DK174727B1 - Indretning og fremgangsmåde til fastfaseanalyse - Google Patents

Description

DK 174727 B1

Opfindelsen angår en analyseindretning og en fremgangsmåde til fastfaseanalyse.

Analyser for forskellige analysander er blevet udført efter en såkaldt fastfaseanalyse. I en fastfaseanalyse er et bindemiddel, der er specifikt for i det mindste den ligand, der 5 skal bestemmes (analysanden) båret på et fast bærelag, hvorved det i analysen ikke er nødvendigt at anvende et yderligere middel til at separere de bundne og frie faser dannet ved analysen.

1 almindelighed har sådanne faste bærelag været i form af rør, faste partikler, og i nogle 10 tilfælde har den faste fase været i form af en nedstikningspind.

I en fastfaseanalyse med en nedstikningspind kan et bindemiddel være båret på nedstikningspinden, hvor nedstikningspinden indeholdende bindemidlet bliver dyppet i en analyseopløsning, der indeholder analysanden, og i almindelighed indeholder en 15 sådan opløsning endvidere en indikator. Tilstedeværelsen af og/eller mængden af indikator på nedstikningspinden bliver så anvendt som et mål for analysanden (enten et kvalitativt eller et kvantitativt mål for analysanden).

I EP 212599 beskrives multilags-immunoanalyse-testindretninger til bestemmelse af en 20 analysand i et flydende testmedium, hvilke indbefatter anvendelsen af mærkede reagenser omfattende en kemisk gruppe, som er detekterbar, baseret på kemisk reaktivitet med et andet stof (sædvanligvis et enzym) til tilvejebringelse af et detekterbart signal, såsom fluorescens eller farve. I EP 212599 benyttes en indirekte mærkningsteknik i dets multizone-analytiske elementer, og der benyttes ikke-mobile 25 mærker.

Nærværende opfindelse er rettet imod en tilvejebringelse af en forbedret fastfaseanalyse til bestemmelse af analysanden og især mod en fastfaseanalyse.

30 I overensstemmelse med et første aspekt ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes en analyseindretning til bestemmelse af tilstedeværelse eller fravær afen DK 174727 B1 2 analysand i en flydende prøve, omfattende: a) en teststrimmel med mindst en første og en anden del, som er arrangeret på strimmelen i det samme plan på en måde, således at materiale ved kapillær tiltrækning 5 kan flyde fra den første del til den anden del; b) idet den første del har en indikator, som bevægeligt er støttet deri, hvor indikatoren omfatter en ligand, som er specifik for analysanden, når indretningen er konfigureret til et sammensat analyseformat, og som er analysanden eller en analog 10 deraf, når indretningen er konfigureret til et konkurrenceanalyseformat, konjugeret til en ikke-opløselig, partikelformig markør, og som er stedet for tilsætning af prøven; c) idet den anden del immobiliseret deri har et bindemiddel, som er specifik for analysanden, når indretningen er konfigureret til et sammensat analyseformat, og som 15 er specifik for analysanden og liganden, når indretningen er konfigureret til et konkurrenceformat; idet bindemidlet er til stede i en mængde, således at indikator, som er bundet i en sådan del, er synlig.

Ifølge et andet aspekt ifølge opfindelsen anvises en ettrins-fremgangsmåde uden vask 20 til bestemmelse af tilstedeværelse eller fravær en analysand i en flydende prøve, bestående af trinnene: a) tilsætning af en flydende prøve til den første del af indretningen ifølge et hvilket som helst af de foregående krav; 25 b) i tilstrækkelig tid at gøre det muligt for væsken at blande sig med indikatoren og for indikator-analysand-blandingen at strømme til den anden del af indretningen ifølge krav 1; og 30 c) aflæsning af resultatet ved detektering af tilstedeværelsen eller fraværet af den synlige, partikelformige, detekterbare markør i den anden del.

DK 174727 B1 3

Indikatoren bliver båret på det faste bærelag på en indikatordel af det faste bærelag på en sådan måde, at når indikatoren er gennemvædet, er den i stand til at blive transporteret ved kapillarvirkningen til den anden del af det faste bærelag og derefter afhængigt af tilstedeværelsen og/eller fraværet af analysanden og/eller mængden af analysanden, 5 som forklaret nærmere i det følgende, til en tredje del af det faste bærelag.

Indikatordelen af det faste bærelag kan være en separat del af det faste bærelag eller kan være den første del af det faste bærelag (den del, hvortil prøven bliver tilsat).

10 Bindemidlet, som bliver båret på den anden del af den faste fase, bliver båret på en sådan måde, at bindemidlet forbliver ubevægeligt og ikke af kapillarvirkningen bliver transporteret til den tredje del af det faste bærelag.

Den tredje del af det faste bærelag kan være en del til detektering af en indikator, som 15 af kapillarvirkningen er blevet transporteret fra den anden del til den tredje del. Den tredje del kan eventuelt inkludere et stof, der er båret af denne del med henblik på at detektere indikatoren. Alternativt kan den tredje del fungere udelukkende med henblik på at modtage materialer, der ikke er bundet i den anden del.

20 I overensstemmelse med nærværende opfindelse er mængden af indikator, som er gjort ubevægelig i den anden del af det faste bærelag ved at være bundet enten direkte til bindemidlet i den anden del (i et konkurrenceanalyseformat) eller ved at være indirekte bundet til bindemidlet (ved at indikatoren er bundet til analysanden, som er bundet til bindemidlet i et sammensat analyseformat), afhængigt af tilstedeværelsen og/eller 25 mængden af analysand i prøven. I et såkaldt sammensat analyseformat er mængden af indikator, som bliver overført fra den anden del til den tredje del af det faste bærelag ved kapillarvirkning, indirekte proportional med mængden af analysand i prøven, og i det såkaldte konkurrenceanalyseformat er mængden af indikator, som overføres fra den anden del til den tredje del af det faste bærelag ved kapillarvirkningen, direkte 30 proportional med mængden af analysand i prøven.

DK 174727 B1 4 I en foretrukken udførelsesform ifølge opfindelsen bliver det faste bærelag og forskellige komponenter fremstillet og anvendt på en måde med henblik på at bestemme analysanden med et konkurrenceanalyseformat, hvor indikatoren bliver båret på den første del af det faste bærelag.

5 I en særlig foretrukken udførelsesform, som forklares nærmere i det følgende, består den detekterbare mærkedel af indikatoren af en sæk eller en lipid blære (ofte omtalt som en liposom), der indeholder et detekterbart mærke.

10 Ved anvendelsen af en foretrukken udførelsesform, hvor analysen er en konkurrenceanalyse, bliver indikatoren båret på det faste bærelag på den første del af dette, og den første del af det faste bærelag bliver gennemvædet med prøven indeholdende den analysand, der skal bestemmes. Efter gennemvædning af det faste bærelag med prøven strømmer såvel prøven som indikatoren ved kapillarvirkning ind i den 15 anden del af det faste bærelag, der indeholder et bindemiddel, som er specifikt for såvel analysanden som indikatoren, og hvor bindemidlet er blevet gjort ubevægeligt på den anden del af det faste bærelag. Afhængigt af tilstedeværelsen og/eller mængden af analysanden i prøvedelen bliver indikatoren bundet til bindemidlet på den anden del af det faste bærelag. Den del af indikatoren, der ikke bliver bundet af bindemidlet på den .

20 anden del, strømmer så ved kapillarvirkningen ind i den tredje del af det faste bærelag med henblik på detektering og/eller bestemmelse deri. Hvis analyseformatet skal være et simpelt "ja eller nej" format (der kun bestemmer, hvorvidt en analysand er til stede i prøven eller ej), så bliver bindemidlet, der bæres på den anden del af det faste bærelag, båret i en sådan mængde, at ved fravær af en detekterbar mængde af analysand i prøven 25 er der ingen detekterbar tilstedeværelse af indikator i den tredje del af det faste bærelag.

Som det ville vise sig, når mængden af analysand i prøven forøges, forøges mængden af indikator, som ikke er bundet til bindemidlet i den anden del af det faste bærelag, hvorved mængden af indikator til stede i den tredje del af det faste bærelag forøges.

Følgelig kan en kvantitativ analyse gennemføres ved at man bestemmer den indikator, 30 der er tilbage i den anden del af det faste bærelag, og/eller som strømmer ind i den tredje del af det faste bærelag ved kapillarvirkningen, og sammenligner en sådan DK 174727 B1 5 detekteret mængde af indikator i den anden og/eller den tredje del med en standardkurve med henblik på at bestemme mængden af analysand i prøven. Således kan i en analyse bestemmelsen af indikator og/eller analysand være enten kvalitativ eller kvantitativ.

5 I det sammensatte analyseformat bliver indikatoren fortrinsvis båret på en indikatordel af det faste bærelag, som er forskelligt fra den første del af det faste bærelag. Liganddelen af indikatoren er bundet til analysanden, hvor bindemidlet i den anden del af det faste bærelag er specifikt for analysanden. Den første del af det første bærelag 10 bliver bragt i berøring med prøven indeholdende analysanden, og indikatordelen af det faste bærelag bliver gennemvædet for at få såvel indikatoren som analysanden til at strømme ved kapillarvirkningen hen til bindemidlet båret af den anden del af bærelaget. Mængden af indikator, der bliver bundet til analysanden, er direkte proportional med mængden af analysanden i prøven, og såvel indikator bundet til analysanden som 15 enhver ubunden indikator strømmer ved kapillarvirkningen til den anden del af det faste bærelag. I den anden del af det faste bærelag bliver analysanden bundet til det ubevægelige bindemiddel, der er specifikt for analysanden, hvorved den ubundne indikator (indikator, der ikke er bundet til analysanden, som er bundet til det ubevægelige bindemiddel) ved kapillarvirkningen strømmer til den tredje del af det 20 faste bærelag. Indikatoren på den tredje del af det faste bærelag kan detekteres som et mål for tilstedeværelsen og/eller mængden af analysanden i prøven.

I et sammensat analyseformat af typen "ja eller nej" er mængden af indikator, der bliver anvendt på den første del af det faste bærelag, såvel som mængden af bindemiddel på 25 den anden del af det faste bærelag sådan, at ved tilstedeværelsen af en detekterbar mængde af analysanden strømmer der i alt væsentligt ingen detekterbar indikator ind i den tredje del af det faste bærelag. 1 et sammensat analyseformat er mængden af bindemiddel, der bliver anvendt på den 30 anden del af det faste bærelag, en sådan mængde, at i alt væsentligt hele analysanden, der er mistænkt for at være til stede i prøven, bliver bundet til bindemidlet på den DK 174727 B1 6 anden del.

Det faste bærelag, der bliver anvendt i analysen, er et, som er i stand til at absorbere analysanden fra prøven, og som, når det bliver gennemvædet, tilvejebringer en strøm af 5 analysand og indikator ved kapillær tiltrækning fra den første del og gennem den anden del ind i den tredje del af det faste bærelag. Desuden er det faste bærelag et, som er i stand til at bære indikatoren og bindemidlet. Som repræsentative eksempler på egnede faste bærelag kan nævnes: Glasfiber, cellulose, nylon, tværbundet dextran, forskellige kromatografiske papirer, nitrocellulose osv. Et særligt foretrukket materiale er 10 nitrocellulose.

Det faste bærelag er fortrinsvis udformet i form af en strimmel med den første, den anden og den tredje del anbragt på strimmelen i samme plan på en sådan måde, at materiale ved kapillær tiltrækning kan strømme fra den første del og gennem den anden 15 del til den tredje del. Skønt den foretrukne udformning er i form af en strimmel, kan enhver anden af et bredt udvalg af udformninger eller former anvendes, så længe som udformningen og formen muliggør separate dele med henblik på opfyldelse af de forskellige funktioner, som er beskrevet ovenfor.

20 Den indikator, der blev anvendt i analysen som angivet ovenfor, består af en liganddel og en detekterbar mærkedel, der er forbundet med liganddelen. Det detekterbare mærke i den detekterbare mærkedel kan være en hvilken som helst af et stort antal detekterbare mærker; imidlertid er det detekterbare mærke i overensstemmelse med en foretrukken udførelsesform et, som tilvejebringer en farveændring i den anden og/eller 25 tredje del af det faste bærelag, som enten er en synlig farveændring eller en farveændring, der kræver et instrument til at detektere ændringen i farve. I overensstemmelse med en foretrukken udførelsesform tilvejebringer det mærke, der anvendes, et farveskifte i den anden og/eller tredje del af det faste bærelag, som er synligt uden brug af et instrument. F.eks. kan et sådant farveskifte tilvejebringes ved 30 anvendelse af et enzym som det detekterbare mærke og ved anvendelse af et substrat for enzymet i den tredje del af det faste bærelag, hvilket substrat tilvejebringer et DK 174727 B1 7 synligt detekterbart farveskifte, når det bringes i berøring med enzymet. Alternativt kan det detekterbare mærke være substratet, og den tredje del af det faste bærelag kan være forsynet med enzymet, hvorved der fremkommer detekterbart farveskifte i den tredje del, når man bringer enzymet i berøring med substratmærket. Som repræsentative 5 eksempler på andre detekterbare mærker, som kræver eller ikke kræver et instrument til detektering af et farveskifte, kan der nævnes forskellige chromogener, såsom fluorescerende materialer, absorberende farvestoffer og lignende. Som angivet i det følgende er en foretrukken mærkedel i en konkurrenceanalyse en lille blære, der inkluderer en detekterbar markør, hvor den detekterbare markør er en, som er synlig.

10

Liganddelen af indikatoren er afhængig af analyseformatet. Hvis analysen er en konkurrenceanalyse, så er liganddelen af indikatoren enten analysanden eller en passende analog dertil. En passende analog betyder, at analogen til liganden også er specifik bundet af bindemidlet for analysanden. Hvis analyseformatet er en analyse af 15 en sammensat art, så er liganddelen af indikatoren en ligand, som er specifikt bundet af analysanden eller af et antistof, som er specifikt bundet af analysanden.

Det bindemiddel, som er anvendt i analysen, er et, som i det mindste binder analysanden. Som angivet ovenfor, hvis analyseformatet er et analyseformat af 20 konkurrencetypen, så binder bindemidlet også liganddelen af indikatoren.

Som det er almindeligt kendt, kan bindemidlet, hvis analysanden er et antigen eller en hapten, være enten et naturligt forekommende bindemiddel eller et antistof, som er specifikt for analysanden (enten et polyclonalt og/eller monoclonalt antistof). Hvis 25 analysanden er et antistof, kan bindemidlet være enten et antigen, der er specifikt for antistoffet, eller et antistof, som specifikt binder antistofanalysanden.

Bindemidlet kan være båret af det faste bærelag på en måde, som gør bindemidlet ubevægeligt; f.eks. ved adsorption, kovalent kobling osv. Fremgangsmåden til at gøre 30 bindemidler ubevægelige på et bærelag er almindelig kendt teknik.

DK 174727 B1 8

Indikatoren er, når den er båret af den første del af det faste bærelag, båret på en sådan måde, at når den første del bliver gennemvædet, strømmer indikatoren ved kapillarvirkningen. Således kan indikatoren f.eks. være absorberet på den første del af bærelaget.

5 I overensstemmelse med en særlig foretrukken udførelsesform for nærværende opfindelse er indikatoren i en konkurrenceanalyse sammensat af en ligand, der er forbundet med en lille blære, hvilken lille blære indeholder en detekterbar markør, hvor markøren bliver båret på det faste bærelag. Ansøgeren har fundet, at det er muligt at bære en sådan indikator på et fast bærelag af den art, der er beskrevet ovenfor, og at en 10 sådan indikator vil strømme ved kapillarvirkningen, når det faste bærelag bliver gennemvædet med en prøve, der indeholder eller er mistænkt for at indeholde en analysant.

De små lipide blærer (liposomer), som bliver anvendt, kan fremstilles ud fra et stort 15 antal lipider, inklusive phospholipider, glycollipider, og som repræsentative eksempler kan nævnes lecithin, spingomyelin, dipalmitoyllecithin, distearoylphosphatidylcholin osv. De amphilitiske lipider anvendt til fremstilling af liposomer har i almindelighed en hydrofil gruppe, såsom en phosphat-, carboxyl-, sulfat- eller aminogruppe, og en hydrofob gruppe, såsom mættede og umættede alifatiske hydrocarboner og alifatiske 20 hydrocarbongrupper substitueret med en eller flere aromatiske eller cykl oal i fati ske grupper. De vægdannende forbindelse til frembringelsen af liposomeme kan endvidere inkludere en steroid komponent, såsom cholesterol, cholestanol og lignende. Forbindelserne til frembringelse af liposomer er almindelig kendt teknik, og yderligere detaljer i den henseende skønnes ikke nødvendige for en fuldstændig forståelse af 25 nærværende opfindelse.

Liposomeme kan være fremstillet ved fremgangsmåder, der er almindelig tilgængelig teknik. F.eks. kan liposomeme være fremstillet ved en omvendt fasefordampningsteknik, hvori den eller de forbindelser der bliver benyttet til fremstillingen af 30 liposomeme, indledningsvis bliver opløst i en organisk fase efterfulgt af tilsætning af en vandig fase og under dannelse af en homogen emulsion. Efter dannelse af DK 174727 B1 9 emulsionen bliver det organiske opløsningsmiddel fordampet med henblik på at danne et gelagtigt materiale, og en sådan gel kan omdannes til en liposom ved omrøring eller dispersion i et vandigt medium.

5 Fremgangsmåder til fremstilling af liposomer er beskrevet f.eks. i U.S. patenterne nr.

4.241.046 og nr. 4.342.826 samt international patentansøgning PCT nr. WO 80-01515.

Hvis et materiale skal indkapsles i liposomen, kan et sådant materiale blive indkapslet i liposomen ved, at man inkluderer materialet i den vandige opløsning, i hvilken 10 liposomen bliver dannet. Alternativt kan materialet være indkapslet i en tidligere dannet tom liposom (uden materiale, der skal indkapsles) ved fremgangsmåden beskrevet i U.S. ansøgning nr. 659.200, indleveret 13. september 1984.

Liposomeme kan også være fremstillet ved fremgangsmåderne beskrevet i U.S. patent 15 nr. 4.522.803.

Det materiale, som er fanget eller indkapslet i liposomen (materialet befinder sig i den vandige afdeling eller i membrandobbeltlaget i liposomen, er en detekterbar markør, såsom farvestoffer, radioidentifikationer, fluorescerende materialer, kemisk 20 luminescerende materialer, elektroniske svingningsresonansmaterialer og lignende; substrater til detekterbare markører og lignende. Alternativt kan liposomen være deriveret med en detekterbar markør i stedet for at have omsluttet en markør i liposomen.

25 Liposomen er deriveret med en ligand med henblik på at frembringe en indikator. Liposomen kan være deriveret med en ligand ved kendte fremgangsmåder, såsom covalent kobling, delivering eller aktivering osv. Ved deri vering af liposomeme med en ligand kan en forbindelse eller forbindelser benyttet ved dannelsen af liposomen deriveres med liganden før dannelsen af liposomen, eller alternativt kan liposomen 30 deriveres med liganden efter dannelsen af liposomen. Fremgangsmåder til delivering af liposomer med ligander og egnede kobtingsmidler til fremstilling af deriverede DK 174727 B1 10 liposomer er kendte, og ingen yderligere detaljer i denne henseende skønnes nødvendige for en fuldstændig forståelse af nærværende opfindelse.

Ved anvendelsen af en foretrukken indikator, i hvilken den detekterbare markørdel 5 består af en liposom, der inkluderer en detekterbar markør til brug i en konkurrenceanalyse, kan analysen gennemføres som beskrevet ovenfor med generel henvisning til et antal indikatorer, bortset fra at indikatoren inkluderer en liposom som den detekterbar markørdel i indikatoren.

10 I en speciel foretrukken udførelsesform er en indikator benyttet i analysen en ligand, der er forbundet med et særligt mærke, som er synligt. Det særlige mærke kan være et metal eller en metallegering (f.eks. kolloidalt guld) eller en sæk, især en liposom indeholdende et synligt farvestof. Markøren, der fortrinsvis er inkluderet i sækken, er et farvestof eller et andet materiale, som er synligt uden lysering af sækkene.

15

Indikatoren bestående af liganden og det særlige mærke kan også fremstilles ved mærkning af liganden med en vandig dispersion af et hydrofobt farvestof eller pigment eller af polymert nuklein belagt med et sådant farvestof eller pigment.

20 Sådanne mærker er beskrevet mere detaljeret i U.S. patent nr. 4.373.932. Indikatorerne fremstillet i overensstemmelse med dette patent kan også anvendes som indikatorer i nærværende opfindelse.

Som angivet i det forannævnte patentskrift er de farvede organiske forbindelser, som 25 bliver benyttet som mærker, i form af en hydrofob sol, hvilke hydrofobe organiske farvestoffer eller pigmenter er uopløselige i vand eller kun i en meget lille udstrækning opløselige.

Det synlige specielle mærke kan være synlige polymerbare partikler, såsom farvede 30 polystyrenpartikler, fortrinsvis med sfærisk form.

DK 174727 B1 11

Som repræsentative eksempler på andre specielle mærker, der kan anvendes ved fremstillingen af en indikator til brug i analysen ifølge opfindelsen, i hvilken indikatoren ville være synlig, kan nævnes ferritin, phycoerythriner eller andre phy-cobiliproteiner; bundfældede eller uopløselige metaller eller metallegeringer; 5 svampeagtige, algeagtige eller bakterielle pigmenter eller derivater, såsom bakterielle chlorofyler; plantematerialer eller afledte metalsoler og lignende materialer. I en sådan udformning er i det mindste den del af produktet, der indeholder bindemidlet, dannet af et materiale, der har et overfladeareal, som er i stand til at bære bindemidlet i en sådan mængde, at den indikator, der er bundet i en sådan del, er synlig. I almindelighed er 10 overfladearealet i stand til at bære bindemidlet i en koncentration på mindst 1 pg/cm2 og især i en koncentration på mindst 10 ug/cm2. Et specielt foretrukket materiale er nitrocellulose. Sådanne materialer og indikatorer er beskrevet i U.S. patentansøgning nr. 579.667, indleveret 14. februar 1984.

15 I det følgende beskrives opfindelsen nærmere med henvisning til den ledsagende tegning, hvor figuren skematisk viser en nedstikningspind ifølge opfindelsen.

20 På tegningen er der vist en strimmel, der inkluderer en første del A, på hvilken der bæres en indikator, og en anden del B, på hvilken der bæres et bindemiddel, og en tredje del D, hvori indikatoren kan bestemmes. Som specielt vist findes der en del C mellem delene B og D for tilvejebringelse af en adskillelse mellem delene B og D, hvorved delen til bestemmelse af indikatoren er adskilt et stykke fra delen indehol-25 dende bindemidlet. 1 et konkurreneanalyseformat, hvor man anvender et enzym som et detekterbart mærke, ville delen A indeholde liganden mærket med enzymet, hvor liganddelen var analysanden eller en egnet analog deraf; delen B ville indeholde et bindemiddel, der 30 var specifikt for analysanden og liganddelen i indikatoren; og delen D ville indeholde et substrat for enzymet, som samvirker med enzymet om at tilvejebringe et farveskifte.

DK 174727 B1 12 I brug ville delen A på strimmelen 10 blive bragt i berøring med en prøve indeholdende analysanden, hvorved delen A ville blive gennemvædet med prøven. Indikatoren i delen A såvel som prøven ville ved kapillarvirkning blive transporteret til delen B, hvor 5 indikatoren og analysanden konkurrerer om bindingerne på bindemidlet. Ubundet indikator og ubunden analysand bevæger sig ved kapillarvirkning gennem delen C til delen D, hvor enhver indikator samvirker med substratet i delen D om at tilvejebringe et farveskifte. Som angivet ovenfor kan analysen være en ja-nej analyse eller en kvantitativ analyse, og detekteringen af indikatoren i delen D er afhængig af den 10 anvendte analyse.

I det tilfælde, hvor indikatoren har et detekterbart mærke, som ikke kræver et yderligere stof til bestemmelse, ville delen D ikke kræve et yderligere stof, dvs. delen D ville også være tom. Hvis således f.eks. indikatoren inkluderede en liposom, der har 15 et farvestof som et detekterbart mærke, så kan indikatoren bestemmes uden medvirkning af et yderligere stof i delen D. Alternativt, hvis det f.eks. var nødvendigt at frigøre det detekterbare mærke fra liposomen, ville delen D indeholde et egnet lyseringsmiddel, såsom et enzym eller en detergent, der lyserer liposomer til frigørelse af mærket fra liposomen i delen D med henblik på detektering af indikatoren.

20

Endvidere er det også muligt at bestemme indikatoren i delen C ved eller uden at bestemme indikatoren i delen D. F.eks. kunne tilsættes et substrat til delen C i det tilfælde, hvor mærket er et enzym.

25 Produktet kan anvendes som en nedstikningspind. Alternativt kan en prøve overføres til Delen A. Følgelig kan genstanden benyttes i enten en vandret eller lodret orientering.

Opfindelsen er anvendelig til detektering og/eller måling af et stort antal analysander, såsom droger, inklusive terapeutiske droger og rusgifte; hormoner, vitaminer, proteiner, 30 inklusive antistoffer af alle typer, peptider; steroider; bakterier; svampe; virus; parasitter; komponenter eller produkter af bakterier, svampe, virus eller parasitter; DK 174727 B1 13 allergener af alle typer; produkter eller komponenter af normale eller syge celler osv.

Som specielle eksempler kan nævnes T4; T3; digoxin; hcG; insulin; theophyllin; luteiniserende hormoner; organismer, der forårsager eller er forbundet med forskellige sygdomstilstande, såsom feberfremkaldende streptokokker (gruppe A), Herpes Simplex 5 I og II, cytomegalovirus, chlamydiae, rubella antistof osv.

Opfindelsen vil blive yderligere beskrevet ved hjælp af følgende eksempel.

Eksempel 10

Nedstikningspinde blev konstrueret ved, at man først coatede 0,5 x 8 cm strimler af polystyren med Scotch®nr. 969 selvklæbende overføringstape (3M, St. Paul Minnesota 55144). Zone B bestående af et 0,5 x 0,5 cm kvadrat af en 5 pm-poret nitrocellulose (S&S, Keene, New Hampshire) blev plettet med 3 μΐ af affinitetsrenset kanin anti-15 Gruppe A Streptokok antigener og så blokeret med 3% kvægserumalbumin. Efter tørring blev den overført til den tapebelagte side af nedstikningspinden, tilnærmelsesvis 1 cm fra bunden af pinden. En strimmel filterpapir på 0,5 x 6,5 cm (Whatman 3 mm) blev påsat lige oven over og i berøring med nitrocellulosen på de steder, der er angivet ved zonerne C og D. Zone A bestående af tørt Sephadex G50 finpul veri seret 20 (Pharmacia) blev så påført.

Detektorliposomer pakket med sulforhodamintørstof blev fremstillet ved fremgangsmåden beskrevet i O'Connel et al. (Clin. Chem. 31:1424 [1985]). De blev covalent koblet med det affinitetsrensede kanin anti-Gruppe A Streptokok antigen.

25

Detektorliposomeme blev pådryppet (2 μΐ) Zone A, 0,5 cm fra bunden og lufttørret. Liposomeme er i en 0,05 M Tris buffer, pH 6,8, indeholdende 2% glycerol, 0,05% dimethylsulfoxid og 20 m M EDTA.

30 Gruppe A Streptokok organismerne blev indhøstet fra dyrkningsplademe, udvasket med salt (0,9% NaCl) og indstillet til 1 x I09 organismer/ml. En aliquot (0,1 ml) DK 174727 B1 14 indeholdende 1 x 108 organismer blev udsat for salpetersyrling-mikroekstrak-tionsmetoden med henblik på at blotlægge Gruppe A carbohydratantigenet. Denne metode består i at blande 0,3 ml af en 0,1 M HC1 med 40 μΐ 4M NaN02, at tilsætte dette til Streptokok organismerne og efter 3 minutter neutralisere med 40 ul af en 1M 5 Tris base. For at lette ekstraktionen og analysen med nedstikningspinden indeholder saltsyren og den efterfølgende fortyndingsvæske 0,1% Tween-20 non-ionisk detergent.

Under anvendelse af det ekstraherede antigen blev en fortyndingsserie fremstillet rækkende fra 8 x 106 organismer/ml til 1,25 x 105 organismer/ml. Aliquoter af disse 10 fortyndinger (0,5 ml) blev anbragt i 12 x 75 mm prøvebeholdere, og en ned- stikningspind blev placeret i væsken i hver prøvebeholder. Når væsken indeholdende det ekstraherede antigen suges op i pinden, bærer den liposomdetektoren forbi stedet med det fastholdte antistof. Ved tilstedeværelsen af antigenet, som binder til stedet med det fastholdte antistof, bindes også nogle af liposomeme, hvilket resulterer i 15 tilsynekomsten af en rød plet i zone B. Resten af liposomeme og antigenopløsningen passerer ind i zonen D.

Analysen kan aflæses ved, at man observerer den laveste koncentration af organismer, der resulterer i en rød plet i zone B. Resultaterne af dette eksempel er givet i følgende 20 tabel og indikerer et sluttal på 5 x 105 organismer/ml, tæt ved den krævede følsomhed for en direkte halspodningsdiagnose for Gruppe A Streptococcus pharyngitis.

Gruppe A Streptokok Antigen (organismer/ml) x 10'5 80 40 20 10 5 2,5 1,25 0 + + + ++ -- -(+) = positiv indikation for antigen (rød plet) (-) = negativ indikation for antigen (ingen rød plet).

Nærværende opfindelse er fordelagtig ved, at der er tilvejebragt et produkt og en 25 fremgangsmåde, som let kan anvendes til at gennemføre en analyse. Produktet og DK 174727 B1 15 fremgangsmåden kræver ingen tilsætning af indikator, idet indikatoren er inkluderet i produktet. Desuden er produktet og fremgangsmåden egnet til at benyttes ved en hurtig analyse.

5 Disse og andre fordele vil ud fra den heri indeholdte beskrivelse være åbenbar for fagfolk på området.

Talrige modifikationer og variationer af nærværende opfindelse er mulig i lyset af den ovenfor givne beskrivelse, således at opfindelsen kan udøves på anden måde end den 10 specielt beskrevne

Claims (8)

1. Analyseindretning til bestemmelse af tilstedeværelse eller fravær af en analysand 5 i en flydende prøve, omfattende: a) en teststrimmel med mindst en første og en anden del, som er arrangeret på strimmelen i det samme plan på en måde, således at materiale ved kapillær tiltrækning kan flyde fra den første del til den anden del; 10 b) idet den første del har en indikator, som bevægeligt er støttet deri, hvor indikatoren omfatter en ligand, som er specifik for analysanden, når indretningen er konfigureret til et sammensat analyseformat, og som er analysanden eller en analog deraf, når indretningen er konfigureret til et konkurrenceanalyseformat, konjugeret til 15 en ikke-opløselig, partikelformig markør, og som er stedet for tilsætning af prøven; c) idet den anden del immobiliseret deri har et bindemiddel, som er specifik for analysanden, når indretningen er konfigureret til et sammensat analyseformat, og som er specifik for analysanden og liganden, når indretningen er konfigureret til et 20 konkurrenceformat; idet bindemidlet er til stede i en mængde, således at indikator, som er bundet i en sådan del, er synlig.

2. Indretning ifølge krav 1, hvor den detekterbare, partikelformige markør er farvet liposom eller farvet polymer-perle. 25

3. Indretning ifølge krav 2, hvor den partikelformige markør er farvet polystyrenperle.

4. Indretning ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, hvor analysanden er et 30 antistof, og hvor liganden er et antigen. DK 174727 B1 17

5. Indretning ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, hvor analysanden er et antigen og liganden er et antistof.

6. Indretning ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, som indbefatter en 5 tredje del nedstrøms i forhold til den anden del, og som er i kapillar strømningsforbindelse med den anden del.

7. Indretning ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor den anden del af teststrimmelen omfatter nitrocellulose. 10

8. Ettrins-fremgangsmåde uden vask til bestemmelse af tilstedeværelse eller fravær af en analysand i en flydende prøve, omfattende trinnene: a) tilsætning af en flydende prøve til den første del af indretningen ifølge et hvilket 15 som helst af de foregående krav; b) i tilstrækkelig tid at gøre det muligt for væsken at blande sig med indikatoren og for indikator-analysand-blandingen at strømme til den anden del af indretningen ifølge krav 1; og 20 c) aflæsning af resultatet ved detektering af tilstedeværelse eller fravær af den synlige, partikel formige, detekterbare markør i den anden del.