na outra metade, os anticorpos contra o polipéptido P62 foram detectados no primeiro mês após o início dos sintomas, enquanto que esses anticorpos fo

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,S? S C íp*'

-55ram detectados mais tardiamente utilizando a técnica da ACIF. Estes resultados estão representados na Figura 5 para os doentes 14 e 2. Os anticorpos anti-P62 foram, portanto, detectáveis utilizando o ELISA de acordo com o presente invento antes dos anticorpos anti-EBNA serem detectáveis pelo ensaio da imunofluorescência anti-complemento padrão.

Para diferenciar a classe de imunoglobulina predominantemente responsável por uma resposta imune do indivíduo a uma dada altura durante o curso da mononucleose infecciosa, foram utiliza dos anticorpos secundários (indicadores), específicos para a IgG ou IgM humana foram utilizados no ELISA, como descrito na secção (III) Métodos e Materiais. A Tabela 6, abaixo, mostra os resulta dos deste estudo, com os soros de dois indivíduos em pontos dife. rentes no tempo durante a infecção pelo EBV, medidos contra o po. lipéptido P62 no ELISA.

Tabela 6

Aparecimento da Actividade Anti-Péptido Detectada pelo ELISA Li. gado ao Polipéptido P62 Após Infecção de Mononucleose

Tempo após a Infecção	Doente MV	Doente 15
IgM¹	IgG²	IgM¹	IgG²
Pré-Infecção	1O3³	74	NE⁴	NE
1 Semana	245	80	152	113
1 Mês	87	37	225	118
3 Meses	136	60	208	118
12 Meses	NE	NE	249	375
21 Meses	145	600	185	994
1 Nível de	IgM do doente	detectado utilizando um	segundo an-
ticorpo	específico para	a IgM humana.
2 Nível de	IgG do doente	detectado utilizando um	segundo an-

ticorpo específico para a IgG humana.

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-563 Densidade óptica medida a um comprimento de onda de 405 na nometros.

Não efectuado.

Utilizando este método do ELISA, a elevação nos valores do anticorpo IgM, apesar de pequena, é reprodutível e encontrada em todos os soros sequenciais testados. A resposta imune medida pelo ensaio do ELISA é normal por a IgM clássicamente aparecer antes da IgG durante a infecçâo pelo EBV. 0 aparecimento dos anticorpos IgM antes dos anticorpos IgG é particularmente bem mostrado para o doente 15 na Tabela 6. Os resultados acima mostram novamente que a infecçâo pelo EBV provoca a produção de anticorpos que reagem com, pelo menos, um polipéptido de acordo com este invento.

Num estudo mais lato com ELISA do anti-polipéptido, o pai_ nel de 19 soros VCA^- aqui anteriormente descrito foi examinado contra os polipéptidos P27, P62, P60, F12, F13, F14, F15 e F16. Nenhum dos soros VCA^- reagiu positivamente. Os dados típicos são apresentados na Tabela 7, abaixo. Os soros de indivíduos clínica mente normais, positivos para os anticorpos VCA, foram testados a duas diluições. Os resultados típicos, apresentados na Tabela 7 abaixo, indicam que todos os indivíduos VCA⁺ foram positivos, isto é, tinham anticorpos que se ligavam a cada um dos polipépti. dos.

Os soros de um certo número de doentes com artrite reumatóide (AR) foram também examinados no ELISA. Estes resultados e£ tão resumidos na Tabela 7.

762

EPG:11-SCRF 45.2

6, ./7

-57Tabela 7

	Níveis Anti-Péptido	Médios	Determinados nos	pelo	ELISA	em Soros Huma
	Grupo do	Número	de	Actividade Média do	- Anticorpo
	Doente	Soros	para os	Polipéptidos⁴
				P27	P62	P60	F12	F13	F16
	_M -2 Nor	1/20 ³	19	22	17	77	34	41	47
	Nor⁺⁴	1/20 ³	26	521	854	394	128	70	733
	Nor⁺⁴	1/320³	48	90	223	70	37	37	166
^x--''	A⁺⁵	1/20 ³	28	597	999	564	118	113	843
	RA⁺⁵	1/320³	48	126	348	122	50	50	231

Actividade medida como densidade óptica a um comprimento de onda da luz de 405 nanometros após 30 minutos de incuba ção do soro.

Indivíduos negativos para o VCA.

Diluição a que os soros foram testados.

Indivíduos positivos para o VCA.

Indivíduos diagnosticados como tendo artrite reumatóide.

A diferença entre o positivo para o VCA, normal (controlo) e os doentes com AR pode ser melhor observada à diluição de 1:320. Os níveis do anticorpo em doentes com AR foram significa tivamente mais elevados para todos os polipéptidos testados a esta diluição quando analisados utilizando o método de Wilcox Rank Sum (nível com significado maior do que 99%).

Os doentes com Síndrome de Sjbgren, Lupus Eritematoso Sistémico (LES) e Esclerose Sistémica Progressiva (ESP) foram também examinados a diluições séricas quer altas quer baixas.

As únicas diferenças encontradas entre estes grupos de doentes e os normais foram um título médio relativamente mais elevado nos doentes com ESP para os polipéptidos P27, P62, P60, F16, F14 e F15. Acredita-se que estes resultados sejam possivelmente devi

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-58dos a uma infecção relacionada com o EBV prévia ou ao envolvimen to do EBV nessas doenças auto-imunes. Estes dados não diminuem a utilidade do ELISA como um método diagnóstico.

As quantidades relativas de anticorpos IgM e IgG podem, deste modo, ser utilizadas para determinar o estágio relativo da doença num indivíduo. Em vista (1) da resposta faseada, ante, riormente ilustrada, da produção, do anticorpo IgM anti-EBNA que se estabeleceu e em seguida cai, que é sobreposta e seguida no tempo pelo estabelecimento da produção do anticorpo IgG anti-EBNA, e (2) do facto dessa resposta faseada seguir os níveis de ocorrên. cia normais de IgM num estágio precose da doença seguido por IgG no estágio de recuperação.

Assim, os dados da Tabela 6 mostram que, durante o estágio agudo, precose, da doença existe uma maior quantidade de anticorpo IgM anti-EBNA presente do que de anticorpo IgG anti-EBNA. 0 ní. vel da IgG começa, seguidamente, a subir durante a recuperação, enquanto o nível da IgM cai, cruzando-se os níveis de ambas, isto é, a razão da IgG para a IgM é um nalgum ponto no tempo entre os estágios agudo e de recuperação (convalescente).

Estes achados são consistentes com os achados habituais para as imunizações primárias e para os estágios da doença em ge_ ral fiVer, por exemplo, Hood e colab., Immunology, The Ben,jamin7 /Cummings Publishing Co., Inc., Menlo Park, CA, (1978) Págs 39-46; Mims e White, Virai Pathogenesis and Immunoglogy, Blackwell Scientific Publications, Boston (1984) págs 105-106, e Immunology, segunda ed., Bach ed., Jonh Wiley & Sons, New York (1982), págs 337-339_ZZ· Esses achados são contrários à situação para os anticorpos IgM e IgG anti-VCA, em que esses anticorpos IgG estão presentes em quantidades maiores mais precocemente na infecção, por ex., após dois dias, com os anticorpos IgM elevando-se, atin gindo o ponto culminante e caindo a níveis menores durante um pe. ríodo de cerca de três meses, desaparecendo alguns meses após a doença aguda /HCecil, Textbook of Medicine, Beeson e colab, ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, (1979), págs 264-268_7·

Esses achados são também, em alguns aspectos, contrários aos achados de Henle e colab., J. Infect. Dis., 130:231-239 (1974). Estes investigadores relataram o aparecimento de anticor

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-59pos anti-EBNA de baixo título cerca de 2-4 semanas após o início da doença para poucos soros, com títulos baixos, mas relativamen te mais elevados, aparecendo desde o segundo mês após o início até ao fim do seu estudo, 12 meses após o início, para cada vez mais soros à medida que o tempo em relação ao início aumentava. As técnicas utilizadas por aqueles autores eram relativamente in. sensíveis e mediam apenas, provávelmente, os anticorpos IgG. Assim, o aparecimento detectável de anticorpos durante o estágio de recuperação pode ser esperado. Mais recentemente, Adniman e colab., Capítulo 33 em Concepts in Virai Pathogenesis II, NotKins e Oldstone ed., Springer-Verlag, New York (1986) pág. 326, relataram, sem identificarem a classe do anticorpo, que os anticorpos anti-EBNA geraimente começam a aparecer um ou dois meses após a infecção.

Os resultados apresentados na Tabela 6 foram aumentados para mostrar adicionalmente a eficácia da comparação das quanti dades relativas dos anticorpos IgG e IgM anti-EBNA para fornecer um diagnóstico para o estágio da EBV-MI, isto é, agudo ou de recuperação, utilizando um polipéptido de acordo com este invento como um antigénio para esses anticorpos. Alguns desses resultados são apresentados em Smith e colab., J. Infect. Dis., 154: :885-889 (Novembro, 1986), cujas descrições são aqui incorporadas por referência. Alguns dados ilustrativos deste trabalho são apresentados, abaixo, na Tabela 8.

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Tabela 8

Dados Serológicos de	Doentes com	Mononucleose	Infecciosa Aguda
Dias após o Início	DO	490¹	Razão
	IgG	IgM	IgG/lgM
2 Doente 1
1	0,011	0,189	0,058
29	0,023	0,527	0,043
95	0,162	0,329	0,492
184	0,552	0,245	2,253
373	0,858	0,152	5,644
2 Doente 2
17	0,125	0,682	0,183
28	0,167	0,674	0,247
68	0,112	0,459	0,244
194	0,233	0,596	0,390
404	0,674	0,665	1,013
Doente 8^
8	0,319	1,046	0,305
38	0,165	0,696	0,237
109	0,141	0,603	0,234
404	1,304	0,562	2,320
Doente 11^
2	0,005	0,055	0,091
23	0,016	0,702	0,023
372	0,878	0,643	1,365
3,519	1,079	0,199	5,422

DO 490 = densidade óptica a 490 nanómetros medida tal como discutido na Secção III K de Materiais e Métodos.

Soros de dadores negativos para o heterófilo.

Soro de um dador positivo para o heterófilo.

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-61- -·^ζ4,

Os resultados na Tabela 8 novamente ilustram a elevação e queda, ao longo do tempo, dos anticorpos IgM anti-polipéptido, e correspondendo a queda da IgM referida com a elevação dos anticorpos IgG anti-polipéptido para doentes que eram quer negativos quer positivos parao heterófilo no início do período de ensaio. Os anticorpos (IgM e/ou IgG) para o antigénio da cápside virai do EBV (VGA) estavam presentes em todos, excepto uma, das amostras de soro examinadas, para o total de 13 doentes do est£ do.

Os soros de um dos doentes negativos para o heterófilo e de dois dos três doentes positivos para o heterófilo apresentavam anticorpos IgG anti-EBNA polipéptido relativamente mais ele. vados pouco após o início da doença. Contudo, a razão de IgG pa ra IgM, apesar de inicialmente maior do que um, aumentou com a passagem do tempo para cada doente; e as amostras do soro apresentaram uma diminuição generalizada do nível de anticorpo IgM anti-polipéptida, associada com uma elevação retardada e sobreponível do nível do anticorpo IgG anti-polipéptido. Assim, em t£ dos os soros dos doentes estudados, uma razão crescente do anticorpo IgG anti-polipéptido para o anticorpo IgM anti-polipéptido presentes anunciou a fase de recuperação da doença, quando as respostas IgG máximas foram observadas.

As amostras do soro foram obtidos a partir de dezanove in. divíduos que foram ou clínicamente diagnosticados como tendo MI ou, quando os dados clínicos são indisponíveis, foram determinados como contendo anticorpos heterófilos nos seus soros. Essas amostras foram analisadas utilizando o ensaio do ELISA de acordo com este invento, no qual o polipéptido P62 foi utilizado como o antigénio ligado à fase sólida. Os níveis de IgG, IgM e IgA na queles soros foram determinados, e os níveis de IgG e IgM anti-EBNA comparados como uma razão. Os níveis de IgA não mostraram qualquer correlação discernível. Os resultados desse ensaio para a IgG e a IgM são apresentados na Tabela 9, abaixo.

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-62- ·' -0

Tabela 9

Níveis do Anticorpo Anti-EBNA em Soros Positivos para o Heteróf ilo

Número da	DO	49O¹	Razão
Amostra	IgG	IgM	IgG/lgM
1	0,018	0,609	0,029
2²	0,055	1,074	0,051
3	0,133	0,412	0,322
4	0,035	0,545	0,064
5	0,087	0,491	0,177
6²	0,319	1,046	0,305
7	0,016	0,388	0,041
8	0,315	1,245	0,25 3
9	0,118	1,255	0,094
10	0,300	0,753	0,039
ll³	0,019	0,918	0,020
12	0,002	0,415	0,005
13	0,282	0,928	0,300
14	0,004	0,572	0,007
15	0,007	0,779	0,009
16	0,009	0,396	0,023
17	0,005	0,446	0,011
18	0,002	0,404	0,005
19	0,002	0,730	0,003

DO 490 - densidade óptica a 490 nanómetros medida como dis. cutido na Secção III K de Materiais e Métodos.

Os soros tinham níveis de IgA relativamente elevados, isto é, maiores do que uma DO 490 de 0,300.

Os dados na Tabela 9 novamente mostram que os soros dos doentes com doença aguda, activa, continham níveis relativamente elevados de anticorpos IgM anti-EBNA, que se ligam ao antigénio polipéptido, quando comparados com os níveis de IgG. Esses dados

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também mostram níveis aumentados de anticorpos anti-EBNA quando comparados com soros de doentes VCA^-, tal como é apresentado na Tabela 5. A presença de níveis negligenciáveis de anticorpos IgG anti-polipéptido é consistente com as observações de Henle e colab., J. Infect. Dis., 130:231-239 (1974).

Os soros de aproximadamente 10# dos casos de MI induzida pelo EBV, aguda, não possuem o anticorpo heterófilo, tal como determinado pela serologia convencional. Dado que o anticorpo he terófilo e os anticorpos anti-EBNA devem ser não relacionados, um certo número de soros adicionais de doentes com MI e negativos para o heterófilo foi analisado com o ensaio usado na Tabela 9. Os resultados são apresentados na Tabela 10, abaixo. Estes d£ entes foram confirmados, quer clínicamente quer por sorologia pa. ra o EBN convencional que tinham MI aguda. Cada soro tinha títulos de antigénio precoce do EBV difuso (EA-D) e de VCA-IgM positivos, os quais em conjunto com os títulos de EBNA negativos (po:

marcos

ACIF), são geralmente considerados/para a MI aguda, independentemente da presença do anticorpo heterófilo.

Tabela 10

Níveis de Anti-Polipéptido EBNA em Soros Negativos para o Heter£ filo de Doentes com Doença Aguda

Número do σ 2 Soro	DO 49O¹	Razão IgG/lgM
IfíG	IgM
1	0,706	1,449	0,49
2	0,836	1,232	0,68
3	0,182	0,713	0,255
4	0,013	0,694	0,018
5	0,351	0,736	0,476
6	0,033	0,841	0,039
7	0,029	0,758	0,038
8	0,011	0,456	0,024
9	0,014	0,538	0,026
10	0,163	0,757	0,215

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-641 Ver nota 1 da Tabela 8.

Gada amostra de soro foi analisada e foi determinada como sendo positiva para o VCA-IgM e o ΞΑ-D e negativa para os anticorpos para o EBNA pela ACIF.

Em todos os casos apresentados, a razão da IgG para a IgM no ELISA anti-EBNA polipéptido foi menor que 1,0 e também menor que 0,7. E evidente a partir destes dados que o ELISA anti-EBNA polipéptido P62 é capaz de detectar MI em indivíduos negativos para o heterófilo quando a razão discriminadora IgG/lgM do anti-polipéptido é aplicada aos dados do ELISA.

Uma ilustração adicional da não articulação da presença dos anticorpos heterófilos dos anticorpos IgM antipolipéptido, e a detecção precoce de anti-polipéptidos fornecida por um ensaio de acordo com o presente invento é apresentada pelos dados da Tabela 11, abaixo. Estes dados também complementam os dados mostrados na Figura 5 em relação à detecção precoce destes anticorpos utilizando um ensaio de acordo com este invento comparado com a ACIF.

Aqui, oito séries de soros emparelhados foram analisados por um ensaio comercial convencional para os anticorpos heterófi los e pelo ELISA anti-polipéptido P62. Em cada caso, a colheita do primeiro soro foi negativa pelo primeiro teste, enquanto que foi positiva pelo último. Os indivíduos apresentavam sintomas de MI na altura dessa primeira colheita. Assim, nestes indivíduos, os anticorpos IgM anti-polipéptido P62 apareceram nos soros antes dos anticorpos heterófilos, como verificado pela serologia convencional. Nos dois primeiros casos da Tabela, os intervalos de tempo entre as datas das colheitas foram de 14 e 8 dias, respectivamente .

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Tabela 11	dos Anticor
Anticorpos Anti-Polipéptido P62 são pos Heterófilos na	Detectados Antes MI Aguda
Número do	DO 49O¹	Razão	Heterófi-
Doente²	IgG	IgM	IgG/IgM	cn o 1—1
1	0,122	0,439	0,25	—
	0,399	0,940	0,42	+
2	0,064	0,512	0,125	-
	0,749	1,10	0,68	+
3	0,013	0,364	0,036
	0,04	0,592	0,068	+
4	0,009	0,597	0,015
	0,038	0,696	0,055	4-
5	0,007	0,472	0,015	—
	0,079	0,624	0,13	Ή
6	0,014	0,363	0,04	—
	0,086	0,937	0,09	+
7	0,009	0,447	0,02	—
	0,021	0,584	0,04	+
8	0,023	0,466	0,05	—
	0,951	0,50	1,9	+
¹ Ver Nota 1	da Tabela 8	•

A primeira colheita de soro foi obtida com a apresentação dos sintomas da MI aguda. A segunda colheita foi obtida, para o mesmo indivíduo, pouco tempo mais tarde. A MI aguda foi confirmada, em cada caso, pela presença final de an ticorpos heterófilos.

A presença dos anticorpos heterófilos foi determinada pela

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-66-bb- y, utilização de um equipamento em conjunto comercial.

Os ensaios de razão anteriormente descritos, embora possuam um aspecto qualitativo dado que é determinada a presença de anticorpos anti-P62, são priniáriamente utilizados quantitati vamente para determinar as quantidades relativas de anticorpos IgM e IgG- anti-P62 que estavam presentes na amostra corporal hu_ mana. Esse ensaio primáriamente quantitativo normalmente requer cerca de 2,5 horas para ser executado após os suportes da fase sólida estarem preparados.

Uma razão mais qualitativa que requer pouco mais de cerca de seis minutos para ser executado, após a preparação do suporte de fase sólida, também foi desenvolvido. Este ensaio utiliza metodologia e química semelhantes aos ensaios anteriormente descritos, mas baseia-se na comparação visual de intensidades de cor, produzida por um meio indicador anteriormente discutido e substracto, para fixar as quantidades relativas de anticorpos IgG e IgM anti-polipéptido P62 presentes na amostra analisada e, deste, modo, se o estado da doença é agudo, convalescente, ou de passagem de agudo para convalescente.

Em concretizações preferidas, o suporte da fase sólida é constituído por uma matriz em colher de polistireno branca opa ca. A matriz em colher da fase sólida é constituída para conter dois poços adjacentes aos quais o polipéptido P62 é afixado. Os poços estão separados por um dique elevado que actua de forma a impedir que o líquido de um poço entre para o outro.

Os ensaios para os anticorpos anti-IgM e anti-IgG são rea lizados separadamente tal como geralmente descrito anteriormente, mas são preferivelmente efectuados lado a lado (uma análise para cada um dos tipos de anticorpo em cada poço) e simultâneamente. Além disso, em vez de determinar os valores da densidade óptica ou outros índices de marcação mecânicamente, o utilizador simplesmente compara a intensidade da cor de cada poço a olho nu.

Este ensaio, embora necessite de menos de cerca de um décimo de tempo do ensaio anteriormente descrito, exibe uma espec.i ficidade e uma sensibilidade extremamente elevadas. Além disso,

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-67está prontamente adaptado para utilização no consultório do médico, de modo que o médico e o doente podem conhecer os resulta dos do ensaio enquanto o doente se encontra no consultório.

Detalhes adicionais deste ensaio são fornecidos na secção III D de Materiais e Métodos.

(c) Ensaios para EBV-MI e CMV-MI antigénio nuclear do Epstein-Barr contém uma sequência única de mais de 200 aminoácidos que contém apenas os aminoácidos glicina e alanina. Os péptidos feitos a partir destas sequên cias são imuno-reactivos com os soros de indivíduos positivos pa ra o VCA, como mostrado antes. Além disso, um péptido desta sequência, P62, é o mais imuno-reactivo com soros de doentes com EBV agudo, infeccioso /jRhodes e colab., em Herpesvirus, R. Rapp ed. Alan R. Liss, New York págs 487-496 (1984); Rhodes e colab., J. Immunology, 134:211-216 (1985); Smith e colab., J. Infect Pis. 154:885-889 (1986); Geltosky e colab., J. Clin lab Analysis 1: :153:162 (I987O· Os doentes com EBV-MI aguda têm anticorpos IgM para as proteínas EBNA em diversas linhas celulares positivas para o EBV /~leltosky e colab., J. Clin Lab Analysis 1:153: :162 (1987); Rhodes e colab., J. Exp Med 165:1026-1040~7 detecta dos por imunomancha.

Os resultados discutidos em seguida ilustram que os soros sequenciais, não apenas de EBV-MI, mas também de doença do tipo mononucleose induzida pelo citomegalovírus (CMV) (CMV-MI), possuem anticorpos IgM dirigidos para os epitopos do P62 de EBNA, na fase aguda da doença. As amostras de soros sequenciais colhidas de oito doente com infecção pelo CMV aguda mostram todas uma elevação bem marcada dos anticorpos IgM anti-P62 durante a doença aguda. A mesma resposta é observada quer em doentes com uma infe£ ção pelo EBV anterior quer num indivíduo que foi infectado pelo CMV antes do EBV. A imuno-mancha do soro de doentes com MI aguda infectados quer com o EBV quer com o CMV mostrava que a mesma sé. rie de anticorpos IgM é induzida por ambos os vírus e que os anticorpos reagem com um certo número de proteínas celulares normais presentes em células não infectadas. Assim, a presença des69 762

EPG:11-SCR? 45.2

-68tes anticorpos IgM é diagnóstica da infecção aguda quer pelo EBV quer pelo CMV.

(i) Os soros Sequenciais de um Doente com EBV-MI têm Anticorpos IgM para ο P62 e para ο ΞΒΝΑ-1 na Fase Aguda da Doença

Os anticorpos IgM que reconhecem o péptido do EBNA P62 são detectados num ensaio do ELISA durante a fase aguda da EBV-MI //Rhodes e colah., em Herpesvirus, R. Rapp ed., Alan R. Liss, New York; págs 487-496 (1984); Rhodes e colab., J. Immunology, 134:211-216 (1985); Smith e colah., J. Infect Dis., 154:885-889 (1936); e Geltosky e colah, J. Clin. Lah Analysis, 1:153-162 (1987 )_7· Estas observações foram confirmadas quando os soros sequenciais de D.B., um doente com EBV-ΜΙ, foram analisados quan_ to à imuno-reactividade pelo ELISA E3NA P62 (Figura 6).

Estes dados demonstram uma elevação precoce dos anticorpos IgM na fase aguda da doença (Jan-Março de 1985), que corres ponde à elevação precoce dos anticorpos IgM e IgG para o VCA (1:2) sem anti-EBNA pelo método de IFA tradicional. Os soros des. te doente apresentaram uma elevação lenta dos anticorpos IgG para ο P62 que atingiram 0 ponto culminante nos espécimes de Março. -Abril de 1985, após a fase aguda da doença. A razão IgG/lgM excedeu 0,7 no espécime de Maio de 1985, quando 0 doente se encontrava na fase convalescente tardia da doença. Nesta altura, os títulos do anti-EBNA estavam a evoluir e os títulos do VCA-IgM eram dificilmente detectáveis pela serologia convencional para 0 EBV.

A elevação dramática dos anticorpos específicos da classe IgM durante a fase aguda da doença foi confirmada pela técnica da imuno-mancha (Figura 7). As mesmas amostras do soro utilizadas para o ELISA foram utilizadas nos estudos de imuno-mancha pa ra detectar os antigénios presentes numa linha celular B transformada pelo EBV.

Como pode ser observado da Figura 7, os anticorpos IgM presentes no soro do doente reconhecem uma série de 8 bandas mai. ores e mais bandas menores no extracto. Os anticorpos IgM para a

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-69maioria destas proteínas elevam-se nas duas primeiras amostras de soro, atingem o ponto culminante na terceira amostra, e decli nam em seguida. Esta é a mesma sequência temporal que é observada no ELISA péptido.

As proteínas reconhecidas pelos anticorpos IgM incluem o EBNA-1 de 77 KD, assim como uma série de proteínas celulares nor mais (bandas a 92, 82, 80, 69, 62 e 53 KD) que contêm os epítopos relacionados com a região de glicina-alanina do EBNA-1 /TRho des e colab., J. Exp. Med., 165:1026-1040 (1987 )_J7 · Os anticorpos para as proteínas a 120 e 29 KD, que não têm sequências em comum com o EBNA-1 //Rhodes e colab., J. Exp. Med., 165:1026-1040 (1987)77» parecem atingir 0 ponto culminante mais cedo. Assim, existe uma boa correlação entre os anticorpos IgM para o péptido sintético P62 e a maioria dos anticorpos IgM detectados por mancha de Western.

Os anticorpos IgG para o EBNA-1 (77 KD), no doente D.B., apareceram tardiamente nas imuno-manchas (Figura 7), uma observa, ção consistente com os dados do ELISA EBNA P62. Do lado esquerdo da mancha na Figura 7, a forte resposta IgG para a banda de EBNA de 77 KD de um indivíduo positivo para o VCA (VCA⁺), positivo pa ra o EBNA-1 (EBNA-1⁺) é apresentada como um controlo. Os anticor pos IgG anti EBNA-1 foram primeiramente detectados nas manchas 51 dias após o início da doença (quarto ponto no tempo), na mesma altura que os anticorpos IgG para 0 péptido começaram a elevar-se .

(ii) Soros Sequenciais de um Doente com CMV-MI que Subsequentemente Desenvolveu EBV-MI

As amostras de soro sequenciais do doente D.S. também foram analisadas pelo ELISA EBNA P62 e pela mancha de Western. Os dados clínicos/sorológicos sobre este doente foram publicados, e por sorologia clássica demonstrou-se que ele teve uma infecção pelo CMV aguda seguida, três meses depois, por doença pelo EBV aguda.

Os resultados dos estudos do ELISA anti-péptido, utilizan.

do os soros colhidos sequencialmente do doente D.S., são apresen

762

EPG:11-SCRF 45.2

-70tados na Figura 8. Os soros do doente D.S. na fase aguda da doença pelo CMV apresentavam uma resposta IgM pronunciada ao pépti. do P62 detectada pelo ELISA, tal como o doente D.B. apresentava durante a sua infecçâo pelo EBV aguda. 0 sinal IgM anti-péptido foi alto para as três amostras de soro obtidas durante a primeira doença e também foi elevado na amostra inicial da segunda doença. Não se sabe se o nível de anticorpo diminiu entre as duas doenças. Os anticorpos IgG para o polipéptido P62 não foram detectados até à última amostra de soro obtida um ano após a segun da doença.

As amostras deste doente também foram analisadas por imuno-mancha (Figura 9)· Foram encontrados anticorpos IgM para as proteínas de pesos moleculares 82, 80-77, 69, 62 e 58 KD durante ambas as infecções. Deverá ter-se em atenção que os anticorpos IgM reconhecem os mesmos antigénios durante ambas as doenças. Os níveis de anticorpo IgM medidos nas manchas encontravam-se nos seus níveis mais altos durante a primeira e a parte inicial da segunda infecçâo, e declinaram em seguida, um achado semelhante ao observado no ELISA anti-péptido P62. 0 anticorpo IgG para o EBNA-1 apareceu apenas no último ponto do tempo (banda fraca pró xima a um controlo VOA ⁺ , EBNA-1⁺ normal, na faixa da direita).

Ambos os doentes apresentavam uma resposta IgM anti-pépti do P62 precoce correlacionada com os anticorpos IgM para um certo número de bandas observadas nas manchas de Western. A resposta IgG anti-péptido P62 ocorreu muito mais tarde e estava correlacionada con o aparecimento de anticorpos IgG que são específicos para a proteína EBNA-1. Isto é consistente com o que foi anteriormente descrito //Rhodes e colab., em Herpesvirus, R. Rapp ed., Alan R. Liss, New York, págs. 487-496 (1984); Rhodes e colab., J. Immunology, 134:211-216 (1985); Smith e colab., J. Infect Dis., 154:885-889 (1986); Geltosky e colab., J. Clin. Lab Analysis, 1:153-162; e Rhodes e colab., J. Exp. Med., 165:1026-1040 (1987)-3⁷.

A constatação surpreendente é o da infecçâo pelo CMV indu zir anticorpos IgM com estas mesmas propriedades. Isto é, os anticorpos IgM que surgem durante as infecções pelo CMV reagem com

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urna série de antigénios de tamanho aparentemente idêntico àqueles que ocorrem durante a infecção pelo EBV.

(iii) Soros de Dez Doentes com CMV-MI Aguda

Foram estudados os soros de dez doentes com CMV-MI, no ELISA e por imuno-mancha, para determinar se os anticorpos IgM, detectados nos soros do doente D.S., para o EBNA P62 e aqueles das imuno-manchas eram únicos para este doente ou se esta respos. ta podia ser detectada nos soros de outros doentes com CMV-MI. Todos estes doentes tinha tido uma infecção pelo EBV prévia, como indicado pelos títulos de IgG para o VCA positivos e títulos de EBNA-1 positivos pela IFA.

Os dados anti-péptido P62 representativos de dois destes doentes são apresentados nas Figuras 10A e 10B. Todos os 10 doen tes apresentavam um aumento pronunciado de anticorpos IgM antipéptido P62 durante a fase aguda da doença pelo CMV. Os anticorpos IgM persistiram durante um a dois meses, e, em seguida, regressaram aos níveis de fundo.

Em contraste, os anticorpos IgG anti-péptido P62 começaram num valor positivo (dado que os doentes eram EBV⁺, VCA⁺, EBNA-1⁺), e apresentaram uma alteração pequena durante o curso da doença. Na realidade, de sete doentes com amostras de soro sequenciais, quatro apresentaram ligeiros aumentos nos níveis de anticorpo IgG anti-péptido P62 (por ex., Figura 10B), 1 apresentou uma diminuição (Figura 10A), e dois não apresentaram qualquer alteração.

Os mesmos soros foram analisados por imuno-mancha. Todos os doentes apresentaram uma elevação transitória dos anticorpos IgM para um certo número de antigénios durante a fase aguda da doença semelhante às observadas nas Figuras 7 θ 9· Pequena, ou mesmo nenhuma alteração pôde ser detectada nos níveis de anticor po IgG anti-EBNA-1.

Assim, todos os doentes examinados com infecções pelo CMV agudas apresentaram um aumento transitório pronunciado nos anticorpos IgM anti-péptido P62, com uma alteração menor e variável no nível de IgG anti-péptido.

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A razão da IgG para a IgM é uma maneira conveniente de expressar os dados do anti-péptido P62 dos doentes com EBV-MI. Como ilustrado anteriormente, esta razão é menor que 1 durante a fase aguda da doença, e aumenta durante a convalescença para um valor maior do que 1 onde permanece para o resto da vida do indivíduo /3Rhodes e colab., J. Exp. Med», 165:1026-1040 (1987)37· A vantagem deste método de análise pela razão é que ele evita a definição dos valores de fundo e de Cutoff 77^^e3 tosky e colab., J. Clin, lab Analysis, 1:153-162 (1987)77♦

Quando analisado pelo método da razão, este estudo revelou dois tipos gerais de respostas imunes ao epítopo do polipéptido P62. Por exemplo, os soros do doente L.S. (Pigura 10A) de. monstraram a resposta predominante. Aqui, foi observado uma razão de perto de 2 nas amostras de pré-doença. Esta razão caiu para baixo de 1 (para 0,661) durante a doença aguda, subindo en tão novamente durante a convalescença. Um total de oito dos dez doentes com uma infecção CMV-MI aguda foram classificados como positivos no ELISA EBNA P62 pela análise da razão.

Os doentes S.G. e G. S. apresentaram um outro tipo de res. posta ao P62. Embora ambos exibissem um aumento dos anticorpos IgM durante a doença aguda, o valor máximo mantevesse abaixo dos níveis de IgG. Estes soros são classificados como negativos pela análise da razão. Em ambos os casos, o resultado falso negativo foi devido a um sinal IgG inicial forte. Assim, apesar de uma in. fecção anterior pelo CMV ser relativamente rara, no grupo etário dos indivíduos que contraiem EBV-MI, podem ocorrer alguns resultados falsos-negativos utilizando o método da razão IgG/lgM.

(iv) Comparação Directa dos Antigénios Reconhecidos pelos Soros EBV-MI e CMV-MI

Um padrão muito semelhante de antigénios é reconhecido pe. los anticorpos IgM durante as infecções pelo EBV e pelo CMV agudas (comparar Piguras 7 θ 9)· A fim de comparar directamente estes antigénios, os soros dos doentes com qualquer uma das doenças foram submetidos a imuno-mancha lado a lado com o mesmo extracto celular. As células utilizadas para o extracto foram da

762

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fer» notar que estas células não con.

Assim, quaisquer antigênios denormais.

f)

-73linha celular K562. E importante têm sequências do EBV ou do CMV. tectados são proteínas celulares

Os dados deste estudo relacionados com a ligação pelos anticorpos IgM são apresentados na Figura 11A. As faixas 1, 2, e 10 foram investigadas com soros de doentes com EBV-MI, enquari to que as faixas restantes foram investigadas com soros de doentes com infecções CMV-MI agudas.

Como pode ser observado a partir dessa Figura, as maiores bandas de antigénio a 92,82-77, 69, 62 e 58 KD têm reactividades idênticas com os soros dos doentes infectados com qualquer dos dois vírus. Algumas bandas menos intensas também foram observadas nos dois grupos de doentes. Existia uma banda a cerca de 50 KD que parece ser apenas encontrada nos doentes com CMV, mas isto é uma excepção. Todas as outras bandas foram encontradas quer num quer em poucos soros ou são comuns a todos os soros. Assim, a infecção por qualquer dos dois vírus induziu anticorpos IgM pa ra a mesma série de proteínas.

A mesma série de soros foram também submetidos a mancha utilizando um extracto de fibroblastos infectados pelo CMV. 0 anticorpo IgG foi detectado nestes estudos apresentados na Figura 11B.

Nessa Figura, pode ser observado que todos os doentes com CMV tinham anticorpos IgG para um antigénio proeminente de 50 KD, outro a 64 KD, e outros que estavam presentes apenas em alguns dos doentes com CMV. Pequena, ou mesmo nenhuma reacção foi obser vada nos doentes infectados pelo EBV. Trabalhos em curso indicam que todas as bandas observadas neste estudo são causadas por pr£ teínas do CMV codificadas pelo vírus.

Conclui-se que a infecção aguda pelo CMV ou pelo EBV induz uma série comum de auto-anticorpos IgM. Em contraste, os anticorpos IgG são específicos para as proteínas do vírus que causa a doença, e esses anticorpos IgG não apresentam reactividade com os componentes do hospedeiro //Rhodes e colab., J. Exp. Med,, 165:1026-1040 (1987 /769 762

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-74(v) Inibição da Ligação do Anticorpo cota o Péptido P62

Demonstrou-se préviamente que o péptido P62 inibe a liga ção do anticorpo para um certo número de anticorpos IgM induzi, dos pelo EBV //Rhodes e colab., J. Exp. Med., 165:1026-1040 (1987)77· Isto é novamente demonstrado na Figura 12 onde dois soros EBV⁺ foram submetidos a mancha sobre um extracto de células B EBV⁺.

Na Figura 12, a faixa 1 continha soro do doente D.3. 15 dias após o início da doença e a faixa 5 continha outro soro de EBV-ΜΙ aguda. As faixas 2 e 6 tinham os soros respectivos contendo adicionalmente 400yAg/ml de péptido P62. Estes estudos fo. ram efectuados a diluições do soro mais elevadas do que aqueles apresentadas na Figura 7, de modo que apenas as bandas mais for temente reactivas podessem ser fácilmente visíveis.

Como pode ser observado da Figura 12, o polipéptido inibiu a ligação do anticorpo IgM a diversas bandas de proteína, sendo as mais fácilmente observadas as bandas a 82 até 77 KD. Trabalhos em curso indicam que esta área contém o EBNA-1 e uma ou mais proteínas celulares.

A faixa 3 continha soro do doente D.S. 12 dias após o ini. cio da sua doença pelo CMV, enquanto que a faixa 4 era constituí, da pelo mesmo soro mais o péptido 62, como anteriormente. Novamente, as reactividades do IgM com as bandas 82-77 KD, assim como com algumas nos limites de 58 a 62 KD, foram inibidas pelo pé. ntido do EBV.

Foram também efectuados estudos de inibição dos anticorpos IgG observados nas experiências de mancha. A faixa 7 continha soro do doente D.B. 514 dias após o início da doença, a faixa 9 continha soro do doente D.S. 417 dias após o início da sua doença pelo CMV, e a faixa 11 era de um adulto normal com uma in. fecção pelo EBV muito antiga. As faixas 8, 10 e 12 continham os soros respectivos com 50y_Ag/ml de P62.

A única proteína detectada foi a banda EBNA-1 a 77 KD. A ligação a esta proteína foi inibida pelo péptido em todos os ca69 762

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Conclui-se destes estudos que a infecção pelo CMV produz auto-anticorpos IgM que reconhecem um péptido da região do EBNA-1 do EBV. Estes anticorpos IgM reconhecem uma série de au to-antigénios celulares que são idênticos em motilidade e parti lham uma especificidade de epítopo com aqueles produzidos duran. te a infecção pelo EBV.

(d) Ensaio para o Carcinoma Naso-faríngeo (CNP)

Como anteriormente observado, o EBV foi implicado como o agente causador do carcinoma naso-faríngeo (CNP). 0 carcinoma naso-faríngeo é uma forma maior de cancro na China, com uma taxa de incidência tão elevada como 100 em 100 000 pessoas, por ano.

As análises da mancha de Western utilizando extractos de células Wi-L2 infectadas pelo EBV com soros de um indivíduo VCA⁺normal, de um doente com MI e de seis doentes com CNF, apresenta vam uma imuno-reacção de IgG com a proteína EBNA, respostas IgM e IgG para a proteína EBNA com o soro doente com MI, e reacções de IgG, IgM e IgA para a proteína EBNA de doentes com CNF.

Estudos recentes mostraram que os níveis séricos dos ant/ corpos IgG e IgA para uma variedade de antigénios do EBV estão significativamente elevados em doentes com CNF //Henle e colab., Int. J. Câncer, 17:1-7 (1976); Desgranges e colab., Int. J. Câncer, 19:627-633 (1977); e Pearson e colab., Câncer, 51:260-268 (1983)/7 . Mais especificamente, Henle e colab., relataram altos títulos séricos de IgA para os antigénios VCA e D/(difuso) que ocasionalmente igualavam títulos de IgG para esses antigénios. Desgranges e colab., utilizaram saliva e relataram o achado de anticorpos IgA e IgG neutralizantes para o VCA e o EA (antigénio precoce). Person e colab., descreveram a eficácia diagnóstica de um ensaio de IgA anti-VCA articulado com um ensaio de IgG anti-EA. Esses estudos não descreveram a presença de anticorpos IgA anti-EBNA nas amostras que eles examinaram.

Um certo número de soros de doentes que se sabe terem CNF foram analisados utilizando um ELISA de fase sólida com o polipé.

ptido P62 afixado a uma matriz sólida para formar um suporte só69 762

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A lido, como discutido anteriormente. Esses soros também foram ana lisados por ensaios sorológicos padronizados. Os resultados estão indicados na Tabela 12, abaixo.

Tabela 12

Valores do E1ISA em Soros de Doentes com CNF

Amostras	Títulos de Anti-EBV^	Títulos de Anti-P62^{* 1 2}
VCA	EA	IgA	IgA	IgM	IgC-
1	320	120	60	0,617(+)	0,642	1,686
2	960	40	60	0,376(-)	0,541	1,570
3	640	120	15	0,737(+)	0,247	1,143
4	320	NT	30	0,289(-)	0,173	0,958
5	1920	320	240	0,871(+)	0,303	2,000
6	960	80	80	0,738(+)	0,334	0,915
7	640	320	10	0,675(+)	0,216	0,993
8	960	640	320	0,667(+)	0,478	1,160
9	480	NT	15	0,701(+)	0,417	1,324
10	640	60	20	0,024(-)	0,159	0,207
11	1280	240	80	0,466(+)	0,142	1,139
12	240	40	80	0,651(+)	0,725	1,360
13	1280	120	160	0,421(+)	0,190	1,566

NT = Não testado.

0 ELISA Anti-polipéptido P62 do EBV foi efectuado nestes soros tal como descrito na Secção Materiais e Métodos. Os sinais (+) indicam valores de densidade óptica considerados positivos para o CNF, enquanto que os sinais menos (-) indicam valores da densidade óptica considerados nega tivos para o CNF.

Como pode ser verificado a partir dos dados acima, os en saios sorológicos para o VCA, EA e IgA correlacionam-se bem com um título de IgA anti-péptido P62 relativamente aumentado. 0 ti. tulo de IgA anti-péptido P62 não foi inibido pela presença de anticorpos IgM ou IgG presentes no soro. Além disso, a razão da IgM para a IgG pode ser vista como mostrando que os doentes não

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-77tiveram MI aguda. Ainda mais, os títulos de anti-EBNA, tal como determinados pela ACIF, foram verificados como sendo não relacio. nados com a doença.

Ao estudar os soros de indivíduos normais que não têm CNF, foi encontrado um valor da DO 490 de 0,3 como o valor de controlo para este ensaio de IgA. Neste formato particular de ensaio, um valor de ϋ.Ο.^θ significativamente acima de 0,3 foi conside. rado como um indicador positivo de CNF. Assim na Tabela acima, dos 13 soros foram positivos para o CNF e estão indicados por um sinal mais (+).

método geral de ensaio anteriormente descrito para detecção de anticorpos anti-EBNA é também entendido como sendo efi_ caz na detecção da presença do CNF num indivíduo. E utilizada uma amostra corporal contendo o anticorpo, tal como soro, plasma, saliva, expectoieçao ou/favado faríngeo. A amostra corporal é misturada com o suporte de fase sólida num meio aquoso, como anterior mente descrito. Aqui, a quantidade de anticorpos IgA é analisada, com uma quantidade relativamente aumentada acima de um controlo indicando a presença do CNF.

(e) Reactividade Cruzada Imunológica dos Péptidos Relacionados com o EBV e com o CMV vírus do herpes, citomegalovírus humano (CMV), foi implicado como um agente patogénico importante que pode causar de. feitos à nascença e infecçoes oportunistas em indivíduos imunos. suprimidos. 0 vírus CMV também causa uma doença do tipo da mononucleose (CMV-MI), semelhante à mononucleose infecciosa causada pelo EBV (EBV-MI).

Durante os estudos clínicos sobre a utilização de um ELISA baseado no polipéptido P62 para detectar a presença de anticorpos anti-EBNA em doentes com EBV-MI na fase aguda, foi verificado que aproximadamente 60-70% dos casos de CMV-MI negativos para o heterófilo foram considerados positivos no ELISA baseado no P62. Pensou-se que a presença de anticorpos nos doentes com CMV-MI capazes de imuno-reagirem com ο P62 fosse o resultado quer de uma reactivação da infecção pelo EBV latente pela infecção pe.

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-78lo CMV corrente, quer o resultado da produção de uma proteína do CMV que seja imunológicamente reactiva de forma cruzada com o EBNA.

Para investigar a possibilidade do soro de indivíduos infectados pelo CMV conter anticorpos, que apresentavam reacção cruzada com ο P62, induzidos por um antigénio codificado pe. lo CMV, foram sintetizados três polipéptidos relacionados com o CMV, apresentados na Tabela 13.

Tabela 13

Designação do

Péptido Sequência dos Resíduos de Aminoácidos

Cl AGGGGGGGAGGGGGGGGSGG

C2 SSSSAGGGGGGGAGGGGGGGGSGG

C3 SSSSAGGGGGGGAGGGGGGGC-SGGC

1. A sequência dos resíduos de aminoácidos dos péptidos Cl, C2 e C3 corresponde, cada uma, a uma porção de um polipéptido prognosticado como sendo expresso por uma região codificadora do exão 1 do ARN do CMV de 2,2 qui. lobases descrito por Stapraus e colab., J. Virol., 57: :591-602 (1986).

As amostras de soro obtidas durante o curso da MI de doentes seleccionados foram analisadas quanto à imuno-reactividade de IgG e IgM para os polipéptidos P62, Cl e C2, utilizando um ELISA semelhante ao descrito na secção III D de Métodos e Materiais. A Figura 14 ilustra os resultados deste estudo estudo uti lizando amostras de soro obtidas a partir de um doente (DB) tendo uma infecção pelo EBV que resultou no desenvolvimento de MI aguda seguida pela fase convalescente da doença. Esses resultados ilustram o padrão anteriormente descrito de detecção de anti. corpos IgM anti-P62 durante a fase aguda da EBV-ΜΙ e elevação de anticorpos IgG anti-P62 (e queda concomitante de IgM anti-P62) durante a convalescença.

A Figura 14 também ilustra que, quando os péptidos rela69 762 . EPG:11-SCRF 45.2

cionados com o CMV, Cl e C2, são utilizados como antigénio de fase sólida (alvo) no ELISA, verificou-se que os mesmos espécimes sequenciais obtidos do doente DB continham anticorpos IgM anti-Cl e anti-C2 durante a fase aguda da doença. Contudo, enquanto a resposta do anticorpo IgM anti-Cl e anti-C2 cai com o início da convalescença, não foi detectada qualquer elevação con comitante do anticorpo IgG anti-Cl e anti-C2.

As amostras de soro sequenciais de um segundo doente (DS), tendo uma infecção pelo CMV primária resultando em CMV-MI aguda seguida por uma infecção pelo EBV secundária resultando em EBV-MI aguda, foram analisadas com os ELISAs P62, Cl e C2, como des. crito acima. Tal como ilustrado na Figura 15, cada um dos FLISA detectou anticorpos IgM anti-péptido durante as fases agudas das infecções pelo CMV e pelo EBV.

A actividade imunológica dos pêptidos relacionados com o CMV foi adicionalmente examinada estudando a capacidade dos anti corpos induzidos pelo Cl, C2 e C3, de imuno-reagirem com o EBNA. Os anti-soros anti-péptido de coelho para Cl, C2 e C3 foram, cada um deles, submetidos a imuno-reacção com extractos de células expressando o EBNA, utilizando um processo de imuno-mancha semelhante ao descrito na secção III G de Métodos e Materiais. Os re. sultados do estudo de imuno-mancha indicam que os anticorpos anti-Cl, anti-C2 e anti-C3 de rato imuno-reagem com o EBNA.

Além disso, quando os anticorpos anti-Cl e anti-C2 de coe. lho foram mantidos com os seus pêptidos respectivos antes de serem submetidos a imuno-mancha, a imuno-reacção com a proteína EBNA foi bloqueada.

Consequentemente, deve notar-se que, enquanto as sequências de resíduos de aminoácidos dos polipéptidos Cl, C2 e C3 cor respondem a uma sequência codificada pelo genoma do CMV, aqueles polipéptidos são polipéptidos de acordo com o presente invento dado que contém uma sequência de resíduos de aminoácidos representada pela fórmula:

-Gly-R¹-Gly-R²-Glyem que R e R designam resíduos de aminoácidos que, quando to—

762

EPG:11-SCRP 45.2 ο

z?

•*^4. ' '

-80mados individualmente são iguais ou diferentes e são selecciona dos a partir do grupo constituído por Ala, Arg, Gly, Leu,Pro, *2

Ser e Thr, com a condição de R e R não serem ambos Gly. Além disso, os resultados acima indicam que os polipéptidos Cl, 02 e 03 podem imuno-reagir com os anticorpos IgM induzidos pelo EBNA e que os anticorpos induzidos por esses pêptidos imuno-reagem com o EBNA.

Tanto o EBV como o CMV produzem uma doença linfoproliferativa não maligna cuja fase aguda é caracterizada pela produção de anticorpos IgM que imuno-reagem com um polipéptido de acordo com este invento. Dado que os anticorpos anti-EBNA não são tipi, camente encontrados em associação com a doença linf oproliferati. va maligna, o presente invento fornece, portanto, um método e um sistema diagnóstico para efectuar a distinção entre a doença linfoproliferativa maligna e a não-maligna induzida por vírus.

3. Preparação para Imunização Passiva

Um doente com linfócitos B infectados de forma latente, que expressa EBNA nas suas superfícies celulares, pode ser tratada com os receptores de acordo com este invento, preferívelmen. te como anticorpos completos, originados para os polipéptidos sintéticos de acordo com o presente invento que imuno-reagem com o EBNA. Os receptores são administrados numa dose unitária tendo uma quantidade eficaz de receptores dispersa num diluente farmacêuticamente aceitável.

Uma quantidade eficaz dos referidos anticorpos varia, dependendo da reactividade e tipo dos anticorpos. Geralmente, cerca de 0,5 miligramas até cerca de 25,0 miligramas de anticorpo por quilograma de peso corporal do doente é considerado eficaz. Os anticorpos podem ser administrados por via intravenosa, intra muscular ou intraperitoneal com várias administrações dadas com intervalos de 3 a 20 dias. Os anticorpos podem também ser dados em conjunto com um tratamento cirúrgico ou químico.

Os anticorpos podem ser obtidos a partir de soros ou pias, ma de um animal de espécie diferente da do doente a ser tratado, dando origem a anticorpos para o polipéptido de acordo com este

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-81invento utilizando o inoculado antes descrito. Os anticorpos tam bém podem ser obtidos a partir de fontes monoclonais, tal como o fluído ascístico, por preparação de uma linha celular de hibrid£ ma utilizando técnicas conhecidas na especialidade. Os anticorpos completos são preferidos como o local de combinação dado que eles são capazes de activar o sistema do complemento quando é formado um complexo imune.

III. MÉTODOS E MATERIAIS A. Síntese de Polipéptidos

Os polipéptidos de acordo com este invento foram sintetizados quimicamente por métodos de fase sólida, como descrito em Merrifield e colab., J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963) e Houghten e colab., Int. J. Pept. Prot. Res. 16:311-320 (1980).

método de fase sólida de síntese polipéptidica foi executado utilizando um Sintetizador de Polipéptidos Beckman Modelo 99OB, comercialmente disponível a partir de Beckman Instrument Co., Berkeley, CA, E.U.A.

Para polipéptidos tendo menos de 35 resíduos que foram utilizados num inoculo , foi adicionado um resíduo de cisteína ao terminal amino ou ao terminal carboxilo para auxiliar na ligação ao transportador da proteína, como descrito abaixo. As com posições de todos os polipéptidos foram confirmados por análise dos aminoácidos.

Na preparação de um polipéptido sintético de acordo com este invento pelo método de fase sólida acima, os resíduos de aminoácidos são ligados a uma resina (fase sólida) através de uma ligação éster do resíduo do terminal carboxi. Quando o polipéptido está para ser ligado ao transportador por meio do resí. duo de Cys ou polimerizado por meio dos resíduos de Cys terminais, é conveniente utilizar aquele resíduo de Cys como 0 resíduodo ter minai carboxi que está ligada, por meio de uma ligação éster, à resina.

grupo alfa-amino de cada aminoácido adicionado é tipicamente protegido por um grupo de butoxicarbonilo terciário (t-BOC) antes do aminoácido ser adicionado à cadeia polipéptidica em cres cimento. 0 grupo t-BOC é então removido antes da adição do próxi69 762

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-82mo aminoácido à cadeia polipéptidica em crescimento.

Ás cadeias laterais de aminoácidos reactivas também foram protegidas durante a síntese dos polipéptidos. Os grupos protectores habituais das cadeias laterais foram utilizados para os re síduos de aminoácidos restantes, como se segue:

0-(jo-bromobenziloxicarbonilo) para tirosina; O-benzilo para treonina, serina, ácido aspártico e ácido glutâmico; S-metoxibenzilo para cisteina, dinitrofenilo para histidina; 2-clorobenzoxicarbonilo para lisina e tosilo para arginina.

Os aminoácidos protegidos foram recristalizados dos solventes apropriados para originar pontos únicos por cromatografia de camada fina. Os acoplamentos foram tipicamente realizados num excesso molar de dez vezes de ambos, aminoácido protegido e dici. clo-hexilcarbodiimida, em relação ao número de miliequivalentes do aminóacido do terminal N inicial. Também pode ser usado um ex cesso molar de dois de ambos os reagentes. Para a asparagina, foi adicionada uma quantidade molar igual de N-hidroxi-benzotria zol para o aminoácido protegido e a dimetil formamida foi utilizada como solvente. Todas as reacções de acoplamento foram mais de 99% completas pelo teste do ácido pícrico de Gisin, Anal. Chem. Acta. 58:248-249 (1972).

Após preparação do polipéptido desejado, uma porção do po.

lipéptido protegido resultante (cerca de 1 grama) foi tratada com dois mililitros de anisol, e cerca de 20 mililitros de fluoreto de hidrogénio anidro foram condensados para o recipiente reaccional à temperatura do gelo seco. A mistura resultante foi agitada, a cerca de 4^QC durante cerca de uma hora para clivar os grupos protectores e para remover o polipéptido da resina. Após evaporação do fluoreto de hidrogénio a uma temperatura de 4²C com uma corrente de N₂, o resíduo foi extraído com éter dietílico anidro, três vezes, para remover o anisol, e o resíduo foi se. co in vacuo.

material seco sob vácuo foi extraído com ácido acético aquoso a 5% (3 vezes, 50 mililitros) para separar o polipéptido livre da resina. A solução contendo o extracto foi liofilizada

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originando o polipéptido não oxidado monomérico.

polipéptido sintético produzido pode ser utilizado como um reagente num ensaio de imunossorvente ligado ao enzima (ELISA), para detectar os anticorpos anti-EBNA. 0 polipéptido sintético também pode ser utilizado para produzir um inoculo, geralmente ligando-o a um transportador para formar um conjugado e , em seguida, dispersando uma quantidade eficaz do conjugado num diluente fisiológicamente tolerado, tal como aqui discutido em seguida.

Deve também observar-se que um multímero sintético de acor do com este invento pode ser preparado pela síntese de fase sólida de uma pluralidade dos polipéptidos de acordo com este invento ligados uns aos outros, extremidade com extremidade (cabeça-à-cau da ), por uma ligação amida entre o resíduo do terminal carboxi de um polipéptido e o resíduo do terminal amino de um segundo polipéptido. Tais polímeros sintéticos são preferivelmente sintetizados como um único multímero polipéptidico comprido, mas também podem ser preparados como polipéptidos individuais que são ligados uns aos outros após a sua síntese individual, utilizando um reagente de carbodiimida tal como o cloridrato de l-(3-dimetilaminopropil)-3-etil-carbodiimida em água. 0 número total de resíduos de aminoácidos contido num multímero preparado como uma cadeia polipéptidica única é preferivelmente menor do que cerca de 50, de modo que até cerca de oito polipéptidos de acordo com este invento possam ser incorporados numa cadeia única do multímero, cabeça-à-cauda, que é sintetizada como um polipéptido único. Um multímero, cabeça-à-cauda, sintético contém, mais preferivelmente, dois a cerca de quatro blocos de polipéptidos de copolíme_ ros aleatórios de acordo com este invento, sintéticos, ligados, e um total de menos de cerca de 40 resíduos de aminoácidos.

Β o Preparação de Polímeros

Os polipéptidos de acordo com o presente invento pode ser unidos uns aos outros para formar um polímero antigénico e/ou imunogénico (multímero sintético), compreendendo uma pluralidade das unidades de repetição polipeptídicas. Tal polímero tem, típi_ camente, a vantagem de imunogenicidade e antigenicidade aumenta69 762

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Z^? ,4

-84- -- ---^Sí

- - 7* das. Além disso, um transportador é tipicamente não necessário quando é utilizado um imunogénio polimérico. Onde são utilizados monómeros polipeptídicos diferentes para formar o polímero, é obtida a capacidade para imuno-reagir com anticorpos para várias determinantes antigénicas do EBNA. Uma vantagem adicional é a ca pacidade do referido polímero, quando utilizado num inoculo, para induzir anticorpos que imuno-reagem com diversas determinan. tes antigénicas do EBNA.

Um polímero de acordo com este invento pode ser preparado sintetizando os polipéptidos, tal como discutido acima, e incluindo resíduos de cisteína em ambos os terminais amino e carb£ xi para formar um polipéptido terminado em di-Cys. Por exemplo, cada um dos polipéptidos da Tabela 1 e os polipéptidos Bl e D2 da Tabela 2 podem ser sintetizados para conter um resíduo de Cys adicional en cada um dos terminais amino e carboxi, para fornecer polipéptidos terminados em di-Cys nas suas formas reduzidas. Após a síntese, numa preparação laboratorial típica, 10 miligramas do polipéptido di-Cys (contendo resíduos de cisteína numa forma não-oxidada), são dissolvidos em 250 mililitros (ml) de tampão de bicarbonato de amónio a 0,1 molar (íú). 0 polipéptido terminado em di-Cys dissolvido é então oxidado ao ar por agitação suave da solução resultante, durante un período de cerca de 18 horas, ao ar, ou até que não exista qualquer mercaptano livre detectável pelo teste de Ellman //Ver Ellman, Arch. Biochem. Biophys., 82:70-77 (1959)_7« polímero (multímero sintético) assim preparado contém uma pluralidade de unidades de repetição do polipéptido de copolímeros aleatórios sintéticos, que estão unidas umas às outras pelos resíduos de cisteína (cistina) oxidantes. Tais polímeros contêm tipicamente as suas unidades de repetição do polipéptido unidas umas às outras duma maneira cabeça-à-cauda assim como nas maneiras cabeça-à-cabeça e cauda-à-cauda, isto é, os terminais de duas unidades de repetição polipéptidicas podem estar unidos uns ao outro através de um único resíduo de cistina, assim como podem os dois terminais carboxi dado que os grupos de ligação em ambos os terminais do polipéptido são idênticos.

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C. Acoplamento a Transportadores

Os polipéptidos sintéticos foram acoplados a hemocianina de lapa do género Fissurella (KLH) como transportador pelo méto. do descrito em Liu e colab., Biochem., 80:690 (1979). Resumidamente, 4 miligramas (mg) do transportador foram activados com 0,51 mg de éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, e posteriormente reagiram com 5 mg do polipéptido através de uma cisteína do terminal amino ou carboxi para fornecer um conjugado contendo cerca de 10 a cerca de 35% por peso de polipéptido.

Podem ser adicionados um ou mais resíduos de aminoácidos adicionais aos terminais amino ou carboxi do polipéptido sintético para auxiliar na ligação do polipéptido ao transportador. Como anteriormente discutido, verificou-se que os resíduos de cisteína adicionados aos terminais amino ou carboxi do polipépti. do sintético eram particularmente úteis para a formação de polímeros por meio de ligações dissulfeto. Contudo, também podem ser utilizados outros métodos bem conhecidos na especialidade para a preparação dos conjugados. Processos de ligação adicionais ilustrativos incluem a utilização dos produtos da reacção de adição de Michael, dialdeídos tais como o glutaraldeído, Klipstein e colab., J. Infect. Bis., 147:318-326 (1983) e similares, ou a utilização da tecnologia da carbodiimida, como na utilização de uma carbodiimida solúvel em água para formar ligações amida ao transportador, tal como discutido antes para a ligação de uma pluralidade de polipéptidos uns aos outros para formar um multí. mero sintético.

Os transportadores úteis são bem conhecidos na especiali. dade, e são geralmente eles próprios proteínas. Exemplos de tais transportadores são hemocianina de lapa do género Fissurella (KLH), edestina, tireoglobulina, albuminas tais como a albumina sérica bovina (BSA) ou a albumina sérica humana (HSA), células vermelhas do sangue tais como eritrócitos de carneiro (SRBC), to. xóide do tétano, toxóide da cólera, assim como ácidos poliamino tal como poli (D-lisina; ácido D-glutâmico), e similares.

Tal como é bem sabido na especialidade, é muitas vezes

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benéfico ligar um polipéptido sintético ao seu transportador por meio de um grupo de ligação intermediário. Como indicado acima, o glutaraldeído é um dos referidos grupos de ligação. Contudo, quando é utilizada a cisteína, o grupo de ligação é preferivelmente uma m-maleimidobenzoil N-hidroxi succinimida (MBS), tal como aqui utilizado.

Adicionalmente, a MBS pode ser primeiro adicionada ao transportador por uma reacção de intercâmbio éster-amida, como revelado por Liu e colab., acima. Em seguida, a adição pode ser seguida pela adição de um grupo mercapto bloqueado tal como ác.i do tiolacético (CH^COSH) através da ligação dupla do maleimido. Após clivagem do grupo bloqueador acilo, é formada uma ligação dissulfeto entre o grupo de ligação desbloqueado mercaptano e o mercaptano do resíduo de cisteína adicionado do polipéptido sin. tético.

A escolha do transportador é mais dependente do uso definitivo do imunogénio do que da porção determinante do imunogénio e é baseada em critérios que não estão particularmente implicados no presente invento. Por exemplo, se um inoculo se destina a ser utilizado em animais, deve ser seleccionado um transpor tador que não produza uma reacção desfavorável no animal particu. lar.

D. ELISA

Os estudos de ligação e inibição do anticorpo anti-pépti^ do foram levados a cabo por um ensaio de imunossorvente ligado ao enzima (ELISA), como descrito abaixo.

Resumidamente, poços de microtitulação (Costar, =3590, Cambridge, MA) foram tipicamente revestidos com polipéptidos in. dividuais como antigénios por adição de 100 microlitros (/ul) de BBS AEjorato de sódio 10 milimolar (mM) (pH 8,3), NaCl 150 mM/7 contendo o polipéptido a uma concentração de 10 microgramas por mililitro (pg/ml). 0 contacto entre os poços e a solução conten. do o antigênio foi mantido durante um período de tempo pré-determinado, tipicamente de 15 minutos, e a 20?C, para formar uma fase sólida revestida por antigênio. As fases sólida e líquida

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foram separadas e os poços foram lavados, três vezes, com BBS.

Os sítios de ligação não específicos foram bloqueados misturando 200 microlitros de albumina sérica bovina a 1% (BSA) em cada poço para formar outra mistura de fase sólida/líquida, e mantendo essa mistura de fase sólida/líquida durante 30 minutos, a 20^0. As fases foram separadas e a BSA não ligada, em ex cesso, foi removida por lavagem, três vezes, com BBS.

Os soros humano e de coelho (alíquotas de amostra corporal) foram analisadas, quanto à actividade anti-polipéptido, pe la adição de 100 microlitros de um soro diluído a 1:20 em BBS, por poço, para formar uma composição de fase sólida/líquida. 0 contacto entre os soros diluídos e a fase sólida revestida pelo antigénio foi mantido durante um período de tempo pré-determina do, tal como 1 hora, e a 20^0, para formar um imuno-reagente.

As fases sólida e líquida foram separadas, e a fase sólida, isto é, os poços contendo o imuno-reagente revestidos pelo antig£ nio, foi então lavada, três vezes, com BBS.

Os anticorpos nos soros humanos que imuno-reagiram com um polipéptido adsorvido foram detectados utilizando um meio fn dicador compreendendo anticorpo anti-Ig humana de cabra conjuga do com fosfatase alcalina (Tago, Burlington, CA). Os anticorpos dos soros de coelho que imuno-reagiram com um polipéptido adsor vido foram detectados utilizando um meio indicador compreendendo anticorpo anti-Ig de coelho de cabra conjugado com fosfatase alcalina (Kirkegard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD). Em qualquer dos casos, foram adicionados 100 microlitros do anticorpo indicador diluído a 1:300 em BBS, por poço, para formar uma composição de fase sólida/líquida adicional. Esta com posição de fase sólida/líquida foi mantida durante um período de tempo pré-determinado, uma hora, para a formação de um produto reaccional entre os anticorpos humanos ligados à fase sólida e o meio indicador, e a 20²C. As fases foram separadas, e a fase sólida foi lavada, três vezes, com BBS.

anticorpo conjugado com a fosfatase alcalina ligado ao anticorpo específico para o polipéptido foi detectado por medição espectrofotométrica da hidrólise enzimática do fosfato de jo69 762

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-88-nitrofenilo para υ-nitrofenol. Resumidamente, 100 microlitros de fosfato de £-nit.rofenol /~1 miligrama por mililitro em MgC^ mM (pH 9,8), carbonato de sódio 50 mM_/7 foram adicionados a cada poço. A reacção enzimática foi deixada prosseguir durante 1 hora e então a densidade óptica a 405 nm foi determinada num espectrofotómetro TITERTEK disponível de Flow Laboratories, In. glewood, CA.

Os ensaios adicionais utilizados nestes estudos, em que as razões de IgG para IgM foram determinadas para avaliar o estado da doença induzida pelo EBV, foram efectuados como descrito em Smith e colab., J, Infect. Lis., 154:885-889 (1986) e Gel tosky e colab., J. Clin Lab Analysis, 1:153-162 (1987). Resumidamente, os poços de microtitulação como matriz de fase sólida foram revestidos com 50 /il de 20 microgramas (Mg) de polipéptido P62/ml em solução salina tamponada com borato //BBS; borato de sódio 0,5 M, NaCl 0,15 M, e MgC^ 0,001 M, pH 8,3/7, durante 12 horas a 4^SC, para formar um suporte sólido contendo o péptido afixado à matriz de fase sólida.

A solução foi, em seguida, rejeitada e as placas foram bloqueadas com 300/il de soro normal de cabra a 10% em solução salina tamponada com fosfato (PBS), a pH 7,3. Após 90 minutos de manutenção (incubação) a 37⁹C, os poços foram esvaziados e secos durante 60 minutos a 37⁹C.

A esta altura, 200 jul de soro de cabra a 10% em PBS foram adicionados aos poços. Um volume de 10 /il do soro espécime do do. ente foi misturado a cada poço contendo soro de cabra para formar uma mistura de fase sólida/líquida. Essa mistura foi mantida durante um período de tempo de uma hora, à temperatura ambiente, para permitir a ligação de todos os anticorpos presentes ao suporte sólido e para formar um imuno-reagente ligado à fase sólida contendo esses anticorpos.

Após lavagem, cinco vezes, com 350/il de Tween-20 //poli£ xietileno (20) monolaurato de sorbitano_/7 em BPS para executar a separação das fases sólida e líquida, foi misturada, a cada poço, uma solução de 200/11 de anticorpo monoclonal de ratinho para IgG

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-39- * ou IgM humana conjugado com peroxidase de rábano-de-cavalo (HRPO) (Ortho Diagnostic Systems, Raritan, NJ), para formar uma mistura de fase sólida/líquida. Esta segunda mistura de fase s£ lida/líquida foi mantida durante outro período de tempo de uma hora para permitir que os anticorpos ligados ao enzima se liguem a todos os anticorpos ligados à fase sólida formados na primeira mistura de fase sólida/líquida.

Após separação das fases sólida e líquida, e lavagem da fase sólida, cinco vezes, utilizando a solução de Tween-20/PBS, acima, a cor foi desenvolvida por mistura de O-fenilenodiamina (OPD; 2 mg de um comprimido tamponado com citrato dissolvido em 3 ml de água; Pitman-Moore, Washington Crossing, NJ) e peróxido de hidrogénio. A solução resultante foi mantida durante 30 minu tos à temperatura ambiente. A reacção foi concluída pela mistura de 50 /il de HC1 2N, e a absorvência foi determinada a 490 n£ nómetros (nm).

Os resultados do ELISA com o polipéptido P62 como antig£ nio foram normalizados por multiplicação dos valores da absorve cia por uma razão de controlo positiva:

razão de controlo positiva - valor da absorvência de referência/absorvência média do controlo positivo.

Ao controlo positivo foi atribuído um valor de absorvência de referência (D.O.) de 1,0. 0 valor da absorvência de refe. rência foi dividido pelo valor da absorvência média observada do controlo positivo. 0 valor da absorvência para os controlos e para cada espécime testado foram multiplicados pela razão de controlo positivo para determinar um valor do ELISA padronizado Os valores de separação cutoff” (DO+SL médio) foram anteriormente descritos //Geltosky e colab., J. Clin. Lab. Analysis, 1: :153-162 (1987)~7. Com estas condições padronizadas, as razões dos valores do ELISA do IgG para 0 IgM maiores do que 0,7 foram determinadas numa população assintomática, saudável. Os valores da absorvência menores do que 0,7 foram considerados como representando uma infecção aguda devida ao EBV //Smith e colab., J. Infect Dis., 154:885-889 (1986)~7·

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Ainda um outro ensaio semelhante mas muito mais rápido também foi desenvolvido e aqui utilizado. Aqui a matriz da fase sólida utilizada era a chamada colher.

As colheres particulares utilizadas eram dispositivos de poliestireno branco, opaco, tendo uma porção superior geralmente aplanada (como normalmente utilizada) que se estende por cer ca de metade do comprimento da colher e é adaptada para ser segura pelos dedos do utilizador. Cerca de dois-terços do comprimento da porção inferior (metade inferior) são mais estreitos que a porção superior e têm forma cilíndrica.

Cerca do terço mais baixo da colher contém uma segunda porção aplanada, que tem aproximadamente a largura da porção su perior e que define duas depressões em forma de prato (poços), que são ligeiramente menores em diâmetro do que a largura desta porção aplanada. As duas depressões em forma de prato estão separadas por um dique que se prolonga, aproximadamente, em angulo recto en relação à superfície aplanada que define as depressões. A superfície superior do dique, olhando para baixo em direcção às depressões, é portadora de indicadores, tais como K para IgM e G para IgG, e as paredes verticais do dique, adjacentes a cada depressão, são conformadas em pontos que confrontam uma ou outra depressão. Os pontos e os indicadores respecti. vos no topo do dique combinam-se para indicar o que está a ser analisado en cada depressão, IgM ou IgG.

As porções aplanadas anteriormente mencionadas têm substancialmente a mesma largura, e essa largura e o comprimento da colher estão proporcionados para se ajustarem prontamente dentro e se prolongar para além de um tubo de ensaio, tal como um tubo de ensaio de 13x100 ou de 16x160 milímetros (mm), de uma proveta ou de outro dispositivo contendo liquido. As dimensões típicas para a referida colher são uma largura de cerca de 10-12 mm, uma espessura de cerca de 2-4 mm e um comprimento global de cerca de 130-160 mm, com depressões que podem conter cerca de 200-250 /rl de líquido.

Uma colher preferida inclui adicionalmente uma porção ain

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-91- . ...

da mais larga no ponto mais alto a cerca de um terço do cimo, porção geraimente aplanada cuja largura é maior do que o diâmetro do tubo de ensaio a ser utilizado, por exemplo, mais larga do que cerca de 16 mm, de modo que a colher possa ser suspensa no tubo de ensaio sem que o fundo da colher toque no fundo do tubo, e possa ser melhor adaptada para a preensão. Além do mais, estão incluídas pernas projectadas, com o comprimento aproximado da espessura da colher, no lado da colher oposto às depressões, para fornecer uma base horizontal substancialmente estável sobre a qual a colher possa repousar numa bancada de la boratório.

Uma série de depressões das referidas colheres foram revestidas com o polipéptido P62, misturando uma solução contendo 100/ig/ml de polipéptido em 3B5 a um valox^- do pH de 8,3-8,5. As soluções foram mantidas dentro das depressões durante um período de tempo de cerca de 18-24 horas para afixar o polipéptido à matriz fornecida pelas depressões da colher, e, deste modo, formar suportes de fase sólida, e as fases sólida e líquida foram separadas .

Os sítios de ligação não-específicos nos suportes de fase sólida assim formados foram bloqueados por mistura com uma so. lução de BSA a 10/, ou outra proteína não-humana, em BBS, a um valor de pH de 7,4, durante um período de tempo de 90 minutos a 37^?C. Quando a colher não se destinava a ser utilizada imediatamente, foi incluído glicerol a 20/ (v/v) na solução de bloqueio para auxiliar ao armazenamento. As fases sólida e líquida foram, em seguida, separadas, e as colheres foram secas a uma temperatu. ra de 37²C durante uma hora.

Quando utilizadas, 100/il da amostra corporal líquida, tal como, sangue, plasma, soro ou saliva, foram adicionados a ca da depressão da colher. Alíquotas da amostra de um indivíduo foram utilizadas em cada depressão de uma única colher. As misturas de fase sólida/líquida resultantes foram mantidas durante um período de tempo de dois minutos para formar os imuno-reagentes ligados à fase sólida respectivos.

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-92As fases sólida e líquida foram separadas e lavadas em dois tubos de ensaio de 13x100 mm separados, cada um contendo 5 ml de PBS contendo 0,05% de Tween-20. A lavagem com água da torneira foi também utilizada com eficácia para este passo.

Em seguida, 100/<1 de anticorpo anti-IgG humana conjuga do com HRPO foram misturados com o suporte sólido da depressão indicada pelo G anteriormente mencionado, e 100/tl de anticor po anti-IgK humana conjugado com HRPO foram misturados com o su. porte sólido da depressão indicada pelo M anteriormente meneio, nado. As misturas resultantes foram mantidas à temperatura ambiente durante um período de dois minutos.

As fases sólida e líquida foram separadas. A fase sólida foi, em seguida, lavada duas vezes com a solução de PBS/Tween-20 descrita antes.

Após o passo de lavagem, 100^1 de uma solução de revela ção da cor, tal como aquela contendo OPD anteriormente descrita, ou ABTS e peróxido de hidrogénio a 3% (v/v) no tampão anteriormente descrito, foram misturados com os suportes sólidos. As co lheres foram colocadas horizontalmente sobre as suas pernas na bancada do laboratório, para este passo. Λ mistura sólida/líqu/ da formadora da cor assim formada foi mantida durante um período de tempo adicional de dois minutos à temperatura ambiente, e as reacções de formação da cor foram concluídas pela mistura de 50 /11 de uma solução a 1% de dodecil sulfato de sódio, ou de uma solução de HC1 2N, como descrito anteriormente.

ensaio acima descrito demora um pouco mais de 6 minutos, uma vez que os suportes sólidos estejam preparados. 0 ensaio resultante é completado por um exame visual da intensidade da cor em cada depressão. Assim, quando a cor é mais intensa no ensaio da IgG, o doente está em convalescença; quando a cor é mais intensa no ensaio da IgM, o doente está na fase aguda da MI; e quando as cores estão, aproximadamente, com a mesma intensidade, a MI da fase aguda está a passar para a convalescença.

Os resultados utilizando o ensaio acima de aproximadamen.

te seis minutos foram comparados com os resultados obtidos num

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-93ensaio de razão calculada numa placa de microtitulação, tal como descrito anteriormente, que requereu cerca de 2,5 horas para se completar. Trinta amostras de soro cada foram comparadas de painéis tendo (a) infecções EBV-ΜΙ primárias agudas, (b) sujeitos do laborátorio normais que tinham experimentado o vírus e que eram serológicamente VCA⁺, e (c) amostras submetidas a um laboratório clínico de doentes com uma doença do tipo MI.

Vinte e oito dos trinta soros de doentes clínicamente identificados como estando no estágio agudo foram classificados como agudos em ambos os ensaios. Dois soros classificados como não tendo resultado no ensaio mais longo devido a um nível de IgM abaixo do mínimo requerido, também foram classificados como estando na fase aguda pelo ensaio mais curto.

Foi verificada concordância geral com os outros grupos de soro, com exemplos adicionais de um resultado sendo classifi. cado para um soro no ensaio visual mais curto, quando nenhum re. sultado foi registado para o ensaio quantitativo mais longo. Alé disso, houve também alguns casos em que os resultados foram dife rentes.

Num estudo clínico posterior, o ensaio de aproximadamente seis minutos apresentou uma especificidade e uma sensibilida de para a EBV-ΜΙ na fase aguda de cerca de 94-95%.

E. Culturas de Células

A capacidade das moléculas do receptor de acordo com este invento para imuno-reagirem com o EBNA produzido nas células foi estudada, como descrito em seguida, utilizando as linhas ce. lulares de WI-L2, Raji, Daudi e BJAB. As células WI-L2 (ATCC CRI 8155 V/112-NS, American Type Culture Collection, Bethesda, MD) são uma linha de linfoblastos B não produtores positivos pa ra o genoma do EBV, derivadas a partir de um doente humano com anemia esferocítica hereditária. Levy, e colab., Câncer 22:517-524 (1968).

As células Raji (ATCC CCL 86, Americal Type Culture Collection, Bethesda, MD) são uma linha de células do tipo do linfoblasto produzindo o EBNA, positivas para o genoma do EBV, de

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Ff

-94ura linfoma de Burkitt Epstein, J. Nat. Câncer Inst. 34:231 (1965). As células Daudi (ATCC CCL 213, American Type Culture Collection, Bethesda, MD) são também uma linha de células prodja zindo o EBNA. As células BJAB são uma linha celular de linfócitos não produzindo o EBNA, disponíveis no Scripps Clinic e Rese arch Foundation, La Jolla, CA.

As linhas celulares acima foram cultivadas em meio RPMI 1640 J. Am. Med. Assoe. 199:519-524 (1967); e Morton, In Vitro 6:89-100 (1970)77 suplementado com L-glutamina 2 mM e 10% de soro fetal de vitelo.

A estirpe CMV das células AD-169 foram uma oferta do Dr. D. Richman da Universidade da Califórnia, San Diego. 0 vírus foi propagado na linha f ibroblastica humana GM-2504 obti da de Human Genetic Ivíutant Cell Repository (Camden, NJ). As células foram cultivadas em meio DMEM contendo 10% de soro fetal de vitelo e foram infectadas imediatamente antes da confluência a uma multiplicidade de 3. As células foram recolhidas após nove dias por lavagem, duas vezes, com PBS, e os extractos foram preparados pela adição de 10 ml de DEM / 2% de SDS, 2% de 2-mer caproetanol, 0,0004% de azul de bromofenol, Tris-HCl 40 milimolar (mM), pH 6,8, e 15% de glicerol) contendo lOyig/ml de fluoreto de fenilmetilsulfonilo, directamente para um frasco de cultura de tecidos de 150 cm² contendo as células infectadas aderen. tes. 0 frasco foi raspado com um raspador de células, e a solução foi removida, fervida durante dois minutos e armazenada a -202C.

F. Extractos de Células Inteiras

Extractos de células não-produtoras (controlo) e produt£ res de EBNA foram preparados para determinar se as moléculas de receptor de acordo com este invento eram úteis para diagnosticar a expressão do EBNA. Células de culturas descritas acima foram lavadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS; NaCl 150 mM, fosfato de sódio 10 mM, pH 7,4) contendo fluoreto de fenilme tilsulfonilo 0,2 mM, intumescidas durante 5 minutos em tampão padrão de reticulócito (RS3; NaCl 10 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,4,

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-95MgCl^ 1,5 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 0,2 mM) e lisadas por sonicação em 3-5 volumes de RBS ajustado para NaCl 0,2-0,35 molar (M). Após 30 minutos em gelo, o sonicado foi centrifugado a 10 000 x g durante 15 minutos para remover os restos celulares .

G. Processos de Imuno-mancha

Os extractos celulares obtidos acima são analisados para o EBNA utilizando soros humanos conhecidos como contendo anticor pos anti-EBNA ou moléculas de receptor ilustrativas de acordo com este invento. Os extractos foram quer concentrados por preci. pitação com 2 volumes de etanol a -20^0 durante cerca de 13 horas, e foram, em seguida, dissolvidos em tampão de amostra //SB; 10% de glicerol; 2% de 2-mercaptoetanol, 1% de dodecilsulfato de sódio (SDS); 0,002% de azul de bromofenol, Tris-HCl 40 mM (pH 7,4)_7, quer diluídos a 1:6 em tampão de amostra para electrof orese em gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE). 7,5% dos geles de poliacrilamida foram impelidos e passados (cast andrun) de acordo com o processo de Laemmli, Nature, 277:680-685 (1970), aplicando 50 a 200 microgramas de proteína total por faixa.

Após a electroforese, as bandas de proteína dos geles de poliacrilamida-SDS foram transferidas electroforéticamente para um suporte sólido sob a forma de folhas de nitrocelulose (Schlei^ cher e Schuell, Detroit, MI), pelo processo de Towbin e colab., Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A., 76:4850-5354 (1979). Isto foi efectuado utilizando um aparelho de Bio-Rad Trans-Blot (Bio-Rad, Richmond, CA) a 70 volts durante 2-3 horas em hidróxido de Tris

12,5 mM, glicina 96 mM e metanol a 20%.

Após a transferência, os filtros de nitrocelulose ou manchas foram saturados durante uma hora quer em BSA a 2% (p/v) em PBS quer em leite em pó a 2% (p/v) em PBS, para reduzir a ligação não-específica. As manchas imuno-reagiram com 0,1 ml quer de soro humano positivo para o EBNA quer de anticorpos anti-polipéptido de coelho em 2 ml de PBS ou de leite a 2%, durante 1 hora a 37⁹C.

Os anticorpos anti-péptido ligados à proteína EBNA foram

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detectados por reacção das manchas com um meio indicador. Neste caso, 20 ml de proteína A de S. aureus (Calbiochem, La Jolla,

CA) marcada com //200 000 contagens por minuto por mililitro (cpm/ml), 10^ contagens por minuto por miligrama (cpm/mg)/7 foram colocados em contacto com o produto imuno-reaccional duran. te 30 minutos a 37^QC. As manchas foram lavadas com PBS e expostas a uma película de raios X Kodak XAR durante toda a noite a -70®C.

Num processo alternativo, os extractos contendo a proteí. na celular foram carregados para um sulco de 13 cm de largura de um gel de acrilamida a 7,5% θ submetidos a electroforese. Os conteúdos do gel da electroforese foram transferidos para nitr£ celulose, tal como anteriormente descrito //Billings e colab., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:7104-7108 (1983); Rumpold e colab

J. Immunol., 138:593-599 (1987); Rhodes e colab., J. Exp. Med., 165:1026-1040 (1987 )/7· θ³ soros foram diluídos a 1:20 ou 1:50 em tampao de leite em pó (PM) (3% de leite em pó em borato 0,05 M, NaCl 0,15 M, pH 8,3), e colocados em contacto com a faixa, durante 1 hora à temperatura ambiente, para que os anticorpos nos soros imuno-reajam com as proteínas. As faixas foram então lavadas, e a imuno-reactividade foi determinada por incubação com uma solução de 0,6/J.g/ml (em PM) de anticorpos anti-IgM humana de coelho de afinidade purificada (Jackson Laboratories, Avondale, PA) ou anticorpos anti-IgG humana de coelho de afinidade purificada, da mesma fonte.

Após lavagem, as faixas reagiram com uma solução de dete£ 125 ção de anticorpo anti-IgG de coelho de cabra - I, como anteriormente descrita //Rumpold e colab., J, Immunol. 128:593-599 (1937); Rhodes e colab., em Herpesvirus, R. Rapp ed., Alan R. Liss, New York; págs. 487-496 (1984); Rhodes e colab., J. Immunology 134:211-216 (1985); Smith e colab., J. Infect. Dis. 154: :885-889 (1986); Geltosky e colab., J. Clin, Lab Analysis, 1:153. -162 (1987); e Rhodes e colab., J. Exp. Med., 165:1026-1040 (1987) ~7 θ as bandas foram detectadas por auto-radiografia como antes descrito.

As inibições dos péptidos sintéticos foram efectuadas por

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diluição dos soros a 1:50 em PM e adição de pêptido livre até uma concentração final de 400/lg/ml para inibir o anticorpo IgM e de 20 a 50 jLlg/ml para inibir o anticorpo IgG. Esta solução foi mantida (incubada) durante toda a noite a 4-C e então utilizada para a mancha, tal como descrito acima.

H. Imunizações

As moléculas de receptor de acordo com este invento inclu em anticorpos completos originados em mamíferos pela sua imuniza ção com inoculo , que inclui um polipéptido e/ou multímero tal como descrito acima. Os polipéptidos e os multímeros podem ser utilizados incluídos num inoculo sós ou conjugados com uma pro. teína transportadora, tal como hemocianina de lapa do género Fis surella (KLH). Contudo, os polipéptidos são preferivelmente utilizados como um conjugado e os multímeros são preferivelmente utilizados sós.

Os coelhos foram imunizados com inoculo contendo 1,0 mg de conjugado em adjuvante completo de Freund (CFA) e reforçados um mês mais tarde com 1,0 mg do conjugado em adjuvante incom pleto de Freund (IFA). Cada imunização consistiu numa injecção subcutânea, no quadril traseiro. Os coelhos foram sangrados 1 e 2 meses após o reforço.

Os soros contendo anticorpos imunológicamente activos foram então produzidos a partir destas sangrias por métodos bem conhecidos na especialidade. Estes anticorpos imuno-reagiram com um ou mais dos polipéptidos de acordo com este invento e uma determinante antigénica do EBNA. Eles podem, portanto, ser utiliza dos num sistema para analisar o EBNA.

Os inoculos individuais foram preparados com CFA ou IFA como se segue: uma quantidade suficiente de conjugado para forne cer a quantidade desejada de polipéptido por inoculação (por ex. 1 mg) foi dissolvida em BBS (cerca de 0,5 ml), a pH de 7,2. Volu mes iguais de CFA ou IFA foram então misturados com as soluções do conjugado, originando um inoculo contendo o conjugado, água e adjuvante, no qual a relação da água para o óleo era de 1:1. A mistura foi, em seguida, homogeneizada para produzir o inoculo.

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-980 volume dum inoculo preparado deste modo era tipicamente maior do que 1 ml, e algum do conjugado, PBS e adjuvante foi perdido durante a emulsificação. Substancialmente toda a emulsão que pôde ser recuperada foi colocada numa seringa, e em seguida introduzida nos coelhos como discutido anteriormente. Acredita-se que a quantidade do inoculo introduzido nos coelhos tenha sido cerca de 90# daquele presente antes do passo de emulsifica ção .

As soluções concentradas de inoculo acima são ilustrativas do inoculo de acordo com este invento. Como foi aqui de. monstrado, podem ser utilizados para produzir moléculas de rece. ptor que imuno-reagem com ο EBNA-1.

Processos de Imunofluorescência

Um outro método ilustrativo para detectar a presença de EBNA numa amostra corporal utiliza moléculas de receptor de acor do com este invento e um meio indicador fluorocronático para detectar o produto de imuno-reacção receptor-EBNA.

Uo presente estudo, 2x10^ células WI-L2, cultivadas tal como descrito acima, foram dispersas sobre uma lâmina simples de microscópio utilizando uma cito-centrífuga (CYTOSPIU, Shandon Southern, Astnoor, Runcorn, Chesire, Inglaterra). Após secagem ao ar durante 5 minutos a 20^0, as células foram fixadas com ace tona durante 2 minutos, em seguida secas ao ar durante 2 minutos a 2O2C. As lâminas foram armazenadas a -20^0 até serem utilizadas .

As células WI-L2 fixadas foram analisadas quanto à presen. ça de EBNA utilizando anticorpos anti-polipéptido de coelho (receptores de acordo com este invento) originados para os polipéptidos P27, P60, P62 e P89· Cinquenta /11 de cada anti-soro de coelho, diluído a 1:10 em tampão VBS (barbitol 120 mM, pH 7,3, NaCl 144 mM, MgClg 2,5 mM e CaC^ 0,75 mM), foram incubados (colocados e mantidos em contacto com as células fixadas) a 20^QC, sobre uma lâmina, durante um período de tempo pré-determinado (por ex., 30 minutos), suficiente para que os anticorpos e o EBNA imuno-reajam. Uma lâmina de controlo negativa foi tratada

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EPG:11-SCRF 45.2 t-r.'— -99de forma idêntica com soro de coelho normal

Durante a incubação acima, uma porção dos anticorpos anti-polipéptido imuno-reagiram com o EBNA presente nas células WI-L2 fixadas. Os anticorpos não ligados foram removidos por la vagens com VBS, deixando apenas o produto da imuno-reacção rece ptor-ΞΒΝΑ sobre a lâmina.

Os anticorpos anti-polipéptido ligados ao EBNA foram detectados, por, primeiro, incubar 50/jlI de complemento de cobaia (Tago, Burlingame, CA) diluído a 1:10 em VBC, sobre cada lâmina, durante um período de tempo (30 minutos) suficiente para o complemento se ligar aos receptores. As lâminas foram, em seguida, lavadas com VBS para remover todo o complemento que não se ligou à IgG anti-polipéptido de coelho.

Cj anti-cobaia de cabra marcado com fluoresceína (anticor pos anti-complemento marcados, Cappel Laboratories, Cochranville, PA) foi utilizado para detectar os complexos antigénio-anticorpo-complemento. Cinquenta/11 do anti-soro indicador, diluído a 1:20 em VBS, foram incubados como acima, sobre cada lâmina, durante 30 minutos a 20^0. 0 C^ anti-cobaia de cabra não ligado foi removido por lavagem da lâmina com VBS. Os produtos imuno-reaccionais foram então visualizados por microscopia de fluores. cência.

J. Espectroscopia de Dicroísmo Circular

As propriedades conformacionais dos polipéptidos foram investigadas para elucidar sobre qualquer estrutura secundária que possa ser necessária para a imuno-reacção do polipéptido com anticorpos anti-EBNA humanos. Os polipéptidos foram dissolvidos, numa concentração de 1 mg/ml em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Foram feitos os espectros utilizando amostras de 1 ml num espectropolarímetro Cary6l (Cary Instruments, Applied Physics Corp., Monrovia, CA) em interface e automatizado com um computador de Digital Equipment Corporation 11/02 (Digital Equipment Corporation, Maynard, MA). A média de 10 explorações suce sivas para cada polipéptido foi marcada, tal como mostrado na F gura 1.

|h· |ra

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-100K. Fontes de espécimes e Serologia

As amostras de soro aqui utilizadas foram obtidas de uma variedade de fontes. Uma série de soros para este estudo foi obtida de 13 doentes com MI induzida pelo EBV. Os anticorpos he. terófilos específicos para a MI tinham sido préviamente identificados em 10 dos 13 doentes utilizando um tubo de ensaio de adsorção diferencial de célula de cavalo. Os anticorpos heterófilos não foram detectados em dois doentes apesar de testados por uma variedade de métodos. Um indivíduo tinha níveis baixos não diagnosticados de aglutininas de célula de cavalo que foram detectadas em apenas um único espécime colhido durante a fase aguda da sua doença. Este doente foi considerado como sendo negativo para o heterófilo para os fins deste estudo. Os dados se. rológicos dos três doentes negativos para o heterófilo apresentavam evidência de infecçoes por EBV primárias, contínuas.

Os dados de dois dos 10 positivos para o heterófilo e de dois dos três doentes negativos para o heterófilo foram anterior mente publicados //Horwitz e colab., Am. J. Med. .63.:947-957 (19773? Quanto ao estudo presente, os testes serológicos para o EBV foram realizados em amostras de soro préviamente congeladas por imunofluorescência indirecta com os testes comercialmente disponíveis para os anticorpos IgG e IgM para o VCA (Litton Bionetics, Inc., Charleston, SC).

Um outro grupo de soros foi utilizado para os estudos da EBV-ΜΙ e da CMV-MI. Nesse grupo de amostras, um doente (D.B.) tinha um episódio típico de EBV-ΜΙ positivo para o heterófilo se. guido por uma recuperação clínica rotineira. Durante a fase aguda da doença, desenvolveu altos títulos de anticorpos para o VCA (IgM = 1:80 e VCA-IgG - 1:1280) sem anticorpos acompanhantes para anti-EBNA (1:2). Aos 174 dias após o início, os anticorpos IgM anti-VCA já não eram detectáveis, enquanto que os anti-EBNA tinham evoluído entre os 76 e 111 dias. Os anticorpos para o CMV não foram detectados em soros seriados por fixação do complemento (1:8). Um segundo doente (D.S.) teve, inicialmente, uma infe£ ção provávelmente primária pelo citomegalovírus (CMV-IM), activa,

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-101que foi seguida, quatro meses mais tarde por uma infecção primá ria pelo EBV. Este doente demonstrou macroglobulinas para o CMV (1:256), uma elevação de quatro vezes nos anticorpos para anti-CMV por fixação do complemento (CMV-FC), e nenhuma resposta de anticorpos para qualquer dos antigénios relacionados com o EBV. Durante esta segunda doença, iniciando-se 124 dias após o início da primeira, ocorreu uma infecção primária pelo EBV caracte_ rizada por IgM anti-VCA (1:320) e uma ausência inicial (1:2), mas evolução mais tardia de anticorpos para o EBNA. Os anticorpos IgM para o VCA desapareceram com a análise seriada. Durante a sua segunda doença (EBV-ΜΙ), as macroglobulinas para o CMV (CMV-IgM) já não eram detectáveis, enquanto que os anticorpos fixadores do complemento para o CMV estavam ainda presentes a níveis estáveis de 1:128.

Também foram disponíveis soros de dez outros doentes colhidos durante as várias fases de mononucleose induzida pelo CMV. Os seus soros de fase aguda demonstraram títulos significativos (=1:32) de macroglobulinas para o CMV e anti-CMV (FC), em todos os casos, elevações ou quedas de quatro vezes nos títulos foram verificadas por fixação do complemento em seis dos dez (6/10) dos doentes com amostras seriadas. Todos os dez doentes demonstraram evidência serológica de infecções pelo EBV antigas com níveis constantes moderados de Anti-VCA (IgG) anti-EBNA (1:10) e nenhuns anticorpos para o anti-VCA (IgM). Alguns dados dos últimos onze doentes foram incluídos numa descrição anterior //Horwitz e colab., Medicine, 65.:124-133 (1986)/7.

Ensaios para os anticorpos relacionados com o EBV para o VCA (IgM e IgG), antigénios precoces (EA), e EBNA, assim como ma croglobulinas para o CMV (CMV-IgM), foram executados por processos de imunofluorescência indirecta (IFA) padrão //Horwitz e colab., Medicine, 65:124-133 (1986) / e Henle e colab., Human Pathology , 5:551-565 (1974)/7. 0 anti-CMV foi também detectado por fixação do complemento utilizando a estirpe AD-169 de vírus (Microbiological Associates, Bethesda, Maryland).

anterior destina-se a ilustrar o presente invento e não a limitá-lo. Numerosas variações e modificações podem ser efec69 762

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-102tuadas sem. se afastar do verdadeiro espírito e âmbito dos novos conceitos do invento. Deverá compreender-se que não é intencional e não deve ser inferida qualquer limitação com respeito aos processos de preparação dos polipéptidos, anticorpos, suas composições e utilizações aqui ilustradas.

Claims

REIVINLICAÇÕES

1 - Processo de preparação de un polipéptido possuindo de 15 a cerca de 40 resíduos aminoácidos, possuindo uma sequên. cia correspondendo à sequência do polipéptido codificado pelo CMV (citomegalovírus), incluindo a referida sequência uma sequê cia definida pela fórmula

-Gly-R^Gly-R^Gly

12 , , na qual R e R designam resíduos aminoácidos, que quando tomados individualmente, são iguais ou diferentes e são Ala, Asu,

1 2

Arg, Gly, Leu, Pro, Ser e Thr, desde que R e R nao sejam, ambos, Gly, dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis e das suas variantes antigenicamente afins, caracterizado por se efectuar o crescimento da cadeia peptídica, em fase sólida, sobre uma re sina polimérica, quimicamente inerte, com protecção dos grupos amino dos aminoácidos, remoção dos grupos protectores e finalme te clivagem do polipéptido obtido, do polímero.
2 - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracteri zado por o referido polipéptido ter uma sequência de resíduos de aminoácidos que inclui a sequência seleccionada do grupo con sistindo em:

a) -Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-AlaGly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-SerGly,Gly-, e

b) -Ser-Ser-Ser-^Ser-Ala-Gly-Gly-Gly-GlyGly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-GlyGly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly
3 - Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracteri zado por o referido polipéptido ter uma sequência seleccionada do grupo consistindo em:

a) H-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-GlyAla-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-GlySer-Gly,Gly-OH,

b) H-Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Gly69 762

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-104Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-GlyGly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-OH, e

c) H-Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-GlyGly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-GlyGly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-OH-CysOH.
4 - Processo de determinação da presença de anticorpos anti-EBNA, numa amostra corporal, caracterizada por compreender:

a) misturar a referida amostra corporal com um polipépti_ do preparado de acordo com a reivindicação 1, de modo a formar uma mistura imuno-reaccional;

b) conservar a referida mistura durante um período de tem po predeterminado, suficiente para que todos os referidos anticorpos anti-EBNA imuno-reajam com o referido polipéptido para formar um imuno-reagente; e

c) determinar a presença do referido imuno-reagente e con sequentemente a presença dos referidos anticorpos anti-EBNA, na referida amostra.
5 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o referido polipéptido ser seleccionado a partir do gru po consistindo em:

a) H-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-GlyAla-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-GlySer-Gly,Gly-OH,

b) H-Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-GlyGly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-GlyGly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-OH, e

c) H-Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-GlyGly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-GlyGly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-OH-CysOH.
6 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o referido passo c) compreender os passos de:

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-105i) misturar o imuno-reagente do passo b) com moléculas de anticorpo marcadas com enzima de IgM anti-humana, para formar uma segunda mistura imuno-reaccional, ii) conservar a segunda mistura imuno-reaccional durante um período de tempo predeterminado, suficiente para que todos os anticorpos anti-EBNA presentes, imuno-reajam com as referidas moléculas de anticorpo marcadas, de modo a formar um imuno. -reagente marcado, e iii) determinar a presença do referido imuno-reagente marcado e, em consequência, a presença de anticorpos IgM anti-ΞΒΝΑ, na referida amostra.