NO309720B1 - Syntetiske polypeptider relatert til Epstein-Barr-virus- nukleærantigen, fremgangsmåte for identifisering av anti-EBNA- antistoffer i en kroppsvæske, samt diagnostisk system til anvendelse ved fremgangsmåten - Google Patents

Description

Beskrivelse

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse angår syntetiske polypeptider relatert til Epstein-Barr-virus-nukleærantigen, fremgangsmåte for identifisering av anti-EBNA-antistoffer i en kroppsvæske, samt diagnostisk system til anvendelse ved f remgangsmåteny.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Epstein-Barr-viruset (EBV) er et medlem av herpes-virusfamilien og er det årsakende middel til infeksiøs mononukleose (IM) hos mennesker. EBV er også blitt trukket inn i patogenesen av Burkitts lymfom, nasofaryngealt carcinom og B-lymfocyttneoplasmer som oppstår i immunundertrykkede pasienter. Utførlige bevis har også indikert en mulig rolle for dette virus i human, autoimmun sykdom slik som reumatoid artritt og Sjøgrens syndrom.

EBV er et ytterst vanlig miljømiddel som infiserer 80-100% av individene rundt om i verden. Den første eller primære infeksjon kan være akutt eller subklinisk. Denne etterfølges av en lang periode hvor EBV-infeksjonen er latent i B-lymfocyttene tilstedeværende i det sirkulerende blod, lymfeknuter og milt.

Latens er den prosess ved hvilken et virus er til stede intracellulært i en ikke uttrykt eller delvis uttrykt tilstand. Denne latens kan reaktiveres. Selv om vert-faktorer som kontrollerer latensen in vivo er lite kjent, finnes det noen bevis for å anta at svikt i én eller flere immunmekanismer er en viktig faktor.

Cytotoksiske og undertrykkende T-celleelementer av immunresponsen på EBV er rapportert å være meget viktige ved undertrykkelse av akutt infeksjon med EBV i IM. De er også viktige når det gjelder å forhindre ukontrollert ut-vekst av B-lymfocytter som er latent infisert med EBV.

Svikt i T-cellesuppressormekanismer er antatt å

være viktig ved å muliggjøre tilsynekomst av afrikansk Burkitts lymfom, nasofaryngealt carcinom, B-cellelymfomer

som oppstår som en konsekvens av immunundertrykkende terapi

anvendt for å forhindre avstøtelse av organtransplantasjon, og lymfomer som oppstår under behandlinger av forskjellige autoimmune forstyrrelser. Epstein og Achong, red., "The Epstein-Barr Virus", Spring-Verlag, Berlin, Heidelberg

(1970); og Crawford et al., Lancet, 1355 (1980). I tillegg er svikt av disse T-cellemekanismer og følgelig overvekst av EBV-infiserte lymfocytter antatt å spille en rolle i reumatoid artritt. Slaughter et al., J. Exp. Med., 148:1429 (1978); Depper et al., J. Immunology, 127:1899

(1981) og Tosato et al., N. Engl. J. Med. 305:1238 (1981).

De serologiske og celleformidlede immunresponser som følger primærinfeksjon med EBV, er godt dokumentert og gjenspeiler vertens respons på de virale antigener uttrykt under infeksjonsforløpet. Profilen av disse responser såvel som påvisning av antigenene i vev, er blitt stadig økende anvendbare ved diagnosen av EBV-assosierte sykdommer.

Klassisk påvises primærinfeksjonen med antistoff mot det virale kapsidantigen (VCA), og rekonvalesensfasen observeres ved dannelse av antistoffer mot de EBV-kodede, nukleære antigener [EBNA] [Henie et al., Hum Pathol., 5^:551-565 (1974)]. EBNA-1, (også enkelte ganger angitt her som EBNA), det første nukleære antigen som skal gjenkjennes, er blitt identifisert som et 65.000 til 85.000 kilodalton (kD) protein ved immunblottingsteknikken [Strnad et al.,

J. Virol., 38:990 (1981); Hennessey et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80:5665-5669 (1983); og Billings et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80:7104 (1983).

Størrelsen av EBNA-I-proteinet varierer fra 65.000 til 85.000 i forskjellige B-cellelinjer, med ca. 77 kD som typisk. Størrelsen av molekylet er korrelert med varia-sjonen av lengden av IR-3-regionen av EBV-DNA [Hennessey et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80:5665-5669 (1983)]. IR-3-regionen koder en repeterende glycin-alaninsekvens som er blitt karakterisert som å være hovedepitopen av EBNA-I-proteinet [Billings et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80:7104 (1983)].

Selv om de vanlig anvendte prøvninger undersøker

VCA og deretter EBNA-1, er EBNA-1 det tidligste EBV-assosierte antigen som kan påvises etter infeksjon. EBNA er blitt påvist i kjernen av latentinfiserte, veksttransformerte B-lymfocytter. EBNA er også blitt påvist i kjernen av afrikansk Burkitt tumorlymfoblastere og i anaplastiske, nasofaryngeale carcinomceller.

Konsentrasjonen av EBNA i cellekjernen av EBV-infiserte B-lymfocytter svinger under forskjellige faser av cellens reproduktive syklus. Således er det antatt at EBNA syntetiseres og nedbrytes syklisk. Som et resultat av slik nedbrytning krysser proteinfragmenter (polypeptider) av EBNA det cellulære cytoplasma og er antatt å eksistere eller

bli uttrykt på den ytre membran. Imidlertid har spesifikke EBNA-nedbrytningspolypeptider hittil ikke blitt identifisert.

Det er antatt at EBNA-nedbrytningspolypeptider om enn i eller på den ytre cellemembran, utgjør en signifikant stimulus av vertens T-lymfocytter og initierer immunresponsen som resulterer i produksjon av anti-EBNA-antistoffer. Det er også antatt at den spesifikke T-celle-respons på B-celler som uttrykker EBNA-nedbrytningspolypeptider på deres overflate, kan bidra til dannelse av cytotoksiske og undertrykkende T-celler som er viktige for å begrense vekst av EBNA-holdige (EBV-infiserte) B-lymfocytter.

Således er utprøvninger med hensyn til nærvær av både EBNA og anti-EBNA-antistoffer av betydning i flere vanlige kliniske situasjoner. I tillegg ville en vaksine mot EBV-infiserte B-lymfocytter også være av klinisk betydning.

Anti-EBNA-antistoffer bestemmes typisk under anvendelse av den langsommelige anti-komplement-immunfluorescens-teknikk (ACIF). Reedman et al., Int. J. Cancer,

11: 499-520 (1973). Denne bestemmelse innbefatter fikser-ing av EBV-transformerte, humane B-celler til et mikroskopglass. Forskjellige fortynninger av pasientens serum tilsettes deretter til de fikserte celler. På grunn av at antikomplementære sera kan gi falske-negative reaksjoner

eller prozoner når de blandes med komplementet (en to-trinnsprosedyre), er det vesentlig å behandle testcelle-utsmøringene i rekkefølge med serumkomplement, og anti-komplement-fluorescenskonjugatet (en tre-trinnsprosedyre).

Det er flere problemer med denne bestemmelse.

Disse innbefatter det faktum at bestemmelsen er relativt ufølsom og krever forsterkning formidlet gjennom komplement. I tillegg er denne bestemmelse ikke fullstendig spesifikk og kan ikke fortolkes i pasienter hvis serum inneholder antistoffer mot pattedyrcellekjerner. Enn videre er kvantitative resultater erholdt under anvendelse av en anti-komplement immunfluorescensbestemmelse, vanskelige å reprodusere. Som en konsekvens av disse og andre årsaker har bestemmelser for anti-EBNA-antistoffer generelt vært begrenset til noen få, spesialiserte laboratorier.

De ovenfor angitte vanskeligheter med bestemmelse av anti-EBNA-antistoffer stammer fra mangel på relativt rent EBNA. Rensing av EBNA fra pattedyrcellevevkulturer er kompleks på grunn av antigenets lave konsentrasjon og poly-morfologi. Selv om det er lettere og mindre kostbart å anvende hele celler som uttrykker EBNA som i den for tiden anvendte teknikk, er problemer med spesifisitet og repro-duserbarhet direkte resultatet av anvendelse av helceller.

Syntetiske peptider inneholdende deler av glycin-alanin-EBNA-l-regionen, er blitt vist å være reaktive med sera fra pasienter med EBV-IM [Rhodes et al., i Herpesvirus, R. Rapp, red., Alan R. Liss, New York; s. 487-496

(1984); Rhodes et al., J. Immunology, 134:211-216 (1985); Smith et al., J. Infec. Dis., 154:885-889 (1986) og Geltosky et al., J. Clin. Lab. Analysis, 1:153-162 (1987)]. Som vist i US patentskrift nr. 4.654.419 og deretter annetsteds, kan peptidet angitt som P62 anvendes i en ELISA-bestemmelse for å skille serologisk den akutte fase av EBV-IM fra rekonvalesensfasen og restitusjonsfasen av IM [Smith et al., J. Infec. Dis., 154:885-889 (1986) og Geltosky et al., J. Clin. Lab. Analysis, 1:153-162 (1987)]. Den akutte fase av sykdommen er påvisbar ved tilsynekomst av IgM-antistoffer mot dette peptid. Under rekonvalesensfasen faller IgM-antistofftiteren, og IgG-antistoff kan påvises [Smith et al., J. Infec. Dis., 154:885-889 (1986)]. Pasienter med en lang tidligere infeksjon har IgG-antistoffer mot peptidet som den dominerende immunglobulinklasse.

Antistoffproduksjonen mot EBNA-l-proteinet er meget uvanlig. IgM-antistoffer som gjenkjenner glycin-alanin-peptid P62, påvises innen én dag av sykdomsutbruddet [Smith et al., J. Infec. Dis., 154:885-889 (1986)]. Analysert ved immunblotting, ble det funnet at disse IgM-antistoffer gjenkjenner EBNA-l-proteinet såvel som mer enn ett dusin normale, cellulære proteiner [Rhodes et al., J. Exp. Med., 165:1026-1040 (1987)]. Antistoff som bindes til EBNA-1 og til autoantigenene, kan inhiberes med peptidet P62. Således fremkaller akutt EBV-infeksjon syntese av autoantistoffer som synes å dele en epitop relatert til den glycin-alanin-repeterende region av EBNA-1.

Derimot fremkommer ikke IgG-antistoffer mot EBNA-1 før flere måneder etter sykdomsutbruddet. IgG-anti-

peptid P62-antistoffer målt ved ELISA-bestemmeIse [Smith et al., J. Infec. Dis., 154:885-889 (1986) og Geltosky et al., J. Clin. Lab. Analysis, 1:153-162 (1987)], anti-EBNA-1-antistoffer målt ved standard anti-komplement immunfluorescens [Reedman et al., Int. J. Cancer, 11:499-520 (1973)] og IgG-antistoffer mot EBNA-l-protein målt ved immunblotting, fremkommer alle side om side. Disse IgG-anti-stof fer kan også inhiberes med peptid P62, men er spesifikke for EBNA-l-proteinet og reagerer ikke lenger med de cellulære autoantigener [Rumpold et al., J. Immunol., 138:593-599

(1987); Rhodes et al., J. Exp. Med., 165:1026-1040 (1987); og Dillner et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82:4652-4656

(1984)].

Cytomegalovirus (CMV) er et annet medlem av herpes-virusfamilien. CMV-infeksjoner i immunkompetente personer er vanligvis uten signifikante komplikasjoner og ligner helt typisk på EBV-forårsaket mononukleose.

Diagnose av en CMV-infeksjon i en pasient med IM-lignende symptomer kan foretas ved virusisolering fra vaskulære lesjoner. Antistoffer dannet i respons på en CMV-infeksjon, kan påvises ved nøytralisering (NT), komplementfiksering (CF), immunfluorescens og blodplateagglutin-erings- (PA) prosedyrer. [Se, Weller, N., Engl. J. Med., 285:203 (1971)]. CMV-infeksjoner er også latente, og sykdommen oppstår i pasienter på immunundertrykkende behandling og i de som utsettes for opportunistiske infeksjoner. CMV-infeksjon er blitt den mest vanlige infeksjon hos pasienter som mottar allogen benmargtransplantasjon og er en viktig determinant for vellykketheten eller svikten ved trans-plantasjonsprosedyren [Neiman et al., J. Infect. Dis., 136:754 (1977)].

Blant voksne som gjennomgår immunundertrykkende behandling etter nyrehomotransplantasjon, utvikler over 90% aktive cytomegalovirus-antistoffer. Ca. halvparten av de seronegative pasienter blir deretter infisert ved immunundertrykkende behandling. Seronegative mottagere som mottar en nyre fra en seropositiv donor, utvikler praktisk talt alltid en postoperativ infeksjon og vil sannsynligvis utvikle symptomer på infeksjonen.

For immunkompetente personer, dvs. personer som ikke tar immunundertrykkende legemidler, og de som er frie for immunforlikende sykdommer slik som ARC og AIDS, finnes typisk CMV-mononukleose- (CMV-IM) infeksjoner i barn (fra fødsel til ca. 2 år gamle) og i voksne, dvs. personer som er eldre enn ca. 30 til 35 år. Infeksiøs mononukleose forårsaket av EBV (EBV-IM), finnes generelt hos personer i tenårene til 25-årsalder, og i særdeleshet hos pasienter på 15 til 25 år.

Pasienter med begge sykdommer utviser atypisk lymfo-cytose, faryngeale symptomer, unormale leverfunksjonstester, splenomegali og feber. Sera fra CMV-IM-pasienter er heterofil-negative, mens sera fra mesteparten av EBV-IM-pasienter er heterofil-positive.

Genetisk konstruksjon og syntetisk polypeptid-teknologier har nylig tilveiebrakt løsninger på problemet med å fremstille store mengder av protein og polypeptidantigener. Imidlertid er begge teknikker effektive bare hvis aminosyrerestsekvensen av det naturlige protein er kjent.

Aminosyrerestsekvensen av et naturlig protein kan bestemmes fra proteinet i seg selv, men dette er ofte vanskelig. Gennukleotidsekvensen som koder for proteinet, kan også åpenbare proteinets aminosyrerestsekvens. Imidlertid har alle DNA-sekvenser tre mulige leserammer som hver gir et forskjellig protein. Derfor må den korrekte leseramme være kjent for å fremkalle den korrekte aminosyrerestsekvens av et protein fra dets gen.

Den korrekte leseramme av en DNA-sekvens som koder for et protein, og derfor proteinets aminosyrerestsekvens, kan bestemmes via anvendelse av antistoffer. Denne strategi innbefatter fremstilling av en oppstilling av proteinfragmenter eller polypeptider hvis aminosyrerestsekvenser svarer til sekvensene erholdt fra de tre mulige genprod-ukter. Proteinfragmentene eller polypeptidene som innbefatter antistoffer som immunreagerer med genets naturlige proteinprodukt, identifiserer derved genets korrekte leseramme. Hvis derimot antistoffer mot det naturlige protein gjenkjenner de fremstilte proteinfragmenter eller polypeptider, er forholdet mellom gen og protein derved også etablert.

Heller et al., J. Virol., 44:311-320 (1982), rapporterte DNA-sekvensen for en del av EBV-genomet som ble funnet å inneholde en indre region, angitt som IR3, bestående av direkte gjentagelser av et hexanukleotid og to nonanukleotidsekvenser. De anga bevis som antydet at sekvensen som omgir og innbefatter IR3, inneholder genet som koder for EBNA. Da det imidlertid ikke var kjent hvilke av de tre mulige DNA-sekvens-leserammer som ble translatert, var Heller et al., supra, ikke i stand til definitivt å utlede aminosyresekvensen for det mulige EBNA-protein.

I september 1983 rapporterte Hennessy og Kieff,

Proe. Nati. Acad. Sei., U.S.A., 80:5665-5669 (1983), etableringen av den naturlige leseramme for EBV DNA-sekvensen rapportert av Heller et al., supra. Hovedsakelig isolerte de IR3 DNA, spaltet det i små vilkårlige biter og innføyde bitene i lacZ-genet av en E. coli ekspresjons-vektor slik at alle tre EBNA-genleserammene ble uttrykt, hver i en forskjellig klon. LacZ-genet koder for beta-galactosidase, et bakterielt enzym. IR3-lacZ-gen-fusjons-produktet uttrykkes i E. coli som et fusjonsprotein med IR3-proteinsekvensen innskutt mellom aminosyrer 7 og 9 (8 er utelatt i konstruksjonsprosessen) av beta-galactosidase-proteinmolekylet.

Hennessy og Kieff identifiserte en IR3-lacZ-gen-fusjon som uttrykte IR3 DNA i dens naturlige leseramme ved screening med hensyn til fusjonsproteiner som ble gjenkjent av anti-EBNA positive humansera. Et således identifisert plasmid ble betegnet som pKHl82-44.

For å bekrefte at proteinet uttrykt av pKH182-44 inneholdt EBNA-spesifikke, antigeniske determinanter, dannet Hennessy og Kieff, supra, antisera i kaniner mot cyanogenbromid-spaltet (CNBr) IR3-galactosidasefusjons-protein. CNBr-fragmentet anvendte et immunogen inneholdende 53 aminosyrer homologe med EBNA og 89 aminosyrer homologe med beta-galactosidase. Disse antisera gjenkjente naturlig EBNA i EBV-infiserte celler under anvendelse av indirekte immunfluorescens.

Resultatene av Hennessy og Kieff synes å være avhengig av den gjentagende art av EBNA IR3-området. Fusjons-proteinet produsert av pkHl82-44, inneholder et relativt langt segment homologt med IR3-området (f.eks. 53 aminosyrer) . Det er derfor ikke overraskende at fusjons-proteinet og CNBr-fragmentet derav inneholdt antigeniske determinanter. Enn videre identifiserte Hennessy og Kieff ikke hvilke av sekvensene gjentatt i deres fragment som virket som antigeniske determinanter.

Selv om Hennessy og Kieff er i stand til genetisk

å fremstille et materiale gjenkjent av anti-EBNA-antistoffer

i humant serum, ville det være tungvint å anvende i en klinisk oppstilling på grunn av dets konstruksjon. Det 53 aminosyre-restsegment av deres fusjonsprotein som er homologt med EBNA, er fysikalsk og kjemisk del av beta-galactosidaseproteinet. Dets immunologiske egenskaper er derved influert av disse deler av beta-galactosidase-molekylet fra hvilket det ikke kan adskilles. Faktisk rea-gerte alle de humane sera som ble anvendt i deres studium, med beta-galactosidase, og krevet behandling med beta-galactosidase for å adsorbere og fjerne dens reaktivitet før testing med hensyn til spesifisitet mot det genetisk fremstilte protein.

En annen løsning på de innbyrdes beslektede problemer med bestemmelse av et gens korrekte leseramme og fremstilling av store mengder patogen-relaterte antigener (immunogener) for kliniske og diagnostiske formål, er anvendelse av syntetisk polypeptidkjemi. Denne metode for fremstilling av antigener (immunogener) har en fordel overfor genetiske konstruksjonsmetoder beskrevet ovenfor. Syntetiske polypeptidantigener inneholder ikke naturlige protein-biprodukter eller fragmenter derav, og deres anvendelse eliminerer derved muligheten for uønsket kryssreaktivitet og behovet for å forbehandle serumprøver slik som ved Hennessy og Kieff-studien.

Selv om den generelle forestilling for fremstilling av syntetiske antigener (immunogener) og anvendelse av disse for å fremkalle antistoffer med på forhånd bestemt spesifisitet er blitt beskrevet, foreligger det et stort område av denne teknologi som fortsetter å unndra seg forut-sibarhet. Det er minst to grunner for dette. For det første fremkaller et syntetisk antigen (immunogen) ikke nødvendigvis antistoffer som immunreagerer med det intakte protein i dets naturlige miljø. For det andre immunreagerer en verts naturlige antistoffer mot et naturlig forekommende immunogen slik som et viralt protein, sjelden med et polypeptid som tilsvarer en kort, lineær del av immunogenets aminosyrerestsekvens. Dette sistnevnte fenomen er antatt å være resultatet av at korte, lineære proteiner mangler de nødvendige sekundære og tertiære overensstemmende struk-turer.

Meget av arbeidet vedrørende bindingen av peptid med antistoff vedrørende proteiner er oppsummert i en over-sikt av Benjamini, E. et al., Current Topics in Microbio-logy and Immunology 58^:85-134 (1972). Peptidstrukturens rolle i antistoffbinding er blitt understreket av Goodman, J. W., Immunochem. 6^:139-149 (1969).

Mesteparten av studiene vedrørende hvordan forandringer i sekvensen av peptider påvirker antistoffbinding, er blitt tolket som å angi at strukturen av det anti-stof f kombinerende sete spiller en dominerende rolle. Effekten av sekvens- og strukturforandringer i disse studier er sammenblandet og vanskelig å segregere. Enkelte at disse studier kan like godt forklares ved strukturelle forandringer i antigen som påvirker bindingen.

Antistoffrespons ved molekylærnivået innbefatter binding av et antigen med definert sekvens (primærstruktur) og i en definert tilpasning (sekundær-og tertiær-struktur). Immunrespons på proteinantigener er tradisjonelt blitt tolket som å være rettet mot primær-, sekundær- eller tertiærstrukturen av proteinet.

Dette klassifiseringsskjema kan ha en viss gyldighet for proteiner som har en godt definert totalstruktur ved fysiologiske temperaturer og løsninger. Imidlertid er dets gyldighet tvilsom for peptidantigener som har en mer dynamisk struktur.

Flere grupper har rapportert strukturelle studier

av polymerer med gjentagende sekvens av glycin og alanin eller glycin og serin som ble syntetisert som modeller på silkefibroiner [Anderson et al., J. Mol. Biol. 67:459-468

(1972)] og collagen [Anderson et al., BBRC 39:802-808 (1970); Doyle et al., J. Mol. Biol. 51:47-59 (1970)]. Den mest systematiske studie er den av Brack et al., Biopolymers 11:563-586 (1972) som rapporterte syntese av en serie av blokk-homopolymere polypeptider hvori de homopolymere, blokk-repeterende enheter hadde formelen (Alax-Glyy) hvori når x=l, er y = 1, 2 og 3; når x=2, ery=l, 2 eller 3;

og når x = 3, er y = 3.

Resultatene rapportert fra denne sistnevnte studie, var at blokk-homopolymerene i fast tilstand sammensatt for det meste av alanin, var alfa-heliske, og de inneholdende for det meste glycin, var uordnet. I løsning ble poly-alanin rapportert å være alfa-helisk, men poly- (Ala^Gly-^ ble rapportert å være i beta-antiparallell form. De mer glycinrike polymerer ble angitt å ha en annen fiksert struktur som ble rapportert som hverken alfa-helisk eller av beta-struktur.

De homopolymeriserte blokker av glycin og alanin rapportert av Brack et al., ble fremstilt ved kondensasjons-polymerisering av de di- til hexapeptid-repeterende enheter som har en carboxyl-terminal glycylrest i aktiv esterform. Grader av polymerisering fra 2 til 68 ble rapportert for poly(Ala-Gly2).

Selv om løsningsmidlene anvendt i disse studier ikke var fysiologisk akseptable, f.eks. vann eller fosfatbufret saltvann, illustrerer resultatene to punkter: (1) strukturelle forandringer kan oppstå ettersom sekvensen av et polypeptid forandres, og (2) strukturelle forandringer oppstår også under overgangen fra løsning til fast tilstand.

Sammendrag av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse tar i betraktning et CMV-homologt polypeptid for anvendelse in vitro. Polypeptidet inneholder ca. 6 til 40, fortrinnsvis ca. 15 til 40, aminosyrerester med en sekvens svarende til sekvensen av det CMV-kodede polypeptid vist i figur 13, hvilken sekvens innbefatter ka-sekvens definert ved formelen:

1 2

hvori R og R betegner aminosyrerester som når de tas individuelt, er like eller forskjellige og er Ala, Asn, Arg,

1 2

Gly, Leu, Pro, Ser og Thr, forutsatt at R og R ikke begge er Gly, farmasøytisk akseptable salter derav og antigenisk

beslektede varianter derav.

I en annen utførelsesform tar foreliggende oppfinnelse i betraktning en metode for identifisering av anti-EBNA-antistof f er i en kroppsprøve. Metoden omfatter blanding av en pasients kroppsprøve med et CMV-homologt peptid ifølge oppfinnelsen. Den således dannede immunreaksjonsblanding opprettholdes i et på forhånd bestemt tidsrom tilstrekkelig for at ethvert anti-EBNA-antistoff tilstedeværende i prøven, får immunreagere med peptidet under dannelse av et immun-reaks jonsprodukt. Nærværet av ethvert dannet produkt bestemmes deretter, og derved nærværet av anti-EBNA-anti-stof f er i prøven. I en foretrukket utførelsesform er metoden immunglobulin-klassespesifikk.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også et diagnostisk system for bestemmelse av nærværet av anti-EBNA-antistof f er i en kroppsprøve. Systemet innbefatter, i separate forpakninger, (a) et CMV-homologt polypeptid, og

(b) et indikerende middel for signalisering av nærvær av

en immunreaksjon mellom polypeptidet og humane anti-EBNA-antistof f er. Fortrinnsvis er det indikerende middel et enzymmerket, humant lg klasse-spesifikt antistoff.

Foreliggende oppfinnelse tar også i betraktning en multimer inneholdende et flertall av forbundne polypeptid-repeterende enheter hvori minst én av de repeterende enheter er et polypeptid som beskrevet ovenfor. De polypeptid-repeterende enheter kan være forbundet i en hode-til-hale-måte ved amidbindinger. Alternativt kan de syntetiske polypeptidmonomerer være forbundet med andre enn amidbindinger for å danne en polymer multimer slik som gjennom anvendelse av intramolekylære, interpolypeptidcystein-disulfidbindinger.

En metode for bestemmelse av nærvær av anti-EBNA-antistoffer under anvendelse av et ovenfor beskrevet polypeptid eller multimer som antigen, tas her i betraktning.

I henhold til denne metode tilveiebringes en væskeformig, human kroppsprøve og blandes med det ovenfor beskrevne polypeptid. Den resulterende immunreaksjonsblanding opprettholdes i et på forhånd bestemt tidsrom tilstrekkelig for at ethvert anti-EBNA-antistoff tilstedeværende i prøven, får immunreagere med polypeptidet og danne en immunreaktant. Nærværet av immunreaksjonen bestemmes deretter. I særlig foretrukket praksis bestemmes nærværet av en immmunreaksjon ved blanding av anti-humane tungkjede-antistoffer slik som anti-IgG-, -IgM-eller -IgA-antistoff er med immunreaktanten, den andre immunreaksjonsblanding opprettholdes i et på forhånd bestemt tidsrom tilstrekkelig for at de anti-humane antistoffer får immunreagere med anti-EBNA-antistoffene tilstedeværende i immunreaktanten for å danne en andre immunreaktant, og deretter bestemmelse av nærvær av den andre immunreaktant, og av den tilstedeværende, bestemte, humane anti-EBNA tungkjede-antistoffart.

Fortrinnsvis utføres bestemmelsen under anvendelse av polypeptidet eller multimeren festet til en fast matriks under dannelse av en fast bærer. Kroppsprøven slik som blod, serum, plasma, spytt eller sputum, blandes med den faste bærer under dannelse av en fast/væskefase-immunreaksjonsblanding. Denne blanding opprettholdes som ovenfor beskrevet under dannelse av en fast fase-bundet immunreaktant som inneholder anti-EBNA-antistoffene, og de faste og væskeformige faser separeres deretter. Nærvær av fast fase-bundet immunreaktant bestemmes deretter.

Ytterligere tatt i betraktning er et diagnostisk system for bestemmelse av nærvær av antistoffmolekyler overfor EBNA i en kroppsvæskekomponent. Et slikt system omfatter et polypeptid ifølge oppfinnelsen og et indikator-middel for signalisering av immunreaksjonen av polypeptidet med anti-EBNA-antistoffmolekylene. I en mer foretrukket utførelsesform inneholder dette system også en fast bærer omfattet av en fast matriks til hvilken polypeptidet er bundet. Et middel for identifisering av isotypen av de immunreagerende antistoffmolekyler kan også innbefattes i systemet.

Kort beskrivelse av tegningene

I figurene som utgjør en del av beskrivelsen ifølge oppfinnelsen: er figur 1 en kurve av de sirkulære dikroisme-spektra av polypeptider (F), (B) og (E). Disse polypeptider er også her angitt som polypeptid F13, F6 2 og F12. Hvert spektrum er gjennomsnittet av 10 suksessive avsøkninger av et polypeptid i en fysiologisk løsning (fosfatbufret saltvann) ved en konsentrasjon på 1 milligram/milliliter (mg/ml). Den optiske rotasjon er uttrykt som milliradianer og er nedtegnet mot den polariserte lysbølgelengde, uttrykt i nanometer (nm). Den relativt karakterløse kurve for polypeptid F (F13) er indikativ for en vilkårlig tilpasning som er det vanlige resultat erholdt med peptider av denne størrelse. Bunn- og toppspektret vist ved polypeptid B (P62), er karakteristisk for en relativt stabil sekundærstruktur eller tilpasning, sannsynligvis beta-fold. Selv om dataene ikke er vist, har polypeptid P27, P60, F14 og F15 meget like spektra som indikerer at de mer foretrukne polypeptider ifølge oppfinnelsen eksisterer som lignende stabile tilpasninger i fysiologisk løsning. Spektret av polypeptid E (F12) indikerer delvis antagelse av slik struktur.

Figur 2 er et fotografi av nitrocellulose-immunavtrykk av helcellekstrakter av EBV-transformerte WI-L2-celler under anvendelse av kanin-antipeptid-antisera overfor syntetiske polypeptider C (P60) og B (P62). Et humant serum (fra pasient TJ) tidligere definert som anti-EBNA-positiv; dvs. inneholdende anti-EBNA-antistoffer, ble anvendt som en positiv kontroll i spor A ved en 1:20 fortynning. Kanin anti-P60-(C) serum ved en 1:50 fortynning (spor B) og kanin anti-P62- (B) serum ved 1:10 (spor D) immunreagerte med samme bånd som den positive kontroll som indikerer at de gjenkjente naturlig EBNA. Spor A-G er identifisert ved bunnen av figuren.

Gjenkjennelse av EBNA med anti-P60-serum ble inhibert ved inkubering av anti-P60-serum fortynnet 1:50 med 40 mikrogram/milliliter (ug/ml) av polypeptid P60 i 1 time før immunblotting (spor 3). På tilsvarende måte ble gjenkjennelse av EBNA med anti-P62-serum inhibert ved inkubering av anti-P62-serum fortynnet 1:10 med 40 ug/ml polypeptid P62 i 1 time før immunblotting.

Det antigeniske slektskap av P60 og P62 er vist i spor 6 og 7. Spor 6 viser anti-P62-serum fortynnet 1:10 som immunreagerer med EBNA-båndet. I spor 7 ble immunreaktiviteten av anti-P62-serum med EBNA-båndet inhibert ved inkubering med polypeptid P60 til 40 ug/ml i 1 time før immunblotting. Figur 3 er en kurve som illustrerer inhiberingen av anti-P62-serumaktivitet i EBNA-positivt serum av pasient 1011 med et konkurrerende polypeptid i oppløsning. En ELISA under anvendelse av polypeptid P62 som fast fase-mål ble utført under anvendelse av serum fra pasient 1011 pre-inkubert i 1 time med enten polypeptid P27, P62, P60, P89 eller F16 før anvendelse i ELISA. Polypeptid P27, P62, P60, P89 og P16 er også angitt her som polypeptid A, B, C, D og G. Den prosentvise anti-polypeptidaktivitet er nedtegnet som ordinaten mot konsentrasjonen av det konkurrerende polypeptid i mikrogram pr. milliliter (ug/ml). Figur 4 er en kurve som illustrerer de parallelle tidsforløp for tilsynekomst av antistoffer overfor EBNA (stiplet linje, åpne sirkler) og polypeptid P62 (helopp-trukket linje, lukkede sirkler) i tilfelle av dokumentert EBV infeksiøs mononukleose (EBV-IM). Sekvensvise sera ble oppsamlet etter klinisk start og ble titrert for anti-EBNA-aktivitet ved å følge prosedyren rapportert i Catalano et al., J. Clin. Invest., 65:1238-1242 (1980) på den høyre ordinat. Serumprøvene ble også bestemt ved ELISA ifølge oppfinnelsen under anvendelse av polypeptid P62 som fast fase-målet som vist på den venstre ordinat hvori den optiske densitet ved 405 nanometer (0D^Q5) er nedtegnet. Figur 5 er sammensatt av to kurver (fig. 5A og 5B) som illustrerer den tidlige påvisning av antistoffer mot polypeptid P62 (heltrukket linje, lukkede sirkler) sammenlignet med anti-EBNA (stiplet linje, åpne sirkler) under anvendelse av påvisning ved den klassiske ACIF-metode beskrevet av Henie, G. et al., J. Infect. Dis., 130:231

(1974) . Sekvensvise sera ble oppsamlet fra to pasienter

(prøve 14 toppfeltet, figur 5A; prøve 2 bunnfeltet, fig. 5B)

med klinisk dokumentert, infeksiøs mononukleose. Seraene ble titrert for anti-EBNA-aktivitet som rapportert i Catalano et al., ovenfor. Anti-polypeptidaktivitet ble målt under anvendelse av ELISA ifølge oppfinnelsen under anvendelse av polypeptid P62 som fast fase-målet hvor aktiviteten er angitt som i figur 4.

Figur 6 er en kurve som viser en analyse av sekvensvise sera fra pasient D.B. som hadde en akutt EBV-IM-infeksjon, bestemt ved EBNA P62 ELISA. IgM-responsen i akutt fase er vist ved lukkede sirkler, rekonvalesens-IgG-responsen er angitt ved åpne sirkler, og forholdet mellom IgG/IgM er angitt ved åpne kvadrater. EBNA polypeptid P62-bestemmelsen ble utført som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Figur 7 er fotografier av immunavtrykk som illustrerer en analyse av sekvensvise sera fra pasient D.B. Lysater av EBV-udødeliggjorte Wi-L2- (også angitt som WI-L2) celler ble anvendt som kilde for EBNA-l-proteiner for avtrykkene. På venstre side av avtrykket (fig. 7A) ble en normal (NORM), VCA-positiv prøve anvendt som en kontroll for å indikere 77 kD EBNA-l-proteinet. Avtrykkene viser den forsinkede respons (venstre side) av IgG-antistoffer overfor 77 kD EBNA-proteinene og den hurtige dannelse av IgM-antistoffer mot disse proteiner i den akutte fase av sykdommen (høyre side, figur 7B). Dager etter starten av sykdommen er indikert ved tallene under hvert spor som skal leses vertikalt. Figur 8 er en kurve som illustrerer en analyse av sekvensvise sera fra pasient D.S. med en første infeksjon på grunn av CMV-IM, etterfulgt av en andre infeksjon på grunn av EBV-IM. IgM-responsen i akutt fase er vist ved lukkede sirkler, rekonvalesens-IgG-responsen er indikert ved åpne sirkler, og IgG/IgM-forholdet er vist som lukkede kvadrater. Figur 9 er fotografier av en immunavtrykksstudie som illustrerer en analyse av sekvensvise sera fra pasient D.S. ved immunblottingsteknikken. Den venstre side av avtrykket (fig. 9A) illustrerer akutt fase-IgM-responsen på EBNA-l-proteiner med pasientens sera. Den høyre side av avtrykket (fig. 9B) illustrerer IgG-responsen fra pasientens sera. Tallene under hvert spor og sporangivelsen NORM er som angitt i figur 7. EBNA-l-proteinene ble fremstilt fra Wi-L2-celleekstrakter som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Figur 10 er en todelt kurve (fig. 10A og 10B) som illustrerer en polypeptid P62 ELISA-analyse av sekvensvise serumprøver fra to pasienter med CMV-IM-infeksjoner som tidligere hadde EBV-infeksjoner. I figur 10A er IgM-anti-stof f responser for pasient L.S. vist som åpne sirkler, IgG-responser er vist som lukkede sirkler, og IgG/IgM-forhold er vist som lukkede kvadrater. I figur 10B er IgM-responsene for pasient S.G. vist som åpne sirkler, mens IgG-responser er vist som lukkede sirkler. Figur 11 inneholder to felter (figur 11A og 11B) som er fotografier av immunavtrykksanalyse av fire sera fra fire pasienter med akutt EBV-IM og seks pasienter med akutt CMV-IM. I felt A ble seraene immunavtrykket på ekstrakter fra K562-celler (EBV~, CMV~), hvor IgM-antistoffer spesifikt ble påvist. I felt B ble seraene avtrykt på ekstrakter fra sene CMV-infiserte, humane fibroblastceller hvor IgG-antistoffer ble påvist. Alle sera ble anvendt ved en 1:20 fortynning. Bokstavbetegnelsene "E" og "C" ved toppen av hvert spor betegner seraene anvendt i disse spor fra pasienter med enten EBV-IM eller CMV-IM. Figur 12 er et fotografi av et immunavtrykk som illustrerer inhibering av binding av IgM og IgG fra serum-prøver tatt fra pasient D.B., D.S. og T.G. under akutte og rekonvalesente trinn av deres sykdom til ekstrakter fra Wi-L2-celler, en EBV<+> B-cellelinje. Pasient G var en normal VCA+, EBNA-l<+->donor. Spor 1 og 2 inneholdt serum-prøver fra pasient D.B. erholdt 15 dager etter starten av sykdom (pod), spor 3 og 4 var fra pasient D.S. 12 dager pod, spor 5 og 6 var fra pasient T.G. med akutt IM tatt 4 dager pod, spor 7 og 8 var fra pasient D.B. 514 dager pod, spor 10 og 11 var fra pasient D.S. 471 dager pod, og spor 11 og 12 var fra den normale donor G. Alle serumprøver ble fortynnet 1:50. De oddetalls nummererte spor inneholdt bare serum og er betegnet med minustegn (-), mens de like-talls nummererte spor inneholdt serum pluss polypeptid P62 og er betegnet med plusstegn (+). Konsentrasjonen av polypeptid P62 var 400 mikrogram pr. milliliter (ug/ml) i spor 2, 4 og 6, og var 50 ug/ml i spor 8, 10 og 12. IgM-antistof f er ble spesifikt påvist i spor 1-6, mens IgG-antistof f er ble spesifikt påvist i spor 7-12. Figur 13 illustrerer aminosyrerestsekvensen av CMV-kodet polypeptidantigen som beskrevet av Strapraus et al., J. Virol., 57:591602 (1986). Den numeriske stilling av hver rest i sekvensen er angitt ved tall i den venstre marg. Foretrukne CMV-homologe peptider ifølge oppfinnelsen innbefatter en aminosyrerestsekvens som tilsvarer sekvensen vist i figuren fra reststilling 200 til reststilling 220. Figur 14 er en kurve som illustrerer evnen hos EBV-homologt peptid P62 og CMV-homologe peptider Cl og C2 til å påvise anti-EBNA IgG (åpne symboler) eller IgM-(lukkede symboler) antistoffer i serumet fra pasient DB over forløpet av en EBV-infeksjon. Under den akutte fase av infeksjonen ble anti-EBNA IbM-antistoffer påvist under anvendelse av EB-homologt peptid P62 (trekanter), CMV-homologt peptid Cl (sirkler) og CMV-homologe C2 (kvadrater) ELISA-er, som bekrefter nærvær av infektiøs mononukleose. Starten av rekonvalesens er indikert med en stigning i anti-EBNA IgG, og ledsagende fall i IgM-antistoffer. Figur 15 er en kurve som illustrerer evnen hos EBV-homologt peptid P62 og CMV-homologe peptider Cl og C2 til å påvise anti-EBNA IgG (åpne symboler) eller IgM- (lukkede symboler) antistoffer i serumet fra pasient DS over forløpet

for CMV-infeksjonen etterfulgt av en EBV-infeksjon. Under den akutte fase av begge sykdommer ble anti-EBNA IgM-anti-stof fer påvist under anvendelse av EBV-homologt peptid P62, CMV-homologt peptid Cl og CMV-homologt peptid C2 ELISA-er som bekrefter nærvær av infeksiøs mononukleose ved starten av hver akutt sykdom.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

I. Introduksjon

Mennesker infisert med Epstein-Barr-virus (EBV), utvikler antistoffer mot et viralt, nukleært antigen (EBNA) som er til stede i viralt-transformerte B-lymfocytter. Tradisjonelle, kliniske teknikker anvendt for å bestemme EBNA og anti-EBNA-antistoffer i mennesker, er arbeids-krevende. I tillegg er nåværende prosedyrer for rensing av EBNA fra cellekultur ikke lett å tilpasse til masseproduk-sjon.

Foreliggende oppfinnelse tar i betraktning anvendelse av syntetisk polypeptidteknologi for å overvinne enkelte av de problemer som er forbundet med nåværende metodologier. Korte, syntetiske polypeptider kan immunologisk etterligne antigeniske determinanter på et naturlig protein og kan derfor anvendes for å danne antistoffer med på forhånd bestemt spesifisitet som gjenkjenner det naturlige protein.

Uttrykket "immunologisk etterligner" anvendes her for å angi at et immunogent polypeptid ifølge oppfinnelsen fremkaller produksjon av antistoffer som binder til det fremkallende polypeptid, og også til den beslektede sekvens i det intakte protein. Dette fenomen kan anvendes både eksperimentelt og klinisk.

Eksperimentelt kan antistoffer mot syntetiske polypeptider anvendes for å etablere DNA-leserammen, og derfor aminosyrerestsekvensen av et klinisk viktig protein slik som EBNA. Klinisk kan antistoffer med på forhånd bestemt spesifisitet dannet mot syntetiske polypeptider, anvendes for diagnostiske og terapeutiske formål.

Heller et al., J. Virol., 44:311-320 (1982) rapporterte en DNA-nukleotidsekvens med karakteristika som indikerte at den kunne inneholde genet som koder for EBNA. De forutsa at hvis DNA ble translatert til protein, ville tre mulige leserammer kode for et IR3-proteinområde på mer enn 200 aminosyrerester sammensatt av bare (i) serin, arginin og glycin; (ii) glycin og alanin; eller (iii) glutamin, glutamat og glycin, avhengig av den uttrykte DNA-leseramme.

De rapporterte, kjemiske egenskaper av EBNA-molekylet sammenfattet med fordelingen av mulige stoppkodoner i EBNA-genet, indikerte at IR3 var sammensatt primært av glycin og alaninrester.

For å bekrefte denne indikasjon ble korte polypeptider syntetisert hvis aminosyrerestsekvenser hovedsakelig tilsvarte den til et EBNA-protein hvis IR3 er en glycin-alanin vilkårlig copolymer.

Som det vil fremgå i den diskusjon som følger, ble disse syntetiserte polypeptider, og ett polypeptid som i særdeleshet er angitt som P62, funnet å immunologisk etterligne EBNA. I tillegg ble en gruppe av disse særlig foretrukne polypeptider innbefattende polypeptid P62, funnet å binde humane anti-EBNA-antistoffer. Anvendelse av disse polypeptider i forskjellige utprøvningsprosedyrer er også diskutert i det etterfølgende.

Nærmere spesifikt med hensyn til slike bestemmelser er en bestemmelse, fortrinnsvis i fast fase, som anvender et særlig foretrukket polypeptid, blitt utviklet. Denne bestemmelse er blitt funnet å være klinisk pålitelig ved påvisning av infektiøs mononukleose (IM) forårsaket av EBV (EBV-IM), såvel som IM fremkalt av CMV (CMV-IM), og også ved påvisning av nasofaryngealt carcinom (NPC), en annen sykdom hvori EBV er blitt implisert. Spesifikke resultater med utprøvninger innen hvert område er diskutert, slik som også utprøvningsmetodene generelt.

II. Foretrukne utførelsesformer

A. Syntetiske polypeptider

1. Sekvenser

Seriene av små, syntetiske polypeptider (5-21 aminosyrerester i lengde) anvendt i denne studie, ble syntetisert under anvendelse av fast-fasemetoden ifølge Merrifield. Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963). Sekvensene ble valgt for å representere forskjellige områder innenfor og like utenfor den foreslåtte IR3-region av EBNA.

Uttrykket "syntetisk" som anvendt her, angir at polypeptidmolekylet eller den polypeptidrepeterende enhet er blitt bygget opp på kjemisk måte, dvs. kjemisk syntetisert snarere enn å ha blitt fremstilt på biologisk måte, slik som ved genetiske konstruksjonsteknikker. Således er de syntetiske polypeptider som utgjør foreliggende oppfinnelse, frie for naturlig forekommende proteiner og fragmenter derav.

De kjemisk syntetiserte polypeptider avviker derfor også fra nedbrytningsprodukter av naturlig forekommende proteiner som fremstilles ved virkningen av cyanogenbromid på proteinet. Den velkjente fase-fase-kjemiske syntese hvori blokkerte aminosyrerester adderes på en serievis måte for å oppnå det ønskede polypeptid, er den foretrukne syntese-metode, og er diskutert mer i detalj i det etterfølgende.

Alle aminosyrerester identifisert her, er i den naturlige eller L-konfigurasjon. I henhold til standard polypeptidnomenklatur er forkortelser for aminosyrerestene som følger: En side ved oppfinnelsen tar i betraktning et vilkårlig copolymer-polypeptid inneholdende ca. 6 til ca. 40 aminosyrerester, fortrinnsvis 15 til ca. 20 aminosyrerester, og innbefattende sekvensen definert ved formelen skrevet fra venstre til høyre og i retning av aminoenden til carboxylenden

hvori R 1 og R 2 angir aminosyrerester som når de tas individuelt, er like eller forskjellige og er Ala, Asn, Arg, Gly,

1 2

Leu, Pro, Ser og Thr, forutsatt at R og R ikke begge er

Gly. Polypeptidet inneholder også minst 25 mol% glycin-rester, og er når det er kjedet til en bærer og innført i en effektiv mengde i en pattedyrvert, i stand til å fremkalle produksjon av antistoffer som immunreagerer med EBNA.

1 2

I en foretrukket utførelsesform er både R og R

Arg slik at polypeptidet innbefatter aminosyrerestsekvensen: -Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-. I en annen foretrukket utførelses-form er R 1 Asn og R 2 er Leu slik at polypeptidet innbefatter aminosyrerestsekvensen: -Gly-Asn-Gly-Leu-Gly-. I en ytterligere foretrukket utførelsesform er R 1 og R 2 begge Ser slik at polypeptidet innbefatter aminosyrerestsekvensen:

-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-.

Foretrukne aminosyrerestsekvenser innbefatter sekvensene, tatt fra venstre til høyre og i retning fra aminoenden til carboxylenden, representert ved formlene: -Arg-Ala-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Glu-Lys-Arg-Pro-Met-; -Ile-Met-Ser-Asp-Glu-Gly-Pro-Gly-Thr-Gly-Asn-Gly-Leu-Gly-Glu-

-Pro-Gly-Ala-Pro-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-

Gly-Pro-;

farmasøytisk akseptable salter derav og antigenisk beslektede varianter derav.

1 2

I mer foretrukne utførelsesformer er R og R Ala

1 2

eller Gly. Eksempelvis kan R være Ala og R kan være Ala;

12 1

R kan være Ala og R kan være Gly; og R kan være Gly og

R 2 kan være Ala. De mer foretrukne utførelsesformer innbefatter således en fem aminosyrerestsekvens representert ved en formel valgt fra gruppen bestående av (i) -Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-;

(ii) -Gly-Ala-Gly-Gly-Gly- og

(iii) -Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-.

Uttrykket "vilkårlig copolymer" anvendes her i sin vanlige betydning. Således er polypeptidene copolymerer fordi de inneholder et flertall av forskjellige aminosyrerest-repeterende enheter. Copolymerene er vilkårlige sammenlignet med alternerende eller blokk-copolymerer fordi de individuelle aminosyrerester av polypeptidene ikke er til stede i en bestemt repeterende sekvens slik som finnes i de repeterende sekvenser av en alternerende copolymer eller homoblokk-copolymerer fremstilt av Anderson et al., Doyle et al. eller Brack et al., supra.

Selv om polypeptidet angitt som P62 (tabell 1) som inneholder den sekvensvis repeterende sekvens -Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-, inneholder dette polypeptid i tillegg et -Ala-Gly- peptid ved carboxylenden. Følgelig er det ingen aminosyrerestsekvens som gjentas gjennom polypeptidet, og polypeptid P62 må ses å være en vilkårlig copolymer og ikke en homoblokk-copolymer slik som poly(Ala x -Gly y)-materialene fremstilt av Brack et al. eller poly(Ser-Gly)-materialene fremstilt av Anderson et al. hvis identiske blokker av bestemte aminosyrerestsekvenser gjentas gjennom lengden av deres polymerer.

De vilkårlige copolymer-polypeptider ifølge oppfinnelsen er ofte her angitt enkelt som "polypeptider", som "syntetiske polypeptider", eller som "peptider". Denne anvendelse er for korthets skyld.

Uttrykket "antigenisk beslektede varianter" anvendes her for å angi polypeptider med forskjellig total-aminosyrerestsekvens som deler minst en del av én antigenisk determinant og som derfor er immunologisk kryssreaktive.

Uttrykket "antigenisk determinant" som anvendt her, angir den strukturelle komponent av et molekyl som er ansvarlig for spesifikk interaksjon med tilsvarende antistoff- (immunglobulin) molekyler fremkalt av det samme eller beslektede antigen eller immunogen.

Uttrykket "immunogenisk determinant" som anvendt her, angir den strukturelle komponent av et molekyl som er ansvarlig for fremkallelse i en vert av et antistoff inneholdende et antistoffkombinerende sete (idiotype) som binder til immunogenet når det anvendes som et antigen.

Uttrykket "antigen" som anvendt her, angir en

enhet som bindes av et antistoff.

Uttrykket "immunogen" som anvendt her, beskriver en enhet som fremkaller antistoffproduksjon i vertdyret. I enkelte tilfeller er antigenet og immunogenet samme enhet, mens i andre tilfeller er de to enheter forskjellige.

Som beskrevet i det etterfølgende, ble f.eks. polypeptid P62 anvendt for å fremkalle produksjon av antistoffer i en kanin, og ble således anvendt som et immunogen. De således fremkalte antistoffer binder seg til polypeptid P62 når de anvendes som et antigen. Polypeptid P62 var derfor både et immunogen og et antigen. Anti-EBNA-antistoffer bindes til både EBNA-immunogenet og antigenet såvel som til polypeptid P62 som antigen.

Foretrukne utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse er de vilkårlige copolymer-polypeptider P89, F12, F13, som vist i tabell 1 i det etterfølgende, farmasøytisk akseptable salter derav og antigenisk beslektede varianter derav. Hvert av disse polypeptider inneholder en

12. 12

-Gly-R -Gly-R -Gly- aminosyrerestsekvens hvori R og R er som tidligere definert; hvert polypeptid inneholder minst 25 mol% Gly; og hvert er i stand til å fremkalle antistoffer som bindes til EBNA som beskrevet tidligere.

<*> Store bokstaver i parentes anvendes for å angi det tilsvarende polypeptid i enkelte av figurene og

tabellene.

Resultatene av polypeptid/anti-polypeptidreseptor-binding og bindingsinhiberingsstudier er diskutert i det etterfølgende i avsnitt II D. Disse resultater illustrerer kryssreaktiviteter og kryss-inhiberende effekter som parallelliserer graden av sekvenshomologi blant polypeptidene. Eksempelvis inneholder polypeptid P60 et 10 aminosyresegment homologt med P62. Polypeptid P27 inneholder et 8 aminosyresegment homologt med polypeptid P60, P62 og Dl (tabell 2). Polypeptid D2 (tabell 2) inneholder et 7 aminosyresegment homologt med segmentene av polypeptid P27, P60, P62 og Dl. Polypeptid P89 som ikke signifikant kryssreagerer i studien, inneholder ingen sekvenshomologi med polypeptid P27, P62 og P60.

Mer betydningsfullt inneholder 8 aminosyrerestsekvensen som deles av polypeptid P27, P62, P60 og Dl, minst én antigenisk determinant felles for alle tre vilkårlige copolymer-polypeptider som derved gjør disse tre polypeptider til antigenisk beslektede varianter. I tillegg innbefatter det delte segment 6 aminosyrerestsekvensen

-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-

og en overlappende sekvens representert ved formelen

12 12 -Gly-R -Gly-R -Gly- hvori R og R begge er Ala; dvs.

-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-.

Med "overlappende" menes at den andre angitte sekvens er inneholdt delvis av den førstnevnte sekvens. Denne overlapping av aminosyrerestsekvens er illustrert for polypeptid P62 ved de overlappende, "boxed", sekvensdeler vist nedenfor hvori enbokstavs-aminosyrerestkoden er anvendt.

G-G-G-A-G-G-A-G-A-G-G-G-A-G-G

Vilkårlige copolymer-polypeptider som inneholder både den delte seks aminosyrerest-holdige sekvens og den overlappende fem aminosyrerest utgjør en ytterligere mer foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse. I slike særlig foretrukne utførelsesformer inneholder det vilkårlige copolymer-polypeptid ifølge oppfinnelsen ca. 8 til 40, og fortrinnsvis ca. 15 til ca. 20, aminosyrerester, og innbefatter i tillegg til den tidligere definerte -Gly-R 1 -Gly-R 2-Gly- aminosyrerestsekvens, sekvensen skrevet fra venstre til høyre og i retning fra aminoenden til carboxylenden, representert ved formelen

-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-,

inneholder minst ca. 50 mol% Gly-rester og er i stand til

både (a) å fremkalle produksjonen av antistoffer som immunreagerer med EBNA når de er kjedet til en bærer og innført i en effektiv mengde i en pattedyrvert, og (b) immunreagerer med humane antistoffer fremkalt av naturlig EBNA.

Særlig foretrukne aminosyrerestsekvenser innbefatter sekvensene, tatt fra venstre til høyre og i retning fra aminoenden til carboxylenden, representert ved formlene: (i) -Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-; (ii) -Lys-Gly-Thr-His-Gly-Gly-Thr-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-; (iii) -Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-; (iv) -Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly- ; (v) -Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-; (vi) -Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-; (vii) -Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-; (viii) -Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-;

farmasøytisk akseptable salter derav og antigenisk beslektede varianter derav.

Det skal bemerkes at en strek ved begynnelsen eller enden av en aminosyrerestsekvens indikerer en binding til et radikal slik som H og OH, ved amino- eller carboxyendene, eller en ytterligere sekvens av én eller flere aminosyrerester opp til totalt 40 aminosyrerester i poly-peptidkjeden.

Også særlig foretrukne er de tilsvarende polypeptider i seg selv, dvs. polypeptid P60, P27, P62, F14, F15 og F16 vist i tabell 1 og Dl og D2 vist i tabell 2, og de farma-søytisk akseptable salter derav og antigenisk beslektede varianter derav. Polypeptid P62 anvendes her illustrativt som et eksempel på de særlig foretrukne polypeptider. Polypeptid P62 er enkelte ganger angitt som P62, peptid P62, EBNA P62 og lignende, med den forståelse at enhver betegn-else som innbefatter "P62", refererer til dette materiale. Ordene "peptid" og "polypeptid" anvendes her om hverandre.-=»

Uttrykket "farmasøytisk akseptable salter" som anvendt her, angir ikke-toksiske alkalimetall-, jordalkali-metall- og ammoniumsalter anvendt innen den farmasøytiske industri, innbefattende natrium-, kalium-, lithium-, calcium-, magnesium- og ammoniumsalter og lignende som fremstilles ved velkjente metoder innen faget. Uttrykket innbefatter også ikke-toksiske syreaddisjonssalter som generelt fremstilles ved omsetning av forbindelsene ifølge oppfinnelsen med en egnet organisk eller uorganisk syre. Representative salter innbefatter hydrokloridet, hydro-bromidet, sulfatet, bisulfatet, acetatet, oxalatet, valer-atet, oleatet, lauratet, voratet, benzoatet, lactatet, fos-fatet, tosylatet, citratet, maleatet, fumaratet, succinatet, tartratet og lignende.

I en annen foretrukket utførelsesform tar foreliggende oppfinnelse i betraktning et polypeptid inneholdende minst ca. 15 til ikke mer enn 40 aminosyrerester med en sekvens homolog (tilsvarende) med sekvensen av EBNA eller det CMV-kodede polypeptid vist i figur 13 og innbefattende den tidligere beskrevne formel -Gly-R 1 -Gly-R 2-Gly-. EBNA-homologe og CMV-homologe peptider ifølge oppfinnelsen er ytterligere karakterisert ved å ha evne til å immunreagere med anti-EBNA-antistoffer.

2. Størrelse

Effekten av å forandre størrelsen av det syntetiske polypeptid på dets evne til å bli bundet av anti-EBNA-antistof f er, ble undersøkt. Det ble generelt funnet at ettersom polypeptidstørrelsen avtok, avtok også dets evne til å bli bundet av antistoffer.

Polypeptid p62 består av 20 aminosyrerester av hvilke de første 9 rester fra aminoenden er direkte gjentatt som vist i tabell 2 under anvendelse av enbokstavs-koden for aminosyrerester. En serie av polypeptider homologe med P62, ble syntetisert hvori aminosyrerest-triader ble utelatt fra aminoenden av det foregående peptid under dannelse av polypeptid Dl, D2 og D3 som vist i tabell 2 i det etterfølgende. Økende deler av sekvenssymmetrien av P6 2 er derfor manglende i polypeptid Dl, D2 og D3.

4k Polypeptidsekvenser under anvendelse av enbokstavskode er vist i retningen fra venstre til høyre og fra aminoenden til carboxylenden.

<*> Foreningen av 9-mer direkte gjentagelse i polypeptid P62.

Evnen hos D-serien av polypeptid til å immunreagere med 3 humane anti-EBNA-sera og kanin-anti-P62-serum ble studert under anvendelse av polypeptidene i fast fase av ELISA, beskrevet i det etterfølgende. Antistoffbinding til Dl var tilnærmet den samme som den til moder-polypeptidet P62 for alle de testede sera. Derimot var det ingen binding til fast-fase-D3 for noe serum bortsett fra kanin-anti-P62. Resultatene for D2 var mellomliggende og var avhengige av det testede serum. Antistoffgjenkjennelse av denne serie av polypeptider var således nedsatt ettersom polypeptidlengden var forkortet fra 20 til 11 aminosyrerester.

Det faktum at antistoffbinding falt fra for alle antisera, taler mot muligheten for at en spesifikk, antigenisk determinant var blitt utelatt ved den sekvensvise eliminering av aminosyrerester da polypeptidene inneholdt to antigeniske determinanter hvorav bare én var påvirket av sekvensvise utelatelser. Også den sekvensvise symmetri av P62 sikret at alle sekvenser på fire til åtte aminosyrerester som var til stede i P62, også var til stede i D3, med unntak av de som krysser forbindelsen for gjentagelsen.

Strukturelle forandringer i polypeptidene bundet til den faste bærer i ELISA, kan ha bidratt til undertrykkelsen av antistoffgjenkjennelse. Denne mulighet ble studert ved inhibering av bindingen (immunreagering) av flere sera til fast-fase-bundet P62 ved anvendelse av varierende konsentrasjoner av konkurrerende polypeptider i oppløsning. Anti-seraene ble blandet og opprettholdt (inkubert) med polypeptid P62, Dl, D2 eller D3 i oppløsning i en på forhånd bestemt tid tilstrekkelig for at immunreaksjon (binding) kunne finne sted før de ble tilsatt til en mikrotiterplate belagt med P62. Resultatene av denne studie med sera fra fem pasienter er oppført i tabell 3 i det etterfølgende.

*

ELISA-prosedyren anvendt for disse bestemmelser, er beskrevet heretter i avsnitt II E(2) og III\D.

Den inhiberende virkning av polypeptid Dl på anti-stof fbindingen til P62 betraktes som å ikke kunne skjelnes fra den inhiberende effekt av P62 i seg selv. Dette er tilfelle for alle testede sera.

Mer interessant inhiberte polypeptid D3 enkelte av seraene VM og N6 omtrent like godt som de større polypeptider gjorde. Denne sterke, inhiberende effekt oppsto til tross for det faktum at ingen av disse sera utviste noen binding til D3 bundet til den faste bærer i ELISA-en. Disse data er antatt å indikere at polypeptidet må være av en viss minimumslengde, minst ca. 15 aminosyrerester, for å opprettholde nødvendig sekundærstruktur når det bindes til plastoverflaten av en mikrotiterplate. For fast-fase-bestemmelser er således en peptidlengde på ca. 15 til ca. 40 rester foretrukket, hvor en lengde på 15 til 20 rester er mer foretrukket.

Den minimale antigenstørrelse som er nødvendig for gjenkjennelse, ble ytterligere studert under anvendelse av polypeptid A5, A6, A7, A8 og A9. Som vist i tabell 2, har polypeptid A5 fem aminosyrerester, og hvert medlem av serien A6-A9 hadde økt i lengde med én aminosyrerest i forhold til det foregående polypeptid opp til de ni rester tilstedeværende i A9. Intet testet antiserum immunreagerte med disse polypeptider når de var bundet til mikrotiterplater i ELISA-en beskrevet i det etterfølgende.

Dataene for evnen til polypeptidene av A-serien til å inhibere binding av humane anti-EBNA-antistoffer til fast-fase-P62, er vist i tabell 4 i det etterfølgende.

Disse studier ble utført som beskrevet for tabell 3.

Praktisk talt alle testede sera ble inhibert med A9 selv om meget høye konsentrasjoner var nødvendig (mer enn 100 ganger høyere enn konsentrasjonene av P62 eller Dl som var nødvendig for ekvivalent inhibering). I tillegg immunreagerte tre sera med og ble inhibert av A8 og én av A7. Ingen ble inhibert av de kortere polypeptider A6 og A5.

Nedsettelsen i immunreaktivitet som parallelliserer en nedsettelse i polypeptidstørrelse, synes således å skyldes to effekter: (1) effekten av utelatelse av sete på antigenet til hvilket antistoffet bindes som vist ved polypeptidene av A-serien, og (2) forandringen i struktur av polypeptidet ettersom dets størrelse reduseres som vist ved polypeptidene av D-serien. =

3. Struktur

De strukturmessige egenskaper av polypeptidene ifølge oppfinnelsen ble studert under anvendelse av sirkulær dikroisme-(CD) spektroskopi. CD-spektrene av polypeptid P27, P60, P62, F13, F15 og F16 ble bestemt. Dataene, delvis vist i figur 1, indikerer at polypeptidene ifølge oppfinnelsen som innbefatter både de foretrukne aminosyrerestsekvenser, dvs.

-Gly-R<1->Gly-R<2->Gly-

1 2

hvori R og R er som tidligere definert, og

-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-

antar en relativt stabil sekundærstruktur eller tilpasning i en fysiologisk løsning ved 20°C. Da den dominerende struktur av disse polypeptider er relativt stabil, er det antatt at human anti-EBNA-antistoffaktivitet oppstår i respons på denne bestemte struktur.

B. Multimerer

Foreliggende oppfinnelse tar også i betraktning et multimert polypeptid (multimer) inneholdende et flertall av forbundne, vilkårlige copolymer-polypeptid-repeterende enheter hvori minst én av de repeterende enheter er et polypeptid som her beskrevet.

Multimerene ifølge oppfinnelsen, alene eller kjedet til en bærer, er når de innføres i en effektiv mengde i en pattedyrvert, i stand til å fremkalle produksjonen av antistoffer som bindes til EBNA. Særlig foretrukne multimerer er de som inneholder et CMV-homologt polypeptid ifølge oppfinnelsen som er i stand til å binde humane antistoffer

fremkalt av EBNA.

Således er multimerene ifølge oppfinnelsen, som deres konstituent-polypeptider, immunogeniske og er antigeniske overfor humane anti-EBNA-antistoffer. Disse multimerer kan derfor anvendes for å fremkalle produksjon av anti-EBNA-antistoffer som er anvendbare i diagnostiske metoder og systemer diskutert i det etterfølgende, og kan 3 også anvendes som et antigen i egnede, diagnostiske metoder og systemer.

Multimerer som inneholder færre enn ca. 35 aminosyrerester i den totale multimer, er typisk kjedet til en bærer for anvendelse som et immunogen. De multimerer som inneholder mer enn totalt ca. 35 aminosyrerester, er typisk tilstrekkelig immunogeniske til å anvendes uten en bærer.

Polypeptidmultimerer kan fremstilles ved sammenbind-ing av polypeptidmonomerene i en hode-til-hale-måte under anvendelse av den tidligere.angitte fast-fase-metode, dvs. en komplett polypeptidsekvens kan syntetiseres på harpiksen etterfulgt av én eller flere av de samme eller forskjellige polypeptidsekvenser, hvor den hele multimere enhet deretter spaltes fra harpiksen og anvendes som her beskrevet. Slike hode-til-hale-polypeptidmultimerer inneholder fortrinnsvis 2 til 4 polypeptidrepeterende enheter.

Alternativt kan multimerer fremstilles som en polymer av vilkårlige copolymer-polypeptider anvendt som monomerer. Som anvendt her, er uttrykket "polymer" i dets forskjellige grammatikalske former definert som en type av multimer som inneholder et flertall av vilkårlige copolymer-polypeptid-repeterende enheter som er bundet sammen ved annet enn peptidbindinger.

En eksempelvis polymer ifølge oppfinnelsen kan syntetiseres under anvendelse av polypeptidmonomerene ifølge oppfinnelsen som inneholder adderte cysteinrester ved både amino- og carboxylendene (diCys-polypeptid). diCys-polypeptidmonomerene kan bindes sammen ved intramolekylære, interpolypeptidcystein-disulfidbindinger under anvendelse av en oxydasjonsprosedyre under dannelse av en immunogenisk, antigenisk polymer. Den således fremstilte polymer inneholder et flertall av de vilkårlige copolymer-polypeptider ifølge oppfinnelsen som repeterende enheter. Disse repeterende enheter er bundet sammen ved de ovenfor diskuterte, oxyderte cystein- (cystin) rester.

Nærværet av én eller to terminale Cys-rester i et polypeptid ifølge oppfinnelsen for det formål å binde polypeptidet til en bærer eller for fremstilling av en polymer, skal ikke betraktes som en forandring av aminosyresekvensen av polypeptidrepeterende enheter ifølge oppfinnelsen.

E. Diagnostiske bestemraelsessystemer og metoder

Polypeptidene, antistoffene og antistoffkombinerende seter (reseptorer) dannet mot de tidligere beskrevne polypeptider, og metoder ifølge foreliggende oppfinnelse kan også anvendes for diagnostiske tester slik som immunbestemmelser. Slike diagnostiske teknikker innbefatter f.eks. enzym-immunbestemmeIse, enzym "multipled" immunbestemme1ses-teknikk (EMIT), enzymkjedet immunosorbentbestemmelse (ELISA), radioimmunbestemmelse (RIA), fluorescens-immunbestemmelse, enten enkle eller doble antistoffteknikker, og andre teknikker hvori enten reseptoren eller antigenet er merket med et påvisbart merke eller indikerende middel. Se generelt Maggio, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Cleveland, Ohio

(1981); og Goldman, M., Fluorescent Antibody Methods, Academic Press, New York, N.Y. (1980). Spesifikke eksempler på slike bestemmelsesmetoder og systemer anvendbare ved ut-førelse av disse metoder, er diskutert i det etterfølgende.

1. Bestemmelser av EBNA

En metode for bestemmelse av nærværet av EBNA i en kroppsvæske er også tatt i betraktning her. I en generell metode tilveiebringes en kroppsvæske som skal bestemmes, og blandes med reseptormolekyler som inneholder et antistoffkombinerende sete dannet mot et vilkårlig copolymer-polypeptid ifølge oppfinnelsen. Blandingen opprettholdes i et på forhånd bestemt tidsrom tilstrekkelig for at reseptormolekylene får immunreagere med EBNA tilstedeværende i kroppsprøven. Graden av denne immunreaksjon måles deretter for å bestemme hvorvidt EBNA-molekyler var til stede eller fraværende i den undersøkte kroppsprøve.

Et illustrativt diagnostisk system i settform som utgjør én side ved foreliggende oppfinnelse, som er anvendbart for påvisning av EBNA tilstedeværende i en aliquot av en kroppsprøve, inneholder reseptormolekyler ifølge oppfinnelsen slik som antistoffer, hovedsakelig hele antistoffer, eller antistoffkombinerende seter slik som Fab eller F(ab')2~antistoffdeler dannet mot et polypeptid ifølge oppfinnelsen i en forpakning. Dette system innbefatter også

et indikerende middel for signalisering av nærvær av en immunreaksjon mellom reseptoren og antigenet.

Typisk innbefatter indikerende midler radioisotoper slik som 125 I og <131>I, enzymer slik som alkalisk fosfatase, pepperrotperoxydase, (3-D-galactosidase og glucoseoxydase,

og fluorkrom-fargestoffer slik som fluorescein og rhodamin. De indikerende midler kan være kjedet direkte til reseptoren ifølge oppfinnelsen. De indikerende midler kan også være kjedet til et separat molekyl slik som til et andre antistoff, til et antistoffkombinerende sete eller til Staphylo-coccus aureus (S. aureus) protein A som reagerer med

(bindes til) reseptoren ifølge oppfinnelsen. Et spesifikt eksempel på et slikt separat molekyl-indikerende middel er 125

I-merket S-aureus protein A.

De indikerende midler muliggjør at immunreaksjonsproduktet kan påvises og forpakkes separat fra reseptoren når de ikke er kjedet direkte til en reseptor ifølge oppfinnelsen. Blandet med en kroppsprøve slik som en aceton-fiksert, perifer blodlymfocytt- (PBL) flekk, immunreagerer reseptormolekylet med EBNA under dannelse av en immunreaktant, og det tilstedeværende, indikerende middel signaliserer deretter dannelse av immunreaksjonsproduktet.

En utførelsesform av en EBNA-diagnostisk metode er en immunfluorescent bestemmelse som innbefatter et forsterkningsreagens. I en slik bestemmelse aceton-festes en PBL-flekk til et klart mikroskopglass. En aliquot av antistoffer dannet i henhold til oppfinnelsen, f.eks. dannet i kaniner, generelt ca. 10 mikrogram til ca. 500 mikrogram, bringes i kontakt med glasset under anvendelse av velkjente teknikker.

Etter bortskylling av ethvert ikke-immunreagert antistoff ifølge oppfinnelsen blokkeres typisk ethvert ikke-spesifikt bindingssete på glasset med et protein slik som kvegserumalbumin (BSA), om ønsket. Et andre reagens (forsterkningsreagens) slik som komplement, eller anti-immunglobulin-antistoffer, f.eks. marsvinkomplement, kan deretter inkuberes på testglasset.

Etter denne andre inkubering fjernes ethvert uomsatt forsterkningsreagens ved skylling under dannelse av det so» er bundet til de førstnevnte antistoffer på prøveglasset.

Et tredje reagens (indikerende middel), f.eks. antistoff, slik som geite-anti-marsvinkomplement, inkuberes deretter på testglasset. Det tredje reagens merkes ved å kjedes til et fluorkromfargestoff slik som fluorescein-isothiocyanat (FITC), rhodamin B-isothiocyanat (RITC), tetramethylrhodamin-isothiocyanat (TRITC), 4,4*-diisothiocyanostilben-2, 2' - disulfonsyre (DIDS), og lignende, hvilket er velkjent innen faget.

Ethvert uomsatt tredje reagens skylles av etter denne tredje inkubering under dannelse av FITC-merket geite-antimarsvinkomplement-antistoffer som binder til komplementet på testglasset. Nærvær av FITC-merket tredje reagens kan påvises under anvendelse av fluorescensmikroskopi og derved signaliserer nærvær av EBV-infeksjon.

B-lymfocytter kjent for å være infisert med EBV,

ble testet med hensyn til nærvær av EBNA under anvendelse av immunfluorescensbestemmelsesmetoden beskrevet ovenfor og mer i detalj i avsnittet Materialer og metoder III. Kanin-antistoffer dannet mot hvert av polypeptidene vist i tabell 1, var i stand til å påvise EBNA i EBV-infisert cellelinje WI-L2.

Et foretrukket diagnostisk system, fortrinnsvis i settform, anvendbart for utførelse av den ovenfor beskrevne bestemmelsesmetode, innbefatter i separate forpakninger,

(a) reseptorer (antistoffer) ifølge oppfinnelsen som immunreagerer med EBNA, (b) et andre, forsterkende reagens slik som komplement, slik som marsvinkomplement, anti-immunglobulin-antistoffer eller S. aureus protein A som reagerer med reseptoren, og (c) et indikerende middel som kan kjedes

direkte til forsterkningsmidlene eller kan være en del av et separat molekyl slik som et antistoff eller en antistoff-del som reagerer med forsterkningsreagenset. Det indikerende middel signaliserer indirekte immunreaksjonen av reseptormolekylet og EBNA via formidlingen av forsterkningsreagenset.

Reseptormolekyler og separate, indikerende midler av et hvilket som helst diagnostisk system beskrevet her, såvel som det ovenfor beskrevne forsterkningsreagens, kan tilveiebringes i oppløsning, som en væskedispersjon eller som et hovedsakelig tørt pulver, f.eks. i lyofilisert form. Hvis det indikerende middel er et separat molekyl adskilt fra forsterkningsreagenset, foretrekkes det at det indikerende middel forpakkes separat. Hvor det indikerende middel er et enzym, kan enzymets substrat også være tilveiebrakt i en separat forpakning av systemet. En fast bærer slik som det ovenfor beskrevne mikroskopglass, én eller flere buffere og aceton, kan også være innbefattet som separate forpak-ningselementer i dette diagnostiske bestemmelsessystem.

Forpakningene diskutert her i forbindelse med diagnostiske systemer, er de som vanligvis anvendes i diagnostiske systemer. Slike forpakninger innbefatter glass og plast-(f.eks. polyethylen, polypropylen, polystyren og polycarbonat) flasker, ampuller, plast og plastfolie-laminerte konvolutter og lignende.

Anvendelse av hele, intakte, biologisk aktive antistoffer er ikke nødvendig i mange diagnostiske systemer slik som den ovenfor beskrevne immunfluorescensbestemmelse. Snarere kan bare det immunologisk aktive, idiotypeholdige, antigenbindende og gjenkjennende reseptorsete; dvs. det antistoffbindende sete, av antistoffmolekylet anvendes. Eksempler på slike antistoffkombinerende seter er de som er kjent innen faget som Fab og F(ab')2-antistoffdeler som fremstilles ved proteolyse under anvendelse av papain og pepsin, som er velkjent innen faget.

2. Bestemmelser av anti- EBNA- antistoffer (a) Bestemmelser generelt

En annen diagnostisk metode ifølge oppfinnelsen er en bestemmelse slik som en ELISA som påviser anti-EBNA-antistof f er i en antistoffholdig væskekroppsprøve. Her anvendes et EBV-homologt eller CMV-homologt polypeptid ifølge oppfinnelsen slik som polypeptid P62, Cl, C2, C3 som et antigen, og bindes fortrinnsvis til (adsorberes til) eller på annen måte kjedes eller festes til en fast matriks slik som det tverrbundne dextran tilgjengelig under varemerket "Sephadex" fra Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, New Jersey), agarose, glassperler, polyvinylklorid, polystyren, tverrbundet acrylamid, nitrocellulose, brønnene av en mikrotiterplate eller overflaten av en dyppestift eller

-skje, under dannelse av en fast bærer.

Det EBV- eller CMV-homologe polypeptid blandes med den væskeformige kroppsvæske som skal bestemmes. Den således dannede immunreaksjonsblanding opprettholdes i en på forhånd bestemt tid tilstrekkelig for at ethvert anti-EBNA-antistof f tilstedeværende i kroppsprøven, får immunreagere med polypeptidene. Nærværet av denne immunreaksjon bestemmes deretter med et indikerende middel for å signalisere nærværet av anti-EBNA-antistoffer i den bestemte kroppsprøve.

En eksempelvis ELISA som gjør bruk av den ovenfor angitte metode, anvender en fast bærer omfattet av et EBV-eller CMV-homologt polypeptid ifølge oppfinnelsen adsorbert (festet) på en fast matriks, hver som brønnene av en 12 eller 96 brønns mikrotiterplate fremstilt av polystyren eller polyvinylklorid, av en opak, dobbeltbrønnet plastskje som beskrevet heretter i avsnittet Materialer og metoder og lignende. Ikke-spesifikke bindingsseter på den faste matriks blokkeres deretter typisk med et protein som ikke innbefatter en sekvens til hvilken anti-EBNA-antistoffene bindes eller immunreagerer slik som kvegserumalbumin (BSA). Ubundet polypeptid og BSA fjernes fra matriksen slik som ved skylling.

Et kroppsprøvealiquot slik som humant spytt, serum, blod eller plasma blandes med den ovenfor beskrevne, faste bærer under dannelse av en immunreaksjonsblanding inneholdende faste og væskeformige faser. Den faste/væskeformige faseblanding opprettholdes i et tidsrom (f.eks. 2-60 minutter) tilstrekkelig til at ethvert anti-EBNA-antistoff i kroppsprøven får immunreagere med polypeptidantigenet og danne en fast-fase-bundet immunreaktant. De faste og væskeformige faser separeres generelt deretter.

En oppløsning av et andre, merket, indikerende middel-holdig antistoff, antistoffkombinerende sete eller S. aureus protein A som reagerer med det førstnevnte, anti-EBNA-antistof f , blandes deretter med den faste fase under dannelse av en annen eller andre fast/væskeformig fase immunreaksjonsblanding. Et eksempelvis andre antistoff er et pepperrotperoxydase (HRPO)-merket geite-anti-humant Ig-antistoff hvor de førstnevnte antistoffer er fra en human kroppsprøve. I tillegg innbefatter anvendbare enzymmerker alkalisk fosfatase, (3-D-galactosidase og glucoseoxydase. Blandingen dannet fra den faste fase og den andre, merkede antistoffløsning, opprettholdes (inkuberes) i et på forhånd bestemt tidsrom (f.eks. 2-30 minutter) tilstrekkelig til å danne en andre, fast-fase-bundet immunreaktant mellom det førstnevnte antistoff og den indikerende middel-holdige enhet slik som en immunreaksjon mellom de to antistoffer. Den faste og væskeformige fase separeres deretter.

Det andre antistoff beskrevet ovenfor, kan også være spesifikt for å immunreagere med bare én av immunglobulin-klassene (f.eks. IgG, IgM, IgE, IgA eller IgD) slik som murine anti-IgG, anti-IgM eller anti-IgA monoklonale antistoffer eller deres kombinerende sete-hoIdige deler. Slike antistoffer tilveiebringer evnen til å identifisere immun-globulinklassen av anti-EBNA-antistoff tilstedeværende i kroppsprøven, slik som vist i tabell 6-10 i det etterfølg-ende. I tillegg kan det andre antistoff eller antistoffkombinerende sete være spesifikt for å immunreagere med bare én av de to typer av immunglobulin-lettkjeder (f.eks. kappa eller lambda). Disse antistoffer tilveiebringer evnen til å identifisere isotypen av immunglobulinmolekylet tilstedeværende i kroppsprøven.

En løsning inneholdende et substrat for enzymmerket slik som hydrogenperoxyd for peroxydase og en fargedannende fargeforløper slik som o-fenylendiamin eller p-nitrofenylfosfat for alkalisk fosfatase, blandes deretter med den faste fase, og denne blanding opprettholdes i et annet på * forhånd valgt tidsrom. Den optiske densitet ved en på forhånd valgt bølgelengde (f.eks. 490 eller 405 nanometer) kan deretter bestemmes etter at det på forhånd bestemte tidsrom har forløpt (f.eks. 60 minutter), og sammenlignes med den optiske densitet av en kontroll for å bestemme hvorvidt anti-EBNA-antistoffer var tilstedeværende i kroppsprøven.

I en annen utførelsesform av den ovenfor angitte bestemmelse anvendes to faste bærere. Hver fast bærer omfatter et EBV-homologt, vilkårlig copolymer-polypeptid festet til en fast matriks.

En første aliquot at en pasients væskekroppsprøve slik som blod, plasma eller serum, blandes med den første, faste bærer under dannelse av en fast/væskefaseblanding. Blandingen opprettholdes i et på forhånd bestemt tidsrom (f.eks. 2 til 30 minutter) tilstrekkelig til at ethvert anti-EBNA-antistoff tilstedeværende i prøven, får immunreagere med polypeptidet og danne en fast-fase-bundet immunreaktant inneholdende anti-EBNA-antistoffene. Analoge trinn utføres med en andre aliquot av pasientens væskekroppsprøve og den andre faste bærer. Selvsagt kan den første og andre aliquot blandes med deres respektive fast-fase-bærere i en hvilken som helst rekkefølge eller hovedsakelig samtidig.

Etter separering av de faste og væskeformige faser som resulterer fra de ovenfor angitte blande- og opprett-holdelsestrinn, blandes den første, faste bærer og ethvert fast-fase-bundet anti-EBNA-antistoff tilstedeværende i dets immunreaktant i et vandig væskemedium med merkede anti-humane IgG-antistoffer. Denne blanding opprettholdes i et tidsrom tilstrekkelig til at anti-IgG-antistoffene får immunreagere med ethvert tilstedeværende fast-fase-bundetv humant IgG-antistoff. Den andre faste bærer og ethvert tilstedeværende fast-fase-bundet antistoff blandes på lignende måte og opprettholdes med merkede anti-humane IgM-antistoffer.

Deretter bestemmes de relative mengder av merkede anti-IgG- og anti-IgM-antistoffer. Som senere angitt i forbindelse med tabell 6-10, indikerer nærværet av en relativt større mengde av merket anti-IgM enn anti-IgG at pasienten^er i den akutte tilstand av EBV-IM-infeksjon, mens en relativt større mengde av tilstedeværende, merket anti-IgG enn anti-IgM indikerer at pasienten er i en rekonvalesent tilstand av sykdommen. Ca. ekvimolare mengder av anti-IgM og anti-IgG indikerer at pasienten går fra den akutte til rekonvalesente tilstand.

En annen utførelsesform av oppfinnelsen omfatter et diagnostisk system i settform som innbefatter en fast bærer omfattet av en fast matriks slik som en polystyren tolv-brønns mikrotiterremse eller dobbeltbrønnet "skje", og et EBV- eller CMV-homologt polypeptid ifølge oppfinnelsen, adsorbert (bundet) eller på annen måte festet til den faste matriks under dannelse av en fast matriks. Dette system innbefatter fortrinnsvis også separat forpakkede anti-humane Ig-antistoffer som har et bundet, indikerende middel slik som peroxydase-merkede geite-anti-humane Ig-antistoffer, og kan også innbefatte substrat for det kjedede, indikerende middel slik som hydrogenperoxyd og en fargedannende farge-forløper slik som o-fenylendiamin, i ytterligere separerte forpakninger. Disse anti-humane Ig-antistoffer kan være antistoffer som immunreagerer spesifikt bare med humant IgM, IgG, IgA eller IgE eller med alle humane antistoffer som tidligere angitt. Stabilisert hydrogenperoxyd kan også være innbefattet i settet, eller kan tilføres av brukeren. Buffersalter anvendbare i en bestemmelse under anvendelse av dette system, kan også være innbefattet i én eller flere separate forpakninger i tørr eller væskeform. Separate forpakninger inneholdende humane anti-EBNA-antistoffer og humane antistoffer frie for anti-EBNA-antistoffer (normale, humane antistoffer) kan også være innbefattet som positive og negative kontroller. Mengder av de ovenfor angitte bestanddeler som er tilstrekkelig for å utføre minst én bestemmelse, er innbefattet i settet, og en bestemmelse med hensyn til nærvær av anti-EBNA-antistoffer i en kroppsprøve slik som serum,

kan utføres med dette diagnostiske system under anvendelse av den ovenfor beskrevne metode.

TS.

(b) Bestemmelse av EBV- IM

En eksempelvis ELISA lik den som er beskrevet tidligere og beskrevet i detalj i avsnittet Materialer og metoder (III), ble anvendt for å utsortere med hensyn til nærværet av anti-polypeptid-immunglobulin i sera fra 91 mennesker med anti-EBNA-positive serotyper fastslått under anvendelse av anti-komplement-immunfluorescens (ACIF) som beskrevet tidligere. Når seraene ble bestemt ved en 1:20 fortynning, var alle 91 positive mot (bundet til) polypeptid P27, P62, P60 og F16, F14 og F15. Selv ved den høyere fortynning på 1:320 immunreagerte 83 av de 91 EBNA-positive sera med polypeptid P62 ved ELISA-en. Således synes det å være en glimrende korrelasjon mellom anti-EBNA-antistofftiteren fastslått ved ACIF og antipeptidaktiviteten av hvert serum.

I tillegg illustrerer resultatene en glimrende korrelasjon mellom ACIF-metoden og foreliggende ELISA-teknikk som er enklere og lettere å anvende. Enn videre illustrerer resultatene anvendbarheten av polypeptidene ifølge oppfinnelsen ved en diagnostisk bestemmelse av anti-EBNA-antistof fer .

Tabell 5 i det etterfølgende viser reaktiviteter av sera erholdt fra to personer (SB og MV) før og etter EBV-fremkalt, infeksiøs mononukleose (IM; dvs. EBV-IM). I begge tilfeller var antistoffer som binder til polypeptid P27, P62 og P60, fraværende før infeksjon, men fremkom etterpå. Derimot ble ingen antistoffer dannet av noen av disse individer som bandt seg til polypeptid P89.

I en ytterligere studie ble lagret sera fra et tidligere rapportert panel av 27 EBV ikke-immune donorer

[Catalano et al., J. Clin. Invest., 65:1238-1245 (1980)]

undersøkt med hensyn til binding til polypeptid P62 og P60

i den ovenfor beskrevne ELISA. EBV-immunstatusen av de anvendte sera var definert ved nærvær eller fravær av Epstein-Barr viralt kapsid-antigen (VCA). Individer som ikke hadde noen serumantistoffer mot VCA (VCA~), var aldri blitt infisert med EBV. VCA-positive (VCA<+>) individer hadde hatt EBV-infeksjoner og bærer typisk et lavt nivå av anti-EBNA-antii» stoffer. Ingen av seraene utviste signifikant reaktivitet til noe polypeptid, hvilket fremgår fra tabell 5 i det etter-følgende.

Alle sera ble testet ved en fortynning på 1:20.

<2> Optisk densitet målt ved 40 nanometer lysbølgelengde etter 30 minutters substratinkubasjon. <3> VCA +-sera fra individer som ikke viste noen kliniske

tegn på tilstedeværende EBV-relatert sykdom.

Sera fra 27 individer som ikke viste noen kliniske tegn på EBV-relatert sykdom, tidligere eller nåværende,

som indikert ved fravær av antistoffer mot VCA.

<5> Midlere optisk densitet + - ett standardavvi.k.

<6> Ikke foretatt.

For å undersøke korrelasjonen mellom ELISA og ACIF-diagnoseteknikken under infeksjonsforløpet ble lagrede sera fra 8 videregående studenter, oppsamlet sekvensvis etter starten av infeksiøs mononukleose (IM), undersøkt ved den tidligere beskrevne ELISA under anvendelse av polypeptid P62. Alle studenter utviklet anti-EBNA-titere fra 1 måned til ett år etter infeksjon som målt ved den klassiske metode, dvs. ACIF. Henie et al., J. Infect. Dis., 130:231-239 (1974).

I halvparten av personene steg anti-P62-antistoffene parallelt med den tilsvarende anti-EBNA-titer som vist for pasient 15 i figur 4. I den andre halvpart ble antistoffer mot polypeptid P62 påvist i den første måned etter starten av symptomene, mens disse antistoffer ble påvist ved senere tidspunkter under anvendelse av ACIF-teknikken. Disse resultater er vist for pasient 14 og 2 i figur 5. Anti-P62-antistoffer var derfor påvisbare under anvendelse av ELISA-en ifølge oppfinnelsen før anti-EBNA-antistoffer var påvisbare ved standard anti-komplement-immunfluorescensbestemmelsen.

For å differensiere klassen av immunglobulin som hovedsakelig er ansvarlig for et individs immunrespons ved et gitt tidsrom under forløpet av infeksiøs mononukleose, ble sekundære (indikerende) antistoffer spesifikke for humant IgG eller IgM, anvendt i ELISA-en som beskrevet i avsnittet Metoder og materialer (III) . Tabell 6 i det etterfølgende viser resultatene av denne studie med sera fra to individer fra forskjellige tidspunkter under EBV-infeksjon målt mot polypeptid P62 i ELISA.

Pasient IgM-nivå påvist under anvendelse av et andre

antistoff spesifikt for humant IgM.

<2> Pasient IgG-nivå påvist under anvendelse av et andre antistoff spesifikt for humant IgG.

<3> Optisk densitet målt ved 405 nanometer lysbølgelengde.

4

Ikke foretatt.

Under anvendelse av denne ELISA-metode er stigningen i IgM-antistoffverdier, selv om den er liten, gjentagbar og finnes i alle de testede, sekvensvise sera. Immunresponsen målt ved ELISA-bestemmelsen, er normal ved at IgM klassisk fremkommer før IgG under EBV-infeksjonen. Tilsynekomsten av IgM-antistoffer før IgG-antistoffer vises særlig for pasient 15 i tabell 6. De ovenfor angitte resultater viser igjen at infeksjon med EBV forårsaker produksjon av antistoffer som reagerer med minst ett polypeptid ifølge oppfinnelsen.

I en større anti-polypeptid ELISA-studie ble panelet av 19 VCA~-sera beskrevet tidligere, undersøkt mot polypeptid P27, P62, P60, F12, F13, F14, F15 og F16. Ingen av VCA~-seraene ble funnet å reagere positivt. Typiske data er vist i tabell 7 i det etterfølgende. Sera fra klinisk normale individer som er positive for VCA-antistoffer, ble testet ved to fortynninger. Typiske resultater vist i tabell 7 i det etterfølgende, indikerer at alle VCA<+->individene var positive for; dvs. hadde antistoffer som bandt seg til hvert av polypeptidene.

Seraene fra et utall av reumatoid artritt- (RA) ■* pasienter ble også undersøkt i ELISA-en. Disse resultater er også oppført i tabell 7.

Aktivitet målt som optisk densitet ved 405 nanometers

lysbølgelengde etter 30 minutters seruminkubasjon. VCA-negative individer.

<3> Fortynning ved hvilken seraene ble testet.

4

<4> VCA-positive individer.

^ Individer diagnostisert som å ha reumatoid artritt.

Forskjellen mellom de normale, VCA-positive (kontroll) og RA-pasienter kan best ses ved serumfortynningen 1:320. Antistoffnivåene i RA-pasienter var signifikant høyere for hvert polypeptid testet ved denne fortynning når de ble analysert under anvendelse av Wilcox Rank Sum-metoden (signi-fikansnivå større enn 99%).

Pasienter med Sjøgrens syndrom, systemisk Lupus Erythematosus (SLE) og progressiv systemisk sklerose (PSS) ble også undersøkt ved både høye og lave serumfortynninger. De eneste forskjeller som ble funnet mellom disse pasientgrupper og normale, var en relativt høyere, midlere titer stv PSS-pasientene overfor polypeptid P27, P62, P60, F16, F14 og F15. Disse resultater er antatt å muligens skyldes en tidligere EBV-beslektet infeksjon eller innbefattelse av EBV i disse autoimmune sykdommer. Disse data forringer ikke anvendbarheten av ELISA-en som en diagnostisk metode.

De relative mengder av IgM-og IgG-antistoffer kan således anvendes for å bestemme det relative trinn av sykdommen hos en pasient. I lys av (1) den tidligere illus-trerte faserespons av IgM-anti-EBNA-antistoffproduksjon som bygges opp og deretter faller, som overlappes og etterfølges tidsmessig ved oppbygning av IgG-anti-EBNA-antistoffproduksjon, og (2) det faktum at faseresponsen følger de normale tilsynekomstnivåer av IgM i et tidlig trinn av en sykdom etterfulgt av IgG i rekonvalesenstrinnet.

Således viser dataene i tabell 6 at under den tidlige, akutte fase av sykdommen er det en større mengde av anti-EBNA-IgM-antistoff til stede enn anti-EBNA-IgG-antistoff. Nivået av IgG begynner deretter å stige under rekonvalesensen, mens nivået av IgM faller, idet nivåene av begge krysser hverandre, dvs. forholdet mellom IgG og IgM blir én ved et visst tidspunkt mellom den akutte fase og rekonvalesensfasen.

Disse observasjoner er i overensstemmelse med de vanlige observasjoner for primærimmuniseringer og sykdoms-tilstander generelt [se f.eks. Hood et al., Immunology, The Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc., Menlo Park, CA,

(1978), s. 39-46; Mims og White, Viral Pathogenesis and Immunology, Blackwell Scientific Publications, Boston (19 84), s. 105-106, og Immunology, andre utg., Bach red., John Wiley & Sons, New York (1982), s. 337-339]. Disse observasjoner er i motsetning til situasjonen for anti-VCA IgM- og IgG-antistoffer hvori disse IgG-antistoffer er til stede i større mengder tidlig ved infeksjonen, f.eks. etter to dager, hvor IgM-antistoffene stiger, når en topp og faller til mindre nivåer over en periode på ca. 3 måneder, og for-svinner flere måneder etter akutt sykdom [Cecil, Textbook of Medicine, Beeson et al., red., W.B. Saunders Co., Phila-delphia, (1979), s. 264-268].

Disse observasjonene er også i enkelte henseender motsatt med observasjonene ifølge Henie et al., J. Infect. Dis., 130 ; 231-239 (1974). Disse forskere rapporterte tilsynekomst av lav-titer-anti-EBNA-antistoffer rundt 2-4 uker etter starten av sykdommen for noen få sera, med lave, men relativt høyere titere som kommer til syne fra den andre måned etter starten til slutten av deres studie 12 måneder etter starten for flere og flere av seraene ettersom tiden fra starten økte. Teknikkene anvendt av disse forfattere, var relativt ufølsomme og målte sannsynligvis bare IgG-antistof f er. Den påvisbare tilsynekomst av antistoffer under rekonvalesenstrinnet kunne således være forventet. Mere nylig rapporterte Adniman et al., kapittel 33 i Concepts in Viral Pathogensis II, Notkins og Oldstone, red., Springer-Verlag, New York (1986), s. 326, uten identifisering av antistoffklassen, at anti-EBNA-antistoffer vanligvis begynner å komme til syne én eller to måneder etter infeksjon.

Resultatene vist i tabell 6, er blitt forsterket for ytterligere å vise effektiviteten ved sammenligning av de relative mengder av IgG-og IgM-anti-EBNA-antistoffer for å tilveiebringe en diagnose for trinnet for EBV-IM; dvs. akutt eller rekonvalesens, under anvendelse av et polypeptid ifølge oppfinnelsen som et antigen for disse antistoffer. Enkelte av disse resultater er vist i Smith et al., J. Infect. Dis., 154:885-889 (1986, november), hvis beskrivelse er inkorporert ved referanse. Enkelte eksempelvise data fra denne publikasjon er vist nedenfor i tabell 8. OD 490 = optisk densitet ved 490 nanometer målt som diskutert i avsnittet Materialer og metoder III K.

<2> Sera fra heterofil-negative donorer.

<3> Serum fra en heterofil-positiv donor.

Resultatene i tabell 8 illustrerer igjen stigningen og fallet over tid av IgM-anti-polypeptidantistoffer, og hvis IgM-fall tilsvarer stigningen av IgG-anti-polypeptid- ■* antistoffer for pasienter som var både heterofil-negative og -positive ved starten av forsøksperioden. Antistoffer (IgM og/eller IgG) mot det virale kapsid-antigen av EBV (VCA) var til stede i alle bortsett fra én av serumprøvene under-søkt for totalt 13 pasienter i studien.

Sera fra én av de heterofil-negative pasienter og to av de tre heterofil-positive pasienter hadde relativt høyere IgG-anti-EBNA-polypeptidantistoffer etter starten av sykdommen. Imidlertid økte forholdet mellom IgG og IgM, selv om det i begynnelsen var større enn efi, med tidsforløpet for hver pasient: og serumprøvene viste en generell nedsettelse av IgM-anti-polypeptidantistoffnivået koplet med en for-sinket, overlappende stigning i IgG-anti-peptid-antistoffnivå. I alle de studerte pasientsera innevarslet et økende forhold av IgG-anti-polypeptidantistoff i forhold til IgM-anti-polypeptidantistof f som var til stede, gjenvinningsfasen av sykdommen når maksimale IgG-responser ble observert.

Serumprøver ble erholdt fra 19 individer som var enten klinisk diagnostisert som å ha IM, eller når kliniske data ikke var tilgjengelige, ble bestemt å inneholde heterofile antistoffer i deres sera. Disse prøver ble undersøkt under anvendelse av en ELISA-bestemmelse ifølge oppfinnelsen hvori polypeptid P62 ble anvendt som det fast-fase-bundne antigen. IgG-, IgM- og IgA-nivåene i disse sera ble bestemt, og nivåene av anti-EBNA IgG og IgM ble sammenlignet som et forhold. IgA-nivåene utviste ingen merkbar korrelasjon. Resultatene av denne bestemmelse av IgG og IgM er vist i tabell 9 i det etterfølgende.

^ OD 490 = optisk densitet ved 490 nanometer målt som

diskutert i avsnittet Materialer og metoder III K. Sera hadde relativt forhøyede IgA-nivåer; dvs. større enn en OD 490 på 0,300.

Dataene i tabell 9 viser igjen at sera fra pasienter med den aktive, akutte sykdom inneholdt relativt forhøyede nivåer av IgM-anti-EBNA-antistoffer som bandt seg til polypeptidantigenet sammenlignet med nivåer av IgG. Disse data viser også forhøyede nivåer av anti-EBNA-antistoffer sammenlignet med sera fra VCA~-pasienter som vist i tabell 5. Nærvær av neglisjerbare nivåer av IgG-anti-polypeptidantistoffer er overensstemmende med observasjonene ifølge Henie et al., J. Infect. Dis., 130:231-239 (1974).

Sera fra ca. 10% av akutte EBV-fremkalte tilfeller av IM mangler det heterofile antistoff som bestemt ved konvensjonell serologi. Da det heterofile antistoff og anti-EBNA-antistof f ene skal være beslektet, ble et utall av ytterligere sera fra heterofil-negative IM-pasienter analysert ved bestemmelsen anvendt i tabell 9. Resultatene er vist i tabell 10 i det etterfølgende. Disse pasienter var enten bekreftet klinisk eller ved konvensjonell EBV-serologi. å ha akutt IM. Hvert serum hadde positive VCA-IgM og EBV tidlige antigen-diffuse (EA-D) titere som i forbindelse med negative EBNA-titere (ved ACIF) vanligvis betraktes som kjennetegn for akutt IM uten hensyn til nærvær av heterofilt antistoff.

Se fotnote 1 i tabell 8.

<2> Hver serumprøve ble undersøkt og funnet å være positiv for VCA-IgM og EA-D, og negativ for EBNA-antistoffer med ACIF.

I alle de viste tilfeller var forholdet mellom IgG

og IgM i anti-EBNA-polypeptid-ELISA-en mindre enn 1,0 og også mindre enn 0,7. Det er tydelig fra disse data at anti-EBNA-polypeptid P62 ELISA er i stand til å påvise IM i heterofil-negative individer når IgG/IgM-anti-polypeptidforhold-diskriminatoren anvendes på ELISA-dataene.

En ytterligere illustrasjon av utløsning av nærvær

av heterofile antistoffer og IgM-anti-polypeptidantistoffer, og tidlig påvisning av anti-polypeptider tilveiebrakt ved en

bestemmelse ifølge oppfinnelsen, er vist ved dataene i tabell 11 i det etterfølgende. Disse data utskiller også dataene vist i figur 5 med hensyn til tidlig påvisning av disse antistoffer under anvendelse av en bestemmelse ifølge oppfinnelsen sammenlignet med ACIF.

Her ble 8 sett av parede sera undersøkt med en konvensjonell, kommersiell bestemmelse for heterofile anti- ■* stoffer og med anti-polypeptid P62 ELISA. I hvert tilfelle var den første serumuttrekning negativ ved den førstnevnte test, men positiv ved den sistnevnte. Individene utviste symptomer på IM ved tidspunktet for den første blodtagning. I disse individer fremkom således IgM-anti-polypeptid P62-antistoffer i sera før de heterofile antistoffer som fastslått ved konvensjonell serologi. I de første to tilfeller i tabellen var tidspunktet mellom blodtagningsdatoene 14 og 8 dager.

^ Se fotnote 1 i tabell 8.

<2> Den første serumuttrekning ble erholdt ved presentasjon av symptomer på akutt IM. Den andre uttrekning ble erholdt fra det samme individ en kort tid senere. Akutt IM ble bekreftet i hvert tilfelle ved det endelige nærvær

av heterofile antistoffer.

<3> Nærværet av heterofile antistoffer ble bestemt ved anvendelse av et kommersielt sett.

De tidligere beskrevne forholdsbestemmelser, selv om de har et kvalitativt aspekt ved at nærværet av anti-P62-antistoff bestemmes, anvendes primært for kvantitativt å fastslå relative mengder av anti-P62 IgM- og IgG-antistoffer tilstedeværende i den humane kroppsprøve. Denne primært kvantitative bestemmelse krever det normalt 2,5 time å ut-føre etter at fast-fase-bærerne er fremstilt.

Et mer kvalitativt forhold som krever litt mer enn

6 minutter å utføre etter fremstilling av fast-fase-bæreren, er også blitt utviklet. Denne bestemmelse anvender lignende metodologi og kjemi som de tidligere beskrevne bestemmelser, men bygger på en visuell sammenligning av fargeintensiteter fremkalt av et tidligere diskutert indikerende middel og substrat for å fastslå de relative mengder av anti-peptid P62 IgG- og IgM-antistoffer tilstedeværende i den undersøkte prøve, og således hvorvidt sykdomstilstanden er akutt, rekonvalesent eller går over fra akutt til rekonvalesent fase.

I foretrukne utførelsesformer er fast-fase-bæreren omfattet av en hvit, opak polystyren "skje"-matriks. Fast-fase-"skje"-matriksen er konstruert for å inneholde to til-støtende brønner til hvilke polypeptid P62 er festet. Brønnene er adskilt av en avsperring som virker til å forhindre væske fra én brønn å tre inn i den andre.

Bestemmelser av anti-IgM- og anti-IgG-antistoffer ut-føres separat som generelt beskrevet tidligere, men utføres her fortrinnsvis side ved side (én analyse for hver av antistofftypene i hver brønn) og hovedsakelig samtidig. Snarere enn å bestemme optiske densitetsverdier eller andre merkende indekser mekanisk, sammenligner i tillegg brukeren bare fargeintensitetene av hver brønn med det blotte øye.

Denne bestemmelse som krever mindre enn ca. 1/10 av tiden for den tidligere beskrevne bestemmelse, utviser like-vel en ekstremt høy spesifisitet og sensibilitet. I tillegg kan den lett tilpasses for bruk på et legekontor slik at lege og pasient kan få vite resultatene av bestemmelsen mens pasienten er på kontoret.

Ytterligere detaljer ved denne bestemmelse er tilveiebrakt i avsnittet Materialer og metoder III D.

(c) Bestemmelser av EBV- IM og CMV- IM

Det Epstein-Barr nukleære antigen inneholder en unik sekvens på over 200 aminosyrer som bare inneholder amino-syrene glycin og alanin. Peptider fremstilt fra disse sekvenser, er immunreaktive med sera fra VCA-positive individer som tidligere vist. Enn videre er et peptid fra denne sekvens, P62, mest immunreaktivt med sera fra pasienter med akutte EBV-infeksjoner [Rhodes et al., i Herpesvirus,

R. Rapp red., Alan R. Liss, New York, s. 487-496 (1984); Rhodes et al., J. Immunology, 134:211-216 (1985); Smith et al., J. Infect. Dis. 154:885-889 (1986); Geltosky et al.,

J. Clin. Lab. Analysis 1:153-162 (1987)]. Pasienter med akutt EBV-IM har IgM-antistoffer mot EBNA-proteiner i flere EBV-positive cellelinjer [Geltosky et al., J. Clin. Lab. Analysis 1: 153-162 (1987); Rhodes et al., J. Exp. Med. 165:1026-1040] påvist ved immunblotting.

Resultatene diskutert i det etterfølgende, illustrerer at sekvensvise sera ikke bare fra EBV-IM, men også fra cytomegalovirus (CMV)-fremkalte mononukleose-lignende sykdommer (CMV-IM), har IgM-antistoffer rettet mot EBNA P62-epitopene i den akutte fase av sykdommen. Sekvensvise serumprøver tatt fra 8 pasienter med akutt CMV-infeksjon, utviste alle en skarp stigning av IgM-anti-P62-antistoffer under den akutte sykdom. Denne samme respons ses både i pasienter med en tidligere EBV-infeksjon såvel som et individ som var infisert med CMV før EBV. Immunblotting av serumet fra både akutte EBV- og akutte CMV-infiserte IM-pasienter viste at det samme sett av IgM-antistoffer frem-kalles av begge virus, og at antistoffene reagerer med et utall normale, cellulære proteiner tilstedeværende i uinfis-erte celler. Nærværet av disse IgM-antistoffer er således diagnostisk for akutt infeksjon med enten EBV eller CMV.

(i) Sekvensvise sera fra en pasient med EBV-IM

har IgM-antistoffer mot P62 og EBNA-1 i den akutte fase av sykdommen

IgM-antistoffer som gjenkjenner peptid-EBNA P62, påvises i en ELISA-bestemmelse under den akutte fase av EBV-IM [Rhodes et al., i Herpesvirus, R. Rapp red.,

Alan R. Liss, New York; s. 487-496 (1984); Rhodes et al., J. Immunology, 134:211-216 (1985); Smith et al., J. Infect. Dis., 154:885-889 (1986); og Geltosky et al., J. Clin. Lab. Analysis, 1:153-162 (1987)]. Disse observasjoner ble bekreftet når sekvensvise sera fra D.B., en pasient med EBV-IM, ble analysert med hensyn til immunreaktivitet ved EBNA P62 ELISA (figur 6).

Disse data demonstrerer en tidlig dannelse av IgM-antistof f er i den akutte fase av sykdommen (jan. - mars 1985) som tilsvarer den tidlige dannelse av VCA IgM- og IgG-antistof fer (1:2) uten anti-EBNA ved den tradisjonelle IFA-metode. Sera fra denne pasient hadde en langsom stigning av IgG-antistoffer overfor P62 som nådde en topp i prøvene fra mars - april 1985 etter den akutte fase av sykdommen. IgG/IgM-forholdet overskred 0,7 i mai 1985-prøven når pasienten var i den sene rekonvalesensfase av sykdommen. Ved dette tidspunkt ble anti-EBNA-titere utviklet, og VCA-IgM-titere var bare så vidt påvisbare ved konvensjonell EBV-serologi.

Den dramatiske stigning av IgM-klassespesifikke

antistoffer under den akutte fase av sykdommen ble bekreftet ved immunblottingsteknikken (figur 7). De samme serumprøver anvendt for ELISA-en, ble anvendt i immunblottingsstudier for å påvise antigener tilstedeværende i en EBV-transformert B-cellelinje.

Som det kan ses fra figur 7, gjenkjenner IgM-antistoffer tilstedeværende i pasientens serum, en serie på 8 hoved og mindre bånd i ekstraktet. IgM-antistoffer overfor mesteparten av disse proteiner stiger i de første to serumprøver, når en topp ved den tredje prøve og avtar deretter. Dette er den samme tidsmessige sekvens som observeres

ved peptid-ELISA-en.

Proteinene gjenkjent av IgM-antistoffene, innbefatter EBNA-1 ved 77 kD såvel som en serie av normale, cellulære proteiner (bånd ved 92, 82, 80, 69, 62 og 58 kD) som inneholder epitoper beslektet med glycin-alaninregionen av EBNA-1 [Rhodes et al., J. Exp. Med., 165:1026-1040 (1987)]. Antistoffer mot proteinene ved 120 og 29 kD som ikke har noen sekvens til felles med EBNA-1 [Rhodes et al., J. Exp. Med., 165:1026-1040 (1987)], synes å nå en topp tidligere. Således er det en god korrelasjon mellom IgM-antistoffene overfor det syntetiske peptid P62 og hovedmengden av IgM-antistoffer påvist ved Western blotting.

IgG-antistoffene mot EBNA-1 (77 kD) i pasient D.B. fremkom sent på immunavtrykkene (figur 7), en observasjon som er i overensstemmelse med EBNA P62 ELISA-dataene. På den venstre side av avtrykket i figur 7 er den sterke IgG-respons på 77 kD EBNA-båndet fra en VCA-positiv (VCA<+>), EBNA-1-positiv (EBNA-1 ) pasient vist som kontroll. IgG-anti-EBNA-1-antistoffer ble først påvist i avtrykkene 51 dager etter starten av sykdommen (fjerde tidspunkt), ved samme tidspunkt som IgG-antistoffer mot peptidet begynte å stige.

(ii) Sekvensvise sera fra en pasient med CMV-IM

som deretter utviklet EBV- IM

Sekvensvise serumprøver av pasient D.S. ble også analysert ved EBNA P62 ELISA og Western blotting. De kliniske/serologiske data på denne pasient er blitt publisert, og ved klassisk serologi ble det vist at han hadde en akutt CMV-infeksjon etterfulgt 3 måneder senere av en akutt EBV-sykdom.

Resultatene av disse anti-peptid-ELISA-studier under anvendelse av sera tatt sekvensvis fra pasient D.S., er vist i figur 8. Sera fra pasient D.S. i den akutte CMV-fase av sykdommen hadde en uttalt IgM-respons på P62-peptidet påvist ved ELISA, akkurat som pasient D.B. hadde under hans akutte EBV-infeksjon. IgM-anti-peptidsignalet var sterkt for de

tre serumprøver erholdt under den første sykdom, og var også

forhøyet i den første prøve av den andre sykdom. Det er ikke kjent om antistoffnivået avtok mellom de to sykdommer. IgG-antistoffene mot polypeptid P62 ble ikke påvist før den siste serumprøve ble erholdt ett år etter den andre sykdom.

Prøver fra denne pasient ble også analysert ved immunblotting (figur 9). IgM-antistoffer mot proteiner med molekylvekter på 82, 80-77, 69, 62 og 58 kD ble funnet undar begge infeksjoner. Det skal bemerkes at IgM-antistoffene gjenkjenner de samme antigener under begge sykdommer. IgM-antistof f nivåene målt i avtrykkene, var ved sine høyeste nivåer under den første og startdelen av den andre infeksjon og avtok deretter, en observasjon lik den som ses i anti-peptid P62 ELISA. IgG-antistoff mot EBNA-1 fremkom bare ved det siste tidspunkt (svakt bånd ved siden av en normal VCA<+>, EBNA-l<+->kontroll i høyre spor).

Begge pasienter utviste en tidlig IgM-anti-peptid P62-respons som korrelerte med IgM-antistoffer mot et utall av bånd som ses i Western-avtrykkene. IgG-anti-peptid P62-responsen fremkom meget senere og var korrelert med tilsynekomsten av IgG-antistoffer som er spesifikke for EBNA-l-proteinet. Dette er i overensstemmelse med hva som tidligere er blitt rapportert [Rhodes et al., i Herpesvirus, R. Rapp red., Alan R. Liss, New York, s. 487-496 (1984); Rhodes et al., J. Immunology, 134:211-216 (1985); Smith et al.,

J. Infect Dis., 154:885-889 (1986); Geltosky et al., J. Clin. Lab. Analysis, 1:153-162 og Rhodes et al., J. Exp. Med., 165:1026-1040 (1987)].

Den overraskende observasjon er at CMV-infeksjon fremkaller IgM-antistoffer med disse samme egenskaper. Det vil si at IgM-antistoffer som fremkommer under CMV-infeksjoner, reagerer med en serie av antigener av tilsynelatende identisk størrelse med de som oppstår under EBV-infeksjon.

(iii) Sera fra ti pasienter med akutt CMV- IM

Sera fra ti pasienter med CMV-IM ble studert i ELISA og ved immunavtrykk for å bestemme om IgM-antistoffer påvist i sera fra pasient D.S. overfor EBNA P62 og de av immunavtrykkene var unike for denne pasient, eller om denne respons kunne påvises i sera fra andre pasienter med CMV-IM. Alle disse pasienter hadde hatt en tidligere EBV-infeksjon som indikert ved positive IgG VCA-titere og positive EBNA-1-titere med IFA.

Representative anti-peptid P62-data fra to av disse pasienter er vist i figur 10 A og 10 B. Alle 10 pasienter, utviste en uttalt økning i IgM-anti-peptid P62-antistoffer under den akutte fase av CMV-sykdommen. IgM-antistoffene vedvarte i 1 til 2 måneder og vendte deretter tilbake til bakgrunnsnivåer.

Derimot startet IgG-anti-peptid P62-antistoffer ved en positiv verdi (da pasientene var EBV<+>, VCA<+>, EBNA-1<+>) og utviste liten forandring under sykdomsforløpet. Ut av 7 pasienter med sekvensvise serumprøver utviste faktisk fire svake økninger i IgG-anti-peptid P62-antistoffnivåer (f.eks. figur 10 B), én utviste en nedsettelse (figur 10 A), og to utviste ingen forandring.

De samme sera ble også analysert ved immunblotting. Alle pasientene utviste en forbigående økning av IgM-antistoffer mot et utall antigener under den akutte fase av sykdommen lik de som ses i figur 7 og 9. Liten, om noen, forandring kunne påvises i IgG-anti-EBNA-l-antistoffnivåene.

Alle de undersøkte pasienter med akutte CMV-infeksjoner utviste således en uttalt, forbigående økning i IgM-anti-peptid P62-antistoffer med en mindre og variabel forandring i IgG-anti-peptidnivået.

Forholdet mellom IgG og IgM er en egnet måte å ut-trykke anti-peptid P62-data på fra EBV-IM-pasienter. Som illustrert tidligere, er dette forhold mindre enn 1 under den akutte fase av sykdommen og øker under rekonvalesensen til en verdi større enn 1 hvor den forblir resten av individets levetid [Rhodes et al., J. Exp. Med., 165:1026-1040 (1987)]. Fordelen ved denne forholdsanalysemetode er at den unngår å måtte definere bakgrunn og avkutningsverdier [Geltosky et al., J. Clin. Lab. Analysis, 1:153-162 (1987)].

Når den ble analysert ved forholdsmetoden, avslører denne studie to generelle typer av immunresponser på polypeptid P62-epitopen. Eksempelvis utviste sera fra pasient L.S. (figur 10 A) den dominerende respons. Her ble et forhold på nesten 2 i pre-sykdomsprøver observert. Dette forhold falt til under 1 (til 0,661) under den akutte sykdom og steg deretter igjen under rekonvalesensen. Totalt 8 av 10 pasienter med en akutt CMV-IM-infeksjon ble bedømt som positive i EBNA P62 ELISA-en ved forholdsanalysen.

Pasientene S.G. og G.S. representerte en annen type av respons på P62. Selv om begge utviste en økning i IgM-antistoffer under den akutte sykdom, forble maksimumverdien under IgG-nivåene. Disse sera ble bedømt som negative ved forholdsanalysen. I begge tilfeller skyldtes det falske, negative resultat et stort initialt IgG-signal. Selv om en tidligere CMV-infeksjon er relativt sjelden i aldersgruppen av individer som pådrar seg EBV-IM, kan enkelte falske, negative resultater oppstå under IgG/IgM-forholdsmetoden.

(iv) Direkte sammenligning av antigenene gjenkjent

av EBV IM- og CMV IV- sera

Et meget likt mønster av antigener gjenkjennes av IgM-antistoffer under akutte EBV- og CMV-infeksjoner (sammen-lign figur 7 og 9). For å sammenligne disse antigener direkte, ble sera fra pasienter med den ene eller andre sykdom immunblottet side ved side med samme cellekstrakt. Cellene anvendt for ekstraktet, var K562-cellelinjen. Det er viktig å observere at disse celler ikke inneholder noen EBV- eller CMV-sekvenser. Ethvert påvist antigen er således normale, cellulære proteiner.

Dataene fra denne studie vedrørende binding av IgM-antistoffer, er vist i figur 11 A. Spor 1, 2, 9 og 10 ble undersøkt med sera fra EBV-IM-pasienter, mens de gjenværende spor ble undersøkt med sera fra pasienter med akutte CMV-IM-infeks joner .

Som det kan ses fra denne figur, har hovedantigen-båndene ved 92, 82-77, 69, 62 og 58 kD identiske reaktiviteter med seraene fra pasienter infisert med det ene eller andre virus. Enkelte mindre intense bånd kunne også ses i begge pasientgrupper. Det var et bånd rundt 50 kD som synes å kunne finnes bare i CMV-pasienter, men dette er et unntak. Alle andre bånd ble enten funnet i ett eller få sera eller er felles for alle sera. Således fremkalte infeksjon av det ene eller andre virus IgM-autoantistoffer mot det samme sett av proteiner.

Det samme sett av sera ble også avtrykket under anvendelse av et ekstrakt av CMV-infiserte fibroblastere. IgG-antistoff ble påvist i studiene vist i figur 11 B.

I denne figur kan det ses at alle CMV-pasienter hadde IgG-antistoffer mot et fremtredende antigen på 50 kD, et annet ved 64 kD, og andre som var til stede i bare noen få av CMV-pasientene. Liten, om noen reaksjon, ble observert i de EBV-infiserte pasienter. Videre arbeide indikerer at alle bånd som ses i denne studie, skyldes viralt kodede CMV-proteiner.

Det konkluderes med at akutt infeksjon av CMV eller EBV fremkaller et felles sett av IgM-autoantistoffer. Derimot er IgG-antistoffene spesifikke for pro-

teiner fra det virus som fremkaller sykdommen, og disse IgG-antistoffer har ingen reaktivitet med vertkomponenter [Rhodes et al., J. Exp. Med., 165:1026-1040 (1987)].

(v) Inhibering av antistoffbinding med peptid P62

Peptid P62 er tidligere blitt vist å inhibere antistoffbinding mot et utall av IgM-antistoffer fremkalt av EBV [Rhodes et al., J. Exp. Med., 165:1026-1040 (1987)]. Dette er igjen demonstrert i figur 12 hvori to EBV<+->sera ble avtrykket på et ekstrakt av EBV<+> B-celler.

I figur 12 inneholdt spor 1 serum fra pasient D.B.

15 dager etter starten av sykdommen, og spor 5 inneholdt et annet akutt EBV-IM-serum. Spor 2 og 6 hadde de respektive

sera ytterligere inneholdende 400 ug/ml av peptid P62. Disse studier ble foretatt ved høyere serumfortynninger enn de som er vist i figur 7 slik at bare de . sterkest reaktive bånd ville bli lett synlige.

Som det kan ses fra figur 12, inhiberte polypeptidet IgM-antistoffbinding til flere proteinbånd, og de enkleste

å se er båndene ved 82 til 77 kD. Arbeid under utvikling indikerer at dette areal inneholder EBNA-1 og ett eller flere cellulære proteiner.

Spor 3 inneholdt serum fra pasient D.S. 12 dager etter starten av hans CMV-sykdom, mens spor 4 var det samme serum pluss peptid P62 som tidligere. Igjen ble IgM-reaktiviteter med 87-77 kD-båndene såvel som enkelte i området 58 til 62 kD inhibert med EBV-peptidet.

Inhiberingsstudier av IgG-antistoffene som ses i avtrykksforsøk, ble også utført. Spor 7 inneholdt serum fra pasient D.B. 514 dager etter starten på sykdommen, spor 9 inneholdt serum fra pasient D.S. 417 dager etter starten av hans CMV-sykdom, og spor 11 var fra en normal voksen person med en tidligere EBV-infeksjon. Spor 8, 10 og 12 inneholdt de respektive sera med 50 ug/ml P62.

Det eneste protein som ble påvist, var EBNA-l-båndet ved 77 kD. Binding til dette protein ble inhibering med peptidet i alle tilfeller.

Det konkluderes med fra disse studier at CMV-infeksjon produserer IgM-autoantistoffer som gjenkjenner et peptid fra EBNA-1-regionen av EBV. Disse IgM-antistoffer gjenkjenner en serie av cellulære autoantigener som er identiske i mobilitet og deler en epitopspesifisitet med de som produseres under EBV-infeksjon.

(d) Bestemmelse av nasofaryngealt carcinom ( NPC)

Som tidligere angitt, har EBV vært involvert som det forårsakende middel ved nasofaryngealt carcinom (NPC). Nasofaryngealt carcinom er en hovedform for cancer i Kina med en forekomst så høy som 100 pr. 100.000 personer pr. år.

Western-avtrykksanalyser under anvendelse av EBV-infiserte Wi-L2-celleekstrakter med sera fra en normal VCA<+->person, en pasient med IM og 6 pasienter med NPC, utviste en IgG-immunreaksjon med EBNA-proteinet, IgM- og IgG-responser på EBNA-proteiner med serumet fra IM-pasienten, og IgG-, IgM-og IgA-reaksjoner på EBNA-proteinet fra NPC-pasientene.

Nylige studier har vist at serumnivåer av IgG- og IgA-antistoffer mot et utall av EBV-antigener er signifikant forhøyet i NPC-pasienter. [Henie et al., Int. J. Cancer, 17:1-7 (1976). Desgranges et al., Int. J. Cancer, 19:627-633 (1977) og Pearson et al., Cancer, 51:260-268

(1983)]. Nærmere bestemt rapporterte Henie et al. høye IgA-serumtitere mot VCA- og D-(diffuse) antigener som leilig-hetsvis tilpasset IgG-titrene til disse antigener. Desgranges et al. utnyttet spytt og rapporterte at de fant nøytraliserende IgA- og IgG-antistoffer mot VCA og EA (tidlig antigen). Pearson et al. rapporterte den diagnostiske effektivitet av en IgA-anti-VCA-bestemmelse koplet med en IgG-anti-EA-bestemmelse. Disse studier vedrørte ikke nærværet av IgA-anti-EBNA-antistoffer i prøvene som de under-søkte.

Et utall sera fra pasienter kjent for å ha NPC, ble undersøkt under anvendelse av en fast-fase-ELISA med polypeptid P62 festet til en fast matriks under dannelse av en fast bærer som tidligere diskutert. Disse sera ble også undersøkt ved standard serologiske bestemmelser. Resultatene er illustrert i etterfølgende tabell 12.

NT = ikke testet

Anti-EBV-polypeptid P62-ELISA ble utført på disse sera som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Plusstegn (+) indikerer optiske densitetsverdier som betraktes som positive for NPC, mens minustegn indikerer optiske verdier som betraktes som negative for NPC.

Som det kan ses fra de ovenfor angitte data, korrelerte de serologiske bestemmelser av VCA, EA og IgA godt med en relativt forøket IgA-anti-peptid P62-titer. IgA-anti-peptid P62-titeren ble ikke inhibert ved nærvær av IgM- eller IgG-antistoffer tilstedeværende i serumet. Enn videre kan forholdet mellom IgM og IgG ses å vise at pasientene ikke hadde akutt IM. Enn videre ble anti-EBNA-titere som bestemt ved ACIF, funnet å være beslektet med sykdommen.

Ved undersøkelse av seraene fra normale personer som ikke har NPC, ble en O.D.^gQ-verdi på 0,3 funnet som kon-trollverdien for denne IgA-bestemmelse. I dette bestemte a bestemmelsesformat ble en O.D.^gQ-verdi signifikant over 0,3 tatt som en positiv indikator for NPC. I den ovenfor angitte tabell var således 10 av 13 sera positive med hensyn til NPC og er således angitt med et plusstegn (+).

Den tidligere diskuterte, generelle bestemmelsesmetode for påvisning av anti-EBNA-antistoffer ses også å være effektiv ved påvisning av nærværet av NPC i en person. En antistoff-holdig kroppsprøve slik som serum, plasma, spytt, sputum eller en svelgskylling, anvendes. Kroppsprøven blandes med fast-fase-bæreren i et vandig medium som tidligere beskrevet. Her bestemmes mengden av IgA-antistoffer hvor en relativt forøket mengde over en kontrollverdi indikerer nærværet av NPC.

(e) Immunologisk kryssreaktivitet av EBV- og CMV-beslektede peptider

Herpesviruset humant cytomegalovirus (CMV) er blitt trukket inn som et viktig patogen som kan forårsake fødsels-defekter og opportunistisk infeksjon i immunundertrykkede individer. CMV-virus forårsaker også en "mononukleose-lignende" sykdom (CMV-IM) lik infeksiøs mononukleose forårsaket av EBV (EBV-IM).

Under kliniske studier på bruken av polypeptid P62-basert ELISA for å påvise nærvær av anti-EBNA-antistoffer i pasienter med EBV-IM akutt fase, ble det observert at ca. 60-70% av de heterofile, negative tilfeller av CMV-IM ble be-dømt positive i den P62-baserte ELISA. Nærværet av antistoffer i CMV-IM-pasientene som var i stand til å immunreagere medP62, ble antatt å være resultatet av enten en reaktivering av den latente EBV-infeksjon med den nylige CMV-infeksjon, eller resultatet av produksjonen av et CMV-protein som er immunologisk kryssreaktivt med EBNA.

For å undersøke muligheten for at serumet av CMV-infiserte individer inneholdt P62 kryssreaktive antistoffer fremkalt av et CMV-kodet antigen, ble tre CMV-beslektede polypeptider vist i tabell 13, syntetisert. 1. Aminosyrerestsekvensen av peptid Cl, C2 og C3 tilsvarer hver en del av et polypeptid som er forutsagt å bli uttrykt av en kodende region av exon 1 av 2,2 kilobase CMV RNA rapportert av Stapraus et al.,

J. Virol., 57:591-602 (1986).

Serumprøver erholdt under forløpet av IM fra utvalgte pasienter, ble undersøkt med hensyn til IgG- og IgM-immunreaktivitet mot polypeptid P62, Cl og C2 under anvendelse av en ELISA lik den som er beskrevet i avsnittet Metoder og materialer IIID. Figur 14 illustrerer resultatene av denne studie under anvendelse av serumprøvene erholdt fra pasient (DB) som har en EBV-infeksjon resulterende i utvikling av akutt IM, etterfulgt av rekonvalesensfasen av sykdommen. Disse resultater illustrerer det tidligere beskrevne mønster ved påvisning av anti-P6 2 IgM-antistoffer under den akutte fase av EBV-IM og stigningen av anti-P62 IgG- (og ledsagende fall av anti-P62 IgM) antistoffer under rekonvalesens.

Figur 14 illustrerer også at når CMV-beslektede peptider Cl og C2 ble anvendt som fast-fase (mål) antigen i

ELISA-en, ble de samme sekvensvise prøver erholdt fra pasient DB, funnet å inneholde anti-Cl- og anti-C2 IgM-antistoffer under den akutte fase av sykdommen. Mens imidlertid IgM anti-Cl- og anti-C2-antistoffresponsen faller med starten av rekonvalesens, var ingen ledsagende stigning i anti-Cl-eller anti-C2 IgG-antistoff påvist.

Sekvensvise serumprøver fra en andre pasient (DS)-a med en primær CMV-infeksjon resulterende i akutt CMV-IM, etterfulgt av en sekundær EBV-infeksjon resulterende i akutt EBV-IM, ble undersøkt i P62, Cl og C2 ELISA-er som beskrevet ovenfor. Som illustrert i figur 15, påviste hver av ELISA-ene IgM-anti-peptidantistoffer under de akutte faser

av CMV- og EBV-infeksjonene.

Den immunologiske aktivitet av de CMV-beslektede peptider ble ytterligere undersøkt ved å studere evnen hos antistoffer fremkalt av Cl, C2 og C3 til å immunreagere med EBNA. Kanin-anti-peptidsera overfor Cl, C2 og C3 ble hver immunomsatt med ekstrakter av celler som uttrykker EBNA under anvendelse av en immunblottingsprosedyre lik den som er beskrevet i avsnittet Metoder og materialer HIG. Resultatene av immunblottingsstudiet indikerer at anti-Cl, anti-C2 og anti-C3-kaninantistoffer immunreagerer med EBNA.

Når enn videre anti-Cl- og anti-C2-kaninantistoffene ble opprettholdt med sine respektive peptider før immunblotting, ble immunreaksjonen med EBNA-protein blokkert.

Det skal derfor observeres at mens aminosyrerest-sekvensene av polypeptid Cl, C2 og C3 tilsvarer en sekvens kodet av CMV-genomet, er disse polypeptider polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse fordi de inneholder en aminosyrerestsekvens representert ved formelen:

hvori R 1 og R 2 betegner aminosyrerester som tatt hver for

seg, er like eller forskjellige og er valgt fra gruppen bestående av Ala, Arg, Gly, Leu, Pro, Ser og Thr forutsatt at R 1 og R 2 ikke begge er Gly. I tillegg indikerer de ovenfor angitte resultater at polypeptid Cl, C2 og C3 kan immunreagere med IgM-antistoffer fremkalt av EBNA, og at anti-

stoffer fremkalt av disse peptider, immunreagerer med EBNA.

Både EBV og CMV fremkaller en ikke-ondartet lymfo-proliferativ sykdom hvis akutte fase er karakterisert ved produktet av IgM-antistoffer som immunreagerer med et polypeptid ifølge oppfinnelsen. Fordi anti-EBNA-antistoffer typisk ikke finnes i forbindelse med ondartet lymfecelle-deling, tilveiebringer foreliggende oppfinnelse derfor et = diagnostisk system og metode for å skille mellom viralt fremkalte, ikke-ondartede og ondartede lymfoproliferative sykdommer.

3. Preparering for passiv immunisering

En pasient med latent infiserte B-lymfocytter som uttrykker EBNA på sine celleoverflater, kan behandles med reseptorer ifølge oppfinnelsen, fortrinnsvis som hele antistoffer dannet mot de syntetiske polypeptider ifølge oppfinnelsen som immunreagerer med EBNA. Reseptorene adminis-treres i en enhetsdose med en effektiv mengde av reseptorer dispergert i et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel.

En effektiv mengde av slike antistoffer varierer avhengig av reaktiviteten og type av antistoffene. Generelt er 0,5 milligram til 25,0 milligram antistoff pr. kilo kropps-vekt betraktet som effektivt. Antistoffene kan adminis-treres intravenøst, intramuskulært eller intraperitonealt, med flere administreringer gitt med 3 til 20 dagers inter-valler. Antistoffene kan også gis i forbindelse med kirur-gisk eller kjemikalsk behandling.

Antistoffene kan erholdes fra sera eller plasma fra en dyreart forskjellig fra den pasient som skal behandles, ved dannelse av antistoffer mot polypeptidene ifølge oppfinnelsen under anvendelse av de tidligere beskrevne inokula. Antistoffene kan også erholdes fra monoklonale kilder slik som ascitesvæske ved fremstilling av en hybridomcellelinje under anvendelse av teknikker velkjente innen faget. Hele antistoffer foretrekkes som det kombinerende sete da disse er i stand til å aktivere komplementsystemet når et immun-kompleks dannes.

III. Metoder og materialer

A. Syntese av polypeptider

Polypeptidene ifølge oppfinnelsen ble kjemisk syntetisert ved fast-fase-metodene som beskrevet i Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc, 85:2149-2154 (1963) og Houghten et al., Int. J. Pept. Prot. Res. 16:311-320 (1980). Fast-fase-metoden for polypeptidsyntesen ble utøvet under anvendelse av en Beckman modell 990B polypeptidsyntetisator, tilgjengelig kommersielt fra Beckman Instrument Co., Berkeley,

CA, U.S.A.

For polypeptider med færre enn 35 rester som ble anvendt i inokula, ble en cysteinrest addert til aminoenden eller til carboxylenden for å medhjelpe til kopling til en proteinbærer som beskrevet nedenfor. Sammensetningene av alle polypeptider ble bekreftet ved aminosyreanalyse.

Ved fremstilling av et syntetisk polypeptid ifølge oppfinnelsen ved den ovenfor angitte fast-fase-metode kjedes aminosyrerestene til en harpiks (fast fase) gjennom en esterbinding fra den carboxyterminale rest. Når polypeptidet skal kjedes til en bærer via en Cys-rest eller polymeriseres via terminale Cys-rester, er det hensiktsmessig å anvende denne Cys-rest som den carboxyterminale rest som er ester-bundet til harpiksen.

Alfa-aminogruppen av hver tilsatt aminosyre beskyttes typisk med en tertiær-butoxycarbonyl- (t-BOC) gruppe før aminosyren tilsettes til den voksende polypeptidkjede. t-BOC-gruppen fjernes deretter før tilsetning av neste aminosyre til den voksende polypeptidkjede.

Reaktive aminosyre-sidekjeder beskyttes også under syntesen av polypeptidene. Vanlige sidekjedebeskyttende grupper ble anvendt for de gjenværende aminosyrerester som følger: 0-(p-brombenzyloxycarbonyl) for tyrosin; 0-benzyl for threonin, serin, asparaginsyre og glutaminsyre; S-methoxybenzyl for cystein, dinitrofenyl for histidin; 2-klorbenzoxycarbonyl for lysin og tosyl for arginin. Beskyttede aminosyrer ble omkrystallisert fra egnede løsningsmidler under dannelse av enkle flekker ved tynn-skiktskromatografi. Koplingene ble typisk utført under anvendelse av et tidobbelt molart overskudd av både beskyttet aminosyre og dicyclohexylcarbodiimid i forhold til antallet av milliekvivalenter av den første N-terminale aminosyre.

Et to molart overskudd av begge reagenser kan også anvendes. For asparagin ble en lik molar mengde av N-hydroxybenzo- --= triazol tilsatt til den beskyttede aminosyre, og dimethyl-formamid ble anvendt som løsningsmiddel. Alle koplings-reaksjoner var mer enn 99% komplette ved picrinsyretesten ifølge Gisin, Anal. Chem. Acta. 58:248-249 (1972).

Etter fremstilling av et ønsket polypeptid ble en del av det resulterende, beskyttede polypeptid (ca. 1 gram) behandlet med to milliliter anisol, og vannfritt hydrogen-fluorid, ca. 20 milliliter, ble kondensert i reaksjonskaret ved tørristemperatur. Den resulterende blanding ble omrørt ved ca. 4°C i 1 time for å spalte de beskyttende grupper og for å fjerne polypeptidet fra harpiksen. Etter fordampning av hydrogenfluoridet ved en temperatur på 4°C med en strøm av N2 ble residuet ekstrahert med vannfri diethylether tre ganger for å fjerne anisolen, og residuet ble tørket i vakuum.

Det vakuumtørkede materiale ble ekstrahert med 5% vandig eddiksyre (3 ganger 50 milliliter) for å separere det frie polypeptid fra harpiksen. Den ekstraktholdige løs-ning ble lyofilisert under dannelse av et monomert, uoxydert polypeptid.

Det dannede, syntetiske polypeptid kan anvendes som et reagens i en enzymkjedet immunosorbentbestemmeIse (ELISA) for å påvise anti-EBNA-antistoffer. Det syntetiske polypeptid kan også anvendes for å fremstille et inokulum, vanligvis ved kjeding av dette til en bærer under dannelse av et konjugat og deretter dispergering av en effektiv mengde av konjugatet i et fysiologisk tolererbart løsningsmiddel som diskutert i det etterfølgende.

Det skal også bemerkes at en syntetisk multimer ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved fast-fase-syntesen av et flertall av polypeptidene ifølge oppfinnelsen kjedet sammen ende-til-ende (hode-til-hale) med en amidbinding mellom carboxylenderesten av ett polypeptid og amino-enderesten av et annet polypeptid. Slike syntetiske multimerer syntetiseres fortrinnsvis som en enkel, lang polypep-tidmultimer, men kan også fremstilles som individuelle polypeptider som kjedes sammen deretter ved deres individuelle, synteser under anvendelse av et carbodiimidreagens slik som 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-hydroklorid i vann. Det totale antall aminosyrerester inneholdt i en multimer fremstilt som en enkel polypeptidkjede, er fortrinnsvis mindre enn ca. 50, slik at opptil 8 polypeptider ifølge oppfinnelsen kan være inkorporert i en enkel hode-til-hale-multimerkjede som syntetiseres som et enkelt polypeptid. En syntetisk hode-til-hale-multimer inneholder aller helst 2 til 4 blokker av kjedede, syntetiske, vilkårlige copolymerpolypeptider ifølge oppfinnelsen, og totalt mindre enn ca. 40 aminosyrerester.

B. Fremstilling av polymerer

Polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan koples sammen under dannelse av en antigenisk og/eller immunogenisk polymer (syntetisk multimer) omfattende et flertall av de polypeptidrepeterende enheter. En slik polymer har typisk den fordel at den har forøket immunogenisitet og antigenisitet. I tillegg er en bærer typisk ikke nød-vendig når et polymert immunogen anvendes. Hvor forskjellige polypeptidmonomerer anvendes for å fremstille polymeren, erholdes evnen til å immunreagere med antistoffer mot flere EBNA-antigeniske determinanter. Nok en ytterligere fordel er evnen til en slik polymer når den anvendes i et inokulum, til å fremkalle antistoffer som immunreagerer med flere antigeniske determinanter av EBNA.

En polymer ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved syntetisering av polypeptidene som diskutert ovenfor, og innbefatte cysteinrester ved både amino- og carboxy-

endene under dannelse av et "diCys-terminert" polypeptid.

Eksempelvis kan hvert av polypeptidene i tabell 1 og polypeptidene Dl og D2 i tabell 2 syntetiseres til å inneholde en ytterligere Cys-rest ved hver av amino- og carboxy-

endene for å tilveiebringe diCys-terminerte polypeptider i deres reduserte former. Etter syntese, i en typisk labora-toriefremstilling, oppløses 10 milligram av diCys-polypeptidet (inneholdende cysteinrester i uoxydert form) i 250 <3 >milliliter (ml) av 0,1 molar (M) ammoniumbicarbonatbuffer. Det oppløste diCys-terminerte polypeptid luftoxyderes deretter ved forsiktig omrøring av den resulterende løsning i en periode på ca. 18 timer i luft, eller inntil det ikke er noe påvisbart, fritt mercaptan ved Ellman-testen. [Se Ellman, Arch. Biochem. Biophys. , B2-. 10- 11 (1959)].

Den således fremstilte polymer (syntetiske multimer) inneholder et flertall av de syntetiske, vilkårlige copolymer-polypeptid-repeterende enheter som er bundet sammen ved oxydering av cystein- (cystin-) rester. Slike polymerer inneholder typisk sine polypeptid-repeterende enheter bundet sammen på en hode-til-hale-måte, såvel som i en hode-til-hode- og hale-til-hale-måte; dvs. aminoendene av to polypeptid-repeterende enheter kan bindes sammen gjennom en enkelt cysteinrest, slik som to carboxylender, da de kjedende grupper ved begge polypeptidender er identiske.

C. Kopling til bærere

De syntetiske polypeptider ble koplet til albuskjellhemocyanin (KLH) som bærer ved metoden beskrevet i Liu et al., Biochem., 80:690 (1979). Kort angitt ble 4 milligram (mg)

av bæreren aktivert med 0,51 mg m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester og ble deretter omsatt med 5 mg av polypeptidet via et amino- eller carboxy-terminalt cystein under dannelse av et konjugat inneholdende 10 til 35 vekt% polypeptid.

Én eller flere ytterligere aminosyrerester kan adderes til amino- eller carboxyendene av det syntetiske polypeptid for å medhjelpe til binding av polypeptidet til en bærer. Som tidligere diskutert, er cysteinrester addert

til amino- eller carboxyendene av det syntetiske polypeptid, blitt funnet å være særlig anvendbare for dannelse av polymerer via disulfidbindinger. Imidlertid kan andre metoder velkjente innen faget for fremstilling av konjugater,

også anvendes. Eksempler på ytterligere kjedingsprosedyrer innbefatter anvendelse av Michael addisjonsreaksjons-produkter, dialdehyder slik som glutaraldehyd, Klipstein e* al., J. Infect. Dis., 147:318-326 (1983) og lignende, eller anvendelse av carbodiimidteknologien slik som ved anvendelse av et vannløselig carbodiimid for å danne amidbindinger til bæreren, som diskutert tidligere for kjeding av et flertall av polypeptider sammen under dannelse av en syntetisk multimer.

Anvendbare bærere er velkjente innen faget og er generelt proteiner i seg selv. Eksempler på slike bærere er albuskjellhemocyanin (KLH), edestin, thyroglobulin, albu-miner slik som kvegserumalbumin (BSA) eller humant serum-albumin (HSA), røde blodceller slik som saueerythrocytter (SRBC), tetanus-toxoid, kolera-toxoid såvel som polyamino-syrer slik som poly (D-lysin:D-glutaminsyre) og lignende.

Som velkjent innen faget er det ofte gunstig å binde et syntetisk polypeptid til dets bærer ved hjelp av en intermediær, kjedende gruppe. Som ovenfor angitt, er glutaraldehyd en slik kjedende gruppe. Når imidlertid cystein anvendes, er den intermediære, kjedende gruppe fortrinnsvis et m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimid (MBS), slik som anvendt her.

I tillegg kan MBS først adderes til bæreren ved en ester-amid-interbytningsreaksjon som beskrevet av Liu et al., supra. Deretter kan addisjonen følges ved addisjon av en blokkert mercaptogruppe slik som thioleddiksyre

(CH3COSH) over maleimido-dobbeltbindingen. Etter spaltning av den acylblokkerende gruppe dannes en disulfidbinding mellom det avblokkerte, kjedende mercaptan og mercaptanet av den tilsatte cysteinrest av det syntetiske polypeptid.

Valget av bærer er mer avhengig av den sluttelige anvendelse av immunogenet enn determinantdelen av immunogenet, og er basert på kriterier som ikke er særlig involvert i foreliggende oppfinnelse. Hvis f.eks. et inokulum skal anvendes i dyr, skal det velges en bærer som ikke danner en uønsket reaksjon i det bestemte dyr.

D. ELISA

Anti-peptid-antistoffbindings- og inhiberingsstudier ble utført ved en enzymkjedet immunosorbentbestemmelse (ELISA) som beskrevet i det etterfølgende.

Kort angitt ble mikrotiterbrønner (Costar, #3590, Cambridge, MA) typisk belagt med individuelle polypeptider som antigener ved tilsetning av 100 mikroliter (ul) BBS

[10 millimol (mM) natriumborat (pH 8,3), 150 mM NaCl] inneholdende polypeptid i en konsentrasjon på 10 mikrogram pr. milliliter (ug/ml). Kontakt mellom brønnene og antigen-holdig løsning ble opprettholdt i et på forhånd bestemt tidsrom, typisk 15 minutter, og ved 20°C, under dannelse av en antigenbelagt fast fase. De faste og væskeformige faser ble separert, og brønnene ble vasket tre ganger med BBS.

Ikke-spesifikke bindingsseter ble blokkert ved tilblanding av 200 mikroliter 1% kvegserumalbumin (BSA) i hver brønn for å danne en annen fast/væskefaseblanding, og denne fast/væskefaseblanding ble opprettholdt i 30 minutter ved 20°C. Fasene ble separert, og overskudd av ubundet BSA ble fjernet ved vasking tre ganger med BBS.

Kanin- og humansera (kroppsprøvealiquoter) ble undersøkt med hensyn til anti-polypeptidaktivitet ved tilsetning av 100 mikroliter av et serum fortynnet 1:20 i BBS pr. brønn for å danne et fast/væskefasemateriale. Kontakt mellom de fortynnede sera og den antigenbelagte, faste fase ble opprettholdt i et på forhånd bestemt tidsrom slik som 1 time, og ved 20°C, for at en immunreaktant skulle få dannes. De faste og væskeformige faser ble deretter separert, og den faste fase; dvs. de antigenbelagte, immun-reaktantholdige brønner, ble deretter vasket tre ganger med

BBS.

Antistoffene i humane sera som immunreagerte med et adsorbert polypeptid, ble påvist under anvendelse av et indikerende middel omfattende alkalisk fosfatase-konjugert geite-anti-humant Ig-antistoff (Tago, Burlington, CA). Antistoffene i kaninsera som immunreagerte med et adsorbert polypeptid, ble påvist under anvendelse av et indikerende middel omfattende alkalisk fosfatase-konjugert geite-anti-kanin Ig-antistoff (Kirkegård & Perry Laboratories, Inc., a Gaithersburg, MD). I hvert tilfelle ble 100 mikroliter av det indikerende antistoff fortynnet 1:300 i BBS, tilsatt pr. brønn for å danne et ytterligere fast/væskefasemateriale. Dette fast-væskefasemateriale ble opprettholdt i et på forhånd bestemt tidsrom, i 1 time, for dannelse av et reaksjons-produkt mellom de humane antistoffer bundet til den faste fase og de indikerende midler, og ved 20°C. Fasene ble separert, og den faste fase ble vasket 3 ganger med BBS.

Alkalisk fosfatase-konjugert antistoff bundet til polypeptid-spesifikt antistoff, ble påvist ved spektrofoto-metrisk måling av den enzymatiske hydrolyse av p-nitrofenylfosfat til p-nitrofenol. Kort angitt ble 100 mikroliter p-nitrofenylfosfat [1 milligram pr. milliliter i 2 mM MgCl 2, (pH 9,8), 50 mM natriumcarbonat] tilsatt til hver brønn.

Den enzymatiske reaksjon fikk forløpe i 1 time, og den optiske densitet ved 405 nm ble deretter bestemt i et "Titertek" spektrofotometer tilgjengelig fra Flow Laboratories, Inglewood, CA.

Ytterligere bestemmelser anvendt i disse studier hvori IgG- til IgM-forhold ble bestemt for å fastslå til-standen av EBV-fremkalt sykdom, ble utført som beskrevet i Smith et al., J. Infect. Dis., 154:885-889 (1986) og Geltosky et al., J. Clin. Lab. Analysis, 1:153-162 (1987). Kort angitt ble mikrotiterbrønner som fast-fase-matriks belagt med 50 ul av 20 mikrogram (ug) polypeptid P62/ml i borat-bufret saltvann [BBS; 0,5 M natriumborat, 0,15 M NaCl og 0,001 M MgCl2, pH 8,3] i 12 timer ved 4°C under dannelse av en fast bærer inneholdende peptidet festet til fast-fase-matriksen.

Løsningen ble deretter kastet, og platene ble blokkert med 300 ul 10% normalt geiteserum i fosfatbufret saltvann (PBS) til pH 7,3. Etter 90 minutters opprettholdelse (inkubering) ved 37°C ble brønnene tømt og tørket i 60 minutter ved 37°C.

Ved dette tidspunkt ble 200 ul 10% geiteserum i PBS tilsatt til brønnene. Et volum på 10 ul pasientprøveserum ble tilblandet til hver geiteserum-holdig brønn for å danng en fast/væskefaseblanding. Denne blanding ble opprettholdt i et tidsrom på 1 time ved romtemperatur for å tillate binding av ethvert tilstedeværende antistoff til den faste bærer og danne en fast-fase-bundet immunreaktant inneholdende disse antistoffer.

Etter vasking fem ganger med 350 ul 0,05% "Tween-20"

[polyoxyethylen (20) sorbitanmonolaurat] i PBS for å bevirke separasjon av den faste og væskefasen, ble en løsning av 200 ul pepperrotperoxydase-(HRP0-) konjugert, muse-monoklonalt antistoff mot humant IgG eller IgM (Ortho Diagnostic Systems, Raritan, NJ) tilblandet til hver brønn for å danne en andre fast/væskefaseblanding. Denne andre fast/væskeblanding ble opprettholdt i ytterligere 1 time for å tillate at de enzym-bundne antistoffer fikk bindes til ethvert fast-fase-

bundet antistoff dannet i den første faste/væskefaseblanding.

Etter separasjon av den faste og væskeformige fase, og vasking av den faste fase fem ganger under anvendelse av "Tween-20"/PBS-løsningen ble en farge fremkalt ved tilblanding av o-fenylendiamin (OPD; 2 mg av en citratbufret tablett oppløst i 3 ml vann; Pitman-Moore, Washington Crossing, NJ) og hydrogenperoxyd. Den resulterende løsning ble opprettholdt i 30 minutter ved romtemperatur. Reaksjonen ble stanset ved tilblanding av 50 ul 2N HC1, og absorbansen ble bestemt ved 490 nanometer (nm).

Resultatene av ELISA-en med polypeptid P62 som antigen ble normalisert ved multiplisering av absorbansverdiene med et positivt kontrollforhold: positivt kontrollforhold = referanseabsorbans verdi/midlere absorbans av positiv kontroll.

Den positive kontroll ble gitt en referanseabsorbans-verdi (O.D.) på 1,0. Referanseabsorbansverdien ble dividert med den observerte, midlere absorbansverdi av den positive kontroll. Absorbansverdien for kontrollene og for hver testprøve ble multiplisert med det positive kontrollforhold for å oppnå en standardisert ELISA-verdi. Avskjærings-verdier (midlere OD + SD) er tidligere blitt beskrevet [Geltosky et al., J. Clin. Lab. Analysis, 1:153-162 (1987)#. Med disse standardiserte betingelser ble forholdene av ELISA-verdiene av IgG til IgM på større enn 0,7 bestemt i en frisk, asymptomatisk populasjon. Absorbansverdier mindre enn 0,7 ble betraktet som å representere en akutt infeksjon på grunn av EBV [Smith et al., J. Infect. Dis., 154:885-889

(1986) ].

En ytterligere lik, men meget hurtigere bestemmelse er også blitt utviklet og anvendt her. Her var den anvendte faste fase-matriks en såkalt "skje".

De bestemte skjeer som ble anvendt, var opake, hvite polystyrenanordninger med en generelt flat, øvre del (som normalt anvendes) som strekker seg i ca. halvparten av skjeens lengde og er tilpasset for å bli holdt av brukerens fingre. Ca. to tredjedeler av lengden av den nedre del (nedre halvpart) er snevrere enn den øvre del og er sylind-risk formet.

Den nederste tredjedel av skjeen inneholder en andre flat del som er ca. vidden av den øvre del og som avgrenser to skiveformede nedsenkninger (brønner) som er ubetydelig mindre i diameter enn vidden av denne flate del. De to skiveformede nedsenkninger er adskilt av en avsperring som strekker seg i tilnærmet rette vinkler til den flate overflate som avgrenser nedsenkningene. Toppoverflaten av avsperringen når man ser nedover mot nedsenkningene, bærer indekser slik som "M" for IgM og "G" for IgG, og de verti-kale vegger av avskjæringen tilstøtende hver nedsenkning er formet i punkter som vender mot den ene eller andre nedsenkning. Punktene og deres tilsvarende indekser på toppen av avsperringen kombineres for å angi hva som bestemmes i hver nedsenkning, IgM eller IgG.

De tidligere nevnte flate deler er av hovedsakelig samme vidde, og denne vidde og lengden av skjeen er propor-sjonert til å passe lett inn i og strekker seg fra et test-rør slik som et 13x100 eller 16x160 millimeter (mm) test-rør, begerglass eller annen væskeholdig anordning. Typiske dimensjoner for en slik skje er en vidde på 10-12 mm, en tykkelse på 2-4 mm og en total lengde på 130-160 mm, med nedsenkninger som kan holde 200-250 pl væske.

En foretrukket skje innbefatter enn videre en enda videre del ved den øverste tredjedel av den øvre, generelt flate del hvis vidde er større enn diameteren av det testrør som anvendes, f.eks. videre enn ca. 16 mm, slik at skjeen kan suspenderes i testrøret uten å røre bunnen av skjeen til bunnen av røret, og kan bedre tilpasses for holding. Enn videre er utstående ben med en lengde på ca. tykkelsen av skjeen innbefattet på den motsatte side av nedsenkningene for å tilveiebringe en hovedsakelig stabil, horisontal basis på hvilken skjeen kan hvile på en laboratoriebenk.

En serie av nedsenkningene av slike skjeer ble belagt med polypeptid P62 ved tilblanding av en løsning inneholdende 100 ug/ml polypeptid i BBS ved en pH-verdi på 8,3-8,5. Løsningene ble opprettholdt innen nedsenkningene i en periode på 18-24 timer for å feste polypeptidet til matriksen tilveiebrakt av skjenedsenkningene og derved danne fast-fase-bærere, og den faste og væskeformige fase ble separert.

Ikke-spesifikke bindingsseter på den faste fase-bærer som således var dannet, ble blokkert ved tilblanding med en løsning av 10% BSA eller annet ikke-humant protein i PBS ved en pH-verdi på 7,4 i et tidsrom på 90 minutter ved 37°C. Når en skje ikke skulle anvendes umiddelbart, ble 20% glycerol (v/v) innbefattet i den blokkerende løsning for å medhjelpe til lagringen. Den faste og væskeformige fase ble deretter separert, og skjeene ble tørket ved en temperatur på 37°C i 1 time.

Under anvendelse ble 100 ul av den væskeformige kroppsprøve slik som blod, plasma, serum eller spytt, tilsatt til hver nedsenkning av skjeen. Aliquoter av prøven fra et individ ble anvendt i hver nedsenkning av en enkel skje.

De resulterende fast/væskeblandinger ble opprettholdt i et tidsrom på 2 minutter for å danne de respektive fast-fase-bundne immunreaktanter.

Den faste og væskeformige fase ble separert og vasket i to separate 13x100 mm testrør, hver inneholdende 5 ml PB& inneholdende 0,05% "Tween-20". En kranvannskylling ble også effektivt anvendt i dette trinn.

Deretter ble 100 ul HRPO-konjugert, anti-humant IgG-antistoff tilblandet med den faste bærer av nedsenkningen indikert med den tidligere angitte "G", og 100 ul HRPO-konjugert, anti-humant IgM-antistoff ble tilblandet med den faste bærer av nedsenkningen indikert ved den tidligere angitte "M" for å danne to andre fast/væskefaseblandinger.

De resulterende blandinger ble opprettholdt ved romtemperatur i en to minutters periode.

Den faste og væskeformige fase ble separert. Den faste fase ble deretter vasket to ganger med PBS/"Tween-20"-løsningen som beskrevet tidligere.

Etter dette vasketrinn ble 100 pl av en farge-fremkallende løsning slik som den inneholdende 0PD som tidligere beskrevet, eller ABTS og 3% hydrogenperoxyd (v/v) i den ovenfor beskrevne buffer, tilblandet til de faste bærere. Skjeene ble anbrakt horisontalt på deres ben på en laboratoriebenk for dette trinn. Den således dannede fargedannende fast/væskeblanding ble opprettholdt i ytterligere to minutter ved romtemperatur, og de fargedannende reaksjoner ble stanset ved tilblanding av 50 pl av en 1% løs-ning av natriumdodecylsulfat eller en 2N HCl-løsning som tidligere beskrevet.

Den ovenfor beskrevne bestemmelse tar litt mer enn

6 minutter så snart de faste bærere er blitt fremstilt.

Den resulterende bestemmelse fullføres ved visuell undersøk-else av fargeintensiteten i hver nedsenkning. Hvor således fargen er mer intens i IgG-bestemmelsen, er pasienten i rekonvalesens; hvor fargen er mer intens i IgM-bestemmelsen, er pasienten i den akutte fase av IM; og hvor fargene er av ca. samme intensitet, går den akutte fase IM over i rekonvalesens .

Resultater av den ovenfor angitte, ca. 6 minutters utprøvning ble sammenlignet med resultatene erholdt i en mikrotiterplate-kalkulert forholdsbestemmelse som tidligere beskrevet som det krevet ca. 2,5 time å fullføre. 30 serum-prøver hver ble sammenlignet fra paneler med (a) akutte, primære EBV-IM-infeksjoner, (b) normale laboratoriepersoner som hadde hatt viruset og var serologisk VCA<+>, og (c) prøver underkastet en klinisk laboratorietesting fra pasienter med en IM-lignende sykdom. 28 av de 30 sera fra pasienter klinisk identifisert som å være i den akutte fase, ble bedømt som akutte ved begge bestemmelser. 2 sera bedømt som å ikke å gi noe resultat i den lengre bestemmelse på grunn av et IgM-nivå under det minimale som var nødvendig, ble også bedømt som å være akutt fasesera i den kortere bestemmelse.

Generell overensstemmelse ble observert med de andre grupper av sera med ytterligere eksempler på et resultat bedømt for et serum i den kortere, visuelle bestemmelse hvor intet resultat ble nedtegnet ved den lengre, kvantitative bestemmelse. I tillegg var det også noen få tilfeller hvor resultatene var forskjellige.

I en etterfølgende klinisk studie ble den tilnærmet 6 minutter lange bestemmelse funnet å ha en spesifisitet og sensibilitet for akutt fase-EBV-IM på 94-95%.

E. Cellekulturer

Evnen til reseptormolekylene ifølge oppfinnelsen til å immunreagere med EBNA produsert i celler, ble studert som tidligere beskrevet under anvendelse av WI-L2-, Raji-, Daudi-og BJAB-cellelinjer. WI-L2-celler (ATCC CRL 8155 W1L2-NS, American Type Culture Collection, Bethesda, MD) er en EBV-genom-positiv, ikke-produserende B-lymfoblastcellelinje av-ledet fra en human pasient med arvelig sferocytisk anemi. Levy et al., Cancer 22:517-524 (1968).

Raji-celler (ATCC CCL 86, American Type Culture Collection, Bethesda, MD) er en EBV-genom-positiv, EBNA-produserende, lymfoblastlignende cellelinje fra et Burkitt lymfom. Epstein, J. Nat. Cancer Inst. 34:231 (1965). Daudi-celler (ATCC CCL 213, American Type Culture Collection, Bethesda, MD) er også en EBNA-produserende cellelinje. BJAB-celler er en ikke-EBNA-produserende lymfocyttcellelinje tilgjengelig fra Scripps Clinic and Research Foundation,

La Jolla, CA.

De ovenfor angitte cellelinjer ble dyrket i RPMI 1640-medium [Moore, J. Am. Med. Assoc. 199:519-524 (1967); og Morton, In Vitro 6:89-100 (1970)] supplert med 2 mM L-glutamin og 10% kalvefosterserum.

CMV-stamme AD-169-celler var en gave fra

dr. D. Richman, University of California, San Diego. Viruset ble propagert i human fibroblastlinje GM-2504 erholdt fra Human Genetic Mutant Cell Repository (Camden, NJ). Cellene ble dyrket i DMEM-medium inneholdende 10% kalvefosterserum og ble infisert like før sammenløpning til en multiplisitet på 3. Celler ble høstet etter 9 dager ved vasking to ganger med PBS, og ekstrakter ble fremstilt ved tilsetning av 10 ml DEM [2% SDS, 2% 2-mercaptoethanol, 0,0004% bromfenoIblått, 40 millimolar (mM) Tris-HCl, pH 6,8 og 15% glycerol)] inneholdende 10 ug/ml fenylmethylsulfonylfluorid direkte til en 150 cm 2vevd<y>rknmgskolbe inneholdende de adherent infiserte celler. Kolben ble skrapt med en celleskraper, og løs-ningen ble fjernet, kokt i 2 minutter og lagret ved -20°C.

F. Helcellekstrakter

Ekstrakter av EBNA-produserende og ikke-produserende (kontroll) celler ble fremstilt for å bestemme hvorvidt reseptormolekylene ifølge oppfinnelsen var anvendbare for diagnose for EBNA-ekspresjon. Celler fra kulturer beskrevet ovenfor, ble vasket i fosfatbufret saltvann (PBS; 150 mM NaCl, 10 mM natriumfosfat, pH 7,4) inneholdende 0,2 mM fenyl-methylsulfonylf luorid, svellet i 5 minutter i reticulocytt standardbuffer (RSB; 10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM fenylmethylsulfonylfluorid) og ble lysert ved lydbehandling i 3-5 volumer RBS justert til 0,2-0,35 molar (M) NaCl. Etter 30 minutter på is ble soni-katet sentrifugert ved lO.OOOxg i 15 minutter for å fjerne cellebrokker.

G. Immunblottingsprosedyrer

Celleekstrakter erholdt som ovenfor beskrevet, ble undersøkt med hensyn til EBNA under anvendelse av humansera kjent for å inneholde anti-EBNA-antistoffer eller eksempelvis reseptormolekyler ifølge oppfinnelsen. Ekstraktene ble enten konsentrert ved utfelling med 2 volumer ethanol ved -20°C i ca. 18 timer og ble deretter oppløst i prøvebuffer [SB; 10% glycerol, 2% 2-mercaptoethanol, 1% natriumdodecylsulfat (SDS), 0,002% bromfenolblått, 40 mM Tris-HCl (pH 7,4)] eller fortynnet 1:6 i prøvebuffer for SDS-polyacrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE). 7,5% polyacrylamidgeler ble støpt og kjørt i henhold til prosedyren ifølge Laemmli, Nature, 277:680-685 (1970), idet det ble påført 50 til 200 ug totalt protein pr. spor.

Etter elektroforese ble proteinbåndene fra SDS-polyacrylamidgelene overført elektroforetisk til en fast bærer i form av nitrocelluloseark (Schleicher og Schuell, Detroit, MI) ved prosedyren ifølge Towbin et al., Proe. Nati. Acad. Sei., U.S.A., 76:4350-5354 (1979). Dette ble utført ved anvendelse av en Bio-Rad Trans-Blot apparatur (Bio-Rad, Richmond, CA) ved 70 volt i 2-3 timer i 12,5 mM Tris-hydroxyd, 96 mM glycin og 20% methanol.

Etter overføringen ble nitrocellulosefiltrene eller avtrykkene mettet i 1 time i enten 2% BSA (w/v) i PBS eller 2% pulverisert melk (w/v) i PBS for å redusere ikke-spesifikk binding. Avtrykkene ble deretter immunreagert med 0,1 ml av enten EBNA-positivt, humant serum eller kanin-anti-polypeptid-antistoffer i 2 ml PBS eller 2% melk i 1 time ved 37°C.

Anti-peptid-antistoffer bundet til EBNA-protein ble påvist ved omsetning av avtrykkene med et indikerende middel. I dette tilfelle ble 20 ml <125>I-merket [200.000 tellinger, pr. minutt pr. milliliter (cpm/ml), 10<6> tellinger pr. minutt pr. milligram (cpm/mg)] S. aureus protein A (Calbiochem, La Jolla, CA) brakt i kontakt med immunreaksjonsproduktet i 30 minutter ved 37°C. Avtrykkene ble vasket med PBS og eksponert på Kodak XAR røntgenfilm over natten ved -70°C.

I en alternativ prosedyre ble de cellulære, protein, holdige ekstrakter fylt på en 13 cm vid spalte av en 7,5% acrylamidgel og elektroforert. Innholdet av den elektro-forerte gel ble overført til nitrocellulose som tidligere beskrevet [Billings et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80:7104-7108 (1983); Rumpold et al., J. Immunol., 138:593-599 (1987); Rhodes et al., J. Exp. Med., 165:1026-1040 (1987)]. Sera ble fortynnet 1:20 eller 1:50 i en pulvermelk- (PM) buffer (3% pulvermelk i 0,05 M borat,

0,15 M NaCl, pH 8,3), og ble brakt i kontakt med remsen i 1 time ved romtemperatur for å immunreagere antistoffer i seraene med proteinene. Remsene ble deretter vasket, og immunreaktiviteten ble bestemt ved inkubering med en løsning av 0,6 ug/ml (i PM) av affinitetsrenset kanin-anti-humant IgM (Jackson Laboratories, Avondale, PA) eller affinitetsrenset kanin-anti-humant IgG-antistoffer fra samme kilde.

Etter vasking ble remsene omsatt med en påvisnings-løsning av et 12<5>I-geite-anti-kanin-IgG-antistoff som tidligere beskrevet [[Rumpold et al., J. Immunol. 128:593-599

(1987); Rhodes et al., i Herpesvirus, R. Rapp red.,

Alan R. Liss, New York; s. 487-496 (1984); Rhodes et al.,

J. Immunology 134:211-216 (1985); Smith et al., J. Infect. Dis. 154:885-889 (1986); Geltosky et al., J. Clin. Lab. Analysis, 1:153-162 (1987); og Rhodes et al., J. Exp. Med., 165:1026-1040 (1987)], og bånd ble påvist ved autoradiografi som tidligere beskrevet.

Syntetiske peptidinhibiberinger ble utført ved fortynning av seraene 1:50 i PM og tilsetning av fritt peptid til en sluttkonsentrasjon på 400 ug/ml for å inhibere IgM-antistoff, og 20 til 50 ug/ml for å inhibere IgG-antistoff. Denne løsning ble opprettholdt (inkubert) over natten ved 4°C og ble deretter anvendt for å avtrykke som ovenfor beskrevet.

H. Immuniseringer

Reseptormolekylene ifølge oppfinnelsen innbefatter hele antistoffer dannet i pattedyr ved immunisering av disse med inokula innbefattende et polypeptid og/eller multimer., som tidligere beskrevet. Både polypeptider og multimerer kan anvendes innbefattet i inokula alene eller konjugert til et bærerprotein slik som albuskjellhemocyanin (KLH). Imidlertid anvendes polypeptidene fortrinnsvis som et konjugat, og multimerene anvendes fortrinnsvis alene.

Kaniner ble immunisert med inokula inneholdende

1,0 mg konjugat i Freunds komplette adjuvans (CFA) og ble injisert 1 måned senere med 1,0 mg konjugat i Freunds ufull-stendige adjuvans (IFA). Hver immunisering besto av en sub-kutan injeksjon bak på hoften. Kaninene ble tappet for blod 1 og 2 måneder etter den andre injeksjon.

Sera inneholdende immunologisk aktive antistoffer, ble deretter produsert fra blod ved metoder velkjente innen faget. Disse antistoffer immunreagerte med ett eller flere av polypeptidene ifølge oppfinnelsen og en EBNA-antigenisk determinant. De kan således anvendes i et system for å bestemme EBNA.

Individuelle inokula ble fremstilt med CFA eller IFA som følger: En mengde av konjugat tilstrekkelig til å tilveiebringe den ønskede mengde av polypeptid pr. inokulering (f.eks. 1 mg), ble oppløst i PBS (til ca. 0,5 ml) ved pH 7,2. Like volumer CFA eller IFA ble deretter blandet med konju-gatløsningene for å tilveiebringe et inokulum inneholdende konjugat, vann og adjuvans hvori vann-til-olje-forholdet var 1:1. Blandingen ble deretter homogenisert for å tilveiebringe inokula. Volumet av et således fremstilt inokulum var typisk større enn 1 ml, og noe av konjugatet, PBS og adjuvans ble tapt under emulgeringen. Hovedsakelig alt av emulsjonen som gjenvinnes, ble anbrakt i en sprøyte og ble deretter innført i kaninene som ovenfor diskutert. Mengden av inokulum innført i kaninene, er antatt å ha vært ca. 90% av det tilstedeværende før emulsjonstrinnet.

De ovenfor angitte inokula-lagerløsninger er illustra-tive for inokulaene ifølge oppfinnelsen. Som demonstrert her, kan de anvendes for å fremstille reseptormolekyler som immunreagerer med EBNA.I.

• -a Immunfluorescensprosedyrer

En annen illustrativ metode for bestemmelse av EBNA

i en kroppsprøve anvender reseptormolekyler ifølge oppfinnelsen og et fluorkromatisk, indikerende middel for å påvise produktet av en reseptor-EBNA-immunreaksjon.

I foreliggende studie ble 2x10 4 WI-L2-celler, dyrket som ovenfor beskrevet, utspredt på et klart mikroskopglass under anvendelse av en cytosentrifuge ("Cytospin", Shandon Southern, Astmoor, Runcorn, Chesire, England). Etter luft-tørking i 5 minutter ble cellene fiksert i aceton i 2 minutter og ble deretter tørket i 2 minutter ved 20°C. Glassene ble deretter lagret ved -20°C inntil bruk.

De fikserte WI-L2-celler ble undersøkt med hensyn til EBNA under anvendelse av kanin-anti-polypeptid-antistoffer (reseptorer ifølge oppfinnelsen) dannet mot polypeptid P27, P60, P62 og P89. 50 ul av hvert kanin-antiserum, fortynnet 1:10 i VBS-buffer (120 mM barbitol, pH 7,3, 144 mM NaCl,

2,5 mM MgCl2 og 0,75 mMCaCl2) ble inkubert (brakt i kontakt og opprettholdt i kontakt med de fikserte celler) ved 20°C på et glass i et på forhånd bestemt tidsrom (f.eks. 30 minutter) tilstrekkelig til at antistoffene og EBNA fikk immunreagere. Et negativt kontrollglass ble behandlet på identisk måte med normalt kaninserum.

Under den ovenfor angitte inkubering immunreagerte en del av anti-polypeptid-antistoffene med EBNA tilstedeværende i de fikserte WI-L2-celler. Ubundne antistoffer ble fjernet ved vasking med VBS under dannelse av bare EBNA-reseptorimmunreaksjonsproduktet på glasset.

Anti-polypeptid-antistoffer bundet til EBNA, ble påvist ved først å inkubere 50 ul marsvinkomplement (Tago, Burlingame, CA) fortynnet 1:10 i VBS på hvert glass i et tidsrom (30 minutter) tilstrekkelig for at komplementet fikk bindes til reseptorene. Glassene ble deretter vasket med VBS for å fjerne ethvert komplement som ikke var bundet til kanin-anti-polypeptid-IgG.

Fluorescein-merket geite-anti-marsvin C^ (merket anti-komplement-antistoffer, Cappel Laboratories, Cochran-= ville, PA) ble anvendt for å påvise antigen-antistoff-komplementkompleksene. 50 ul av det indikerende antiserum fortynnet 1:20 i VBS, ble inkubert som ovenfor beskrevet på hvert glass i 30 minutter ved 20°C. Ubundet geite-anti-marsvin C^ ble vasket fra glasset med VBS. Immunreaksjons-produkter ble deretter visualisert ved fluorescentmikroskopi.

J. Sirkulær dikroismespektroskopi

De strukturmessige egenskaper til polypeptidene ble undersøkt for å utrede enhver sekundærstruktur som kunne være nødvendig for polypeptidimmunreaksjon med humane anti-EBNA-antistof fer . Polypeptidene ble oppløst til en konsentrasjon på 1 mg/ml i fosfatbufret saltvann (PBS). Spektra ble tatt under anvendelse av 1 ml prøver i et Cary 61 spektropolarimeter (Cary Instruments, Applied Physics Corp., Monrovia, CA) tilpasset og automatisert med en Digital Equipment Corporation 11/02 regnemaskin (Digital Equipment Corporation, Maynard, MA). Gjennomsnittet av 10 suksessive avsøkninger for hvert polypeptid ble nedtegnet som vist i figur 1.

K. Prøvekilder og serologi

Serumprøver anvendt her, ble erholdt fra et utall kilder. Ett sett av sera for disse studier ble erholdt fra 13 pasienter med EBV-fremkalt IM. Heterofile antistoffer spesifikke for IM, var tidligere blitt identifisert i 10 av

13 pasienter ved anvendelse av en hestecelle-differensial-adsorpsjonsrørtest. Heterofile antistoffer ble ikke påvist i to pasienter til tross for testing ved et utall metoder. Ett individ hadde ikke-diagnostiske, lave nivåer av heste-celle-agglutininer som ble påvist i bare én enkelt prøve trukket ut under den akutte fase av hennes sykdom. Denne pasient ble betraktet å være heterofil-negativ for denne studies formål. Serologiske data viste bevis på pågående, primære EBV-infeksjoner fra de tre heterofil-negative pasienter.

Dataene fra to av de ti heterofil-positive og to av de tre heterofil-negative pasienter er tidligere blitt publisert [Horwitz et al., Am. J. Med. 63:947-957 (1977)]. For foreliggende studie ble EBV-serologiske tester utført

på tidligere fryste serumprøver ved indirekte immunfluorescens med kommersielt tilgjengelige tester for IgG- og IgM-antistoffer mot VCA (Litton Bionetics, Inc., Charleston,

SC) .

En annen gruppe av sera ble anvendt for EBV-IM- og CMV-IM-studiene. I denne gruppe av prøver hadde én pasient (D.B.) en typisk episode med heterofil-positiv EBV-IM etterfulgt av en begivenhetsløs, klinisk bedring. Under den akutte fase av sykdommen utviklet han høye titere av antistoffer mot VCA (MgM = 1:80 og VCA-IgG 1:1280) uten ledsagende antistoffer mot anti-EBNA (1:2). 174 dager etter starten var IgM-anti-VCA-antistoffer ikke lenger påvisbare, mens anti-EBNA var blitt utviklet mellom 76 og 111 dager. Antistoffer mot CMV ble ikke påvist i seriesera ved komplementfiksering (1:8). En andre pasient (D.S.) hadde en iriitialaktiv, sannsynligvis primær cytomegalovirus- (CMV) infeksjon (CMV-IM) som ble etterfulgt fire måneder senere med en primær EBV-infeksjon. Denne pasient utviste CMV-makroglobuliner (1:256), en firedobbelt stigning i antistoffer mot anti-CMV ved komplementfiksering (CMV-CF) og ingen antistoffresponser mot noen EBV-beslektede antigener. Under hans andre sykdom som startet 124 dager etter starten av den første, oppsto en primær EBV-infeksjon karakterisert ved IgM-anti-VCA (1:320) og et initialt fravær (1:2), men senere utvikling av antistoffer mot EBNA. IgM-antistoffene mot VCA forsvant med serievis testing. Under hans andre sykdom (EBV-IM) var CMV-makroglobuliner (CMV-IgM) ikke lenger påvisbare, mens komplement-fikserende antistoffer mot CMV fremdeles var til stede på stabile nivåer på 1:128.

Sera var også tilgjengelige fra ti andre pasienter tatt under de forskjellige faser av CMV-fremkalt mononukleose. Deres akutt-fasesera viste signifikante titere (=1:32) av CMV-makroglobuliner og anti-CMV (CF) i alle tilfeller. Firedoble titerstigninger eller fall ble observert ved kom» plementfiksering i seks av de ti (6/10) serievis prøvede pasienter. Alle ti pasienter utviste serologiske bevis på gamle EBV-infeksjoner med moderate, konstante nivåer av anti-VCA (IgG) anti-EBNA (1:10) og ingen antistoffer mot anti-VCA-(IgM). Enkelte data fra de sistnevnte elleve pasienter er innbefattet i en tidligere rapport [Horwitz et al., Medicine, j>5:124-133 (1986)].

Bestemmelser for EBV-beslektede antistoffer mot VCA (IgM og IgG), tidlige antigener (EA), og EBNA, såvel som CMV-makroglobuliner (CMV-IgM), ble utført ved standard indirekte immunfluorescent- (IFA) prosedyrer [Horwitz et al., Medicine, 65:124-133 (1986)] og Henie et al., Human Pathology, 5:551-565 (1974)]. Anti-CMV ble også påvist ved komplementfiksering under anvendelse av AD-169-stammen av virus (Microbiological Associates, Bethesda, Maryland).

Claims (8)

1. Polypeptid for anvendelse ln vitro inneholdende 15 til 40 aminosyrerester, karakterisert ved at det har en sekvens svarende til sekvensen av det CMV-kodede polypeptid vist i figur 13, hvilken sekvens innbefatter en sekvens definert ved formelen: -Gly-R^-Gly-R^-Gly hvori R<1> og R<2> betegner aminosyrerester som når de tas individuelt, er like eller forskjellige og er Ala, Asn, Arg, Gly, Leu, Pro, Ser og Thr, forutsatt at R<1> og R<2> ikke begge er Gly, farmasøytisk akseptable salter derav og antigenisk beslektede varianter derav.

2. Polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at angitte polypeptid har en aminosyrerestsekvens som innbefatter en sekvens valgt fra gruppen bestående av: a > -Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala- Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly,Gly-, og<b>) -Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-

3. Polypeptid ifølge krav 2, karakterisert ved at angitte polypeptid har en sekvens valgt fra gruppen bestående av: a > H-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly- Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly,Gly-OH, b > H-Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Gly- Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-OH, og c) H-Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Cys-OH

4. Fremgangsmåte for identifisering av anti-EBNA-antistoffer i en kroppsvæske, karakterisert ved at den omfatter: a) blanding av angitte kroppsvæske med det angitte polypeptid ifølge krav 1 under dannelse av en immunreaksj onsblanding; b) opprettholdelse av angitte blanding i et på forhånd bestemt tidsrom tilstrekkelig for at ethvert av angitte anti-EBNA-antistoffer får immunreagere med angitte polypeptid under dannelse av en immunreaktant, og c) bestemmelse av nærvær av angitte immunreaktant og derved nærvær av angitte anti-EBNA-antistoffer i angitte prøve.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4 karakterisert ved at angitte polypeptid er valgt fra gruppen bestående av: a) H-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly,Gly-OH, b) H-Ser^Ser-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Gly- Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-OH, og c) H-Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Cys-OH

6 . Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at angitte trinn (c) omfatter trinnene for: i) blanding av immunreaktanten fra trinn (b) med merket immunreaktant, og iii) bestemmelse av nærvær av angitte, merkede immunreaktant og derved nærvær av anti-EBNA-IgM-antistoffer i angitte prøve.

7. Diagnostisk system i settform for bestemmelse av nærvær av anti-EBNA-antistoffer i en kroppsprøve, - -a karakterisert ved at det omfatter i separate forpakninger: a) et polypeptid ifølge krav 1, og b) et indikerende middel for signalisering av immunreaksjonen av angitte polypeptid med humane anti-EBNA-anti-stof fer .

8. Diagnostisk system ifølge krav 7, karakterisert ved at det angitte polypeptid er valgt fra gruppen bestående av: a) H-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly,Gly-OH, b) H-Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-OH, og c) H-Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-AJa-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Cys-OH og angitte, indikerende middel er et anti-humant IgM-enzymmerket antistoff.