DK174915B1 - Afgivelsessystem til lokal indgivelse af et terapeutisk middel til rodhindelommen - Google Patents

Description

i DK 174915 B1

Den foreliggende opfindelse angår et afgivelsessystem til indgivelse af et præparat til behandling af tandsygdomme. Nærmere betegnet angår den et system til lokal indgivelse af en formulering med forhalet frigivelse omfat -5 tende f.eks. antibiotika, ikke-steroide, antiinflammetoriske midler, vækstfaktorer eller vilkårlige kombinationer deraf, til det hulrum, som omgiver tanden, og som dannes, når gummerne trækker sig tilbage fra tænderne, såsom ved periodontal sygdom. Når formuleringen indgives til dette hulrum, betegnet 10 den periodontale lomme, er præparaterne i stand til at tilvejebringe medikamentafgivelse til lommen, væv, som omgiver lommen, og mundhulen i perioder på op til 2 uger og mere.

Forbedrede metoder til tilvejebringelse af præparater til kontrolleret frigivelse af terapeutiske midler er be-15 skrevet og eksemplificeret i DK patentansøgning nr. 2850/88.

Det har nu vist sig, at sådanne præparater er enestående .________egnede_t.i.l_behandl±ng_af--tandsygdomme-.. - '-------- ----- ------

Medikamenter indgives konventionelt oralt eller via injektion, ofte på et sted fjernt fra målet. I løbet af et 20 relativt kort tidsrum diffunderer medikamentet i patientens kredsløbssystem og fordeles til de forskellige organer og væv, hvoraf mindst ét er det tilsigtede mål for medikamentet.

Virkningen af medikamentet på andre organer end målet kan resultere i uønskelige bivirkninger. Til sidst metaboliseres 25 medikamentet, eller det fjernes på anden måde reversibelt fra organismen ved udskillelse eller kemisk deaktivering.

Når medikamenter indgives oralt eller ved injektion, kan , niveauet og varigheden af tilgængeligheden af medikamentet ikke kontrolleres uafhængigt, kun størrelsen og frekvensen 3 0 af dosis kan manipuleres. Typisk er der til at begynde med en høj koncentration af tilgængeligt medikament på injektionsstedet eller i kredsløbssystemet, hvilken koncentration derefter falder gradvis, efterhånden som medikamentet fordeles og forbruges i patientens legeme.

35 Ved kontrolleret, forhalet afgivelse indgives en formulering af medikament og et bærestof almindeligvis til 2 DK 174915 B1 patienten ved indtagelse eller implantation. Bærestoffet danner et medikamentreservoir, som beskytter det opbevarede medikament imod ydre fjernelsesmekanismer og frigiver medikamentet til det biologiske reservoir med en forudbestemt 5 hastighed. Kontrolleret, forhalet afgivelse af et medikament forhindrer uønsket store blodniveauer og gør medikamentet tilgængeligt i en optimal og praktisk taget ensartet koncentration i et længere tidsrum. Kun det frigivne medikament er underkastet fjernelse via metabolisme og udskillelse.

10 Ved metoden med kontrolleret, forhalet afgivelse er der et potentiale til kontrol med medikamentfrigivelseshastigheden ved hjælp af faktorer, som er iboende i selve afgivelsesemballagen. Nogle af disse iboende faktorer, såsom hydrolyse-hastigheden af en absorberbar polymer eller hastigheden for 15 transdermal diffusion, er i modsætning til de udefra kommende kontroller forbundet med klassiske frigivelsesmetoder, f.eks. tablet indtagelseshyppigheden eller injektionsfrekvensen.

Ifølge kendte metoder kræver opretholdelsen af terapeutiske niveauer af f.eks. et antibiotikum en ret præcis dosering 20 af tabletter. Selvom dette kan være ukompliceret for mange voksne, kan det være vanskeligt, hvor der er maveproblemer til stede eller for børn, selve svækkelsen eller ved veterinært arbejde, såsom med dyr på marken.

Selvom den følgende diskusion vil lægge vægt på be-25 handlingen af periodontal sygdom, omfatter opfindelsen i sine bredeste aspekter et system til behandling af unorma-liteter i mundhulen, hvilket system er anvendeligt til indgivelse af terapeutiske midler i almindelighed. Sådanne midler omfatter illustererende f.eks. antibakterielle midler, \ 30 antifungale midler, antibiotiske midler, antiinflammatoriske midler, immunosuppresive midler, immunostimulerende midler, dentindesensibilisatorer, lugtmaskeringsmidler, immunreagenser, anæstetiske midler, antiseptiske midler, nærende midler, antioxidanter, midler til kompleksering af lipopoly-35 saccharider, peroxider, vævsvækstfaktorer eller en blanding af vilkårlige af ovennævnte.

3 DK 174915 B1

Periodontal sygdom er et alt omfattende udtryk for en mangfoldighed af kliniske tilstande, som er former af enten gingivitis eller periodontitis. Gingivitis er en betændelse af tandkødet (eller gummerne), som kan være forbun-5 det med dårlig mundhygiejne og/eller patientens hormonale tilstand. Det antages, at gingivitis, hvis den ikke behandles, vil udvikle sig til periodontitis. Periodontitis er en bakteriesygdom, hvor infektionen er skredet frem, således at den involverer mundvæv, som holder tænderne fast i kæbe-10 benet. Periodontitis vil, hvis den ikke behandles, til sidst resultere i tabet af de angrebne tænder.

Selvom dental caries effektivt kan behandles med en kombination af rigtig hygiejne og fluorid, er periodontal sygdom ofte mere modstandsdygtig mod behandling. Denne for-15 skel i tilgængelighed for behandling genspejler de mærkbart forskellige miljøer i mundhulrummet og det periodontale hulrum. Mundhulen er i alt væsentligt et aerobt miljø, som _____ konstant perfuseres af spyt. I modsætning hertil er det periodontale mikromiljø mere anaerobt og perfuseres af et 20 plasmafiltrat, som er kendt som det "creviculære fluidum".

Væksten af mikroorganismer i dette mikromiljø kan forårsage periodontal sygdom. Derfor er behandlingen af sygdommen rettet imod en kontrol med denne vækst. Efterhånden som den periodontale sygdom bliver mere etableret, bliver det perio-25 dontale mikromiljø mere anaerobt, og strømmen af creviculært fluidum vokser.

Anstrengelser for behandling af periodontal sygdom er blevet besværliggjort af adskillige faktorer. Da stedet for bakterieinfektionen stort set er utilgængeligt for mid-30 ler, som er til stede i mundhulen, er antimikrobielle midler, som tilføres til mundhulen, f.eks. ved en mundvask, almindeligvis ineffektive. Den forøgede, udadrettede strømning af creviculært fluidum, som ledsager periodontal sygdom, har den virkning, at den forhindrer terapeutiske midler, som er 35 placeret i mundhulen, i at komme ind i den periodontale lomme.

4 DK 174915 B1 I US patentskrift nr. 4.250.163 er der beskrevet en fremgangsmåde til indgivelse af et bredt område af medikamen-teringer til mundhulen ved hjælp af en vandopkvaeldelig og slimhindeadhæsiv, polymer grundmasse, som kan foreligge i 5 form af en tablet, et pulver eller granuler, og som er effektiv i tidsrum af størrelsesordenen nogle timer. Disse behandlinger er normalt effektive i tidsrum på timer snarere end dage, og et behandlingsforløb, som varer 1 måned, ville kræve anvendelsen af talrige tabletter. Desuden er dette 10 system uhensigtsmæssigt til behandling af periodontal sygdom, fordi medikamentet frigives i spyttet eller mundslimen og ikke trænger ind i den periodontale lomme i nogen væsentlig udstrækning. Kindtape og -strimler og lignende sygdomsbehandlingsformer lider af samme ulemper med ineffektiv afgivelse 15 til det angrebne væv.

En anden ulempe ved sådanne metoder til fordeling af medikamenter er, at de kan glide eller blive flyttet af tungen eller tænderne, kan være ubehagelige og kan gribe ind i de normale mundfunktioner.

20 Det er blevet vist, at oral, systemisk indgivelse af antibiotika er en værdifuld metode til kontrol med den sub-gingivale flora. På grund af bivirkninger, såsom i fordøjelsessystemet, f.eks. pseudomembranøs colitis, anorexi, kvalme og diarré, biokemiske unormaliteter, såsom thrombo-25 cytopeni og eosinophili, har oral, systemisk indgivelse kun haft begrænset anvendelse ved behandling af periodontal sygdom. Oral, systemisk terapi kræver hyppig dosering, således at det hyppigt er et problem, om patienten kan tåle den.

Nyere udviklinger på området er rettet mod tilførsel 30 af det terapeutiske middel direkte til den periodontale lomme, i visse tilfælde i en formulering med kontrolleret frigivelse. I almindelighed tillader indgivelse af midler direkte til lommen højere, lokale medikamentkoncentrationer end dem, som kan opnås ved systemisk indgivelse. Doser er i 35 sidstnævnte tilfælde begrænset af systemiske bivirkninger.

Også visse midler, såsom vævsvækstfaktorer, skal indgives 5 DK 174915 B1 direkte til målstedet, dvs. den periodontale lomme.

I US patentskrift nr. 4.175.326 er der beskrevet anvendelsen af en medikamentfyldt, hul polymerfiber. Dette afgivelsessystem bindes rundt om en tand og presses blødt 5 imod kanten af tandkødet, således at det ligger i den periodontale lomme og er i stand til at afgive en effektiv dosis på 2,5 μg tetracyclin pr. dag pr. periodontal lomme i et længere tidsrum på 1 uge eller derover.

Det er blevet beskrevet, at tetracyclin kan inkor-10 poreres i polymethylmethacrylat eller ethylenvinylacetat til fremstilling af et fast præparat i form af strimler eller fibre, som skal anvendes til topisk tilførsel til en læsion i mundhulen, såsom periodontale lommer (J. Periodon-tol. 53(11), 693-699 (1982), og 54(10), 575-579 (1983)).

15 En acrylstrimmel dannet ud fra ethylcellulose impræg neret med metronidazol er beskrevet i US patentskrift nr.

_ _ _ 4.568.538.______________ _________________ _ _

En anden strimmel, som anvender en vandopløselig polymer med en speciel elasticitet og viskositet, er be-20 skrevet i US patentskrift nr. 4.569.837.

Selvom disse midler kan være i stand til at afgive et hensigtsmæssigt medikament i et tidsrum på l uge eller derover, er de uhensigtsmæssige til vidtstrakt anvendelse, fordi de er vanskelige og tidrøvende at tilføre, og de kan 25 blive flyttet af patienten under normale mundfunktioner.

I EP patentansøgning nr. 0.244.118 er der beskrevet mikropartikler indeholdende terapeutisk middel og suspenderet i et flydende bærestof, men når de placeres i den periodontale lomme, bliver de udvasket og kvælder ikke op eller 30 klæber til de involverede væv.

I US patentskrift nr. 4.701.320 er der beskrevet et stabilt, minocyclinholdigt gelpræparat til behandling af periodontale sygdomme ved direkte tilførsel. Præparaterne i dette US patentskrift begrænser bakterier i den periodontale 35 lomme i løbet af 1 dags behandling, men efter 1 uges forløb stiger bakterietællingen derpå væsentligt, hvilket viser en DK 174915 B1 kortvarig virkning.

Afgivelsessystemet ifølge den foreliggende opfindelse blevet specifikt udviklet til afgivelse af terapeutiske midler, f.eks. minocyclin og doxycyclin, kontinuert i peri-5 oder på op til 2 uger, hvorved der tilvejebringes terapeutisk effektive medikamentniveauer over et væsentligt længere tidsrum end ifølge US patentskrift nr. 4.701.320 og uden manipulationsulemperne hos fibrene og polymerstrimlerne.

I DK patentansøgning nr. 6559/89 anvendes der en 10 faseadskillelsesproces til mikroindkapsling af terapeutiske midler i en biosønderdelelig polymergrundmasse, idet det resulterende produkt udgøres af mikropartikler af midlet i polymeren. De i den nævnte DK patentansøgning beskrevne mikropartikler udgør et afgivelsessystem med forhalet fri-15 givelse til systemisk indgivelse til patienter, som har behov for behandling.

En fremgangsmåde til lokal afgivelse af kemoterapeu-tiske midler til behandling af periodontal sygdom i munden er beskrevet i US patentskrift nr. 4.685.883.

20 Det har nu vist sig, at sådanne præparater med valg frie modifikationer er særligt værdifulde til lokal indgivelse til den periodontale lomme til behandling af tandsygdomme. Afgivelsessystemet ifølge opfindelsen er tilpasset til, at mikropartikler, der indeholder det terapeutiske 25 middel, bliver indgivet som et tørt pulver, som absorberer vand ved indgivelse og bliver klæbrigt. Dette fremmer adhæsion til de væv, som danner den periodontale lomme. Derfor er ingen yderligere midler til fremme af adhæsion i den periodontale lomme nødvendige. Grundmassen i partiklerne er 30 polymere, som biosønderdeles, og som ikke kræver fjernelse fra den creviculære lomme. Sønderdelingsprodukter af de foretrukne polymere er sure og er i stand til at tilvejebringe den optimale pH-værdi inden i mikropartiklerne til stabilitet af visse tetracyclinantibiotika, f.eks. minocyclin 35 og doxycyclin. Som det vil blive vist, tilvejebringer afgivelsessystemet ifølge opfindelsen medikamentniveauer i 7 DK 174915 B1 det creviculære fluidum i længere tidsrum end f.eks. formuleringer af geltypen ifølge US patentskrift nr. 4.701.320.

Opfindelsen vil forstås lettere under henvisning til tegningen, på hvilken 5 fig. 1 viser en kurve, som illustrerer minocyclinkon- centrationen i det creviculære fluidum efter indgivelse og frigivelse fra mikropartikler fra eksempel 1 i en 10 dages periode,- fig. 2 viser en kurve, som illustrerer minocyclinkon-10 centrationen i det creviculære fluidum efter indgivelse og frigivelse fra mikropartikler fra eksempel 2 i en 10 dages periode; fig. 3 viser en kurve, som illustrerer minocyclinkon-centrationen i det creviculære fluidum efter indgivelse og 15 frigivelse fra mikropartikler fra eksempel 3 i en 14 dages periode; fig. 4 viser en kurve, som illustrerer minocyclinkon-_ __ _ centrationen i det creviculære fluidum efter indgivelse og frigivelse fra mikropartikler fra eksempel 4 i en 14 dages 20 periode; fig. 5 viser en kurve, som illustrerer minocyclinkon-centration i creviculært fluidum efter en anden behandling med indkapslede minocyclinmikropartikler fra eksempel 4, som i fig. 4, og viser tilbageholdelsen af terapeutiske 25 niveauer i en 14 dages periode; fig. 6 (a-d) i langsgående tværsnit viser et dis- penseringsapparat ifølge den foreliggende opfindelse til indgivelse af medikamentmikropartikler af det terapeutiske middel direkte til det periodontale hulrum.

30 Ifølge den foreliggende opfindelse er der tilvejebragt et afgivelsessystem til lokal indgivelse af et terapeutisk middel til en patients periodontale lomme, og dette afgivelsessystem er ejendommeligt ved, at det omfatter en kombination af 35 (A) tørre mikropartikler med (a) en effektiv mængde af mindst ét terapeutisk middel 8 DK 174915 B1 dispergeret i (b) en grundmasse omfattende en bioforenelig og bio-sønderdelelig polymer og (B) et apparat med 5 (a) en beholder, som ender i et afgangsorgan tilpasset til at passe ind i den periodontale lomme mellem patientens gumme og tænder, hvilket afgangsorgan indeholder de tørre mikropartikler, og (b) et organ til at overføre en udefra påført kraft 10 på mikropartiklerne, som rummes i afgangsorganet, således at de udtømmes gennem spidsen af afgangsorganet ud i den periodontale lomme.

De mikroindkapslede præparater, som anvendes ved den foreliggende opfindelse, kan fremstilles ved en vilkårlig 15 af adskillige teknikformer, som er kendt på området mikro-indkapsling, herunder f.eks. faseadskillelse, coacervering, opløsningsmiddelafdampning og forstøvningstørring. Ved et foretrukket aspekt fremstilles præparaterne ved en faseadskillelsesproces, som anvender flygtige siliconefluida som 20 hærdningsmidler. De resulterende præparater med forsinket frigivelse omfatter mikrokapsler, mikropartikler og mikro-kugler, og de har typisk et aspektforhold på under ca. 3.

Afgivelsessystemet ifølge opfindelsen kan anvendes til lindring af tandsygdomme ved lokal indgivelse til mellemrum-25 met mellem tænderne og gummen hos en patient, som har behov for en sådan behandling, af en effektiv mængde af flere, tørre, adskilte mikropartikler indeholdende terapeutiske midler dispergeret i en grundmasse omfattende en bioforenelig og biosønderdelelig polymer, hvilke mikropartikler typisk 30 er i størrelsesområdet med en diameter fra ca. 0,1 til ca.

1000 /im, fortrinsvis fra ca. 10 til ca. 200 μτη i diameter, især fra ca. 30 til ca. 120 μτη i diameter.

Almindeligvis udgøres mikrokapslerne af fra ca. 0,00001 til ca. 50 vægtdele terapeutisk middel og udgøres 35 yderligere fra ca. 50 til ca. 99,99999 vægtdele grundmasse.

De foretrukne intervaller er fra 1 til 50, fra 5 til 40 og 9 DK 174915 B1 fra 20 til 30 vægtdele terapeutisk middel, idet resten udgøres af grundmasse. De nedre intervaller er egnede, når det terapeutiske middel er f.eks. en vævsvækstfaktor.

Alment omfatter de klasser af terapeutiske midler, 5 som kan indgives med afgivelsesapparatet ifølge opfindelsen, de i det følgende beskrevne. Specifikke midler omfatter de i det følgende beskrevne.

Selvom opfindelsen i bred forstand er anvendelig med de ovenfor beskrevne, terapeutiske midler, foretrækkes tetra-10 cyclinforbindelserne alment, og specielt skal nævnes anvendelsen af medlemmer af tetracyclinfamilien omfattende substituerede 4-, 7- og 9-aminotetracycliner, som kan gengives ved nedenstående almene formel: 15 X $4

^ I 6 5 I ^OH

20 OH O OH O

hvor R betyder hydrogen eller methyl,. betyder hydrogen eller hydroxyl, og R2, R3 og R4 betyder hydrogen, mono-(lavere alkyl)-amino eller di-(lavere alkyl)-amino, idet dog 25 R2, R3 og R4 ikke alle kan være hydrogen. Typiske forbindel ser, som er repræsenteret ved ovenstående almene formel, er f.eks.

7-methylamino-6-deoxy-6-demethyltetracyclin, 7-ethylamino-6-deoxy-6-demethyltetracyclin, 30 7- i sopropylamino-6-deoxy-6-demethyltetracyclin, 9-methylamino-6-deoxy-6-demethyltetracyclin, 9-ethylamino-6-deoxy-6-demethyltetracyclin, 9-isopropylamino-6-deoxy-6-demethyltetracyclin, 7,9-di-(ethylamino)-6-deoxy-6-demethyltetracyclin, 35 7-dimethylamino-6-deoxy-6-demethyltetracyclin, 9-dimethylamino-6-deoxy-6-demethyltetracyclin, 10 DK 174915 B1 7-methylamino-6-deoxytetracyclin, 9-ethylamino-6-deoxytetracyclin, 7.9- di-(methylamino)-6-deoxytetracyclin, 7-diethylamino-6-deoxytetracyclin, 5 9-diethylamino-6-deoxytetracyclin, 7.9- di-(methylethylamino)-6-deoxytetracyclin, 7-met hy1ami no-9-ethylamino-6-deoxytetracyclin og 9-methylamino-5-hydroxy-6 -deoxytetracyclin.

Foretrukne medlemmer af denne familie omfatter tetra-10 cyclinforbindelser udvalgt fra (a) 7-dimethylamino-6-deoxy-6-demethyltetracyclin; (b) 7-methylamino-6-deoxy-6-demethyltetracyclin; (c) 9-methylamino-6-deoxy-6-demethyl te tracyclin,· (d) 7-ethylamino-6-deoxy-6-demethyltetracyclin; 15 (e) 7-isopropylamino-6-deoxy-6-demethyltetracyclin; (f) 6-deoxy-5-oxytetracyclin; (g) et ikke-toksisk syreadditionssalt eller hydrat af (a)-(f), inkl.; eller (h) en blanding af vilkårlige af ovennævnte forbindelser.

20 Specielt skal nævnes tetracyclinforbindelserne 7- -dimethylamino-6-deoxy-6-demethyltetracyclin, 6-deoxy-5--oxytetracyclin og deres ikke-toksiske syreadditionssalte eller hydrater, f.eks. saltsyre-, sulfonsyre- og trichlor-eddikesyresaltene, især saltsyreadditionssaltene. Først-25 nævnte forbindelse er i form af sit monohydrochlorid også kendt som minocyclin-hydrochlorid, og den anden forbindelse er i form af sit monohydrat også kendt som doxycyclin-hyclat.

Disse forbindelser og fremgangsmåder til deres fremstilling er beskrevet i US patentskrifterne nr. 3.148.212, 3.200.149 30 og 3.226.436.

Minocyclin er en kraftig, halvsyntetisk tetracyclin-analog med aktivitet imod et bredt område af gram-positive og gram-negative organismer. Det har vist sig at koncentreres i humant, periodontalt fluidum i niveauer, som er fem gange 35 højere end serumniveauer, og det har vist sig effektivt imod orale mikroorganismer, medens det frembringer en for- 11 DK 174915 B1 bedring i tandkødets sundhed. Når det indsættes i mikroind-kapslet form direkte i det inficerede tandkødssted hos beagle-hunde, kan der opnås minimale inhiberende koncentrationer (MIC) i perioder på op til to uger. Ved sammenligning med 5 eksisterende doseringsformer, som er nødvendige til opnåelse af tilsvarende niveauer i fluidum i den periodontale lomme, kræver indgivelse af et periodontalt minocyclinpulver en dosis, som er nogle hundrede gange mindre end systemiske formuleringer.

10 Fremgangsmåderne til fremstilling af mikrokapsler kan klassificeres i fire hovedtyper: (1) faseadskillelsesmetoder, herunder adskillelsesprocesser med vandig og organisk fase, smeltedispersion og forstøvningstørring; 15 (2) skillefladereaktioner, herunder skillefladepoly merisation, polymerisation in situ og kemiske dampafsæt-___ ___ninger; og _ __________ __________________ _____ ____ (3) fysiske metoder, herunder forstøvningsovertrækning med fluidiseret masse, elektrostatisk overtrækning og fysisk 20 dampafsætning; og (4) opløsningsmiddelafdampningsmetoder.

Det særegne ved faseadskillelsesmikroindkapsling er, at der indledningsvis via en eller anden fysisk eller kemisk ændring frembringes en ny, dispergeret fase indeholdende 25 overtrækningsstofferne. Til sidst omgiver og overtrækker den dispergerede overtræksfase kernematerialet, som selv også til at begynde med er dispergeret eller opløst i den kontinuerlige fase.

En foretrukket type faseadskillelse er beskrevet i 30 ovennævnte DK patentansøgning nr. 2850/88. Det er deri beskrevet, at mikroindkapsling gennemføres, ved at et ikke-opløsningsmiddel for overtrækspolymeren sættes til en opløsning af overtrækspolymeren, som indeholder dispergeret eller opløst kernemateriale. Når flygtige siliconfluida anvendes 35 som hærdningsmidler, resulterer de i tilbageværende hærdningsmiddelmængder på ca. 3 vægtprocent eller derunder, 12 DK 174915 B1 fortrinsvis under ca. 1 vægtprocent, i mikrokapslerne, og de giver ønskelige resultater, fordi disse fluida ikke per-meerer ind i mikropartiklerne under hærdningstrinnet og på grund af egenskaberne meget lav toksicitet og ikke-brænd-5 barhed. Denne teknik vil blive eksemplificeret i det følgende .

Til tilvejebringelse af en biosønderdelelig polymer-grundmasse til forsinket frigivelse foretrækkes det at udvælge polymeren fra poly-(orthoestere) , poly-(a-hydroxysmør-10 syre), poly-(p-dioxanon), poly-(L-lactid) , poly-(DL-lactid), polyglycolid, poly-(glycolid-co-L-lactid), poly-(glycolid--co-DL-lactid) , en blokpolymer af polyglycolid, trimethylen-carbonat og polyethylenoxid eller en blanding af vilkårlige af ovennævnte.

15 Den indkapslingspolymer, poly- (glycolid-co-DL-lactid), som tjener som det foretrukne afgivelsessystem med forsinket frigivelse for den her omhandlede, indkapslede formulering, er i struktur mage til de absorberbare polyglycolsyre- og polyglycolsyre/polymælkesyre-suturmaterialer. Det polymere 20 bærestof tjener som et frigivelsessystem med forhalet frigørelse for de periodontale formuleringer, hører til en klasse af polymere, som er kendt som termoplastiske polyestere. Disse polymere undergår biosønderdeling ved en proces, ved hvilken deres esterbindinger hydrolyseres til dan-25 nelse af normale stofskifteforbindelser, mælkesyre og glycol syre.

Copolymere bestående af forskellige mængdeforhold af mælke- og glycolsyre er blevet studeret for forskelle i sønderdelingshastigheder. Det har vist sig, at biosønder-30 delingshastigheden afhænger af mængdeforholdet mellem mælkesyre og glycolsyre i copolymeren, og at 50:50-copolymeren sønderdeles hurtigst.

Kriterier, som kernematerialer skal opfylde for at blive mi kro indkapslet ved faseadskillelsesmikroindkapslings-35 processen ved anvendelse af flygtige siliconfluida som hærdningsmiddel, er som følger. Kernematerialet må have lav 13 DK 174915 B1 opløselighed i overtræks-ikke-opløsningsmidlet og ligeledes lav opløselighed i det flygtige siliconhærdningsmiddel. Lav opløselighed betyder under ca. 5% vægt/vægt, fortrinsvis under ca. 1 vægt-%, især under ca. 0,1%. Også hvor der er 5 tale om kernematerialer, som mikroindkapsles som faststoffer eller væsker dispergeret i overtræksopløsningen, skal den koncentrerede overtræksopløsningsfase, som skabes ved tilsætning af ikke-opløsningsmidlet, befugte kernefasen frem for den kontinuerlige fase. Hvor der er tale om kernemater-10 ialer, som er opløselige i begyndelsesovertræksopløsningen, skal kernematerialet dele sig i den,overtræksfase, som skabes ved tilsætning af overtræks-ikke-opløsningsmidlet. Den klasse kernematerialer, som kan mikroindkapsles, er derfor bestemt af de fysisk-kemiske egenskaber af kernen, overtrækket, 15 overtræksopløsningsmidlet og hærdningsmidlet.

Blandt de terapeutiske midler, som opfylder disse _____ ____ kriterier alment, er antibakterielle midler, antifunqale ____ midler, antibiotiske midler, antiinflammatoriske midler, immunosuppresive midler, immunostimulerende midler, dentin-20 desensibilisatorer, lugtmaskeringsmidler, immunreagenser, anæstetiske midler, antiseptiske midler, nærende midler, antioxidanter, midler til kompleksering af lipopolysacchari-der, peroxider, vævsvækstfaktorer eller en blanding af vilkårlige af ovennævnte. Specifikke eksempler på foretrukne, 25 antibiotiske midler omfatter penicilliner, cephalosporiner, quinoloner, aminoglycosidantibiotika (gentamycin, tobramycin, kanamycin, amikacin), tetracycliner (minocyclin, doxycyclin, oxytetracyclin, chlortetracyclin, demeclocyclin, methacy-clin), clindamycin, metronidazol og farmaceutisk acceptable 30 salte eller hydrater af ovennævnte. I DK patentansøgning nr. 2850/88 er det specifikt vist, at peptider opfylder kriterierne for inkorporering i mikropartikler ved faseadskillelsesprocessen.

β-Lactamaseinhibitorer kan anvendes i kombination 35 med penicillinerne. Især foretrukne tetracycliner er som ovenfor nævnt minocyclin og doxycyclin, deres salte og hydra- 14 DK 174915 B1 ter.

Som en yderligere fordel ved foretrukne systemer frembringes der svage syrer (mælke- og glycolsyre), efterhånden som formuleringen med forsinket frigivelse, som er 5 specifik for tetracyclinantibiotika, sønderdeles efter indgivelse, således som det er tilsigtet. Tetracyclinantibiotika, såsom minocyclin, er mest stabile i vandige opløsninger under svagt sure betingelser. Formuleringen udøver derfor en beskyttelsesvirkning, som gør det muligt at frigive 10 sådanne medikamenter over et længere tidsrum.

Det terapeutiske middel i afgivelsessystemet ifølge opfindelsen er især minocyclinholdige mikrokapsler eller doxycyclinholdige mikrokapsler eller andre tetracyclinholdige mikrokapsler og indgives som et tørt pulver, som ved ind-15 givelse absorberer vand og bliver klæbrigt. Dette fremmer adhæsionen til de væv, som udgør den creviculære lomme. Inaktive komponenter er polymere, som biosønderdeles, og som ikke kræver fjernelse fra den creviculære lomme.

En farmakokinetisk undersøgelse af de periodontale 20 minocyclinformuleringer med afgivelsessystemet ifølge opfindelsen er blevet foretaget til fremstilling af en doseringsform, som kan indgives til den periodontale lomme, og som vil give minocyclinkoncentrationer, som overstiger de minimale inhiberende koncentrationer (MIC) (0,05-1,56 Mg/ml) 25 for organismer, som er forbundet med periodontal sygdom, i et tidsrum på op til 14 dage. Derfor er der blevet gennemført et studium in vivo på en hundemodel til vurdering af fire forskellige, periodontale minocyclinformuleringer for at bestemme minocyclinniveauer i det creviculære fluidum.

30 Studiet har anvendt beagle-hunde med kirurgisk frem bragt, "kronisk", periodontale intraknogledefekter. Denne model indebærer udtrækning af de to fjerde præmolarer i undermunden og frembringelse af kirurgisk frembragte intraknogledef ekter ved mesialoverfladen på de første molarer og 35 distaloverfladen på de tredie præmolarer. Faciale, linguale, interproximale knogle- og blotlagte (rodplanerede) rodover- 15 DK 174915 B1 flader udgør den kirurgisk frembragte omkreds af en 6-7 mm dyb intraknogledefekt.

I rækkefølge skabes defekterne som følger: Først udtrækkes de fjerde præmolarer i undermunden, gruberne får 5 lov at hele i én måned, og hundene får en tandstensfjernelse og tandrensning af hele munden. Derefter gennemføres der en mucoperiosteal, periodontal klapmetode i hver af de nedre kvadranter, og intraknogledefekter frembringes ved den me-siale overflade af de første molarer og den distale overflade 10 af de tredie præmolarer. Knoglen umiddelbart op til de inter-proximale overflader af tænderne fjernes ved hjælp af et hurtiggående tandlægebor under konstant sprøjtning med vand.

Tandens cementforing fjernes også. Før de periosteale klapper igen sættes på plads, placeres en tråd af rustfrit stål 15 rundt om tandhalsen, tildannes til en sløjfe, og bøjes ned i knogledefekten, og et stykke aluminiumfolie, udskåret, —_______ -således-at—det—passer-b-il_def.ekt.en-,—placeres—mellem tråden^ _____ _ og tandoverfladen. Trådene efterlades på plads i 6 uger for at tillade, at en plade under tandkødet organiseres. Derefter 20 overskæres og fjernes trådene sammen med aluminiumfolien.

Hundene overvåges i yderligere 4 uger.

Til vurdering af de creviculære niveauer af minocyclin sættes hundene under totalbedøvelse, og de forskellige formuleringer indgives i de periodontale lommer, som er forbun-25 det med de frembragte defekter. Formuleringerne indgives i tør form ved hjælp af en speciel dispensator (fig. 6) . Visuel bedømmelse (primært for at notere fysisk tilbageholdelse af materiale) og indsamling af creviculært fluidum gennemføres alment 2 og 24 timer og 4, 7, 10, 14 og 28 dage efter behand-30 lingen. Tre af de fire formuleringer (A, B, C) er kun blevet studeret som indgivelse til én behandling, medens den fjerde formulering (D) er blevet studeret i to behandlingscycluser.

Prøver af tandkødsfluidum opsamles på en "Periotron"-papirstrimmel placeret ved åbningen af defekten i 30 sekunder.

35 Derefter fjernes strimlen, og den relative mængde fluidum bestemmes ved hjælp af et "Periotron 6000"-instrument. Papir- 16 DK 174915 B1 strimler indsamles i hætteglas og nedfryses til -20°C, indtil de afprøves.

Strimlerne afprøves for minocyclin ved en bioafprøvningsteknik, som indebærer anvendelse af den minocyclinføl-5 somme bakterie Bacillus cereus. Bakterierne podes i næringsagar. Efter at agaren er hældt i petriskåle og har fået lov at hærde, udstanses der huller i agaren, hvori strimmelprøverne dernæst placeres. Derpå inkuberes pladerne i 16-20 timer ved 30°C. Zoner med inhiberet bakterievækst afbiIdes, 10 og mængden af tilstedeværende minocyclin bestemmes ved sammenligning med zoner, som er opnået med minocyclinopløsninger med kendt koncentration.

Dosis af minocyclin i alle formuleringer svarer til 1 mg minocyclin som fri base pr. lomme. De gennemsnitlige 15 minocyclinniveauer i det creviculære fluidum er for alle fire formuleringer blevet holdt over 10 /zg/ml i 7 døgn. Formuleringerne B og C har opretholdt gennemsnitlige niveauer over 10 Mg/ml i 10 døgn, medens formulering D har givet minocyclinniveauer over 10 /xg/ml i 14 døgn. På basis af 20 denne information er formulering D blevet indgivet til hunde til en anden behandlingscyclus, og tilsvarende resultater er blevet fundet, se fig. 1-5.

Minocyclinholdige mikrokapsler udgøres af fra ca. 1 til ca. 50 vægtdele minocyclin-HCl, fortrinsvis fra ca. 5 til 25 ca. 40 vægtdele og især fra ca. 20 til ca. 30 vægtdele, pr.

100 vægtdele mikrokapsler. Præparatet udgøres endvidere af fra ca. 50 til ca. 99 vægtdele glycolsyreinitieret poly--(glycolid-co-DL-lactid), fortrinsvis fra ca. 60 til ca. 95 vægtdele og især fra ca. 70 til ca. 80 vægtdele, pr. 100 30 vægtdele mikrokapsler. Sammensætningen af copolymeren udvælges fortrinsvis således, at den sønderdeles i løbet af et tidsrum på ca. 1 måned eller derunder, og ligeledes således at den hurtigt hydratiserer ved indgivelse til det fugtige miljø i den creviculære lomme. Hydratisering bevirker, at 35 polymeren bliver klæbrig, således at mikropartiklerne ad-hærerer til hverandre.og til det væv, som omgiver lommen.

17 DK 174915 B1

Adhæsion til vævet, som omgiver lommen, tilvejebringer et middel til tilbageholdelse af formuleringen i lommen og tillader frigivelse af det terapeutiske middel i tidsrum på op til 2 uger eller derover. Adhæsion er nødvendig for at 5 forhindre, at doseringsformen udstødes fra den periodonale lomme af creviculært fluidum, som kontinuerligt strømmer fra lommen.

Mikropartiklerne kan i diameter variere fra ca. 0,1 til ca 1.000 μτα, fortrinsvis fra ca. 10 til ca. 200 μπι, 10 især 30-120 μτη, afhængigt af den anvendte metode.

Minocyclin eksisterer som faste partikler med en diameter på ca. 5 μιχι eller derunder fordelt gennem hele det indre af mikropartiklerne.

Mikropartikelformuleringen tilvejebringer væsentlige 15 fordele sammenlignet med andre formuleringer, som er udtænkt til behandling af periodontal sygdom. Den inaktive ingrediens _________ er . biosønderdelel.ig_,_s.åledes_at__det_ikke_er_nødvendi_g.t__a.t___ _____ fjerne formuleringen fra lommen, efter at medikamentet er blevet frigivet. Desuden er mængden af polymer, som er til 20 stede i den periodontale lomme, så lille, og sønderdelings-hastigheden er tilstrækkelig langsom til, at mængden af frembragt syre ikke på uheldig måde påvirker lommens væv.

De periodontale mikrokapsler indeholdende terapeutisk middel fremstilles fortrinsvis ved en faseadskillelsesmikro-25 indkapsling, som omfatter, at (1) den aktive ingrediens dispergeres i en opløsning af indkapslingspolymeren, f.eks. poly-(glycolid-co-DL-lac-tid) ; (2) et faseinduktionsmiddel sættes til suspensionen 30 for at bevirke, at polymeren udskilles (coacerverer) i form af små opløsningsmiddel-polymer-dråber, som adhærerer til fasen af terapeutisk middel; (3) ovennævnte blanding sættes til et hærdningsopløsningsmiddel, som ekstraherer polymeropløsningsmidlet fra 35 dispergeret opløsningsmiddel-polymer-terapeutisk middel--fasen til opnåelse af faste mikropartikler; 18 DK 174915 B1 (4) mikropartiklerne indeholdende terapeutisk middel udvindes, f.eks. ved filtrering af suspensionen gennem en sigte; og (5) de periodonale mikropartikler tørres, f.eks. ved 5 vakuumtørring.

Det tilsatte hærdningsmiddel er fortrinsvis en flygtig silicon.

Mikrokapslerne kan emballeres i en dispensator. Dis-pensatoren er fortrinsvis lukket inde i en fugtighedsuigen-10 nemtrængelig emballage, f.eks. en varmeforseglet aluminium-folielaminatpose, for at forhindre sønderdeling af formuleringen som følge af fugt.

Et foretrukket afgivelsessystem ifølge opfindelsen til tilførsel af de orale præparater til den periodontale 15 lomme hos en patient, som har behov for en sådan behandling, er vist i fig. 6a-6d. En beholder 2 omfatter en cylinder 10 og en indervæg 12, som afgrænser et hulrum. Cylinderen er åben ved 14 og omfatter en fingerindgrebs flange 22 af den type, som gængs ses i sprøjter, som vist i fig. 6d. Cylin-20 deren ender i en spids, som kan være lige 7a eller fortrinsvis kurveformet 7b for at lette manipulering. En mængde medikament 9, som udgør præparatet, anbringes i spidsen, hvis åbne ende kan være lukket med en hætte 8, f.eks. af gummi. Til udtømning af beholderens indhold anbringes der 25 en stempelstang 4, fig. 6a, i åbningen 14 med en fast spids 16 delvis inde i udtømningsspidsen 7a eller 7b. Stempelstangen kan have enhver egnet konfiguration, men det ribbede tværsnit, som er vist i fig. 6a og 6c, giver god mekanisk styrke og let vægt.

30 Dispensatoren kan fortrinsvis fremstilles af en har piks udvalgt fra polypropylen, polypropylencopolymer, polypropylen-tilfældig copolymer, polyethylen med høj vægtfylde eller en kombination af vilkårlige af ovennævnte. Disse kan almindeligvis steriliseres ved bestråling, eller de kan 35 gøres steriliserbare ved kendte metoder. Med tetracycliner udgør præparatet med forsinket frigivelse mindst en effektiv 19 DK 174915 B1 eller terapeutisk mængde, og det kan i doseringsenhedsform indeholde f.eks. fra ca. 0,25 til ca. 10 mg af tetracyclin-forbindelsen, f.eks. minocyclin-hydrochlorid. Eventuelt kan dispensatoren være forsynet med ét eller flere reservoirer, 5 som indeholder større mængder af mikropartiklerne.

Opfindelsen vil blive mere fuldstændigt beskrevet ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

Eksempel 1 10 En 5%'s opløsning af glycolsyreinitieret poly-(glyco- lid-co-DL-lactid)-polymer, logaritmisk viskositetstal 0,11 dl/g, fremstilles i methylenchlorid. Polymeropløsningen filtreres gennem et opløsningsmiddelbestandigt filter med poreåbninger på 0,2 μιη eller derunder. 6,2 g formalet mino-15 cyclin-hydrochlorid sættes til 300 g polymeropløsning og dispergeres med en blander med høj forskydning. Denne disper- ------ — · —s-ion- ov-e-r-f-øres—t-i-1— en—m-i-kroindkapsl-ingsbeholder—omfat-tende_______ en reaktor forsynet med en omrører af propeltypen med variabel hastighed og en ventil til udtagning af væske fra be-20 holderens bund. Dispersionen omrøres, og 300 g Dow Corning "Silicone 360" medicinsk fluidum, viskositet 350 centistoke, tilsættes i løbet af ca. 3 minutter, og omrøringen fortsættes i ca. 2 minutter. Dispersionen overføres fra mikroindkaps-lingsbeholderen til en hærdningstank indeholdende 14-20 kg 25 Dow Corning "Silicone 244"-fluidum. Hærdningsbeholderen er forsynet med en omrører af propeltypen med variabel hastighed. Omrøring gennemføres i ca. 2 timer. Mikropartikel-suspensionen udtømmes gennem en opsamlingssigte, og hærdningstanken skylles med ca. 1 kg "Silicone 244"-fluidum og 30 udtømmes gennem hærdningssigten. De kombinerede mikropartik-ler tørres under vakuum ved en temperatur på ca. 40°C. De tørrede mikropartikler sigtes gennem en sigte med en åbning på 0,175 mm.

DK 174915 B1 20

Eksempel 2-4

Fremgangsmåden ifølge eksempel 1 gentages, idet der 1 stedet anvendes tre polymere af samme type med højere molekyl vajgt med logaritmiske viskositetstal på hhv. 0,22, 0,31 5 og 0,44. Der fås midler, der kan anvendes i afgivelsessystemet ifølge den foreliggende opfindelse.

Eksempel 5

Hvis fremgangsmåden ifølge eksempel 1 gentages, men 10 der i stedet for minocyclin-hydrochloridet anvendes samme vægt af doxycyclin-hyclat, fås der et middel, der kan anvendes i afgivelsessystemet ifølge den foreliggende opfindelse.

Eksempel 6-10 15 Beagle-hunde med kirurgisk frembragte, "kroniske", periodontale intraknogledefekter behandles som ovenfor beskrevet. En dispensator som vist i fig. 6 anvendes til indgivelse af midlerne fra eksemplerne 1-4 i tør form i de i hundene frembragte periodontale lommer. Præparaterne er før 20 indgivelse blevet steriliseret ved hjælp af τ-stråling.

Prøver af tandkødsfluidum opsamles som ovenfor beskrevet og analyseres. Visuel bedømmelse og indsamling af fluidet gennemføres efter 2 timer, 24 timer, 4 dage, 7 dage, 10 dage, 14 dage og 28 dage. Dosis svarer i alle tilfælde 25 til 1 mg minocyclin (fri base) pr. lomme. Strimlerne afprøves for minocyclin ved mikrobiologisk afprøvning med Bacillus cereus. De gennemsnitlige minocyclinniveauer i crevikulært fluidum er afbildet imod tiden i fig. 1-5. Midlet fra eksempel 4 er blevet anvendt ved en anden cyclus, fig. 5. Eksempel 30 1 opretholder gennemsnitlige minocyclinniveauer på over 10 /ig/ml i 7 døgn (10 μg/ml er et terapeutisk niveau) . Eksempel 2 og 3 opretholder terapeutiske niveauer i 10 døgn. Eksempel 4 opretholder terapeutiske niveauer i 14 døgn og opretholder sådanne niveauer i 14 døgn på en anden cyclus.

35 21 DK 174915 B1

Eksempel 11

Hvis fremgangsmåden ifølge eksempel 6-10 gentages under anvendelse af doxycyclinmidlet fra eksempel 5 vil der blive opretholdt vedvarende terapeutiske niveauer af doxy-5 cyclin i det crevikulære fluidum.

Mange variationer i opfindelsen vil være indlysende for fagfolk på området på baggrund af ovenstående, detaljerede beskrivelse. F.eks. kan der i stedet for minocyclin og doxycyclin anvendes steroider, ikke-steroide, antiinflam-10 matoriske midler eller peptidvækstfaktorer. I stedet- for siliconolie som et ikke-opløsningsmiddel kan der til fremstilling af mikropartiklerne anvendes mineralolie eller jordnøddeolie. I stedet for methylenchlorid kan der anvendes andre indkapslingspolymeropløsningsmidler, såsom ethylacetat, 15 methylacetat, methylformiat og ethylformiat.

Der kan anvendes andre mikroindkapslingsprocesser _______ ___ end faseadskillelse.________ ________ _______ ___ ______ _

Andre biosønderdelelige indkapslingspolymere, som bliver klæbrige ved kontakt under vand, kan anvendes.

20

Claims (8)

1. 22 DK 174915 B1 PATENTKRAV.
2. 1. Afgivelsessystem til lokal indgivelse af et terapeutisk middel til en patients periodontale lomme, kendetegnet ved, at det omfatter en kombination af 5 (A) tørre mikropartikler med (a) en effektiv mængde af mindst ét terapeutisk middel dispergeret i (b) en grundmasse omfattende en bioforenelig og biosønderdel el ig polymer og 10 (B) et apparat med (a) en beholder, som ender i et afgangsorgan tilpasset til at passe ind i den periodontale lomme mellem patientens gumme og tænder, hvilket afgangsorgan indeholder de tørre mikropartikler, og 15 (b) et organ til at overføre en udefra påført kraft på mikropartiklerne, som rummes i afgangsorganet, således at de udtømmes gennem spidsen af afgangsorganet ud i den periodontale lomme.
3. 2. Afgivelsessystem ifølge krav 1, kendete g-20 net ved, at beholderen omfatter en cylinder, som ender i en hul udtømningsspids, at organet til overføring af kraft og udtømning af mikropartiklerne omfatter en stempelstang, og at det også omfatter et fjerneligt lukke på den åbne ende i afgangsorganet til opretholdelse af indholdets inte-25 gritet, hvorhos apparatet er lukket inde i en steril emballage.
4. 3. Afgivelsessystem ifølge krav l, kendetegne t ved, at mikropartiklerne som terapeutisk middel indeholder et middel med antibiotisk aktivitet og er udvalgt 30 fra den gruppe, som består af tetracyclin eller et farmaceutisk acceptabelt salt eller hydrat deraf, doxycyclin eller et farmaceutisk acceptabelt salt eller hydrat deraf, mino-cyclin eller et farmaceutisk acceptabelt salt eller hydrat deraf og blandinger af mere end én af ovennævnte antibiotika, 35 og at grundmassen omfatter en polymer udvalgt fra den gruppe, som består af polyglycolid, poly-(L-lactid), poly-{DL-lac- 23 DK 174915 B1 tid), poly- (glycolid-co-L-lactid) , poly- (glycolid-co-DL-lac-tid) , poly-(α-hydroxysmørsyre) , poly-(orthoestere), poly--(p-dioxanon), blokpolymere af polyglycolid, trimethylencar-bonat og polyethylenoxid eller en blanding af vilkårlige af 5 ovennævnte.
5. 4. Afgivelsessystem ifølge krav 3, kendetegnet ved, at mikropartiklerne omfatter fra 20 til 30 vægtdele minocyclin-HCl eller doxycyclin-hydrat og fra 80 til 70 vægtdele poly-(glycolid-co-DL-lactid) pr. 100 vægtdele 10 mikropartikler.
6. 5. Afgivelsessystem ifølge krav 3, kendetegnet ved, at mikropartiklerne kan fremstilles ved en fase-adskil lelsesproces, ved hvilken det tilbageværende hærdningsmiddel udgør under 3 vægtprocent af mikropartiklerne, at 15 mikropartiklerne har en diameter fra 0,1 til 1000 /*m, og at det terapeutiske middel udgør fra 0,00001 til 50 vægtdele ____ ____pr. 100 vægtdele mikropartikler. _____ __________ _ 4 ΙΟΟΟΟγ II FIG. I 1000: \ H \ e \ tn \ =L \ z 0 \ M \ Eh Nv 1 100: Z BMIDDELKONCmNsII ω "v_ ™ -i- u z \ o \ z \ M \ U ΪΗ ·ν o \ g 10: \ M \ S N. I--'-1-1-1---1--1------1-1_I_I_1_I_1_
7. 0 I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13 TID I DAGE 100000 K ! ,, FIG. 21 10000 Λ Η \ e \ &· \ ί Ζ \_ ο ( I ζ 1000 Γ s \ , E-« \ I U ; MIDDELK0NCΝ = 12 U \ '- Ζ I ° Ik. « 1 ζ Μ U _ Μ S 10--1-1-—I-I-1-1-1-J_I_ι_ι_I_ι, . Ο I 2 3 4 5 6 7 β| 9 10 II 12 13 TID I DAGE lOOOOr FIG·3 _ IOOO r X. f—ί 'V a s Cn ^ V MIDDELKONC., N = 12 Z \ O \ Η X. H 100 " Z \ W X U X Z \ O X « X z \ H \ j X u X ΪΗ \ u X· z 10: * H S I__I_I_I_ -----1_I_1 1-1-1-1-1—--·— o I 2 3 4 5 6 7 β 9 10 II 12 13 TID I DAGE S ! lOOOOr- I p""*sv FIG. 4 I 1000 r NSsM middelkonc .. N s 12 a I Z I O M ---- Η I $ 100 r Eh Z I w ! X. U z \ O I « - \ z 1 M 8 ! 8 10- z : M s ! I--1-1-^-1-1-j-1-1_l!__i_I_I_I_ 0 1 2 3 4 5 6 7 Θ 9 10 II 12 13 TID I DAGEj lOOOOr FIG. 5 Β \ &» ΙΟΟΟ- \ η. \ ^ \ Hmiddelkonc., Ν=4 Μ \ ; Η \ i \ tr> \ ζ \ —' X w w— \ ζ ιοο - \ ο \ ζ \ ζ X Η \ ^ . \ υ \__ ΪΗ ___ Ο --— ο ζ Η s ΙΟΙ 4--1-1-1-1-1-1_i_I_I__ I_ οι 23456789 10 II TID I DAGE Λ \ i__ _____ 1 — \ ^ / »; \ w
8. 11 FIG. 6 α ί -.S'» r^^'8 "ν»Λ ,8 (/* ^ " FIG.<Sb ” * ’ ^ 14 (=4=)SNIT Α'Α ί ί 0 I FIG ( VJ^yFIG.6c ; 11 JJ ΜϋΛ I 22^-— i