黄酮磷酸烷酯类化合物的合成和在胆固醇酯酶抑制剂药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种黄酮磷酸酯类化合物的合成方法和在胆固醇酯酶抑制剂药物中的应用。
背景技术
对天然活性物质进行结构改造是目前新药研发和新活性化合物研发的主要方向之一。黄酮是一类分布较广的次生代谢产物,这类化合物具有许多生理功能和药用价值,如抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗菌、抗HIV病毒等。目前,黄酮类化合物已成为当前植物药开发的重要宝库,为研制新药提供了丰富的先导物来源,以天然黄酮为先导化合物进行结构改造合成新药,引起了国内外学者的广泛重视,已成为黄酮类化合物药物研发的热点。
根据已有的报道,对黄酮类化合物进行结构改造可从以下几个方面着手:(1)通过酯化、醚化、酰基化等衍生化反应改变其理化性质,扩大其应用范围,同时增强活性或获得新的活性;(2)与金属离子螯合,使黄酮类化合物成为Fe2+等人体必需元素的补充剂载体,同时发挥自身的生理活性;(3)通过化学合成,使原来活性较低的相似结构变为活性高的黄酮类似物。
磷作为重要的生命元素,在农药和医药领域有着广泛的应用。有机磷化合物与生命化学息息相关,在当今的医药行业中,有机磷类药物不仅在抗肿瘤药中占有重要地位,而且在抗菌、抗病毒、强心、降压、酶抑制剂和治疗骨科疾病等领域发挥着重要作用。如何去寻找新的有生物活性的有机磷化合物已经成为当今有机磷化学研究的重要课题之一。对黄酮类化合物进行磷酰化结构改造,结合了黄酮与含磷化合物二者均具有广泛生物活性的双重优势,为新活性化合物的设计合成提供了良好的思路,有望得到具有新药开发潜能的新活性物质。
血浆中的脂质有胆固醇、胆固醇酯、甘油三酯、磷脂及游离脂肪酸等,它们以结合的形式存在于血液中,胆固醇与蛋白质结合形成胆固醇脂蛋白,极低密度脂蛋白增高甘油三酯症和胆固醇血症,低密度脂蛋白含胆固醇最高,达40~45%,它的增高可产生高胆固醇血症。III型高血脂症在血液中胆固醇含量很高。抑制胆固醇酯酶活性可以抑制胆固醇和甘油三酯的合成,对III型血脂蛋白过高症有效。目前已开发出的药物有氯贝丁酯类药物,如临床应用的复方氯贝丁酯钙片、心脉康片(氯贝丁酯丙二酯)、非诺贝特、氯贝丁酯类似物利贝特和环丙贝特、吉非贝齐等;另外还有阿托伐丁等。这些药物多为胆固醇酯酶抑制剂。但这些药物的应用都具有一定局限性,且对肝肾功能损害较严重。因此开发效果更好、副作用更小的胆 固醇酯酶抑制剂具有重要的临床应用价值。
本发明以天然黄酮为原料,开发高活性的新型胆固醇酯酶抑制剂,既可以拓展胆固醇酯酶抑制剂开发的新途径,又可以开拓天然黄酮的应用方向,提高天然黄酮的附加值和使用量。
传统方法大多以CCl4作为溶剂合成磷酸酯,但是黄酮在CCl4中溶解度通常很低,黄酮的磷酰化反应在CCl4中难以进行。本发明以DMSO、DMF、乙腈、乙醚、二氧六环、THF等极性较强的溶剂作为溶剂,DMAP作为催化剂,反应进行速度快,产率高,能顺利合成一系列黄酮磷酸酯。
发明内容
本发明的目的之一是提供一类黄酮磷酸酯类化合物,该类化合物预期具有许多生物活性,本发明者经过对该类化合物初步药理活性实验,结果表明具有良好的抑制胆固醇酯酶的作用,初步研究结果表明这类化合物存在构-效相关性;更多的生物活性正在筛选测试中。
该方法以DMSO、DMF、乙睛、乙醚、二氧六环、HMPA、THF(四氢呋喃)作溶剂,二乙胺、三乙胺等含氮碱作碱,在DMAP(4-二甲氨基吡啶)的催化作用下,将黄酮化合物与ClPO(OEt)2(氯磷酸二乙酯)反应,高产率地得到了目标产物黄酮磷酸酯类化合物,为这类化合物的合成提供了一种步骤简单、成本低、产率高、较环保的方法。
本合成方法中应用的DMAP是近年来广泛用于化学合成的新型高效催化剂,在有机合成、药物合成、染料、香料、高分子化学、分析化学中的酰化、烷基化、醚化、酯化及酯交换等多种类型的反应中有较高的催化能力。在本方法中发现其对提高合成效率和收率效果明显。国内化学制药行业已成功将DMAP应用于乙(丙)酰螺旋霉素、青蒿素琥珀酸酯、他汀类降脂药物等原料药的生产中,改善了工艺条件,并取得良好的经济和社会效益。并在PRAVASTATIN全合成中的乙酰化、TUBERCIDIN全合成中的三氟乙酰化、MUGINEICACID全合成中的乙酰化和TERPESTACIN全合成中的苯甲酰化,以及西地那非(VIAGAR)全合成中的酰化等反应中进行应用;在农药胺菊酯的合成中用DMAP提高了收率和产品纯度,在异氰酸酯合成氨基甲酸酯、菊酰氯合成拟除虫菊酯的反应中也有明显的催化活性。DMAP在本发明的黄酮磷酸酯的合成中,催化作用非常明显。应用该方法合成的化合物通过小鼠体内试验,具有很好的降低体内低密度胆固醇酯蛋白的作用。
本发明提供的黄酮磷酸酯类化合物具有如下分子式:
其中,X、Y、Z可以分别为H、OH、OP(O)(OEt)2。
本发明提供的黄酮磷酸酯类化合物合成方法如下:
式中式中A、B、C可以分别为H或OH;X、Y、Z可以分别为H、OH、OP(O)(OEt)2。
具体包括以下步骤:
称取一定量的黄酮1、4-二甲胺基吡啶(DMAP)于干燥的圆底烧瓶中,加入一定量的溶剂充分搅拌溶解,然后依次加入一定量的碱和ClPO(OEt)2(氯磷酸二乙酯),所得反应液在0-120℃下反应2-48h,直到反应物基本反应完(薄层层析(TLC)检测),停止反应。反应液用约1倍体积的乙酸乙酯稀释,然后依次用0.5mol/L的HCl、5%(W/V)碳酸钾溶液、饱和氯化钠溶液洗涤,加无水硫酸钠干燥,过滤,减压除去溶剂得粗产物,粗产物经柱层析或重结晶后得纯化合物。
上述步骤所述的催化剂优选为DMAP,溶剂为极性溶剂,如DMSO、DMF、乙腈、乙醚、二氧六环、HMPA、THF等,碱试剂为三乙胺(Et3N)、二乙胺(Et2NH)、吡啶(Py)等含氮碱,磷酯化试剂为ClPO(OEt)2(氯磷酸二乙酯),反应时间为2-48h,反应温度在0-120℃之间。产物的分离纯化先用乙酸乙酯稀释,然后依次用酸、碱和饱和氯化钠水溶液洗涤,收集乙酸乙酯层,用无水硫酸钠干燥,减压浓缩得粗产物,粗产物经柱层析或重结晶后得纯化合物。
上述合成反应具有高度的化学选择性和高反应效率,以较高产率制备了一类结构新颖的黄酮磷酸酯类化合物。
所述本发明提供的黄酮磷酸烷酯类化合物在胆固醇酯酶抑制剂中的应用:
胆固醇酯酶为猪胰腺胆固醇酯酶(pCE),底物为对硝基苯基丁酸酯(PNPB),都是从Sigma公司购买的。根据Hosie法测试黄酮类化合物对胆固醇酯酶的抑制活性,胆固醇酯酶的活性通过监测底物PNPB的水解速率而测定,测试温度保持在25.0±0.2℃。所有的反应在含有NaCl(0.1M)和乙腈(1.5%体积)的磷酸钠缓冲液(0.1M,pH 7.04)中进行。pCE预先 溶解在高纯水中,底物PNPB和备选化合物抑制剂预先溶解在色谱纯乙腈中,在-20℃保存。测试时以移液枪吸取定量的酶液和抑制剂溶液,稀释在缓冲液中,在25.0±0.2℃下恒温15分钟,然后用移液枪加入定量的PNPB溶液使反应开始,在405nm波长的紫外-可见分光光度计上监测酶水解底物的速率1分钟,每次测试重复两次或三次,以没有抑制剂的反应体系为平行控制。根据Lineweaver-Burk双倒数曲线来分析pCE的抑制动力学,计算重复两次或三次测试结果的平均值。
所述本发明提供的黄酮磷酸烷酯类化合物在降低体内低密度胆固醇酯蛋白的应用:
动物房温度空调控制在室温,取小鼠30只,在动物房适应饲养1周,自由摄食普通饲料,将小鼠随机分成3组,每组10只分两笼喂养,将3组随机抽取,分别为空白对照组、模型组和治疗组,每组10只。空白对照组喂市上购买的普通饲料;模型组喂以下配方的高脂饲料:玉米粉33.5%、鱼粉5.0%、胆固醇2.0%、牛奶粉4.0%、猪油10%、黄豆16.7%;治疗组喂以上高脂饲料,同时按每10mg/kg加喂下列方法合成的化合物2a,连续喂养8周。8周后3组小鼠同时用乙醚麻醉后,经腹主动脉采血取样并处死取血清,应用经典测定方法“匀相法”测定血清中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量,用SPSS14.0进行统计分析。
本发明的优点表现在:
1)以DMAP作为催化剂,催化性能优良,反应条件温和,反应速度快,耗时短,转化效率高,反应产生的酸可用有机碱或无机碱中和;
2)用DMSO、DMF、乙腈、乙醚、二氧六环、HMPA、THF(四氢呋喃)等极性溶剂,与用CCl4的传统方法相比,能大大提高反应物的溶解性,提高反应物的溶解量和浓度,从而提高了产率,并适用多种黄酮磷酸酯类化合物的合成,适合于大规模生产的应用;
3)以三乙胺、二乙胺等含氮碱作为碱试剂,可提高反应产物收率和产品质量,并简化合成工艺;
4)以ClPO(OEt)2作为磷酯化试剂,能够合成一系列黄酮磷酸酯类化合物;
5)副反应少,气味小,三废少;
6)产物纯化步骤少,过程和工艺简单,纯化效率高,产物纯度高,能得到高纯度产物或直接得到结晶,分离纯化成本较低,适合大规模生产的需求;
7)获得了高胆固醇酯酶抑制活性的化合物。
附图说明
图1:化合物2a的H-NMR曲线图。
图2:化合物2a的C-NMR曲线图。
图3:化合物2a的P-NMR曲线图。
具体实施方式:
通过下述实施例将有助于进一步理解本发明,但不用于限制本发明的内容。
实施例一:
称1a(715.6mg,2.5mmol)、DMAP(1.8326g,15mmol)于干燥的150mL圆底烧瓶中,在搅拌下加入THF(30.0mL),充分溶解后慢慢滴加入Et3N(2.80mL,20mmol)。量取CIP(O)(OEt)2(2.5883g,15mmol),用THF(20.0mL)稀释,在室温下反应24h。加入反应体系总体积约1倍体积的乙酸乙酯稀释,然后分别用0.5mol/L的HCl、用5%(w/v)碳酸钾溶液、饱和氯化钠溶液洗涤、清水洗涤。乙酸乙酯层(产物层)用无水硫酸钠干燥,然后再减压浓缩干燥,得黄色液体1.8753g,产率为90.3%,经NMR、MS、IR、UV光谱分析,该产物为2a。
实施例二:
氮气保护下,在干燥的50mL圆底烧瓶中加入1b(302.1mg,1.0mmol),DMAP(1.2217g,10.0mmol)。在搅拌下加入HMPA(10.0mL),充分溶解后缓慢滴加入Et2NH(1.1mL,10.7mmol),量取ClP(O)(OEt)2(1.7255g,10.0mmol),用HMPA 5.0mL稀释,在0℃下反应40h以上,加乙酸乙酯稀释,依次经0.5mol/L HCl溶液、5%(w/v)K2CO3水溶液、饱和NaCl水溶液和清水洗涤后,加无水Na2SO4干燥,过滤,减压蒸去溶剂,得黄色黏稠液体817.3mg,产率83.2%,经NMR、MS、IR、UV光谱分析,该产物为2b。
实施例三:
氮气保护下,在干燥的150mL圆底烧瓶中加入1c(635.6mg,2.5mmol),DMAP(0.9163g,7.5mmol),在搅拌下加入DMSO(30.0mL),充分溶解后缓慢滴加入吡啶(0.61mL,7.5mmol),量取ClP(O)(OEt)2(1.2941g,7.5mmol),用DMSO(20.0mL)稀释,在120℃下反应2h,加乙酸乙酯稀释,依次经0.5mol/L HCl溶液、5%(w/v)K2CO3水溶液、饱和NaCl水溶液和清水洗涤后,加无水Na2SO4干燥,过滤,减压蒸去溶剂,得黄色放射状固体,该产物用无水乙醚/正己烷处理得到淡黄色(近白色)固体1.1344g,产率86.2%,经NMR、MS、IR、UV光谱分析,该产物为2c。
实施例四:
氮气保护下,在干燥的25mL圆底烧瓶中加入1d(50.8mg,0.2mmol),DMAP(122.2mg,1.0mmol),在搅拌下加入乙腈(即CH3CN,4.0mL),充分溶解后缓慢滴加入Et3N(0.14mL,1.0mmol),量取CIP(O)(OEt)2(172.6mg,1.0mmol),用乙腈(1.0mL)稀释,再缓慢滴加入。在40℃下反应28h后,过滤,除去生成的铵盐,减压蒸去溶剂,加入一定量水,用乙酸乙酯萃取3次,合并有机相,加无水Na2SO4干燥,过滤,减压蒸去溶剂,剩余物柱层析(CH2Cl2∶石油醚=2∶1,每100mL石油醚加入2.4mL冰醋酸),得85.8mg黄色粉末状固体,产率81.5%,经NMR、MS、IR、UV光谱分析,该产物为2d。
实施例五:
氮气保护下,在干燥的25ml圆底烧瓶中加入1e(120.4mg,0.5mmol),DMAP(183.2mg,1.5mmol)。在搅拌下加入DMF(6.0mL),充分溶解后缓慢滴加入Et3N(0.14mL,1.0mmol).量取ClP(O)(OEt)2(258.8mg,1.5mmol),用DMF(4.0ml)稀释,再缓慢滴加入。室温反应20小时,加乙酸乙酯稀释,依次经0.5mol/L HCl溶液、5%(w/v)K2CO3水溶液、饱和NaCl水溶液和清水洗涤后,加无水Na2SO4干燥,过滤,减压蒸去溶剂,得黄色黏稠液体,该产物用5%(w/v)K2CO3水溶液,加入适量乙酸乙酯,室温搅拌1小时,处理得到淡黄色粉末状固体137.6mg,产率73.5%,经NMR、MS、IR、UV光谱分析,该产物为2e。
实施例六:
氮气保护下,在干燥的25mL圆底烧瓶中加入1e(127.1mg,0.5mmol),DMAP(183.2mg,1.5mmol),在搅拌下加入1,4-二氧六环(6.0mL),充分溶解后缓慢滴加入Et3N(0.14mL,1.0mmol),量取ClP(O)(OEt)2(258.8mg,1.5mmol),用1,4-二氧六环(4.0mL)稀释,再缓慢滴加入。在80℃反应20h,加乙酸乙酯稀释,依次经0.5mol/L HCl溶液、5%(w/v)K2CO3水溶液、饱和NaCl水溶液和清水洗涤后,加无水Na2SO4干燥,过滤,减压蒸去溶剂,得黄色黏稠液体,该产物用5%(w/v)K2CO3水溶液,加入适量乙酸乙酯,室温搅拌1h,处理得到淡黄色粉末状固体206.6mg,产率78.5%,经NMR、MS、IR、UV光谱分析,该产物为2f。
表1实施例黄酮磷酸酯的合成及其胆固醇酯酶抑制活性一览表
表2化合物2a降低小鼠体内低密度胆固醇酯蛋白(LDL-C)含量的结果
组别 |
对照组 |
模型组 |
治疗组 |
小鼠只数 |
8 |
10 |
9 |
LDL-C含量 |
0.23±0.16 |
0.52±0.09 |
0.28±0.14 |