DK168079B1 - Fremgangsmaade og medium til forlaenget opbevaring af roede blodlegemer - Google Patents

Description

DK 168079 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår konservering af røde blodlegemer i i det væsentlige fysiologisk naturlig tilstand. Nærmere bestemt angår den foreliggende opfindelse et hidtil ukendt suspensionsmedium til opbevarelse af humane røde blod-5 legemer ved ca. 4eC i en tilstand, der er egnet til blodtrans fusion. Det hidtil ukendte suspensionsmedium ifølge opfindelsen gør det muligt i væsentligt omfang at forøge lagringstiden for de røde blodlegemer sammenlignet med, hvad der hidtil har været muligt.

10

Opbevaring eller konservering af røde blodlegemer i et suspensionsmedium ved ca. 4°C ifølge standard-blodbank-procedure er velkendt. Så vidt det er ansøgerne bekendt, er der ingen litteraturreferencer, der rapporterer virkningerne af hverken hy-15 potonisk suspension eller tilsætningen af indtrængende salte, f.eks. ammoniumsalte, med hensyn til levedygtigheden for de lagrede røde blodlegemer.

Det er imidlertid iagttaget, at humane røde blodlegemer under 20 fortsat afskølet lagring underkastes en formændring med udvik ling af spikier, der til sidst kan skyde knopper til dannelse af små vesi kier. Dette reducerer det røde bl og 1 egernes overf 1a-deareal og gør det formentligt mindre fleksibelt og mindre i stand til at passere igennem filtreringssystemet i milten. 25 Dette fører igen til fjernelse af blodlegemer fra kredsløbet inden for få minutter efter en transfusion. Acceptable standarder for transfusionsdygtige røde blodlegemer kræver, at mindst 75¾ af blodlegemerne stadig forbliver i cirkulation 24 timer efter transfusion.

30

Den foreliggende opfindelse overvinder de begrænsninger og problemer, der er forbundet med den tidligere kendte proces. Det blev udtænkt, at forøgelse af blodlegemernes overfladespænding ved osmotisk opkvældning teoretisk ville have ten-35 dens til at foregribe udviklingen af spikier. Der blev derfor udviklet et suspensionsmedium med passende relativ osmolaritet og membranpermeabi1 itet, som kunne konservere de røde blodle- 2 DK 168079 B1 gemer ved 4°C i forlængede tidsrum i en tilstand velegnet til transfusion i overensstemmelse med de standarder, der er fastslået for transfusion af røde blodlegemer (RBCer). Relativ osmol ari tet er den samlede osmolaritet for det opløste som ikke pene-5 trerer cellen og derfor kontrollerer cellerumfanget. Det viste sig, at indføjelse af visse indtrængende forbindelser, såsom ammoniumsalte, fortrinsvis NC4C1 og CH3COONH4 i et suspensionsmedium ikke blot undgår de skadelige virkninger af lav io-nisk koncentration, men også giver visse positive fordele, som 10 vil blive beskrevet mere fuldstændigt nedenfor.

Det er således formålet med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe et suspensionsmedium for røde blodlegemer, som i væsentligt omfang forøger lagringstiden for de suspenderede 15 røde blodlegemer ved ca. 4eC, mens de lagrede røde blodlege mers transfusionskvalitet bevares.

Det er endvidere formålet med den foreliggende opfindelse, at tilvejebringe en fremgangsmåde til opbevaring af røde blodle-20 gemer ved 4eC i tidsrum, der er længere end det er muligt ved konventionelle metoder, mens sådanne opbevarede røde blodlegemers velegnethed til transfusion til mennesker bevares.

Andre formål og fordele ved fremgå af efterfølgende beskrivel-25 se af opfindelsen.

Disse og andre formål, træk og mange af de medfølgende fordele ved opfindelsen vil forstås bedre efter læsning af følgende detaljerede beskrivelse i forbindelse med den vedlagte teg-30 ning, på hvilken fig. 1 viser ATP-indho1 det i humane røde blodlegemer (procent af oprindelig værdi) som funktion af lagringstiden ved 4°C i forskellige suspensionsmedier, og 35 fig. 2 viser den procentuelle overlevelse in vivo af humane røde blodlegemer efter opbevaring i forskellige tidsintervaller ved 4°C i forskellige suspensionsmedier.

3 DK 168079 B1

Uden derved at skulle være bundet til nogen særlig teori eller forklaring antages det, at en forøgelse af blodlegemernes overfladespænding ved osmotisk opkvældning kan være nødvendig for at forebygge udviklingen af uønskede spikier i de røde 5 blodlegemer under afkølede opbevaring heraf i konventionelle suspensionsmidler. Blodlegemerne suspenderes derfor i et medium, der er 180-220 relativt mOsm (mi 11iosmolært) , især i et medium der er ca. 200 relativt mOsm. Suspensionsmediets pH-værdi holdes i området fra ca. 6,8 til ca. 7,2, fortrinsvis om-10 kring 7,0. Da dette indebærer en reduktion af den ioniske kon centration, hvilket kunne føre til en forøget membranpermeabi-litet, opretholdes blodlegemernes normale ioniske koncentration ved hjælp af en unik sammensætning under anvendelse af bestemte indtrængende, ioniserbare salte i suspensionsmediet, 15 fortrinsvis blandt sådanne salte som ammoniumacetat og ammo- niumchlorid i en koncentration på 10-200 mM, fortrinsvis i en koncentration på ca. 50 mM. Naturligvis kan der også med fordel anvendes andre egnede kationer end ammonium og andre egnede anioner end acetat og chlorid, når blot sådanne salte 20 opfylder den foreliggende opfindelses kriterier og formål. Et eksempel på et sådant salt er methylamin-amin-hydrochlorid. De andre bestanddele i suspensionsmediet er sådanne, der konventionelt anvendes og omfatter kaliumphosphat, mannitol, adenin, okseserumalbumin, inosin, pyruvat, kaliumcitrat og glucose i 25 passende koncentrationer, f.eks. kan koncentrationen af glucose være 80-150 mM, mannitol 30-80 mM, kaliumcitrat 6-90 mM, adenin 1-5 mM. Koncentrationerne af monobasisk og dibasisk kaliumphosphat indstilles til at opretholde pH-værdi-en ved ca. 6,8 til ca. 7,2 og den relative osmolaritet i suspen-30 sionsmediet ved 180-220 mOsm.

Betegnelsen "væsentligt forlænget" eller "udvidet" opbevaring og lignende betegnelser betyder simpelthen, at der opnås levedygtig konservering eller opbevaring af røde blodlegemer i et 35 tidsrum, der er større end det, der er muligt ved anvendelsen af hidtil kendt blodbank-procedure og konventionelle suspensionsmedier .

4 DK 168079 B1

En typisk sammensætning af suspensionsmediet ifølge opfindelsen omfatter en vandig opløsning indeholdende:

glucose 110 mM

5 mannitol 55 mM

kaliumcitrat 7,9 mM

dibasisk kaliumphosphat 25,8 mM

monobasisk kaliumphosphat 14,7 mM

adenin 2 mM

10 ammoniumchlorid 50 mM

Andre sådanne sammensætninger kan let fremstilles, så længe pH-værdien er ca. 7,0 og den relative osmolaritet er i området omkring 200 mOsm.

15

Røde blodlegemer, der er blevet adskilt fra deres plasma ved det normale forløb af komponentfremsti 11 ing, gensuspenderes i et tilnærmelsesvis lige så stort rumfang af dette suspensionsmedium. Blodlegemesuspensionen opbevares derpå ved 4°±2°C

20 i overensstemmelse med standard-blodbank-procedurer, som er beskrevet i "Clincal Practice of Blood Transfusion" red.: Petz & Swisher, Churchi11-Livingston publishers, N.Y., 1981, som inkorporeres heri ved henvisning. Kapitel 11, side 281 i denne reference viser levedygtighedsdata for røde blodlegemer, der 25 er bevaret ved konventionel teknik.

Når der opbevares i et suspensionsmedium ifølge opfindelsen, er der en voksende stigning i adenosintriphosphat (ATP) over de første 4-5 ugers lagring. ATP-niveauer har tendens til at 30 være korreleret med overlevelse af røde blodlegemer efter transfusion. Ved fire uger ligger ATP-niveauerne fra 115% til så højt som 250% med et gennemsnit på 165% af den oprindelige værdi. ATP-niveauet falder derefter støt under yderligere lagring, idet det når den oprindelige værdi omkring 11 uger og 35 falder til 50% af den oprindelige værdi efter ca. 16 uger.

Tabel I viser koncentrationer af forskellige komponenter og opløste materialer i suspensionsmedier, hvori røde blodlegemer DK 168079 B1 5 blev opbevaret i op til 16 uger. Det bemærkes, at opløsning nr. 20, som er det foretrukne suspensionsmedium ifølge opfindelsen, opretholder ATP i røde blodlegemer på et højere niveau i længere tid end nogen af de andre afprøvede opløsninger som 5 vist på fig. 1.

10 15 20 25 30 35 6 DK 168079 B1 I Γ''· i—I HHHHHHHHi—I /—JHrHr—ίΗι—I \X) Η i—i Η Ή |T{ I S, ·>» th I r^-oo r- Π - OM O oooo ooooooooooooooo Φ E OCN1 H HHHrI ririHHHrtHHHrlrlOHHrl

'gj rj| m «s* ro nnmm tMoiMromnnr^oiCNf'jocscNCN

nj

0) O C U

P <C W <C ·Η

Ό Ui S <Λ Η CM

C CQ Q CQ 3 > (C in cm

dP dP dP C dP

. 00 (N 00 -H 10 ? tJl h s •Η O in 'a' o o o in o o c K * in tn o m o o

q Z o in H N

•H

ti o

Sm ^ JJ 'S' ooooooo r· K in in in o h in o

g) Z NiOrMHH

o c , 0 3

ly* P

^ P -P oooooo oo 1 >i3MMnnmm mm H O* > U ··

O H

^ i + 4J * m O c oooooo ooo .j-jrg C-h rnnmcnnn m m m 0) r-i H in

> O

k "S

i-S i C

m Ό -Η ΗΗΗΗΗΗΝΟΙΜΝΝΝΝΜΝΙΝΝΝΝΜΜΜΝΝΝΝ &>-h « c ω H +> Ό Φ _ O Ό ,_|3 O Γ" Γ^Γ'Γ'ΐ^^'ΐ^Γ'Γ'^Γ^Γ^Γ'Γ-'η'Γ'Γ^ r- r- r-~ . I _n^ Af ^ »»·»*>·» φ 53 *H HHHriHHHHHHHHrJHHHfOcNlHHHrl d) Ό & λ & σ>

Π3 PC

En -H _ tW tf ^ ^ O oo COCOCOCOCOCOOOCOCOCOCOCOCOCOCOOO CO 00 CO 00 Λ p4 ^ ^ ^ ^ ^ γώ,Ι) æ inoooininininininininLninminininintnmioinininin

g q, (N «N^r,3,'l,r'J(NilMnJrMrMniCNnJ(NCMnjCNJCMnJCNlOHCMCNCNCN

-H O ^

P

Π3 G>

> O

rt) -H

j-i i, ti lOlOlDVDlDlDlOlOlDlDOOlOlOlOlOOOCn Ο (Τι σ\ σι *Q^ H V I ** s

Qg -P 'S'HHHCOCOCOCOCOCOCOr-~r--COCOOOOOCOl''I'- ΟΙ Γ" r- S ι-H r^'i'^'S'ininininininin in in m m in f- tH tr> « 0 •Η φ PH i

rQ H

it g C oooininininininininmininininininin ininininin η,,ΐ! CH oooinininininininininininwinininin minminm

3 O rH HH

c e* -Η Φ C T3 in φ Η X I 0) o,m 3» in ininoooooooooooooooooooo

r\ r\. H 0 in ininHHHHHHHHHHHrlHHHHriHHH

tjt O *—1 i—i i—i i—i i—{ *—i *—! i—I HHHHHHHHHHHH

tn

·$. tn H C

CM-h *—t cm n’cj' ιηΐΒηωσιοΗηιπ'ίΐηιο>οσιοΗΜΗ'ίιηΐίΐ OC ΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗΝηΠΜΝΙΝηΐΠ DK 168079 B1 7

Fig. 1 viser ATP-værdier efter 4, 8, 10, 12, 14 og 16 uger for blodlegemer suspenderet i a) en isotonisk opløsning af kaliumcitrat, phosphat, mannitol, glucose og adenin svarende til opløsning nr. 7 i tabel I; b) den samme opløsning som (a) med 5 tilsat ammoniumacetat svarende til opløsning nr. 14 i tabel I; c) den samme opløsning som (a) med en del af kaliumcitratet fjernet for at gøre den hypotonisk svarende til opløsning nr. 12, tabel I,· d) denne samme opløsning som (c) med til sæt ni ng af ammon i umacetat svarende til opløsning nr. 13 i tabel I; og 10 e) den samme hypotoniske opløsning som (c) med tilsætning af ammoniumchlorid svarende til opløsning nr. 20 i tabel I. Resultaterne viser, at der er fordele både ved hypotonicitet og ved tilsætning af ammoniumsalte. Fordelene ved hypotoniciteten kan være forbundet med udsættelse af spikeldannelsen, men 15 grunden til stigningen i ATP-niveauerne er ukendt. Den meka nisme, hvormed ammoniumsaltene øger ATP, når de inkorporeres i suspensionen, er ligeledes ukendt.

Fig. 2 viser overlevelsesttallene in vivo efter 24 timer for 20 røde blodlegemer opbevaret i opløsning (c) i perioder op til 125 dage.

Det kan bemærkes, at det er usandsynligt, at en hypotonisk blodlegemesuspension, som indeholder ammoniumchlorid ville væ-25 re acceptabel til transfusion. Det anbefales derfor, at blod legemerne før transfusion bør sedimenteres ved centrifugering, og derefter gensuspenderes i en transfusionsdygtig opløsning, hvorefter der kan foretages transfusion.

30 Hæmolyse af røde blodlegemer opbevaret i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse er fra ca. 0,3 til 3,8%.

35

Claims (10)

1. Suspens i onsmedi um til forlænget opbevar i ng af røde bl odie- 5 gemer ved ca. 4°C, kendetegnet ved, at det i det væsentlige består af 80-150 mM glucose, 30-80 mM manni tol, 6-90 mM kaliumcitrat, 1-5 mM adenin og 10-200 mM af et indtrængende salt i en vandig opløsning, med en pH-værdi på ca. 6,8 til ca. 7,2 og en relativ osmolaritet på 180-220 mOsm, 10 hvori de røde blodlegemer kan opbevares på levedygtig måde.

2. Fremgangsmåde til konservering af røde blodlegemer i forlængede tidsrum ved ca. 4°C, k e n d e t e g n e t ved, at man suspenderer blodlegemerne i et medium, der i det væsent- 15 lige består af 80-150 Mm glucose, 30-80 mM mannitol, 6-90 mM kaliumcitrat, 1-5 mM adenin og 10-200 mM af et indtrængende salt i en vandig opløsning, med en pH-værdi på ca. 6,8 til ca. 7,2 og en relativ osmolaritet på 180-220 mOsm, hvorved de røde blodlegemer kan opbevares på levedygtig måde. 20

3. Suspensionsmedium ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det indtrængende salt er valgt fra gruppen bestående af ammoniumchlorid og ammoniumacetat.

4. Suspensionsmedium ifølge krav 3, kendetegnet ved, at det indeholder 110 mM glucose, 55 mM mannitol, 7,9 mM kaliumcitrat, 2 mM adenin og 50 mM ammoniumchlorid eller ammoniumacetat.

5. Suspensionmedium ifølge krav 4, kendetegnet ved, at pH-værdien holdes på ca. 7,0 ved indstilling af pH med passende mængder af monobasisk eller dibasisk kaliumphosphat.

6. Suspensionsmedium ifølge krav 5, kendetegnet 35 ved, at dets relative osmolaritet er ca. 200 mOsm.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det indtrængende salt er valgt fra gruppen bestående af ammo- DK 168079 B1 9 niumchlorid og ammoniumacetat.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det anvendte suspensionsmedium indeholder 110 mM glucose, 5 55 mM mannitol, 7,9 mM kaliumcitrat, 2 mM adenin og 50 mM am~ moniumchlor id eller ammoniumacetat.

8 DK 168079 B1 Patentkrav.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at mediets pH-værdi holdes på ca. 7,0 ved indstilling af pH-vaer- 10 dien med passende mængder af monobasisk eller dibasisk kalium- phosphat,

10. Fremgangsmådem ifølge krav 9, kendetegnet ved, at mediets relative osmolaritet er ca. 200 mOsm. 15 20 25 30 35