DK172035B1

DK172035B1 - Syntetisk polypeptid, syntetisk polypeptidpodestof, antistof, fremgangsmåde til afprøvning for anti-EBNA-antistoffer i en kropsprøve samt diagnosticeringssystem

Info

Publication number: DK172035B1
Application number: DK156786A
Authority: DK
Inventors: John H Vaughan; Dennis A Carson; Gary Rhodes; Richard Houghten
Original assignee: Scripps Clinic Res
Priority date: 1984-08-08
Filing date: 1986-04-07
Publication date: 1997-09-22
Also published as: IL76037A; US4654419A; USRE33897E; ATE114671T1; ES545971A0; IE851954L; JPS62500027A; WO1986001210A1; AU4721085A; ZA855971B; ES8700442A1; DE3587949T2; DK156786D0; EP0191813B1; EP0191813A1; DK156786A; CA1292839C; EP0191813A4; NZ213035A; AU585529B2

Description

DK 172035 B1

Den foreliggende opfindelse angår et syntetisk poly-peptid, der er ejendommeligt ved det i krav l's kendetegnende del angivne, et syntetisk polypeptidpodestof egnet til at fremkalde antistoffer, hvilket podestof er ejendommeligt 5 ved det i krav 2's kendetegnende del angivne, et antistof produceret mod et syntetisk immunogen, hvilket antistof er ejendommeligt ved det i krav 3's kendetegnende del angivne, en fremgangsmåde til afprøvning for anti-EBNA-antistoffer i en kropsprøve, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved 10 det i krav 4's kendetegnende del angivne, og et diagnosticeringssystem i form af et sæt til afprøvning af tilstedeværelse af antistoffer mod EBNA i en kropskomponent, hvilket system er ejendommeligt ved det i krav 6's kendetegnende del angivne. En hensigtsmæssig udførelsesform for fremgangs-15 måden er angivet i krav 5, og en hensigtsmæssig udførelses-form for systemet er angivet i krav 7.

Epstein-Barr-virus (EBV) er af herpesvirusfamilien og er den fremkaldende faktor ved mononucleosis in-fectiosa (IM) hos mennesker. EBV har også været implice-20 ret i pathogenesen af Burkitt’s lyrafom, næse/svælg-carci-nom og B-lymfocyt-neoplasmer, der opstår hos patienter med immunsuppression. Detaljerede vidnesbyrd har også antydet dette virus' mulige rolle ved human- autoimmun sygdom, såsom rheumatoid arthritis og Sjogren's syndrom.

25 EBV er et yderst almindeligt stof i miljøet, der inficerer 80-100% af individerne i hele verden. Den indledende eller primære infektion kan være akut eller subklinisk. Denne efterfølges af en lang periode, hvor EBV-infektionen er latent i B-lymfocytter, der forekommer 30 i blodstrømmen, lymfekirtlerne og milten.

Latenstilstanden indebærer, at et virus forekommer intracellulært i en ikke-udtalt eller delvis udtalt tilstand.

DK 172035 B1 2

Denne latenstilstand kan reaktiveres. Selv om man kun ved lidt om de værtsfaktorer, som regulerer latenstiden in vivo, er der visse tegn på, at svigt hos én eller flere immunmekanismer er en vigtig faktor.

5 Cytotoksiske og suppressive T-celleelementer i immunreaktionen over for EBV rapporteres at være meget vigtige ved undertrykkelsen af akut EBV-infektion med IM.

De er også vigtige med hensyn til at forhindre den ure-gulerede udvækst af B-lymfocytter, der latent er infΙοβι 0 ret med EBV.

T-Celle-suppressormekanismernes svigt menes -at være afgørende for opståen af afrikansk Burkitt lymfom, næse/svælg-carcinom, B-celle-lymfomer, der opstår som følge af immunsuppressiv terapi, der anvendes for at 15 forebygge afstødning af organtransplantation, og lymfo- mer, der opstår under behandling af forskellige autoimmun--forstyrrelser, jf. Epstein og Achong udg., "The Epstein-Barr Virus.", Spring-Verlag, Berlin, Heidelberg (1970), og Crawford m.fl., Lancet, 1355 (1980). Desuden menes disse 20 T-cellemekanismers svigt og den deraf følgende overproduktion af EBV-inficerede lymfocytter at spille en rolle ved rheumatoid arthritis. Slaughter m.fl., J. Exp. Med. 148. 1429 (1978), Depper m.fl., J. Immunology 127, 1899 (1981), og Tosato m.fl., N. Engl. J. Med. 305. 1238 (1981).

25 De serologiske og celle-formidlede immunreaktio- ner, som efterfølger primær EBV-infektion, er vel dokumenterede og afspejler værtens reaktion på de virale antigener, der kommer til udtryk under infektionsforløbet.

Disse reaktioners profil samt påvisningen af antigenerne 30 i vævene er blevet stadig mere anvendelige ved diagnosticering af med EBV forbundne sygdomme.

Det tidligste med EBV forbundne antigen, der kan påvises efter infektion, er EBV-induceret nukleært antigen (EBNA). EBNA er blevet påvist i kernen i latent 0 3 DK 172035 B1 inficerede, væksttransformerede B-lymfocytter. EBNA er også blevet påvist i kernerne i afrikansk Burkitt-turaor-lyfoblaster og anaplastiske næse/svælg-carcinomceller.

EBNA-koncentrationen i cellekernerne i med EBV 5 inficerede B-lymfocytter svinger under de forskellige faser i cellens reproduktive cyklus. Man mener således, at EBNA cyclisk syntetiseres og nedbrydes. Som følge af en sådan nedbrydning krydser proteinfragmenter (po-lypeptider) af EBNA den celluLære cytoplasma og menes at 10 forekomme eller udtrykkes på den ydre membran. Imidlertid har man ikke indtil nu identificeret specifikke EBNA--nedbrydningspolypeptider.

Man mener, at EBNA-nedbrydningspolypeptider, når de findes i eller på den udvendige cellemembran^udgør 15 et signifikant stimulus for værtens T-lymfocytter og i-gangsætter immunreaktionen, der resulterer i produktion af anti-EBNA-antistoffer. Man mener også, at den specifikke T-cellereaktion mod B-celler, der udtrykker EBNA-nedbrydningspolypeptider på disses overflade,kan 20 bidrage til dannelsen af cytotoksiske og suppressive T-celler, der er vigtige til restriktion af væksten af EBNA-indeholdende (EBV-inficerede) B-lymfocytter.

Således vil prøver for tilstedeværelse af både EBNA- og anti-EBNA-antistoffer være af betydning 25 i mange almindelige kliniske situationer. Desuden vil en vaccine mod med EBV-inficerede B-lymfocytter også have klinisk betydning.

Anti-EBNA-antistoffer afprøves i reglen ved hjælp af den langsommelige anti-komplement-immunfluore-30 sceneteknik (ACIF), jf. Reedman m.fl., Int. J. Cancer 11, 499-520 (1973). Denne prøve indebærer fiksering af EBV-transformerede humane B-celler på et mikroskop-ob-jektglas. Derpå tilsættes forskellige fortyndinger af en patients serum til de fikserede celler. Da antikom-35 plementære sera kan give forkert-negative reaktioner eller prozoner, når de blandes med komplementet (en 2-trins- 0 DK 172035 B1 4 proces), er det vigtigt at fylde prøvecellesmears først med serum, så med komplement og endelig antikomplement--fluorescenskonjugatet (en 3-trins-proces)..

Der er flere problemer forbundet med denne prø-5 ve. Disse omfatter, at prøven er forholdsvis ufølsom og kræver forstærkning formidlet ved komplement. Desuden er denne prøve ikke helt specifik og kan ikke fortolkes hos patienter, hvis serum indeholder antistoffer mod pattdyrecellekerner. Endvidere er de kvantitative 10 resultater, der fås ved hjælp af en anti-komplement immun-fluorescensprøve, vanskelige at reproducere. Som følge heraf og af andre grunde er prøver for anti-EBNA-anti-stoffer i reglen begrænset til nogle få specialiserede laboratorier.

15 De ovennævnte vanskeligheder ved afprøvning af tilstedeværelse af anti-EBNA-antistoffer hidrører fra manglen på forholdsvis rent EBNA. Rensning af EBNA fra pattdyrecellevævskulturer er kompleks på grund af antigenets lave koncentration og polymorfologi. Selv 20 om det er lettere og mindre kostbart at anvende hele celler, der udtrykker EBNA, som i den nuværende teknik, er problemerne med specificitet og reproducerbarhed et direkte resultat af, at der anvendes hele celler.

Genteknologien og syntetisk polypeptidteknik 25 har i den senere tid udgjort løsninger på problemet med at fremstille store mængder protein- og polypeptid-antigener. Imidlertid er begge disse metoder kun effektive, hvis det oprindelige proteins aminosyrerestse-kvens er kendt.

30 Et naturligt proteins aminosyrerestsekvens kan bestemmes ud fra proteinet selv, men dette er ofte vanskeligt. Gen-nucleotidsekvensen, der koder for proteinet, kan også afsløre proteinets aminosyrerestsekvens. Imidlertid har alle DNA-sekvenser tre mulige aflæsnings-35 rammer, som giver hver sit protein. Derfor må man kende den korrekte aflæsningsramme for at kunne udlede den korrekte aminosyrerestsekvens i et protein ud fra dets gen.

0 5 DK 172035 B1

Den korrekte aflæsningsramme for en DNA-sekvens, der koder for et protein, og dermed proteinets aminosyre-restsekvens, kan bestemmes ved brug af antistoffer. Den ne strategi indebærer fremstilling af en række protein-5 fragmenter eller polypeptider, hvis aminosyrerestsekvenser svarer til de sekvenser, der opnås ud fra de tre mulige genprodukter. Proteinfragmenterne eller polypep-tiderne, der inducerer antistoffer/ som immunreagerer med genets naturlige proteinprodukt, identificerer der-10 ved genets korrekte aflæsningsramme. Hvis omvendt antistoffer mod det naturlige protein genkender de fremstillede proteinfragmenter eller polypeptider, er forholdet mellem gen og protein også fastslået.

Heller m.fl., J. Virol. ££/ 311-320 (1982), rap-15 porterer DNA-sekvensen for en del af EBV—genomet, som viser sig at indeholde en intern region, betegnet IR3, bestående af direkte gentagelser af et hexanucleotid og to nonanucleotidsekvenser. De'tyder på, at den sekvens, der omgiver og omfatter IR3, indeholder det gen, der ko-20 der for EBNA. Da man imidlertid ikke vidste, hvilken af de tre mulige DNA-sekvensaflæsningsrammer der var·: translateret, ver Heller m.fl., supra, ikke i stand til definitivt at udlede aminosyresekvensen for det mulige EBNA-protein.

25 I september 1983 rapporterer Hennessy og Kieff,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 5665-5669 (1983), at de havde · konstateret den naturlige aflæsningsramme for den EBV-DNA-sekvens, der blev rapporteret af Heller m.fl., supra. I alt væsentligt isolerede de IR3-DNA, spaltede 30 det i små tilfældige stykker og indsatte stykkerne i lacZ-genet i en E.coli-ekspressionsvektor, så at alle tre EBNA-genaflæsningsrammer blev udtrykt i hver sin klon. lacZ-Genet koder for β-galactosidase, et bakterielt enzym. IR3-lacZ-genfusionsproduktet udtrykkes i 35 E.coli som et fusionsprotein med IR3-proteinsekvensen indsat mellem aminosyrer 7 og 9 (idet 8 er udeladt under konstruktionsprocessen) i 8-galactosidaseproteinmo-lekylet.

0 DK 172035 B1 6

Hennesy og Kieff identificerede en IR3-lacZ-genfusion/ som udtrykte IR3-DNA i dets naturlige aflæsningsramme ved at screene for fusionsproteiner, som genkendes af anti-EBNA-positive humansera. Et således i-5 dentificeret plasmid betegnes pKHl82-44,

For at bekræfte, at proteinet, der udtrykkes af pKHl82-44 indeholder EBNA-specifikke antigene determinanter, dyrkede Hennesy og Kieff, supra, antisera i kaniner mod med cyanogenbromid spaltet (CNBr) IR3-ga-10 lactosidasefusionsprotein. CNBr-fragmentet, der blev anvendt som immunogen, indeholder 53 aminosyrer, der er homologe med EBNA, og 89 aminosyrer, der er homologe med β-galactosidase. Disse antisera genkender naturligt EBNA i med EBV-inficerede celler ved hjælp af in-15 direkte immunfluorescens.

Hennesy og Kieff's resultater syndes at afhænge af EBNA-IR3-domænets gentagelsesnatur. Fusionsproteinet, der produceres af pKH182-44, indeholder et relativt langt segment, der er homologt med IR3-domænet (f.

20 eks. 53 aminosyrer). Det er derfor ikke overraskende, at fusionsproteinet og CNBr-fragmentet deraf indeholder antigene determinanter. Desuden identificerede Hennes-sy og Kieff ikke, hvilken af sekvenserne, der gentages i deres fragment, der optræder som antigene determinanter.

25 Selv om Hennessy og Kieff genetisk kunne frem stille et materiale, der genkendes af anti-EBNA-antistof-fer i humanserum, ville det være besværligt at anvende klinisk på grund af dets konstruktion. Segmentet på 53 aminosyrerester i deres fusionsprotein, som er homologt 30 med EBNA, er fysisk og kemisk en del af β-galactosidase-proteinet. Dets immunologiske egenskaber påvirkes derfor af de dele af β-galactosidasemolekylet, hvorfra det ikke kan skilles. Faktisk reagerer alle de humansera, der anvendes ved deres undersøgelse, med β-galactosidase og 35 kræver behandling med β-galactosidase for at adsorbere og fjerne denne reaktivitet før afprøvning for specificitet mod det genetisk fremstillede protein.

DK 172035 B1 0 7

En anden løsning på de problemer, der opstår ved bestemmelse af et gens korrekte aflæsningsramme og ved at fremstille store mængder patogen-relaterede antigener (immunogener) til kliniske og diagnostiske formål, er 5 anvendelsen af syntetisk polypeptidkerai. Denne metode til fremstilling af antigener (immunogener) har en fordel frem for de ovenfor beskrevne genteknologiske metoder. Syntetiske polypeptidantigener indeholder ikke naturlige proteinbiprodukter eller fragmenter deraf, og 10 derved eliminerer deres anvendelse muligheden for uønsket krydsreaktivitet og behovet for at forbehandle . serumprøver som i Hennessy og Kieff's undersøgelse.

Selv om den almindelige idé ved fremstillingen af syntetiske antigener (immunogener) og deres anven-15 delse til at fremkalde antistoffer med forud bestemt specificitet er blevet beskrevet, er der en stor del af denne teknologi, der fortsat unddrager sig enhver forudsigelighed. Hertil er der mindst to årsager. For det første behøver et syntetisk antigen (immunogen) ikke nødven-20 digvis at inducere antistoffer, som immunreagerer med det intakte protein i dets oprindelige omgivelser. For det andet immunreagerer en værts naturlige antistoffer mod et naturligt forekommende immunogen, såsom et viralt protein, sjældent med et polypeptid, som svarer til en kort 25 lineær del af immunogenets aminosyrerestsekvens. Dette sidste fænomen menes at skyldes, at korte lineære poly-peptider mangler de krævede sekundære og tertiære tilpasningsstrukturer .

Meget af arbejdet med at binde peptid ved hjælp 30 af antistof, der er gjort til proteiner, er gennemgået i en oversigt af E. Benjamini m.fl., Current Topics in Mirobiology and Immunology ££, 85-134 (1972). Peptidstrukturens rolle ved antistofbinding er blevet understreget af J.W. Goodman, Immunochem j>, 139-149 (1969) .

35 DK 172035 B1 8

De fleste af undersøgelserne af, hvordan ændringer i peptiders sekvens påvirker antistofbinding, er blevet fortolket således, at de viser, at strukturen af antistoffets kombineringssted spiller en overvejende rolle. Virkningen 5 af sekvens og strukturelle ændringer i disse undersøgelser er blandet sammen og er vanskelige at holde ude fra hinanden. Nogle af disse undersøgelser kan lige så godt forklares ved strukturelle ændringer i antigenet, der påvirker bindingen.

Antistofreaktion på det molekylære niveau indebærer 10 binding af et antigen med defineret sekvens (primærstruktur) og i en defineret tilpasning (sekundær og tertiær struktur). Immunreaktion over for proteinantigener har traditionelt været fortolket som rettet mod proteinets primære, sekundære eller tertiære struktur.

15 Dette klassifikationsskema kan have en vis gyldighed for proteiner, som har en veldefineret helhedsstruktur ved fysiologiske temperaturer og opløsninger. Imidlertid er dets gyldighed tvivlsom for peptidantigener, der har en mere dynamisk struktur.

20 Flere grupper er fremkommet med strukturelle under søgelser af polymerer med en gentagelsessekvens af glycin og alanin eller glycin og serin, som blev syntetiseret som modeller for silkefibroiner [Anderson m.fl., J.Mol.

Biol. 67. 459-468 (1972)) og collagen [Anderson m.fl., 25 BBRC 22/ 802-808 (1970), Doyle m.fl., J. Mol. Biol. 51, 47-59 (1970)]. Den mest systematiske undersøgelse er Brack m.fl.'s i Biopolymers JL1, 563-586 (1972), som anfører syntese af en række blok-homopolymere polypepti-der, hvor de homopolymere blokgentagelsesenheder har 30 formlen (Ala -Gly ), hvor y er 1, 2 og 3, når x er 1, x y y er 1, 2 og 3, når x er 2, og y er 3, når x er 3.

De resultater, der rapporteres i denne sidste undersøgelse, går ud på, at i fast tilstand er blokhan&o-polymererne, der mest består af alanin, α-skrueformede, 35 og de, der mest indeholder glycin, er uden orden. I opløsning rapporteres polyalanin at være α-skrueformet, DK 172035 B1 9 men poly-(Ala2-Gly^) rapporteres at være i B-antiparal-lel form. De mere glycinrige polymerer siges at have en anden fast struktur end den,der rapporteres som hverken a-skrueform eller B-struktur.

5 De homopolymeriserede blokke af glycin og alanin, der rapporteres af Brack m.fl., fremstilles ved kondensationspolymerisation af di- til hexapeptid-gentagelsesenheder med en carboxylendestillet glycylrest i aktiv esterform. For poly(Ala-Gly2) rapporteres poly-10 merisationsgrader fra 2 til 68.

Selv om de opløsningsmidler, der anvendes i-disse undersøgelser, ikke er fysiologisk acceptable, f. eks. vand eller phosphatpufret saltvandsopløsning, viser resultaterne to ting: l) strukturændringer kan forekomme, 15 efterhånden som et polypeptids sekvens ændres, og 2) strukturændringer forekommer også under overgangen fra opløsning til fast tilstand.

Den foreliggende opfindelse angår et syntetisk poly-peptid, der kan inducere produktion af antistoffer, som 20 immunreagerer med Epstein-Barr virus-nukleært antigen (EBNA) , og dette polypeptid er som allerede nævnt ejendommeligt ved det i krav 1's kendetegnende del angivne. Foretrukne er også selve de tilsvarende polypeptider, nemlig: (i) H-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala- 25

Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-OH; (ii) H-Lys-Gly-Thr-His-Gly-Gly-Thr-Gly-Ala-Gly-Ala-

Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-OH; (iii) H-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala- 3 Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-OH; (iv) H-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-

Gly-Gly-Ala-Gly-OH; (v) H-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-

Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-OH; 3s (vi) H-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-

Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-

Gly-OH; DK 172035 B1 10 (vi i) H-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-OH ? (viii) H-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-OH; 5 de pharmaceutisk acceptable salte deraf og antigenet beslægtede varianter deraf.

Der kan også tilvejebringes en syntetisk multimer indeholdende flere forenede syntetiske polypeptidgentagelsesenheder, hvor mindst én af gentagelsesenhederne er et 10 polypeptid som beskrevet ovenfor. Polypeptidgentagelsesenhederne kan forenes hoved-til-hale ved amidbindinger* Alternativt kan de syntetiske polypeptidmonomere forenes ved andet end amidbindinger til dannelse af en polymer multimer, såsom ved anvendelse intramolekylære, interpolypeptidcystein-15 disulfidbindinger.

Ved en anden udførelsesform anvendes en effektiv mængde af et polypeptid ifølge opfindelsen i et fysiologisk acceptabelt fortyndingsmiddel til dannelse af et podestof, der kan inducere antistoffer, som immunreagerer med EBNA.

20 Ud over at blive anvendt til produktion af antistoffer kan podestoffet ifølge opfindelsen anvendes som vaccine til mennesker og tillige som et middel til at inducere aktiv immunitet over for lymfocytter, der udtrykker EBNA eller fragmenter deraf på deres celleoverflade.

25 Ved endnu en udførelsesform anvendes et antistof- molekyle, der indeholder et antistofkombineringssted, der kan immunreagere med EBNA. Antistoffet dyrkes mod et syntetisk immunogen indeholdende et syntetisk polypeptid, som beskrevet ovenfor, alene eller som et konjugat.

30 Opfindelsen.angår også et diagnosticeringssystem til afprøvning af tilstedeværelse af EBNA. Systemet omfatter antistofmolekyler som beskrevet ovenfor, og indikationsmidler, der viser immunreaktion mellem kombineringsstederne og EBNA.

35 Endvidere angår opfindelsen et diagnosticeringssy stem til afprøvning af tilstedeværelsen af antistofmolekyler DK 172035 B1 11 mod EBNA i en kropskomponent. Et sådant system omfatter et særlig foretrukket syntetisk polypeptid som beskrevet ovenfor samt en indikator, der viser immunreaktion mellem polypep-tidet og antistofmolekylerne mod EBNA. En mere foretrukket 5 udførelsesform er et system, der også indeholder en fast understøtning, der omfatter en fast matriks, hvortil det særlig foretrukne polypeptid er fikseret. Et middel til identificering af de immunreagerede antistofmolekylers iso-type kan også indgå i systemet.

10 Der kan fremstilles en tilberedning til passiv immunisering mod B-lymfocytter, der udtrykker EBNA på deres celleoverflader. Tilberedningen omfatter en effektiv mængde af et antistofmolekyle, som beskrevet ovenfor, i et fysiologisk acceptabelt fortyndingsmidde. Når tilberedningen ind-15 føres i en pattedyrevært, kan den reducere virkningen på værten af B-lymfocytter, der udtrykker EBNA på deres celleoverflade.

Opfindelsen vil i det følgende blive beskrevet under henvisning til tegningen, på hvilken 20 fig. 1 er et koordineringssystem, hvori polypep- tiders (F), (B) og (E) cirkulære dichroisme-spektre er afsat.

Disse polypeptider omtales også her som polypeptider hhv.

F13, F62 og F12. Hvert spektrum er gennemsnittet af 10 efter hinanden følgende skanderinger af et polypeptid i fysiologisk 25 opløsning (phosphatpufret saltvandsopløsning) i en koncentration på 1 mg/ml. Den optiske rotation udtrykkes som milli-radianer og afsættes som funktion af den polariserede lysbølgelængde udtrykt i nanometer (nm). Den forholdsvis ukarakteristiske kurve for polypeptid F (F13) tyder på en random 30 udformning, som er det sædvanlige resultat, der opnås med peptider af denne størrelse. Spektret med fordybninger og spidser for polypeptid B (F62) er karakteristisk for en relativ stabil sekundær stryktur eller udformning, formentlig β-læg. Selv om dataene ikke vises, har polypeptiderne P27, 35 P60, F14 og F15 spektre, der er meget lignende, hvilket viser, at de mere foretrukne polypeptider ifølge opfindelsen DK 172035 B1 12 forekommer som lignende stabile udformninger i fysiologisk opløsning. Spektret for polypeptid E (F12) viser delvis antagelse af en sådan udformning.

Fig. 2 er et fotografi af nitrocelluloseimmun-5 aftryk af hele celleekstrakter af EBV-transformerede WI--L2-celler ved hjælp af kanin-antipeptid-antisera mod syntetiske polypeptider C (P60) og B (P62). Et human-serum (fra patient TJ), der tidligere er defineret som anti-EBNA-positivt, dvs. indeholdende anti-EBNA-antistof-10 fer, anvendes som positiv kontrol i bane A ved en fortynding på 1:20. Kanin-anti-P60-(C)-serum i en fortynding på 1:50 (bane B) og kanin-anti-P62-(B)-serum i en fortynding på 1:10 (bane D) immunreagerer med det samme bånd som den positiv kontrol, hvilket viser^ at de genkender 15 naturligt EBNA. Banerne A-G er identificeret forneden i figuren.

Genkendelse af EBNA af anti-P60-serum inhibe-res ved at inkubere anti-P60-serum fortyndet 1:50 med 40^,ug/ml polypeptid P60 i en time før immunaftryk (bane 20 3). på lignende måde inhiberes genkendelse af EBNA af anti-P62-serum ved at inkubere anti-P62-serum fortyndet 1:10 med 40^,ug/ml polypeptid P62 i en time forud for immunaftryk .

Den antigene beslægtethed mellem P60 og P62 25 vises i banerne 6 og 7. Bane 6 viser anti-P62-serum fortyndet 1:10, der immunreagerer med EBNA-båndet. I bane 7 inhiberes anti-P62-serums immunreaktivitet med EBNA-båndet ved inkubation med polypeptid P60 ved 40 ^ug/ml i en time forud for immunaftryk.

30 Fig. 3 er en grafisk fremstilling, der viser in-

hiberingen af anti-P62-serumaktivitet i serum, der er EBNA-positivt, fra patient 1011 ved hjælp af et konkurrerende polypeptid i opløsning. Der udføres en ELISA

ved hjælp af polypeptid P62 som fast-fase-target med serum 35 0 13 DK 172035 B1 fra patient 1011, der er præinkuberet i én time med et af polypeptiderne P27, P62, P60, P89 eller F16 før anvendelse ved ELISA. Polypeptiderne P27, P62, P60, P89 og P16 omtales også her som polypeptiderne hhv. A, B, 5 C, D og 6. Anti-polypeptidaktiviteten i procent afsættes som ordinat som funktion af koncentrationen af det konkurrererende polypeptid i ^,ug/ml.

Fig. 4 er en grafisk fremstilling, der viser det parallele tidsforløb for fremkomst af antistoffer 10 mod EBNA (stiplet linie, 0) og polypeptid P62 (fuldt optrukket linie, ·) i et tilfælde med dokumenteret in-fektiøs mononucleose (IM) . Fortløbende sera tages efter klinisk indtræden og tLtreres for anti-EBNA-aktivitet ved en metode ifølge Catalano m.fl., J. Clin. Invest. 65.

15 1238-1242 (1980) på ordinaten til højre. Serumprøver analyseres også ved ELISA ifølge opfindelsen ved hjælp af polypeptid P62 som fast-fase-target som vist på ordinaten til venstre, hvor den optiske tæthed ved 405 nm (OD4Q5) er afsat.

20 Fig. 5 er sammensat af to grafiske fremstillin ger, der belyser den. tidlige påvisning af antistoffer mod polypeptid P62 (fuldt optrukket linie, ·) sammenligner med anti-EBNA (stiplet linie, 0), idet der anvendes påvisning ved hjælp af den klassiske ACIF-metode, der 25 er beskrevet af G. Henle m.fl. i J. Infect. Dis., 130-231 (1974). Forløbende sera tages fra to patienter (nr. 14 foroven, nr. 2 forneden) med klinisk dokumenteret infek-tiøs mononucleose. Seraene titreres for anti-EBNA-aktivitet som anført af Catalano m.fl., supra. Anti-poly-30 peptid-aktivitet måles ved hjælp af ELISA ifølge opfindelsen med polypeptid P62 som fast-fase-target, med den i fig. 4 rapporterede aktivitet.

Mennesker, der er inficeret med Epstein-Barr-•7virus (EBV) udvikler antistof fer; jnod et viralt nukleært 35 antigen (EBNA), som forekommer i viralt-transformerede B-lymfocytter. Traditionelle kliniske metoder, der an- 0 14 DK 172035 B1 vendes til prøver for EBNA og anti-EBNA-antistoffer hos mennesker, er besværlige. Desuden er de nuværende metoder til rensning af EBNA fra cellekultur ikke lette at tilpasse til masseproduktion.

5 Den foreliggende opfindelse omhandler anvendelsen af syntetisk polypeptid-teknologi til at løse de nuværende metodologiers problemer. Korte syntetiske polypeptider kan immunologisk efterligne antigene determinanter på et naturligt protein og kan derfor anvendes til 10 at dyrke antistoffer med forud bestemt specificitet, som genkender det naturlige protein.

Udtrykket "efterligner immunologisk" anvendes her i betydningen, at et immunogent polypeptid ifølge opfindelsen inducerer produktion af antistoffer, som bin-15 des til det inducerende polypeptid og også til den beslægtede sekvens i det intakte protein. Dette fænomen kan anvendes både ekperimentelt og klinisk.

Eksperimentelt kan antistoffer mod syntetiske polypeptider anvendes til at bestemme DNA-aflæsningsram-20 men og defor også aminosyrerestsekvensen i et klinisk vigtigt protein som EBNA. Klinisk kan antistoffer med forud bestemt specificitet dyrket mod syntetiske polypeptider anvendes til diagnostiske og terapeutiske formål .

25 Heller m.fl., supra, anfører en DNA-nucleotid sekvens med karakteristika, som viser, at den kan indeholde genet, der koder for EBNA. De forudser, at hvis DNA'et translateres ind i protein, ville de tre mulige aflæsningsrammer kode for et IR 3-proteindomæne på mere 30 end 200 aminosyrerester, kun sammensat af (i) serin, ar-ginin og glycin, (ii) glycin og alanin eller (iii) glu-tamin, glutamat og glycin, afhængigt af den udtrykte DNA-aflæsningsramme.

EBNA-molekylets anførte kemiske egenskaber vi-35 ser, når de tages sammen med fordelingen af mulige stop-codoner i EBNA-genet, at IR3 primært er sammensat af DK 172035 B1 0 15 glycin- og alaninrester.

For at bedømme denne oplysning syntetiseres korte polypeptlder, hvis aminsyrerestsekvenser i det væ-sentlige svarer til den i et EBNA-protein, hvis IR3 er 5 en glycin/alanin-random copolymer.

A. Syntetiske polypeptlder.

1. Sekvenser Rækken af små syntetiske polypeptlder (5-21 ami-nosyrerester i længden), der anvendes ved denne undersø-10 gelse, syntetiseres ved hjælp af Merrifield's fastfase- metode [Merrifield m.fl., J. Am. Chem. Soc. QJ5./ 2149-2154 (1963)]. Sekvenserne vælges, så at de repræsenterer'forskellige områder inden for og lige uden for EBNA'ets foreslåede IR3-region.

15 Udtrykket "syntetisk", som det anvendes her, betyder, at polypeptidmolekylet eller polypeptidets gentagelsesenhed er blevet opbygget ved hjælp af kemiske midler, dvs. kemisk syntetiseret i stedet for at blive fremstillet ad biologisk vej, som f.eks. ved genteknolo-20 9i· Således er de syntetiske polypeptlder ifølge opfin delsen uden naturligt forekommende proteiner og fragmenter deraf.

De kemisk syntetiserede polypeptlder afviger derfor også fra naturligt forekommende proteiners ned-25 brydningsprodukter, da de er fremstillet ved, at cyano-genbromid indvirker på proteinet. Den velkendte kemiske fast-fase-syntese, ved hvilken der tilsættes blokerede aminosyrerester i rækkefølge for at opnå det ønskede polypeptid, er den foretrukne syntesemetode og omta-30 les mere detaljeret nedenfor.

Alle aminosyrerester, der identificeres her, er i naturlig eller L-konfiguration. I overensstemmelse med standardnomenclaturen for polypeptidteknologi er forkortelserne for aminosyrerester følgende: 35 DK 172035 B1 0 16 _Symbol_Aminosyre_ 5 1 bogstav 3 bogstaver Y Tyr L-tyrosin G Gly L-glycin F Pfte L-pftenylalanin M Met L-methionin A Ala L-alanin S Ser L-serin I Ile L-isoleucin L Leu L-leucin T Thr L-threonin V Val L-valin P Pro L- prolin K Lys L-lysin · H His L-histidin Q Gin L-glutamin 20 E Glu L-glutaminsyre Z Glx L-glutaminsyre el, L-glutamin ^ Trp L-tryptophan r Arg L-arginin 25 D Asp L-asparaginsyre N Asn L-asparagin B Asx L-aspar åginsyre el. L-asparagin C Cys L-cystein 30 35 0 17 DK 172035 B1

Udtrykket "random copolymer" anvendes her i sin sædvanlige betydning. Polypeptiderne er således copolymere, fordi de indeholder en række af flere forskellige aminosyrerest-gentagelsesenheder. Copolymere-5 ne er random sammenlignet med alternerende eller blok-copolymere, fordi de enkelte aminosyrerester i polypeptiderne ikke forekommer i en særlig gentagelsessekvens, som man finder dem i gentagelsessekvenser i en alternerende copolymer eller i homoblok-copolymerene, der frem-10 stilles af Anderson m.fl., Doyle m.fl. eller Brack m. fl., supra.

Selv om polypeptidet, der betegnes P62 (tabel i), fortløbende indeholder gentagelsessekvensen -Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-, indeholder det 15 desuden et Ala-Gly-peptid i carboxylendestillingen.

Som følge heraf er der ingen aminosyrerestsekvens, der gentages gennem hele polypeptidet, og polypeptid P62 skal således betragtes som en random copolymer og ikke som en homoblokcopolymer, således som poly(Ala -Gly )- x y 20 materialer fremstillet af Brack m.fl. eller poly(Ser-Gly)-materialerne fremstillet af AndersoA m.fl., hvis identiske blokke af bestemte aminosyrerestsekvenser gentages i hele disse polymeres længde.

De syntetiske random-copolymerpolypeptider ifølge 25 opfindelsen omtales ofte her ganske enkelt som "polypep-tider" eller som "syntetiske polypeptider", hvilket sker for némheds skyld.

Udtrykket "antigent beslægtede varianter" anvendes her til at betegne polypeptider med afvigende 30 total aminosyrerestsekvens, som har i det mindste en del af én antigen determinant fælles og som derfor er immunologisk kryds-reaktive.

Udtrykket "antigen determinant", som det anvendes her, betegner den strukturelle komponent i et moleas kyle, der er ansvarligt foret særligt samspil med tilsvarende antistof-(immunglobulin)-molekyler, der udløses DK 172035 B1 0 18 af det samme eller et beslægtet antigen eller immunogen.

Udtrykket "immunogen determinant" betegner, som det anvendes her, den strukturelle komponent i et molekyle, som er ansvarligt for igangsættelse i en vært af 5 et antistof indeholdende et antistofkombinerende sted (idiotype), som bindes med immunogenet, når det anvendes som et antigen.

Udtrykket "antigen", som det anvendes her, betyder en helhed, som bindes af et antistof.

10 Udtrykket "immunogen", som det anvendes her, beskriver en enhed, som igangsætter antistofproduktion hos værtsdyret. I nogle tilfælde er antigenet og immunogenet den samme enhed, medens de to enheder i andre tilfælde er forskellige.

15 Som beskrevet nedenfor anvendes således poly- peptid P62 til at fremkalde produktion af antistoffer i en kanin og anvendes således som immunogen. De således fremkaldte antistoffer bindes til polypeptid P62, når det anvendes som antigen. Polypeptid P62 er derfor 20 både et immunogen og et antigen. Anti-EBNA-antistoffer bindes til både EBNA, immunogenet,og antigenet, samt til polypeptid P62 som antigen.

Forfetrukne udførelsesformer for den foreliggende opfindelse er de syntetiske random copolymere po-25 lypeptider P89, F12 og F13, som vist i tabel I nedenfor, de pharmaceutisk acceptable salte deraf samt antigent beslægtede varianter deraf.

30 35 0 19 DK 172035 B1

Tabel I

Syntetiske polypeptIdsekvenser

Peptid * Sekvens P60(C) H-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala- 5

Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-OH; P89(D) H-Arg-Ala-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Glu-Lys-Arg-Pro-Met-OH; F12(E) H-Ile-Met-Ser-Asp-Glu-Gly-Pro-Gly-Thr-Gly-Asn-

Gly-Leu-Gly-Glu-OH;

10 J

F13(F) H-Pro-Gly-Ala-Pro-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Pro-OH; P27(A) H-Lys-Gly-Thr-His-Gly-Gly-Thr-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-OH; P62(B) H-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-OH; F14 H-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Al.a-Gly-Ala-

Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-OH? F15 H-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala- 20

Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-OH; F16(G) H-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-OH; 25 - * Store bogstaver i parentes betegner det tilsvarende polypeptid i nogle af figurerne og tabellerne i beskrivelsen.

30 Resultaterne af undersøgelser af polypeptid/an- ti-polypeptid-antistof-binding og -bindingsinhibering om tales nedenfor i afsnit I D. Disse resultater illustrerer krydsreaktivitet og kryds-inhiberende virkninger, der svarer til omfanget af sekvenshomologi blandt poly-35 peptiderne. F.eks. indeholder polypeptid P60 et segment på 10 aminosyrer, der er homologt med P62. Polypeptid 0 20 DK 172035 B1 P27 indeholder et segment på 8 aminosyrer, der er homologt med polypeptiderne P60, P62 og Dl (tabel II). Po-lypeptid D2 (tabel II) indeholder et segment på 7 amino-surerester, der er homologt med segmenter i polypepti-5 derne P27, P60, P62 og Dl. Polypeptid P89, som ikke signifikant krydsreagerer i undersøgelsen, indeholder ingen sekvenshomologi med polypeptiderne P27, P62 og P60.

Hvad der er mere vigtigt, er, at sekvensen på 8 aminosyrerester, siom polypeptiderne P27, P62, P60 og Dl 10 har fælles, indeholder i det mindste én antigen determinant, der er fælles med alle tre random copolymere polypeptider, hvilket gør disse tre polypeptider til antigent beslægtede varianter. Desuden omfatter det fælles segment sekvensen på 6 aminosyrerester 15 -Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly- 1 2 og en overlappende sekvens med formlen -Gly-R -Gly-R -Gly-, 1 2 hvor R og R begge er Ala, dvs. -Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-.

20 Ved "overlappende" menes, at den sekvens, der er nævnt som nr. 2, er indeholdt i en del af den først nævnte sekvens. Denne overlapning i aminosyrerestsekvens belyses for polypeptid P62 ved de overlappende "indrammede" sekvensdele, der er vist nedenfor, hvor 25 aminosyrerestkoden med 1 bogstav er anvendt.

r--------, I—f-1 i

G-G- G-A-G-}g-A-G-A-G4G-G-A-G-G

i · -»- j 30 ;_______ί

Syntetiske random copolymerpolypeptider, som indeholder både den fælles sekvens med 6 aminosyrerester og de overlappende . fem aminosyrerester; udgør end-35 nu en særlig foretrukket udførelsesform for opfindelsen.

Ved sådanne særlig foretrukne udførelsesformer indehol- 0 21 DK 172035 B1 der det syntetiske random copolymere polypeptid ifølge opfindelsen ca. 8 til ca. 40 og fortrinsvis ca. 15 til ca. 20, aminosyrerester og omfatter foruden den tidli- 1 2 gere definerede -Gly-R -Gly-R -Gly- -aminosyrerestsekvens § sekvensen med formlen, skrevet fra venstre mod højre og i retning af aminoendestilling til carboxyendestilling: -Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly- 10 og indeholder mindst ca. 50 mol% Gly-rester og kan både (a) fremkalde produktion af antistoffer, som immunrea-gerer med EBNA, når det er bundet til en bærer,og i effektiv mængde er indført i en pattedyrevært, samt (b) im-munreagerer med humane antistoffer fremkaldt af natur-15 ligt EBNA.

Særlig foretrukne aminosyrerestsekvenser omfatter sekvenser taget fra venstre mod højre og i retning fra aminoendestilling til carboxyendestilling, med formlerne: 20 (i) -Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-

Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-; (ii) -Lys-Gly-Thr-His-Gly-Gly-Thr-Gly-Ala-

Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-; (i ii) -Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly- 25 Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-

Ala-Gly-; (iv) -Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-

Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-; (v) -Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly- 30 Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-y (vi) -Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-oxy-

Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-; (vii) -Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala- 35 Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-; (viii) -Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly- A1a-Gly-Ala-Gly-; 0 22 DK 172035 B1 pharmaceutisk acceptable salte deraf og antigent beslægtede varianter deraf.

Det skal bemærkes, at en bindestreg i begyndelsen eller slutningen af en aminosyrerestsekvens viser 5 en binding til en gruppe, såsom H eller OH, i hhv. amino-og carboxy-endestillingen eller en yderligere sekvens på en eller flere aminosyrerester op til i alt 40 aminosy-rerster i polypeptidkæden.

Særligt foretrukne er også selve de tilsvarende 10 polypeptider, dvs. polypeptider P60, P27, P62, F14, F15 og F16, der er vist i tabel I, og Dl og D2 vist i tabel II, samt de pharmaceutisk acceptable salte deraf og antigent beslægtede varianter deraf.

Udtrykket "pharmaceutisk acceptable salte", som 15 det anvendes her, refererer til ikke-toksiske alkalimetal-, jordalkalimetal- og ammoniumsalte, der anvendes i den pharmaceutiske industri, herunder natrium-, kalium-, lithium-, calcium-, magnesium- og ammoniumsalte og lignende, som fremstilles ved hjælp af velkendte metoder.

20 Udtrykket omfatter også ikke-toksiske syreadditionssalte, som i reglen fremstilles ved at omsætte forbindelserne ifølge opfindelsen med en passende organisk eller uorganisk syre. Repræsentative salte omfatter hydrochlo-rid, hydrobromid, sulfat, bisulfat, acetat, oxalat, va-25 lerat, oleat, laurat, vorat, benzoat, lactat, phosphat, tosylat, citrat, maleat, fumarat, succinat, tartrat og lignende.

2. Størrelse

Virkningen af at ændre det syntetiske polypep-30 tids størrelse på dets evne til at bindes af anti-EBNA--antistoffer undersøges. Det viser sig i reglen, at efterhånden som polypeptidstørrelsen aftager^ aftager også dets evne til at bindes af antistoffer.

Polypeptid P62 består af 20 aminosyrerester, 35 hvoraf de første 9 rester fra amino-endestillingen gentages direkte som vist i tabel II, hvor man anvender 0 23 DK 172035 B1 koden med 1 bogstav til aminosyrerester. En række poly-peptider, der er homologe med P62, syntetiseres, og heri udelades aminosyreresttriader fra aminoendestillingen i det forudgående peptid, så at der fås polypeptider Dl, 5 D2 og D3 som vist i tabel II nedenfor. Stigende dele af sekvenssymmetri i P62 savnes derfor i polypeptiderne Dl, D2 og D3.

Tabel II

10 Polypeptid betegnelse Aminosyreyestsekvens _

P62: AGAGGGAG G*A GAGGGAGGAG

15 Dl: GGGAGGAGAGGGAGGAG

D2: AGGAGAGGGAGGAG

D3: A GAGGGAGGAG

A5 : G G G A G

20 A6 : A G G G A G

A7: G A G G G A G

A8 : AGAGGGAG

A9: GAGAGGGAG

25

Polypeptidsekvenser med enkeltbogstavskoden vises i retningen fra venstre mod højre og fra aminoendestilling mod carboxyendestilling * Samlestykke på 9-mer direkte gentagelse i poly-30 peptid P62.

Evnen hos polypeptid-D-serien til at immunrea-gere med 3 human-anti-EBNA-sera og kanin-anti-P62-serum undersøges ved hjælp af polypeptider ved fast fase af 35 ELISA som beskrevet nedenfor. Antistof bindingen til Dl er næsten den samme som det oprindelige polypeptid P62

O

DK 172035 B1 24 for alle de afprøvede sera. Derimod er der ingen binding til fast fase D3 for noget serum med undtagelse af kanin-anti-P62. Resultaterne for D2 er middelgode og afhænger af det afprøvede serum. Således er antistof-5 genkendelsen for denne serie polypeptider aftagende, efterhånden som polypeptidlængden afkortes fra 20 til 11 aminosyrerester.

Den kendsgerning, at antistofbindingen udebliver for alle antiseraene modsiger muligheden for, at en 10 specifik antigen determinant er udeladt ved sekvenselimineringen af aminosyrerester, eftersom polypepti-derne indeholder to antigene determinanter, hvoraf kun den ene påvirkes af sekvensudeladelserne. Ligeledes garanterer sekvenssymmetrien i P62, at alle sekvenser på 15 4-8 aminosyrerester, som forekommer i P62, også findes i D3^med undtagelse af dem hen over gentagelsesforbindelsespunktet .

Tilpasningsændringer i polypeptiderne, der er bundet til den faste understøtning under ELISA, kan ha-20 ve bidraget til undertrykning af antistofgenkendelse.

Denne mulighed undersøges ved at inhibere bindingen (immunreaktionen) mellem flere sera og fast-fase-bundet P62 ved hjælp af varierende koncentrationer af konkurrerende polypeptider i opløsning. Antiseraene iblandes og 25 holdes i opløsning (inkuberes) med polypeptid P62, Dl, D2 eller D3 i en forud bestemt tid, der er lang nok til, at immunreaktion (binding) kan finde sted, før de tilsættes til en mikrotiterplade dækket med P62. Resultaterne af denne undersøgelse med sera fra fem patienter 30 findes i tabel III nedenfor.

35 0 25 DK 172035 B1

Tabel III

Koncentration af konkurrerende polypeptider, der giver 50%* s inhibering af antistofbinding til peptid P62*

Konkurrerende polypeptid 5 (^ug/ml)

Sera_P62_Dl_D2_D3 TJ 0,05 0,05 0,1 200 VM 0,3 0,3 0,4 3 CV 0,1 0,1 0,1 10 10 N6 0,6 0,6 0,6 3 JC 111 500 * Elisa-metoderne, der anvendes til disse bestemmelser, vil blive beskrevet nedenfor.

15

Polypeptid Dl's inhiberende virkning på antistofbinding til P62 anses for ikke at kunne skelnes fra selve P62's inhiberende virkning. Dette gælder for alle afprøvede sera.

20 Det er mere interessant, at polypeptid D3 inhi- berer nogle af seraene, VM og N6, lige så godt som de større polypeptider gør. Denne kraftige inhiberende virkning opstår til trods for, at ingen af disse sera udviser nogen binding til D3 bundet til den faste understøt-25 ning i ELISA. Disse data menes at vise, at polypepti-det skal være af en vis minimumslængde, mindst ca. 15 aminosyrerester, for at opretholde den krævede sekundære struktur, når det bindes til plastoverfladen på en mikrotiterplade.

30 Den minimumsantigenstørrelse, der er nødvendig for genkendelse, undersøges yderligere ved hjælp af polypeptider A5, A6, A7, A8 og A9. Som vist i tabel II har polypeptid A5 fem aminosyrerester, og hvert medlem i serien A6-A9 forøges i længden med 1 aminosyrerest i for-35 hold til det foregående polypeptid op til 9 rester, der findes i A9. Intet afprøvet antiserum immunreagerer 0 26 DK 172035 B1 med disse polypeptider, når de bindes til mikrotiterpla-der ved ELISA som beskrevet nedenfor.

Dataene for A-seriens polypeptiders evne til at inhibere binding af human anti-EBNA-antistoffer til g fast-fase-P62 ses i tabel IV nedenfor.

Tabel IV

Inhibering af antlstofbindinq til peptid P62 med 100 ,ug pr. ml konkurrerende peptid1 10 _% af ikke-inhjberet aktivitet -

Sera A5 A6 å7 A8 A9 TJ 96 80 91 74 31 15 VM 93 81 51 17 9 CV 92 93 93 72 20 JC 94 92 60 . 88 74 S62 86 96 89 95 78 S60 106 109 93 84 53 20

Disse undersøgelser udføres som beskrevet for tabel III.

25 Næsten alle de afprøvede sera inhiberes af A9, selv om der kræves meget høje koncentrationer (mere end 100 fold højere end de koncentrationer af P62 eller Dl der kræves til ækvivalent inhibering). Desuden immun-30 reagerer tre sera med og inhiberes af A8 og en af A7.

Ingen inhiberes af de kortere polypeptider A6 og A5.

Således synes nedgangen i immunreaktivitet, som er parallel med en nedgang i polypeptidstørrelse, at skyldes to ting: (1) virkningen af udeladelse af 35 <jet sted på antigenet, hvortil antistoffet bindes som vist ved hjælp af A-serie-polypeptiderne, og (2) æn- DK 172035 B1 27 dringen i polypeptidets tilpasning, efterhånden som det størrelse aftager som vist ved D-serie-polypepti-derne.

3. Tilpasning 5 Tilpasningsegenskaberne hos de syntetiske poly- peptider ifølge opfindelsen undersøges ved hjælp af cirkulær dichroisme(CD)spektroskopi. CD-spektrene for po-lypeptiderne P27, P60, P62, F13, F15 og F16 bestemmes.

Dataene, der delvis er vist i fig. 1, viser, at polypep-10 tiderne ifølge opfindelsen, der omfatter begge de foretrukne aminosyrerestsekvenser, dvs.

-Gly-R1-Gly-R2-Gly- 1 2 15 hvor R og R er som tidligere anført, og -Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly- antager en forholdsvis stabil sekundær struktur eller 20 tilpasning i en fysiologisk opløsning ved 20°C. Eftersom den overvejende tilpasning hos disse polypeptider er forholdsvis stabil, mener man, at human-anti-EBNA-an-stofaktivitet forekommer som reaktion på denne særlige tilpasning.

25 B. Multimere

En syntetisk multimer, der indeholder flere forbundne syntetiske random copolymerpolypeptidgentagelsesen-heder, hvor i det mindste én af gentagelsesenhederne er et polypeptid, er beskrevet her.

30 Multimererne er, når de alene eller bundet til en bærer indføres i effektiv mængde i en pattedyrvært, i stand til at fremkalde produktion af antistoffer, som bindes til EBNA. De multimerer, som indeholder de særligt foretrukne syntetiske random copolymerpolypeptider ifølge opfindelsen, 35 hvis aminosyrerestsekvneser omfatter både sekvensen med de fem rester -Gly-R1-Gly-R2-Gly, hvor R1 og R2 er som define- DK 172035 B1 28 ret ovenfor, og sekvensen med de seks rester -Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly- og også indeholder mindst 50 mol% glycinrester, kan også binde humane antistoffer fremkaldt af EBNA.

Således er multimererne lige som de polypepti-5 der, hvoraf de består, immunogene og er antigene over for humane anti-EBNA-antistoffer. Disse multimerer kan derfor anvendes til at fremkalde produktion af anti--EBNA-antistoffer, som er anvendelige ved de diagnosticeringsmetoder og -systemer, der omtales nedenfor, og 10 kan også anvendes som antigen i passende diagnostise-ringsmetoder og -systemer.

Multimerer, der indeholder færre end ca. 35 aminosyrerester i hele multimeren, bindes typisk til en bærer, når de skal anvendes som immunogener. De multi-15 merer, der indeholder mere end i alt ca. 35 aminosyrerester, er i reglen tilstrækkeligt immunogene til at kunne anvendes uden bærer.

Polypeptidmultimerer kan fremstilles ved at sammenbinde de syntetiserede polypeptidmonomere hoved-20 -til-hale ved hjælp af ovennævnte fast-fase-metode, dvs. en fuldstændig polypeptidsekvens kan syntetiseres på harpiksen efterfulgt af én eller flere af samme eller andre polypept idsekvenser, hvorefter hele den multimere enhed derefter spaltes fra harpiksen og anvendes som 25 beskrevet her. Sådanne hoved-til-hale-polypeptidmulti-merer indeholder fortrinsvis ca. 2 til ca. 4 polypeptidgentagelsesenheder .

Alternativt kan multimerer fremstilles som en polymer af syntetiske random copolymerpolypeptider, der an-30 vendes som monomerer. Som anvendt her defineres udtrykket "polymer" i dets forskellige grammatikalske former som en multimertype, der indeholder flere syntetiske random copolymerpolypeptidgentagelsesenheder, som bin- DK 172035 B1 29 des sammen af andet end peptidbindinger.

Et eksempel på en polymer ifølge opfindelsen kan syntetiseres ved hjælp af polypeptidmonomererne ifølge opfindelsen, som indeholder tilføjede cysteinrester 5 i både amino- og carboxy-endestillingen (diCys-polypeptid) . diCys-Polypeptidmonomerene kan bindes sammen af intramolekylaere, interpolypeptidcysteindisulfidbindinger ved hjælp af en oxidationsmetode, så at der dannes en immunogen antigen polymer. Den således fremstille-10 de polymer indeholder flere syntetiske random copolymer-polypeptider ifølge opfindelsen som gentagelsesenheder.

Disse gentagelsesenheder bindes sammen af de ovennævnte oxiderede cystein(cystin)rester.

Forekomsten af en eller to endestillede Cys-15 -rester i et polypeptid ifølge opfindelsen med henblik på at binde polypeptidet til en bærer eller at fremstille en polymer skal ikke fortolkes som ændring af amino-syresekvensen i polypeptidgentagelsesenheder ifølge opfindelsen.

20 C. Podestoffer

Ved en anden udførelsesform anvendes polypepti-derne ifølge opfindelsen i et pharmaceutisk acceptabelt fortyndingsmiddel, så at der dannes et podestof eller en vaccine, som,når det indgives i effektiv mængde, kan frem-25 kalde antistoffer, som immunreagerer med EBNA.

Ordet "podestof" i dets forskellige grammatikalske former anvendes her til at beskrive en sammensætning, der indeholder et polypeptid ifølge opfindelsen som aktivt stof, der anvendes til fremstilling af anti-30 stoffer mod EBNA. Når der anvendes et polypeptid til at fremkalde antistoffer, skal det forstås således, at polypeptidet kan anvendes alene, bundet til en bærer eller som multimer, men for nemheds skyld vil disse alternativer ikke altid blive nævnt nedenfor.

35 Til polypeptider, der indeholder færre end ca.

35 aminosyrerester, foretrækkes det at anvende en bæ- DK 172035 B1 30 o rer med henblik på at fremkalde antistofproduktion. Et polypeptid, der er bundet til en bærer, vil her blive anvendt som illustration, når der fremstilles antistoffer.

Podestoffet kan anvendes til at producere anti-5 stoffer til brug ved diagnosticeringsprøver, som påviser celler, der udtrykker EBNA. Antistofferne, der produceres af podestoffet, kan også anvendes i en tilberedning til fremkaldelse af passiv immunitet mod B-lymfo-cytter, der udtrykker EBNA på deres celleoverflader.

10 Ordet "vaccine" i det forskellige grammatikal ske former anvendes her til at beskrive en type podestof, der indeholder et polypeptid ifølge opfindelsen som aktivt stof, som anvendes til at fremkalde aktiv immunitet hos et værtspattedyr. Eftersom aktiv immunitet indebæ-15 rer produktion af antistoffer, kan en vaccine eller et podestof således indeholde identiske bestanddele, men deres anvendelse er forskellig, I de fleste tilfælde er bestanddelene i en vaccine og i et podestof forskellige, fordi mange hjælpestoffer, der er anvendelige til 20 dyr, ikke kan anvendes til mennesker.

Det foreliggende podestof eller vaccine indeholder en effektiv mængde af et polypeptid ifølge opfindelsen, som multimer, såsom en polymer af individuelle polypeptider bundet sammen af oxiderede polypeptid-ende-25 stillede cysteinrester. eller som et konjugat bundet til en bærer. For nemheds skyld omtales imidlertid de forskellige udførelsesformer for polypeptiderne ifølge opfindelsen kollektivt her med udtrykket "polypeptid".

Den effektive mængde polypeptid pr. enhedsdosis 30 afhænger blandt andet af den podede dyreart, dyrets kropsvægt og det valgte inokuleringsskema, således som det er velkendt. Podestoffer og vacciner indeholder i reglen polypeptidkoncentrationer på ca. 10^,ug til ca. 500 mg pr. inokulering (dosis). De anførte polypeptidmæng-35 der refererer til polypeptidvægten uden bærerens vægt, hvis en sådan anvendes. Eksempler på podestoffer be- DK 172035 B1 31 skrives nedenfor, idet vægten af bærer plus polypeptid (kon-jugat) anføres.

Udtrykket "enhedsdosis" refererer til fysisk adskilte enheder, der er passende som enhedsdoser til 5 dyr, idet hver enhed indeholder en forud bestemt mængde aktivt materiale, der er beregnet til at gide den ønskede terapeutiske virkning kombineret med det nødvendige fortyndingsmiddel, dvs. bærer eller bærestof. Specifikationerne for den nye enhedsdosis er dikteret 10 af og er direkte afhængig af (a) det aktive materiales særlige karakteristika og den særlige terapeutiske virkning, der skal opnås, og (b) de begrænsninger, der ligger i selve det at blande et sådant aktivt materiale til terapeutisk brug af dyr, således som de omtales details jeret i beskrivelsen, idet disse er træk af den fore-liggende opfindelse.

Podestoffer fremstilles i reglen ud fra det tørrede faste polypeptid-konjugat eller polypeptidpolymer ved at suspendere polypeptid-konjugatet eller polypeptid-20 polymeren i et fysiologisk acceptabelt fortyndingsmiddel, såsom vand, saltvandsopløsning eller phosphatpufret saltvandsopløsning .

Podestoffer kan også omfatte et adjuvans eller hjælpestof. Adjuvanser såsom komplet Freund's adjuvans 25 (CFA), ukomplet Freund's adjuvans (IFA) og alun er kendte materialer på området og fås flere steder i handelen.

D. Antistoffer

Antistoffer og i det væsentlige hele antistoffer produceret mod (fremkaldt af) polypeptiderne iføl-30 ge opfindelsen samt antistofkombinationssteder fremstillet ud fra sådanne antistoffer udgør endnu en udførelsesform for opfindelsen. Antistoffer fremstilles i pattedyreværter såsom mus, kaniner, heste og lignende ved immunisering ved hjælp af de ovenfor beskrevne po-35 destoffer.

DK 172035 B1 32

Egnede monoklone antistoffer, i reglen hele antistoffer, kan også fremstilles ved hjælp af hybridteknologi som beskrevet af Niman m.fl., Proc. Natl.. Sci., USA .80, 4949-4953 (1983) . til dannelse af hybridomet, 5 hvorudfra det monoklone antistof produceres, sammensmeltes et myelom eller en anden selvopretholdende cellelinie med lymfocytter, der fås fra milten hos et pattedyr, der er hyperimmuniseret med et polypeptid ifølge opfindelsen.

10 Det foretrækkes, at myelomcellelinien skal være fra samme art som lymfocytterne. I reglen er en mus af stammen 129 G1X+ det foretrukne pattedyr. Egnede muse-myelomer til brug ved den foreliggende opfindelse omfatter de hypoxanthin-aminopterin-thymidin-følsomme (HAT) 15 cellelinier P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL 1580) og Sp2/0-Agl4 (ATCC CRL 1581).

Spleenocytter sammensmeltes i reglen med mye-lomceller ved hjælp af polyethylenglycol (PEG) 1500. Sammensmeltede hybrider udvælges efter deres følsomhed 20 over for HAT. Hybridomer, der producerer antistofmolekylerne ifølge opfindelsen, identificeres ved hjælp af enzymbundet immunsorbensprøve (ELISA), der beskrives i et efterfølgende afsnit.

Monoklone antistoffer kan ikke blot fås ud fra 25 hybridomvæskeoverfaser, men kan også fås i reglen i mere koncentreret form fra ascitesvæske fra pattedyr, hvori det ønskede hybridom er blevet indført. Produktion af monoklone antistoffer ved hjælp af ascitesvæske er kendt og vil ikke blive nærmere omtalt her.

30 Et antistof ifølge opfindelsen bindes både til polypeptidet, hvorimod det er produceret, og også til det tilsvarende EBNA-antigene-determinantsted, som polypeptidet ifølge opfindelsen immunologisk efteligner. Et polypeptid ifølge opfindelsen kan således være både et 35 immunogen og et antigen.

Antistofferne ifølge opfindelsen kan beskrives 0 DK 172035 B1 33 som oligoklone i sammenligning med naturligt forekommende polyklone antistoffer, eftersom de produceres mod et immunogen med forholdsvis få epitoper sammenlignet med epitoperne i et intakt EBNA-molekyle. Følgelig bindes 5 antistofferne ifølge opfindelsen til polypeptidets epitoper, medens naturligt forekommende antistoffer produceret mod EBNA bindes til epitoper gennem hele EBNA-mo-lekylet.

Eksempler på antistofmolekyler, der indeholder 10 antistofkombineringssteder ifølge opfindelsen produceret i kaniner mod polypeptiderne, der er vist i tabel I, undersøges ved hjælp af immunaftryksmetoderne beskrevet af Towbin m.fl., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354 (1979) og af Billings m.fl., Proc. Natl. Acad. Sci.

15 USA £A, 7104-7108 (1983). Yderligere detaljer anføres i afsnittet om materialer og metoder

Det viser sig, at alle polypeptiderne i denne undersøgelse fremkalder kanin-anti-polypeptid-antistoffer, når de bindes til en proteinbærer som konjugat og 20 i effektive mængder indføres i kaninværter i et podestof som beskrevet nedenfor. Disse- antistofmolekyler genkender intakt EBNA-protein isoleret ud fra de EBV-transfor-merdde humane B-lymfoblastcellelinier WI-L2, Raji og Daudi. Ved kontrolundersøgelser giver proteinekstrak-25 ter af B-lymfocytter, der er negative for EBV-in- fektion (BJAB-celler, der fås hos Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, Californien) ikke reaktive bånd med anti-polypeptid-antisera. Disse data viser, at eksemplerne på antistofmolekyler ifølge opfindelsen 30 immunreagerer med et EBV-infektions-specifikt protein.

Desuden viser det sig, at kanin-anti-polypep-^idantistoffernes immunreaktivitet over for intakt EBNA--protein kan blokeres ved hjælp af det igangsættende, immunogene polypeptid, der anvendes som et antigen, således 35 som det også vises i fig. 2. Disse resultater viser, at anti-polypeptid-antiseraenes idiotyper (antistof-kom- DK 172035 B1 34 bineringssteder) er specifikke for EBNA-antigene determinanter .

Kanin-anti-polypeptid-antistoffet mod polypep-tid P62 anvendes ved en konkurrenceundersøgelse for at 5 undersøge den antigene beslægtethed mellem polypepti-der P27, P62, P60 og P89. Dette antistof krydsreagerer omfattende med de konjugerede og ikke-konjugerede poly-peptider ved ELISA, som beskrives nedenfor. Bindingen af anti-polypeptid P62 til polypeptid P62 i fast fase 10 inhiberes 98% ved først at inkubere antistoffet med po-lypeptid P62. På samme måde inhiberes bindingen af an-ti-polypeptid P62 til polypeptid P62 81% af polypeptid P60 og 36% af polypeptid P27. Polypeptid P89 inhiberer slet ikke anti-polypeptid P62-reaktivitet.

15 For at afgøre^om antistofferne i human EBV-im- mun-serum også genkender denne antigene determinant^foretages en konkurrenceundersøgelse ved hjælp af serum fra en EBV-immun, rheumatoid ar thr i tits-patient (serum 1011). Resultaterne, der ses i fig. 3, ligner dem, der 20 fås, når der anvendes anti-polypeptid-P62. Dette viser, at den antigene determinant, der er fælles for polypep-tiderne P27, P62 og P60, efterligner en naturligt forekommende immunogen determinant i EBNA.

E. Diagnosticerinasprøvesysterner og -metoder 25 Polypeptiderne, antistofferne og antistof-kombine ringsstederne, der produceres mod de tidligere beskrevne polypeptider, og fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan også anvendes til diagnosticeringsprøver, såsom immunprøver. Sådanne diagnosemetoder omfatter f.eks.

30 enzymimmunprøve, enzymsammensat immunprøveteknik (EMIT), enzymbundet immunsorbensprøve, (ELISA), radio-immunprøve (RIA) , fluorescensprøve, enten enkelte eller dobbelte antistofmetoder og andre metoder, ved hvilken enten antistoffet eller antigenet mærkes med et eller andet påviseligt mær-35 kestof eller indikator, jf. generelt Maggio, Enzyme Immuno-

DK 172035 BT

35

O

assay, CRC Press, Cleveland, Ohio (1981), og M. Goldman, Fluorescent Antibody Methods, Academic Press, New York, N.Y., 1980. Særlige eksempler på sådanne prøvemetoder og -systemer, der kan anvendes til at udføre dis-5 se metoder, omtales nedenfor.

1. Prøver for EBNA

En fremgangsmåde til afprøvning af tilstedeværelse af EBNA i en kropsprøve indgår også i opfindelsen.

Ved en almen metode tilvejebringes en kropsprøve, der 10 skal analyseres,: og blandes med antistofmolekyler, som indeholder et antistofkombineringssted produceret mod et syntetisk random copolymerpolypeptid ifølge opfindelsen. Sammenblandingen opretholdes i et forud bestemt tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at antistofmolekyler-15 ne kan immunreagere med EBNA, der forekommer i kropsprøven. Omfanget af denne immunreaktion måles derpå for i; at afgøre, om der forekommer EBNA-molekyler eller ej i den undersøgte kropsprøve.

Et eksempel på et diagnosticeringssystem i 20 form at et sæt, der ud90r en udførelsesform for den foreliggende opfindelse, og som kan anvendes til at påvise EBNA, der forekommer i en alikvot mængde kropsprøve, indeholder antistofmolekyler ifølge opfindelsen, såsom antistoffer, hovedsagelig hele antistoffer, eller anti-25 stofkombineringssteder, såsom Fab- og F(ab')2“antistof-portioner, produceret mod et polypeptid ifølge opfindelsen i én emballage. Dette system omfatter også en indikator, der viser forekomst af en immunreaktion mellem receptoren og antigenet.

30 En typisk indikator omfatter radioisotoper, så som ^5l’iog ^"*^1, enzymer, såsom alkalisk phosphatase, peberrodsperoxidase, β-D-galactosidase og glucoseoxida-se, og fluorchrome farvestoffer, såsom fluorescein og rhodamin. Indikatoren kan være bundet direkte til re-35 ceptoren ifølge opfindelsen. Indikatoren kan også være bundet til et separat molekyle, såsom til et andet 0 36 DK 172035 B1 antistof, til et antistofkombineringssted eller til Staphylococcus aureus-(S. aureus)-protein A, som reagerer med (bindes til) antistoffet ifølge opfindelsen. En specielt eksempel på en sådan indikator med separat moleky-125 5 le er med I-mærket S. aureus-protein A.

Indikatoren tillader, at iimnunreaktionsproduktet kan påvises^ og emballeres separat uden forbindelse med receptoren, når den ikke er direkte bundet til et antistof ifølge opfindelsen. Når antistofmolekylet blandes 10 med en kropsprøve, såsom en acetonefikseret perifer blodlymfocyt (PBL) smear , immunreagerer det med EBNA, så at der dannes en immunreaktant, og indikatoren, der forekommer, signalerer dannelsen af immunreaktionsprodukt.

En udførelsesform for en EBNA-diagnosticerings-15 metode er en immunfluorescensprøve, der omfatter et forstærkningsreagens. Ved en sådan prøve acetonefikseres en PBL-smear på et simpelt mikroskopobjektglas. En ali-kvot mængde antistoffer produceret ifølge opfindelsen, f.eks. i kaniner, i reglen ca. 10^,ug til ca. 500 micro-20 gram, bringes i kontakt med objektglasset ved hjælp af kendte metoder.

Efter afskylning af eventuelle ikke-immunrea-gerede antistoffer ifølge opfindelsen blokeres i reglen eventuelle ikke-specifikke bindingssteder på objektglas-25 set med et protein, såsom okeserumalbumin (BSA), om ønsket. Et andet reagens (forstærkningsreagens), såsom komplement^ eller anti-immunglobulinantistoffer, f.eks. marsvinekomplement, kan derefter inkuberes på objektglasset.

30 Efter denne anden inkubation fjernes eventuelt uomsat forstærkningsreagens ved skylning, hvilket kun efterlader det, der er bundet til de førstnævnte antistoffer på objektglasset. Derpå inkuberes et tredje reagens (indikator), f.eks. antistof, såsom gede-anti-35 marsvinekomplement, på objektglasset. Det tredje reagens er mærket ved at være bundet til et fluorochromt DK 172035 B1 37 farvestof, såsom fluoresceinisothiocyanat (FITC), rhoda-min-B-isothiocyanat (RITC), tetramethylrhodamin-isothio-cyanat (TRITC), 4,4'-diisothiocyanostilben-2,2'-disul-fonsyre (DIDS) og lignende, som er kendt på området.

5 Eventuelt uomsat tredje reagens skylles af ef ter denne tredje inkubation, hvilket efterlader eventuelle med FITC-mærkede gede-antimarsvinekomplement-anti-stoffer, som bindes til komplementet på objektglasset. Tilstedeværelsen af med FITC mærket tredje reagens kan 10 påvises ved hjælp af fluorescensmikroskopi og viser derved tilstedeværelsen af EBV-infektion.

B-Lymfocytter, som man ved er inficeret med EBV, afprøves for tilstedeværelsen af EBNA ved hjælp af den ovenfor beskrevne immunfluorescensprøvemetode og mere 15 detaljeret i afsnittet om materialer og metoder. Kaninantistoffer produceret mod hvert af de i tabel I viste polypeptider kan påvise. EBNA i den med EBV inficerede cellelinie WI-L2.

Et foretrukket diagnosticeringssystem, fortrinsvis 20 som sæt, der kan anvendes til udførelse af ovennævnte prøvemetode, omfatter emballeret separat (a) antistoffer ifølge opfindelsen, som immunreagerer med EBNA, (b) et andet forstærkningsreagens, såsom komplement, f.eks. marsvinekomple-ment, anti-immunglobulin-anstistoffer eller S. Aureus protein 25 A, som reagerer med receptoren og (c) en indikator, som kan være bundet direkte til forstærkeren eller kan være en del af et separat molekyle, såsom et antistof eller en antistof-del, som reagerer med forstærkningsreagenset. Indikatoren signalerer indirekte immunreaktionen mellem antistofmolekylet 30 og EBNA ved forstærkerreagensets formidling.

Antistofmolekyler og den separate indikator i et hvilket som helst diagnosticeringssystem, der er beskrevet her, samt det ovenfor beskrevne forstærknings-reagns, kan foreligge i opløsning, som en flydende 35 dispersion eller som et hovedsagelig tørt pulver, f.eks.

0 DK 172035 B1 38 i lyophiliseret form. Når indikatoren er et molekyle, der er separat fra forstærkningsreagenset, foretrækkes det, at indikatoren emballeres separat. Når indikatoren er et enzym, kan enzymets substrat også foreligge 5 i en separat emballage i systemet. En fast understøtning, såsom det ovenfor beskrevne objektglas, en eller flere puffere og acetone kan også indgå som separat emballerede dele i dette diagnosticeringsprøvesystem.

De emballager, der omtales her i relation til 10 diagnosticeringssysteraer, er dem, der almindeligvis an vendes til diagnosticeringssystemer. Sådanne emballager omfatter glas- og plast- (f.eks. polyethylen, polypropylen og polycarbonat)-flasker, ampuller, plast- og plastfolie laminerede omhylninger og lignende.

15 Anvendelse af hele intakte, biologisk aktive antistoffer er ikke nødvendig til mange diagnosticeringssystemer, såsom den ovenfor beskrevne immunfluo-rescensprøve. Derimod anvendes kun det immunologisk aktive, idiotype-holdige, antigenbindings- og genken-20 delsesantistofsted, dvs. antistofkombineringsstedet, i antistofmolekylet. Eksempler på sådanne antistofkombineringssteder er de på området kendte såsom Fab- og F(ab1)2~antistofdele, som fremstilles ved proteolyse ved hjælp af hhv. papain og pepsin, som det er kendt.

25 2. Prøver for anti-EBNA-antistoffer

En anden diagnosticeringsmetode ifølge opfindelsen er en ELISA, som påviser anti-EBNA-antistoffer i en kropsprøve. Her anvendes et særlig foretrukket polypeptid ifølge opfindelsen, såsom polypeptid P62, 30 som antigen og bindes fortrinsvis til (adsorberes på) eller forbindes på anden måde med en fast matriks,'såsom det tværbundne dekstran, der under betegnelsen "Sephadex"® fås hos Pharmacia Fine Chemicals, Piscata-way, New Jersey), agarose, perler af glas, polyvinyl-35 chlorid, polystyren, tværbundet acrylamid, nitrocellulose eller fordybningerne i en mikrotiterplade, som 0 39 DK 172035 B1 udgør en fast understøtning.

Det særligt foretrukne polypeptid sammenblandes med en tilvejebragt kropsprøve, der skal analyseres. Sammenblandingen opretholdes i et forudbestemt 5 tidsrum, der er tilstrækkeligt til^ at anti-EBNA-antistof fer, der forekommer i kropsprøven, kan immunrea-gere med polypeptidet. At en sådan immunreaktion har fundet sted, bestemmes derpå med en indikator, der viser tilstedeværelsen af anti-EBNA-antistoffer i den 10 afprøvede kropsprøve.

Et eksempel på ELISA, der benytter ovenstående metode, gør brug af en fast understøtning, der består af et særligt foretrukket polypeptid ifølge opfindelsen adsorberet på en fastmatriks; der udgøres af fordybnin-15 gerne i en mikrotiterplade med 12 eller 96 fordybninger fremstillet af polystyren eller polyvinylchlorid. Ik-ke-specifikke bindingssteder på mikrotiterfordybningens vægge blokeres derefter i reglen med et protein, såsom okseserumalbumin (BSA). Ubundet polypeptid og BSA fjer-20 nes fra mikrotiterfordybningen, f.eks. ved skylning.

En alikvot mængde kropsprøve, såsom human serum, blod eller plasma, sammenblandes med den ovenfor beskrevne polypeptidbundne faste understøtning, så at der fås en sammenblanding indeholdende faste og flyden-25 de faser. Den faste/flydende fasesammenblanding opretholdes i tilstrækkelig lang tid til, at anti-EBNA-anti-stoffer i kropsprøven kan immunreagere med polypeptid-antigenet. Derefter adskilles i reglen den faste og den flydende fase.

30 En opløsning af et andet, mærket indikatorhol- digt antistof, antistofkombineringssted eller S. aureus-protein-A, som reagerer med det førstnævnte antistof, sammenblandes derpå med den faste fase, så at der fås endnu en fast/flydende-fasesammenblanding. Et eksempel 35 på et andet antistof er et med peroxidase mærket, gede-anti-humant-Ig-antistof, hvor de førstnævnte antistoffer 0 40 DK 172035 B1 er fra en human kropsprøve. Desuden omfatter anvendelige enzymmærkes toffer alkalisk phosphatase, β-D-galac-tosidase og glucoseoxidase. Sammenblandingen, der er dannet af den faste fase og den anden mærkede antistof-5 opløsning^opretholdes (inkuberes) i et forud bestemt tidsrum (f.eks. 30 minutter), der er langt nok til at der dannes en reaktant mellem det førstnævnte antistof og indikatoren, såsom en immunreaktion mellem de to antistoffer. Derefter adskilles den faste og den fly-10 dende fase.

Det andet antistof, der er beskrevet ovenfor, kan også være specifikt for og immunreagere med kun én af immunglobulinklasserne (f.eks. IgG, IgM,.IgE, IgA eller IgD). Sådanne antistoffer giver evnen til at i-15 dentificere den immunglobulinklasse anti-EBNA-antistof, som forekommer i kropsprøven, som det ses i tabel VI nedenfor. Desuden kan det andet antistof eller antistofkombineringssted være specifikt for og immunreagere med kun den ene af de to typer lette immunglobulin-20 kæder (f.eks. kappa eller lambda). Disse antistoffer tilvejebringer evne til at identificere isotypen af det immunglobulinmolekyle, der forekommer i kropsprøven.

En opløsning indeholdende et substrat for enzym-mærkestoffet, såsom hydrogenperoxid for peroxidase og en 25 farvedannende farvestofsprecursor, såsom o-phenylendia-min, eller p-nitrophenylphosphat for alkalisk phosphatase, sammenblandes derefter med den faste fase. Den optiske densitet ved en forud valgt bølgelængde (f.eks. hhv. 490 eller 405 nanometer) kan derefter bestemmes, 30 efter at der er forløbet et forud bestemt tidsrum (f.

eks« 60 minutter) og sammenlignes med en kontrols optiske densitet for at afgøre, om der forekommer anti--EBNA-antistoffer i kropsprøven.

En anden udførelsesform for opfindelsen omfat-35 ter et diagnosticeringssystem i sætform, som omfatter en fast understøtning bestående af en fast matriks, så- 0 41 DK 172035 B1 som en polystyrenmikrotiterstrimmel med 12 fordybninger, og et polypeptid ifølge opfindelsen absorberet (bundet) eller på anden måde fikseret til den faste matriks, såat der dannes en fast matriks. Dette system indeholder 5 fortrinsvis også separat emballerede anti-human Ig-anti-stoffer med bundet indikator, såsom med peroxidase mærket gede-anti-humane Ig-antistoffer, og kan også indeholde substrat for den bundne indikator, såsom hydro-genperoxid og en farvedannende farvestofprecursor, såsom 10 o-phenylendiamin, i yderligere separate emballager. Hy-drogenperoxid indgår i reglen ikke i sættet på grund af dets forholdsvis store ustabilitet og leveres i reglen af den sidste forbruger. Puffersalte, der skal anvendes i en analyse, ved hvilken dette system benyttes, 15 kan også være omfattet i en eller flere separate emballager i tør eller flydende form. Separate emballager indeholdende humane-anti-EBNA-antistoffer og humane antistoffer uden an ti-EBNA1-an tis toffer (normale humane antistoffer) kan også indgå som hhv. positive og negative 20 kontroller. En analyse med hensyn til tilstedeværelse af anti-EBNA-antistoffer i en kropsprøve, såsom serum, kan udføres med dette diagnosticeringssystem ved hjælp af den ovenfor beskrevne fremgangsmåde.

Eksempelvis anvendes en ELISA i lighed med den 25 ovenfor beskrevne og senere i afsnittet Materialer og fremgangsmåder detaljeret beskrevne til at screene for forekomst af anti-polypeptid-immunglobulin i sera fra 91 personer med anti-EBNA-positive serotyper, konstateret ved hjælp af den tidligere beskrevne anti-30 -komplement-immunfluorescens (ACIF). Når seraene afprøves i en 1:20 fortynding, er alle 91 positive overfor (bundet til) polypeptider P27, P62, P60 og F16, F14 og F15. Selv ved kraftigere fortynding på 1:320 immun-reagerer 83 af de 91 EBNA-positive sera med polypeptid 35 P62 ved ELISA. Der synes således at være udmærket o- verensstemmelse mellem anti-EBNA-antistoftiter, målt DK 172035 B1 0 42 ved ACIF og hvert serums antipeptid-aktivitet.

Desuden viser resultaterne udmærket overensstemmelse mellem ACIF-metoden og den foreliggende ELISA-frem-gangsmåde, som er enklere og lettere at anvende. Yder-5 ligere viser resultaterne anvendeligheden af polypepti-der ifølge opfindelsen til en diagnosticeringsprøve for anti-EBNA-antistoffer.

Tabel V nedenfor viser reaktiviteten af sera, der fås fra to personer før og efter, at de har fået af 10 EBV fremkaldt smitsom monohucleose (IM). I begge tilfælde findes antistoffer, der bindes til polypeptider P27, P62 og P60, ikke før infektion, men viser sig bagefter. I modsætning hertil produceres der ikke åf disse personer nogen antistoffer, som bindes til polypep-15 tid P89.

Ved en yderligere undersøgelse screenes opbevarede sera fra et tidligere rapporteret panel af 27 EBV ikke-immune donorer [Catalano m.fl., J. Clin. Invest. §5., 1238-1245 (1980] med hensyn til binding til 20 polypeptiderne P62 og P60 ved den ovenfor beskrevne ELISA. De anvendte seras EBV-immun-status defineres af, om der forekommer Epstein-Barr-viralt capsid-anti-gen (VCA) eller ej. Personer, der ikke har serum-antistoffer mod VCA (VCA-), har aldrig være inficeret med 25 EBV. VCA-positive (VCA+) personer har haft EBV-infek-tioner og har i reglen et lavt niveau anti-EBNA-antistof fer. Ingen af seraene udviser signifikant reaktivitet over for noget polypeptid, som det fremgår af tabel V nedenfor.

30 35 0 43 DK 172035 B1

Tabel V

Antistoffer mod EBNA-peptider 1 human-sera^- 3 2 Ο°405χ10 opnået roed PATIENT _patientantistoffer rood: _ 5 P27 P62 P60 P89 VCA+ Normal l3 155 958 154 23 VCA+ Normal 23 516 819 145 16 SB præ-mononucleose 11 13 51 9 SB post-mononucleose 33 514 115 23 10 MV præ-mononucleose 15 77 72 29 NV post-mononucleose 107 631 162 25

VCA-Normale (n*27)4 67+235 ND6 45+18 ND

1 Alle sera afprøve i en fortynding på 1:20.

15 2 Optisk densitet roåles ved 405 nm lysbølgelæng de efter 30 minutters substratinkubation.

3 VCA+-sera fra personer, der ikke udviser kliniske tegn på forekommende med EBV-relateret sygdom.

4 Sera fra 27 personer, der ikke udviser kliniske 20 tegn. på med EBV-relateret sygdom før eller nu, hvilket viser sig ved, at der ikke forekommer antistoffer mod VCA.

5 Gennemsnitlig optisk densitet + 1 standardafvigelse .

25 6 Ikke foretaget.

For at undersøge sammenhængen mellem ELISA og ACIF-diagnosticeringsteknik under forløbet af infektion undersøges opbevarede sera fra 8 studerende, taget efter 30 hinanden efter udbrud af smitsom mononucleose (IM) , ved den ovenfor beskrevne ELISA ved hjælp af polypeptid P62.

Alle de studerende udviklede anti-EBNA-titere 1 måned til 1 år efter infektion, målt ved hjælp af den klassiske metode, evs. ACIF, Henle, m.fl., J. Infect. Dis. 130.

35 231-239 (1974).

Hos halvdelen af personerne stiger anti-P62-an- DK 172035 Bl 0 44 tistofferne parallelt med den tilsvarende anti-EBNA-ti-ter, som det ses for patient 15 i fig. 4. Hos den anden halvdel påvises antistoffer mod polypeptid P62 i den første måned efter symptomernes fremkomst, medens 5 disse antistoffer først påvises på et senere tidspunkt med AClF-teknikken. Disse resultater vises for patienterne 14 og 2 i fig. 5. Anti-P62-antistoffer kan derfor påvises med ELISA ifølge den foreliggende opfindelse, før anti-EBNA-antistoffer kan påvises ved hjælp af stan-10 dard anti-komplement-immunfluorescensprøven.

For at skelne den klasse immunglobulin, der overvejende er ansvarlig for et individs immunreaktion på et givet tidspunkt under forløbet af smitsom mono-nucleose (IM), anvendes sekundære (indikerende) antistof-15 fer, der er specifikke for human IgG eller IgM til ELISA som beskrevet i afsnittet om metoder og materialer. I tabel VI nedenfor ses resultaterne af denne undersøgelse med sera fra to personer fra forskellige tidspunkter under EBV-infektion målt mod polypeptid P62 ved ELISA.

20

Tabel VI

Ved polypeptid P62-bundet ELISA"*påvist fremkomst af anti-peptid-aktlvltet efter mononucleoseinfektion Tid efter Patient MV Patient 15 25 infektion_IgM1_IgG2_IgM1 IgG2

Præ infektion 1031 74 ND^ ND

1 uge 245 80 152 113 1 måned 87 37 225 118 3 måneder 136 60 208 118 30 Γ2 måneder ND ND 249 375 21 måneder 145 600 185 994 1 Patient IgM-niveau påvist ved hjælp af et antistof nr. 2 specifikt for human IgM.

2 Patient IgG-niveau påvist ved hjælp af et anti-stof nr. 2 specifikt for human IgG.

DK 172035 B1 0 45 3 Optisk densitet målt ved 405 nm lysbølgelængde.

4 Ikke foretaget.

Ved hjælp af denne ELISA-metode kan stigningen 5 i IgM-antistofværdier, selv om den er lille, gentages og findes i alle følgende afprøvede sera. Immunreaktionen, der måles ved hjælp af ELISA-prøven/ er normal der-ved> at igM på klassisk vis fremkommer før IgG under EBV-infektion. Fremkomsten af IgMrantistoffer før IgG-anti-10 stoffer ses særlig godt hos patient 15 i tabel VI. De ovenstående resultater viser igen, at infektion med EBV bevirker produktion af antistoffer, som reagerer med mindst ét polypeptid ifølge opfindelsen.

I en større anti-polypeptid-ELISA-undersøgelse 15 screenes det ovenfor beskrevne panel på 19 VCA-sera mod polypeptiderne P27, P62, P60, F12, F13, F14, F15 og F16.

Ingen af VCA-seraene viser sig at reagere positivt. Typiske date vises i tabel VII nedenfor. Sera fra klinisk normal personer, der er positive over for VCA-antistof-20 fer, afprøves i to fortyndinger. Typiske resultater, der ses i tabel VII nedenfor, viser, at alle de VCA+ -positive personer var positive overfor, dvs. har antistoffer, der bindes til hvert af polypeptiderne.

Sera fra en række rheumatoid-arthritis-(RA)“ 25 -patienter screenes også ved ELISA. Disse resultater er også anført i tabel VII.

30 35 0 46 DK 172035 B1

Tabel VII

Ved ELISA bestemt gennemsnitlige antlpeptidniveauer 1 humansera 5 Patient Antal Gennemsnit!!« antistofs- gruppe sera aktivitet mod polypeptiderne _P27 Ρ62Γ P60 F12 F13 F16 *

Nor-2 1/202 19 22 17 77 34 41 47 10

Nor+4 1/20 26 521 854 394 128 70 733

Nor+ 1/320 48 90 223 70 37 37 166 15 RA+5 1/20 28 597 999 564 118 113 843 RA+ 1/320 48 126 348 122 50 50 231 20 1 Aktivitet målt som optisk densitet ved 405 nm lysbølglængde efter 30 minutters seruminkubation.

2 VCA-negative personer 3 Fortynding, ved hvilken sera afprøves.

4; VCA-positive personer 25 5 Personer, hos hvem diagnosen rheumatoid arthri tis er stillet.

Forskellen mellem de normale, VCA-positive (kontrol) og RA-patienter kan bedst ses ved serumfortyndingen 30 1: 3205; Antistof niveauerne hos RA-patienter er signifi kant højere for hvert afprøvet polypeptid ved denne fortynding, når der analyseres ved hjælp af Wilcos Rank Sum--metoden (signifikansniveau større end 99%).

Patienter med Sjogren's syndrom, systemisk lupus 35 erythematosus og progressiv systemisk sclerose (PSS) scree-nes også ved både høje og lave serumfortyndinger. De ene- DK 172035 B1 0 47 ste forskelle, der findes mellem disse patientgrupper og normale, er forholdsvis højere gennemsnitstiter hos PSS-patienter over for polypeptiderne P27, P62, P60, F16, F14 og F15. Disse resultater menes muligvis at skyldes 5 en tidligere EBV-relateret inf ektion3 eller at EBV indgår i disse autoimmunsygdomme. Disse data mindsker ikke anvendeligheden af ELISA som diagnosticeringsmetode.

3. Tilberedning til passiv immunisering

En patient med latent inficerede B-lymfocytter, 10 som udtrykker EBNA på deres celleoverflader, kan behandles med antistoffer ifølge opfindelsen, fortrinsvis hele antistoffer, dyrket mod syntetiske polypeptider ifølge opfindelsen, som immunreagerer med EBNA. Antistofferne indgives i en enhedsdosis, hvori en effektiv mængde anti-15 stoffer er dispergeret i et pharmaceutisk acceptabelt fortyndingsmiddel.

En effektiv mængde af sådanne antistoffer varierer afhængigt af antistoffernes reaktivitet og type.

I reglen anses ca. 0,5 til ca. 25,0 mg antistof pr. kg 20 af patientens vægt for effektivt. Antistofferne kan indgives intravenøst, intramuskulært eller intraperito-ne£lt med flere indgivelser med 3 til 20 dages mellemrum. Antistofferne kan også indgives kombineret med kirurgisk eller kemisk behandling.

25 Antistofferne kan fås fra sera eller plasma fra en dyreart, der afviger fra patientens, ved at producere antistoffer mod polypeptidet ifølge opfindelsen ved hjælp af de tidligere beskrevne podestoffer. Antistofferne kan også fås fra monoklone kilder, såsom asci-30 tesvæske, ved at fremstille en hybridomcellelinie ved hjælp af kendt teknik. Hele antistoffer foretrækkes som kombineringssted, eftersom de er i stand til at aktivere komplementsystemet, når der dannes et immunkompleks .

35 0 48 DK 172035 B1 II. Metoder og materialer A. Syntese af polypeptider

Polypeptiderne ifølge opfindelsen syntetiseres kemisk ved fast-fase-metoder, som beskrevet af Merrifield 5 m.fl., J. Am. Chem. Soc. J15# 2149-2154 (1963), og Hough- ten m.fl., Int. J. Pept. Prot. Res. 311-320 (1980). Ved fast-fase-metoden til polypeptidsyntese anvendes en Beckman model 990B Polypeptide Synthesizer, der fås hos Beckman Instrument Co., Berkeley, CA, USA.

10 For polypeptider med færre end 35 rester, som anvendes i podestoffer, tilføjes en cysteinrest til ami-noendestillingen eller til carboxy-endestillingen for at medvirke ved kobling til en proteinbærer som beskrevet nedenfor. Sammensætningerne af alle polypeptider bekræf-15 tes ved aminosyreanalyse.

Ved fremstilling af et syntetisk polypeptid ifølge opfindelsen ved ovennævnte fast-fase-metode bindes aminosyreresterne til en harpiks (fast fase) via en esterbinding fra carboxyendestillingsresten. Når polypepti-2° det skal bindes til en bærer via en Cys-rest eller poly-meriseres via endestillede Cys-rester, er det bedst som den cårboxy-endestillede rest at benytte den Cys-rest, som er ester-bundet til harpiksen.

α-Aminogruppen i hver tilføjet aminosyre be-25 skyttes i reglen med en tert.-butoxycarbonyl-(t-BOC)--gruppe,før aminosyren tilføjes til den voksende poly-peptidkæde. t-BOC-Gruppen fjernes derpå før tilføjelse af den næste aminosyre til den voksende polypeptid-kæde.

30 Reaktive aminosyre-sidekæder beskyttes også under syntese af polypeptiderne. Sædvanlige sidekæde-beskyttelsesgrupper anvendes til de øvrige aminosyrere-ster, som følger: 0-(p-brombenzyloxycarbonyl) til tyrosin } O-benzyl til threonin, serin, asparaginsyre og glu-35 taminsyre; S-methoxybenzyl til cystein; dinitrophenyl til histidin; 2-chlorbenzoxycarbonyl til lysin; og to- 0 49 DK 172035 B1 syl til arginin.

Beskyttede aminosyrer omkrystalliseres ud fra passende opløsningsmidler, så at der fås enkelpletter ved tyndtlagschromatografi. Koblinger udføres i reglen 5 ved at anvende et 10-fold overskud af både beskyttet a-minosyre og dicyclohexylcarbodiimid i forhold til antallet af milliækvivalenter af N-endestillet begyndel-sesaminosyre. Et to-molært ovérskud af begge reagenser kan også anvendes. Til asparagin tilsættes en ækvimolær 10 mængde N-hydroxy-benzotriazol til den beskyttede aminosyre, og dimethylformamid anvendes som opløsningsmiddel.

Alle koblingsreaktioner er mere end 99% komplette ved picrinsyreprøven, jvf. Gisin, Anal. Chem. Acta 58, 248-249 (1972).

15 Efter fremstilling af et ønsket polypeptid be handles en del af det fremkomne beskyttede polypeptid (ca. 1 g) med 2 ml anisol,og ca. 20 ml vandfrit hydrogenfluorid kondenseres ind i reaktionsbeholderen ved tøris-temperatur. Den fremkomne blanding omrøres ved 20 ca. 4°C i ca. 1 time for at fraspalte beskyttelsesgrupperne og fjerne polypeptidet fra harpiksen. Efter afdampning af hydrogenfluoridet ved 4°C med en strøm af N2 ekstraheres remanensen med vandfri diethylether tre gange for at fjerne anisol, og remanensen tørres i vakuum.

25 Det vakuumtørrede materiale ekstraheres med 5%'s vandig eddikesyre (3 x 50 ml) for at skille det fri polypeptid fra harpiksen. Den ekstraktholdige opløsning lyophiliseres, så at der fås et monomert uoxi-deret polypeptid.

30 Det fremstillede syntetiske polypeptid kan an vendes som reagens i en enzymbundet immunsorbens-prøve (ELISA) til at påvise anti-EBNA-antistoffer. Det syntetiske polypeptid kan også anvendes til at fremstille et podestof, i reglen ved at binde det til en bærer, så 35 at der dannes et konjugat, og dispergere en effektiv mængde af konjugatet i et fysiologisk acceptabelt fortyn- DK 172035 B1 50 dingsmiddel, som det vil blive omtalt nedenfor.

Det skal også bemærkes, at en syntetisk multimer kan fremstilles ved fast-fase-syntese af flere af polypep-tiderne ifølge opfindelsen bundet sammen hoved-til-hale ved 5 hjælp af en amidbinding mellem den carboxyl-endestillede rest i det ene polypeptid og den amino-endestillede rest i et andet polypeptid. Sådanne syntetiske multimerer syntetiseres fortrinsvis som en enkelt lang polypeptidmultimer, men kan også fremstilles som individuelle polypeptider, som 10 er bundet sammen efter hver enkelts syntese, idet der anvendes et carbodiimidreagens, såsom 1-(3-dimethylaminopropyl)- 3-ethylcarbodiimid-hydrochlorid i vand. Det samlede antal aminosyrerester, der indeholdes i en multimer fremstilles som en enkelt polypeptidkæde, er fortrinsvis mindre end ca.

15 50, så at op til ca. 8 polypeptider ifølge opfindelsen kan inkorporeres i en enkelt hoved-til-hale-multimerkæ-de, som syntetiseres som et enkelt polypeptid. En syntetisk hoved-til-hale multimer indeholder særlig foretrukket 2 til ca. 4 blokke forbundne syntetiske random 20 copolymer-polypeptider ifølge opfindelsen og i alt færre end ca. 40 aminosyrerester.

B. Fremstilling af polymere

Polypeptiderne ifølge den foreliggende opfindelse kan bindes sammen, så at de danner en antigen 25 og/eller immunogen polymer (syntetisk multimer) omfattende flere af polypeptid-gentagelsesenhederne. En sådan polymer har i reglen den fordel, at den har forøget immunogenicitet og'åntigenicitet. Desuden er en bærer i reglen ikke nødvendig, når der anvendes et 30 polymert immunogen. Når der anvendes forskellige po-lypeptidmonomere til at fremstille polymere, opnås evne til at immunreagere med antistoffer mod flere EBNA-an-tigene determinanter. En yderligere fordel er en sådan polymers evne til, når den anvendes i et podestof, 35 at fremkalde antistoffer, som immunreagerer med flere 0 51 DK 172035 B1 antigene determinanter 1 EBNA.

En polymer ifølge opfindelsen kan fremstilles ved at syntetisere polypeptiderne som forklaret ovenfor og medtage cysteinrester i både amino- og carboxyende-5 stillingerne/ så at der dannes et "diCys-afsluttet" poly-peptid. Således kan hvert af polypeptiderne i tabel I og polypeptiderne Dl og D2 i tabel II syntetiseres, så at de indeholder en yderligere Cys-rest i både amino- og i carboxyendestillingerne, så at der fås diCys-afsluttede 10 polypeptider i deres reducerede former. Efter syntese opløses ved en typisk fremstilling i laboratorium, 10 mg af diCys^-polypeptidet (indeholdende cystein-rester i u-oxideret form) i 250 ml 0,1 molær ammonium-biearbonat-puffer. Det opløste diGys-afluttede polypeptid luftoxi-15 deres derpå ved at omrøre den fremkomne opløsning forsigtigt i ca. 18 timer i luften, eller indtil der ikke kan påvises fri . mercaptan ved hjælp af Ellman-prøven.

[Jfr. Ellman, Arch. Biochem. Biophys. £2, 70-77 (1959)].

Den således fremstillede polymer (syntetiske mul-20 timer) indeholder flere af de syntetiske random copolyrae-re polypeptidgentagelsesenheder, som bindes sammen af oxiderende cystein-(cystin)-rester. Sådanne polymere indeholder i reglen polypeptidgentagelsesenheder bundet sammen hoved-til-hale, men også hoved-til-hoved og ha-25 le-til-hale, dvs. aminoendestillingerne i to polypeptidgentagelsesenheder kan være bundet sammen af en enkelt cystin-rest, lige som to carboxy-endestillinger, eftersom forbindelsesgrupperne i begge polypeptid-endestil-lingerne er identiske.

30 C. Kobling til bærere

De syntetiske polypeptider kobles til nøglehuls-klæber-hæmocyanin (KLH) som bærer ved hjælp af den af Liu m.fl. beskrevne metode.,1 Biochem. 80, 690 (1979).

Kort fortalt aktiveres 4 mg bærer med 0,51 mg m-maleim-35 idobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester og omsættes derpå med 5 mg polypeptid via et amino- eller carboxy-ende- 0 52 DK 172035 B1 stillet cystein, hvilket giver et konju at, der indeholder ca. 10 til ca. 35 vægt% polypeptid.

En eller flere yderligere aminosyrerester kan tilføjes til det syntetiske polypeptids amino- eller carb-5 oxyendestillinger for at understøtte polypeptidets binding til en bærer. Som omtalt nedenfor har det vist sig, at cysteinrester, tilføjet ved det syntetiske polypeptids amino- eller carboxy-endestilling,· er særlig anvendelige til dannelse af polymere via disulfidbindinger. Imid-10 lertid kan der også anvendes andre kendte metoder på området til at fremstillig konjugater. Således omfatter yderligere bindingsmetoder anvendelse af Michael's additions-reaktionsprodukter, dialdehyder såsom glutaralde-hyd, Klipstein m.fl., J. Infect. Dis. 147, 318-326 (1983) 15 og lignende, eller anvendelse af carbodiimid-teknologi som ved anvendelse af et vandopløseligt carbodiimid til dannelse af amidbindinger til bæreren, som omtalt ovenfor, for at binde flere polypeptider sammen til dannelse af en syntetisk multimer.

20 Anvendelige bærere er kendt og er i reglen pro teinerne selv. Eksempler på sådanne bærere er nøgleuls-hæmocyanin (KLH), edestin, thyroglobulin, albuminer, såsom okseserumalbumin (BSA) eller human-serumalbumin (HSA), røde blodlegemer såsom fåreerythrocytter (SRBC), tetanus 25 toxoid, koleratoxoid samt polyaminosyrer, såsom poly(D--lysin:D-glutaminsyre) og lignende.

Som det også er kendt, er det ofte gavnligt at binde et syntetisk polypeptid til dets bærer ved hjælp af en mellemliggende bindingsgruppe. Som nævnt ovenfor 30 er glutaraldehyd sådan en forbindeIsesgruppe. Når der imidlertid anvendes cystein, er den mellemliggende bindingsgruppe fortrinsvis et m-maleimidobenzoyl-N-hydroxy--succinimid (MBS), hvilket anvendes her.

Yderligere kan MBS først tilsættes til bæreren 35 ved hjælp af en ester/amid-udvekslingsreaktion som omtalt af Liu m.fl., supra. Derefter kan tilføjelsen ef- 0 53 DK 172035 B1 terfølges af tilføjelse af en blokeret mereaptogruppe, såsom thioleddikesyre (CH^COSH) på tværs af maleimido-dobbeltbindingen. Efter fraspaltning af den acylblo-kerende gruppe dannes en disulfidbinding mellem den af-5 blokerede mercaptanforbindelsesgruppe og mercaptanen i den tilføjede cysteinrest i det syntetiske polypeptid.

Valg af bærer afhænger mere af immunogenets endelige anvendelse end af den determinante del af im-munogenet og hviler på kriterier, der ikke indgår i den 10 foreliggende opfindelse. Hvis et podestof således skal anvendes til dyr, bør der vælges en bærer, der ikke giver en negativ reaktion i det pågældende dyr.

D. ELISA

Anti-peptid-antistofbindings- og inhiberingsun-15 dersøgelser udføres ved hjælp af en nedenfor beskrevet enzymbundet immunsorbensprøve (ELISA)*

Kort fortalt dækkes mikrotiterfordybninger (Co-star nr. 3590, Cabridge, MA) med individuelle polypep-tider som antigener ved at tilsætte lOO^uliter BBS [10 20 mmolær natriumborat (pH 8,3) , 150 mmolær NaCl] indeholdende polypeptid i en koncentration på 10^ug/ml. Kontakt mellem fordybningerne og antigen-holdig opløsnng opretholdes i et forud bestemt tidsrum, i reglen 15 minutter, og ved 20°C til dannelse af en med antigen dæk-25 ket fast fase. Den faste og den flydende fase adskilles, og fordybningerne vaskes tre gange med BBS.

Ikke-specifikke bindingssteder blokeres ved i-blanding af 200^uliter 1%'s okseserumalbumin (BSA) i hver fordybning, så at der dannes endnu en fast/flyden-30 de faseblanding, og denne fast/flydende fase-blanding opretholdes i 30 minutter ved 20°C. Faserne adskilles, og overskydende ubundet BSA fjernes ved vask ,tre gange med BBS.

Kanin- og human-sera (alikvote mængder kropsprø-35 ve) analyseres for anti-polypeptid-aktivitet ved at tilsætte lOO^uliter af et serum fortyndet 1:20 i BBS pr.

0 54 DK 172035 B1 fordybning, så at der dannes en fast/flydende-fåse-sammensætning. Kontakt mellem de fortyndede sera og den antigendækkede faste fase opretholdes i forud bestemt tid, såsom 1 time, og ved 20°C, så at en immunreaktant 5 kan dannes. Den faste og den flydende fase adskilles, og den fase fase, dvs. de antigen-dækkede, immunreak-tant-holdige fordybninger, vaskes derpå tre gange med BBS.

Antistofferne i humansera, som immunreagerer 10 med et adsorberet polypeptid, påvises ved hjælp af en indikator, der omfatter alkalisk phosphatase-konjugeret gede-anti-human-Ig-antistof (Tago, Burlington, CA). Antistofferne i kaninsera, som immunreagerer med et adsorberet polypeptid, påvises ved hjælp af en indikator 15 omfattende alkalisk phosphatase-konjugeret gede-anti-ka-nin-Ig-antistof (Kirkegård & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD). I begge tilfælde tilsættes lOO^uliter af indikatorantistoffet fortyndet 1:300 i BBS pr. fordybning, så at der dannes en yderligere fast/flydende-20 fase-sammensætning. Denne fast/flydende-fase-sammensæt-ning opretholdes i et forud bestemt tidsrum, en time, til dannelse af et reaktionsprodukt mellem de humane antistoffer bundet til den faste fase og indikatoren og ved 20°C. Faserne adskilles, og den faste fase vaskes tre gange 25 med BBS.

Alkalisk-phosphatase-konjugeret antistof bundet til polypeptid-specifikt antistof påvises ved spektro-fotometrisk at måle den enzymatiske hydrolyse af p-nitro-phenylphosphat til p-nitrophenol. Kort forklaret til-30 sættes lOO^uliter p-nitrophenylphosphat (1 mg/ml i 2 mmolær MgC^ (pH 9,8), 50 mmolær natriumcarbonat] til hver fordybning. Den enzymatiske reaktion får lov at forløbe en time, og derpå bestemmes den optiske densitet ved 405 nm i et "Titertek"-spektrofotometer, der 35 fås hos Flow Laboratories, Inglewood, DA.

0 55 DK 172035 B1 E. Cellekultur

Evnen hos antistofmolekylerne ifølge opfindelsen til at immunreagere med EBNA produceret i celler undersøges som beskrevet ovenfor ved hjælp af WI-L2-, Raji-, 5 Daudi- og BJAB-cellelinier. WI-L2-celler (ATCC CRL 8155 W1L2-NS, American Type Culture Collection, Bethesda, MD) er en EBV-genom-positiv, ikke-producerende B-lymfoblast-linie afledt ud fra en human patient med arvelig sfæro-cytisk anæmi,, jf. Levy m.fl., Cancer 22", 517-524 (1968).

10 Raji-celler (ATCC CCL 86, American Type Culture

Collection, Bethesda, MD) er et EBV-genom-positivt, EBNA-producerende lymfoblast-lignende cellelinie fra et Bur-kitt-lymfom, jf. Epstein, J7 Nat. Cancer Inst. jJ4, 231 (1965) .. Daudi—celler (ATCC CCL 213, American Type Culture Collec-15 tion, Bethesda, MD) er også en EBNA-producerende cellelinie. BJAB-celler er en ikke-EBNA-producerende lymfocytcellelinie, der fås hos Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, CA.

De ovennævnte cellelinier dyrkes i RPMI 1640*-ft»e-20 dium [Moore, J. Am. Med. Assoc. 199, 519-524 (1967), og

Morton, In Vitro .6, 89-100 (1970)] suppleret med 2 mmolær L-glutamin og 10% kalvefosterserum.

F. Ekstrakt af hele celler

Ekstrakter af EBNA-producerende og ikke-produce-25 rende (kontrol-) celler fremstilles for at afgøre, om · åhf tistofmolekyler ifølge opfindelsen er anvendelige til diagnosticering af EBNA-ekspression, Celler fra kulturer beskrevet ovenfor vaskes i phosphat-pufret saltvandsopløsning (PBS, 150 mmolær NaCl, 10 mmolær natriumphosphat, 30 pH 7,4) indeholdende 0,2 mmolær phenylmethylsulfonylflu-orid, kvældes i 5 minutter i reticulocyt-standardpuffer (RBS, 10 mmolær NaCl, 10 mmolær Tris-HCl, pH 7,4, 1,5 mmolær MgClj, 0,2 mmolær phenylmethylsulfonylfluorid) og lyses ved lydbølgebehandling i 3-5 volumendele RBS ju-35 steret til 0,2-0,35 molær NaCl. Efter 30 minutter på is, centrifugeres det lydbølgebehandlede materiale ved 10,000 0 56 DK 172035 B1 G i 15 minutter for at fjerne cellerester.

G. Immunaftryksmetoder

Celleekstrakter, der fås som beskrevet ovenfor, afprøves for EBNA ved hjælp af humansera, som man ved 5 indeholder anti-EBNA-antistoffer eller eksempler på antistofmolekyler ifølge opfindelsen. Ekstrakterne koncentreres enten ved fældning med 2 volumendele ethanol ved -20°c i ca. 18 timer og opløses derpå i prøvepuffer [SB, 10% glycerol, 2% 2-mercaptoethanol, 1% natriumdode-10 cylsulfat (SDS), 0,002% bromphenolblåt, 40 mmolær Tris- -HC1 (pH 7,4)] eller fortyndes 1:6 i prøvepuffer til SDS--polyacrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE). Der støbes 7,5% polyaarylamidgeler, som køres ifølge Laemmli's metode, Nature 277, 680-685 (1970), idet der påføres 50-15 200^,ug totalt protein pr. bane.

Efter elektroforese overføres proteinbåndene fra SDS-polyacrylamidgelerne elektroforetisk til en fast understøtning i form af nitrocelluloseark (Schleicher & Schuell, Detroit, MI) ved hjælp af Towbin m.fl.'s meto-20 de, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 76, 4350-5354 (1979).

Dette sker ved hjælp af et "Bio-Rad Trans-Blot"-apparat (Bio-Rad, Richmond, CA) ved 70 volt i 2-3 timer i 12,5 mmolær Tris-hydroxid, 96 mmolær glycin og 20% methanol.

(Efter overførslen mættes nitrocellulosefiltre-25 ne eller-aftrykkene i en time i enten 2% BSA (væ/vo) i PBS eller 2% mælkepuler (væ/vo) i PBS for at reducere ikke-specifik binding. Aftrykkene immunreageres derpå med 0,1 ml af enten EBNA-positiv humanserum eller kanin--antipolypeptid-antistoffer i 2ml PBS eller 2% mælk i 30 en time ved 37°C.

Anti-peptidrantistoffer bundet til EBNA-pro- tein påvises ved at omsætte aftrykkene med en indikator.

12=1 I dette tilfælde bringes 20 ml med I-mærket [200.000 tællinger pr. minut pr. ml (cpm/ml), 106 tællinger pr.

35 minut pr. mg (cpm/mg)] S. aureus-protein A (Cabiochem,

La Jolla, CA) i kontakt med immunreaktionsproduktet i 0 57 DK 172035 B1 30 minutter ved 37°C. Aftrykkene vaskes med PBS og eksponeres for Kodak XAR-røntgenfilm natten over ved -70°C.

H. Immuniseringer

Antistofmolekylerne ifølge opfindelsen omfatter 5 hele antistoffer produceret i pattedyr ved at immunisere dem med podestof omfattende et polypeptid og/eller en multimer som beskrevet ovenfor. Både polypeptider og multimere kan anvendes medtaget i podestoffer alene eller konjugeret med et bærerprotein, såsom nøglehulsklæber-10 hæmocyanin (KLH). Imidlertid anvendes polypeptider fortrinsvis som konjugat, og multimere anvendes fortrinsvis alene.

Kaniner immuniseres med podestoffer indeholdende 1,0 mg konjugat i komplet Freund's adjuvans (CFA) og 15 boostes en måned senere med 1,0 mg konjugat i ukomplet Freund's adjuvans (IFA). iver immunisering består af en subcutan injektion på bageste hofte. Kaniner tappes for blod 1 og 2 måneder efter boosteren.

Sera indeholdende immunologisk aktive antistof-20 fer produceres derpå ud fra blodtapningerne ved hjælp af kendte metoder. Disse antistoffer immunreagerer med et eller flere af polypeptiderne ifølge opfindelsen samt en EBNA-antigen determinant. De kan således anvendes i et system til analyse for EBNA.

25 Individuelle podestoffer fremstilles med CFA

eller IFS på følgende måde: En mængde konjugat, der er tilstrækkelig til at give den ønskede mængde polypeptid pr. inokulering (f.eks. 1 mg) opløses i PBS (ved ca.

0,5 ml) ved pH 7,2. Lige store voluminer CFA eller IFA 30 blandes derpå med konjugatopløsningerne, så at der fås et podestof-indeholdende konjugat, vand og adjuvans, hvor vandzolie-forholdet er 1:1. Derefter homogeniseres blandingen, så at der fås et podestof. Voluminet af et således fremstillet podestof er i reglen større end 1 ml, og 35 noget af konjugatet, PBS og adjuvanset går tabt under e-mulgeringen. Hovedsagelig al emulsionen, der kan udvin- 0 58 DK 172035 B1 des, kommes i en sprøjte og indføres derpå i kaniner som tidligere omtalt. Mængden af podestof, der indføres i kaninerne, menes at skulle være ca. 90% af det, der forekommer før emulgeringstrinnet.

5 De ovennævnte stampodestofopløsninger tjener til belysning af podestofferne ifølge opfindelsen. Som vist her kan de anvendes til at producere antistofmolekyler, der immunreagerer med EBNA.

I. Immunfluorescensmetoder 10 Et andet eksempel på en fremgangsmåde til af prøvning af, om der findes EBNA i en kropsprøve, er anvendelsen af antistofmolékyler ifølge opfindelsen og en fluorchromatisk indikator til at påvise produktet af en receptor/EBNA-immunreaktion.

15 Ved den foreliggende undersøgelse spredes 2 x 4 10 WI-L2-celler, dyrket som beskrevet ovenfor, på et plant objektglas ved hjælp af en cytocentrifuge ("Cyto-spin", Shandon Southern, Astmoor, Runcorn, Cheshire,

England). Efter lufttørring i 5 minutter ved 20°C fik-20 seres cellerne i acetone i 2 minutter og lufttørres derpå i 2 minutter ved.20°C. Objektglassene opbevares ved -20°C, indtil de skal anvendes.

De fikserede WI-L2-celler afprøves for EBNA ved hjælp af kanin-anti-polypeptid-antistoffer (antistoffer 25 ifølge opfindelsen) produceret mod polypeptiderne P27, P60, P62 og P89. 50yUliter af hvert kaninantiserum fortyndet 1:10 i VBS-puffer (120 mmolær "Barbitol", pH 7,3, 144 mmolær NaCl, 2,5 mmolær MgC^ og 0,75 mmolær CaC^) inkuberes (bringes i kontakt med og holdes i kontakt med 30 de fikserede celler) ved 20°C på et objektglas i et forud bestemt tidsrum (f.eks. 30 minutter), der er tilstrækkeligt langt tilj at antistofferne og EBNA kan immunrea-gere. Et negativt kontrolobjektglas behandles på samme måde med normalt kaninserum.

35 Under ovennævnte inkubation immunreagerer en del af anti-polypeptid-antistofferne med det EBNA, der

DK 172035 BT

59 0 forekommer i de fikserede WI-L2-celler. Ubundne antistoffer fjernes ved vask med VBS, hvilket efterlader EBNA-receptor-immunreaktionsproduktet på objektglasset.

Anti-polypeptid-antistoffer bundet til EBNA 5 påvises ved først at inkubere 50^uliter marsvine-komple-ment (Tago, Burlingame, CA) fortyndet 1:10 i VBS på hvert objektglas i et tidsrum (30 minutter), der er langt nok til, at komplmentet kan bindes til antistofferne. Objektglassene vaskes derpå med VBS for at fjerne even-10 tuelt komplement, der ikke er bundet til kanin-anti-po-lypeptid-IgG'et.

Med fluorescein mærket gede-anti-marsvine-C3 (mærkede anti-komplement-antistoffer, Cappel Laboratories, Cochranville, PA) anvendes til at påvise anti-15 gen/antistof-komplementkomplekserne. 50^uliter af indikatorantiserummet fortyndet 1:20 i VBS inkuberes som ovenfor på hvert objektglas i 30 minutter ved 20°C. U-bundet gede-anti-marsvine-C^ vaskes af objektglasset med VBS. Immunreaktionsprodukter gøres synlige ved 20 fluorescensmikroskopi.

J. Cirkulær dichroismespektroskopi

Tilpasningsegenskaberne hos polypeptiderne undersøges for at klarlægge enhver sekundær struktur, der kunne være nødvendig for polypeptidimmunreaktion med hu-25 mane anti-EBNA-antistoffer. Polypeptiderne opløses i en koncentration på 1 mg/ml i phosphatpufret saltvandsopløsning (PBS). Der tages spektre ved hjælp af 1 ml--prøver i et "Cary 61” spektropolarimeter (Cary Instruments, Applied Physics Corp., Monrovia, CA) sammenstil-30 let og automatiseret med en "Digital Equipment Corporation 11/02" computer (Digital Equipment Corporation,

Maynard, MA). Gennemsnittet af 10 på hinanden følgende scanninger for hvert polypeptid afsættes som vist I fig. 1.

35

Claims

10 Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly- Ala-Gly-; (iii) -Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly- Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-j 15 (iv) -Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala- Gly- Ala-Gly-Gly-Gly- Ala-Gly- ; (v) -Gly-Gly-Ala-GJLy-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly- A1 a-Gly-Gly- Al a- Gly-Al a-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-? 20 (vi) -Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly- Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-; (vii) -Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala- Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-? og (vi i i) -Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-

25 Ala-Gly-Ala-Gly-, de pharmaceutisk acceptable salte deraf og antigent beslægtede varianter deraf.

2. Syntetisk polypeptidpodestof egnet til at frem-30 kalde * antistoffer, kendetegnet ved, at det immun- reagerer med EBNA, omfatter et syntetisk polypeptid ifølge krav 1, bundet til en bærer, opløst eller dispergeret i effektiv mængde i et pharmaceutisk acceptabelt fortyndingsmiddel, idet podestoffet, når det i effektiv mængde indføres 3 5 i en pattedyrevært, kan fremkalde produktion af antistoffer, som immunreagerer med EBNA. DK 172035 B1

3. Antistof produceret mod et syntetisk immunogen, kendetegnet ved, at det syntetiske immunogen er et syntetisk polypeptid ifølge krav 1.

4. Fremgangsmåde til afprøvning for anti-EBNA-anti-5 stoffer i en kropsprøve, kendetegnet ved følgende trin: (a) tilvejebringelse af en kropsårøve, der skal analyseres, (b) sammenblanding af kropsprøven med et syntetisk 10 polypeptid ifølge krav 1, (c) opretholdelse af sammenblandingen i et forudbestemt tidsrum, der er langt nok til, at anti-EBNA-antistof-ferne i prøven kan immunreagere med polypeptidet, og (d) konstatering af, om immunreaktionen har fundet 15 sted.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at den yderligere omfatter fiksering af polypeptidet til en fast understøtning før sammenblanding.

6. Diagnosticeringssystem i form af et sæt til 20 afprøvning af tilstedeværelse af antistoffer mod EBNA i en kropskomponent, kendetegnet ved, at det i separate emballager omfatter (a) et syntetisk polypeptid ifølge krav 1 og (b) en indikator til signalering af immunreaktionen 25 mellem polypeptidet og antistoffer mod EBNA.

7. Diagnosticeringssystem ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det syntetiske polypeptid er fik-seret til en fast matriks, der udgør en fast understøtning.