JPH0614053B2 - ヒトサイトメガロウィルス特異的ＩｇＭの検出方法及びそのための手段 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明はヒト−サイトメガロウィルス(HCMV)−特異的
抗体の検出方法、及びそのための手段に関する。

サイトメガロウィルス(CMV)なる語は、臨床サンプルか
ら独立に単離された広範囲の種類の密接に関連するウィ
ルスの異る株(atrain)を包含する。現在の技術は独立に
単離された異る株間の関係を明確に確立することができ
ない。従って、サイトメガロウィルスは、 1.ヘルペスウィルス科、 2.組織学的に染色した場合に容易に認識し得る核内イン
クルーションを示す感染されたヒト細胞試験管内培養
物、 の性質を示すヒト−サンプル又は天然源由来のウィルス
と定義される。

CMV感染は医療的に最も重要な先天性ウィルス感染であ
る（CID、子宮内死、早熟、奇形、身体的及び精神的遅
延）。CMV感染の症状は次の通りである。

一次感染−新生児感染、CMV−誘発単核症様症候群、肝
炎。

活性化感染(reactivated infection)−輪注熱、間質性
肺炎、脈絡網膜炎、悪性疾患の合併症。この発明におい
て使用するモノクローナル抗体は、マウス骨髄腫細胞系
由来の細胞とＨＣＭＶによってあらかじめ免疫されたマ
ウス由来の細胞との融合により形成されたハイブリドー
マにより産生され得る。異るモノクローナル抗体のカク
テルは(1)異る抗原を認識することができ、又は(2)異る
エピトープを認識することができ、あるいは(3)アイソ
タイプを異にする。

先天性CMV感染の実験室診断は特に、生後２週間以内に
新生児からウィルスが分離されることを必要とする。CM
V−感染患者は長期にわたって、唾液、尿、精液、頸管
分泌物、及び便中にウィルスを排出する。

ウィルスの証明は試験管内においてヒト−細胞の３〜６
週間の感染を必要とし、しばしば長期に失して治療を遅
らせる。

現在用いることができる血清学的方法（補体結合法、免
疫結合法、ラジオイムノアッセイ法及びELISA法）は、C
MV−特異的IgM及びIgG抗体の間の識別を十分に行わな
い。IgM抗体は最近の感染の指標であり、従ってこの抗
体に対して特異的な試験が必要である。

この発明の範囲内において、モノクローナル抗体がCMV
感染の迅速な検出及びCMV−特異性IgMの特異的検出のた
めの卓越した方法、並びに一般的血清学的方法のために
ふさわしい試薬を提供することが証明された。

幾つかの個々のモノクローナル抗体はウィルスの異る蛋
白質又は糖蛋白質成分に結合し、他方その他の抗体は異
るエピトープを認識するが同一の又は類似の蛋白質又は
糖蛋白質（これらの分子量により定義される）と結合す
る。さらに、この集合はアイソタイプを相互に異にする
抗体から成ることが認識されている。

この発明のその他の特徴は、これらの抗体が、別々であ
っても又は集合としても、「イムノドット(imunodot)」
試験、又はウィルス抗原の直接検出に関連する任意の類
似の変法により、臨床サンプル中のウィルス粒子又は抗
原を直接検出するために使用することができることであ
る。

要約すれば、この発明は、前初期(immediateearly)及び
／又は初期(early)HCMV抗原と反応性のモノクローナル
抗体の使用、具体的には、HCMV−特異的IgMの検出のた
めのその使用に関する。

モノクローナル抗体の製造はそれ自体公知の細胞融合技
法によって行われ、この方法においては骨髄腫細胞と、
ＨＣＭＷ抗原によってあらかじめ免疫されたマウスの脾
細胞とが融合される。生ずるモノクローナル抗体のタイ
プ、及び異るHCMV抗原に対するそれらの反応性のスペク
トルはマウスを免疫するのに使用された抗原標品の性質
によって決定される。この発明においては、異るHCMV抗
原に対して反応性の種々のモノクローナル抗体を得るた
めに、感染の異る段階におけるHCMV感染ヒト細胞抽出物
の抽出により、そして異る抽出技法により得られた種々
の異る抗原標品が使用される。

次に例によりこの発明をさらに詳細に説明する。

モノクローナル抗体の製造 (a)抗原の調製 HCMV ＡＤ１６９及びデービス(Davis)の実験室株をヒ
ト胚線維芽細胞(HEF)組織培養物中に増殖せしめた。完
全な細胞変性効果が観察されたときウィルスを回収し
た。このために８〜１０日間の感染後期間(pest-infect
ion ,p.i.)を要した。2,０００rpm１０分間で土清から
細胞片を除去した後、2,５０００rpm（Ｔ３５固定角ロ
ーター）で３時間、又は３５,000rpmで２時間にわたっ
てウィルスをペレット化した。濃縮されたウィルスを７
０％シュークロースクッション及び２０％シュークロー
スクッションの間で部分的に精製した。クッション層形
成は２8,０００rpm（ＳＷ２8.１ローター）において３
時間にわたって行った。７０％シュークロースクッショ
ン上に層形成したウィルスバンドを燐酸緩衝化塩溶液(P
BS,pH7.2,0.01M)に対して透析し、そして蛋白質の量を
２８０nmにおける吸収を読み取ることにより決定した。
蛋白質の量はDavis感染HEF細胞を収容する１７５cm²フ
ラスコ２本から約６７０μｇ／mlであった。サンプルは
その感染性を保持していた。この理由は、マウス細胞に
おけるHCMVの前初期抗原及び初期抗原の生体内誘導を許
容することである。

(b)マウスの免疫 生後１５週間のBalb/e/J雌性マウスを、シュークロース
クッション精製したHCMV抗原により免疫した。安定乳剤
の形で不完全フロインドアジュバントと共に、及びこれ
を伴わないでHCMV蛋白質を用いて１回の腹腔内注射を行
う。この蛋白質濃度は４５μｇ〜１６５μｇと変化し、
そして第１表に示す。免疫後２０〜２３日目に尾部静脈
から試験採血した。

前初期（α）、初期（β）及び後期（γ）HCMV抗原の範
囲に対して、１／４０稀釈において間接免疫螢光法によ
りマウス血清を試験した。

HCMV抗原を未稀釈ラビット血清でブロックすることによ
り、HCMV株により誘導されたFeリセプターを介しての非
特異的結合を除去した。マウス血清における反応性を、
抗−マウスIgGフルオレッセインイソチオシアネート(FI
TC)接合体を用いて、接合体の各バッチに特異的なあら
かじめ定められた稀釈において検出した。

免疫抗原の詳細な記載及びマウスの前選択の結果を第１
表に示す。これらのマウスを細胞融合において最終的に
使用した。選択されたすべてのマウスが、この段階にお
ける未感染細胞抗原に比較して優先的な反応をHCMV(AD1
69又はDavis)感染細胞に対して示した。第１注射から７
０〜１９８日後（第１表）に、記載された量の蛋白質／
マウスを用いて２回マウスを追加免疫した。この第２接
種のためにはアジュバンドを使用しなかった。追加免疫
の４日後、マウスを殺し、そしてモノクローナル抗体の
調製のために脾臓を取り出した。

(c)細胞培養及び細胞融合 次の材料及び培地を使用した。RPMI１６４０はフロウ(F
low)から得た。これを、ピルビン酸ナトリウム(1.8m
M)、グリタミン(2.0mM)、ペニシリン（１００ユニット
／ml）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ml）と共
に新らしく調製した。完全HAT培地は完全PMPI 1640とヒ
ポキサンチン（１０^-4Ｍ）、アミノプテリン（４×１０
^-7Ｍ）、チミジン（1.５×１０^-5Ｍ）及び１０％ウシ胎
児血清（ＦＣＳ）から成る。RPMI 1640中ポリエチレン
グリコール4,０００（PEG4,０００、メルク）の５０ｗ
／ｖ％溶液を調製した。

HAT培地感受性細胞系であるアザグアニン耐性Ｐ３×６
3.Ag8/NS-1との融合を、Fazekas de St.Groth及びSchei
digger，ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド
(J.Immunol.methods)，３５，１−２５（１９８０）に
より記載された方法に従って、この方法にわずかな変更
を加えて行った。脾細胞(splenocyte)をワイャーメッシ
ュを通して血清不含RPMI 1640中に圧し出すことによっ
て脾臓細胞(spleen cell)を得た。骨髄腫細胞をその増
殖の対数期（１０⁵〜１０⁶細胞／ml）において得、そし
て培地を除去した。次にこれらを第２表に記載する比率
において懸濁し（即ち、融合Ａの比率を7.2×１０⁷個の
脾細胞と１０⁷個のP3×63.Ag8/NS-1骨髄腫細胞系とから
構成し、そして３０mlの円錐形汎用容器に収容した２０
mlの血清不含培地中で、２００×ｇにおいて１５分間沈
降せしめ、すべての細胞をペレット化した。

完全に除水された細胞沈降物に１．０mlの５０％PEG4.
０００溶液を６０秒間にわたって滴加した。さらに６０
秒間、３７℃でのインキュベート及び細胞のおだやかな
分散を行った。４〜５分間おだやかに振とうしながら１
０mlの血清不含RMPI１６４０を加えた。

細胞混合物をペレット化し、そして血清不含培地を１０
％のFCSが補充された１０mlの培地で置換した。１匹の
マウスからの１０mlの正常脾細胞をフィーダー細胞とし
て加えた。細胞を３７℃にて１時間置き、この培地を６
０mlの完全HAT培地で置換し、そして次に９６ウエルプ
レート６枚に入れた（１００μｇ／ウエル）。まず、１
００μｌの完全HAT培地を培養物に加え、そして次に培
養の半分を新鮮なHAT培地で置換し、これを１週間に２
回行った。

(d)免疫螢光法によるCMV特異的ハイブリドーマの検出 CMV感染HEFを感染後種々の時点において用いて標準的間
接免疫螢光法を適用した。

HCMV細胞を３〜４mmのガラス球と共に、前初期抗原
（α）については感染後１４時間目、すなわち１００μ
ｇ／mlのシクロシヘキシミドによる１２時間のブロック
及び２時間のブロック解除後、及び初期抗原（β）につ
いては４０μｇ／mlのホスホノ蟻酸(phosphonoformic a
cid)による２４時間のブロックの後、及び後期HCMV抗原
（γ）については感染の５日後に、崩壊させた。

３×１０⁴細胞／スポット空気乾燥し、そして冷アセト
ン中で固定した。連続使用のためスライドをシリカゲル
と共に−２０℃にて貯蔵した。HCMV感染細胞を未稀釈ラ
ビット血清によりブロックし、非特異的Fc-リセプタ−
結合をブロックした。すべてのハイブリドーマからの上
清を、感染細胞及び未感染細胞との反応について評価し
た。これを、抗−マウスIgG FITC接合体、及びＵＶ付属
部品を有する顕微鏡を用いて監視した。ラビット血清又
はウシ胎児血清と交差反応しないために抗−マウスIgG
FITCが必要であった。

(e)ELISAによるCMV特異的ハイブリドーマの検出 この方法は、Booth等（１９７９），ジャーナル・オブ
・クリニカル・パソロジー(J.Clin.Pathology)，３２，
１２２−１２７の方法の変法である。グリシン緩衝液(p
H9.6)感染細胞抽出液をCMV抗体陽性ヒト血清を用いて検
定した。次に、0.1％のナトリウムアジドが補充された
炭酸水素ナトリウム緩衝液pH9.6中で４℃にて１６時間
ポリビニルクロリドプレートを被覆するために検定され
た稀釈（通常1/200〜1/800）を用いた。残りの結合部位
を燐酸緩衝化塩溶液(PBSpH7.2)中３％卵白アルブミン溶
液を用いて２０℃にて２時間ブロックした。未稀釈のハ
イブリドーマ培養上清液をHCMV抗原と反応せしめ、そし
てマウス抗体結合を抗−マウスIgGアルカリ性ホスファ
ターゼ（ＡＰ）接合体により検出した。プレートをPBS
＋0.1％トウィーン８０により５回洗浄した。ＡＰ基質
の転換を４５０nmにおいて監視した。

結果 (a)免疫螢光法による最初のスクリーニング まず５匹のマウスを選択し、これらの脾臓を用いてマウ
ス骨髄腫細胞系との融合を行った。第１表はこれらのマ
ウスにおける抗体反応を示す。これらすべてが、融合に
先立って、細胞性抗原との反応に比べてウィルスポリペ
プチドとの一層大きな反応性を示した。

２８８６個の可能性ある培養ウエル中１２９０個がハイ
ブリードーマの増殖を示した。上清液を、間接免疫螢光
試験において、HCMV特異的抗体について試験した。HCMV
抗原のその範囲を用いて、９４個がCMV感染細胞に対す
る高い結合を示し、そして非感染細胞と全く又はほとん
ど交差反応を示さなかった。免疫螢光のパターンは核か
ら細胞質又は混合まで分布した。これらすべては後期HC
MV抗原と反応した。これらのハイブリードーマ上清液の
４個はさらに前初期及び初期CMV抗原との反応性を示し
た。これらすべてをCHMV-15，CHMV-16，HCMV-17等とHCM
V-100まで命名した。

(b)ELISAによる最初のスクリーニング 同じ上清液をさらにELISA試験により試験した。非常に
少数がELISA抗原との明瞭な反応性を示した。これらの
内の４個がELISA抗原抽出物と相当高い反応性を示し
た。この発明の目的のためにこれら４個のハイブリドー
マ上清液の反応性を第１図に示す。他のハイブリドーマ
上清液は一層低い範囲の反応性を示した。この低い反応
性によりさらに５個の、免疫螢光法により陽性でないハ
イブリドーマを選択した。これにより、ＨＣＭＶ反応性
マウスハイブリドーマ上清液の合計は、１２９０個の増
殖ハイブリドーマ中９９個となった（第２表）。

(c)クローニング及びHCMV特異的抗体の安定化 安定なハイブリドーマ系を調製するために、９９個のHC
MV特異的ハイブリドーマを９６ウエルプレートから２４
ウエルプレート〔コスター(Costar)〕中２×１ml培養に
拡大した。85／９９の特異的培養物が増殖し、そしてこ
の段階において液体窒素貯蔵した。４９個のHCMV特異的
ハイブリドーマを、フィーダー層としてマウす脾細胞を
用いるミクロタイタープレート中での限界稀釈により好
結果にクローニングした。クローニングは、２×１mlの
２４ウエル培養への拡大の時点で開始し、そして必要が
あれば反復し直接に液体窒素中にハイブリドーマを貯蔵
した。ハイブリドーマのクローニングの結果の例を第３
表に示す。クローニングの方法を示すためにこれらのハ
イブリドーマを無作為に選択した。同様の方法で他のす
べてのクローンをクローニングした。８６個の選択され
たハイブリドーマについての、主として免疫螢光に基い
て得られた結果の要約を第４表に示す。各ハイブリドー
マから２〜４個の強い陽性を示す培養物を腹水産生及び
貯蔵の両者のために拡大した。すべてのケースについ
て、液体窒素中で貯蔵する場合これに続くクローンを個
別的に処理した。しかしながら、新名称はこれらのサブ
クローン間の区別を行わない。

(d)免疫グロブリンのアイソタイプ ハイブリドーマ上清液を、アミコン蛋白質濃縮器を用い
て２０倍に濃縮した。これらを鎖特異的抗マウスIg試薬
（マイルスラボラトリーズ）のパネルと反応せしめ、オ
ークターロニー(Ouchterlony)試験において沈澱ライン
を形成した。

γ_2a及びγ_2b鎖に特異的なラビット血清のこのバッチ
は、この系において大きな反応を示す。従って、追加の
確認のために追加の技法を用いた。ミクロタイターポリ
ビニルクロリドプレートを、ラビット鎖特異的ポリクロ
ーナル抗−マウス免疫グロブリン試薬により１／１００
０稀釈において被覆した。

次に、プレートをPBS中３％卵白アルブミン溶液により
ブロックし、そしてポリクローナル試薬を濃縮されてい
ないハイブリドーマ上清液と反応させた。PBS＋0.1％ト
ウィーン８０により５回洗浄した後、結合したマウス免
疫グロブリンを、アルカリ性ホスファターゼ（マイルス
ラボラトリーズ）でラベルした一般的抗−マウス免疫グ
ロブリンを用いて検出した。

アイソタイプの例及び鎖の特徴付けを第５表に示す。

(e)HCMV蛋白質への結合の特異性の評価 ７５cm²のプラスチックフラスコ(Nune)中で、HEF細胞に
５p.f.u./細胞のＡＤ−１６９ウィルウを感染させた。
５日後、感染細胞及び対照細胞を、1/5の濃度の非ラベ
ルメチオニンを含有する培地中５０μＣｉmlの³⁵Ｓ−メ
チオニン(800mCi/mモル；アメルシャム）に暴露した。
２４時間後、ラベルした細胞をTris緩衝化塩溶液(0.1
Ｍ，pH7.4）で３回洗浄し、そして１mlの(1)ＴＴ緩衝液
（１％トリトンＸ−１００），0.1％SDS，５０mM Tri
s，１５０mM Nacl、１００KIUアプロチニン，pH7.2）
中、及び(2)ＮＴ緩衝液〔１％メニデットＰ４０，４０m
M Tris，0.6Ｍ Nacl，２％グリセリン、２ｍＭ CaC
l₂、１ｍＭ Macl₂、４ｍＭ ＥＤＴＡ、pH9.0(Blanton
及びTevethia，1981）中で２０分間可溶化した。細胞を
３０秒間超音波処理し、そしてベックマンＳＷ５０ロー
ター中で３0,０００rpmにおいて遠心分離した。６０0,
０００cpmの可溶化された細胞性抗原を0.5mlのモノクロ
ーナル抗体サンプル（組織培養上清液）と混合し、そし
て混合物を４℃にて一夜インキュペートした。１／２０
０稀釈の抗−マウスIgG（ダコパッツ）が免疫沈澱を助
ける。沈澱を５mgのプロティンＡ−セファロース（ファ
ルマシア、スェーデン）を用いて集め、そしてペレット
を(1)ＴＴ緩衝液で３回、TBSで１回及びＴＢ(pH7.2)で
１回、又はＮＴ洗浄緩衝液（１％ノニデットＰ４０、４
０mM Tris、0.5Ｍ LiCl、0.1Ｍ NaCl、pH7.2）で３
回、TBS及びＴＢで１回、十分に洗浄した。次に、電気
泳動サンプル緩衝液中８５℃にて５分間加熱し、そして
SDSポリアクリルアミドゲルスラブ−ゲル電気泳動(Laem
mli，１９７０）により分離した。蛋白質マーカーとし
てホスホリラーゼＢ ９4,０００；ウシ血清アルブミン
６7,０００；大豆トリプシン阻害剤２0,０００（ファル
マシア，スェーデン）を用いた。ゲルを0.２５％クーマ
シーブルーを用いて染色することによりマーカーを可視
化し、そしてフルオログラフィーに先立って脱色した
（２５％メタノール、５％酢酸）。ジメチルスルホキシ
ド中２０％PPO（２，５−ジフェニルオキサゾール）を
用いてフルオログラフィーを行い(Bonner及びLaskey，
１９７８；Laskey及びMills，1975）、次にＸ−線フィ
ルム（コダックX-matＡＲフィルム）に暴露した。

これらの免疫沈澱の結果の幾つかを第６表及び第２図に
示す。６６Ｋの主なポリペプチドを有する１群のモノク
ローナル抗体について強い結合が見られた。

第２図に示す例にはHCMV-19、HCMV-23、HCMV-24、HCMV-
25（トラックａ、ｂ、ｃ、ｄ）モノクローナル抗体が含
まれ、これらはマトリクスHCMV主要ペプチドであると考
えられる６６Ｋペプチドと優先的に反応する。他のHCMV
ペプチドを免疫沈澱にかけた（第６表）。これと他の１
つの主要なグループノモノクローナル抗体との対比がHC
MV−２９モノクローナル抗体（トラックｆ）により代表
される。このモノクローナル抗体は弱いがしかし完全に
異なるパターンを示す。

RPMI 1640培地及びHCMV感染細胞から抽出された同一数
のカウントを用いる対照（トラックｇ）はHCMVポリペプ
チドをなんら示さなかった。対照未感染細胞もまたこれ
らのモノクローナル抗体と反応しなかった（示されてい
ない）。このことは、HCMV特異的ポリペプチドへのその
特異性を確認するものである。

モノクローナル抗体HCMV-19，HCMV-23、HCMV-24及びHCM
V-25（トラックａ，ｂ，ｃ，ｄ）のパターンの複雑さを
さらに検討した。これらのモノクローナル抗体を用いる
免疫沈澱又はイムノアフィニティークロマトグラフィー
は多数のウィルス成分をもたらすようである。この性質
は、６６Ｋマトリクス蛋白質を含有するこれらのモノク
ローナル抗体の一次反応性と関連し、そしてこの群に特
徴的であった。

これに対して、HCMV-29又はHCMV-31は、同じ抽出標品か
ら少数のポリペプチドを沈澱せしめた（第６表）。

(f)モノクローナル抗体により検出されるHCMV抗原の出
現時期の評価 個々の抗体集成を、感染後種々の時点において誘導され
たHCMV抗原との反応性について、免疫螢光法によるHCMV
抗原の検出において記載した化学的ブロック法を用いて
試験した。種々の交差反応の１例を第７表に示す。HCMV
-19、HCMV-23及びHCMV-24は２つのHCMV株AD169及びDavi
sの前初期抗原（α）、初期抗原（β）及び後期抗原
（γ）と反応し、これに対してHCMV-39はα抗原及びβ
抗原とは免疫螢光を示さず、そしてＡＤ１６９のγ抗原
のみと特異的に反応することが示された。

HCMV-19、HCMV-23及びHCMV-24モノクローナル抗原のカ
クテルは臨床的分離株の抗原の検出において有用であっ
た。尿又は咽喉綿棒の１７個の臨床サンプルをHEF細胞
に通し、そして２４時間固定した。６サンプルにおける
陽性の核免疫螢光の出現はHCMVの古典的な診断的ウィル
ス分離により決定された陽性反応と対応する（第８
表）。

モノクローナルカクテルHCMV-19、HCMV-23及びHCMV-24
を、すべてのHCMV株の迅速検定法において、及びHCMV感
染性の低下の予測（すなわち中和又は抗−ウィルス剤）
においても使用した。

広範囲のHCMV分離株のウィルスサイクルにわたって存在
する抗原を検出することができるモノクローナル抗体に
加えて、この集成体はさらに、ＡＤ１６９株とDavis株
との識別の可能性を示しており、(HCMV-27、HCMV-34及び
HCMV-39)、そしてHCMVの他の株の識別において有用とな
りつつある（第７表）。

(g)抗原捕捉測定(Antigen Capture assay) 発明者等は、HCMV-24及びHCMV-25モノクローナル抗体が
同じ抗原を検出すること、及びもしそうであればこれら
は異るエピトープと反応することを確認することに興味
を持った。このことは、ポリビニルプレートをHCMV-3に
より（第３図）及びHCMV-25により（第４図）被覆する
ことにより達成した。対照プレートは、異なる１セット
のHCMVポリペプチド（１４１Ｋ、６０Ｋ及び３６Ｋ）と
反応することが知られているHCMV-1により被覆した（第
５図）。

第３図から、HCMV-25モノクローナル抗体はHCMV-24に捕
捉された抗原と結合する。この方向は第４図では逆にさ
れている。これらの結果はモノクローナル抗体HCMV-24
及びHCMV-25が同一抗原と反応するがしかし異なるエピ
トープと反応することを示している。直接迅速診断法の
ために、発明者等はポリスチレンビーズ（６mm、ノーサ
ンブリア社）をHCMV-25モノクローナル抗体でコートし
た。これを尿サンプル中の実験室株ＡＤ169抗原の捕捉
において、そして臨床試料の収集にあたって使用した。
CMV抗原の捕捉をHCMV-24モノクローナル抗体によって検
出した（第９表）。

(h)IgM測定（抗体捕捉測定、Antibody captureassay) Sutherland及びBriggs（１９８３）ジャーナル・オブ・
メディカル・ビロロジー(J.Med.Virology)，１１，１４
７−１５９の記載に変更を加えたIgM−抗体捕捉ラジオ
イムノアッセイ(MACRIA)における最終検出系としてモノ
クローナル抗体HCMV-24及びHCMV-25を使用した。要約す
れば、ミクロタイタープレート又はポリスチレンビーズ
（ノーサンブリア社）を抗−ヒトIgM抗体(Seward 1/200
〜1/400稀釈）で被覆し、IgMを特異的に捕捉した。この
ものをグリシン緩衝液抽出HCMV抗原(1/10〜1/40稀釈）
と反応せしめた。この反応を特異的HCMVモノクローナル
抗体で検出した。HCMV IgM陽性ヒト血清〔ＨＳ(1)＋
(4)〕により捕捉された抗原（1/40稀釈）への結合か
ら、モノクローナル抗体は単独で機能するが混合物とし
て使用するのが有利であることが明らかとなった（第１
０表）。HCMV-24、HCMV-25及びHCMV-1のカクテルは単独
のモノクローナル抗体の同じcpmに比べて高い比率を示
した。２つのヒトCMV IgM陰性血清〔ＨＳ(2)＋(3)〕は
この試験においても陰性であることが見出された。

上記のカクテルを用いるヒト血清の収集を１７個の血清
に拡大した（第１１表）。

陽性／陰性抗原比率及び差を用いた。全体的な比率の増
加はこの実験に使用したHCMV抗原の高い濃度（１／１
０）に基く。既知のサンプルのパターンに従って比率及
び差の両者に基く判定により未知ヒト血清群を一層明確
に識別することができる。

(i)イムノドット(Immunodot)測定 イムノドット法は、ハイブリドット過装置を用いる、
ニトロセルロース膜への非特異的蛋白質結合に基礎を置
く。この方法は、９６サンプルを同時に取扱うことを可
能にする。試験尿サンプル（１ml以下）をトラップし、
２〜３時間空気乾燥し、そして膜を３％卵白アルブミン
溶液でブロックする。特異的モノクローナルHCMV抗体を
蛋白質ドットと反応せしめた。モノクローナル抗体の結
合をイムノパーオキシダーゼでラベルした抗−マウス免
疫グロブリン（ビオ−ラド、又はインベレスクリザーチ
インターナショナル）により検出した。酵素の反応性を
３−アミノ−９−エチルカルバゾールを用いて検出し
た。特異的反応は褐色ドットとして現われる。

HCMVモノクローナル抗体集成の能力が全ウィルス粒子及
び感染細胞のグリシン緩衝液(pH9.6)抽出物を用いるイ
ムノドット測定において示される（第６図）。HCMV-1
9、HCMV-23及びHCMV-24のカクテルは両者と反応した。
対照RPMI１６４０培地は陰性であった。モノクローナル
抗体カクテルは１０⁴粒子／ドットまで検出することが
でき、そしてHCMV抗原の存在について臨床サンプルを直
接評価するのに有用である。

幾つかの正常な尿サンプル中に非特異的イムノパーオキ
シダーゼ活性が見られ、これは抗−マウムIgG IPの使用
と関連した。これを、幾らかのCMVモノクローナル抗体
活性を保持した尿サンプルの２％ＳＤＳ前処理により破
壊した。モノクローナル抗体がイムノドットにおいて機
能するためには、上記の前処理を伴って、使用される該
モノクローナル抗体がウエスタン移行(Western transfe
r)(Towbin等、１９７９）において陽性でなければなら
ない。（ウエスタン移行においては、抗原蛋白質が還元
剤により処理され、そしてSDS-PAGEがニトロセルロース
膜に移され、そして抗体と反応する。反応するこれらの
抗体は一次アミノ酸構造を認識しつつあり、そしてその
ために前処理されたサンプルのために使用することがで
きる。）例えば、HCMV-25及びHCMV-1が適当であること
が見出された。

間違った陽性を除去するためにこのような条件を用いな
がら、２１個の未知尿試料を用いることによりイムノド
ット検出技法の実験を続けた。これらの内１４個が組織
培養分離により陽性であった。イムノドットは７／１４
の陽性を検出し、そして間違った陽性結果を与えなかっ
た（第１２表）。陽性試料を見落す傾向が、組織培養分
離における長期遅延の試料について一層しばしば示され
た。検出された陽性について平均分離時間は8.2±４日
であり、そしてイムノドットにより見落された陽性につ
いては組織培養における分離時間が17.4±4.8日であっ
た。組織培養における検出時間は感染性粒子の数／尿中
に存在するHCMV抗原の測定値であろう。このことは、上
記のイムノドット試験は、現在のところ、低い臨床レベ
ルのHCMVを検出するのに十分な感度を有しないことを示
している。しかしながら、感度は例えば現在知られてい
る増幅技法（例えばヨーロッパ特許出願４９６０６Ａ、
２７０３６Ａ、５８５３９Ａ、及び国際出願８１／００
７２５を参照のこと）により上昇せしめることができ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、異るモノクローナル抗体を用いるDavis CMV
抽出抗原希釈物のELISA測定を示す。 第２図は、HCMVモノクローナル抗体を用いる、ＡＤ１６
９感染HEF細胞の³⁵Ｓ−メチオニンラベルＮＴ緩衝液抽
出物の免疫沈澱を示す。 第３図は、HCMV−２４モノクローナル抗体により被覆さ
れたミクロタイタープレートを用いる固相サンドイッチ
測定を示す。HCMV-24抗体に捕捉された抗原（２倍ごと
に稀釈したもの）がHCMV-25モノクローナル抗体
（×）、HCMV-24¹²⁵Ｉモノクローナル抗体（○）、及び
HCMV-1モノクローナル抗体（△）（一定稀釈）と反応す
る。 第４図は、HCMV-25モノクローナル抗体により被覆され
たミクロタイタープレートを用いる固相サンドイッチ測
定を示す。HCMV-25モノクローナル抗体に捕捉された抗
原（２倍ごとに稀釈したもの）がHCMV-24¹²⁵Ｉモノクロ
ーナル抗体（○）、及びHCMV-25¹²⁵Ｉモノクローナル抗
体（×）と反応する。 第５図は、HCMV-1モノクローナル抗体により被覆された
ミクロタイタープレートを用いる固相サンドイッチ測定
を示す。HCMV-1モノクローナル抗体に捕捉された抗原は
HCMV-24¹²⁵Ｉモノクローナル抗体（○）、又はHCMV-25
¹²⁵Ｉモノクローナル抗体（×）と反応しない。 第６図は、イムノドット系における、HCMV-19、HCMV-23
及びHCMV-24カクテルと、ＡＤ１６９及びDavisウィルス
粒子並びにＡＤ１６９グリシン抽出物との反応性を示
す。イムノパーオキシダーゼ（ビオ−ラド）によりラベ
ルされた抗−マウスIgG及び３−アミノ−９−エチルカ
ルバゾール(AEC)基質によりモノクローナル抗体が可視
化される。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】臨床サンプル中のヒトサイトメガロウィル
   ス（ＨＣＭＶ）−特異的ＩｇＭの存在を検出する方法で
   あって、 臨床サンプル中のＩｇＭを、支持体上に固定された抗−
   ヒトＩｇＭ抗体により捕捉し、 捕捉されたＩｇＭをＨＣＭＶ抗原と反応せしめ、そして 結合したＨＣＭＶ抗原を、標識したＨＣＭＶ−特異的モ
   ノクローナル抗体により検出する、 ことを含んで成る方法。
2. 【請求項２】前記モノクローナル抗体の混合物を使用す
   る、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】臨床サンプル中のＨＣＭＶ−特異的ＩｇＭ
   の存在の検出のための測定手段であって、 (i)支持体に固定された抗−ヒトＩｇＭ抗体、 (ii)ＨＣＭＶ−抗原、及び (iii)捕捉されたＨＣＭＶ−特異的ＩｇＭを介して前記
   抗原(ii)が前記固定された抗体(i)に結合する場合に、
   該抗原(ii)に結合することができる標識されたＨＣＭＶ
   −特異的モノクローナル抗体、 を含んで成る測定手段。
4. 【請求項４】前記標識された抗体(iii)が２以上のＨＣ
   ＭＶ−特異的モノクローナル抗体を含んで成る、請求項
   ３に記載の測定手段。