DK175901B1 - Syntetiske HTLV-III peptider, sammensætninger, anvendelser samt fremgangsmåde til fremstilling deraf - Google Patents

Description

DK 175901 B1

Den foreliggende opfindelse angår syntetiske peptider og nærmere bestemt syntetiske peptider, som efterligner en del af et eller flere proteiner frem-5 stillet af de HTLV-III eller HTLV-IIl-lignende viruser, som er etiologisk associeret med de som AIDS og ARC kendte sygdomssyndromer.

Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS) blev først konstateret i USA i 1981, og antallet af tilfælde i USA er siden da blevet fordoblet ca. hver 10 måned. Siden 1981 er der blevet registreret ca. 16.000 AIDS tilfælde i USA, 10 af hvilke ca. halvdelen allerede er døde. Det forventede resultat af sygdommen er uden undtagelse døden, da der i øjeblikket ikke kendes nogen behandling, som effektivt kan forsinke eller forebygge sygdommens hærgen. Selv om sygdommen først viste sig hos homoseksuelle eller biseksuelle mænd og misbrugere af intravenøse stoffer, har den nu spredt sig til andre ved fælles brug af 15 kontaminerede nåle eller ved intim seksuel kontakt med eller modtagelse af blodprodukter fra en bærer af viruset.

Det med AIDS associerede etiologiske middel er blevet identificeret som en gruppe beslægtede retroviruser kendt enten som Human T-cell Lymphotro-pic Viruses-type III (HTLV-III), Human Immunodeficiency Virus (HIV), Lym-20 phoadenopathy Viruses (LAV) eller AlDS-beslægtede viruser (ARV). Disse viruser vil for nemhedens skyld her samlet blive omtalt som "HTLV-III viruser".

Da AIDS kan overføres med blodprodukter, har der lige fra sygdommen blev kendt været et stærkt incitament til at udvikle diagnostiske tests til screening af blod fra antistoffer eller antigener, som er specifikke for det inficerende 25 virus. Bestræbelser indenfor dette område har båret frugt, og ved udgangen af 1985 var fem firmaer blevet godkendt til at markedsføre tests til påvisning af antistoffer mod HTLV-III virus. Disse tests hviler alle på anvendelse af virusproteiner opnået fra dyrkede HTLV-III inficerede T-lymfocytter til påvisning af antistofferne. Det fra de dyrkede celler opnåede virus sønderdeles (for eksem-30 pel med detergent), og et fluidum (kaldet "viruslysat") opnås. Dette lysat (inde-

DK 175901 B1 I

holdende forskellige fragmenter af virusprotein) anvendes derefter typisk som H

fastfasekomponenten ved en immunoanalyse. I

De gængse kommercielle immunoanalyser er af det konventionelle H

sandwich ELISA format, hvor fastfasekomponenten (med viruslysatet aflejret · I

5 derpå) bringes i kontakt med blod eller serum, som mistænkes for at indeholde I

HTLV-III antistoffer. Hvis antistofferne forefindes, forventes de at binde til vi- I

ruslysatet, og efter at ubundet materiale er vasket bort, bringes de i kontakt I

med enzym-mærket anti-humant immunoglobulin. De mærkede antistoffer vil I

binde til eventuelle humane antistoffer knyttet til den faste fase, og det er derfor I

10 viruslysatet, som giver testen specificitet for HTLV-III antistoffer. I

Selv om de eksisterende tests synes at have mindsket overførslen af I

HTLV-III virus via blodprodukter signifikant, har disse tests baseret på virusly- H

sat nogle betydelige ulemper. H

For det første er der, da viruslysatet fremstilles af celler inficeret med le- H

15 vende HTLV-III virus, en mulighed for, at de, der fremstiller testsproduktet, kan I

blive inficeret under fabrikationen. Der er i det mindste også den teoretiske mu- I

lighed, at det levende virus kan overleve sønderdelingsproceduren og finde vej I

til den diagnostiske test og således inficere brugeren. I

En anden ulempe hænger sammen med vanskeligheden ved at opnå ly- I

20 satet og den variable natur af det resulterende lysat, der afhænger af variation i I

fremstillingsproceduren eller i karakteristika for de inficerede celler, som an- I

vendes til opnåelse af viruslysatet. I

En tredie og langt mere alvorlig praktisk ulempe er det betydelige antal

falske positive og i mindre udstrækning falske negative resultater, som iagtta- I

25 ges under de gængse tests. Det er nu velkendt, at de gængse viruslysat ELISA I

tests giver et betydeligt antal falske positive resultater. Som det i oversættelse I

lyder i Hastings Center Report, Special Supplement/August 1985, med titlen I

"AIDS; The Emerging Ethical Dilemmas"; I

3 DK 175901 B1 "Imidlertid er ELISA testen ikke så specifik, som den er følsom. Det vil sige, at i en population af raske bloddonorer vil så mange som et ud af hver hundrede testresultater være positivt, og af disse vil så mange som 90 ud af 100 være falsk positive. I national målestok vil 40.000 ud af de 8 millioner årlige 5 bloddoneringer være falsk positive.” (side 9)

De falske positive menes til dels at skyldes forekomsten af ikke-virusproteiner i viruslysatpræparaterne, der anvendes i fastfasekomponenten I

ved de gængse analyser.

Rapporten indikerer yderligere, at en Western aftryksbekræftelsestest 10 (som er mere bekostelige og teknisk vanskeligere end ELISA testen) må udføres for at udelukke de falske positive resultater. Da Western aftryksanalyser i sig selv er behæftet med fejl og genstand for subjektiv fortolkning, er en simpel, i i hurtig og objektiv bekræftelsestest for HTLV-III antistof stadig ønskelig.

Falske negative er også et problem, selv om sådanne falske negative 15 delvis kan skyldes analysens natur, sygdommens immunosuppressive natur eller latensperioden mellem eksponering for HTLV-III virus og udviklingen af antistof.

En yderligere ulempe ved de i øjeblikket tilgængelige tests er, at de kun påviser antistof mod HTLV-III viruset og ikke selve viruset eller virusantigenet.

20 Et positivt resultat indikerer derfor kun, at det testede individ på et tidspunkt blev eksponeret for HTLV-III viruset og udviklede antistoffer mod dette. Det siger intet om, hvorvidt individet i øjeblikket er inficeret eller infektiøst eller har AIDS. Det bør bemærkes, at ifølge den reviderede Center for Disease Control definition af AIDS (juni 1985) udelukkes patienter som AIDS tilfælde, hvis de er 25 negative for serumantistof mod HTLV-III og ikke har et lavt antal T-hjælperlymfocytter eller et lavt forhold mellem T-hjælper og T-suppressorlymfocytter.

Til trods for deres ufyldestgørende diagnostiske værdi anvendes de gængse tests ikke blot til påvisning af viruskontamineret blod men også til på-30 visning af inficerede personer (om hvem det formodes, at de muligvis kan ud-

DK 175901 B1 I

i

vikle egentlig AIDS og overføre sygdommen til andre). Da et betydeligt antal I

mennesker, som er positive ved de kommercielt tilgængelige antistoftests, I

hverken udviser kliniske symptomer eller (tilsyneladende) er i stand til at infice- I

re andre, er der en betydelig risiko for ved de gængse tests falsk at identificere I

5 en person som Al DS-bærer med de deraf følgende sociale og psykologiske I

resultater. I

Mange af ulemperne ved den gængse lysatbaserede test kunne undgås I

ved i stedet for viruslysatet at anvende et materiale, som ikke hidrører fra viru- I

sinficerede celler. Et sådant materiale kunne for eksempel være et virusspeci- I

10 fikt syntetisk peptid eller et virusspecifikt peptid hidrørende fra en rekombinant I

organisme (typisk E. coli). I

Arbejde med sidstnævnte løsningsmodel er blevet rapporteret af Robert I

C. Gallo og medarbejdere i en række artikler i den senere tid indbefattende I

Biotechnology, bind 3, side 905-909 (oktober 1985), Science, bind 228, side . I

15 93-96 (5. april 1985) og Nature, bind 315, side 151-154 (9. maj 1985). Disse I

forskere har identificeret et 82 aminosyrepeptid, for hvilket der kodes af et gen- I

segment i ENV området af det via rekombinant E. coli teknik producerede I

HTLV-III virus. Dette peptid genkendes af antistoffer mod HTLV-III virus. For I

nylig har en Genentech gruppe rapporteret et arbejde med et 102 aminosy- I

20 repeptid, som i sig indeholder Gallo gruppens 82 aminosyrepeptid. Biotechno- I

logy, bind 4, side 128-133 (februar 1986). I

Selv om teknikken med syntetiske peptider frembyder flere åbenbare for-

dele (for eksempel specificitet, renhed, fremstillingslethed), er der kun udført få I

arbejder indenfor dette område. I realiteten er den eneste publikation, som de I

25 foreliggende opfindere er bekendt med vedrørende sådant arbejde, et indlæg I

af Dr. Dino Dina og medarbejdere på Fifth Annual Congress for Recombinant I

DNA Research, 3-6. februar 1985. Selv om det i sammendraget anføres, at I

forskellige syntetiske peptider "anvendes (1)” til vurdering af immunreaktioner i I

AIDS patienter og (2) til fremkaldelse af antisera i dyr”, blev de anvendte speci- I

30 fikke peptider ikke omtalt. Endvidere blev der i selve indlægget ikke identificeret I

5 DK 175901 B1 nogen specifikke peptider, og det blev ikke angivet, at noget enkelt peptid eller en kombination af peptider kunne genkende alle eller de fleste af de kendte positive sera. Siden dette indlæg i februar 1985 og op til nærværende ansøgnings prioritetsdato er opfinderne ikke bekendt med nogen yderligere publikati-5 oner fra denne forskergruppe eller nogen anden om syntetiske HTLV-III peptider. Senere, i august 1986, blev en publikation af Wang et al., Proc. Natl. Acad.

Sci., U.S.A. (1986) 83:6159-6163 offentliggjort.

Syntetiske peptider, som vellykket ville efterligne en del af HTLV-III proteinet og derfor ville kunne anvendes både til påvisning af antistof mod HTLV-III 10 og til fremstilling af antistof, som ville genkende HTLV-III virus eller virusanti-gen, ville være en betydelig fordel indenfor området. Den foreliggende opfindelse tilvejebringer sådanne peptider, præparater indeholdende sådanne peptider og fremgangsmåder til anvendelse af disse peptider og præparater til terapi og diagnose. Opfindelsen tilvejebringer også anti-peptidantistoffer, præpa-15 rater indeholdende disse antistoffer og fremgangsmåder til anvendelse af anti stofferne og præparaterne.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer syntetiske peptider, som defineret i krav 1 og 2, udvalgt blandt: 20 IWGCSGKLJCTTAVP (II) IWGCSGKLICTTAVPWNAS (III) AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLI (IV) AVERYLKDQQLLG IWGCSGKLICTTAVPWNAS (V) LKDQQLLGIWGCSGKLI (VI) 25 QQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS (VIII) CSGKLICTTAVPWNAS (X) AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLIC (XII) GCSGKLICTTAVPWN (XIII) LKDQQLLGIWGCSGK (XIV) 30

DK 175901 B1 I

Disse peptider genkendes af størsteparten af HTLV-III antistofpositive I

sera fra patienter med AIDS/ARC samt antistofpositive sera af ukendt diagno- I

se. Desuden giver de omhandlede peptider næsten ikke nogen falske positive. I

5 Disse resultater er yderst overraskende i betragtning af, at andre peptider I

svarende til dele af HTLV-III svøbproteinerne ikke er effektive til selektivt at I

genkende antistoffer mod HTLV-III virus. I

Den foreliggende opfindelse omfatter yderligere opdagelsen af, at gen- I

kendelsen af antistoffer mod HTLV-III virus forøges stærkt, hvis bestemte pep- I

10 tider, som defineret i krav 3, anvendes i kombination. I

Kombinationen af peptider (IV) eller (XII) med peptider (III), (XIII) eller (X) I

foretrækkes specielt. Kombinationen af (III) og (IV) eller (XIII) og (IV) er de I

foretrukne kombinationer. I

I betragtning af disse resultater er det klart, at der i syv aminosyrerest- I

15 peptiderne, som indbefatter sekvensen med formel CSGKLIC (I), er indeholdt I

en betydelig antigenisk determinant af HTLV-III viruset, som reagerer med I

HTLV-III antistoffer. Selv om hvert af de omhandlede peptider reagerer med de I

fleste HTLV-III positive sera, har individuelle patientsera desuden vist sig at I

reagere specifikt med et af de omhandlede peptider men ikke med et andet. I

20 Denne iagttagelse indikerer, at der forefindes yderligere antigeniske determi- I

nanter i længere peptider indeholdende sekvensen med formel (I) såsom pep- I

tiderne (II) til (X).Peptiderne ifølge opfindelsen indeholder mindst en cysteinrest I

og i visse tilfælde to sådanne rester. De omhandlede peptider kan følgelig eksi- I

stere i forskellige oxidative former. Ud over den monomere form, hvori cystein- I

25 restens eller -resternes sulfhydrylgruppe er reduceret, kan der også eksistere I

dimere eller polymere former, hvori sulfhydrylgrupper på to eller flere peptid- I

molekyler bliver oxyderet og danner disulfidbindinger. Mens de omhandlede I

peptider, som kun har en cysteinrest, kun kan danne lineære dimerer, kan så- I

danne, som har to cysteinrester, danne cykliske monomerer eller lineære eller I

30 cykliske dimerer og lineære polymerer af forskellig længde. Disse forskellige I

7 DK 175901 B1 oxidative former anses for en del af opfindelsen og er indbefattet i udtrykket "omhandlede peptider".

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer desuden en fremgangsmåde til påvisning eller bestemmelse af HTLV-III antistoffer og et diagnostisk sæt eller 5 udstyr til påvisning eller bestemmelse af HTLV-III antistoffer ved hjælp af et eller flere syntetiske peptider ifølge opfindelsen. Den omhandlede fremgangsmåde til påvisning eller bestemmelse af antistoffer mod HTLV-III i et fluidum, som mistænkes for at indeholde antistofferne, for eksempel blod, serum, plasma, salvia eller urin, er defineret i krav 8.

10 Det kan være værdifuldt at adskille den faste overflade fra fluidet og bort vaske ubundet materiale fra materialet på den faste overflade efter trin b i afhængighed af den anvendte påvisningsmetode. Selv om den specifikke påvisningsteknik ikke er kritisk, har enzymmærket anti-humanimmunoglobulin vist sig at fungere godt. Det omhandlede diagnostiske sæt eller udstyr til udøvelse 15 af fremgangsmåden omfatter en fast overflade med mindst et omhandlet peptid bundet dertil og mærket (fortrinsvis enzymmærket) anti-humant immunoglobulin. Andre konventionelle materialer til mærkning af antistof kan også anvendes såsom for eksempel biotin eller en radioisotop.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer desuden en fremgangsmåde til 20 fremstilling af anti-peptidantistoffer, som kan anvendes til påvisning af HTVL-III virus eller virusantigen, der omfatter, at man immuniserer et værtsdyr med et omhandlet peptid i polymeriseret form eller knyttet til en passende immunogen bærer. Fremgangsmåden til fremstilling af polyklonale antistoffer mod HTVL-III omfatter immunisering af en vært med mindst et omhandlet peptid i polymerise-25 ret form eller knyttet til en passende immunogen bærer og overladning af værten. Fremgangsmåden til fremstilling af monoklonale antistoffer mod HTLV-III omfatter immunisering af et værtsdyr med mindst et omhandlet peptid eller et immunogenfragment deraf i polymeriseret form eller knyttet til en passende immunogen bærer, isolering af splenocytter fra den immuniserede vært, fusio-30 nering af splenocytterne med en passende myelomacellelinie, udvælgelse af | i

____________________ _____________J

DK 175901 B1 I

de fusionerede celler ved reaktivitet med det immuniserende peptid eller frag- I

ment, med HTLV-llI eller med HTLV-I Il-inficerede celler og enten dyrkning af den udvalgte hybridom in vitro eller injektion af den i en passende vært. Det

resulterende ønskede monoklonale antistof kan udvindes fra supernatanten I

5 over den dyrkede hybridom eller fra den innokulerede værts serum eller asci- I

tes. I

Selve anti-peptidantistofferne, fremgangsmåden til påvisning af HTLV-llI I

vims ved hjælp af antistofferne og diagnostiske sæt eller udstyr indeholdende I

antistoffet (som kan anvendes til påvisning af HTLV-llI virus) er også omfattet I

10 af opfindelsen. I

En sandwichmetode ifølge opfindelsen er defineret i krav 12. I

Det kan være værdifuldt at adskille den faste overflade fra fluidet, som I

skal testes og bortvaske ubundet materiale fra den faste overflade efter trin b i I

afhængighed af den anvendte påvisningsmetode. I

15 En konkurrencemetode ifølge opfindelsen er defineret i krav 13. I

Et diagnostisk sæt til påvisning eller bestemmelse af HTLV-llI virus ved I

sandwich- eller konkurrencemetode er defineret i krav 14. I

Et omhandlet peptid kan også anvendes for at forbedre specificiteten af I

den omhandlede peptidtest eller en, hvortil der anvendes rekombinant HTLV-llI I

20 protein og således formindske afhængigheden af den mere vanskelige Western I

aftryksbekræftelsestest. Nøjagtigheden af et positivt resultat ved den omhand- I

lede peptidtest eller en rekombinant proteintest kan bekræftes ved at gentage I

testen i nærvær af en virksom blokerende mængde af et omhandlet peptid. I

Hvis binding af de formodede HTLV-llI antistoffer til pladen blokeres af det I

25 tilsatte peptid, bekræftes det oprindelige positive resultat; hvis bindingen ikke I

blokeres, var det oprindelige resultat en falsk (ikke-specifik) positiv. I

Den foreliggende opfindelse omfatter derfor også en fremgangsmåde til I

bestemmelse af nøjagtigheden af et positivt resultat af en test for HTLV-llI anti- I

stoffer på en fluidumprøve, som mistænkes for at indeholde disse antistoffer, I

30 hvilken test er en sandwichanalyse, hvor et rekombinant HTLV-llI protein eller I

DK 175901 B1 9 i i ! et syntetisk HTLV-III peptid knyttes til den faste overflade, hvilken fremgangsmåde er defineret i krav 15. Udtrykket "virksom blokerende mængde" af det omhandlede peptid betyder en mængde, som i det væsentlige reagerer fuld- | j stændigt med eventuelle HTLV-III antistoffer rettet mod den eller de antigeniske 5 determinanter, som er indeholdt i peptidet, der forefindes i den testede prøve og således i det væsentlige blokerer disse antistoffers reaktion med peptidet eller proteinet på analysens faste overflade. Sandwichanalysen er fortrinsvis en ELISA analyse.

De omhandlede peptider kan fremstilles ved hjælp af en hvilken som helst 10 konventionel teknik (indbefattende rDNA teknologi og teknikker til syntese i flydende fase), selv om fastfasesynteser af Merrifield-type er en bekvem måde at fremstille og isolere peptidet på. En yderligere beskrivelse af denne teknik og andre teknikker kendt indenfor området kan findes i litteraturen, for eksempel M. Bodanszky, et al.. Peptide Synthesis. John Wiley & Sons, anden udgave, 15 1976 samt i andre referenceværker, som er kendte for fagmanden. Syntese- i teknikker (i modsætning til rDNA teknikker) foretrækkes af sådanne årsager som renhed, antigenisk specificitet, frihed for uønskede biprodukter, fremstil-lingslethed og lignende. Passende beskyttende grupper til anvendelse ved sådanne synteser og forkortelserne for disse vil kunne findes i ovenstående tekst 20 såvel som i J.F.W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry. Plenum Press, New York, 1973. Begge disse bøger inkorporeres heri ved henvisning.

Typiske bærere, hvortil de omhandlede peptider kan knyttes for udvikling af anti-peptidantistoffer indbefatter for eksempel bovinserumalbumin, teta-nustoxoid, "keyhole limpit" hæmacyanin, procin-, bovin- eller equinimmunoglo-25 bulin og kolera eller E. coli varmelabil toxin B-underenhed.

De omhandlede peptiders struktur er angivet ved hjælp af de konventionelle enkeltbogstavskoder for aminosyrer og skal læses fra venstre mod højre som retningsmæssigt svarende til amino-til-carboxyretningen af sekvensen. For at gøre det lettere for læseren kan det oplyses, at enkeitbogstavskodeme for 30 de i de omhandlede peptider indeholdte aminosyrer er: _^_______ _ _

I DK 175901 B1 I

I 10 I

I l=L-isolucin; W=L-tryptophan; G=glycin; C=L-cystein; I

I S=L-serin; K=L-lysin; L=L-leucin; T=L-threonin; I

I A=L-alanin; V=L-valin; P=L-prolin; D=L-asparaginsyre; I

I N=L-asparagin; E=L-glutaminsyre; R=L-arginin; I

I 5 Y=L-tyrosin; Q=L-glutamin; M=L-methionin; og F= I

I L-phenylalanin. I

I Opfindelsen illustreres nærmere i de følgende eksempler. I

I 10 Eksempel 1 I

I A. Syntese af BOC-prolinharpiks I

I Chlormethyleret styren-divinylbenzenpolymer indeholdende 1,3 mækv. I

I chlorid/gram harpiks forestredes med Boc-prolin i vandfrit Ν,Ν- I

I 15 dimethylformamid (DMF) under anvendelse af kaliumiodid (Kl) som katalystisk I

I middel. Omsætningen udførtes ved 55X i 24 timer (1). Boc- I

I prolinsubstitutionen var 0,92 mmol/gram bestemt ved pikrinsyreanalyse på en I

I portion deblokeret harpiks. I

I 20 B. Syntese og karakterisering af peptid (10 I

I Syntese af peptidet med formel (II) udførtes ved hjælp af klassisk Merri- I

I field-teknik (2). Peptidsekvensen "IWGCSGKLICTTAVP" syntetiseredes på en I

I automatiseret peptidsyntetisator af typen Vega 250C under anvendelse af et I

I dobbelt koblingsprogram. 1,8326 g Boc-prolinharpiks dobbeltkobledes sekven- I

25 tielt med følgende Boc-L-aminosyrer (3,8) i tolv mækv. overskud: I

11 DK 175901 B1

Aminosyre Opløsningsmiddel

Boc-Val CH2CI2

Boc-Ala CH2CI2

Boc-(0-Bzl)-Thr CH2CI2 5 Boc-(0-Bzl)-Thr CH2CI2

Boc-(MeOBzl)-Cys CH2CI2

Boc-lle CH2CI2

Boc-Leu 10% DMF/CH2CI2

Boc-(CI-Z)-Lys CH2CI2 10 Boc-Gly CH2CI2

Boc-(0-Bzl)-Ser CH2CI2

Boc-(MeOBzl)-Cys CH2CI2

Boc-Gly CH2CI2

Boc-Trp 10% DMF/CH2CI2 15 Boc-lle CH2CI2

Peptider spaltedes fra harpiksen med 10% anisol i flussyre og ekstrahe-redes med 20% vandig eddikesyre. Denne opløsning filtreredes for at fjerne fast harpiks og kørtes gennem en afsaltningssøjle af typen Fractogel TSK HW-20 40F ved hjælp af et elueringsmiddel af 20% vandig eddikesyre. Fraktioner op samledes i 10 ml portioner, og søjleafgangsstrømmen overvågedes ved 280 nm. Fraktioner, som udviste positiv absorbans ved 280 nm, fortyndedes med 0,1% trifluoreddikesyre (TFA) i vand og analyseredes ved højpræstationsvæ-skekromatografi (HPLC) (4). Hovedabsorbanstoppen ved 214 nm bestemtes til 25 at have en retentionstid på 12,42 minutter. De Fractogenfraktioner, som indeholdte mere 70% af denne top, sammenblandedes og mærkedes Fr:1. De Fractogelfraktioner, der indeholdt mindre end 70% men mere end 50% af denne top, sammenblandedes og mærkedes Fr:2.

Analytisk HPLC (4) på Fr1 viste, at 12,42 minutters toppen udgjorde 87% 30 af det samlede areal. Fr:1 karakteriseredes yderligere ved aminosyreanalyse - _.

DK 175901 B1 I

(5), sekvensbestemmelse (6) og bestemmelse af % peptidindhold (7). Peptid- I

sekvensanalyse (6) udførtes også på peptidharpiksen for at bekræfte den for- I

ventede sekvens af peptidet. I

5 (1) Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. udgave (1984), I

Pierce Chemical Co. I

(2) Merrifield, R.B. (1963), J. Amer. Chem. Soc. 85, side 2149-2154 I

10 (3) Alle Boc-aminosyrer leveret fra Bachem Inc., Torrance, Calif. I

(4) Analytiske HPLC betingelser: I

puffer A: 0,1 % TFA/destilleret deioniseret vand I

puffer B: 0,1 % TFA/acetonitril af HPLC kvalitet I

15 gradientbetingelser: 10% "B" til 50% "B" over 20 minutter I

bølgelængde: 214 nm I

gennemstrømning: 1,0 ml/min I

søjle: Vydac 214TP54 C-4 proteinsøjle, 250 x 4,5 mm I

20 (5) Aminosyreanalyse udført på en aminosyreanalysator af typen LKB I

4150 ALpha Amino Acid Analyzer. I

(6) Peptidsekvensbestemmelse udførtes på et sekvensbestemmelses- I

apparat af typen Applied Biosystems 470A Protein Sequencer. I

25 I

(7) Peptidindhold bestemt ud fra genvinding ved aminosyreanalyse af I

kendt mængde peptid. I

(8) Boc er en kemisk forkortelse for tert-butyloxcarbonylalpha- I

30 aminobeskyttelsesgruppen. Den funktionelle gruppe fjernes ved hydrolyse i I

13 DK 175901 B1 50% trifluoreddikesyre (TFA)/50% dichlormethan (CH2CI2) efter at aminosyren er koblet til den voksende peptidkæde. Denne handling frilægger kædens ami-noterminal, hvorefter den næste aminosyre kan tilkobles effektivt.

Udover den bestyttende Boc-gruppe på hver aminosyre beskyttes side-5 kæderne i nogle aminosyrer yderligere mod angreb af peptidsyntesekemien.

Disse beskyttende grupper, som i oversigten er anført i parentes, er alle stabile under peptidsyntesebetingelseme men kan let fjernes fra aminosyren ved spaltning i flussyre. Anisol (methylphenylether) virker som et nukleofilt uddrivningsmiddel under HF spaltningstrinnet for at forebygge alkylering af peptidet 10 med de frigjorte carboniumioner fra de beskyttende grupper. De beskyttende grupper for de anførte aminosyrer defineres nedenfor: O-benzyl: benzylester, knyttet til hydroxylsidekæden af både serin og threonin for at hindre acylering eller forgrening af peptidkæden.

MeObzl: 4-methoxybenzyl, knyttet til sulfhydrylgruppen i cystein for at 15 forebygge oxidation af denne under peptidsyntese.

Cl-Z: 2-chlorbenzyloxycarbonyl, knyttet til lysins alpha-aminogruppe for at hindre dannelse af sidekædevækst fra dette sted i peptidet.

C. Polymerisation af peptidet med formel (ID: 20 Peptidet indeholdet i Fr:1 forrådet fra del B lyofiliseredes for at fjerne ed dikesyre og solubiliseredes til 200 pg/ml i 0,1 M natriumbicarbonatpuffer, pH 9,0. Portioner af dette peptid fortyndet til 20 pg/ml i natriumbicarbonatpuffer anvendtes til belægning af mikrotiterbrønde til ELISA’er vist i tabel IV. Til tests vist nedenfor i tabel l-lll solubiliseredes peptid i vand til 10 mg/ml og fortynde-25 des i phosphatpuffer, pH 7,3, til 5 pg/ml til belægning af mikrotiterbrønde. Peptidet i Fr:1 eksisterer primært i en enkelt form, som menes at være uoxyderet monomer. Da peptidet med formel (II) indeholder to cysteiner, polymeriseres det imidlertid ved solubilisering i neutral eller basisk vandig puffer. Det i de nedenfor beskrevne ELISA'er anvendte peptid er en blanding af meget små 30 mængder lineær monomer og større mængder cyklisk monomer (dannet ved

14 I

DK 175901 B1 I

intramolekylær disulfidbinding) og endnu større mængder polymerer (dannet I

ved intermolekylær disulfidbinding) af forskellig størrelse. Uden at ville være I

bundet af denne teori mener ansøgeren, at polymerformeme er vigtige for de I

her beskrevne reaktiviteter. Den cykliske monomerform menes, selv om den I

5 bibeholder en del af polymerfomnens antigenicitet, at være mindre effektiv ved I

binding til mikrotiterbrøndene og mindre egnet som fastfasekomponenten ved I

ELISA'en. Den formodede cykliske monomer viser sig som en skarp top ved I

ca. 12,7 minutters retentionstid ved HPLC analyse, mens polymeren karakten- I

seres som en bred top ved ca. 15,9 minutters retentionstid. Oxidationsbetingel- I

10 ser kan, som det er fagmanden bekendt, ændres med hensyn til temperatur, I

pH, peptidkoncentration og lignende for at ændre forholdet mellem monomer, I

cyklisk monomer og polymer, som er tilbage i præparatet eller størrelsen af de

dannede polymerer. Små mængder af såkaldte deleteringspeptider (som I

mangler en eller flere aminosyrer) og deres oxidationsformer kan også findes i I

15 de til ELISA'en anvendte peptid præparater, men disse mindre urenheder påvir- I

ker ikke peptidets anvendelse.

Eksempel II I

20 Syntese oa karakterisering af peptider (ΙΙΠ til fXH I

Syntese af disse peptider udførtes ved i det væsentlige at anvende sam- I

me klassiske Merrifield-teknik som beskrevet tidligere for peptid (II). Til peptid I

(III) anvendtes Boc-serinharpiks med en substitution på 0,92 mmol/g. Til peptid I

(IV) anvendtes Boc-isoleucinharpikssubstitution på 0,8 mmol/g. Syntese af I

25 Boc-serin- og Boc-isoleucinharpikserne udførtes ved Gisin metoden som be- I

skrevet af Stewart & Young (1). I

A. Til peptid (III) syntetiseredes peptidsekvensen "IWGCSGKLICTTAV- I

PWNAS" ved hjælp af følgende Boc-L-aminosyrer i tolv mækv. overskud: I

30 I

15 DK 175901 B1

Aminosyre Opløsningsmiddel

Boc-Ala CH2CI2

Boc-Asn/Hobt DMF

Boc-Trp 10% DMF/Ch2CI2 5 Boc-Pro CH2CI2

Boc-Val CH2CI2

Boc-Ala CH2CI2

Boc-(0-Bzl)-Thr CH2CI2

Boc-(0-Bzl)-Thr CH2CI2 10 Boc-(MeOBzl)-Cys CH2CI2

Boc-lle CH2CI2

Boc-Leu 10% DMF/CH2CI2

Boc-(CI-Z)-Lys CH2CI2

Boc-Gly CH2CI2 15 Boc-(0-Bzl)-Ser CH2CI2

Boc-(MeOBzl)-Cys CH2CI2

Boc-Gly CH2CI2

Boc-Trp 10% DMF/CH2CI2

Boc-lle CH2CI2 20 B. Til peptid (IV) syntetiseredes peptidsekvensen "AVE-RYLKDQQLLGIWGCSGKU" ved anvendelse af følgende Boc-aminosyrer i 12 mækv. overskud: 25 Aminosyre Opløsningsmiddel

Boc-Leu 10% DMF/CH2CI2

Boc-(CI-Z)Lys CH2CI2

Boc-Gly CH2CI2

Boc-(0-Bzl)-Ser CH2CI2 30 Boc-(MeOBzl)-Cys CH2CI2 ________ _____i

I DK 175901 B1 I

I 16 I

I Boc-Gly CH2CI2 I

I Boc-Trp 10% DMF/CH2CI2 I

I Boc-lle CH2CI2 I

I Boc-Gly CH2CI2 I

I 5 Boc-Leu 10% DMF/CH2CI2 I

I Boc-Leu 10% DMF/CH2CI2 ' I

I Boc-Gln/Hobt DMF I

I Boc-Gln/Hobt DMF ! I

I Boc-(Bzl)-Asp CH2CI2 I

I 10 Boc-(CI-Z)Lys CH2CI2 I

I Boc-Leu 10% DMF/CH2CI2 I

I Boc-(Br-Z)-Tyr CH2CI2 I

I Boc-(Tosyl)-Arg 10% DMF/CH2CI2 i I

I Boc-(Bzl)-Glu CH2CI2 j I

I 15 Boc-Val CH2CI2 * I

I Boc-Ala CH2CI2 I 1

Som ved peptid (II) er ud over Boc beskyttelsesgruppen på hver aminosy- I

I re sidekæderne på visse aminosyrer beskyttet yderligere mod angreb af pep- I

I 20 tidsyntesekemien. Ud over de beskyttende grupper, som er beskrevet for ami- I

I nosyrerne ved peptid (II) syntesen, anvendtes følgende beskyttende grupper I

I for aminosyrer, som er specielle for peptid (III) og (IV): I

I Hobt: 1-hydroxybenzotriazol, anvendt i ækvimolære mængder til glutamin I

I og asparagin under kobling for at hindre dehydratisering til nitrilformeme. I

I 25 Tosyl: p-toluensulfonyl, anvendt til at asylere guanidingruppen i sidekæ- I

I den på arginin. I

I Bzl: beta-benzylester, blokerer carboxylgrupperne i sidekæden på aspa- I

I raginsyre og glutaminsyre. ι I

I BrZ: 2-brombenzyloxycarbonyl, blokerer hydroxylgrupperne i sidekæden I

30 på tyrosin. I

17 DK 175901 B1

Peptider spaltedes fra harpiksen, filtreredes, ekstraheredes med eddikesyre og kørtes igennem en Fractogelafsaltningssøjle som i eksempel I. For peptid (IV) analyseredes Fractogelfraktioner ved analytisk HPLC, og fraktioner indeholdende mindst 30% af den samlede absorption ved 214 nm som hoved-5 toppen, der migrerede ved ca. 14 minutters retentionstid, sammenblandedes.

De sammenblandede fraktioner kromatograferedes på carboxymethylcellulose bragt i ligevægt med 0,01 M ammoniumacetat, pH 4,4. Søjlen elueredes med en tringradient af ammoniumacetat, og fraktionen, der eluerede 0,2M ammoniumacetat, opsamledes, lyofiliseredes og analyseredes ved analytisk HPLG.

10 Hovedtoppen, som migrerede ved 14 minutters retentionstid, udgjorde mellem 30 og 40% af den samlede absorption ved 214 nm, og materialet havde et acceptabelt aminosyreindhold. Dette materiale genopløstes og anvendtes til ELISA som beskrevet for peptid (II).

For peptid (III) analyseredes Fractogelfraktioner ligeledes ved analytiske 15 HPLC. Fraktioner indeholdende mindst 70% af den samlede absorption ved 214 nm som hovedtoppen, der migrerede ved ca. 12,99 minutters retentionstid, sammenblandedes, lyofiliseredes og analyseredes ved HPLC og for aminosyreindhold. Dette materiale genopløstes og anvendtes til ELISA som beskrevet for peptid (II).

20 Ved anvendelse i kombination som fastfasekomponenten ved en ELISA 1 anvendtes et mikrogram af hvert af peptiderne (III) og 0,5 mikrogram peptid (IV) pr. mikrotiterbrønd. Peptidet enten tørredes på brønden ved 37eC eller "våd-pakkedes" på pladen ved inkubation natten over ved 4°C.

25 C. Til peptid (V) anvendtes Boc-serinharpiks som beskrevet for syntese af peptid (III). Syntese af (V) forløb som beskrevet for syntese af (III) ved tilsætning af C-terminalisoleucinet i peptid (III). Fra dette punkt fulgtes proceduren for tilføjelse af aminosyrerne i sekvensen AVERYLKDQQLLG i peptid (IV) til fuldendelse af (V) sekvensen. 2 ----- --------------_Λ 2 !

18 I

DK 175901 B1 I

Peptid (V) spaltedes fra harpiksen, filtreredes, ekstraheredes med eddi- I

kesyre og kørtes gennem en Fractogelafsaltningssøjle som beskrevet i eksem- I

pel I. Fractogelfraktioner indeholdende hovedabsorptionstoppen ved 280 nm I

sammenblandedes og mærkedes Fr:1. Fn1 analyseredes for aminosyreindhold I

5 og fandtes at være acceptabel. Denne fraktion lyofiliseredes og anvendtes til I

ELISA som beskrevet for peptid (II). I

D. Ved at følge lignende procedurer fremstilledes peptiderne med formlerne

(I) og (VI) til (XVI). I

10 I

E. Polymerisation af peptid (III), (IV) og (V): I

Peptid (I) til (III), (V) og (VII) til (X) indeholder to cysteiner. Disse peptider I

kan følgelig polymerisere og ringslutte ved oxidativ disulfidbinding. Tilføjelsen I

af de fire aminosyrer ved C-terminalenden af (III) tillader tilsyneladende den I

15 cykliske form af peptidet at binde til formstoffet ved ELISA analysen. Som re- I

sultat deraf er den cykliske form af (III) mere effektiv ved fastfase-ELISA end I

cyklisk (II) er. De former af (II), (III) og (V) peptider, som hidtil har været an- I

vendt ved ELISA for at teste for HTLV-III antistofgenkendelse, har typisk været I

en blanding af lineær monomer, cyklisk monomer, dimer og polymer. I

20 Peptid (IV), (VI) og (XI) indeholder kun et cystein. Disse peptider kan I

danne en dimer struktur via disulfidbinding. I

Under betingelser til solubilisering af peptider som forberedelse til ELISA I

(for eksempel 0,1M natriumbicarbonatpuffer, pH 9,0) er de fleste af sulfhydryl- I

grupperne i peptid (II), (III), (IV) og (V) blevet omdannet til disulfidformen. I

25 I

Eksempel III I

Fremstilling af sammenlianinqspeptider I

Ved at følge lignende procedurer som i eksempel II og III syntetiseredes

30 peptider med følgende formler i sammenligningsøjemed: I

19 DK 175901 B1 QLQARILAVERY (C-l), AVERYLKDQQLLG (C-ll), LKDQQLLGIWGCS (C-lll), 5 IWGCSGKLI (C-IV), og LICTTAVPWNASWSN (C-VIII)

Disse peptider har hver især sekvenser svarende til HTLV-III svøbets sekvens, men de svarer ikke til opfindelsens anvisninger. Nærmere bestemt er 10 peptiderne med formel (C-l) og (C-ll) sekvenser opstrøms for aminoenden af sekvensen med formel (I), det vil sige CSGKLIC. Peptider med formlen (C-lll) indeholder kun aminoterminaldelen af sekvensen med formel (I). Peptider med formlen (C-IV) indeholder hele sekvensen i formel (I) bortset fra carboxytermi-nal L-cysteinresten. Peptider med formlen C-VIII er sekvenser nedstrøms for 15 carboxyenden af sekvensen med formel (I), og som det vil blive beskrevet udviser ingen af disse peptider de ønskelige immunoreaktive egenskaber.

Eksempel IV

20 Fremstilling af ELISA analvsesæt eller -udstyr og procedurer for anvendelse.

Procedure nr. 1 for ELISA (tabel IV): 25 (1) Belæg ELISA pladen med peptid- 1pg/50pl/brønd i 0,1 M NaHC03, pH 9.

(2) Lad plader tørre utildækket natten over ved 37°C, vask derefter med PBS.

(3) Bloker plader med 300 pl/brønd 5% NCS-PBS i 2 timer ved 37°C.

30 (4) Udryst blokeringspuffer og tør godt.

| ί ______å

20 I

DK 175901 B1 I

(5) Tilsæt 50 μΙ/brønd testantisera i 30 til 120 minutter ved 37°C. (Hvis I

antisera skal fortyndes, brug T-wash). Vi har anvendt 1:2 til 1:100 fortyndinger. I

(6) Udryst testantisera og vaske plade seks gange med PBS-Tween20. I

(7) Tilsæt 100 μΙ/brønd andet antistof fortyndet 1:4000 med T-wash. 30 I

5 til 120 minutter ved 37°C. I

(8) Udryst andet antistof og vask plade seks gange med PBS- I

Tween20. I

(9) Tilsæt 100 μΙ/brønd OPD substrat (eller 5 μΙ ABTS opløsning) i 20 I

minutter ved RT. I

10 (10) Tilsæt 50 μΙ/brønd 4N H2S04 for at standse OPD reaktion (eller I

100 μΙ/brønd 1% SDS til ABTS reaktion). I

(11) Aflæs plade på MR 600 Microplate ELISA pladeaflæser. (490 nm til I

OPD eller 405 nm til ABTS) I

15 Reagenser: I

(1) 0,1M NaHC03, pH 9. I

(2) PBS + 5% normalt kalveserum. I

(3) T-wash : (780 ml TBS + 20 ml NCS + 1,6 g BSA + 0,4 ml Tween 20) I

TBS 12,11 g T risbase I

20 17,5 g NaCI I

1800 ml H20 I

pH til 7,6 med HCI (ca. 3N) I

slutvolumen til 2000 ml I

(4) Va$kepuffer/PBS-Tween20: 0,5 ml Tween 10/IL PBS. I

25 (5) OPD substrat: 10PD tablet/3 ml H20/1,24 μΙ 30% H202. j I

(6) 4NH2S04. I

(7) ABTS: H202 i 1:1 volumenforhold af opløsninger leveret af Kirke- I

gaard and Perry Laboratories, Inc., Gaithersbury, Md.) I

ABTS = 2,2'-azino-di|3-ethyl-benzthiazolinsulfonat_ I

30 (8) 1% SDS. I

21 DK 175901 B1

Det i trin 1 anvendte materiale til belægning af ELISA pladen er peptid med formel (II), (III), (IV), (V) eller en blanding deraf som ovenfor beskrevet.

Det andet antistof er enten et kommercielt tilgængeligt peroxidmærket polyklo-5 nalt antistof (Cappel Laboratories Catalog No. 3201-0231; peroxidasekonjuge-ret IgG fraktion af gedeanti-humane immunoglobuliner) eller et peroxidase-mærket musemonoklonalt anti-humant IgG antistof eller en blanding af peroxi-dasemærkede musemonoklonale anti-humane IgG, IgA og IgM antistoffer.

10 Procedure nr, 2 for ELISA (tabel l-IIO: (1) Belæg ELISA pladen med peptider - pg peptid (IV), 0,5 pg peptid (III), 200 pl/brønd i 0,1M carbonatpuffer, pH 9,6.

(2) Inkuber plader natten over ved 4°C.

15 (3) Bloker plader med 300 pl/brønd i 1,0% BSA-PBS plus additiver i 2 timer ved 37°C.

(4) Udryst blokeringspuffer.

(5) Tør plader ved 37°C i i,5 time.

(6) Tilsæt 200 pl/brønd 1 % bovingammaglobulin - 5% BSA - 0,5% 20 Tween-PBS, pH 7,2.

(7) Tilsæt 10 pl/brønd testsera, inkuber ved 37°C i 30 minutter.

(8) Udryst testsera, vask plade 5 gange med PBS - 0,5% Tween.

(9) Tilsæt 200 pl/brønd monoklonant anti-human IgG fortyndet 1:3500 med 50% kalvefosterserum -1% hesteserum - 0,5% Tween-PBS.

25 (10) Inkuber 30 minutter ved 37°C.

(11) Udryst testsera, vask plade 5 gange med PBS - 0,05% Tween.

(12) Tilsæt 200 pl/brønd OPD substrat og inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter.

(13) Tilsæt 50 pl/brønd 4 N H2S04 for at standse reaktion.

30 (14) Aflæs plade ved 490 nm i MR 600 Microplate Reader. i _____ _a

22 I

DK 175901 B1 I

Reagenser: I

(1) Phosphatforpufret saline (PBS), pH 7,3 I

5 3,0 g natriumchlorid I

0,2 g kaliumphosphat, monobasisk I

1,16 g natriumphosphat, dibasisk I

0,2 g kaliumchlorid I

0,2 thimerosal I

10 vand til 800 ml og bland I

juster pH om nødvendigt, tilsæt vand til 1 I I

(2) Belægningspuffer, pH 9,6 I

0,01M carbonatpuffer. I

15 I

(3) Blokeringspuffer (1% BSA-PBS plus additiver) I

1% bovinserumalbumin (Signa nr. A7030) I

10 Κμ/ml aprotinin I

10 pg/ml trypsininhibitor I

20 10 nM EACA (E-aminokapronsyre) I

0,5 mM PMSF (phenyl-methyl-sulfonylflourid) I

2.0 mM EDTA I

10% glycerol I

25 (4) Prøvefortyndingsmiddel I

10.0 g bovingammeglobuiin, fraktion II, lyofiliseret I

50.0 g bovinalbumin, fraktion V

0,5 ml polysorbat 20 (Tween 20) I

30 tilsæt vand til 1 I og bland I

23 DK 175901 B1 filtrer gennem 0,2 pm filter.

(5) Konjugatfortyndingsmiddel

490 ml PBS

5 500 ml varmeinaktiveret kvægfosterserum 10 ml varmeinaktiveret hesteserum 0,1 g thimerosal 0,329 g kaliumferricyanid vand til 1 I, bland, filtrer gennem 0,2 pm filter.

10

Eksempel V

De i eksempel IV under procedure 1 beskrevne ELISA sæt, som var fremstillet med peptid (II), vurderedes over for et panel af sera omfattende sera fra normale individer, patienter med lidelser eller sygdomme uden relation til 15 AIDS, kendte AIDS patienter, kendte ARC patienter og patienter, hvis diagnose er ukendt, men som er antistofpositive ved kommercielle tests eller ved Western aftryksanalyse. Resultaterne summeres i tabel I - IV. I sammenlignings-øjemed analyseredes samme seraprøver med kommercielt tilgængelige sæt og ved Western aftryksanalyse. De kommercielle sæt, som valgtes til disse under-20 søgelser, var fra Abbott Laboratories, North Chicago, III. og Electro-Neucleonics, Inc. (ENI), Columbia, Md.

A. Tabel viser resultater med normale sera.

25 Tabel 1

Analyse af normale sera ved ELISA med peptid (II).

30 ___ __å

I DK 175901 B1 I

I 24 I

Antal E8 ΕΝ I Abbott Diagnose/ I

I prøver analyse analyse analyse prøve I.D. I

I 198 5-,194NT 41-.156NT Normal I

I 5 1 + Normal/749 I

I J_ + NT NT Normal/2846 I

200 I

I Middelværdi af normalværdier = 0,016 for E8 analyse I

I 10 Standardafvigelse (S.D.) fra middelværdi = 0,017 I

Grænseværdi ved middelværdi + S.D. = 0,104 I

I Hyppighed af falske positive i 200 prøver ved 0,104 grænseværdi = 0,5% I

I (1/200) I

I NT = ikke testet I

I 15 Som det fremgår af ovenstående tabel reagerer de omhandlede sera, I

I som ikke indeholder antistoffer mod HTLV-III, i almindelighed ikke på peptid (II) I

I ved en standard ELISA. Dette muliggør beregning af en absorptionsgrænse- I

I værdi til skeining mellem antistofnegative og antistofpositive sera. Ved oven- I

I stående analyse af 200 normale sera valgtes en grænseværdi på 0,104. Ved I

I 20 denne grænse forventes hyppigheden af falske positive at være mindre end I

I eller lig med 0,5%. I

I B. For at vise den bedre effektivitet til eliminering af falske positive ved an- I

I vendelse af peptidet med formel (II) fremfor de kommercielt tilgængelige sæt I

I 25 med viruslysat testedes en række sera fra patienter med to lidelser uden relati- I

I on til AIDS, nemlig Naso-Pharyngeal Carcinoma og Rheumatoid Arthritis ved I

I den omhandlede analyse og kommercielle test. Resultaterne summeres i tabel I

I II nedenfor og viser den øgede specificitet med den omhandlede analyse. I

I Mange prøver, som gav falske positive resultater med kommercielle tests, blev I

I 30 korrekt identificeret som negative ved den omhandlede analyse. I

Η H

25 DK 175901 B1

Tabel II

Test af patienter med Naso-Pharvnqeal Carcinoma oo Rheumatoid Arthri-5 tis

Antal Omhandlet ENi Abbott Diagnose/ prøver analyse analyse analyse prøve I.D.

10 6 (+) NT (+) NPC/NON-AIDS

17 - NT (+) NPC/NON-AIDS

8 - NT - NPC/NON-AIDS

1 - NT NT NPC/NON-AIDS;920 1 -(+)- RA/NON-AIDS;305

15 7 - 2-.5NT 3-.4NT RA/NON-AIDS

1 - (+) RA/NON-AIDS;615 (+) = falske positive NT = ikke testet NPC = Naso-Pharyngeal Carcinoma; RA = Rheumatoid Arthritis 20 C. For at vise effektiviteten af den omhandlede analyse til påvisning af HTLV-III antistof i AIDS/ARC patientsera sammenlignet med kommercielle sæt, vurderedes det i eksempel IV under procedure 1 beskrevne ELISA sæt over for at panel af sera hidrørende fra diagnosticerede AIDS og ARC patienter. Re-25 sultaterne summeres i tabel III og viser, at analysen er ækvivalent med kommercielle sæt, hvad dens evne til at identificere seraindeholdende antistof mod HTLV-III angår.

A

30

I DK 175901 B1 I

I 26 I

I Tabel III I

I Analyse af AIDS/ARC sera: I

I 5 Antal Omhandlet ENI Abbott Diagnose/ I

I prøver analyse analyse analyse prøve I.D. I

I 67 + + + (16NT) AIDS I

I 2 (-) (-) (-) AIDS/533,3621 I

I 10 1 (-) + + AIDS/653 I

I 2 + + (-) AIDS/661,662 I

I 21 + + + ARC I

I 2 (-) (-) (-) ARC/512,529 I

I 95 I

I 15 I

I {-) = falske negative I

I ARC = Aidsrelateret kompleks I

I D. Den høje hyppighed af falske positive, som er karakteristisk for de i øje- I

I 20 blikket tilgængelige sæt med viruslysat, skyldes til dels tilstedeværelsen af cel- I

I lulære antigener i lysatet, som reagerer med antistoffer, som forefindes både i I

I AIDS og ikke-AIDS patientsera. Desuden indeholder komplekse antigener så- I

I som antigener hidrørende fra et virus såsom HTLV-III mange epitoper og er I

mere tilbøjelige til at reagere ikke-specifikt med antistoffer, som forefindes i I

I 25 humane sera. Det omhandlede peptid (II) reducerer kompleksiteten af det til I

I reaktion med patientsera anvendte antigen ned til en eller måske kun nogle få I

I epitoper. Risikoen for ikke-specifik interaktion med ikke-HTLV-lll antistoffer for- I

I ventes at være stærkt reduceret. Ikke-specifikke interaktioner kan imidlertid I

I fortsat forekomme, da nogle antistoffer er “klæbrige" og kan binde til den ved I

I 30 analysen anvendte plastbærer eller til andre proteiner såsom bovinserumalbu- I

27 DK 175901 B1 min eller gedesera anvendt til blokering af pladen efter tilsætning af peptidet. I tabel IV nedenfor vises data vedrørende analysen af forskellige patientsera.

Udover den sædvanlige analyse med peptid (II) som beskrevet i eksempel IV under procedure 1 analyseredes hvert serum over for peptid (II) efter blanding 5 af serumprøverne med en effektiv blokerende mængde af peptidet (II). Tabellen indeholder også resultater af analyse af hver af prøverne med i handelen tilgængelige sæt.

Tabel IV

Konkurrenceanalyse til bekræftelse af positiv/negativ ELISA: 10 ELISA værdi

Prøve og bedømmelse med peptid Abbott ENI Western Diag.

I.D. Ikke blokeret blokeret analyse analyse analyse (bedømmelse) 15

615 0,031 0,033(-) - - - RA

3195 0,026 0,045(-) - +* - DP

3196 0,028 0,039(-) - +* - DP

3197 0,065 0,073(-) - +* - DP

20 3376 0,104 0,105(-) - +* - UNK

3362 0,740 0,727(-) - +* - UNK

912 0,055 0,065(-) +* NT - NPC

918 0,100 0,092(-) +* NT - NPC

922 0,127 0,103(-) +* NT NT NPC

25 923 0,114 0,080(-) +* NT NT NPC

3644 0,336 0,380(-) +* +* - UNK

3406 1,400 1,390(-) +* ’+*- DP

3461 1,426 1,137(-) +* +* - DP

________J

28 I

DK 175901 B1 I

3532 1,770 0,080(+) + + + UNK I

3469 0,300 0,030(+) + + + UNK I

3431 0,507 0,087(+) NT + + UNK I

644 0,160 0,024(+) NT + + AIDS I

5 659 0,510 0,042(+) + + + AIDS I

661 0,500 0,031(+) -** + + AIDS I

662 0,160 0,030(+) -** + + AIDS I

* = Falsk positiv DP = Dialyse patient, ikke-Aids

10 ** = Falsk negativ NPC = Naso-Pharyngeal Carcinoma, I

UNK = Ukendt ikke-Aids I

RA = Rheumatoid Arthritis, ikke-Aids

Af disse resultater fremgår det klart, at ikke-AIDS seraprøver, som ukor- I

15 rekt, identificeres som positive med et af de kommercielt tilgængelige sæt eller I

begge korrekt identificeres som negative med peptidkonkurrenceanalysen. I

Endvidere bliver selv prøver, der korrekt identificeres som positive ved analy- I

sen, korrekt identificeret som negative ved peptidkonkurrenceanalysen. Det er I

endvidere bemærkelsesværdigt, at blokerings- eller konkurrenceanalysen også I

20 tjener som bekræftende analyse ved tests af semmprøver, som ikke indeholder I

antistoffer mod HTLV-III. De sidste syv testede prøver, der vises i tabel IV, er I

positive for antistof både ved den omhandlede test og kommercielt tilgængelige I

analyser (med undtagelse af to falske negative ved anvendelse af Abbott sæt-

tet) og ved Western aftryksanalyse. Reaktiviteten af disse sera med peptid (II) I

25 blokeres effektivt ved blanding af seraene med peptid (II), hvilket indikerer, at I

reaktiviteten af antistof til peptidet er peptidspecifik, og at disse sidste syv prø- I

ver er sande positive. I

Eksempel VI I

30 ELISA sæt som beskrevet i eksempel IV, procedure 1, fremstilledes med j I

peptidformel (I) til (XV) samt formel (C-1) til (C-VIII). ELISA sættene vurderedes I

hver især over for at serapanel på ti prøver omfattende klinisk positive prøver, I

det vil sige prøver, som var symptomatiske for HTLV-III infektionen ved be- I

. - ^ ' —--- DK 175901 B1 29 stemmelse ved kommercielle analyser og Wester aftryksanalyse. Resultaterne af disse tests vises i tabel V nedenfor.

En peptidanalyse anses for positiv, hvis absorptionsniveauet ved ELISA testen er mere end dobbelt så stort som baggrundsniveauet bestemt ved ud-5 regning af gennemsnit af absorptionen for to normale sera. Den rapporterede middelværdi repræsenterer middelværdien af den optiske densitet ved ELI-SA’en beregnet efter, at baggrundsniveauet var subtraheret. Det rapporterede indeks er en vægtet aktivitet af et givet peptid i forhold til aktiviteten af peptidet med formel (II). Indekset vægtes til gunst for en given peptidanalyses evne til 10 korrekt at rapportere en positiv værdi skelnet fra niveauet af den normale baggrundsreaktion. Formlen til beregning af indekset er som følger: (% positive)3 x middelværdi _ = indeks 15 (% positive)ll)3 x middelværdill hvori % positive er % positive for den pågældende peptidanalyse, middelværdi er middelværdien for den pågældende peptidanalyse, 20 % positivell er % positive for peptidanalyse med formel (II), og % middelværdill er middelværdi for peptidanalysen med formel (II).

25 ____!__å

30 I

DK 175901 B1 I

Tabel V I

Peptid- Middel- I

formel Sekvens %Positivé værdi Indeks I

(XI) IWGCSGKLICTTAVP BO 1,67*0/82 1,00

(C-V) QLTVWGIKOLOABIL O - - O

(C-VI) CIKQLQAHILAVERY 20 0/45*0,06 0,01 I

(C-I) QLQAR ILAVE&Y O 0 I

(C-1X) qabilavehylkdqq O 0 I

(XV) RILAVEBYLXDQQLLGIWGCS 90' 2,01*1,40 1, 56

(C-II) - AVERYLKDQQLLG 10 0,04 - <0,01 I

(C-VII) AVERYLKDQQLtGIW 60 1,18*0,68 0,35 (IV) AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLI 100 2,23*0,68 2,26

(XII) AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLIC 100 1,95*0,27 2,11 I

(C-III) LKDQQLLGIWGCS 30 0/28*0,06 0,02 I

(XIV) LKDQQLLGIWCCSCK 90 1,69*0,65 1,43 I

(VI) LKDQQLLGIWGCSGKLI 100 1,19*0,85 1, 65 H

(VII) LLGIWGCSGKL1C 50 0,22*0,05 0,09 I

(XI) LLGIWCCSGKLICTT 80 ' 1,53*0,77 0,96

(C-IV) IWCCSCKLI 20 0,17*0,00 0,01 I

(I) CSCKLIC 60 0,34*0,11 0,19 I

(VIII) QQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS 90 0,51*0,25 0,79 I

(IX) IWGCSGKLICTTAVPWN 70 0,86*0,4S 0,48 I

(III) IWGCSGKLICTTAVPWNAS 100 2,20*0,86 2,24 I

(XIII) GCSGKLICTTAVPWN 100 2,14*0,58 2,21 I

(X) CSGKLICTTAVPWNAS 100 1,74*1,01 1,99 I

(XI) SGKLICTTAVPWNAS SO 0,86*0 ,63 0, 17 I

(C-VIII) LICTTAVPWNASWSN O - - O I

- (V) AVEEYT.KDOOLLGIWGCSCKLICTTAVPWNAS 100 1,53*0, 66 1,89 I

(UD t (rv> avehylkdoollgiwgcsgkli ♦ I

IWGCSGKLICTTAVPWNAS 100 >3,0-2,62 H

31 DK 175901 B1

Som det fremgår af ovenstående tabel, giver analyser foretaget med peptider med formlerne (I) til (XV) alle positive resultater på mindst 50% eller mere og manifesterer i hvert enkelt tilfælde et indeks på mindst 0,1. På den anden side giver hvert af sammenligningssegmenterne, til trods for at de repræsente-5 rer nært tilgrænsende eller overlappende eller delvis overlappende segmenter fra HTLV-III svøbet, ikke sådanne positive resultater eller så høje indeks.

Eksempel VII

Yderligere AIDS/ARC patient sera testedes med ELISA analyser under 10 anvendelse af to stærkt reaktive peptider med formel (III) og (IV) (eksempel IV-procedure 1). Reaktiviteten af nogle af disse sera udtrykt som absorbansvær-dier vises i tabel VI.

___.__ _____ J

I DK 175901 B1 I

I 32 I

I Tabel V» I

I Peptidformel

I Serumprøve {III} (II) I

I I

I 3362 0,503 0,151 I

I 3412 >2,00 0,540 I

I A. 3693 0,559 0,120 I

I 3722 0,620 0,193 I

I 10 0649 1,756 0,379 I

I 3544 0,428 >2,00 I

I 3575 0,350 1,773 I

I 15 3744 0,311 1,326 I

I B. 3790 0,224 1,765 I

I 0509 0,403 2,000 I

I 0653 0,111 0,999 I

I 0662 0,301 1,392 I

I 20 _ I

I 3416 1,914 >2,00 I

I 3456 1,670 1,780 I

I C. 3666 >2,00 >2,00 I

I 25 3414 1,453 1,057 I

I 3411 >2,00 >2,00 I

I 3413 >2,00 >2,00 I

I i I

I 30 De fleste sera, som testedes, reagerede særdeles godt med begge pepti- I

I der, meget som det ses med prøver i tabel VI, gruppe C. Lejlighedsvis var I

I nogle prøver imidlertid langt mere reaktive med det ene peptid end med det I

I andet, således som det fremgår af tabel VI, gruppe A og B. Disse data indike- I

I I

Η I

DK 175901 B1 33 rer, at der kan være mere end en epitop (for eksempel en lineær eller en kon-formationsmæssige epitop) i dette område på toogtredive aminosyrer, som almindeligvis findes hos patienter, der har været udsat for AIDS virus. HPLC analyse af peptider med formel (III) og (IV) i opløsning indikerer, at peptider 5 med formel (III) i stor udstrækning forefindes som cykliske monomerer, mens peptider med formel (IV) for det meste er på dimer form. De strukturelle karakteristika, som disse to peptider giver ved disulfidbinding, kan både have relation til antigenpræsentation og skabelsen af en konformationsmæssig epitop.

10 Eksempel VIII

Yderliger bevis på at der forekommer mere end en epitop i peptider med formel (III) og (IV) kan udledes af konkurrenceundersøgelser, og resultaterne er et eksempel herpå vises i tabel VIIA. Ved denne undersøgelse påførtes peptider med formel (III) og (IV) begge en mikrotiterplade som immobiliseret anti-15 gen, og en ELISA analyse udførtes under fem forskellige betingelser: uden konkurrence eller konkurrence med overskud af peptid med formel (III), formel .

(IV), begge peptider eller et heterologt peptid. Konkurrencen udførtes ved tilsætning af det eller de passende peptider til det fortyndede serum umiddelbart før tilsætning af serumprøven til mikrotiterbrønden.

20

Tabel VIIA

Formelkonkurrerende peptid

Prøve Ublokeret (III) (IV) (IllVdV) Heterologt 25 3412 1,450 0,113 1,182 0,059 1,348 3413 >2,00 0,381 2,032 0,068 2,026 3416 >2,00 1,811 1,055 0,197 2,041 3544 1,810 0,876 0,137 0,048 1,750 30 3575 1,267 0,982 0,105 0,036 1,304 3693 0,340 0,103 0,217 0,065 0,293 3790 1,558 1,320 0,635 0,134 1,349

______ _ A

DK 175901 B1 I

34 I

Under disse betingelser er det meget klart, at nogle prøver reagerer sær- I

deles godt med hvert af de omhandlede peptider eller begge. For eksempel I

reagerer prøve 3416 godt med begge peptider, da konkurrence med peptidet I

med formel (III) giver en optisk densitet (OD) på >1,8, konkurrence med pepti- I

5 det med formel (IV) giver en OD på 1,055, og i nærvær af begge konkurrerende ' I

peptider går OD i det væsentlige ned til baggrundsniveauet. Andre serumprø- I

ver såsom 3412 reagerer meget stærkere med det ene peptid end med det an- I

det. I dette tilfælde reduceres OD fra >1,4 til 0,113 ved blokering med peptid I

med formel (III) og forbliver >1 ved konkurrence med peptid med formel (IV). I

10 Det er imidlertid klart, at der er en vis reaktivitet med peptidet med formel (III), I

da immunoreaktivitet ophæves fuldstændigt (0,059) i nærvær af begge pepti- I

der. I

En anden konkurrenceundersøgelse med peptidet med formel (I) på pla- I

den viser, at peptidet med formel (IV) ikke konkurrerer effektivt med peptidet I

15 med formel (I), selv om peptidet med formel (III) konkurrerer meget effektivt. Se I

tabel VIIB nedenfor. I

Tabel VIIB I

20 Formelkonkurrerende peptid I

Prøve Ublokeret (III) (IV) (1I1WIV1 Heterologt I

013 1,77 0,038 0,046 0,770 0,865 I

014 0,383 0,050 0,067 0,273 0,324 I

25 I

Det fremgår således af disse analyser, at en epitop, som forefindes i pep- I

tidet med formel (III), også forefindes på peptidet med formel (I), og at denne

epitop afviger væsentligt fra dem, der forefindes i peptidet med formel (IV). Ba- I

seret på selv samme prøve reagerer praktisk taget alle sera yderligere med de I

30 epitoper, der forefindes på peptiderne med formel (III) og (IV), selv om de i I

mange tilfælde reagerer stærkere med det ene peptid end med det andet. I

35 DK 175901 B1

Eksempel IX

Ved anvendelse af 1 pg kombination af formel (III) og 0,5 pg formel (IV) peptider som fastfaseantigenet ved en ELISA analyse (eksempel IV - procedure 2) var specificiteten og sensitiviteten af denne analyse lig med eller bedre 5 end et hvilket som helst af de testede kommercielt tilgængelige viruslysatanti-stof påvisningssæt.

Tabel VIII viser ELISA resultater opnået ved anvendelse af patientsera, normale sera og sera fra forskellige sygdomsgrupper indbefattende rheumatoid arthritis, naso-pharyngeal carcinoma (NPC), Epstein-Barr virusinfektion, cyto-10 megalovirusinfektion, gramnegativ sepsis, toxoplasmagondii, systemisk lupus erythematosus og herpes virusinfektioner.

i

Tabel VIII

15 Antal (III)/ (III)/

Prøveqruppe sera ENI+ (IV)+ ENI- (IV)- AIDS + ARC 458(243)* 449 450 9 8 i

Symptomatisk PLS 320(146) 239 242 81 78 20 Asymptomatisk/høj risiko for immunabnormiteter 135(87) 38 39 97 96

Asymptomatisk/høj risiko for immunnormal 134(69) 10 10 124 124 25

Normal/ikke-AIDS 728(728) 12 4 716 724

Forskellige sygdoms- grupper/ikke-AIDS 387(387) 10 7 377 380 30

Samlet antal ikke-AIDS 1115 22 11 1093 1104 * angiver antal patienter ____ __Å I DK 175901 B1 Når bona fide normale sera testedes for reaktivitet ved (lll)/(IV) analysen og analysen markedsført af Electronucleonics, Incorporated (ENI), gav (lll)/{IV) peptidanalysen signifikant lavere hyppighed af falske positive. Som tabel VIII 5 viser, var hyppigheden af falske positive for EN11,65% (12/728), mens hyppig- i i heden af falske positive for (lll)/(IV) peptidanalysen kun er 0,55% (4/728). Når hyppigheden af falske positive i gruppen af forskellige sygdomme undersøges, giver peptidanalysen en lidt lavere hyppighed af falske positive end ENI analysen, 1,81% kontra 2,58% (7/387 kontra 10/387).

10 Ovenstående eksempler er kun givet i illustrationsøjemed og ikke for at begrænse opfindelsens omfang, der kun defineres i de følgende krav.

Claims (17)

1. Syntetisk peptid med en af de følgende formler: 5 IWGCSGKLICTTAVP (II), IWGCSGKLICTTAVPWNAS (III), AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLI (IV), AVERYLKDQQLLGIWGCSGKUCTTAVPWNAS (V),

2. Peptid ifølge krav 1 KENDETEGNET ved, AT det er på cyklisk monomer, dimer eller polymer form.

3. Blanding af mindst et første peptid og et andet peptid, hvor: blandingen har forstærket genkendelse af antistoffer mod HTLV-III virus i forhold til hvert af peptiderne alene; 30 det første af peptiderne er et af de følgende peptider: CSGKLIC (I) IWGCSGKLICTTAVP (II), ___;_______ _ i I DK 175901 B1 I IWGCSGKLICTTAVPWNAS (III), AVERYLKDQQLLG IWGCSGKLICTTAVPWNAS (V), LKDQQLLGIWGCSGKLI (VI), I LLGIWGCSGKUC (VII), I 5 QQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS (VIII), I IWGCSGKLICTTAVPWN (IX), I CSGKLICTTAVPWNAS (X), AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLIC (XII), | GCSGKLICTTAVPWN (XIII), 10 det andet af peptiderne er et af de følgende: AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLI (IV), I AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS (V), LKDQQLLGIWGCSGKLI (VI), QQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS (VIII) I 15 AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLIC(XII), LKDQQLLGIWGCSGK (XIV) I RILAVERYLKDQQLLGIWGCS (XV) eller et hvilket som helst af disse peptider, hvori aminosyren I i undersekvensen I 20 LLGIW er erstattet med aminosyren L, M eller F, forudsat det første og andet peptid er forskelligt.

4. Blanding ifølge krav 3, hvor det første peptid er et af peptiderne III, I X og XIII som defineret i krav 3; og 25 det andet peptid er enten peptid IV eller peptid XII som defineret i krav 3, I eller begge disse peptider i hvilke aminosyren I i undersekvensen LLGIW er erstattet med aminosyren L, M eller F.

5. Blanding ifølge krav 4, hvor det første peptid er peptid III og det an- I 30 det peptid er peptid IV eller peptid IV i hvilket aminosyren I i undersekvensen I LLGIW er erstattet med med en L, M eller F aminosyre. ------, DK 175901 B1

6. Blanding ifølge krav 4, hvor det første peptid er peptid XIII og det andet peptid er peptid IV eller peptid IV i hvilket aminosyren I i undersekvensen LLGIW er erstattet med med en L, M eller F aminosyre.

7. Blanding ifølge krav 5 eller 6, hvor det andet peptid er peptid IV.

8. Fremgangsmåde til påvisning eller bestemmelse af antistoffer mod HTLV-III i et fluidum, som mistænkes for at indeholde antistoffet KENDETEGNET ved, AT man 10 a) tilvejebringer et peptid ifølge krav 1 eller krav 2 knyttet til en fast overflade, b) bringer den peptidbelagte faste overflade i kontakt med fluidet, som 15 skal testes i tilstrækkelig tid til at tillade en immunologisk reaktion at finde sted, °9 c) påviser eller bestemmer tilstedeværelsen eller mængden af antistoffer bundet til peptidet eller det antigeniske fragment på overfladen af det 20 faste stof.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8 KENDETEGNET ved, AT påvisningseller bestemmelsestrinnet omfatter, at man bringer overfladen i kontakt med mærket anti-humant immunoglobulin. 25

10. Fremgangsmåde til fremstilling af antistoffer mod HTLV-III virus omfattende at man immuniserer et dyr med en immunogent virksom mængde af et peptid ifølge krav 1 eller krav 2, i polymeriseret form og/eller knyttet til en passende immunogen bærer og overlader dyret. 30

10 LKDQQLLGIWGCSGKLI (VI), QQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS (VIII), CSGKLICTTAVPWNAS (X), 15 AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLIC (XII), GCSGKLICTTAVPWN (XIII),

20 LKDQQLLGIWGCSGK (XIV),

11. Diagnostisk sæt til påvisning eller bestemmelse af antistoffer mod HTLV-III KENDETEGNET ved, AT det omfatter: (a) en fast overflade, hvortil .____ ___Å I DK 175901 B1 der er bundet et peptid ifølge krav 1 eller krav 2; og (b) mærkede anti-humane immunoglobuliner.

12. Sandwichmetode til påvisning eller bestemmelse af HTLV-III virus 5 eller virusspecifikt antigen i et fluidum, som mistænkes for at indeholde viruset eller antigenet KENDETEGNET ved, AT man a) tilvejebringer antistof mod et peptid ifølge krav 1 eller krav 2 knyttet til en fast overflade, b) bringer den antistofbelagte faste overflade i kontakt med fluidet, som skal testes, i tilstrækkelig tid til at tillade en immunologisk reaktion at finde sted, og 15 c) påviser eller bestemmer tilstedeværelsen eller mængden af HTLV-III virus eller virusspecifikt antigen knyttet til antistofferne på den faste overfla-

13. Konkurrencemetode til påvisning eller bestemmelse af HTLV-III vi-20 rus eller virusspecifikt antigen i et fluidum, der mistænkes for at indeholde viruset eller antigen KENDETEGNET ved, AT man a) tilvejebringer et antistof mod et peptid ifølge krav 1 eller krav 2, hvilket antistof er knyttet til en fast overflade, b) blander en portion af fluidet, som skal testes, med en kendt mængde mærket omhandlet peptid til frembringelse af en blandet prøve, c) bringer den antistofbelagte faste overflade i kontakt med den blan-30 dede prøve i tilstrækkelig tid til at tillade en immunologisk reaktion at finde sted, d) adskiller den faste overflade fra den blandede prøve, DK 175901 B1 j e) påviser eller bestemmer tilstedeværelsen eller mængden af mærket peptid, som enten er bundet til den faste overflade eller er tilbage i den blandede prøve, og 5 f) ud fra resultatet af trin e) bestemmer tilstedeværelsen eller mæng den af viruset eller antigenet i fluidet.

14. Diagnostisk sæt til påvisning eller bestemmelse af HTLV-III virus eller virusspecifikt antigen KENDETEGNET ved, AT det omfatter: 10 a) en fast overflade, hvortil der er bundet antistof mod et peptid ifølge krav 1 eller krav 2, og ! b) en kendt mængde mærket antistof mod HTLV-III, mod et virusspe- 15 cifikt antigen eller mod et peptid ifølge krav 1 eller krav 2.

15. Fremgangsmåde til bestemmelse af nøjagtigheden af et positivt resultat ved en test for HTLV-III antistoffer på en fluidumprøve, der mistænkes for at indeholde antistofferne, hvilken test er en sandwich-analyse ved hvilken et 20 syntetisk HTLV-III peptid ifølge krav 1 eller krav 2 knyttes til den faste overflade KENDETEGNET ved, AT man a) blander en portion af prøven med en virksom blokerende mængde af det syntetiske HTLV-III peptid til frembringelse afen blandet prøve, 25 b) bringer den blandede prøve i kontakt med testens faste fase i tilstrækkelig tid til at tillade en immunologisk reaktion at finde sted, c) bestemmer om binding af antistofferne i den blandede prøve til den j 30 faste fase er inhiberet i forhold til bindingen i fravær af peptidet, og j d) på basis af tilstedeværelsen eller fraværet af inhibering bestemmer nøjagtigheden af det positive resultat. i i ___ _J I DK 175901 B1 I

16. Diagnostisk sæt til bestemmelse eller påvisning af antistof mod HTLV-III og bekræftelse af det positive resultat KENDETEGNET ved, AT det omfatter: a) en fast overflade, hvortil der er bundet et peptid ifølge krav 1 eller krav 2, b) en virksom blokerende mængde af peptidet, og c) mærket anti-humant immunoglobulin.

17. Fremgangsmåde til fremstilling af monoklonale antistoffer mod HTLV-III KENDETEGNET ved, AT man a) immuniserer et værtsdyr med et 15 peptid ifølge krav 1 eller krav 2 i polymeriseret form eller knyttet til en passende immunogen bærer, b) isolerer splenocytter fra den immuniserede vært, c) fusionerer splenocytterne med en passende myelomacellelinie, d) udvælger de fusionerede celler ved reaktivitet med det immuniserende peptid, med HTLV-III eller med HTLV-III inficerede celler, e) enten dyrker den udvalgte hybridoma in 20 vitro eller injicerer den i en passende vært, og f) udvinder det ønskede monoklonale antistof fra supematanten over den dyrkede hybridoma eller fra den injicerede værts serum eller ascites. 30 7