CN110907642A

CN110907642A - 一种快速检测犬细小病毒抗原、抗体的试剂盒及方法

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Publication number: CN110907642A
Application number: CN201911214079.7A
Authority: CN
Inventors: 杨瑞梅; 单虎; 黄娟; 张洪亮
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2019-12-02
Filing date: 2019-12-02
Publication date: 2020-03-24

Abstract

本发明公开了一种快速检测犬细小病毒抗原、抗体的试剂盒，包括白瓷板，猪红细胞悬浮液、猪红细胞贮存液和样品稀释液；猪红细胞悬浮液为PBS缓冲液中添加0.1‑1.2mg/mL牛血清白蛋白；猪红细胞贮存液为葡萄糖、氯化钠、甘露糖等组成的溶液，其中含体积分数为5‑8％的猪红细胞；样品稀释液pH为6.1‑7.0。并且公开了使用该试剂盒进行犬细小病毒抗原、抗体检测的方法。本发明使用健康猪红细胞和白瓷板进行HA和HI试验，15‑30min即可判定结果，快速定性、定量，特异高，简易，经济，易于在基层推广应用。

Description

一种快速检测犬细小病毒抗原、抗体的试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及病毒检测领域，更具体的说是涉及一种快速检测犬细小病毒抗原、抗体的试剂盒及方法。

背景技术

犬细小病毒(Canine Parvovirus，CPV)属细小病毒科，细小病毒属，最早从患肠炎的病犬粪便中分离获得的，在粪便中可存活数月至数年。主要感染犬，尤其幼犬，传染性极强，死亡率也高；若在感染早期及时发现并采取相应措施，感染犬得以救治的可能性大大提高。

目前，粪便中犬细小病毒的主要检测方法有：

(1)PCR法，该法灵敏，但需要相应仪器设备，3.5h左右得知结果；

(2)胶体金试纸条检测法，该法特异、灵敏、快速，在10min内得出结果，但购买成本相对较高，可对该病进行定性检测，不能定量；

(3)电镜检测粪便处理上清，敏感、特异、准确，但仪器设备昂贵，在临床中不易配制；

(4)病毒培养，需要2-3周，并且必须在有细胞培养条件的实验室中完成；

(5)96孔V型微量板血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验检测，HA和HI试验不需要活的细胞，但需采集猪新鲜红细胞且需3h左右获得结果。

因此，如何提供一种快速、简便、经济的犬细小病毒抗原、抗体检测产品及方法成为本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种快速检测犬细小病毒抗原、抗体的试剂盒及方法，使用健康猪红细胞和白瓷板进行HA和HI试验，15-30min即可判定结果，快速定性、定量，特异高，简易，经济，易于在基层推广应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种快速检测犬细小病毒抗原、抗体的试剂盒，包括白瓷板，猪红细胞悬浮液、猪红细胞贮存液和样品稀释液；

猪红细胞悬浮液为PBS缓冲液中添加0.1-1.2mg/mL牛血清白蛋白；

猪红细胞贮存液包括：14.4-27.0mg/mL葡萄糖，2.5-3.5mg/mL氯化钠， 5.5-14.6mg/mL甘露醇，1.83-27.6mg/mL柠檬酸钾，0.51-2.53mg/mL三磷酸腺苷，0.77-15.42mg/mL乙酸铵，0.5-1.0mg/mL叠氮钠以及体积分数为5-8％的猪红细胞；

样品稀释液pH为6.1-7.0。

本发明试剂盒中的猪红细胞贮存液可在4℃保存180天，保证了长期贮存过程中猪红细胞具有良好的活性。使用时直接将猪红细胞贮存液离心弃上清，取猪红细胞悬于猪红细胞悬浮液中制成猪红细胞体积分数为1.5-2.5％的猪红细胞工作液即可用于检测，无需进行猪新鲜红细胞的制备，操作方便。

优选地，上述快速检测犬细小病毒抗原、抗体的试剂盒，还包括犬细小病毒的阴性对照血清和阳性对照血清，以及犬细小病毒灭活抗原。

利用犬细小病毒与猪红细胞的血凝反应即可判断粪便/肠内容物/直肠棉拭子中是否存在犬细小病毒；进一步地，利用添加阳性对照血清后的血凝抑制可进一步证实引起血凝反应的是犬细小病毒。

此外，向待测血清中添加犬细小病毒灭活抗原，通过血凝抑制即可判定血清中是否含有犬细小病毒抗体。

优选地，猪红细胞贮存液的制备如下：

(1)取无菌阿氏液，加入4-5倍体积的成年健康猪耳静脉血和10-20倍体积无菌生理盐水混匀，10-25℃、2000-5000r/min离心5-10min，吸去上清液及沉淀上层的白细胞薄膜，得沉淀；使用无菌生理盐水反复洗涤沉淀，得到猪新鲜红细胞；

(2)将步骤(1)中获得的猪新鲜红细胞悬于包含葡萄糖、氯化钠、甘露醇、柠檬酸钾、三磷酸腺苷、乙酸铵、叠氮钠的水溶液中，使猪红细胞最终体积分数为5-8％，获得猪红细胞贮存液，4℃保存备用。

本发明制备的猪红细胞贮存液保存时间长，稳定性强。

优选地，猪红细胞悬浮液为pH6.1-7.0、0.015-0.15M的PBS缓冲液中添加 0.1-1.2mg/mL牛血清白蛋白。

一种非诊断目的的快速检测犬细小病毒抗原、抗体的方法，包括如下步骤：

(1)白瓷板处理：

取表面洁净的白瓷板，4℃预冷；

(2)待测样品处理：

1)HA检测样品处理：使用样品稀释液对待测粪便/肠内容物/直肠棉拭子处理液进行梯度稀释，得到各梯度稀释液；

2)HI检测样品处理：使用样品稀释液对待测粪便/肠内容物/直肠棉拭子处理液进行梯度稀释，并加入阳性对照血清，28-37℃处理15min，得到各梯度稀释液；或者，使用样品稀释液对待测血清进行梯度稀释，并加入犬细小病毒灭活抗原，28-37℃处理15min，得到各梯度稀释液；

(3)猪红细胞工作液的制备：

猪红细胞贮存液离心，弃上清，加入猪红细胞悬浮液，使猪红细胞终浓度为1.5-2.5％，得到猪红细胞工作液；

(4)检测：

吸取各梯度稀释液滴于白瓷板上；

吸取猪红细胞工作液，垂直滴于各梯度稀释液上，立即用牙签将猪红细胞工作液与各梯度稀释液充分混合均匀，涂布成直径0.5-1cm的滴状物；

平稳摇动白瓷板，在3-10min内观察结果，根据肉眼可见红色颗粒或显微镜 40倍放大可见明显红色凝集颗粒判定结果。

优选地，白瓷板上划有3×3cm方格；使用前，将白瓷板于4℃预冷；使用后，用水清洗干净，擦干备用。

优选地，待测粪便/肠内容物/直肠棉拭子处理液的制备方法如下：

使用pH6.1-7.0、0.015-0.15M的PBS缓冲液对粪便或肠内容物或直肠棉拭子进行稀释，充分混匀后，7000-8500r/min，离心5-10min；离心后取上清，加等量氯仿，充分混匀后，10000-12000r/min离心10-15min，取水相即为待测粪便/肠内容物/直肠棉拭子处理液。

优选地，待测血清的制备方法如下：

血清样品用pH6.1-7.0、0.015-0.15M的PBS缓冲液稀释5-10倍，56-60℃水浴灭活30-40min；待凉后，加入血清样品体积10-15％的红细胞沉淀(猪红细胞贮存液离心去上清，使用pH6.1-7.0、0.015-0.15M的PBS缓冲液洗涤一次后，取红细胞沉淀)，混匀后室温吸附2-3h，3000-4000r/min 5-10min，取上清液即为待测血清。

优选地，步骤(3)中猪红细胞贮存液3000r/min离心3-10min，弃上清。

优选地，步骤(4)中各梯度稀释液用量25μL，猪红细胞工作液用量25μL。

优选地，在白瓷板上步骤(3)结果判定标准如下：

HA检测：

#表示100％凝集，红细胞呈颗粒状，液体透明；

+++表示75％凝集，红细胞颗粒小，液体较透明；

++表示50％凝集，红细胞约50％凝集和约50％未被凝集；

+表示25％凝集，只有少数凝集的红细胞，液体混浊；

-表示100％不凝集，液体均匀混浊，无红细胞凝集沉淀；

判定：血凝效价HA是指能产生++凝集的待测粪便/肠内容物/直肠棉拭子处理液最高稀释倍数；

HI检测：

-表示100％凝集，红细胞呈颗粒状，液体透明；

+表示75％凝集，红细胞颗粒小，液体较透明；

++表示50％凝集，红细胞约50％凝集和约50％未被凝集；

+++表示25％凝集，只有少数凝集的红细胞，液体混浊；

#表示100％不凝集，液体均匀混浊，无红细胞凝集沉淀；

判定：血凝抑制效价HI是指能产生#凝集的待测粪便/肠内容物/直肠棉拭子处理液或待测血清最高稀释倍数。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明15-30min即可判定结果，检测敏感度高、快速准确，经济实用，易于在基层推广应用。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1白瓷板HA检测

1.制备猪红细胞工作液

猪红细胞贮存液3000r/min离心5min，弃上清，取1.5mL猪红细胞加入 98.5mL猪红细胞悬浮液中，轻轻吹打混匀，得到1.5％(体积比mL/mL)的猪红细胞工作液。

其中，猪红细胞悬浮液为pH6.1、0.015M的PBS缓冲液中添加0.1mg/mL 牛血清白蛋白。

猪红细胞贮存液制备方法如下：

取无菌阿氏液1mL、成年健康猪耳静脉血4.5mL，放入50mL离心管中，加15mL生理盐水混匀，10℃、2000r/min离心10min，用吸管移去上清液及沉淀上层的白细胞薄膜，得沉淀；向沉淀中加入15mL生理盐水反复洗涤5次，得到猪新鲜红细胞；

将猪新鲜红细胞悬于包含葡萄糖、氯化钠、甘露醇、柠檬酸钾、三磷酸腺苷、乙酸铵、叠氮钠的水溶液中，得到猪红细胞贮存液。

猪红细胞贮存液中含如下成分：20mg/mL葡萄糖，3.0mg/mL氯化钠，8.5 mg/mL甘露醇，11.0mg/mL柠檬酸钾，1.5mg/mL三磷酸腺苷，6.8mg/mL乙酸铵，0.8mg/mL叠氮钠以及体积分数为6％的猪红细胞。

将上述猪红细胞贮存液置于4℃，需要进行检测时取出使用。

2.粪便/肠内容物/直肠棉拭子样品处理

用pH7.0、0.15M的PBS缓冲液将粪便或肠内容物或直肠棉拭子1:10稀释，充分混匀后，7000r/min，离心5min；取上清，加等量氯仿，充分混匀后，10000 r/min，离心15min，取水相即为待测粪便/肠内容物/直肠棉拭子处理液。用pH7.0、 0.15M的PBS缓冲液对待测粪便/肠内容物/直肠棉拭子处理液进行梯度稀释，得到各梯度稀释液。

3.HA检测

取表面洁净的白瓷板(首次使用前用热肥皂粉水反复洗刷干净，再用自来水反复冲洗，晾干备用)，板上划有3×3cm方格，于4℃冰箱预冷40min。

各梯度稀释液取25μL滴于预冷的白瓷板方格内；吸取25μL 1.5％猪红细胞工作液，垂直滴于各梯度稀释液上，随后立即用牙签将猪红细胞工作液与各梯度稀释液充分混合均匀，涂布成直径0.5-1cm的滴状物；随后平稳摇动白瓷板，在3-10min内观察结果；根据肉眼可见红色颗粒或显微镜40倍放大可见明显红色凝集颗粒判定结果。

HA检测结果判定：

#表示100％凝集，红细胞呈颗粒状，液体透明；

+++表示75％凝集，红细胞颗粒小，液体较透明；

++表示50％凝集，红细胞约50％凝集和约50％未被凝集；

+表示25％凝集，只有少数凝集的红细胞，液体混浊；

-表示100％不凝集，液体均匀混浊，无红细胞凝集沉淀；

判定：血凝效价HA是指能产生++凝集的待测粪便/肠内容物/直肠棉拭子处理液最高稀释倍数。

实施例2白瓷板HI检测

1.制备猪红细胞工作液

同实施例1。

2.检测样品处理

1)粪便/肠内容物/直肠棉拭子样品处理

用pH7.0、0.15M的PBS缓冲液将粪便或肠内容物或直肠棉拭子1:10稀释，充分混匀后，7000r/min，离心5min；取上清，加等量氯仿，充分混匀后，10000 r/min，离心15min，取水相即为待测粪便/肠内容物/直肠棉拭子处理液。

用pH7.0、0.15M的PBS缓冲液对待测粪便/肠内容物/直肠棉拭子处理液进行梯度稀释，然后与抗体效价为2⁷阳性对照血清等体积混合，37℃处理15min，得到各梯度稀释液。(可用阴性对照血清进行对比)

2)血清样品处理

血清样品用pH7.0、0.15M的PBS缓冲液稀释5倍，56℃水浴灭活30min；待凉后，加入血清样品体积10％的红细胞沉淀(猪红细胞贮存液离心去上清，使用pH7.0、0.15M的PBS缓冲液洗涤一次后，取红细胞沉淀)，混匀后室温 (15-25℃)吸附2h，3000r/min 10min，取上清液即为待测血清。

使用pH7.0、0.15M的PBS缓冲液对待测血清进行梯度稀释；取血凝效价为 2⁹的犬细小病毒灭活抗原，8倍稀释，与稀释的待测血清等体积混匀，37℃处理 15min，得到各梯度稀释液。

3.HI检测

结果判定：

HI检测：

-表示100％凝集，红细胞呈颗粒状，液体透明；

+表示75％凝集，红细胞颗粒小，液体较透明；

++表示50％凝集，红细胞约50％凝集和约50％未被凝集；

+++表示25％凝集，只有少数凝集的红细胞，液体混浊；

#表示100％不凝集，液体均匀混浊，无红细胞凝集沉淀。

实施例3验证猪红细胞最适浓度

猪红细胞工作液的制备方法同实施例1，猪红细胞工作液中猪红细胞浓度设置为0.8-5.0％。

所选样品为本实验室2016年分离的犬细小病毒自然弱毒株(QD/犬 /CC/1/2016)，血凝效价为2¹⁰，用pH7.0、0.15M的PBS缓冲液进行梯度稀释，得到各梯度稀释液。

白瓷板上划3×3cm方格，排成方阵，4℃预冷30min；各梯度稀释液取25μL 滴于预冷白瓷板的不同方格内，再向各个方格加不同浓度(1-5％)猪红细胞工作液25μL，用牙签充分混匀，在室温(15-25℃)下3-10min判定。结果如表1 所示，猪红细胞工作液最佳浓度为1.5-2.5％。

表1猪红细胞工作液最佳浓度测定结果

实施例4粪便/肠内容物/直肠棉拭子样品处理方法验证

取胶体金试纸条和PCR检测确定的犬细小病毒阳性粪便样品10份，进行如下处理：

(1)组用pH7.0、0.15M的PBS缓冲液对样品进行1:10稀释，充分混匀后，静置取上清，用pH7.0、0.15M的PBS缓冲液进行梯度稀释，得到各梯度稀释液。

(2)组用pH7.0、0.15M的PBS缓冲液对样品进行1:10稀释，充分混匀后， 7000r/min，离心10min，取上清，用pH7.0、0.15M的PBS缓冲液进行梯度稀释，得到各梯度稀释液。

(3)组用pH7.0、0.15M的PBS缓冲液对样品进行1:10稀释，充分混匀后， 7000r/min，离心10min；取上清，加等量氯仿，充分混匀后，10000r/min，离心 10min，取水相，用pH7.0、0.15M的PBS缓冲液进行梯度稀释，得到各梯度稀释液。

使用实施例1制备的猪红细胞工作液按照实施例1中HA检测方法进行检测，结果如表2所示，(3)组血凝效价最高。表明粪便样品离心处理，氯仿抽提后能达到最佳血凝效价。

表2粪便样品不同处理的白瓷板HA价比较

注：HA价：100％凝集的样品最大稀释度，如100％凝集的样品最大稀释度为1:64，在表中记为2⁶。

实施例5HA检测最适pH值验证

使用经96孔V型微量板测定的HA价为2¹⁰的犬粪便样品进行验证。

犬粪便样品处理过程中分别使用0.15M不同pH的PBS缓冲液对待测粪便处理液进行1:10稀释，其余步骤同实施例1，如表3所示，白瓷板凝集结果表明， pH6.1-7.0为最佳pH值。

表3 CPV白瓷板HA最适pH值

实施例6白瓷板预处理最适温度验证

取已知犬细小病毒阳性样品，按照实施例1方法进行检测，对白瓷板预先在不同温度处理，检测HA价为2¹⁰的样品出现凝集的时间，如表4所示，4℃ 预冷白瓷板效果最好，出现凝集最快，可在3-5min内出现凝集。

表4 CPV白瓷板HA最适温度

实施例7白瓷板与96孔V型微量板HA、HI试验比较

以43例疑似感染犬细小病毒的犬只为研究对象，分别取其粪便和血清进行分析：

按照实施例1方法对粪便样品进行犬细小病毒白瓷板HA试验，按照实施例2方法对血清样品进行犬细小病毒白瓷板HI试验。

96孔V型微量板检测HA和HI按如下方法进行：

(1)制备猪新鲜红细胞

取无菌阿氏液1mL、成年健康猪耳静脉血4.5mL，放入50mL离心管中，加15mL生理盐水混匀，10℃、2000r/min离心10min，用吸管移去上清液及沉淀上层的白细胞薄膜，得沉淀；向沉淀中加入15mL生理盐水反复洗涤5次，得到猪新鲜红细胞沉淀，取1.0mL猪红细胞沉淀加入添加有0.1mg/mL牛血清白蛋白的99mLpH6.1、0.015M的PBS缓冲液中，轻轻吹打混匀，得到1.0％(体积比 mL/mL)的猪新鲜红细胞悬液；

(2)HA测定：用0.15M PH7.0的PBS对粪便处理液(粪便处理液的处理方法同实施例1)进行二倍比稀释，取25μL加入V型微量板各孔，每孔加1.0％猪新鲜红细胞悬液25μL，于4℃静止1h后判定结果，以50％的红细胞凝集为终点，出现凝集终点的最高稀释倍数判为该抗原的HA效价。

(3)HI测定：用0.15M PH7.0的PBS对待测血清(待测血清的处理方法同实施例2)进行倍比稀释，每孔加25μL，然后各孔再加4单位血凝抗原25μL，混匀后置温箱37℃30min，每孔加1.0％猪新鲜红细胞悬液25μL，混匀后4℃60min后判定，出现凝集抑制为犬细小病毒阳性。

结果表明，V型微量板检出43例犬细小病毒，白瓷板法检出43例，二者试验符合率为100％，白瓷板法HA检出率与微量板HA灵敏度相同，但可以节约时间4-5倍。

表5白瓷板与96孔V型微量板检测效果比较

实施例8猪红细胞在贮存液中的保存时间验证

按照实施例1方法制备猪红细胞贮存液，4℃下贮存，观察不同贮存时间红细胞及上清液的变化；并按照实施例1方法进行HA试验，验证血凝效果，结果如表6所示。

表6猪红细胞贮存液随贮存时间的变化

上述结果表明4℃下猪红细胞贮存液可保存红细胞至6个月，保存到7个月时有少量红细胞发生溶血溶液呈浅红色，保存8个月时溶血更为明显为暗红色。即该猪红细胞贮存液能够保证猪红细胞在6个月内有较强的抗原性和稳定性。

实施例9不同贮存液对4℃保存红细胞数量的影响

目前对于人的红细胞低温贮存研究较多，猪的红细胞低温保存研究极少。以下分别使用两种4℃保存人红细胞贮存液、PBS(pH 7.4)缓冲液、阿氏液和实施例 1猪红细胞贮存液对猪红细胞保存时间进行研究。

1.液体配制

1)PBS(pH 7.4)缓冲液：0.137g/L氯化钠，0.0027g/L氯化钾，0.01g/L磷酸氢二钠，0.002g/L磷酸二氢钾，调pH 7.4，高压灭菌4℃备用。

2)阿氏液：20.5g/L葡萄糖，8g/L柠檬酸钠，0.55g/L柠檬酸，4.2g/L氯化钠，加热溶解后将pH值调到6.1，高压灭菌4℃备用。

3)已知贮存液1：双糖30.0g/L，氯化钠2.0g/L，EDTA-Na25.0g/L，甘氨酸 8.0g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磺胺40mg/L，甲氧苄啶20mg/L，抗氧化剂0.5g/L，pH 7.5-8.5。

4)已知贮存液2：腺嘌呤0.4g/L，葡萄糖30g/L，柠檬酸钠8g/L，肌苷0.3 g/L，氯霉素0.25g/L，硫酸新霉素0.1g/L，氯化钠3.0g/L，磷酸二氢钠0.05g/L。

5)按照实施例1配置包含120mg/mL葡萄糖、3.0mg/mL氯化钠、8.5mg/mL 甘露醇、11.0mg/mL柠檬酸钾、1.5mg/mL三磷酸腺苷、6.8mg/mL乙酸铵、0.8 mg/mL叠氮钠的水溶液。

2.猪新鲜红细胞制备：取无菌阿氏液，加入4.5倍体积的成年健康猪耳静脉血和15倍体积无菌生理盐水混匀，15℃、3000r/min离心5min，吸去上清液及沉淀上层的白细胞薄膜，得沉淀；使用无菌生理盐水反复洗涤沉淀，得到猪新鲜红细胞；

3.猪红细胞贮存和不同时间数量变化检测

获得的猪新鲜红细胞按8％的体积分数悬于1)-5)液体中，4℃密封保存，于不同贮存时间取样检测红细胞数量，共取样13次，每次做3个重复。

采用红细胞计数法对5种液体中红细胞的数量进行计数。结果见表8，4℃下不同液体中红细胞的保存时间不同。在pH 7.4PBS缓冲液中，保存到第5d时，红细胞数量减少近一半，第10d大部分溶血，15d完全溶血。阿氏液中红细胞保存5d时基本稳定，但到第10d时，红细胞数量急剧减少，15d时大部分溶血，1 月时完全溶血。已知贮存液1中，能保存4个月，保存5个月时红细胞数量急剧减少。已知贮存液2中，能保存3个月，保存4个月时红细胞数量急剧减少。实施例1猪红细胞贮存液能保存6个月，保存7个月时红细胞数量减少了一半左右，表明实施例1猪红细胞贮存液具有较强的红细胞贮存能力。

表7不同贮存液中红细胞数量变化 (×10⁸/mL)

注：-完全溶血

(续)表7不同贮存液中红细胞数量变化 (×10⁸/mL)

注：-完全溶血

实施例10猪新鲜红细胞与贮存液保存猪红细胞HA和HI效价比较

猪新鲜红细胞制备同实施例1，将猪新鲜红细胞沉淀用猪红细胞悬浮液 (pH6.1、0.015M的PBS缓冲液中添加0.1mg/mL牛血清白蛋白)重悬，使猪新鲜红细胞体积分数为1.5％，制得猪新鲜红细胞悬液，用于HA和HI效价检测。

按照实施例1方法制备猪红细胞贮存液，4℃保存6个月，然后按照实施例 1方法制备猪红细胞工作液。

分别使用猪新鲜红细胞悬液和猪红细胞工作液进行如下实验：

血凝试验，对已知HA效价为2⁸的犬粪便样品进行检测，按实施例1进行白瓷板HA检测。

血凝抑制试验，用犬细小病毒阳性对照血清，抗体效价为2⁷，按实施例2 进行白瓷板HI检测。

结果如表8所示，贮存液中红细胞与猪新鲜红细胞在HA和HI上有相同效价，说明本发明猪红细胞贮存液中的猪红细胞保持了较好的白瓷板血凝和血凝抑制活性。

表8新鲜红细胞与贮存红细胞HA和HI效价比较

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种快速检测犬细小病毒抗原、抗体的试剂盒，包括白瓷板，猪红细胞悬浮液、猪红细胞贮存液和样品稀释液；

所述猪红细胞悬浮液为PBS缓冲液中添加0.1-1.2mg/mL牛血清白蛋白；

所述猪红细胞贮存液包括：14.4-27.0mg/mL葡萄糖，2.5-3.5mg/mL氯化钠，5.5-14.6mg/mL甘露醇，1.83-27.6mg/mL柠檬酸钾，0.51-2.53mg/mL三磷酸腺苷，0.77-15.42mg/mL乙酸铵，0.5-1.0mg/mL叠氮钠以及体积分数为5-8％的猪红细胞；

所述样品稀释液pH为6.1-7.0。

2.根据权利要求1所述的一种快速检测犬细小病毒抗原、抗体的试剂盒，其特征在于，还包括犬细小病毒的阴性对照血清和阳性对照血清，以及犬细小病毒灭活抗原。

3.根据权利要求1所述的一种快速检测犬细小病毒抗原、抗体的试剂盒，其特征在于，所述猪红细胞贮存液的制备如下：

(2)将步骤(1)中获得的猪新鲜红细胞悬于包含葡萄糖、氯化钠、甘露醇、柠檬酸钾、三磷酸腺苷、乙酸铵、叠氮钠的水溶液中，使猪红细胞终浓度达到5-8％。

4.一种非诊断目的的快速检测犬细小病毒抗原、抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)白瓷板处理：

取表面洁净的白瓷板，4℃预冷；

(2)待测样品处理：

(3)猪红细胞工作液的制备：

(4)检测：

吸取各梯度稀释液滴于白瓷板上；

平稳摇动白瓷板，在3-10min内观察结果，根据肉眼可见红色颗粒或显微镜40倍放大可见明显红色凝集颗粒判定结果。

5.根据权利要求4所述的一种非诊断目的的快速检测犬细小病毒抗原、抗体的方法，其特征在于，所述白瓷板上划有3×3cm方格；使用前，将白瓷板于4℃预冷；使用后，用水清洗干净，擦干备用。

6.根据权利要求4所述的一种非诊断目的的快速检测犬细小病毒抗原、抗体的方法，其特征在于，所述待测粪便/肠内容物/直肠棉拭子处理液的制备方法如下：

7.根据权利要求4所述的一种非诊断目的的快速检测犬细小病毒抗原、抗体的方法，其特征在于，所述步骤(4)中各梯度稀释液用量25μL，猪红细胞工作液用量25μL。

8.根据权利要求4所述的一种非诊断目的的快速检测犬细小病毒抗原、抗体的方法，其特征在于，在白瓷板上步骤(4)结果判定标准如下：

HA检测：

#表示100％凝集，红细胞呈颗粒状，液体透明；

+++表示75％凝集，红细胞颗粒小，液体较透明；

++表示50％凝集，红细胞约50％凝集和约50％未被凝集；

+表示25％凝集，只有少数凝集的红细胞，液体混浊；

-表示100％不凝集，液体均匀混浊，无红细胞凝集沉淀；

HI检测：

-表示100％凝集，红细胞呈颗粒状，液体透明；

+表示75％凝集，红细胞颗粒小，液体较透明；

++表示50％凝集，红细胞约50％凝集和约50％未被凝集；

+++表示25％凝集，只有少数凝集的红细胞，液体混浊；

#表示100％不凝集，液体均匀混浊，无红细胞凝集沉淀；