DK170283B1

DK170283B1 - Ascorbat-2-polyphosphatforbindelser og fremgangsmåde til deres fremstilling

Info

Publication number: DK170283B1
Application number: DK092987A
Authority: DK
Inventors: Paul A Seib; Ming-Long Liao
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1985-06-25
Filing date: 1987-02-24
Publication date: 1995-07-24
Also published as: DE3676671D1; DK92987D0; ES556503A0; PH22988A; FI870763A; FI870763A0; FI82835C; SG56193G; DK92987A; EP0229154A1; IS3109A7; WO1987000172A1; CA1246593A; JPH0521114B2; FI82835B; US4647672A; EP0229154B1; ES8707220A1; JPS63500240A; IS1304B6

Description

i DK 170283 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte ascorbat-2-polyphosphatforbindelser samt en fremgangsmåde til fremstilling deraf.

Ascorbat-2-polyphosphatforbindelserne ifølge opfindel-5 sen er ejendommelige ved, at de har formlen I

CH-OH

I 2

x—c—Y

n\==// Q Γ ° 9 15 N)-f—0—F--0-F-O-A5 A—A Α,-A O-A4 1 L -q 20 hvor X og Y er forskellige og hver især betyder hydrogen eller hydroxy, q er 1-4, og Αχ, A2, A3, A4 og A5 hver især betyder hydrogen eller en saltdannende kation.

Den foretrukne forbindelse ifølge opfindelsen er L-ascorbat-2-triphosphat med formlen 25 c|2oh

HCOH

^0. (la) 30 fvv * f~\ i ? j f .

35 A" A" Γ 2 DK 170283 B1 •r som har vist sig at være en hidtil ukendt, stabil form for vitamin C, og som kan fremstilles og udvindes til lavere » pris end kendte, stabile former for vitamin C, såsom mono-phosphatformen L-ascorbat-2-phosphat.

5 L-Ascorbinsyre og D-isoascorbinsyre er to stereo- isomere ascorbinsyrer med 6 carbonatomer, hvilke syrer har mange anvendelser i pharmaceutica, fødevarer til dyr og mennesker og en mangfoldighed af mindre betydende produkter. Anvendeligheden af L-ascorbinsyre stammer hoved-^ sageligt fra dens vitamin C-aktivitet, dens evne til at virke kraftigt reducerende og dens lave toksicitet, medens anvendelsen af D-isoascorbinsyre afhænger af dens evne til at virke kraftigt reducerende og dens lave pris sammenlignet med L-ascorbinsyre. Anvendelsen af D-isoascorbinsyre *5 i fødevarer til dyr og mennesker er begrænset på grund af dens lave vitamin C-aktivitet og dens antagonistiske virkning på absorptionen af L-ascorbinsyre i fordøjelseskanalen. Eftersom L-ascorbinsyre reducerer oxygen, går vitaminet ofte tabt, når det kommer i kontakt med luft under be- 9 0 handling og opbevaring af fødevarer til dyr og mennesker.

Ved langtidsopbevaring i et surt medium, især i varme, ødelægges L-ascorbinsyre også af en anden proces, som indebærer dehydratisering af molekylet. Derfor har ernæringseksperter og fødevareforskere længe søgt efter en form

p C

for vitamin C, som er stabil mod luft og syre, især mod luft.

To metoder er tidligere blevet anvendt til forøgelse af ascorbinsyres stabilitet, nemlig indkapsling af de faste krystaller af L-ascorbinsyre og kemisk substitution af den en-diol-funktionelle gruppe på molekylet. Fedtind-kapslede former for vitamin C har adskillige ulemper. Jo større de krystaller af L-ascorbinsyre, som overtrækkes, er, jo vanskeligere er det at fordele det overtrukne vita- 35 3 DK 170283 B1 0 min i en fødevare til dyr eller mennesker, især hvis fødevaren er findelt. På den anden side gælder, at jo mindre krystallerne af L-ascorbinsyre er, jo mindre perfekt er 5 indkapslingen. Typisk overtrækkes krystaller på 250-300 μια med 15-50% tilsat fedtstof. Under behandling af fødevaren til dyr eller mennesker kan det beskyttende fedtovertræk smeltes bort fra eller gnides af krystallerne. Indkapslede partikler er overtrukket med triglycerider, som smelter 10 ved 50-60°C, eller med voks, såsom caranauba, som smelter ved ca. 85°C. Det er sandsynligt, at caranaubaovertrukket L-ascorbinsyre ikke er fordøjelig, og at den derfor er utilgængelig for dyr. L-Ascorbinsyre er også blevet indkapslet med polymere, som langsomt opløses til frigivel-15 se af vitamin C. Under behandling af fødevarer til dyr eller mennesker kan disse typer af overtrukne former give væsentlige tab af vitaminet.

Kemisk modificerede former for L-ascorbinsyre omgår problemerne med stabilitet, partikelstørrelse og bio-20 logisk tilgængelighed af overtrukne former. De kemisk modificerede former er stabiliseret imod oxygen ved substitution af 2- eller 3-hydroxylgruppen i L-ascorbinsyre.

Eksempler på disse derivater omfatter 2- eller 3-methyl-estrene, 2-sulfatesteren, 2-phosphatesteren og 2,2-bis-25 -(L-ascorbyl)-phosphatesteren. Af disse eksempler er det blevet vist, at 2-phosphatesteren af L-ascorbinsyre er en aktiv form for vitamin C i aber og sandsynligvis i andre primater, såsom mennesker (L. J. Machlin et al., Am. J.

Clin. Nutr. 32, 1979, side 325). 2-Sulfatesteren er ikke 30 en aktiv kilde for vitamin C i marsvin og aber (L. J.

Machlin, Am. J. Clin. Nutr. 29, 1976, side 825), men den er det i fisk og muligvis i krebsdyr (J. E. Halver et al., N. Y.

Acad. Sci. 258, 1975, side 81). Methylestrene er kun ca.

35 0 4 DK 170283 B1 5% aktive i marsvin (P. W. Lu et al., J. Ag. Food. Chem.

32, 1984, side 21).

L-Ascorbat-2-phosphat (ASMP) har været kendt siden 1961, da det første gang blev beskrevet af italienske 5 forskere (E. Cutolo og A. Larizza, Gazz. Chim. Ital. 91, 1961, side 964). Andre forskere har siden da forbedret den kemiske syntese af L-ascorbat-2-phosphat, således at 86% af magnesiumsaltet kan isoleres i en næsten ren form uden chromatografisk rensning ved at gå ud fra L-ascor-10 binsyre (US patentskrift nr. 4.179.445). Fremgangsmåder til fremstilling af 2,2-bis-(L-ascorbyl)-phosphat giver kun moderat gode resultater (ca. 30% udbytte, C. H. Lee et al-, Carbohydrate Res. 67, 1978, side 127), men vitamin C-aktiviteten af diascorbylphosphatet er ukendt.

15 L-Ascorbat-2-pyrophosphat (L-ascorbat-2-diphos- phat) er blevet fremstillet ved omsætning af phosphor-oxychlorid med 5,6-0-isopropyliden-L-ascorbinsyre i en blanding af vand, acetone og pyridin (H. Nomura et al.,

Chem. Phar. Bull., Japan, 17, 1969, side 381). Pyrophosphat-20 esteren er blevet fremstillet i et udbytte på kun 5%, og den har måttet renses fra tre andre reaktionsprodukter ved anvendelse af ionbytterchromatografi. Det lave udbytte og den vanskelige rensning gør L-ascorbat-2-pyrophos-phat til en upraktisk kilde for stabilt vitamin· C til 25 kommercielle formål.

Den foreliggende opfindelse er baseret på erkendelsen af en hidtil ukendt, stabil form af ascorbinsyre, nemlig ascorbat-2-polyphosphat (ASPP) og de tilsvarende salte deraf, f.eks. alkalimetal- eller ammoniumsalte, 30 skønt praktisk taget enhver, saltdannende kation kan anvendes.

35 5 DK 170283 B1

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af de her omhandlede ascorbat-2-polyphosphatforbindelser er ejendommelig ved, at en eventuelt C5- og/eller C6-beskyttet forbindelse med formlen II 5

<j:H20H

X-C-Y

,<2> O* hvor X, Y og Aj_ er som defineret ovenfor, omsættes med et 15 opløseligt salt af metaphosphorsyre i en vandig opløsning ved en pH-værdi på mindst 9, hvorefter eventuelle beskyttelsesgrupper fjernes.

Ved den omhandlede fremgangsmåde dannes der en reaktionsblanding indeholdende respektive mængder af den even-20 tuelt C5- og/eller Cg-beskyttede forbindelse med formlen II,* et vandopløseligt salt af metaphosphorsyre, vand og tilstrækkelig base til at give blandingen en pH-værdi på mindst ca. 9. Derefter får blandingen lov at reagere i et tidsrum, som tillader, at polyphosphoryleringsreaktionen 25 skrider frem, f.eks. fra 1-24 timer eller fortrinsvis i 1-12 timer. Under denne omsætning holdes reaktionsblandingens pH-værdi imidlertid over ca. 9, sædvanligvis ved periodisk tilsætning af base. Det polyphosphorylerede produkt kan anvendes direkte, eller spiselige salte deraf kan let udvin-30 des ved anvendelse af kolonnechromatografi.

Ved den mest foretrukne fremgangsmåde fremstilles L-ascorbat-2-triphosphat (ASTP) ved omsætning af L-ascor-binsyre (til at begynde med en 1 molær opløsning) med to ækvivalenter natriumtrimetaphosphat i vand ved 32-35°C i 35 nærværelse af kalium- eller natriumhydroxid i en mængde, som er tilstrækkelig til at holde reaktionsblandingens pH-værdi på et niveau fra 10,5 til 12 under hele reak- 0 6 DK 170283 B1 tionsperioden. Mere detaljeret er ascorbinsyreforbindel-sen fortrinsvis udvalgt fra den gruppe, som består af ascorbinsyre, alkali- og jordalkalimetalsalte af ascorbinsyre, tertiære aminsalte af ascorbinsyre og derivater af 5 ascorbinsyre, hvori der på Cg er en basestabil blokeringsgruppe. Eksempler på denne sidstnævnte type forbindelser er 5,6-acetal- og 5,6-ketalderivater af ascorbinsyre, såsom 5,6-O-benzyliden-L-ascorbinsyre og 5,6-0-isopropyli-den-L-ascorbinsyre. I den særligt.foretrukne udførelsesform 10 for opfindelsen er ascorbinsyrereaktanten udvalgt fra

den gruppe, som består af de fire stereoisomere af forbindelsen med formlen XII

15

H2-jj —°H

Q— C—M

(III) 20 H-C^\ 0==0 1—c/ / ΌΗ Z--u n 25 hvor Z er udvalgt fra den gruppe, som består af hydrogen, alkalimetallerne, jordalkalimetallerne og de tertiære 30 aminer, n er valensen af Z, og Q og M er forskellige og udvalgt fra den gruppe, som består af hydrogen og hydroxy, samt forbindelser med formlen iv 35 7 0 DK 170283 B1 5 H2-C-Ck

x Y

B-C-0^ (IV) 10 H-^ \ c * o /°ia:a=:=:d^

z.-<f OH

15

hvor er udvalgt fra den gruppe, som består af hydrogen, alkalimetallerne, jordalkalimetallerne og de tertiære ami-20 ner, n·^ er valensen af Z^, og Y betyder cycloalkyl med 5-7 carbonatomer eller en gruppe med formlen V

/‘ 25 C (V)

Xr2 hvor betyder hydrogen, phenyl, furfural eller alkyl- grupper med 1-4 carbonatomer, og R2 betyder hydrogen 30 eller alkylgrupper med 1-4 carbonatomer.

Phosphoryleringsmidlet er et salt af metaphosphor- syre, M (P0,~) , som er en cyclisk polyphosphatanion med a ^ y en negativ ladning y, en ringstørrelse på 2y atomer, og M er en metalion, hvis kationiske ladning neutraliserer 35 phosphatets negative ladning. Når y er 3, er phosphoryle- 0 8 DK 170283 B1 ringsmidlet det let tilgængelige trimetaphosphat, dvs.

\/°

5 . / X

I I/O- 7V< 10

Andre individuelle typer metaphosphatsalte omfatter tetra-, penta- og hexametaphosphatsalte. Et stort antal blandede metaphosphater er mulige. De Særligt foretrukne salte er alkalimetalsaltene, såsom natrium- eller kalium-15 metaphosphat, selv om andre salte kan anvendes.

Reaktanterne blandes fortrinsvis i et vandigt opløsningsmiddel, som ikke griber ind i den ønskede poly-phosphoryleringsreaktion. Vand er det særligt foretrukne reaktionsmedium. Tilstrækkelig base tilsættes, fortrins-20 vis red mellemrum under reaktionen, til opretholdelse af reaktionsblandingens pH-værdi på mindst ca. 9 under hele omsætningen mellem komponenterne. Hvis pH-værdien er for lav, er dannelseshastigheden for ASPP langsom, medens de stærkt koncentrerede hydroxidioner, 25 hvis pH-værdien er for høj (over ca. 13), vil reagere med metaphosphatreagenset, i stedet for at dette reagerer med ascorbatet. Meget høj basicitet ødelægger således phos-phoryleringsmidlet. Desuden begynder,ved en pH-værdi på over ca. 12, et biprodukt at akkumulere i reaktionsblan-30 dingen, således som det fremgår af et ekstra absorptionsbånd ved 313 nm i slutreaktionsblandingens ultraviolette (UV) spektrum. Under en pH-værdi på 12 er slutreaktions-produktets UV-spektrum i alt væsentligt et enkelt absorptionsbånd med et absorptionsmaksimum ved 258 nm. Af disse 35 grunde er derfor det særligt foretrukne .reaktions-pH-værdi-område fra ca. 10 til ca. 12,5, især fra ca. 10,5 til 12, 0 9 DK 170283 B1 hvor der er tale om triphosphorylering.

Den base, som sættes til reaktionsblandingen, bør være praktisk taget blandbar dermed, have en passende basestyrke til opnåelse af den ønskede pH-værdi for reak-5 tionen og ikke bevirke udfældning af metaphosphatreagen-set. Baser bestående af alkalimetalhydroxiderne foretrækkes .

Til forøgelse af produktionen af ASPP bør reagensernes koncentration reguleres i en vis udstrækning. Når 10 pH-værdien reguleres med natrium- eller kaliumhydroxid, bør begyndelseskoncentrationen af ascorbinsyre eller dets derivat (IV) være fra ca. 0,5 til 4 M, medens det molære mængdeforhold mellem metaphosphat og ascorbat bør være fra ca. 1,5 til 3. Ved den særligt foretrukne fremgangsmåde 15 til fremstilling af ASTP bør disse intervaller være 0,75--1,5 M med et molært mængdeforhold på 1,5-3.

Den øvre temperaturgrænse for reaktionen udvælges til minimering af tabet af ascorbinsyre under reaktionen, til minimering af biproduktet med UV-absorption ved 313 20 nm og til maksimering af UV-absorptionen af det ønskede ASPP ved 258 nm. Den nedre temperaturgrænse er dikteret af længden af den reaktionsperiode, som er nødvendig til opnåelse af høj omdannelse af ascorbatet til phosphatesteren. I brede træk er temperaturintervallet til fremstil-25 ling af L-ascorbat-2-triphosphat 20-80°C med et foretrukket interval på 25-55°C. Til fremstilling af 2-phosphory-leret ascorbinsyre ud fra et metaphosphat med højere molekylvægt end trimetaphosphatet stiger temperaturen noget med metaphosphatets molekylstørrelse. Med 30 hexametaphosphat er reaktionstemperaturen f.eks. 50-80°C. Reaktionen gennemføres sædvanligvis under udelukkelse af luft for at undgå oxidativ ødelæggelse af ascorbinsyre-udgangsmaterialet.

Den reaktionstid, som er nødvendig til opnåelse af 35 høje udbytter af ASPP, afhænger af temperatur, pH-værdi og koncentration af reaktanter. En høj pH-værdi, en høj o 10 DK 170283 B1 temperatur og en høj koncentration af reaktanter begunstiger korte reaktionstider. Når f.eks. 1,0 M L-ascorbinsyre omsættes med 2,0 M natriumtrimetaphosphat ved en pH-vær-di på ca. 11 ved 55°C, er praktisk taget alt L-ascorbin-5 syre omsat i løbet af 1 time. Ved anvendelse af samme betingelser, bortset fra at temperaturen er indstillet på 33°C, er 8 timer nødvendig til omsætning af alt L-ascor-bat. Når 1 M ascorbinsyre omsættes med 2 M trimetaphos-phat ved 35°C og en pH-værdi på ca. 11 eller ca. 10, er 10 der efter 8 timers forløb blevet iagttaget en 2-phos-phorylering på hhv. 93% og 33%.

Efter at polyphosphoryleringsreaktionen er afsluttet, indstilles reaktionens pH-værdi på 3-8, fortrinsvis på en pH-værdi på 7, med en spiselig, uorganisk eller or-15 ganisk syre. Den vandige reaktionsblanding indeholder ingen skadelige opløsningsmidler eller reagenser, men den indeholder i stedet uorganiske næringsstoffer og, hvor der er tale om polyphosphatestere af L-ascorbinsyre, tillige vitamin C-aktivitet. En meget lille mængde ascorbinsyre 20 karameliseres ved reaktionsblandingens alkaliske pH-vær-di, hvilket giver en behagelig lugt og en lysegul farve.

Det antages derfor, at hele reaktionsblandingen kan sættes til fødevarer til dyr eller mennesker, med eller uden fjernelse af reaktionsvandet inden indtagelsen som næring.

25 Hvis der ønskes et ascorbat-2-polyphosphat, som er frit for uorganiske phosphatsalte, kan adskillelse og rensning let opnås ved anvendelse af ionbytterkolonne-chromatografi. F.eks. kan reaktionsblandingen, hvor der er tale om ASTP, indstilles på en pH-værdi på 8,5 ved om-30 røring med en stærkt sur kationbytterharpiks i hydrogen-ionformen. Kationbytterharpiksen fjernes hurtigt ved filtrering, og blandingen sættes til toppen af en kolonne af en stærkt basisk anionbytterharpiks i bicarbonat-formen. Eluering med 0,4 M ammoniumbicarbonat fjerner u-35 organiske phosphater, og eluering med 0,5 M. ammoniumbicarbonat eluerer rent ascorbat-2-triphosphat. Inddamp- o 11 DK 170283 B1 ning af afgangsvæsken fra kolonnen fjerner det meste vand og alt ammoniumbicarbonat. Derefter kan salte af ASTP med enhver ønskelig kation fremstilles ved at lede det tilbageværende ammoniumsalt af ASTP gennem en kationbytter-5 harpiks i den udvalgte kationform. Rensning af ASTP kan også opnås ved anvendelse af kolonnechromatografi med aktivt kul som beskrevet af Takeda Chem. Industries, Jpn. Kokai Tokyo Koho, JP 59 36, 539 (Chem. Abst. 101, 1984, 10695p).

10 Til rensning af andre 2-polyphosphatestre af as- corbat ud over ASTP kan det være nødvendigt at indstille koncentrationen af elueringsalt- og -baseopløsninger i forhold til dem, som anvendes for ASTP.

2-Polyphosphatestrene af ascorbinsyre kan anven-15 des til fremstilling af 2-monophosphatesteren. I det sure område ved en pH-værdi på 0-1 hydrolyseres den lineære phosphatkæde på et ascorbat-2-polyphosphat fortrinsvis mellem phosphorylrester snarere end mellem 0-2 stillingen på ascorbatet og 2-phosphorylresten. Triphosphat-20 esteren hydrolyseres til overvejende L-ascorbat-2-phos-phat og nogen L-ascorbinsyre.

Som nævnt er hovedudnyttelsen af de her omhandlede forbindelser som en stabil kilde for vitamin C, som er modstandsdygtig mod oxidation og sur eller enzymatisk hydro-25 lyse. De herudfra opnåede produkter ved omsætning af L- -ascorbinsyre kan anvendes som additiver i fødemidler til dyr eller mennesker eller i farmakologiske præparater. Produkter opnået ved omsætning af D-isoascorbinsyre kan anvendes i blanding med kontrollerede mængder af phospha-30 taseenzym til tilvejebringelse af en vedvarende tilførsel af reduktionsevne.

Det har overraskende vist sig, at ASTP er mere stabilt imod oxidation end ASMP. Desuden er L-ascorbat stabiliseret imod autooxidation af ASTP i vandigt medium ved 35 en pH-værdi på 7, sandsynligvis på grund af ASTP1 s evne til chelatering af divalente mineralioner, såsom kobber o 12 DK 170283 B1 og jern. Som sådanne udviser de hidtil ukendte forbindelser ifølge opfindelsen forbedrede stabilitetsegenskaber i sammenligning med det kendte monophosphatderivat.

Det laveste medlem af 2-polyphosphatestrene af 5 L-ascorbat fremstillet ifølge opfindelsen er 2-triphos-phatestreren, som ligner adenosintriphosphat (ATP). ATP er til stede i alle celler, det er den kemiske opbevaringsform for energi, og det deltager i utallige biokemiske reaktioner i levende organismer. Det er derfor muligt, 10 at ASTP kunne finde medicinske anvendelser, hvis ASTP an-tagoniserer funktionen af ATP i biokemiske omdannelser.

2-T.riphosphatesteren af L-ascorbinsyre er en aktiv form for vitamin C i marsvin, hvilket er vist på tegningen, og næsten med sikkerhed i alle andre dyr. Phos-15 phataseenzymer er til stede i fordøjelseskanalen i alle dyr, og dette enzym fjerner tre phosphatrester fra ASTP på trinvis måde, indtil L-ascorbinsyre er frigivet. Den trinvise fjernelse af phosphatrester fra adenosintriphosphat (ATP) med frigivelse af adenosin og uorganisk 20 phosphat af phosphatase er blevet påvist et antal gange (D. L. M. Verheydes et al., J. Am. Chem. Soc. 87, 1965, side 2257, og L. A. Heppel et al., J. Biol. Chem. 237,

1962, side 841). Det forventes derfor, at ASTP vil finde anvendelse i fødevarer til dyr og mennesker, både 25 til ernæringsmæssige og funktionelle formål. ASTP

kunne, ligesom ASMP, også anvendes til stabilisering af helblod (G. L. Moore et al., Transfusion 21, 1981, side 723) .

Tre separate hydrolytiske trin er nødvendige til 30 frigivelse af L-ascorbat fra ASTP imod kun ét trin til en sådan frigivelse fra ascorbatmonophosphat (ASMP). Der er derfor fremsat den teori, at den forøgede hydrolytiske stabilitet af ASTP i sammenligning med ASMP kan forklares af denne faktor. Den forøgede oxidative stabili-35 tet af ASTP i forhold til ASMP er imidlertid overraskende, således som det er vist i nedenstående tabel III.

13 DK 170283 B1 ASMP ødelægges fuldstændigt ved hydrogenperoxidoxidation, medens 55% ASTP bliver tilbage under samme betingelser.

Under alle omstændigheder antages det, at ASTP og andre ASPP-estere kan tilvejebringe en stabil kilde for vita-5 min C i fødevarer til dyr og mennesker, hvori ASMP syreeller enzymhydrolyseres til L-ascorbinsyre med medfølgende tab af vitamin C-aktivitet. I andre systemer indeholdende begrænsede mængder phosphatase kunne en blanding af ASMP og ASPP tilvejebringe en langsom og vedvarende frigivel-10 se af L-ascorbinsyre over et tidsrum, som er længere end for en ækvivalent mængde ASMP alene. I visse systemer kan det phosphat, som frigives ved enzymatisk hydrolyse af ASPP, være højt nok til konkurrerende inhibering af phos-phataseenzymet, således at tab af det 2-phosphorylerede 15 derivat ville formindskes og give en meget langsom frigivelseshastighed for ascorbinsyre. Det oxidative tab af vitamin C i fødevarer til dyr og mennesker indeholdende ASPP ville også forventes at være langsomt sammenlignet med fødevarer indeholdende ASMP.

20 På tegningen er vist en afbildning af et marsvine- fodringsforsøg foretaget til bekræftelse af vitamin C--aktiviteten af en foretrukket forbindelse ifølge opfindelsen, nemlig L-ascorbat-2-triphosphat.

Opfindelsen forklares nærmere ved hjælp af de efter-25 følgende eksempler.

EKSEMPEL 1

Et 250 ml bægerglas forsynes med en pH-elektrode, en magnetisk omrører, et nitrogentilledningsrør og en burette. Til bægerglasset, som er placeret i et vandbad 30 ved 33-35°C, tilsættes i rækkefølge 55 ml vand, 10 g 0 14 DK 170283 B1 (57 mmol, 1,03 M) L-ascorbinsyre og 10 M kaliumhydroxid til en pH-værdi på ca. 11,0. Natrium- eller kaliumtri-metaphosphat (95-97% rent, ca. 114 mmol) tilsættes, reaktionsblandingen gennemskylles kontinuerligt med nitrogen, 5 og pH-værdien holdes på 10,9-11,2 ved periodisk tilsætning af 10 M kaliumhydroxid. Reaktionsblandingen omrøres kontinuert og reaktionen standses efter en reaktionstid på 8 timer. Reaktionsblandingen, som har et samlet volumen på ca.

100 ml, fortyndes til et volumen på 250 ml med vand, og 10 en portion på 5,0 ml titreres øjeblikkeligt med 0,05 N vandigt iod. Iodtiteren (2,82 ml) viser 6,2% uomsat L--ascorbat. En anden portion på 2,0 ml af den fortyndede reaktionsblanding fortyndes yderligere (6250 gange) i 0,01 M natriumcarbonatpuffer til en pH-værdi på 10. Den 15 fortyndede blanding med pH-værdien 10 får lov at henstå i 2 timer, i løbet af hvilke L-ascorbatet ødelægges ved O^-oxidation som vist ved UV-afprøvning i et separat forsøg. I dette separate forsøg blandes reaktanterne uden pH-indstilling (hvilket giver en pH-værdi på ca.

20 3) , blandingen fortyndes til en pH-værdi på 10, og absorp tionen aflæst ved 258 nm og en pH-værdi på 10 er 0,004 efter henstand i 2 timer. Efter at den fortyndede tri-phosphoryleringsreaktionsblanding med pH-værdien 10 har henstået i 2 timer, er UV-absorptionen ved 258 nm 0,537, 25 hvilket viser en 2-phosphorylering af L-ascorbat på 92,3% (under antagelse af 8^ på 16 ved en pH-værdi på 10 for 2-phosphorylerede estere, se Lee et al., Carbohydrat Res. 67, 1978, side 127). Forholdet mellem UV-absorption ved 313 nm og ved 258 nm er 0,014, hvilket viser en me-30 get lille mængde biprodukt i reaktionsblandingen.

Phosphorsyre eller saltsyre sættes derefter til reaktionsblandingen til en pH-værdi på 7,0, og blandingen inddampes til et lysegult fast stof. Alternativt isoleres L-ascorbat-2-triphosphat (ASTP) i ren form ved ko-35 lonnechromatografi. Reaktionsblandingens pH-værdi (slut-volumen ca. 100 ml) indstilles til en pH-værdi på 8,5 ved 0 15 DK 170283 B1 tilsætning af en stærkt sur kationbytterharpiks (H -form), harpiksen fjernes, og blandingen fortyndes derefter til 250 ml. En portion på 40 ml fyldes på en kolonne (5 x 40 cm, 0,037-0,074 mm) af stærkt basisk anionbytter-5 harpiks i bicarbonatformen. Uorganiske phosphatsalte, påvist ved hjælp af molybdatreagens, elueres først med 0,4 M ammoniumbicarbonat ved en strømningshastighed på 1-2 ml/-minut. Derefter elueres ascorbat-2-triphosphat, påvist ved UV-absorption ved 258 nm, med 0,5 M ammoniumbicarbonat.

10 Efter kombination af fraktionerne inddampes opløsningen, til tørhed, vand tilsættes to gange, og blandingen inddampes på ny. Det sirupagtige ammoniumsalt af ASTP opløses i vand, ledes gennem en stærk sur kationbytterharpiks i natriumformen, og kolonneafgangsstrømmen inddampes til 15 et amorft fast stof. Natriumsaltet giver den korrekte 31 1 13 elementæranalyse, P-, H- og C-nmr-spektre og UV-egen-skaber i overensstemmelse med natrium-L-ascorbat-2--triphosphat.

Analyse for CgH^O^^P^Na^·2H20: 20 Beregnet: C = 13,33%, H = 2,04%, P = 17,22%, Na = 17,04%

Fundet: C = 13,19%, H = 1,83%, P = 16,73%, Na = 17,84%.

EKSEMPEL 2

En anden triphosphoryleringsreaktion gennemføres 25 som beskrevet i eksempel 1, bortset fra at udgangsmaterialet er 12,3 g af et 5,6 acetalderivat, nemlig 5,6-0--isopropyliden-L-ascorbinsyre. lodtitrering viser ca.

10% uomsat L-ascorbinsyre, og UV-absorption ved 258 nm viser 86% 2-triphosphorylering. Til fjernelse af den blo-30 kerede isopropylidengruppe behandles den fortyndede reaktionsblanding (150 ml) med en stærk sur kationbytterharpiks (hydrogenform) til en pH-værdi på 3,0. Harpiksen fjernes hurtigt ved filtrering, og fremadskriden af fjernelsen af 5,6-acetalen overvåges ved anvendelse af tyndt-35 lagschromatografi. Når acetalhydrolysen er afsluttet, indstilles blandingen til en pH-værdi på 8,0 ved anvendelse 0 16 DK 170283 B1 af natrium- eller kaliumhydroxid. Isolering af reaktionsprodukterne afsluttes som beskrevet i eksempel 1.

EKSEMPEL 3 s Triphosphoryleringsreaktionen gennemføres som be skrevet i eksempel 1, bortset fra at der anvendes D-iso-ascorbinsyre i stedet for L-ascorbinsyre. Omdannelsen af D-isoascorbinsyre til dens 2-triphosphatester sker i et udbytte på ca. 90%, og isoleringen af produktet gennemfø-10 res som beskrevet i eksempel 1.

EKSEMPEL 4 I dette forsøg varieres pH-værdien af den i eksempel 1 beskrevne triphosphoryleringsreaktion. Når 10 g L-15 -ascorbinsyre omrøres med 36,6 g (2 ækvivalenter) natrium-trimetaphosphat, er reaktionsblandingens pH-værdi ca. 3. Efter 12 timers reaktion ved 35°C er der ingen phosphoryle-ring sket, hvilket viser sig ved iodtitrering, UV-analyse og tyndtlagschromatografi. Efter 10 døgns omrøring viser 20 UV-afprøvning ved 258 nm 5% 2-triphosphorylering. Når reaktionsblandingens pH-værdi forøges og holdes på 10 i 8 timer ved anvendelse af natrium- eller kaliumhydroxid, giver iodtitrering ca. 65% uomsat L-ascorbinsyre, medens UV-absorption ved 258 nm viser ca. 33% 2-triphosphoryle-25 ring. Når reaktionsblandingens pH-værdi holdes på 12,8--13,1, giver iodtitrering 40% uomsat L-ascorbinsyre, og UV-analyse viser 52% 2-triphosphorylering. Desuden er, når reaktionen gennemføres ved en pH-værdi på 12,8-13,1, forholdet mellem UV-absorptionen ved 313 nm og ved 258 nm 30 0,12, hvilket viser dannelse af et biprodukt i reaktions blandingen. Når reaktionsblandingens pH-værdi holdes i det særligt foretrukne pH-interval på 10,5-12 ved anvendelse af natriumhydroxid, viser iodtitrering 5% uomsat L-ascorbinsyre og UV-analyse 87% 2-triphosphorylering.

35 0 17 DK 170283 B1 EKSEMPEL 5

Phosphoryleringsreaktionen gennemføres som i eksempel 1, bortset fra at koncentrationen af L-ascorbinsyre nedsættes fra 1 M til 0,5 M. Efter 8 timers reaktionstid 5 giver iodtitrering 32% uomsat L-ascorbat, medens UV-ana-lyse viser 65% 2-triphosphorylering. Når koncentrationen af L-ascorbat holdes på 1 M, men molækvivalenterne af tri-metaphosphat ændres fra 2 til 3, Kommer udbyttet af 2-tri-phosphat ikke over 93%.

10 Temperaturen af reaktionen i eksempel 1 er også blevet varieret fra 20°C til 80°C. Ved temperaturer over ca. 60°C falder udbyttet af 2-triphosphat, medens forholdet A_.~ /A 0e.0 vokser. Ved en reakt ion s temperatur på 313 nm 258 nm 20°C indeholder reaktionsblandingen efter 8 timers for-15 løb 25% uomsat udgangsmateriale og 75% 2-triphosphatester.

Det er også blevet bekræftet, at opførslen af 2--monophosphatesteren af L-ascorbat, ASMP, overfor enzymet phosphatase er forskellig fra opførslen af 2-triphos-phatesteren, ASTP. ASMP frigiver L-ascorbinsyre langt 20 hurtigere end ASTP, når de behandles med en renset phosphatase fra kartofler, jfr. tabel I. Desuden er ASTP mere modstandsdygtig overfor syrekatalyseret frigivelse af L--ascorbat, end ASMP er, se "blind"-reaktionerne i tabel I. I en puffer med en pH-værdi på 5,0 frigiver ASTP in-25 tet L-ascorbat efter 20 timers forløb sammenlignet med ca. 15% frigivet af ASMP.

30 35 0 18 DK 170283 B1

TABEL I

Enzymatisk hydrolyse af L-ascorbat-2-phosphat (ASMP) og L-ascorbat-2-triphosphat (ASTP) ved anvendelse af sur phosphatase fra kartof-5 ler. L-Ascorbat frigivet (%) under enzymolyse·*·._ _Substrat_

Reaktions- _ASMP_ _ASTP_ tid, timer Blind Phosphatase Blind Phosphatase 0,25 0 9,3 0 0 10 0,50 0 18,6 00 1.0 0 35,5 0 0 2.0 2,9 60,5 0 0 3.0 4,6 77,3 0 0,4 4.0 4,6 88,4 0 0,8 15 8,0 8,1 100 0 3,5 20,0 14,5 100 0 8,5 ^Enzymolyse gennemføres ved 25°C ved omrøring af 200 μπιοί magnesium-L-ascorbat-2-phosphat eller ammonium-L-ascor-bat-2-triphosphat i 100 ml 0,05 M acetatpuffer (pH-vær-20 di 5,0) indeholdende ca. 400 mg komprimeret bagerigær og 2 enheder phosphatase (1 enhed aktivitet hydrolyserer 1 μπιοί p-nitrophenylphosphat ved pH-værdi 4,8 og 37°C) . Efter en given reaktionstid udtages en portion på 5 ml, blandes med 5,0 ml 12% trichloreddikesyre/4% metaphos-phorsyre, og blandingen filtreres. En portion på 5 ml af filt'iråtet titreres med. 2,6-dichlorphenolindophenol til 25 lyserødt slutpunkt. Blindopløsninger indeholder alle rea genser undtagen phosphatase.

Den langt større stabilitet af ASTP i forhold til ASMP overfor phosphatase er også blevet iagttaget i et modelfødevaresystem, som det er vist i tabel II. Omrørt 30 med en fortyndet suspension af hvedemel ved 25°C er ASMP fuldstændig hydrolyseret i løbet af 1 time, medens ASTP kræver ca. 10-20 timer til en hydrolyse på 95%.

35 0 19.

DK 170283 B1

TABEL II

Enzymatisk hydrolyse af L-ascorbat-2-phosphat (ASMP) og L-ascorbat-2-triphosphat (ASTP) i nærværelse af hvedemel. L-Ascorbat frigivet (%) under enzymolyse'1'._ 5 _Substrat_

Reaktions- ASMP_ ASTP_ tid, timer Blind Phosphatase Blind Phosphatase 0,25 0 47,1 0 0 0,50 0 76,2 0 1,2 10 1,0 0 100 0 3,5 2.0 2,9 100 0 29,6 3.0 4,6 100 0 65,8 4.0 4,6 100 0 86,9 5.0 5,8 100 0 93,1 15 20,0 14,5 100 0 95,0 ^Enzymolyse og titrering af frigivet L-ascorbat gennemføres som beskrevet i fodnoten til tabel I, bortset fra at phosphatasen er den, som er til stede i hvedemel. 2 g hvedemel anvendes i 100 ml enzymolysereaktionsblanding.

20 L-Ascorbat-2-triphosphat er ca. to gange så vanskelig at oxidere som L-ascorbat-2-monophosphat. Når ASTP og ASMP behandles under identiske betingelser (pH--værdi 7, 25°C) med hydrogenperoxid i 8 døgn, forbliver 25 77% ASTP uomsat, medens der er 44% ASMP tilbage. Efter 14 døgns oxidation er der 0% ASMP tilbage sammenlignet med 55% ASTP. Stamforbindelsen, L-ascorbinsyre, ødelægges på mindre end 1 time, således som det vil ses af tabel III. Det er indlysende, at ASTP er langt mere stabilt 30 i fødevarer til dyr og mennesker, som indeholder phospha-taseenzym eller oxidanter, såsom oxygen.

35 0 20 DK 170283 B1

TABEL III

Stabilitet (% tilbage) af L-ascorbat og dets phos- phatestere ved omsætning med vandigt hydrogenperoxid'*'.

„ , .. L-Ascorbatderivat

Reaktions- -~~- 5 tid_ Stamforbindelse ASMP^ ASTP2 0/25 time 56,9 98,7 98,6 1,0 time 0 97,1 98,3 1 dag 0 93,9 96,7 3 dage 0 77,7 87,6 10 6 dage 0 64,1 83,3 8 dage 0 44,1 77,0 14 dage 0 0 55,2 '''Reaktionsblandingen indeholder 0,05 ml 30%'s vandigt 15 hydrogenperoxid og 200 μπιοί L-ascorbat eller dets 2- -phosphorylerede derivat i 100 ml 0,05 tris-puffer (pH-værdi 7,0). Efter en given reaktionstid fortyndes en portion på 1 ml af reaktionsblandingen indeholdende den 2-phosphorylerede ester 10 gange med tris-puffer ^il en pH-værdi på 7, og UV-absorptionen af blandingen aflæses ved 258 nm. For at følge tabet af L-ascorbinsyre fortyndes en portion på 1 ml af reaktionsblandingen med 20 2%'s metaphosphorsyre, og UV-absorptionen aflæses ved 245 nm.

2 ASMP = L-Ascorbat-2-phosphat; ASTP = L-ascorbat-2--triphosphat.

25 EKSEMPEL 6

Engelske, korthårede marsvin anbringes individuelt i et bur og fodres med en Purina-marsvineration under en akklimatiseringsperiode på 1 uge. De unge marsvin (190—

-250 g) deles i fire grupper med 10 dyr i hver. Den ene 30 gruppe fodres med en diæt, som er fri for vitamin C

(Reid-Briggs-marsvinediæt, U.S. Biochemicals, Cleveland,

Ohio), den anden gruppe får samme diæt, men suppleret med 5,0 mg L-ascorbinsyre pr. kg legemsvægt pr. dag, den tredie gruppe får 15,4 mg renset tetranatrium-L-ascorbat-2-tri- ; 35 phosphat-dihydrat (L-ascorbat-2-tri-P0^, renset) pr. kg legemsvægt pr. dag, og den fjerde gruppe får 15,4 mg te- 0 21 DK 170283 B1 tranatrium-L-ascorbat-2-triphosphat-dihydrat (L-ascor-bat-2-tri-PO^, reaktionsblanding) i blanding med biprodukterne i reaktionsblandingen som beskrevet i eksempel 1, bortset fra at den lille mængde uomsat L-ascorbinsyre 5 i reaktionsblandingen ødelægges ved C^-oxidation. 15,4 mg tetranatrium-L-ascorbat-2-triphosphat-dihydrat er ækvivalent med 5,0 mg L-ascorbinsyre. Vitamin C indgives oralt med en kalibreret sprøjte fra opløsninger, som holdes ved 5°C, idet dog L-ascorbinsyreopløsningen friskfremstilles 10 dagligt. Dyrenes vægt noteres dagligt, og det aritme- triske middeltal for hver enkelt gruppe er blevet beregnet og afbildet på figur 1.

Dette forsøg er beregnet på at bekræfte vitamin--C-aktiviteten af L-ascorbat-2-triphosphat i marsvin.

15 Vitamin C-aktiviteten af ASTP er indlysende ud fra de kurver, som er vist på tegningen. L-Ascorbat-2--triphosphat indgives dyrene enten i ren form (kurve betegnet L-ascorbat-2-tri-PC>4, renset) eller i blanding med alle produkterne i triphosphoryleringsreaktionsblandingen 20 (kurve betegnet L-ascorbat-2-tri-PO^, reaktionsblanding).

De grupper af dyr, som får begge disse former for ASTP, vokser med en hastighed, som er lig med hastigheden af den gruppe, som fodres med en ækvivalent mængde L-ascorbinsyre. Den gruppe dyr, som ikke får nogen supplerende 25 kilde for vitamin C, taber imidlertid vægt og vokser dårligt begyndende på omtrent den 14. dag af fodringsforsø get. De dyr, som får ASTP som kilde for vitamin C, har et fortræffeligt helbred under hele forsøget og viser ingen kliniske tegn på mangel på vitamin C.

30 EKSEMPEL 7 2-Polyphosphoryleringen af ascorbinsyre gennemføres som beskrevet i eksempel 1, bortset fra, at 1,0 M L-ascorbinsyre (begyndelseskoncentration) omsættes med 35 2,0 M natriumhexametaphosphat ved 75-80°C og en pH-værdi på 11,5-12,0. Efter en reaktionstid på 2 timer findes 42% DK 170283 B1 22 0 ; uomsat L-ascorbat (iodtitrering) og 49% 2-phosphorylering (UV-analyse). Der er således 10% af L-ascorbatudgangsma-terialet, som der ikke er gjort regning for, hvilket tyder på en vis ødelæggelse af udgangsmaterialet ved den 5 høje pH-værdi og temperatur for reaktionen.

Tyndtlagschromatografi af reaktionsblandingen foretages ved anvendelse af en fleksibel film overtrukket med cellulose. Efter pletning af reaktionsblandingen på den chromatografiske film filmkaldes chromatogrammet ved an-10 vendelse af en 30;35:15:20:0,4:5-blanding (volumen/volu-men/volumen/volumen/volumen/vægt) af vand, ethanol, iso-butanol, isopropanol, koncentreret ammoniumhydroxid og trichloreddikesyre. Ved sprøjtning af det tørrede chromatogram med en ethanolisk opløsning af ferrichlorid (1%) 15 giver reaktionsblandingen seks lyserødt-farvede komponenter. De mest intense pletter viser sig at have en mobilitet, som er lig med mobiliteten af 2-mono-, 2-di- og 2--triphosphatestrene af L-ascorbat. De højere phosphatestere af L-ascorbat giver svage lyserøde pletter.

20 25 30 35

Claims

1. Ascorbat-2-polyphosphatforbindelser, kendetegnet ved, at de har formlen I 5 ch9oh χ-ΐΛ 10 \ «> / \ i [11 i

15 O-An N>-P--0— *--o-j-0-A5 0—A 2 0—A^ Q— Jq 1 2 3 4 5 6 hvor X og Y er forskellige og hver især betyder hydrogen 2 eller hydroxy, g er 1-4, og Αχ, A2, A3, A4 og A5 hver især 3 betyder hydrogen eller en saltdannende kation. 4

2. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet 5 ved, at den er ascorbat-2-triphosphat. 6

3. Fremgangsmåde til fremstilling af ascorbat-2-poly- phosphatforbindelser ifølge krav 1, kendetegnet ved, at en eventuelt C5- og/eller Cg-beskyttet forbindelse med formlen II 30 <j?H20H X-C-Y J>=0 (II)

35 HV\ O-Ai ΌΗ DK 170283 B1 * hvor X, Y og er som defineret ovenfor, omsættes med et opløseligt salt af metaphosphorsyre i en vandig opløsning ved en pH-værdi på mindst 9, hvorefter eventuelle beskyttelsesgrupper fjernes.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendeteg net ved, at forbindelsen med formlen II vælges blandt forbindelser, hvori betyder hydrogen, et alkalimetal eller en tertiær amin eller blandt forbindelser, som er Cg-beskyttede med en basestabil gruppe.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendeteg net ved, at metaphosphorsyresaltet vælges blandt natrium-og kaliumtrimetaphosphat.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at pH-værdien er fra 10 til 12,5.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendeteg net ved, at omsætningen gennemføres ved en temperatur på fra 20 til 80°C.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at omsætningen gennemføres i et tidsrum på fra 20. til 24 timer.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at koncentrationen af forbindelsen med formlen II er fra 0,4 til 4 molær i opløsningen, idet molforholdet mellem metaphosphorsyren og forbindelsen med formlen II er 25 fra 1,5 til 3. 30