DK167929B1 - Rekombinant dna-molekyle indeholdende en for hesteinterferoner kodende sekvens, transformeret vaertsorganisme indeholdende dna-molekylet, interferon kodet af det rekombinante dna-molekyle, fremgangsmaade til fremstilling af heste-interferoner, anvendelse af interferonerne, middel til terapeutisk behandling samt heste-interferon til anvendelse som laegemiddel - Google Patents

Description

DK 167929 B1

Opfindelsen angår et rekombinant DNA-molekyle indeholdende en for heste-interferoner kodende sekvens, transformeret værtsorganisme indeholdende DNA-molekylet, interferon kodet af det rekombinante DNA-molekyle, frem-5 gangsmåde til fremstilling af heste-interferoner, anvendelse af interferonerne, middel til terapeutisk behandling samt heste-interferon til anvendelse som lægemiddel.

Interferoner er proteiner, der udskilles af eu-karyotiske celler efter virusinfektion eller anden sti-10 mulation, og som på sin side kan beskytte cellerne mod virusinfektioner. Hidtil kendes fire klasser af interferoner, der betegnes ved interferon-alpha, interferonbeta, interferon-omega og interferon-gamma (forkortet: IFN-a, IFN-β, IFN-tø og IFN-γ). De afviger indbyrdes med 15 hensyn til opbygning og virkninger. Således kan interferoner have en regulerende indvirkning på immunsystemets celler eller påvirke celledifferentieringen og væksten af tumorer.

Det har længe været antaget, at interferonerne 20 virker specifikt. In-vitro-forsøg har imidlertid vist, at IFN-præparater fra kvæg kan udløse en antiviral virkning hos aber og hos mennesker (32, se litteraturfortegnelse) . Denne artsinteraktivitet hænger muligvis sammen med den mere eller mindre store homologi hos generne el-25 ler proteinerne. På grund af de små mængder af dyriske interferoner har denne antagelse ikke kunnet efterprøves.

Trods de fastslåede artsinteraktiviteter må der ved anvendelse af artsfremmede interferoner forventes bivirkninger, såsom antigeniteter, der ikke kan tolere-30 res ved θη terapi.

Da på den anden side nytte- og husdyrhold har en betydelige økonomisk værdi, er der et behov for interferoner for de forskellige arter, hvilke interferoner kan anvendes af dyrlæger.

Højt renset interferon fra de forskellige arter ville endvidere byde på en velkommen lejlighed til at undersøge virkningsmekanismen for interferonerne med henblik på at nå frem til model-teorier, der kan overføres til mennesker.

DK 167929 B1 2

De første undersøgelser med dyriske interferoner er gennemført med præparater fra naturligt cellemateriale. Udbytte og renhed af de ved denne fremgangsmåde fremstillede interferoner synes imidlertid at vise, at de er 5 uegnede til fremstilling af lægemidler.

Gennem udviklingen af rekombinant DNA-teknik er det muligt ud fra mikroorganismer at lade fremstille heterologe proteiner. Således er der for eksempel også fremstillet human-interferoner (Hu-IFN), og for nyligt 10 også et kvæg-α- og et kvæg-f3-interferon.

Den foreliggende opfindelse angår et rekombinant DNA-molekyle, indeholdende en for EqIFN-alpha-, -beta, -omega kodende sekvens, der er ejendommelig ved, at den kodende sekvens er valgt blandt 15 a) insertioner fra plasmiderne pAH50 (fig. 4), pRH63 (fig. 10), pRH82 (fig. 27), pRH83 (fig. 26) pRH61 (fig. 12), pRH62 (fig. 23) eller pAH 60 (fig. 8) og b) DNA-sekvenser, som hybridiserer med insertio-nerne fra plasmiderne pAH50, pRH63, pRH83, pRH61, pRH62 20 eller pAH60 under stringente betingelser, som udviser en homolog! større end 85%, fortrinsvis større end 90%, og som koder for et protein med aktivitetsspektrummet for EqIFN-alpha, -beta, eller -omega.

Opfindelsen angår også en transformeret værtsor-25 ganisme indeholdende den for EqIFN-alpha, -beta eller -omega kodende sekvens angivet ovenfor.

Opfindelsen angår endvidere interferon, som er ejendommeligt ved, at det er EqIFN-alpha, -beta eller -omega kodet af en af de ovenfor angivne DNA-sekvenser, 30 i det væsentlige fri for andre proteiner af dyrisk herkomst, fortrinsvis i en i det væsentlige ren form.

Opfindelsen angår navnlig heste-interferonerne med de for disse kodende sekvenser med følgende formler: 35 DK 167929 B1 3

Cys Asp Leu Pro His Thr His Ser Leu Gly Asn Thr Arg Val Leu

TGT GAC CTG CCT CAC ACC CAT AGC CTG GGC AAC ACA AGG GTC TTG

5 Met Leu Leu Gly Gin Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu

ATG CTC CTG GGG CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCC TTC TCC TGC CTG

Lys Asp Arg Asn Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Val Phe Asp*Gly

AAG GAC AGA AAT GAC TTT GGA TTC CCC CAG GAG GTG TTT GAC GGC

10

Asn Gin Phe Arg Lys Pro Gin Ala Ile Ser Ala Val His Glu Thr

AAC CAG TTC CGG AAG CCT CAA GCC ATC TCT GCG GTC CAT GAG ACG

Ile Gin Gin Ile Phe His Leu Phe Ser Thr Asp Gly Ser Ser Ala

15 ATC CAA CAG ATC TTC CAC CTC TTC AGC ACA GAC GGC TCG TCT GCC

Ala Trp Asp Glu Ser Leu Leu Asp Lys Leu Tyr Thr Gly Leu Tyr

GCC TGG GAC GAG AGC CTC CTA GAC AAA CTC TAC ACT GGA CTC TAT

20 Gin Gin Leu Thr Glu Leu Glu Ala Cys Leu Ser Gin Glu Val Gly

CAG CAG CTG ACT GAG CTG GAA GCC TGT CTG AGC CAG GAG GTG GGG

Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Glu Asp Ser Leu Leu Ala Val

GTG GAA GAG ACG CCC CTG ATG AAC GAG GAC TCC CTG CTG GCT GTG

25

Arg Arg Tyr Phe Gin Arg Ile Ala Leu Tyr Leu Gin Glu Lys Lys

AGG AGÅ TAC TTC CAA AGA ATC GCT CTC TAT CTG CAA GAG AAG AAA

Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Ala Glu Ile Met Arg

30 TAC AGC CCT TGT GCC TGG GAG ATC GTC AGA GCA GAA ATC ATG AGA

Ser Phe Ser Ser Ser Thr Asn Leu Pro Gin Ser TER

TCC TTC TCT TCA TCC ACA AAC 7TG CCr. OAL- AGT ΊλΆ

35 Formel I

4 DK 167929 B1

Cys Asp Leu Pro His Thr His Ser Leu Gly Asn Thr Arg Val Leu

TGT GAC CTG COT CAC ACC CAT AGC CTG GGC AAC ACA AGG GTC TTG

Met Leu Leu Gly Gin Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu

5 ATG CTC CTG GGA CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCC TTC TCC TGC CTG

Lys Asp Arg Asn Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Val Phe Asp Gly

AAG GAC AGA AAT GAC TTT GGA TTC CCC CAG GAG GTG TTT GAC GGC

Asn Gin Phe Arg Lys Pro Gin Ala Ile Ser Ala Val His Glu Thr

AAC CAG TTC CGG AAG CCT CAA GCC ATC TCC GCG GTC CAT GAG ACG

Ile Gin Gin Ile Phe His Leu Phe Ser Thr Asp Gly Ser Ser Ala

ATC CAA CAG ATC TTC CAC CTC TTC AGC ACA GAC GGC TCG TCT GCT

15

Ala Trp Asp Glu Ser Leu Leu Asp Lys Leu Tyr Thr Gly Leu Tyr

GCC TGG GAC GAG AGC CTC CTA GAC AAG CTC TAC ACT GGA CTC TAT

Gin Gin Leu Thr Glu Leu Glu Ala Cys Leu Ser Gin Glu Val Gly 20

CAG CAG CTG ACT GAG CTG GAA GCC TGT CTG AGC CAG GAG GTG GGG

Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Glu Asp Ser Leu Leu Ala Val

GTG GAA GAG ACG CCC CTG ATG AAC GAG GAC TCC CTG CTG GCT GTG

25

Arg Arg Tyr Phe Gin Arg Ile Ala Leu Tyr Leu Gin Glu Lys Lys

AGG AGA TAC TTC CAA AGA ATC GCT CTC TAT CTG CAA GAG AAG AAA

Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Ala Glu Ile Met Arg

TAC AGC CCT TGT GCC TGG GAG ATC GTC AGA GCA GAA ATC ATG AGA

30

Cys Phe Ser Ser Ser Thr Asn Leu Gin Gin Ser TER

TGC TTC TCT tc* TuC ACA AAC TTG CAG CAG AGT TAA

35 Formel II

5 DK 167929 B1

Val Asn Tyr Asp Leu Leu Arg Ser Gin Leu Arg Ser Ser Asn Ser

GTG AAC TAT GAC TTG CTT CGG TCC CAA CTA AGA AGC AGC AAT TCA

5 Ala Cys Leu Met Leu Leu Arg Gin Leu Asn Gly Ala Pro Gin Arg

GCA TGT CTG ATG CTC CTG CGG GAG TTG AAT GGA GCC CCT CAA CGT

Cys Pro Glu Asp Thr Met Asn Phe Gin Val Pro Glu Glu Ile Glu

TGC CCC GAG GAC ACA ATG AAC TTC CAG GTC CCT GAG GAG ATT GAG

10

Gin Ala Gin Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala Leu Val Ile Tyr

CAA GCA CAG CAG TTC CAG AAG GAG GAT GCT GCA TTG GTC ATC TAT

Glu Met Leu Gin His Thr Trp Arg Ile Phe Arg Arg Asn Phe Ala

15 GAG ATG CTC CAG CAC ACC TGG CGT ATT TTC AGA AGA AAT TTC GCT

Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Lys Asn Leu Leu Val Glu

AGC ACT GGC TGG AAT GAG ACC ATC GTT AAG AAC CTC CTT GTG GAA

20 Val His Leu Gin Met Asp Arg Leu Glu Thr Asn Leu Glu Glu Ile

GTC CAT CTG CAG ATG GAC CGT CTG GAG ACA AAC CTG GAG GAA ATA

Met Glu Glu Glu Ser Ser Thr Trp Gly Asn Thr Thr Ile Leu Arg

ATG GAG GAG GAA AGC TCC ACC TGG GGA AAC ACA ACC ATT CTG CGC

25

Leu Lys Lys Tyr Tyr Gly Arg Ile Ser Gin Tyr Leu Lys Ala Lys

CTG AAG AAA TAC TAC GGA AGG ATC TCG CAG TAC CTG AAG GCC AAG

Lys Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Val Val Gin Ala Glu Met Leu

30 AAG TAC AGC CAC TGT GCC TGG ACA GTG GTC CAA GCG GAA ATG CTC

Arg Asn Leu Ala Phe Leu Asn Gly Leu Thr Asp Tyr Leu Gin Asn

*sGG - AC o vi GCC TTC CTT AAC GGA CTC ACA GAT TAC CTC CAA AAC

35 Formel III

6 DK 167929 B1

Cys Asp Leu Pro Ala Ser Leu Asp Leu Arg Lys Gin Glu Thr Leu

TGC GAC CTG CCT GCG AGC CTT GAC TTG AGA AAG CAG GAG ACC CTC

Arg Val Leu His Gin Met Glu Thr Ile Ser Pro Pro Ser Cys Leu

5 AGA GTT CTG CAC CAG ATG GAG ACA ATC TCT CCT CCT TCC TGT CTG

Lys His Arg Thr Asp Phe Arg Phe Pro Gin Glu Gin Leu Asp Gly

AAG CAC AGG ACA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG CAG CTG GAT GGC

10 Arg Gin Phe Pro Glu Ala Gin Ala Thr Ser Val Leu Gin Glu Met

AGG CAG TTC CCA GAG GCC CAG GCC ACG TCT GTC CTC CAG GAG ATG

Leu Gin Gin Ile Val Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser Ser Ala

CTC CAG CAG ATC GTC AGC CTC TTC CAC ACA GAG CGC TCG TCT GCT

15

Ala Trp Asn Thr Thr Leu Leu Asp Arg Leu Leu Ala Gly Leu His

GCC TGG AAC ACG ACT CTG CTG GAC CGA CTC CTC GCG GGA CTC CAT

Gin Gin Leu Glu Asp Leu Asn Thr Cys Leu Asp Glu Gin Thr Gly

20 CAG CAG CTG GAA GAC CTC AAC ACC TGC TTG GAT GAG CAG ACA GGA

Glu Glu Glu Ser Ala Leu Gly Thr Val Gly Pro Thr Leu Ala Val

GAG GAA GAA TCC GCC CTG GGA ACT GTG GGC CCT ACA CTG GCC GTG

25 Lys Arg Tyr Phe Arg Arg Ile Arg Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys

AAG AGG TAC TTC AGG AGA ATC CGT CTG TAC CTG ACA GAG AAG AAA

Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Val Asp Ile Met Arg

TAC AGT GAC TGT GCC TGG GAG ATT GTC AGA GTG GAC ATC ATG AGA

30

Ser Phe Ser Ser Ser Ala Asn Leu Gin Gly Arg Leu Gly Met Lys

TCC TT~ rCT TCA TCA CCA AAC CTG ' AA GOA «GG ΊΤΑ GGA ATc «aG

Asp Gly Asp Leu Gly Ser Pro TER

35 GAT GGA GAC CTG GGG TCA CCT TGA

Formel IV

DK 167929 B1 7

Den til grund for opfindelsen liggende opgave er løst ved, at højmolekylært DNA blev isoleret fra nævnte dyrs væv, fortrinsvis fra leveren ved en modificeret fremgangsmåde ifølge Blin og Stafford (18), og fragmen-5 teret statistisk ved hjælp af specielle endonucleaser.

De således vundne forskelligt store fragmenter blev fraktioneret efter størrelse, fortrinsvis til dannelse af 10-23 kb fragmenter, med henblik på at blive klonet i en vektor, for eksempel i en Lambda-vektor. Derefter blev 10 disse vektorer formeret i en bakterie, fortrinsvis E.co-li.

Heste-DNA'et blev under ikke-stringente betingelser screenet ved hjælp af det for modent humaninterferon-alpha2ARG kodende DNA og det for humant β-interferon ko-1 5 dende cDNA.

Som følge af den lave stringens fik man også kloner, der i deres sekvenser udviser betydelige forskelle fra HuIFN-alpha2ARG eller HuIFN-β.

Ved undersøgelsen af heste-DNA'et med human-alpha-20 genet blev der, ligesom for kvæg, svin og mennesker, ved Southern-analyse fastslået flere bånd, således at man kan gå ud fra, at der også for heste må foreligge en klasse af alpha-interferon-gener.

Opfindelsen skal i det følgende beskrives nærmere med 25 henvisning til tegningen.

Fig. 1: Southern-analyse af genomt DNA fra hest med

HuIFNa2-DNA og HuIFNp-DNA som prober. De relevante spor er disse, hvor der står "HEST".

Fig. 2: Øverst: Restriktionskort for den genomiske 30 klon XEqal fra λ-phag.

Nederst: Restriktionskort for insertionen i plasmidet pAH50. Det udgøres af et 3,2 kb-Hindlll-fragment fra phag-klonen kEqal.

Fig. 3: Øverst: Restriktionskort for den genomiske 35 klon kEqp6 fra λ-phag.

DK 167929 B1 8

Nederst: Restriktonskort for insertionen i plasmidet pAH60. Det udgøres af et 2,5 kb-Hindlll-fragment fra phag-klonen XEqp6.

Fig. 4: Nukleotid- og aminosyresekvens for EqIFNal.

5 HindiII-fragment fra plasmidet pAH50.

Fig. 5: Parvis sammenligning af homologien for ami- nosyresekvenserne af a-interferon for forskellige arter (Hu = menneske, Eq = hest, Bo = kvæg, Bo = kvæg, Ra = rotte, Mu = mus). Angivet i procent.

10 Fig. 6: Parvis sammenligning af homologien for ami- nosyresekvenser af β-interferon for forskellige arter (Hu = menneske, Eq = hest, Bo = kvæg, Mu = mus). Angivet i procent.

Fig. 7: Sammenligning af aminosyresekvenserne for a-15 interferon for forskellige arter (Hu = menneske, Eq = hest,

Bo = kvæg, Ra = rotte, Mu = mus).

Fig. 8: Nukleotid- og aminosyresekvens af EqIFNp.

HindIII-fragment af plasmidet pAH60.

Fig. 9: Øverst: Restriktonskort for insertionen i 20 plasmidet pRH61. Det udgøres af et 2,2 kb-EcoRI-fragment fra phagklonen λEqα20, som indeholder den genetiske information for EqIFNail.

Nederst: Restriktonskort for insertionen i plasmidet pRH63. Det udgøres af et 3,3 kb-EcoRI-fragment fra phag-25 klonen λEqαl6, som indeholder den genetiske information fra EqqIFNa2.

Fig. 10: Nukleotid- og aminosyresekvens for EqIFNa2. Insertion i plasmidet pRH63.

Fig. 11: Sammenligning af nukleotid- og aminosyrese-30 kvenserne for EqIFNal (pAH50) og EqIFNa2 (pRH63).

Fig. 12: Nukleotid- og aminosyresekvens for EqIFNcol. EcoRI-fragment fra plasmidet pRH61.

Fig. 13: Konstruktion af plasmidet pATER103.

Fig. 14: Konstruktion af plasmiderne pAH52 og pAH53.

35’ Fig. 15: Konstruktion af plasmidet pAH55 til udtryk- kelse af EqIFNa2.

Fig. 16: Konstruktion af plasmidet pAH62 til udtryk-kelse af EqIFNp.

Fig. 17: Autoradiografi af en SDS-polyacrylamidgel 40 efter selektiv radioaktiv mærkning af det af ekspressions- DK 167929 Bl 9 plasmidet kodede protein (raaxicelleteknik). Over sporene er de anvendte plasmider til transformation angivet.

Fig. 18: Southern-analyse af genomisk DNA fra hest med de angivne prober for hesteinterferongener. (E = EcoRI, 5 H = Hindlll, Ba = BamHI, P = PstI, B = Bglll).

Fig. 19: Sammenligning af aminosyresekvenser af Type-I-interferon for forskellige arter (Hu = menneske, Eq = hest, Bo = okse, Ra = rotte, Mu = mus).

Fig. 20: Parvis sammenligning af homologien for ami-10 nosyresekvenserne af Type-1-interferoner for forskellige arter (Hu = menneske, Eq = hest, Bo = kvæg, Ra = rotte, Mu = mus). Angivet i procent.

Fig. 21: Southern-analyse af genomisk DNA fra hund med HuIFNa2-DNA som probe. De relevante spor er disse, 15 hvorover der står "hund".

Fig. 22: Restriktionskort for phagklonen XCaal 1-2 fra det genomiske bibliotek for hunde.

Fig. 23: Restriktionskort for insertionerne i plas-miderne pAH2 og pAH4, som indeholder den genetiske infor-20 mation for hundeinterferonerne CalFNal og CaIFNa2. De er Smal-fragmenter fra phagklonen XCaal 1-2.

Fig. 24: Nuklein og aminosyresekvens for CaIFNa2. HindiII-fragment fra pAH2.

Fig. 25: Nuklein- og aminosyresekvens for CalFNal.

25 Hindu I-fragment fra pAH4.

Fig. 26: Sammenligning af aminosyresekvenserne for a-interferon for forskellige arter (Ca = hund, Hu = menneske,

Bo = okse, Ra = rotte, Mu = mus).

Fig. 27: Parvis sammenligning af homologien for ami-30 nosyresekvenser for a-interferoner for forskellige arter (Ca = hund, Hu = menneske, Eq = hest, Bo = kvæg, Ra = rotte, Mu = mus). Angivet i procent.

Fig. 28: Konstruktion af plasmidet pAH4/2 til udtryk-kelse af CalFNa.

35 Fig. 29: Southern-analyse af genomisk DNA fra hunde med CalFNal-DNA og EqIFNol-DNA som prober.

Fig. 30: Restriktionskort for phagklonerne XEqal, XEqal6, XEqa20 og λΕςββ fra genomisk DNA fra hest. Bjælken under kortene viser sådanne fragmenter, der blev subklonet 40 i plasmider og er forsynet med angivelse af de givne plas- 10 DK 167929 B1 mider og interferontyper.

Fig. 31: Nukleotid- og aminosyresekvens af EqIFNæ2. Insertion i plasmidet pRH62.

Fig. 32: Sammenligning mellem nukleotid- og aminos' syresekvenserne fra EqIFNcol og -ω2.

Fig. 33: Parvis sammenligning af homologien for Type-I-interferoner fra forskellige arter (Ca = hund, Hu = menneske, Eq = hest, Bo = kvæg, Ra = rotte, Mu = mus). Angivet i procent.

10 Fig. 34: Sammenligning af nukleotid- og aminosyrese- kvenserne for EqIFNa3. Insertion i plasmidet pRH83.

Fig. 35: Sammenligning af nukleotid- og aminosyrese-kvenserne for EqIFNa4. Insertion i plasmidet pRH82.

Fig. 36: Sammenligning af aminosyresekvenserne for 15 Type-I-interferoner fra forskellige arter (Ca = hund, Hu = menneske, Eq = hest, Bo = kvæg, Ra = rotte, Mu = mus).

Fig. 37: Nukleotid- og aminosyresekvens for EqIFNæ2. Fig. 38: Nukleotid- og aminosyresekvens for EqIFNa3. Fig. 39: Nukleotid- og aminosyresekvens for EqIFNa4.

20 Fig. 40: Konstruktion af ekspressionsplasmidet pRHIOO.

Ud fra de hybridiserende rekombinanter blev der fremstillet phag-DNA, og ud fra de resulterende kloner

Eq-alphal, Eq-beta6 blev der tilvejebragt restriktions-25 kort (Fig. 2 og 3) . Endvidere blev der vundet to med den humane IFN-probe hybridiserende Lambda-kloner, Eq-alphal og Eq-alpha20. Et 3,2 kb Hindlll-fragment fra klonen Eq-alphal, et 4,5 kb PvuII-fragment fra klonen Eq-beta6, et 30. 3,3 kb EcoRI-fragment fra klonen Eq-alphal6 eller et 2,2 kb EcoRI-fragment fra klonen Eq-alpha20 blev subklonet i en vektor, for eksempel pUC9, og derefter transformeret i en værtorganisme, for eksempel E.coli JM101. isoleringen af de korrekte fænotyper gav plasmiderne hen-35 holdsvis pAH50, pAH60, pRH63 og pRH61, der som insertio-• ner indeholder de for heste-interferonerne kodende sekvenser.

40 DK 167929 B1 1 1

Restriktionskortene for pRH61, pRH63 er vist i

Fig. 9.

Plasmidernes insertioner blev sekvensbestemt ved Dideoxy-metoden ifølge Sanger (23) ved "Shotgun-frem-5 gangsmåden". Delsekvenserne af disse insertioner blev ved hjælp af et modificeret computerprogram samlet til en totalsekvens (Fig. 4, 8, 10 og 12).

Det længste åbne læseraster for Eq-IFN-alpha-ge-net fra klonen Eq-alphal koder et polypeptid med 184 10 aminosyrer. Bemærkelsesværdig er den signifikante homo-logi med kendte alpha-interferoner fra andre arter. Ligesom ved human-, okse- og murin-alpha-interferonerne består dette heste-alpha-interferon af et hydrofobt signalpeptid med 23 aminosyrer, der går forud for et modent 15 protein med overraskende kun 161 aminosyrer (Eq-IFN-al-phal). Fire cysteinrester på stederne 1, 29, 99 og 139 er nøjagtigt bevaret for arterne hest, kvæg, mus, rotte og menneske (Fig. 7). Forkortelsen af dette heste-alpha-interferon til 161 aminosyrer må skyldes udeladelse af 20 en base efter den 159. aminosyre, uden hvilken transkrip-tionen ville være skrevet videre til den 166. aminosyre, indtil stopcodonen TGA.

Denne erkendelse tyder på, at polypeptidkæden for modent heste-interferon-alphal kan have en længde på 161 25 aminosyrer, men at der også kan eksistere andre former med op til 166 aminosyrer. Også disse peptider er naturligvis genstand for den foreliggende opfindelse.

Det har overraskende vist sig ved parvis sammenligning af aminosyresekvenserne, at heste-interferon-30 alphal udviser større homologi (71-77%) med human alpha-interferonerne end med kvæg - (57-67%), rotte- (61%) eller muse-alpha-interferonerne (54-59%) (Fig. 5). Homo-logien mellem de forskellige alpha-interferoner inden for én slægt er tydeligt større end mellem de forskellige ar-35 ter (f.eks. menneske 77-100%, kvæg 91-99%).

Det længste åbne læseraster for EqIFN-alpha-ge-net fra klonen Eq-alphal6 koder ligeledes et polypeptid med 184 aminosyrer (signalpeptid 23 aminosyrer, modent protein 161 aminosyrer).

DK 167929 B1 12 DNA-sekvensen fra klonen pEH63 er med hensyn til den proteinkodende region meget lig sekvensen fra klonen pAH50, hvilket kan udnyttes til ekspression af genet (se Eksempel M, Fig. 11 og 15). Interferonet fra klon 5 pRH63 blev på grund af den høje homologi med EqIFN-al-phal (fra klon pAH50) betegnet EqIFN-alpha2. Modent EqIFN-alpha2 udviser sammenlignet med EqIFN-alphal kun to afvigende aminosyrerester ved den C-terminale ende, hvorved der ved udvekslingen Ser—Cys ved position 151 10 hos EqlFN-alpha2 findes en femte cysteinrest ved en ikke tidligere hos noget andet interferon observeret position (se Fig. 19).

løvrigt gælder det for EqIFN-alphal anførte også for EqIFN-alpha2.

15 DNA-fragmentet fra Eq-alpha20 indeholder den ko dende sekvens for et protein med 172 aminosyrer og et hydrofobt signalpeptid med 23 aminosyrer. Ved position 78-80 hos det modne protein findes et potentielt N-gly-cosyleringssted Asn-Thr-Thr, der nøje svarer til det hos 20 EqIFN-β, HuIFN-8, MuIFN-β, MuIFN-alphal,2,4,5,6 (Fig.19).

Proteinsekvenserne i denne figur er ordnet således, at der blev opnået den størst mulige homologi mellem de enkelte interferoner. Til sammenligning af IFN-alpha- og IFN-β-sekvenser blev sidstnævnte forskubbet 3 25 aminosyrer, og der blev indført et mellemrum. Den parvise sammenligning af aminosyresekvenserne i Fig. 20 foregik ud fra denne ordning over den længste fælles længde af proteinerne.

Af Fig. 19 og 20 fremgår, at det af DNA-sekven-sen fra klon pRH61 kodede : protein er beslægtet med type 1-interferonerne (alpha- og β-IFN). Karakteristika'ene med 172 aminosyrer, glycosyleringssted ved position 78 og den omtrent lige så store homologi for interferonerne fra denne klasse mellem forskellige arter (menneske, 33 kvæg, hest) som mellem disse længere interferoner og al-pha-interferonerne inden for én slægt, samt de forskellige mål for hybridiserende DNA-fragmenter med alpha-inter-feron og prober fra klonen pRH61 (Fig. 18) lader formo- DK 167929 B1 13 de, at insertionen fra klonen pRH61 tilhører en hidtil ukendt klasse af type 1-interferoner, der betegnes interferon-omega (33). Denne betegnelse er mindre misvisende end den af Capon et al. (34) anvendte: Type I, 5 klasse Il-interferon, der kunne føre til forveksling med Type Il-interferon (IFN-gamma).

Sekvensen af heste-beta-interferon blev bestemt analogt med sekvensen af alpha-formen. Det længste åbne læseraster for beta-lFN-genet koder for et polypetid 10 med 186 aminosyrer, hvorhos også i dette tilfælde homo-logien med kendte beta-interferoner fra andre arter kunne observeres. Ligesom det humane, de tre okse- og de murine beta-interferoner udviser også heste-beta-inter-feronet et hydrofobt signalpeptid med 21 aminosyrer.

15 Overraskende viste det sig også ved beta-interfe ron, ved parvis sammenligning af aminosyresekvenserne, at heste-beta-interferon udviser en større homologi med det humane beta-interferon (59%) end med kvæg- (50-55%) eller muse-beta-interferonerne (44%) (Fig. 6).

20 På den anden side mangler, trods den overraskende høje homologi heste/menneske-beta-interferon, ligesom hos de tre okse-beta-interferoner den i humant betainterferon ved postiton 119 beliggende aminosyre også i heste-beta-interferonet.

25 Heste-beta-interferonet bærer to potentielle N- glycosyleringssteder: ved position 80 af det modne protein (ASN-GLU-THR, ligesom ved human- og muse-beta-inter-feronet) og ved position 115 (ASN-THR-THR) . Ved okse-be-ta-interferonerne er der lokaliseret to mulige N-glyco-30 syleringssteder ved position 110 (henholdsvis ASN,PHE-THR og ASN-SER-PHE) og 152 (henholdsvis ASN-VAL-SER og ASN-PHE-SER).

Ligesom hos kvæg og hos menneske er de 3 cystein-rester nøjagtigt bevaret (position 17, 31 og 140 hen-35 holdsvis 141 hos menneske).

DK 167929 B1 14 På dette sted skal det nævnes, at der ved de omhandlede interferoner ikke blot er tale om de modne interferoner, der er beskrevet detaljeret, men også om sådanne modifikationer af disse polypeptider, der ikke væ-5 sentligt ændrer . heste-iFN-aktiviteten. Disse modi fikationer omfatter f.eks. forkortning af molekylet, f.eks. ved den N- eller C-terminale ende, udveksling af aminosyrer med andre rester, kemiske eller biokemiske bindinger af molekylet til andre molekyler, der er in-10 differente eller inaktive. Ved sidstnævnte modifikationer kan der for eksempel være tale om hybridmolekyler af ét eller flere af de omhandlede interferoner og/eller kendte a- eller β-interferoner.

Opfindelsen angår derfor ikke blot gen-sekvenser, 15 der koder specifikt for de omhandlede interferoner, men også modifikationer, der kan vindes let og rutinemæssigt ved mutation, nedbrydning, transposition eller addition. Enhver sekvens, der koder for de omhandlede interferoner (dvs. de, der udviser det biologiske aktivitetsspektrum, 20 som her er beskrevet) og sammenlignet med de viste er degenereret, er også omfattet. Fagfolk på området er i stand til at degenerere DNA-sekvenserne af de kodende regioner. Ligeledes er omfattet enhver sekvens, der koder for et polypeptid med aktivitetsspektret ifølge de 25 omhandlede interferoner, og som med de viste sekvenser (eller dele deraf) hybridiserer under stringente betingelser (for eksempel betingelser, der udvælger mere end 85%, fortrinsvis mere end 90% homologi).

Hybridiseringerne gennemføres i 6 x SSC/5xDen-20 hårdt's opløsning/0,1% SDS ved 65°C. Stringensgraden fastlægges i vaske trinnet. Således er, for en udvælgelse på DNA-sekvenser med ca. 85% eller højere homologi, betingelserne 0,2 x SSC/0,01% SDS/65°C egnede, og for en udvælgelse på DNA-sekvenser med ca. 90% eller højere ho-25 mologi egner sig betingelserne 0,1 x SSC/0,01% SDS/65°C.

Omhandlede interferon-gener kan under visse betingelser indføres i enhver organisme, der fører til høje udbytter. Egnede værter og vektorer er fagmanden be- DK 167929 B1 15 kendt. Eksempelvis kan henvises til europæisk patentpublikation EP-A-0.093.619.

Til ekspressionen foretrækkes navnlig prokaryo-ter, for eksempel E.coli K 12, stamme 294 (ATCC Nr. 31 5 446) eller E.coli X1776 (ATCC Nr. 31.537). Ligesom ovennævnte stammer kan der også anvendes E.coli W 3110 (F , Lambda”, Prototroph, ATCC Nr. 27325), baciller, såsom Bacillus subtilis, og andre enterobacteriaceae, såsom Salmonella typhimirium eller Serratia marcescens og for-10 skellige Pseudomonader.

I almindelighed kan der i forbindelse med disse værter anvendes plasmid-vektorer, der indeholder repli-kon- og kontrolsekvenserne, som stammer fra arter, der er kompatible med værtcellerne. Vektoren bærer sædvanliges vis foruden et replikationssted identifikationssekvenser, der gør det muligt at udvælge de transformerede celler fænotypisk. For eksempel transformeres E.coli sædvanligvis med pBR322, et plasmid, der stammer fra E.colirarter (Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)). pBR322 indeholder 20 gener for ampicillin- og tetracyclin-resistens og leverer dermed simple midler til identifikation af transformerede celler. pBR322-Plasmidet eller også andre plas-mider skal endvidere i sig selv indeholde promotorer og skal i den retning være således modificeret, at de indeks holder promotorer, som af den mikrobielle organisme kan anvendes til ekspression af dens egne proteiner. De promotorer, der hyppigst anvendes ved fremstillingen af re-kombinant DNA, omfatter beta-lactama;se (penicillinase) og lactose-promotor-systemer (Chang et al. Nature 275, 30 615 (1978), Itakura et al., Science 198, 1056 (1977),

Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979) og Tryptophan (trp)-promotor-systemer (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980), europæisk patentpublikation EP-A-0.036,776) . Mens de nævnte er de sædvanligste promotorer, er der

*5 C

yderligere udviklet og anvendt andre mikrobielle promotorer. Gen-sekvensen for de omhandlede interferoner kan for eksempel indsættes under kontrol af venstre-promoto-ren fra bakteriophagen Lambda (P^). Denne promotor er en DK 167929 B1 16 af de promotorer, der er kendt som særligt stærk, og som er styrbar. Styringen muliggøres af Lambda-repressoren, for hvilken nabostillede restrikstionskløvningssteder er kendt.

5 Et temperaturfølsomt allel for dette repressor- gen kan indføres i en vektor, der indeholder en fuldstændig IFN-omega-sekvens. Hvis temperaturen forhøjes til 42°C, inaktiveres repressoren, og promotoren ekspri-meres til dens maksimale koncentration. Summen af mRNA, 10 der produceres under disse betingelser, skal være tilstrækkelig til, at der vindes en celle, som blandt sine nye syntetiske ribonucleinsyrer indeholder ca. 10%, der stammer fra P - promotoren. På denne måde er det muligt 4-1 at etablere en klon-bank, hvori en funktionel IFN-se-15 kvens er placeret nabostillet til et ribosom-bindings-sted i varierende afstande til Lambda-P—promotoren. Dis-

Jj se kloner kan derefter undersøges, og de med det højeste udbytte kan udvælges.

Ekspressionen og translationen af en sekvens, der 20 koder for de omhandlede proteiner, kan også forløbe under kontrol fra andre regulationssystemer, der kan gælde for "homologe" med organismen i dens ikke-transformerede form. Således indeholder f.eks. chromosomalt DNA fra en lactose-afhængig E.coli en lactose- eller Lac-operon, 25 der ved udløsning af enzymet beta-galactosidase muliggør lactose-nedbrydningen.

Lac-Kontrolelementerne kan vindes fra bakterio-phagen Lambda-plac5, der er infektiøs for E.coli. Lac-Operonet fra phagen kan ved transduktion stamme fra sam-me bakterieart. Regulationssystemer, der kan finde anvendelse ved den omhandlede fremgangsmåde, kan stamme fra plasmidisk DNA, der er egent for organismen. Lac-promotor-operator-systemet kan induceres med IPTG.

Andre promotor-operator-systemer eller dele deraf O c kan lige så godt anvendes, eksempelvis arabinose-operator, collicin E^-operator, galactose-operator, alkalisk phos-phatase-operator, trp-operator, xylose-A-operator, tac-promotor, og andre.

DK 167929 B1 Ϊ7

Foruden prokaryoter kan der også anvendes eukaryo-tiske mikroorganismer, såsom gærkulturer. Saccharomyces cerevisiae er den mest anvendte blandt de eukaryotiske mikroorganismer, men en række andre arter kan vindes al-5 ment. Til ekspression i Saccharomyces bliver for eksempel plasmidet YRp7 (Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979) , Kingsman et al., Gene 1_, 141 (1979), Tschumper et al., Gene 10, 157 (1980)) og plasmidet YEp 13 (Bwach et al., Gene' 8, 121-133 (1979)) anvendt på sædavnlig må- 10 de. Plasmidet YRp7 indeholder TRPl-genet, der yder en selektioner ingsmarkering for en gærmutant, som er ude af stand til at vokse i tryptophanholdigt medium, for eksempel ATCC 44076.

Forekomsten af TRP1-tabet som karakteristikum for 1 5 gærvært-genomet udgør da et yirksomt hjælpemiddel til påvisning af transformation, idet der dyrkes uden tryptophan. Ganske tilsvarende forholder det sig med plasmidet YEpl3, der indeholder gær-genet LED 2, som kan anvendes til komplettering af en LEU-2-minus-mutant. Egne-20 de promotor-sekvenser for gær-vektorer omfatter den 5'-flankerende region for genet for ADH I (Ammerer G., Methods of Enzymology 101, 192-201 (1983)), 3-phosphogly-cerat-kinase (Hitzeman et al., J. Biol.Chem. 255, 2073 (1980) ) eller andre glycolytiske enzymer (Kawaski og 25 Fraenkel, BBRC 108, 1107-1112 (1982)), såsom enolase, glycerolaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, hexokinase, py-ruvat-decarboxylase, phosphofructokinase, glucose-6-phosphat-isomerase, phosphoglucose-isomerase og -gluco-kinase. Ved koncentrationen af egnede ekspressionsplas-mider kan de med disse gener associerede terminations-sekvenser ligeledes indsættes i ekspressions-vektoren ved 3'-enden af den sekvens, der skal eksprimeres, for at sørge for polyadenylering og termination af mRNA'et.

Andre promotorer, der yderligere har fordelen ved den af vækstbetingelser styrede transskription, er promotor-regionerne fra generne for alkohol-dehydrogenase-2, isocytochrom C, surt-phosphatase-nedbrydende enzymer, der er sammenkoblet med nitrogen-stofskiftet, det ovennævnte glycerolaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase og en- DK 167929 B1 18 zymer, der er ansvarlige for forarbejdning af maltose og galaktose. Promotorer, der reguleres af gær-mating-type-Locus, for eksempel promotorerne fra generne BARI, MFal, STE2, STE3, STE5, kan anvendes til temperaturre-5 gulerede systemer ved anvendelse af temperaturafhængige sir-mutationer. (Rhine PH.D. i Thesis, University of Oregon, Eugene, Oregon (1979), Herskowitz og Oshima, The Molecular Biology of the Yeast' Saccharomyces, del I, 181-209 (1981), Cold Spring Harbor Laboratory). Disse muta-tioner påvirker ekspressionen af de hvilende mating-type-kassetter af gærarter og dermed indirekte de ma-tingtype-afhængige promotorer. Generelt er imidlertid enhver plasmid-vektor, der indeholder en gær-kompatibel promotor, oprindelige replikations- og terminationsse-15 kvenser, egnet.

Foruden mikroorganismer er kulturer af multicel-lulære organismer ligeledes egnede. I princippet kan enhver af disse kulturer benyttes, uanset om den kommer fra hvirveldyr- eller ikke-hvirveldyr-kulturer. Størst inter-20 esse har imidlertid hvirveldyrceller, således at formeringen af hvirveldyrceller i kultur (vævskultur) i de senere år er blevet til en rutinemæssig metode (Tissue, Culture, Academic Press, Kruse og Patterson, Editors (1973)). Eksempler på sådanne naturlige værtcellelinier 25 er VERO- og HeLa-celler, Hamster-æggestok(CHO)-celler og WI38, BHK, COS-7 og MDCK-cellelinier. Ekspressionsvektorer for disse celler indeholder sædvanligvis (om nødvendigt) et replikationssted, en promotor, der er lokaliseret før det gen, der skal eksprimeres, samt ethvert nød-30 vendigt ribosombindingssted, RNA-splejsningssted, poly-adenyleringssted og transkriptionelle terminations-se-kvenser.

Ved anvendelse i pattedyrceller sikres kontrolfunktionerne på ekspressions-vektorerne ofte af viralt 35 materiale. Eksempelvis stammer de sædvanligt anvendte promotorer fra Polyoma Adenovirus 2, og særligt ofte fra DK 167929 B1 T9

Simian yirus 40 (SV 40). De tidlige og sene endepromoto-rer fra SV 40 er særligt nyttige, da begge let kan vindes fra virus'en som fragment, der også endnu indeholder det virale replikationssted fra SV 40 (Fiers et al., Na-5 ture 273, 113 (1978)). Der kan også anvendes mindre eller større fragmenter af SV 40, forudsat at de indeholder den næsten 250 bp lange sekvens, der strækker sig fraHindlll-kløvningsstedet til Bgl 1-kløvningsstedet i det virale replikationssted. Yderligere er det også muligt og ofte 10 anbefalelsesværdigt at anvende promotor- og kontrol-sekvenser, der normalt er forbundet med de ønskede gensekvenser, forudsat at disse kontrol-sekvenser er kompatible med værtcellesysternet.

Et replikationssted kan enten være tilvejebragt 15 ved passende vektorkonstruktion, for at indbygge et exo-gent sted, f.eks. fra SV 40 eller andre virale kilder (f.eks. Polyoma, Adeno, VSV, PBV, osv.), eller kan tilvejebringes af de chromosomale replikationsmekanismer hos værtcellen. Hvis vektoren integreres i værtcellechro-20 mosomet, er det for det meste tilstrækkeligt med sidstnævnte foranstaltning.

Generne kan imidlertid fortrinsvis eksprimeres i et ekspressions-plasmid pERl03 (E.Rastl.-Dworkin et al., Gene 21, 237-248 (1983) og europæisk patentpublikation 25 EP-A-0.115.613 -deponeret hos DSM under nummer DSM 2773 den 27. oktober 1983) eller også i plasmidet parpER33 (EP-A-0.115.613), da disse vektorer indeholder alle re-gulationselementerne, der fører til en høj ekspressionsgrad for de klonede gener.

30 Ud fra ekspressionsplasmidet parpER33 blev den for den forhøjede plasmidstabilitet i E.coli ansvarlige "par"-sekvens og tryptophan-promotor-operator-sekvensen samt det kunstige ribosomale bindingssted indsat i plas-midvektoren pAT153. pATl53 er et forkortet derivat af 35 plasmidet pBR322, der mangler et afsnit, som er nødvendigt for mobiliseringen af DNA (36).

DK 167929 Bl 20

Fremgangsmåden, yed fremstilling af plasmid parpATERl03 er. vist i Fig. 13. Plasmidet parpER33 blev kløvet fuldstændigt med Hindlll og partielt med EcoRI, det dannede 0/47 kb lange DNA-fragment blev isoleret fra 5 en agarosegel og renset og ligeret med EcoRI- og Hindlll-dobbeltkløvet pAT153. Et efter transformation af E.coli HB101 vundet plasmid af den ønskede struktur, der bestemtes ved fordøjelse med forskellige restriktionsenzymer, blev betegnet parpATERl03. Dette plasmid indeholder re-10 plikationskilden og ampicilin-resistensgenet fra plasmid pAT153 samt den for stabiliseringen af E.coli virksomme par-sekvens og det for den effektive ekspression af gener anvendelige tryptophan-promotor-operator-område og ribo-somale bindingssted.

15 Fremstillingen af ekspressionsplasmiderne pAH52, pAH52/2 og pAH53 samt deres forstadier er vist i Fig. 14. Til fremstilling af ekspressionsplasmiderne blev plasmidet pAH50 fordøjet med Hindll, og det 4,2 kb lange DNA-fragment, der indeholder det totale EqIFN-al-gen, blev 20 isoleret og renset. Enderne af Hindll-fragmentet blev forsynet med SphI-linkere. Derefter blev DNA'et fordøjet med Sphl, ekstraheret med phenol og chloroform og udfældet med ethanol. DNA'et blev cirkulariseret med ligase og E.coli HB101 transformeret. Et plasmid af den Ønskede 25 struktur fik betegnelsen pAH51. Det indeholder EqlFN-al-genet med en forkortet 3'-ikke-translateret region og et yderligere Sphl-kløvningssted.

For i slutkonstruktionen at forbinde DNA-sekven-sen for det modne heste-a-interferon med promotorsekven-30 sen i den rigtige afstand gik man ud fra et 0,4 kb langt DNA-fragment, der blev isoleret fra med PvuII kløvet plasmid pAH50. Syntetisk 15mert oligonucleotid med sekvensen 5'-TGTGACCTGCCTCAC blev kinaseret med polynucleo-tid-kinase. Det indeholder den sekvens, der koder for de 35 første 5 aminosyrer i det modne EqIFN-al fra klon pAH50.

Den 15-mere blev blandet med 0,4 kb PvuII-fragmentet, og DK 167929 B1 21 DNA-dobbeltstrengen bley denatureret. Den til enkeltstrengen bundne oligonucleotid-primer blev forlænget med Klenow-fragmentet. For med sikkerhed at fjerne et eventuelt tilbageværende 3'-overhæng blev DNA1 et derefter in-5 kuberet med T4 DNA-polymerase. Det dannede DNA med lige ender blev ekstraheret med phenol og chloroform og udfældet. Til dette DNA-stykke blev en blanding af to ki-naserede, indbyrdes komplementære oligonucleotider: 12-mer 5'-AGCTTAAAGATG, 8-mer S'-CATCTTTA (europæisk patent-10 ansøgning nr. 83 112 812.9) ligeret, hvilket frembringer et Hindlll-kløvningssted og translationstartcodonen ATG. Begge oligonucleotider blev med ligase ligeret til DNA-fragmentet. Efter inaktivering af enzymet blev det vund-ne DNA kløvet med Hindlll og Bglll, og DNA-fragment med 15 en længde på ca. 190 bp blev isoleret og renset. Det yundne DNA-fragment blev ligeret med Hindlll- og Bglll-dobbeltkløvet pAH51-vektor og E.coli __HB101 transformeret. Fra 65 vundne kolonier blev der ud fra 4 plasmider, der udviste det ønskede restriktionsmønster, isoleret 20 et HindIII/BamHI-DNA-fragment, der blev sekvensbestemt ved Sanger-metoden, hvorved to kloner indeholdt netop den ønskede sekvens. Et sådant plasmid blev betegnet pAH51/2. Dette indeholder sekvensen for modent EqIFN-al med foranstillet translationsstartcodon ATG og Hindlll-25 kløvningssted.

Til fremstilling af ekspressionsplasmiderne pAH52 og pAH52/2 blev plasmidet pAH51/2 kløvet to gange med Sphl og Hindlll, det dannede 1,0 kb lange DNA-fragment blev isoleret fra en agarosegel og ligeret med Hindlll-30 og SphI-dobbeltkløvet plasmid parpATERl03. Et efter transformation af E coli HB101 vundet plasmid med den ønskede struktur blev betegnet pAH52. Det indeholder alle for en inducerbar ekspression af modent EqIFN-al nødvendige informationer. På analog måde blev der ud fra med Hindlll 35 og BamHI dobbelkløvet pAH51/2 og med Hindlll/BamHI klø- DK 167929 B1 22 vet parpATER103 fremstillet plasmidet pAH52/2. Dette ekspressionsplasmid er ca. 0,2 kb større end pAH52 og udviser yderligere et enkelt BamHI-kløvningssted.

Et væsentligt formindsket ekspressionsplasmid til 5 fremstilling af modent EqIFN-al i E.coli, hvori tryptophan -pr omotor, interferon-gen, ampicillin-resistensgen og replikationskilde er orienteret i én retning, blev fremstillet ud fra plasmiderne pAH52 og pBR322: pAH53. pAH52 blev kløvet med Sphl og EcoRI, enzymerne blev in-10 aktiveret ved 70°C, og DNA-enderne blev efter tilsætning af dATP, dGTP, dCTP, dTTP gjort stumpe med Klenow-fragment. DNA-fragmenterne blev fraktioneret efter størrelse på en agarosegel, og et 1,1 kb langt stykke blev isoleret, hvilket stykke indeholder promotor og interferon-15 gen. pBR322 blev fordøjet dobbelt med EcoRI og Pvull, enderne blev som ovenfor beskrevet udjævnet med Klenow-fragment og derefter dephosphoryleret med kalvetarm-phos-phatase. Et DNA-fragment på 2,4 kb i længde blev isoleret fra en agarosegel. De to således vundne DNA-stykker 20 blev forbundet med T4 DNA-ligase og E.coli HB101 transformeret. Et således vundet plasmid, hvori der var tilvejebragt to EcoRI-identificeringssteder, fik betegnelsen pAH53.

På grund af den høje homologi hos generne for 25 EqIFN-al (pAH50) og EqIFN-a2 (pRH63, Fig. 11) er det muligt ud fra ekspressionsplasmidet pAH52/2 og Lambda-sub-klonen pRH63 at fremstille et ekspressionsplasmid for EqIFN-a2 (Fig. 15). Da der indtil det fælles Bglll-sted i det for modent interferon kodende område kun findes to 30 baseforskelle, der imidlertid på grund af den degenererede aminosyrekode ikke bevirker nogen aminosyreforskel, kan den første del af genet for EqIFN-al i ekspressionsplasmidet pAH52/2 også anvendes til ekspressionen af EqIFN-a2. pRH73 blev kløvet to gange med Bglll og BamHI, 35 og det dannede DNA-fragment med en længde på 1,0 kb, der DK 167929 B1 23 indeholder den kodende sekvens for EqIFN-a2 fra den 64. aminosyre, blev isoleret fra en agarosegel. pAH52/2 blev ligeledes kløvet med Bglll og BamHI, enderne blev dephos-phoryleret med kalvetarmphosphatase, og det større af de 5 to dannede DNA-fragmenter blev vundet fra en agarosegel. Dette DNA-stykke indeholder plasmidvektorandelen, promotoren og den kodende sekvens for de første 63 aminosyrer i det modne interferon. De to beskrevne DNA-fragmenter blev forbundet med ligase og E.coli HB101 transformeret.

10 Et således vundet plasmid, der indeholder insertionen i den korrekte orientering (kløvbar med BamHI og Bglll), blev betegnet pAH55. Dette plasmid muliggør ekspressionen af modent EqIFN-a2 i E.coli.

Til fremstilling af et ekspressionsplasmid for 15 EqIFN-β blev først heste-DNA-insertionen fra plasmid pAH60 forkortet ved 3'-enden, og dette blev videre manipuleret således, at der eksprimeres et modent EqIFN-β-protein af en bakteriel promotor. Fremgangsmåden er vist skematisk i Fig. 16. pAH60 blev kløvet med HgiAI. Efter 20 inaktivering af enzymet blev de 3'-overhængende DNA-en-der udjævnet med T4 DNA-polymerase (tilsætning af dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Til de stumpe ender blev SphI-linker ligeret, og det vundne DNA blev kløvet med Sphl og Hindlll. Et dannet DNA-fragment 1,85 kb langt blev iso-25 leret fra en agarosegel og ligeret med Hindlll- og Sphl-dobbeltkløvet plasmid parpATER103. En efter transformation af E.coli HB101 vundet klon med det ønskede plasmid blev betegnet pAH61. Dette plasmid udgør et mellemstadium for den videre konstruktion af ekspressionsplasmi-30 det. pAH61 blev kløvet to gange med BamHI og Sall, og et dannet 1,3 kb langt DNA-f ragment blev isoleret fra en agarosegel, renset og ligeret med BamHI/Sall-dobbeltfor-døjet Ml3mp9 phag-DNA. Efter transformation af E.coli JM101 kunne der ud fra en rekombinant Ml3-phag (M13pAH61)

35 vindes enkeltstrenget phag-DNA. Dette enkeltstrengs-DNA

DK 167929 B1 24 blev blandet med kinaseret 15mert oligonucelotid 51GTGAACTATGACTTG, opvarmet til 95°C og langsomt afkølet til stuetemperatur. Oligonucelotidet binder nøjagtigt fra den første base af sekvensen af det modne β-interfe-5 ron. Andenstrengsyntesen på enkeltstreng-forlaget, udgående fra 15mer-primeren, gennemførtes efter tilsætning af dATP, dGTP, dCTP, dTTP og Klenow-fragment. DNA'et blev ekstraheret og udfældet. Tilbageværende, enkeltstrengede DNA-afsnit blev fordøjet med Sl-nuclease. Til det ved 10 denne behandling med stumpe ender forsynede DNA blev der tilligeret blandingen af 12mer- og 8mer-oligonucleoti-derne 5'-AGCTTAAAGATG og 5'-CATCTTTA, og det dannede DNA blev kløvet med Hindlll og SphI. Et DNA-fragment af den ønskede længde på 1,1 kb blev isoleret fra en agarosegel 15 og ligeret med Hindlll/Sphl-dobbeltkløvet plasmid parpATERl03. Efter transformation af E.coli HB101 vandtes 54 kolonier. Fra 9 derfra isolerede plasmid-DNA'er blev der isoleret et 1,3 kb langt EcoRI/Sall-fragment, der blev sekvensbestemt ved Sanger-metoden. Et derfra 20 vundet plasmid med den ønskede sekvens blev betegnet pAH62. Dette plasmid muliggør den effektive ekspression af modent EqIFN-β-protein i E.coli. Et plasmid, der bærer en deletion af den første base (G) fra det modne β-IFN-gen, blev betegnet pAH62deltaGl. Dette plasmid til-25 lader ekspression af et ved amino-terminus forkortet β-IFN ved translationsstart ved det næstfølgende ATG (svarer til am:nosyre 19 i det modne β-IFN), hvilket overraskende udviser antiviral aktivitet, omend tydeligt svagere sammenlignet med det uforkortede protein.

30 Til påvisning af ekspressionen af interferon-ak tiviteten med E.coli HB101, der indeholder plasmidet pAH52, pAH52/2, pAH53, pAH55 eller pAH62, blev bakterierne efter inkubation i et egnet dyrkningsmedium opbrudt, og supernatanten blev efter sterilfiltrering testet for 35 interferonaktivitet ved en prøve, der savner den cyto- DK 167929 B1 25 pathiske effekt (CPE) af VSV eller EMCV. Hertil anvendtes NBL-6-celler (ATCC CCL 57, hestehud-epidermis-cel-ler), der var inficeret med Vesicular-Stomatitis-Virus (VSV), og/eller A549 (ATCC CCL185, human lungecarcinom-5 cellelinie), der var inficeret med Encephalomyocarditis-Virus (EMCV)- Resultaterne er vist i Eksempel 0.

Påvisningen af de eksprimerede heste-interferoner blev opnået ved mærkning af proteinerne i maxiceller. Plasmidkodede proteiner kan ved anvendelse af maxicelle-10 teknik (37) mærkes selektivt in vivo. E.coli-stammen CSR603 (CGSC 5830) F-, thr-1, leuB6, proA2, phr-1, recAl, argE3, thi-1, uvrA6, ara-14, lacYl, galK2, xyl-5, mtl-1, gyrA98 (nalA98), rpsL31, tsx-33, λ”, supE44,) har ingen mekanisme til reparation af DNA-skader opstået ved UV-15 bestråling. Ved bestråling med en egnet UV-strålingsdo-sis ødelægges det bakterielle chromosom, hvorimod nogle af de væsentligt mindre og i flere kopier pr. celle foreliggende plasmid-DNA'er forbliver funktionelle. Efter dræbning af alle ikke-beskadigede, formerende celler med 20 antibioticum'et D-cycloserin og opbrydning af det endogene mRNA bliver i de tilbageværende celler kun endnu ved plasmid kodede gener transkriberet og translateret, og de dannede proteiner kan mærkes radioaktivt ved ind-bygning af S-methionin og påvises. E.coli CSR603 blev 25 på sædvanlig måde transformeret med ekspressionsplasmi-derne og selektioneret for transformerede bakterier på ampicillinholdige agarplader. Præparationen af maxicellerne og mærkningen af proteinerne foregik ved en metode ifølge A. Sancar (37). I Fig. 17 er vist autoradiogram-30 met for den tørrede gel. Som molekylvægtstandard anvendtes en ^C-methyleret proteinblanding (Amersham) . Som kontroller anvendtes plasmidet pER103, der kun indeholder promotoren uden interferon-gen, og plasmidet pER21/l, der indeholder to kopier af det humane IFN-a2arg-gen.

35 Proteinbåndene ved ca. 18 kd er de af plasmiderne eksprimerede interferoner.

26 DK 167929 B1

Til påvisning af totalantallet af sekyenser i hestegenomet, der udviser høj homologi med interferongenerne fra klasse IFN-α, IFN-β eller IFN-omega, blev højmolekylært heste-DNA fordøjet fuldstændigt med det 5 pågældende restriktionsenzym, og dette kløvede DNA blev opdelt efter størrelse. Efter Southern-overføring på nitrocellulosefiltre, denaturering og fiksering af DNA*et blev hvert filter hybridiseret med nicktranslateret probe. Som probe for EqIFN-a anvendtes et 1,0 kb langt 10 Hindlll/SphI-fragment fra plasmid pAH52, for EqIFN-β anvendtes et 1,1 kb langt HindIII/SphI-fragment fra plasmid pAH62, der hver indeholder den kodende sekvens for det totale modne interferon. Som probe for EqlFN-omega anvendtes 2,1 kb EcoRI-insertionen fra plasmid pRH61.

15 Filtrene blev derefter vasket under stringente betingelser, således at der ikke skete nogen krydshybridisering mellem disse 3 interferonsekvenser: Autoradiografi foregik på DuPont Cronex røntgenstrålefilm under anvendelse af Kodak Lanex-Regular-forstærkerfolie 7 dage ved -80°C.

20 Resultatet er vist i Fig. 18. Det viste overraskende, at der i hestegenomet findes mindst 7 gener fra IFN-a-klas-sen, mindst 2 gener fra IFN-β-klassen og mindst 8 gener fra IFN-omega-klassen.

Til fremstilling af ekspressionsplasmidet pRH 100 25 blev plasmidet pER 103 (Eva Dworkin-Rastl et al., Gene 21 (1983) 237-248, europæisk patentpublikation EP-A-0.115-613) lineariseret med restrikstionsnucleasen Hindlll, og de 5'-terminale phosphatrester blev fjernet.

Dette plasmid-DNA blev blandet og ligeret med de 30 phosphorylerede oligonucleotider d (AGCTTAAAGATGAGCT) og d (CATCTTTA)). Ligase-reaktionen blev fordøjet med re-striktionsendonucleasen SacI og ligeret ved tilsætning af T4-PNK. Oligonucleotiderne blev fremstillet analogt med de i EP-A-0.115-613 beskrevne metoder.

35 Kompetent E.coli HB101 blev forsynet med denne ligasereaktion og inkuberet.

DK 167929 B1 27

Fra de dannede bakteriekolonier blev der udsøgt 12 vilkårlige, og derfra blev i mikroraålestok plasmider-ne isoleret (Birnboim og Doly, Nucl. Acids Res. 7 (1979) 1513-1523). Det resulterende DNA blev kløvet med restrik-5 tionsendonucleasen SacI, og DNA*et blev opdelt på en aga-rosegel (1%, lxTBE-puffer). Vandringen af DNA'et som lineært molekyle af størrelsen ca. 4.400 bp bekræftede indføringen af et Sacl-identificeringssted i plasmidet. Et af disse plasmider blev udsøgt vilkårligt. Med DNA'et 10 fra den dertil hørende minipraeparation blev igen E.coli HB101 transformeret. Fra de resulterende transformerede bakterier blev en koloni udvalgt og dyrket i større målestok. Det herfra isolerede plasmid blev kløvet med re-striktionsendonucleaserne EcoRI og BamHI, DNA'et blev op-15 delt på en 1%'s agarosegel, og det mindre fragment blev isoleret fra gelen ved elektroeluering. Dette ca. 460 bp lange EcoRI-BamHI-DNA-fragment blev sekvensbestemt ifølge Sanger. (F. Sanger et al., Proc.Natl.Acad.Sci. (1977) 5463-5467). Det således analyserede plasmid blev beteg-20 net pEH 100.

Transformation af cellerne med vehiklerne kan opnås på flere forskellige måder. Eksempelvis kan den ske med calcium, idet enten cellerne vaskes i magnesium, og DNA'et sættes til de i calcium suspenderede celler, el-25 ler cellerne udsættes for et cobundfald af DNA og dal-ciumphosphat. Ved efterfølgende genekspression bliver cellerne overført til medier, der selekterer for transformerede celler.

Efter gennemført transformation af værten, eks-30 pression af genet og forgæring eller celledyrkning under betingelser, ved hvilke de omhandlede proteiner eks- DK 167929 B1 28 primeres, kan produktet ekstraheres på sædvanlig måde ved kendte chromatografiske adskillelsesmetoder, for herved at vinde et materiale, der indeholder proteinerne med eller uden "leader"- og “tailing"-sekvenser. De om-5 handlede interferoner kan eksprimeres med en "leader"-sekvens ved N-terminus (Pre-IFN), der kan fjernes af nogle værtceller. Hvis dette ikke sker, er en fraspaltning af "leader"-polypeptidet (om tilstede) nødvendig for at vinde modent IFN. Alternativt kan IFN-klonen modifice-10 res således, at det modne protein produceres direkte i mikroorganismen i stedet for Pre-IFN. For dette tilfælde kan der anvendes precursor-sekvensen af gær-matihg- · pheromonet MF-alpha-1 for at sikre en korrekt "modning" af det fusionerede protein og udskillelse af produkterne 15 i vasks tmediet eller det periplasmiske rum. DNA-sekvensen for funktionelt eller modent IFN kan være forbundet med MF-alpha-1 ved de formodede kathepsin-lignende kløvningssteder (efter Lys-Arg) ved position 256 fra initiations-codonen ATG (Kurjan, Herskowitz, Cell 3(), 933-943 (1982)). 20 Baseret på deres biologiske virknings spektrum er de hidtil ukendte, omhandlede interferoner anvendelige for enhver behandlingsart, for hvilken også de kendte interferoner benyttes. Disse omfatter eksempelvis herpes, rhinovirus, heste.-/hunde-abortvirus, forskellige kræft-25 arter og lignende. De hidtil ukendte interferoner kan anvendes alene eller i kombination med andre kendte interferoner eller biologisk aktive produkter, for eksempel med IFN-alpha, IL-2, andre immun-modulatorer og lignende.

De omhandlede interferoner kan gives parenteralt 30 i tilfælde, hvor der kræves antitumor-behandling eller antiviral behandling, og i tilfælde, hvor der viser sig immunosuppressive egenskaber. Dosering og doseringsrate kan svare til, hvad der for nærværende gælder for kliniske undersøgelser med IFN-a-materialer, f.eks. ca.

35 (1-10) x 10° enheder dagligt, og for præparater, der er 7 mere end 1% rene, op til eksempelvis 5 x 10 enheder dag- 29 DK 167929 Bl ligt. Eksempelyis kan til en hensigtsmæssig doseringsform ved et i det væsentlige homogent, bakterielt produceret IFN ifølge opfindelsen og ved parenteral anvendelse^ mg IFN-omega opløses i 25 ml 5%'s dyrisk seru-5 malbumin, fortrinsvis heste/hunde-serum. Denne opløsning ledes derefter gennem et bakteriologisk filter, og den filtrerede opløsning fordeles aseptisk på 100 flasker,

C

der hver indeholder 6 x 10 enheder rent IFN egnet til parenteral anvendelse. Forud for anvendelse bliver glas-10 sene fortrinsvis opbevaret i kulden (-20°C). De omhandlede stoffer kan på kendt måde indarbejdes til opnåelse af farmaceutisk anvendelige midler, idet det omhandlede polypeptid blandes med et farmaceutisk acceptabelt bærestof. Anvendelige bærestoffer og deres sammensætning er 15 beskrevet af E. W. Martin i Remingtom's Pharmaceutical Sciences, hvortil der her specielt skal henvises. De omhandlede interferoner blandes med en tilmålt mængde bærestof med henblik på at tilvejebringe egnede farmaceutiske midler, der kan benyttes effektivt af modtageren 20 (patienten). Der foretrækkes en parenteral anvendelse.

Ved hjælp af den foreliggende opfindelse er det således for første gang muligt at vinde hesteinterferoner og de for disse kodende gensekvenser.

Genstand for opfindelsen er detaljeret: 25 Proteiner:

Heste-alpha-interferoner, i det væsentlige frie for andre proteiner af dyrisk herkomst, - i en i det væsentlige ren form, - frie for nativ glycosylering, 30 - indeholdende et "leader"-peptid, - indeholdende en aminosyresekvens ifølge formel I, II, VI eller VII, eller biologiske aktive varianter af disse sekvenser, - fremstillelige ved den omhandlede fremgangsmåde.

35 Heste-omega-interferoner, i det væsentlige frie DK 167929 Bl 30 for andre proteiner af dyrisk herkomst, - i en i det væsentlige ren form, - frie for nativ glycosylering, - indeholdende et "leader"-peptid, 5 - indeholdende en aminosyresekvens ifølge formel IV eller VIII eller biologisk aktive varianter af disse sekvenser, - fremstillelige ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

10 Heste-beta-interferoner, i det væsnetlige frie for andre proteiner af dyrisk herkomst, - i en i det væsentlige ren form, - frie for nativ glycosylering, - indeholdende et "leader"-peptid, 15 - indeholdende en aminosyresekvens ifølge formel III eller biologisk aktive varianter af disse sekvenser, - fremstillelige ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

20 DNA-sekvenser: - sekvenser kodende for EqIFN-alpha, - sekvenser kodende for EqIFN-alpha eller degenererede variationer af disse sekvenser, der er indføjet i EcoRI- eller Hindlll-kløyningsste- 25 det for plasmidet pUC9 eller pUC8, DK 167929 B1 31 - plasmidet pAH50, - plasmidet pRH63, - plasmidet pRH82, -^plasmidet pRH83, 5 - sekvenser kodende for EqIFN-alpha eller degene rerede variationer af disse sekvenser, der under stringente betingelser, som lader erkende en homologi større end 85%, fortrinsvis større end 95%, hybridiserer med insertionerne fra 10 plasmidet pRH82, pRH83, pAH50 eller pRH63, - for EqIFN-alpha kodende sekvenser eller degenererede variationer af disse sekvenser, der er indeholdt i en ekspres s ionsvektor, som er re-plicerbar i mikroorganismer, fortrinsvis i pro- 15 karyoter eller eukaryoter og i pattedyrceller, - DNA-sekvensen ifølge formel I, II, VI eller VII eller degenererede variationer af disse sekvenser, - for EqIFN-omega kodende sekvenser, 20 - for EqIFN-omega kodende sekvenser eller degene rerede variationer af disse sekvenser, der er indføjet i EcoRI-kløvningsstedet for plasmidet pUC9 eller pUC8, - plasmidet pRH61, 25 - plasmidet pRH62, - for EqIFN-omega kodende sekvenser eller degenererede variationer af disse sekvenser, der under stringente betingelser, som lader erkende en homologi større end 85%, fortrinsvis større 30 end 95%, hybridiserer med insertionerne fra plasmidet pRH61 eller pRH62, - for EqIFN-omega kodende sekvenser eller degenererede variationer af disse sekvenser, der er indeholdt i en ekspres s ions vektor, som er re- 35 plicerbar i mikroorganismer, fortrinsvis i pro- karyoter eller eukaryoter og i pattedyrceller, DK 167929 B1 32 - DNA-.sekvensen ifølge formel IV eller VIII eller degenererede yarrationer af denr.e sekvens. - - for EqlFN-beta kodende sekvenser, - for EqlFN-beta kodende sekvenser eller degenere- 5 rede variationer af disse sekvenser, der er ind føjet i Hindm-kløvningsstedet for plasmidet pAH60, - plasmidet pAH60, - for EqlFN-beta kodende sekvenser eller degenere- 10 rede variationer af disse sekvenser, der under stringente betingelser, som lader erkende en ho-mologi større end 85%, fortrinsvis større end 95%, hybridiserer med insertionerne fra plasmidet pAH60, 15 - for EqlFN-beta kodende sekvenser eller degenere rede variationer af disse sekvenser, der er indeholdt i en ekspressionsvektor, som er replicer-bar i inikroorganismer, fortrinsvis i prokaryo-ter eller eukaryoter og i pattedyrceller, 20 - DNA-sekvensen ifølge formel III eller degenere rede variationer af denne sekvens,

Transformerede værtorganismer: - der indeholder de for EqIFN-alpha, -omega eller -beta kodende genetiske 25 informationer, fortrinsvis prokaryoter, euka ryoter eller pattedyrceller, navnlig E.coli eller E.coli JM101, - der indeholder de genetiske sekvenser for de omhandlede proteiner i en i værtorgansimerne re- 30 plicerbar vektor.

Plasmider: - plasmid pAH51 karakteriseret ved, at et 4,2 kb langt DNA-fragment af det Hindll kløvede plasmid pAH50 er forsynet med SphI-linkere og efter 35 kløvning cirkulariseret med Sphl, - plasmid pAH51/2 karakteriseret ved, at det i

Hindlll/BgIII-kløvningsstedet for plasmidet DK 167929 B1 33 pAH51, i stedet for det plasmid-egne, længere fragment, indeholder et fragment, der blev vundet ud fra det 0,4 kb lange PvuII-fragment fra plasmidet pAH50 og derefter denatureret i nær- 5 værelse af 15mer-oligonucleotid-primeren 5 TGTGACCTGCCTCAC, forlænget med Klenow-fragment, tilligeret oli-gonucleotidkomplekset

5 AGCTTAAAGATG

10 3'atttctac og kløvet med Hindlll og Bglll, - ekspressionsplasmidet parpATER103 karakteriseret ved, at der i EcoRI/Hindlll-kløvningsste-det for plasmidet pAT153 er indføjet et 0,47 kb 15 langt DNA-fragment fra det med EcoRI partielt og med Hindlll fuldstændigt kløvede plasmid parpER33, - ekspressionsplasmidet pAH52/2 karakteriseret ved, at der i Hindlll/BamHI-kløvningsstedet for 20 plasmidet parpATERl03, i stedet for det plasmid- egne, kortere fragment, er indføjet det 1,0 kb lange Hindlll/BamHI-fragment fra plasmidet pAH51/2, - ekspressionsplasmid pAH52 karakteriseret ved, 25 at der i Hindlll/SphI-kløvningsstedet for plas midet parpATER103, i stedet for det plasmid-egne, kortere fragment, er indføjet Hindlll/Sphl-fragmentet fra plasmidet pAH51/2, - ekspressionsplasmid pAH53 karakteriseret ved, 30 at det med Klenow-fragment udjævnede og dephos- phorylerede 2,4 kb lange EcoRI/PvuII-fragment fra pBR322 er forbundet med et med Klenow-fragment udjævnet, 1,1 kb langt EcoRI/SphI-fragment fra plasmidet pAH52, 35 - ekspressionsplasmid pAH55 karakteriseret ved, at plasmidet pAH52/2, i stedet for det plasmid-egne, kortere BglII/BamHI-fragment udvidser det 1,0 kb lange BglII/BamHI-fragment fra plasmidet pRH63, DK 167929 B1 34 - plasmid pAH61 karakteriseret ved, at der i Hindlll/SphI-kløvningsstedet for plasmidet parpATER.103, i stedet for det plasmid-egne, kortere fragment, er indføjet et 1,85 kb langt DNA- 5 fragment fra det med HgiAI-kløvede plasmid pAH60, der blev udjævnet med T4-DNA-Polymerase, forsynet med SphI-linkere og derefter kløvet med Hindlll og Sphl, - Ml3pAH61 karakteriseret ved, at det 1,3 kb lan- 10 ge BamHI/Sall-f ragment fra plasmidet pAH61 er forbundet med BamHI/Sall-dobbeltf ordø jet Ml3mp9-phag-DNA, - ekspressionsplasmid pAH62 karakteriseret ved, at et ved hjælp af den 15mere

15 5'GTGAACTATGACTTG

som dobbeltstreng udformet, med Sl-nuclease behandlet, med oligonucleotidkomplekset 5'agcttaaagatg 3'atttctac 20 ligeret og med Hindlll og Sphl kløvet fragment fra M13pAH61 er indføjet i Hindlll/Sphl-klØv-ningsstedet for plasmidet parpATER103 i stedet for det plasmid-egne, kortere fragment, - ekspressionsplasmid pRHIOO karakteriseret ved, 25 at der i Hindlll-kløvningsstedet for plasmidet

pER103 er indføjet oligonucleotidkomplekset 5 AGCTTAAAGATGAGCTCATCTTTA

3 ATTTCTACTCGAGTAGAAATTTCGA

Endvidere er beskrevet fremgangsmåder til fremstilling 50 af disse plasmider: - Fremgangsmåde til fremstilling af plasmidet pAH51 karakteriseret ved, at plasmidet pAH50 kløves med Hindli, det 4,2 kb lange fragment for- DK 167929 B1 35 synes med SphI-linkere, kløves derefter med Sphl og cirkulariseres med DNA-ligase, og det således vundne plasmid til replikation transformeres i E.coli HB 101 og dyrkes.

5 - Fremgangsmåde til fremstilling af plasmidet pAH51/2 karakteriseret ved, at plasmidet pAH50 kløves med PyuII, det 0,4 kb lange fragment denatureres i nærværelse af 15mer-oligonucleotid-primeren 10 5 TGTGACCTGCCTCAC, den til enkeltstrengen bundne primer forlænges med Klenow-fragment, et eventuelt 3'-overhæng fjernes, oligonucleotidkomplekset 5 'agcttaaagatg

15 3 ATTTCTAC

tilligeres, det vundne DNA-fragment bliver efter restrikstionsendonuclease-fordøjelse med Hindlll og Bglll indføjet i Hindlll/Bglll-kløv-ningsstedet af plasmidet pAH51 i stedet for det 20 plasmid-egne, længere fragment, og det således vundne plasmid bliver til replikation transformeret i E.coli HB101 og dyrket.

- Fremgangsmåde til fremstilling af plasmidet parpATERl03 karakteriseres ved, at der i det 25 ved restriktionsendonuclease-fordøjelse med

EcoRI og Hindlll lineariserede plasmid pAT153 ved ligasereaktion indføjes et 0,47 kb langt fragment af det med Hindlll fuldstændigt og med EcoRI partielt kløvede plasmid parpER33, og det 30 således vundne plasmid til replikation transfor meres i E.coli HB101 og dyrkes.

- Fremgangsmåde til fremstilling af ekspressions-plasmidet pAH52/2 karakteriseret ved, at der i Hindlll/BamHI-kløvningsstedet af plasmidet 35 parpATERl03, i stedet for det plasmid-egne kor- DK 167929 B1 36 tere fragment, indføjes det 1,0 kb lange HindIII/BamHI-fragment fra plasmidet pAH51/2, og det således vundne plasmid til replikation transformeres i E.coli HB101 og dyrkes.

5 - Fremgangsmåde til fremstilling af ekspressions- plasmidet pAH52 karakteriseret ved, at der i HindiII/SphI-kløvningsstedet for plasmidet parpATERl03, i stedet for det plasmid-egne kortere fragment, indføjes Hindlll/SphI-fragmentet 10 fra plasmidet pAH51/2, og det således vundne plasmid til replikation transformeres i E.coli HB101 og dyrkes.

- Fremgangsmåde til fremstilling af ekspressions-plasmidet pAH53 karakteriseret ved, at det med 15 Klenow-fragment udjævnede og dephosphorylerede 2,4 kb lange EcoRI/PvuII-fragment fra pBR322 sammenføjes med et med Klenow-fragment udjæynet 1,1 kb langt EcoRI/SphI-fragment fra plasmidet pAH52, og det således vundne plasmid til repli-20 kation transformeres i E.coli HB101 og dyrkes.

- Fremgangsmåde til fremstilling af ekspressions-plasmidet pAH55 karakteriseret ved, at der i plasmidet pAH52/2, i stedet for det plasmid-egne kortere Bglll/BamHI-fragment, indføjes det 25 1,0 kb lange BglII/BamHI-fragment fra plasmidet pRH63, og det således vundne plasmid til replikation transformeres i E.coli HB101 og dyrkes.

- Fremgangsmåde til fremstilling af plasmidet pAH61 karakteriseret ved, at der i Hindlll/Sphl- 30 kløvningsstedet for plasmidet parpATER103, i stedet for det plasmid-egne kortere fragment, indføjes et 1,85 kb langt DNA-fragment af det med HgiAI kløvede plasmid pAH60, hvilket fragment udjævnes med T4-DNA-polymerase, forsynes 35 med SphI-linkere og derefter kløves med Hindlll og Sphl, og det således vundne plasmid til replikation transformeres i E.coli HB101 og dyr- DK 167929 B1 37 kes.

- Fremgangsmåde til fremstilling af M13pAH61 karakteriseret ved, at det 1,3 kb lange BamHI/Sall-fragment fra plasmidet pAH61 sammen- 5 føjes med BamHI/Sall-dobbeltfordøjet M13mp9-phag- DNA og til replikation transformeres i E.coli JM101 og dyrkes.

- Fremgangsmåde til fremstilling af ekspressions-plasmidet pAH62 karakteriseret ved, at et ved 10 hjælp af 15meren

5 GTGAACTATGACTTG

som dobbeltstreng udformet, med SI nuclease behandlet, med oligonucleotidkomplekset 5'AGCTTAAAGATG 15 3 ATTTCTAC

ligeret og med Hindi 11 og Sphl kløvet fragment af Ml3pAH61 indføjes i Hindlll/Sphl-kløvnings-stedet for plasmidet parpATER103 i stedet for det plasmid-egne kortere fragment, og det såle-20 des vundne plasmid til replikation transforme res i E.coli HB101 og dyrkes.

Opfindelsen angår endvidere fremgangsmåder til fremstilling af de omhandlede proteiner: - Fremgangsmåde til fremstilling af EqIFN-alpha, -beta eller -omega karakteriseret ved, at 25 a)en værtorganisme, fortrinsvis en prokaryot, eu- karyot eller en pattedyrcelle, navnlig E.coli eller Saccharomyces cerevisiae, transformeres med genetiske informationer, der koder for EqIFN-alpha, -beta eller -omega, hvor den ko-30 dende sekvens er valgt blandt insertioner fra plasmiderne pAH50, pRH63, pRH82, pRH83, pRH61, pAH60 eller pRH62 eller blandt DNA-sekvenser, som hybridiserer med insertionerne fra plasmiderne pAH50, pRH63, pRH83, pRH61, pRH62 eller 35 pAH60 under stringente betingelser, som udviser en homologi større end 85%, fortrinsvis større end 90%, og som koder for et protein med akti- 38 DK 167929 B1 vitetsspektrummet for EqIFN-alpha, -beta eller -omega.

b) den kodende sekvens indeholdes i en ekspressionsvektor, fortrinsvis i en af ekspressionsvektorerne pAH52, pAH52/2, pAH53, pAH55 eller 5 pAH62, og at denne information udtrykkes i værtsorganismen og c) interferonet EqIFN-alpha, -beta eller -omega, fortrinsvis et interferon ifølge en af formlerne I til IV isoleres og renses.

10 Endvidere er anvendelsen af de omhandlede proteiner til fremstilling af et farmaceutisk præparat, samt middel til en terapeutisk behandling, der foruden farmaceutisk indifferente bærestoffer indeholder en virksom mængde af disse proteiner, genstand for opfindelsen.

15 Opfindelsen angår endvidere interferonerne EqIFN- alpha, -beta eller -omega til anvendelse som lægemiddel.

Opfindelsen beskrives nærmere gennem følgende eksempler.

20 Materialer

Udgangsmaterialerne blev delvis erhvervet kommercielt og stammede delvis fra EMBL i Heidelberg. E.coli JM101, pUC8, pUC9, Ml3mp8 og M13mp9 stammede fra Bethes-da Research Laboratories, E.coli-stammerne med suppres- 25 sorfaktoren sup F, for eksempel E.coli NM526, 538 og 539 og vektoren Lambda-EMBL3 eller 3A stammede fra EMBL, men kan delvis også fås fra firmaet Stehelin/Basel (Schweiz).

A) Isolering af heste-DNA

30 Frosset yæv, f.eks. hestelever, blev i flydende nitrogen formalet til fint pulver og inkuberet 3 timer ved 55°C i 0,5M EDTA, lOmM Tris-HCl pH 8,0, 0,5% SDS, DK 167929 B1 39 0,1 mg/ml proteinase K (20 ml/g. væv) - Den. vundne viskose opløsning bley ved en phenol ekstraktion og 3 gange ekstraktion med phenol/chloroform/isoamylalkohol (25/24/1 vol) befriet for protein, dialyseret mod 50mM Tris-H.Cl 5 pH 8,0, lOmM EDTA, lOmM NaCl, og DNA'et blev udfældet med 2 voluminer ethanol. Efter fuldstændig tørring i vakuum blev DNA'et bragt i opløsning i TE-puffer (lOmM Tris-HCl pH 8,0, ImM EDTA) ved 4°C og sammen med 1,273 g CsCl/ml opløsning centrifugeret 62 timer med 40.000 rpm 10 ved 20°C (Sorvall 50Ti-Rotor) . CsCl-Gradienten blev ud-dryppet, de DNA-holdige fraktioner blev dialyseret mod TE-puffer, og DNA'et blev derefter fældet med 2 voluminer ethanol, vasket med 70%1 s ethanol, tørret og igen opløst i TE-puffer (4°C).

15 Det færdige DNA-præparat var frit for RNA og læn gere end 50 kb (bestemt ved elektroforese på en 0,45%'s agarosegel).

B) Partiel endonuclease'-fordøjelse' og størrelsesfraktio-nerin'g af' hes'te-DNA.

20 To gange 50 yg heste-DNA blev inkuberet med 1,6 enheder Sau3A i 450 yl reaktionsmedium (lOmM Tris-HCl pH 7,5, lOmM MgC^, ImM dithiothreitol) ved 37°C. Efter 15, 25 og 40 minutter blev der udtaget aliquoter på 150 yl og tilsat 15mM EDTA, og reaktionen blev stoppet 25 ved 10 minutters opvarmning ved 70°C. Efter tilsætning af 0,3M Na-acetat pH 6,0, blev DNA'et fældet med 2,5 voluminer ethanol. Efter genopløsning i TE-puffer blev DNA'et adskilt elektroforetisk efter størrelse natten over på en 0,45%'s agarosegel i TBE-puffer (10,8 g/1 30 Tris, 5,5 g/1 borsyre, 0,93 g/1 Na2EDTA) ved ca. 1 V/cm.

Ved hjælp af størrelsesraarkører (med EcoRI og Hindlll dobbeltfordøjet og med Hindlll fordøjet Lambda-DNA) blev gelstykket med DNA med en længde på 10-23 kb udskåret, DNA'et elektroelueret fra gelen i en dialyseslange 3 ti-35 mer ved 300V (puffer 0,1 x TBE), renset på en Elutip-D- DK 167929 B1 40 søjle (Schleicher og Schiill) ifølge anvendelsesforskriften og derefter fældet med ethanol.

For at hindre selvligation af heste-DNA-fragmen-ter, hvilket dels kan føre til kunstige hybrider af hes-5 te-DNA-sekvenser og dels til for store og dermed ikke mere i Lambda-phager emballerbare DNA-stykker, blev de størrelsesfraktionerede heste-DNA-stykker dephosphory-leret.

Hertil blev DNA*et inkuberet 30 minutter ved 37°C 10 i 140 μΐ reaktionsmedium (50mM Tris-HCl pH 9,5, l,0mM

MgC^, 0,lmM Zn-acetat, ImM spermidin) med 5 enheder Bovine Intestinal Phosphatase, hvorefter der blev tilsat yderligere 5 enheder enzym og inkuberet 30 minutter.

Efter tilsætning af EDTA til 25mM slutkoncentration blev 15 DNA'et ekstraheret én gang med phenol/chloroform/isoamyl-alkohol (25/24/1 vol), 2 gange med chloroform/isoamylal-kohol (24/1 vol) og 3 gange med diethylether, fældet med ethanol, tørret og opløst i 0,1 x TE-puffer.

C) Opbygning af hestegenom-DNA-bibliotek 20 De dephosphorylerede, 10-23 kb lange heste-DNA- fragmenter blev klonet i en Lambda-vektor, for eksempel Lambda-EMBL3 eller -3A (3) med kohæsive G-A-T-C-ender, der var vundet yed fjernelse af det interne BamHI-fragment fra phag-DNA'et.

25 Vektoren blev dyrket i en E.coli-stamme med sup- pressorfaktoren sup F, for eksempel E.coli NM526, 538 eller 539 (3), i LB-dyrkningsmedium (20) med 5mM MgSO^, fældet med polyethylenglycol og renset ved 2 gange CsCl-vægtfyldegradientcentrifugering (0,71 g CsCl/ml opløs-30 ning, 40 timer, 45.000 rpm, 20°C). Efter dialyse mod TE-puffer blev phag-DNA'et befriet for protein ved 2 gange ekstraktion med phenol/chloroform/isoamylalkohol (25/24/1 vol) og 2 gange ekstraktion med chloroform/iso-amylalkohol (24/1 vol) og opkoncentreret ved ethanolfæld-35 ning.

DK 167929 B1 41

Til udyinding af endefragmenterne af EMBL3A bley 50 yg phag-DNA ved 37°C i 450 ja 1 reaktionsmedium (lOmM Tris-HCl pH 7,5, lOmM MgCl^/ ImM dithiothreitol) fordøjet fuldstændigt i to timer med BamHI, reaktionen blev 5 stoppet med 15mM EDTA 10 minutter ved 70°C, og DNA'et blev fældet med ethanol.

Til undgåelse af genligation blev midterfragmentet efterkløvet med EcoRI, og det bortfaldende oligonu-cleotid blev fjernet ved isopropanolfældning.

10 Det BamHI-fordøjede Lambda-DNA blev hertil for døjet fuldstændigt med EcoRI 2 timer ved 37°C i 450 yl lOmM Tris-HCl pH 7/5, lOOmM NaCl, lOmM MgCl2, og reaktionen blev stoppet ved tilsætning af 15mM EDTA og 10 minutters opvarmning ved 70°C. Efter tilsætning af Na-15 acetat til en slutkoncentration på 0,3M blev de 3 store DNA-fragmenter fældet med 0,6 volumen isopropanol 15 minutter ved 0°C, vasket 2 gange med 0,45M Na-acetat/0,6 volumen isopropanol og 1 gang med 0,3M Na-acetat/2,5 voluminer ethanol og opløst i 15 yl 0,1 x TE-puffer.

20 BamHI/EcoRI-linkerne forblev ved denne proces i opløsning.

EMBL3A-Eragmenterne (8 jig) blev forenet med ca.

5 yg 10-23 kb heste-DNA og 10 enheder T4-DNA-ligase (NEN) og inkuberet natten over ved 14°C og én dag ved 25 4°C i 50 yl ligationsmedium (66mM Tris-HCl pH 7,2, 0,1M" NaCl, lOmM MgCl2, ImM EDTA, 5mM dithiothreitol, 0,5mM ATP). Den ligerede DNA-blanding blev ved hjælp af et in vitro-Lambda-emballeringssystem (27) pakket i modne Lambda-phagpartikler.

30 Komponenterne for dette system, dvs. ultralyd ekstrakt (SE), frysning-optøning-lysat (FTL), puffer Ml og A blev fremstillet ifølge (27). Aliquoter på 10 yl af den ligerede DNA-blanding blev inkuberet 2 minutter ved stuetemperatur med 25 yl SE, der ligesom FTL var optøet 35 30 minutter fra is, der blev tilsat 100 yl FTL og in- DK 167929 B1 42 kuberet videre 60 minutter yed stuetemperatur. Emballeringsblandingen blev fortyndet med 150 jil Lambda-for-tyndingsmiddel (lOOmM Tris-HCl pH 7,5, lOmM MgSO^, ImM EDTA) og lagret ved 4°C.

5 En lille andel af de emballerede Lambda-phager blev titreret på E.coli stamme NM 528 SupF. Ialt gav g fremgangsmåden ca. 1x10 uafhængige heste-DNA-rekombinan-ter. Resten af det emballerede materiale blev formeret ved udpladning på NM528 i en tæthed på 30.000 plaque-10 dannende enheder (pfu) pr. 13,5 cm LB/MgSO^-agarplade.

D) Screening af heste-genbibliotek for interferon-gener Til identifikation af de rekombinante phager, der indeholdt hundeinterferon-gener, blev der udnyttet den ved Southern-blots (17) påviste nucleotidhomologi med 15 radioaktivt mærkede hunde-IFN-alpha-gener.

Hertil blev hver gang 10 ug højmolekylært heste-DNA fordøjet fuldstændigt med EcoRI eller Hindlll, opdelt elektroforetisk på 0,8%'s agarosegel og overført til nitrocellulosefiltre. Ud fra et fra ekspressionsplasmidet 20 pER33 (14) stammende 845 bp HindIII-fragment, der indeholder det totale proteinkodende område for modent hu-maninterferon-alpha2ARG, blev der på sædvanlig måde (25) fremstillet et P-32-mærket DNA-stykke.

Til screening efter heste-beta-interferongener 25 blev der ligesom ovenfor ud fra et 363 bp Pstl-Bglll-fragment fra en for humant beta-interferon kodende cDNA-klon P1F12 (15), fremstillet en radioaktivt mærket DNA-probe. Denne probe koder for aminosyrerne 48-166 fra det modne β-interferon.

30 Nitrocellulosefiltrene bley præhybridiseret 7 ti mer ved 65°C i 5xSSPE (0,9M NaCl, 50mM NaH2P04, 5mM EDTA, pH 7,4), 5xDenhardt-opløsning (0,1% Ficoll, 0,1% polyvi-nylpyrrolidon, 0,1% kvægs er uma lbumin) , 0,1% SDS, 20 mg/ml g laksesperma-DNA og derefter hybridiseret med 13x10 cmp 35 af den mærkede probe i samme opløsning, dog uden lakse- DK 167929 B1 43 sperma-DNA. Efter inkubation yed 65°C natten over blev filtrene vasket 4 gange 1-1,5 timer i 3 x SSC (0,45M NaCl, 45mM Na-citrat), 0,1% SDS ved 65°C og eksponeret 7 dage på Kodak x-omat S-røntgenfilm med Kodak Regular-5 forstærkerfolier (Fig. 1). Optræden af flere bånd beviser en familie af alpha-interferongener hos heste, ligesom tidligere påvist for kvæg, svin og mennesker.

Til screening af interferongenerne i heste-DNA-biblioteket anvendtes derfor de samme hybridiseringsbe-10 tingelser.

600.000 Rekombinante Lambda-phager blev udpladet på E.coli NM528 i en tæthed på 30.000 pfu/13,5 cm plade. Firedobbelte nitrocellulosereplikaer blev fremstillet fra hver plade ved metoden ifølge Benton og Davis (19).

15 Efter 2 timers opyarmning ved 80°C blev filtrene vasket 1,5 time ved 65°C i 1M NaCl, lOmM Tris-HCl pH 8,0, 0,1% SDS, præhybridiseret natten over, som ovenfor beskrevet, og 2 filterreplikaer fra hver plade blev hybridiseret 24 timer med 1,5 x 10 cpm radioaktiv alpha-interferon-pro- g 20 be eller 1 x 10 cmp 8-interferon-probe pr. filter. Efter 3 gange gentaget screening, vandtes 8 heste-alpha-interferon-kloner og 6 heste-beta-interferon-kloner, der gav positive hybridiseringssignaler.

E) Karakterisering af de rekombinante phager.

25 Ud fra 7 med humant alpha-IFN og 3 med humant β-IFN hybridiserende rekombinanter blev der fremstillet phag-DNA. DNA'erne blev fordøjet med EcoRI, BamHI,

Hindlll, PstI, Bglll, Salll, Smal, og opdelt elektroforetisk i en 0,8%'s agarosegel. Størrelsen af de hybridi-30 serende fragmenter blev bestemt ved Southern-metoden. Positionen af restrikstionsstederne inden i Lambda-in-sertionerne blev bestemt ved en metode ifølge Rackwitz et al. (4) efter partiel restriktionsfordøjelse af Lambda-DNA'et, mærkning af de højre henholdsvis venstre kohæsive ender af Lambda-armene med syntetisk P-32- DK 167929 B1 44 mærkede oligonucleotider og elektroforese i 0,45%'s aga-rosegeler. Der derud fra tilvejebragte restriktionskort for klonerne Eq-alphal, Eq-alphal6, Eq-alpha20 og Eq-beta6 er vist i Fig. 2, 3 og 30.

5 F) Subkloning af 'bes'te'interfero'n-'alpha-genet.

Et restriktionsfragment af klonen Eq-alphal, der havde hybridiseret med den humane alpha-interferon-mar-kør, blev subklonet i flerrestriktionsenzym-kloningsste-det af pBR322-derivatet pUC9. Insertionen af et fremmed 10 DNA-fragment fører til en afbrydelse af lac z-genet for β-galactosidase og forandrer dermed fænotypen af den med plasmidet transformerede E.coli-stamme JM101 fra lac+ til lac-. På grund af den ikke-fungerende β-galactosidase kan med isopropylthiogalactosid (IPTG) -induceret 15 JM101 ikke spalte den farveløse substratanaloge 5-brom-4-chlor-3-indolyl-B-D-galactosid (BCIG) til blåt farvestof. Bakteriekolonier med lac-fænotype kan derfor erkendes på den hvide farve.

Et 3,2 kb Hindi I I-f ragment fra klonen Eq-alphal 20 blev elueret fra en agarosegel, renset på en Elutip-D-søjle og i ca. 10 gange molært overskud ligeret med 40 ng af med Smal kløvet og dephosphoryleret pUC9-vektor, transformeret i E.coli JM101 og udhældt med LB Top-agar med 0,2 mg/ml BCIG, 0,17 mg/ml IPTG og 0,1 mg/ml ampi-25 cillin. Hvide kolonier blev højdyrket natten over ved 37°C i 5 ml LB-næringsmedium med 0,1 mg/ml ampicillin, og screenet for det indsatte fragment ved en plasmid-minipræparationsmetode (25). Et således vundet plasmid blev betegnet pAH50.

30 G) DNA-Sekvens af heste-alpha-interferon-gener fra klon Eq-alphal

Den 3,2 kb lange Hindlll-insertion fra pAH50 (3,2 kb Hindlll-fragment-subklon fra Eq-alphal, Fig. 3) blev sekvensbestemt ved dideoxy-metoden ifølge Sanger 35 (23) ved Shotgun-fremgansmåden. 60 ug pAH50 plasmid-DNA

DK 167929 B1 45 blev fordøjet fuldstændigt med Hindlll, 3,2 kb fragmentet blev isoleret fra en 1%'s agarosegel og renset som oyenfor beskrevet.

Af dette fragment blev 15 jig i 100 μΐ ligations-5 medium ligeret med 14 enheder T^-DNA-ligase natten over ved 14°C og ligeret yderligere 4 dage ved 4°C med sig selv. Dette ligerede DNA blev i et isbad opdelt i små stykker ved hjælp af ultralyd i 20 sekunders impulser, ialt 100-140 sekunder. DNA-enderne blev repareret 2 ti-10 mer ved 14°C i 250 μΐ reaktionsmedium (50mM Tris-HCl pH 7,5, lOmM MgC^r ImM dithiothreitol, 0,5 mg/ml kvæg-serumalbumin, og 0,lmM af hver af dATP, dGTP, dCTP, dTTP) med 15 enheder af det store fragment fra E.coli-polyme-rase I (Klenow-fragment). Efter koncentrering ved etha-15 nolfældning blev det således forbehandlede DNA opdelt på en 1%'s agarosegel, og DNA-fragmenterne i et størrelsesområde på 0,35-1,0 kb blev isoleret og renset. Fragmenterne blev i ca. 10 gange molært overskud ligeret med den med Smal kløvede og dephosphorylerede, replikative 20 form af bakteriophagen M13mp8 (22) og E.coli JM101 transformeret. Enkeltstreng-DNA'et fra de således vundne re-kombinante phager blev isoleret, og efter binding af et syntetisk oligonucleotid blev andenstrengssyntesen gennemført i 4 enkeltreaktioner med Klenow-fragmentet fra 25 E.coli DNA-polymerase I.

Sekvenserne af insertionerne fra de forskellige rekombinante phager blev. ved hjælp af et af C. Pieler modificeret computerprogram ifølge Staden (24) forenet til en totalsekvens, der er vist i Fig. 4.

30 H) Subkloning af heste-β-interferort-genet

Til subkloning af det i Lambda-klonen Eq-beta6 identificerede heste-β-interferon-gen blev der benyttet en fremgangsmåde analog med den under F) beskrevne. Et 4,5 kb Pvull-fragment, der hybridiserede med den humane 35 β-interferon-probe, blev isoleret, renset og ligeret i Smal-restriktionsstedet af plasmidet pUC9 med glatte en- DK 167929 B1 46 der og E.coli JM101 transformeret. En transformant med ønsket insertion (pAH60) blev stordyrket, og plasmidet blev nøje karakteriseret ved Southern-analyse. Det vund-ne restriktionskort er vist i Fig. 3. Det 2,5 kb Hindlll-5 fragment blev sekvensbestemt analogt med G) ved dideoxy-metoden ifølge Sanger. Den i Fig. 8 viste totalsekvens for 2,5 kb fragmentet blev sammensat af 52 enkeltsekvenser.

I) SUbkToni'ng og sekvensbestemmeise af heste-interferon-10 genet fra klon Eg-al6

Et 3,3 kb langt EcoRI-restriktionsfragment fra Lambda-klonen Eg-al6, der havde hybridiseret med en hu-man-a-IFN-markør (se Eksempel D, E), blev subklonet i EcoRI-stedet af plasmidet pUC8. Et vundet plasmid blev 15 betegnet pRH63. Ved hjælp af et tilvejebragt restrik- . tionskort (Fig. 9) blev definerede restriktionsfragmenter subklonet orienteret i M13-phager, og DNA-sekvensen blev bestemt ved Sanger-metoden (Fig. 10) .

J) ' Subkloning og sekvensbestemmeise' af heste-interferon-20 genet fra klon' Eg-a 20

Et 2,2 kb langt EcoRI-fragment fra Lambda-klonen Eq-a20, der havde hybridiseret svagt med den humane a-IFN-probe, blev subklonet i EcoRI-stedet af plasmidet pUC9. En vundet klon blev betegnet pRH61 (Fig. 9). Den 25 totale 2,2 kb EcoRI-insertion blev isoleret, og DNA-se-kvensen blev bestemt (Fig. 12) ved Shotgun-fremgangsmåden ifølge Sanger-metoden (Eksempel G).

K) Fremstilling a'f ekspressionsplas'midet parpATER103

Ud fra ekspressionsplasmidet parpER33 blev den 30 for den forøgede plasmidstabilitet i E.coli ansvarlige "par"-sekvens og tryptophan-promotor-operator-sekvensen samt det kunstige ribosomale bindingssted indsat i plas-midvektoren pATl53 (Amersham). pAT153 er et forkortet derivat af plasmidet pBR322, der mangler et afsnit, som 35 er nødvendigt for mobiliseringen af DNA (36).

DK 167929 B1 47

Metoden ved fremstillingen af plasmid parpATER103 er vist i Fig. 13. Plasmidet parpER33 blev kløvet fuldstændigt med Hindlll og partielt med EcoRI, det dannede 0,47 kb lange DNA-fragment blev isoleret og renset fra 5 en agarosegel og ligeret med EcoRI- og Hindlll-dobbelt-kløvet pAT153. Et efter transformation af E.coli HB101 vundet· plasmid med ønsket struktur, der blev bestemt ved fordøjelse med forskellige restriktionsenzymer, blev betegnet parpATERl03.

10 L) Direkte' ekspression· af modent EqIFN-'al i E.coli

Fremstillingen af ekspressionsplasmiderne pAH52, pAH52/2 pg pAH53 samt deres forstadier er vist i Fig. 14.

20 ug Plasmid pAH50 (Eksempel F) blev fordøjet med 30 enheder Hindll (Boehringer Mannheim), og det 4,2 kb lan-15 ge DNA-fragment, der indeholder det totale EqIFN-al-gen, blev isoleret og renset fra en agarosegel med DE81-papir (Whatman). Hertil blev der, efter opdeling af DNA-fragmente t i agarosegelen, før og efter det DNA-bånd, der skulle isoleres, skåret en slids, i hvilke der blev stuk-20 ket en strimmel DE81-papir. Elektroforesen blev videreført, indtil det ønskede DNA-fragment var fuldstændigt bundet til den forreste DE81-Strimmel. Den bageste DE81-strimmel hindrer en forurening fra større DNA-fragmenter. DE81-papiret med det bundne DNA-fragment vaskes to gange 25 5 minutter i 400 μΐ lavsalt-puffer (0,2M NaCl, 25mM

Tris-HCl pH 8,0, ImM EDTA), og derefter elueres DNA’et to gange 10 minutter med 200 pi højsalt-puffer (1M NaCl, 25mM Tris-HCl pH 8,0, ImM EDTA) fra DE81-papiret og fældes med 1 ml ethanol. Enderne af Hindll-fragmentet blev 30 forsynet med SphI-linkere. Hertil blev 0,2 jig Sphl-lin-ker (Worthington) inkuberet 45 minutter ved 37°C med 2 enheder polynucleotid-kinase i 10 jil reaktionsmedium (70mM Tris-HCl pH 7,6, lOmM MgC^, ImM ATP, 5iriM dithio-threit). Den kinaserede SphI-linker og Hindll-fragmen-35 tet blev ligeret med 8 enheder T4-DNA-ligase 2o timer DK 167929 B1 48 ved 4°C. Derefter blev enzymet inaktiveret yed 70°C, og DNA'et blev fordøjet med 30 enheder Sphl i et totalvolumen på 100 μΐ, ekstraheret med phenol og chloroform og udfældet med ethanol. DNA'et blev cirkulariseret med li-5 gase og E.coli HB101 transformeret. Et plasmid af den ønskede struktur fik betegnelsen pAH51. Det indeholder EqIFN-al-genet med en forkortet 3'-ikke-translateret region og et yderligere Sphl-kløvningssted.

For i slutkonstruktionen at forbinde DNA-sekven-10 sen for det modne heste-a-interferon i den rigtige afstand med promotorsekvensen blev der anvendt et 0,4 kb langt DNA-fragment, der blev isoleret fra 20 .ug, med PvuIX kløvet plasmid pAH50. 1 mmol Syntetisk 15mert oli-gonucleotid med sekvensen 5' TGTGACCTGCCTCAC blev kina-15 seret med polynucleotidkinase. Det indeholder den sekvens, der koder for de første 5 amonisyrer i det modne EqIFN-al fra klon pAH50. Den 15mere blev blandet med ca.

7 pmol af 0,4 kb PvuII-fragmentet og kogt fem minutter i et totalvolumen på 34 yl for at denaturere DNA-dobbelt-20 strengen. Efter afkøling blev den til enkeltstrengen bundne oligonucleotid-primer i 70 y 1 reaktionsmedium (50mM Tris-HCl pH 7,2, lOmM MgS04, 0,1 mM dithiothreit, 50 yg/ml kvægs erumalbumin, 1 mM af hyer af dATP, dGTP, dCTP, dTTP) forlænget med 30 enheder Klenow-fragment 3 25 timer ved 37°C. For med sikkerhed at fjerne et eventuelt tilbageværende 31-overhæng blev DNA'et derefter inkuberet med 16 enheder T4 DNA-polymerase 20 minutter ved 37°C i 120 yl reaktionsmedium (33mM Tris-acetat pH 7,9, 66mM KAc, lOmM MgfAc)^/ 0,5mM dithiotreit, 0,1 mg/ml 30 kvægserumalbumin, ImM af hver af dATP, dGTP, dCTP, dTTP) . Det dannede DNA med lige ender blev ekstraheret med phenol og chloroform og udfældet 15 minutter ved 0°C med 0,4.5M' Na-scetat og 0,6 volumendele 2-propanol. Til dette DNA-stykke blev en blanding af to kinaserede, ind-35 byrdes komplementære oligonucleotider: DK 167929 B1 49 12mer 5'-AGCTTAAAGATG, 8mer 5'-CATCTTTA ligeret, hvilket frembragte et Hindlll-kløvningssted og translationsstart-codonen ATG. Af hvert af disse to oligonucleotider blev 1 nmol ligeret til DNA-fragmentet i 20 yl med 14 enheder 5 ligase 40 timer ved 4°C. Efter inaktivering af enzymet ved 70°C blev det vundne DNA kløvet i 100 yl med 80 enheder Hindlll og 20 enheder Bglll, og DNA-fragment med en længde på ca. 190 bp blev isoleret og renset fra en 2%'s agarosegel med DE81-papir. Det vundne DNA-fragment 10 blev ligeret med ca. 50 ng, med Hindlll og Bglll dobbelt-kløvet pAH51-vektor og E.coli HB101 transformeret.

Af 65 vundne kolonier blev der ud fra 4 plasmider, der udviste det ønskede restriktionsmønster, isoleret et Hindlll/BamEI DNA-fragment og foretaget sekvensbestemmel-15 se ved Sanger-metoden, hvorved to kloner indeholdt netop den ønskede sekvens. Et sådant plasmid blev betegnet pAH51/2. Dette indeholder sekvensen for modent EqIFN-al med foranstillet translationscodon ATG og Hindlll-kløv-ningssted.

20 fremstilling af eks'p'ressionspiasmiderne pAH52 og pÅH52/2 20 yg Plasmid pAH51/2 blev kløvet to gange med Sphl og Hindlll, det dannede 1,0 kb lange DNA-fragment blev isoleret fra en agarosegel og ligeret med 40 ng, Hindlll- og SphI-dobbeltkløvet plasmid parpATERl03 (Ek-25 sempel K). Et efter transformation af E.coli HB101 yundet plasmid med den ønskede struktur blev betegnet pAH52.

Det indeholder alle for en inducerbar ekspression af modent EqIFN-al nødvendige informationer. På analog måde blev der ud fra med Hindlll og BamHI dobbeltkløvet 30 pAH51/2 og med Hindlll/BamHI kløvet parpATERl03 fremstil let plasmidet pAH52/2. Dette ekspressionsplasmid er ca.

0,2 kb større end pAH52 og udviser yderligere et enkelt BamHI-kløvningssted.

Fremstilling af plasmidet pAH53 35 Et væsentligt formindsket ekspressionsplasmid til 50 DK 167929 B1 fremstilling af modent EqlFN-αΙ i E.coli, hyori trypto-phan-promotor, interferon-gen, ampicillin-resistensgen og replikationskilde er orienteret i én retning, blev fremstillet ud fra plasmiderne pAH52 og pBR322·. 10 yg 5 pAH52 blev kløvet med Sphl og EcoRI, enzymet blev in-aktiveret ved 70°C, og DNA-enderne blev efter tilsætning af 0,15mM af hver af dATP, dGTP, dCTP, dTTP gjort stumpe med Klenow-fragment 1 time ved 22°C.

DNA-fragmenterne blev fraktioneret efter størrel-10 se på en agarosegel, og der blev isoleret et 1,1 kb langt stykke, der indeholder promotor og interferon-gen.

10 y g pBR322 plasmid blev fordøjet dobbelt med EcoRI og PvuII, enderne blev som ovenfor beskrevet udjævnet med Klenow-fragment og derefter dephosphoryleret med kalve-15 tarmphosphatase. Et DNA-fragment på 2,4 kb blev isoleret fra en agarosegel. De to således vundne DNA-stykker blev sammenføjet med T4 DNA-ligase og E.coli HB101 transformeret. Et således vundet plasmid, hvori to EcoRI-identifi-kationsstedet var tilvejebragt, fik betegnelsen pAH53.

20 M) Fremstilling af et ekspres'sionsplasmid for EqIFN-a2 (pAH55) På grund af den høje homologi for generne for EqIFN-al (pAH50) og EqIFN-a2 (pRH63, Fig. 11) er det muligt ud fra ekspressionsplasmidet pAH52/2 (Eksempel L) 25 og Lambda-subklonen pRH63 at fremstille et ekspressions-plasmid for EqIFN-a2 (Fig. 15). 20 yg pRH63 plasmid blev kløvet to gange med Bglll og BamHI, og det dannede DNA-fragment med en længde på 1,0 kb, der indeholder den kodende sekvens for EqIFN-a2 fra den 64. aminosyre, blev 30 isoleret fra en agarosegel. 10 yg Plasmid pAH52/2 blev ligeledes kløvet med Bglll og BamHI, enderne blev de-phosphoryleret med kalvetarmphosphatase, og det større af de to dannede DNA-fragmenter. vandtes fra en agarosegel. Dette DNA-stykke indeholder plasmidvektorandelen, 35 promotoren og den kodende sekvens for de første 63 aminosyrer fra det modne interferon. De to beskrevne DNA- DK 167929 B1 51 fragmenter bley sammenføjet med ligase og E.coli HB101 transformeret. Et således vundet plasmid, der indeholder insertionen i den korrekte orientering (kløvbar med BamHI og Bglll), blev betegnet pAH55. Dette plasmid mu-5 liggør ekspressionen af modent EqIFN-a2 i E.coli.

N) Fremstilling af et ekspressionsplasmid for modent EqIFN-β (pAH62)

Fremgangsmåden er vist skematisk i Fig. 16. 30 jig pAH60 plasmid blev kløvet med 30 enheder HgiAI i 150 μΐ 10 volumen. Efter inaktivering af enzymet ved 70°C blev de 31-overhængende DNA-ender udjævnet med 7 enheder T4 DNA-polymerase (tilsætning af ImM af hver af dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 30 minutter ved 37°C. Til de stumpe ender blev SphI-linkere ligeret (se Eksempel L), og det vundne 15 DNA blev kløvet med Sphl og Hindlll. Et dannet DNA-frag-ment på 1,85 kb blev isoleret fra en agarosegel og ligeret med 50 ng, med Hindlll- og SphI-dobbeltkløvet plasmid parpATER103 (Eksempel K). En efter tranformation af E.coli HBlQl vundet klon med det ønskede plasmid blev 20 betegnet PAH61. Dette plasmid udgør et mellemstadium for den videre konstruktion af ekspressionsplasmidet.

20 μg Plasmid pAH61 blev kløvet to gange med BamHI og Sall, og et dannet 1,3 kb langt DNA-fragment blev isoleret fra en agarosegel, renset og ligeret med BamHI/Sall-25 dobbeltfordøjet M13mp9 phag-DNA. Efter transformation af E.coli JM101 kunne der ud fra en rekombinant Ml3-phag (M13pAH61) vindes enkeltstrenget phag-DNA. Af dette en-keltstreng-DNA blev 3 pmol blandet med 38 pmol kinaseret 15mert oligonucleotid 5'GTGAACTATGACTTG i 50 μΐ 20mM;: 30 Tris-HCl pH 8,0, 10mM__ MgCl2, opvarmet til 95°C og langsomt afkølet til stuetemperatur. Oligonucleotidet binder nøjagtigt fra den første base i sekvensen for det modne β-interferon. Andenstrengssyntesen på enkeltstrengforla-get, ud fra 15mer-primeren blev gennemført i 1 time ved 35 22°C i 100 μΐ volumen efter tilsætning af 3mM af hver af DK 167929 B1 52 dATP, dGTP, dCTP, dTTP og 15 enheder Klenow-fragment.

Efter tilsætning af 20mM" EDTA blev DNA'et ekstraheret med phenol og chloroform og udfældet med ethanol.

Tilbageværende enkeltstrengede DNA-afsnit blev 5 fordøjet 2 timer ved 14°C med 150 enheder Sl-nuclease (Sigma) i 400 yl reaktionsblanding (4mM ZniAc^, 30mM NaAc, 250mM NaCl, 5% glycerol, pH 4,6). Reaktionen blev stoppet ved tilsætning af EDTA og ekstraktion med phenol og chloroform, og DNA'et blev fældet med ethanol. Til det 10 ved denne behandling med stumpe ender forsynede DNA blev der som i Eksempel H tilligeret blandingen af 12mer- og 8mer-oligonucleotiderne 5'-AGCTTAAAGATG og 5'-CATCTTTA, og det dannede DNA blev kløvet med Hindlll og SphI. Et DNA-fragment af den ønskede længde på 1,1 kb blev isole-15 ret fra en agarosegel og ligeret med HindIII/SphI-dob-beltkløvet plasmid parpATER103. Efter transformation af E.coli HB101 blev der vundet 54 kolonier. Fra 9 der ud fra isolerede plasmid-DNA'er blev der isoleret et 1,3 kb langt EcoRI/Sall-fragment og foretaget sekvensbestemmel-20 se ved Sanger-metoden. Et her ud fra vundet plasmid med den ønskede sekvens blev betegnet pAH62. Dette plasmid muliggør den effektive ekspression af modent EqIFN-β-protein i E.coli. Et plasmid, der bærer en deletion af den første base (G) fra det modne β-IFN-gen, blev beteg-25 net pAH62deltaGl. Dette plasmid tillader ekspression af et ved amino-terminus forkortet β-IFN ved translationsstart ved næstfølgende ATG (svarer til aminosyre 19 i det modne (3-IFN), hvilket β-IFN overraskende har antiviral aktivitet, omend betydeligt svagere sammenlignet 30 med det uforkortede protein (se Eksempel O).

O) Ekspression af interferonaktivitet gennem E.coli HB101 indeholdende plasmid pAH52, pAH52/2, pAH53, PÅH55 eller pAH62.

100 ml Bakteriekultur blev ved 37°C under kraftig 35 rystning inkuberet, indtil de nedennævnte optiske tæthe- DK 167929 B1 53 der ved 600 nm i følgende tryptophanfrie medium (angivelser pr. liter medium): 10 g (NH^)2P0^, 3,5 g KE^PO^ pH 7,3 med NaOH, 0,5 g NaCl, 21 g casaminosyre (surt hydrolyseret), 11 g glucose, lmM MgS04, 0,lmM CaCl2, 1 mg 5 thiamin-HCl, 20 mg L-cystein, 20 mg 3-g-indolacrylsyre (IAA, induktor for tryptophan-operori), eventuelt 50-100 mg ampicillin. Derefter blev bakterierne pelleteret ved centrifugering 5 minutter ved 4000 rpm, suspenderet med 1/10 af kulturvoluminet af iskold 50mM Tris-HCl pH 8,0, 10 30mM NaCl og under isafkøling opbrudt to gange 30 sekunder med ultralydsonde (20 kHz, 100 Watt). Celleresterne blev fjernet 10 minutter ved 10.000 rpm (4°C), og su-pernatanten blev efter sterilfiltrering testet for interferonaktivitet ved en prøve, der savner den cytopa-15 tiske effekt (CPE) for Vesicular Stomatitis Virus (VSV) eller Encephalomyocarditis Virus (EMCV).

Testsystem: NBL-6-celler (ATCC CCL 57, hestehud-epider-misceller)/VSV

20 A549 (ATCC CCL 185, human lungecarcinom-

cellelinie)/EMCV

HB101 med IFN-Aktivitet (Enheder/liter kultur)

Plasmid OD600nm NBL-6/VSV A549/EMV

25 E/liter IE/liter pAH52 4,2 l,8xl06 5,2xl04 PAH52/2 6,0 2,0xl06 7,6xl04 pAH53 5,7 l,8xl06 6,2xl04 pAH55 5,7 l,2xl06 9,0xl04 30 pAH62 3,0 Ι,ΙχΙΟ9 <103 pAH62deltaGl 2,1 4,5xl05 <103 2 4 HS12(HuIFN-a2C standard) 5,2x10 2,6x10

Titeren på A 549-celler blev med human-interfe-35 ronstandard normeret på internationale enheder.

54 DK 167929 B1 P) Påvisning af eksprimerede hesteinterferoner. yed mærkning af proteinerne i maxiceller

Plasmidkodede proteiner kan ved anvendelse af ma-xicelleteknik (37) mærkes selektivt in vivo. E.coli 5 CSR603 blev på sædvanlig måde transformeret med ekspres-sionsplasmiderne og selektioneret på transformerede bakterier på ampicillin-holdige agarplader. Præparationen af maxicellerne og mærkningen af proteinerne foregik efter forskriften ifølge A. Sancar (37). Cellerne blev i 10 15 ml medium (se Eksempel 0) uden indolacrylsyre dyrket ved 37°C indtil en 0Ρ^ηηηΐπ= 0,5, og 10 ml af denne kultur blev i en petriskål bestrålet under svingning 5 sekunder fra en afstand af 50 cm med en UV-Germicid-lampe (15 Watt) og inkuberet videre en time ved 37°C. Til kultu-15 rerne blev der sat 100 yg/ml D-cycloserin og inkuberet 14 timer ved 37°C, og bakterierne blev derefter indhøstet ved centrifugering. Cellerne blev vasket to gange med 5 ml Hershey-saltopløsning, suspenderet i 5 ml Her-shey-medium med 20 yg/ml indocrylsyre og inkuberet 2 20 timer ved 37°C. Til hver kultur blev der sat 5 yCi/ml S-methionin (1000 Ci/mmol) og rystet en time ved 37°C. Cellerne blev indhøstet, lyseret i SDS- og 2-mercaptoethanol-holdig elektrof or ese-pr øvepuf fer, og proteinerne blev opdelt på en 15%*s polyacrylamidgel.

25

Hershey-saltopløsning (pr. liter): Hershey-rredium (pr. lOQml

Hershey-saltopløsning) : 5,4 g NaCl 2 ml 20% Glucose 3,0 g KCl 0,5 ml 2% Threonin 30 1,1 g NH^Cl 1,0 ml 1% Leucin 15mg CaCl2,2H20 1,0 ml 2% Prolin 0,2 g MgCl2,6H20 1,0 ml 2% Arginin 0,2 mg EeCl-^e^O 0,1 ml 0,1% Thiamin 87 mg KH2P04 35 12,1 g Tris-HCl pH 7,4 I — _ DK 167929 B1 55 I Fig. 17 er. vist autoradiogrammet for den tørrede gel efter 2 dages eksponering på DuPont Cronex røntgenstrålefilm under anvendelse af et Kodak Lanex-Regu-lar-forstørrelsesfolie ved -80°C. Som molekylvægtstand-5 ard anvendtes en ^C-methyleret proteinblanding (Amer-sham). Som kontroller anvendtes plasmidet pERl03, der kun indeholder promotoren uden interferon-gen, og plasmidet pER21/l, der indeholder to kopier af det humane IFN-a2arg-gen. Proteinbåndene ved ca. 18 kd er de af 10 plasmiderne eksprimerede interferoner.

Q) Påvisning af Med EqIFN-ay EqTFN-'β' og EqIFN-omega hybridisCrende' sekvenser 1 genomisk heste-DNA

Til påvisning af totalantallet af sekvenser i hestegenomet, der udviser høj homologi med interferon-15 gener fra klasserne IFN-α, og IFN-β eller IFN-omega, blev der benyttet følgende metode.

30 yg Højmolekylært heste-DNA (Eksempel A) blev fordøjet fuldstændigt med 100 enheder af det tilsvarende restriktionsenzym i 300 yl reaktionsvolumen, og hver .20 gang 10 yg af dette kløvede DNA pr. spor blev opdelt efter størrelse på en 0,8%*s agarosegel.

Efter Southern-overføring på nitrocellulosefiltre, denaturering og fiksering af DNA'et blev hvert filter hybridiseret med ca. 6x10^ cpm nicktranslateret probe 25 (17 timer ved 65°C, 5x SSPE, 5x Denhardt-opløsning, 0,1% SDS, 20 yg/ml denatureret laksesperma-DNA) . Som probe for EqIFN-α anvendtes et 1,0 kb langt Hindlll/Sphl-fragment fra plasmid pAH52, for EqIFN-β anvendtes et 1,1 kb langt Hindlll/Sphl-fragment fra plasmid pAH62, der 30 hver indeholder den kodende sekvens for det totale modne interferon. Som probe for EqIFN-omega anvendtes 2,1 kb EcoRI-insertionen fra plasmid pRH61. Filtrene blev derefter vasket under stringente betingelser, således at der ikke indtræder nogen krydshybridisering mellem disse 35 3 interferonsekvenser: 4 gange 45 minutter ved 65°C med 0,3x SSC (45mM NaCl, 4,5mM Na^citrat), 0,1%SDS. Autora- DK 167929 B1 56 diografien foregik på DuPont Cronex røntgenstrålefilm under anvendelse af Kodak Lanex-Regular-forstærkerfolie 7 dage ved -80°C.

Forklaring til Fig. 18: 5 Spaltebetegnelse: K = Størrelsesmarkør (Lambda x EcoRI/Hindlll) E = EcoRI, H = Hindlll, Ba = BamHI, P = Pstl, B = Bglll.

1 ) Påvisning af med CalFN-alphal og EqIFN-omega hybri-1 o disere'nde sekvenser i genomisk HUnde-DNA

Til påvisning af det totale antal af sekvenser i hundegenomet, der udviser høj homologi med interferongener fra klasse IFN-alpha eller IFN-omega, blev der benyttet følgende fremgangsmåde: 15 20 yg Højmolekylært hunde-DNA (Eksempel 1} blev fordøjet fuldstændigt med 60 enheder af det pågældende restriktionsenzym i 200 jil reaktionsvolumen, og portioner på 10 yg af dette kløvede DNA pr. spor opdelt efter størrelse på en 0,8%'s agarosegel. Efter Southern-over-20 føring på nitrocellulosefiltre, denaturering og fiksering af DNA'et blev hvert filter hybridiseret med ca.

6x10^ cpm nicktranslateret DNA-probe (17 timer ved 65°C, 5x SSPE, 5x Denhardt-opløsning, 0,1% SDS, 20 ug/ml denatureret laksesperma-DNA, se Eksempel 4).

25 Som probe for CalFN-alpha blev der anvendt et 0,6 kb langt BamHI-fragment af plasmid pAH4, der indeholder den totale kodende sekvens for interferonet. Som probe for EqIFN-omega blev der anvendt 2,1 kb EcoRI-in-sertionen fra plasmid pRH61.

20 Det med CalFN-alphal hybridiserede filter blev derefter vasket under stringente betingelser, 4 gange 45 minutter ved 65°C med 0,3 x SSC (45mM NaCl, 4,5 mM Na^citrat), 0,1% SDS. Det med EqIFN-omega hybridiserede filter blev ved 65°C vasket med 2x SSC (0,3M NaCl, 30mM 25 Na^citrat) 0,1% SDS, 4 gange 45 minutter ved 65°C med 0,3 x SSC (45mM NaCl, 4,5mM Na^citrat)f 0,1% SDS. Det med EqIFN-omega hybridiserede filter blev ved 65°C vasket DK 167929 B1 57 med 2x SSC (0,3M NaCl, 30mM Na^citrat), 0,1% SDS. Autoradiografi foregik på DuPont røntgenstrålefilm under anvendelse af Kodak Lanex-Regular-forstærkerfolie 7 dage ved -80°C.

5 Autoradiogrammet (Fig. 29) viser, at der i hunde- genomet foruden de to, for identiske alpha-interferoner kodende gener ikke kan påvises yderligere sekvenser, der med CalFN-alphal udviser en lignende høj homologigrad, som den der optræder ved andre arter inden for én inter-10 feronklasse. Med DNA'et fra et heste-omega-interferon-gen kan der under noget mindre stringente betingelser påyises mindst ét gen, der er forskelligt fra de beskrevne alpha-interferoner hos hund.

15 2 ) Subkioning og :sekyensbestemmelse af et andet heste- interferon-gen· (EqIFN-omega2) fra Laitibda-klon Eq-al6 Et 5,5 kb langt EcoRI-restriktionsfragment fra Lambda-klonen Eg-al6 (se Fig. 30), der havde hybridise-ret med en human-a-lFN-markør (se Eksempel D, E), blev 20 subklonet i EcoRI-stedet af plasmidet pUC8, og E.coli JM101 blev transformeret med ligationsblandingen. Et vundet plasmid med den ønskede DNA-insertion blev betegnet pRH62. EcoRI-insertionen fra plasmidet pRH62 blev isoleret fra en agarosegel, og subklonet i Ml3mp8 ifølge Shot-25 gun-metoden, som beskreyet i Eksempel G. De efter transformation af E.coli JmlOl vundne M13 phag-plaquer blev ved metoden ifølge Benton og Davis (19) overført til nitrocellulosefiltre (Eksempel D) og hybridiseret. Som hybridiseringsprobe anvendtes det 1,0 kb lange Hindlll-30 fragment fra plasmidet pRH61, der indeholder den totale kodende sekvens for EqIFN-omega. Fra rekombinante M13-phager, der gav et positivt hybridiseringssignal, blev enkeltstreng-DNA isoleret og sekvensbestemt ifølge Sanger-metoden. Den opnåede DNA-sekyens (Fig. 13) inde-35 holder den totale kodende region for et funktionelt heste-interferon-gen, der på grund af homologien med interferonet fra plasmid pRH61 (Eksempel J, Fig. 32) og HuIFN-omegal (23 aminosyrer signalpeptid efterfulgt af DK 167929 B1 58 modent protein med 172 aminosyrer) blev betegnet EgIFN-omega2. EqIFN-omega2 indeholder overraskende ved position 86 af det modne protein en femte cysteinrest. Homologien mellem de to heste-omega-interferoner er fra 5 den 29.· aminosyre i det modne protein meget høj, de fire cysteinrester samt det potentielle N-glycolyseringssted ved position 78-80 (Asn-Thr-T-r) er fuldkomment bevaret (Fig. 31, 32). Aminosyre-homologien til interferonerne fra omega-klassen fra kvæg og menneske er højere 10 (61-70%) end til heste-alpha-interferonerne (57-60%,

Fig. 33).

3) Subkloning og sekvensbestemmelse af to yderligere heste-alpha-inte'rferon-gener :(EqIFN-a3, EqIFN-a4) 15 Et'3,2 kb langt Hindlll-restriktionsfragment fra

Lambda-klonen Eq-a24, der havde hybridiseret med en hu-man-a-IFN-markør (se Eksempel D, É), blev subklonet i Hindlll-stedet af plasmidet pUC8 og E.coli JM101 transformeret. Et vundet plasmid med den ønskede insertion 20 blev betegnet pRH83. På samme måde blev et 2,8 kb langt Hindlll-restriktionsfragment fra Lambda-klonen Eq-a9 klonet i pUC8, og det vundne plasmid betegnet pRH82. Hindlll-insertionen fra plasmiderne pRH82 og pRH83 blev ved Shotgun-fremgangsmåden (Eksempel G) subklonet i 25 M13mp8 og E.coli JM101 transformeret. De vundne phag-plaquer blev som ovenfor beskrevet hybridiseret ifølge Benton og Davis-metoden. Fra phager, der hybridiserede med det 1,0 kb lange Hindlll-BamHI-fragment fra plasmid pAH52/2 (Eksempel L), der indeholder den kodende sekvens 30 for modent EqlFN-al, blev enkeltstreng-DNA isoleret og sekvensbestemt ifølge Sanger-metoden. De fundne DNA-se-kvenser (Fig. 34, 35) viste, at der er tale om to funktionelle α-interferon-gener fra hest, der blev betegnet henholdsvis EqIFN-a3 (fra pRH83) og EqIFN-a4 (fra pRH82).

35 De koder for polypeptider bestående af et 23 aminosyrer langt signalpeptid efterfulgt af et modent protein med en længde på 161 aminosyrer. Homologigraden for DNA-se-kvenserne henholdsvis mellem EqIFN-al (pAH50) og

Claims (14)

59 DK 167929 B1 EqIFN-a3 (pRH83) og mellem EqIFN-a2 (pRH62) og EqIFN-a4 (pRH82) er overordentligt høj. Aminosyresekvenserne for de modne proteiner fra EqIFN-al og EqIFN-a3 er fuldkomment ens. Ved degenereringen af den genetiske kode fø-1-5 rer forskellene i nucleotidsekvensen i dette tilfælde ikke til nogen udveksling i aminosyresekvensen. Muligvis drejer det sig ved EqIFN-a3 om en allel form af EqIFN-al.

1. Rekombinant DNA-molekyle indeholdende en for EqIFN-alpha, -beta, -omega kodende sekvens, kendetegnet ved, at den kodende sekvens er valgt blandt a) insertioner fra plasmiderne pAH50 (fig. 4), 15 pRH63 (fig. 10), pRH82 (fig. 27), pRH83 (fig. 26), pRH61 (fig. 12), pRH62 (fig. 23) eller pAH60 (fig. 8 og b) DNA-sekvenser, som hybridiserer ved insertio-nerne fra plasmiderne pAH50, pRH63, pRH83, pRH61, pRH62 eller pAH60 under stringente betingelser, som udviser 20 en homologi større end 85%, fortrinsvis større end 90%, og som koder for et protein med aktivitetsspektrummet for EqIFN-alpha, -beta eller -omega.

2. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kendetegnet ved, at sekvensen er valgt blandt de 25 følgende sekvenser: 30 35 TGT GAC CTG CCT CAC ACC CAT AGC CTG GGC AAC ACA AGG GTC TTG 60 DK 167929 B1 ATG CTC CTG GGA CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCC TTC TCC TGC CTG

3. Rekombinant DNA-molekyle til udtrykkelse af en DNA-sekvens i mikroorganismer, kendetegnet ved, at man indfører en DNA-sekvens ifølge krav 1 eller 2 i en ekspressionsvektor, der er replicerbar i prokaryoter, eukaryoter eller i pattedyrceller.

4. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 3, ken detegnet ved, at den er ekspressionsplasmidet pAH52, pAH52/2, pAH53, pAH55 eller pAH62.

5 Lys His Arg Thr Asp Phe Arg Phe Pro Gin Glu Gin Leu Asp ply Arg Gin Phe Pro Glu Ala Gin Ala Thr Ser Val Leu Gin Glu Met Leu Gin Gin Ile Val Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser Ser Ala Ala Trp Asn Thr Thr Leu Leu Asp Arg Leu Leu Ala Gly Leu His ^ ^ Gin Gin Leu Glu Asp Leu Asn Thr Cys Leu Asp Glu Gin Thr Gly Glu Glu Glu Ser Ala Leu Gly Thr Val Gly Pro Thr Leu Ala Val Lys Arg Tyr Phe Arg Arg Ile Arg Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Val Asp Ile Met Arg 15 Ser Phe Ser Ser Ser Ala Asn Leu Gin Gly Arg Leu Gly Met Lys Asp Gly. Asp Leu Gly Ser Pro eller 20 Cys Asp Leu Pro Gin Asn His Ile Leu Val Ser Arg Lys Asn Phe Val Leu Leu Gly Gin Met Ser Arg Ile Ser Ser Ala Ile Cys Leu

25 Lys Asp Arg Lys Asp Phe Arg Phe Pro Gin Asp Met Ala Asp Gly Arg Gin Phe Pro Glu Ala Gin Ala Ala Ser Val Leu His Glu Met Leu Gin Gin Ile Phe Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser Ser Ala Ala Trp Asn Thr Thr Leu Leu Asp Glu Leu Cys Thr Gly Leu Leu •3(1 Arg Gin Leu Glu Asp Leu Asp Thr Cys Leu Glu Gin Glu Met Gly Glu Glu Glu Ser Ala Leu Gly Thr Val Arg Pro Thr Leu Ala Val Lys Arg Tyr Phe Arg Gly Ile His Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Met Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Ser Ser Ala Asn Leu Gin Gly Arg Leu Arg Met Lys Asp Gly Asp Leu Gly Ser Pro 35 DK 167929 B1 67 eller biologisk aktive varianter af disse sekvenser, med aktivitetsspektrummet for EqlFN-alpha, -beta eller -omega.

5 Lys Asp Arg Asn Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Val Phe Asp Gly Asn Gin Phe Arg Lys Pro Gin Ala Ile Ser Ala Val His Glu Thr Ile Gin Gin Ile Phe His Leu Phe Ser Thr Asp Gly Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Ser Leu Leu Asp Lys Leu Tyr Thr Gly Leu Tyr 10 Gin Gin Leu Thr Glu Leu Glu Ala Cys Leu Ser Gin Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Glu Asp Ser Leu Leu Ala Val Arg Arg Tyr Phe Gin Arg Ile Ala Leu Tyr Leu Gin Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Ala Glu Ile Met Arg 15 Cys Phe Ser Ser Ser Thr Asn Leu Gin Gin Ser

20 Val Asn Tyr Asp Leu Leu Arg Ser Gin Leu Arg Ser Ser Asn JSer Ala Cys Leu Met Leu Leu Arg Gin Leu Asn Gly Ala Pro Gin Arg' Cys Pro Glu Asp Thr Met Asn Phe Gin Val Pro Glu Glu Ile Glu Gin Ala Gin Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala Leu Val Ile Tyr 25 Glu Met Leu Gin His Thr Trp Arg Ile Phe Arg Arg Asn Phe Ala Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Lys Asn Leu Leu Val Glu Val His Leu Gin Met Asp Arg Leu Glu Thr Asn Leu Glu Glu Ile Met Glu Glu Glu Ser Ser Thr Trp Gly Asn Thr Thr Ile Leu Arg 30 Leu Lys Lys Tyr Tyr Gly Arg Ile Ser Gin Tyr Leu Lys Ala Lys Lys Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Val Val Gin Ala Glu Met Leu Arg Asn Leu Ala Phe Leu Asn Gly Leu Thr Asp Tyr Leu Gin Asn 35 66 DK 167929 B1 Cys Asp Leu Pro Ala Ser Leu Asp Leu Arg Lys Gin Glu Thr Leu Arg Val Leu His Gin Met Glu Thr Ile Ser Pro Pro Ser Cys Leu

5. Transformeret værtsorganisme, kendetegnet ved, at den indeholder den for EqIFN-alpha, -beta 30 eller -omega kodende sekvens ifølge et af de foregående krav.

5 TGC CCC GAG GAC ACA ATG AAC TTC CAG GTC CCT GAG GAG ATT GAG CAA GCA CAG CAG TTC CAG AAG GAG GAT GCT GCA TTG GTC ATC TAT GAG ATG CTC CAG CAC ACC TGG CGT ATT TTC AGA AGA AAT TTC GCT \ AGC ACT GGC TGG AAT GAG ACC ATC GTT AAG AAC CTC CTT GTG GAA

5 AAG CAC AGG ACA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG CAG CTG GAT GGC AGG CAG TTC CCA GAG GCC CAG GCC ACG TCT GTC CTC CAG GAG ATG CTC CAG CAG ATC GTC AGC CTC TTC CAC ACA GAG CGC TCG TCT GCT GCC TGG AAC ACG ACT CTG CTG GAC CGA CTC CTC GCG GGA CTC CAT

5 AAG GAC AGA AAT GAC TTT GGA TTC CCC CAG GAG GTG TTT GAC GGC AAC CAG TTC CGG AAG CCT CAA GCC ATC TCT GCG GTC CAT GAG ACG ATC CAA CAG ATC TTC CAC CTC TTC AGC ACA GAC GGC TCG TCT GCT GCC TGG GAC GAG AGC CTC CTA GAC AAG CTC TAC ACT GGA CTC TAT

5 AAG GAC AGA AAT GAC TTT GGA TTC CCC CAG GAG GTG TTT GAC GGC AAC CAG TTC CGG AAG CCT CAA GCC ATC TCT GCG GTC CAT GAG ACG ATC CAA CAG ATC TTC CAC CTC TTC AGC ACA GAC GGC TCG TCT GCT GCC TGG GAC GAG AGC CTC CTA GAC AAG CTC TAC ACT GGA CTC TAT

6. Transformeret værtsorganisme ifølge krav 5, kendetegnet ved, at den er en prokaryot eller en eukaryot, fortrinsvis E. coli eller Saccharomyces 35 cerevisiae eller en pattedyrcelle. 64 DK 167929 B1

7. Transformeret værtsorganisme ifølge krav 5 eller 6, kendetegnet ved, at den genetiske sekvens er indeholdt i en vektor som er replicerbar i værtsorganismen, og udtrykker proteinet, fortrinsvis 5. et af plasmiderne ifølge krav 3 eller 4.

8. Interferon, kendetegnet ved, at det er et EqIFN-alpha, -beta eller -omega kodet af en DNA-sekvens ifølge et af kravene 1. eller 2, i det væsentlige frit for andre proteiner af dyrisk herkomst, 10 fortrinsvis i en i det væsentlige ren form.

9. Interferon ifølge krav 8, kendetegnet ved, at det foreligger frit for nativ glycosy-lering.

10. Interferon ifølge krav 8 eller 9, k e n -15 detegnet ved, at det indeholder aminosyrese- kvensen ifølge en af formlerne:

20 Cys Asp Leu Pro His Thr His Ser Leu Gly Asn Thr Arg Val Leu Met Leu Leu Gly Gin Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg Asn Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Val Phe Asp Gly Asn Gin Phe Arg Lys Pro Gin Ala Ile Ser Ala Val His Glu Thr 25 Ile Gin Gin Ile Phe His Leu Phe Ser Thr Asp Gly Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Ser Leu Leu Asp Lys Leu Tyr Thr Gly Leu Tyr Gin Gin Leu Thr Glu Leu Glu Ala Cys Leu Ser Gin Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Glu Asp Ser Leu Leu Ala Val 30 Arg Arg Tyr Phe Gin Arg Ile Ala Leu Tyr Leu Gin Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Ser Ser Thr Asn Leu Pro Gin Ser 35 65 DK 167929 B1 Cys Asp Leu Pro His Thr His Ser Leu Gly Asn Thr Arg Val Leu Met Leu Leu Gly Gin Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu

10 GTC CAT CTG CAG ATG GAC CGT CTG GAG ACA AAC CTG GAG GAA ATA ATG GAG GAG GAA AGC TCC ACC TGG GGA AAC ACA ACC ATT CTG CGC CTG AAG AAA TAC TAC GGA AGG ATC TCG CAG TAC CTG AAG GCC AAG AAG TAC AGC CAC TGT GCC TGG ACA GTG GTC CAA GCG GAA ATG CTC 15 AGG AAC TTG GCC TTC CTT AAC GGA CTC ACA GAT TAC CTC CAA AAC TGA eller degenererede varianter heraf.

10 CAG CAG CTG G AA GAC CTC AAC ACC TGC TTG GAT GAG CAG ACA GGA GAG GAA GAA TCC GCC CTG GGA ACT GTG GGC CCT ACA CTG GCC GTG AAG AGG TAC TTC AGG AGA ATC CGT CTG TAC CTG ACA GAG AAG AAA TAC AGT GAC TGT GCC TGG GAG ATT GTC AGA GTG GAC ATC ATG AGA 15 TCC TTC TCT TCA TCA GCA AAC CTG CAA GGA AGG TTA GGA ATG AAG GAT GGA GAC CTG GGG TCA CCT TGA

20 TGT GAC CTG CCT CAG AAC CAC ATC CTG GTT AGC AGG AAG AAC TTC GTG CTT CTG GGC CAA ATG AGC AGA ATC TCC TCC GCA ATC TGT CTG AAG GAC AGA AAA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAC ATG GCG GAT GGC AGG CAG TTC CCA GAG GCC CAG GCC GCG TCT GTC CTC CAC GAG ATG

25 CTC CAG CAG ATC TTC AGC CTC TTC CAC ACA GAG CGC TCG TCT GCT GCC TGG AAC ACG ACC CTC CTG GAC GAA CTC TGC ACG GGA CTC CTT CGG CAG CTG GAA GAC CTG GAC ACC TGT TTG GAG CAG GAG ATG GGA GAG GAA GAA TCT GCC CTG GGA ACT GTG CGC CCT ACA CTG GCC GTG 30 AAG AGG TAC TTC CGG GGG ATC CAT CTC TAC CTG AAA GAG AAG AAA TAC AGT GAC TGT GCC TGG GAG ATT GTC CGA ATG GAA ATC ATG AGA TCC TTC TCT TCA TCA GCA AAC CTG CAA GGA AGG TTA AGA ATG AAG

35 GAT GGA GAC CTG GGC TCA CCT TGA eller DK 167929 B1 63 GTG AAC TAT GAC TTG CTT CGG TCC CAA CTA AGA AGO AGC AAT TCA GCA TGT CTG ATG CTC CTG CGG CAG TTG AAT GGA GCC CCT CAA CGT

10 CAG CAG CTG ACT GAG CTG GAA GCC TGT CTG AGC CAG GAG GTG GGG GTG GAA GAG ACG CCC CTG ATG AAC GAG GAC TCC CTG CTG GCT GTG AGG AGA TAC TTC CAA AGA ATC GCT CTC TAT CTG CAA GAG AAG AAA TAC AGC CCT TGT GCC TGG GAG ATC GTC AGA GCA GAA ATC ATG AGA 15 TCC TTC TCT TCA TCC ACA AAC TTG CCG CAG AGT TAA

20 TGT GAC CTG CCT CAC ACC CAT AGC CTG GGC AAC ACA AGG GTC TTG ATG CTC CTG GGA CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCC TTC TCC TGC CTG AAG GAC AGA AAT GAC TTT GGA TTC CCC CAG GAG GTG TTT GAC GGC AAC CAG TTC CGG AAG CCT CAA GCC ATC TCC GCG GTC CAT GAG ACG

25 ATC CAA CAG ATC TTC CAC CTC TTC AGC ACA GAC GGC TCG TCT GCC GCC TGG GAC GAG AGC CTC CTA GAC AAG CTC TAC ACT GGA CTC TAT CAG CAG CTG ACT GAG CTG GAA GCC TGT CTG AGC CAG GAG GTG GGG GTG GAA GAG ACG CCC CTG ATG AAC GAG GAC TCC CTG CTG GCT GTG 30 AGG AGA TAC TTC CAA AGA ATC ACT CTC TAT CTG CAA GAG AAG AAA TAC AGC CCT TGT GCC TGG GAG ATC GTC AGA GCA GAA ATC ATG AGA TCC TTC TCT TCA TCC ACA AAC TTG CCG CAA AGT TAA 35 TGC GAC CTG CCT GCG AGC CTT GAC TTG AGA AAG CAG GAG ACC CTC 62 DK 167929 B1 AGA GTT CTG CAC CAG ATG GAG ACA ATC TCT CCT CCT TCC TGT CTG

10 CAG CAG CTG ACT GAG CTG GAA GCC TGT CTG AGC CAG GAG GTG GGG GTG GAA GAG ACG CCC CTG ATG AAC GAG GAC TCC CTG CTG GCT GTG AGG AGA TAC TTC CAA AGA ATC GCT CTC TAT CTG CAA GAG AAG AAA TAC AGC CCT TGT GCC TGG GAG ATC GTC AGA GCA GAA ATC ATG AGA 15 TCC TTC TCT TCA TCC ACA AAC TTG CCG CAG AGT TAA

20 TGT GAC CTG CCT CAC ACC CAT AGC CTG GGC AAC ACA AGG GTC TTG ATG CTC CTG GGA CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCC TTC TCC TGC CTG AAG GAC AGA AAT GAC TTT GGA TTC CCC CAG GAG GTG TTT GAC GGC AAC CAG TTC CGG AAG CCT CAA GCC ATC TCC GCG GTC CAT GAG ACG

25 ATC CAA CAG ATC TTC CAC CTC TTC AGC ACA GAC GGC TCG TCT GCT GCC TGG GAC GAG AGC CTC CTA GAC AAG CTC TAC ACT GGA CTC TAT CAG CAG CTG ACT GAG CTG GAA GCC TGT CTG AGC CAG GAG GTG GGG GTG GAA GAG ACG CCC CTG ATG AAC GAG GAC TCC CTG CTG GCT GTG 30 AGG AGA TAC TTC CAA AGA ATC GCT CTC TAT CTG CAA GAG AAG AAA * TAC AGC CCT TGT GCC TGG GAG ATC GTC AGA GCA GAA ATC ATG AGA TGC TTC TCT TCA TCC ACA AAC TTG CAG CAG AGT TAA 35 TGT GAC CTG CCT CAC ACC CAT AGC CTG GGC AAC ACA AGG GTC TTG 61 DK 167929 B1 ATG CTC CTG GGA CAA AT G AGG AGA ATC TCC CCC TTC TCC TGC CTG

10 PATENTKRAV

11. Fremgangsmåde til fremstilling af EqlFN- 5 alpha, -beta eller -omega, kendetegnet ved, at a) en værtsorganisme, fortrinsvis en værtsorganisme ifølge et af kravene 5-7, transformeres med genetiske informationer ifølge et af kravene 1-3, 10 b) den kodende sekvens er indeholdt i en eks pressionsvektor, fortrinsvis i en af ekspressionsvektorerne ifølge krav 3 eller 4, og at denne information udtrykkes i værtsorganismen , og c) interferonet EqlFN-alpha, -beta eller -omega 15 ifølge et af kravene 8-10, fortrinsvis et interferon ifølge krav 10, isoleres og renses.

12. Anvendelse af interferonerne ifølge et af kravene 8-10 til fremstilling af et farmaceutisk præparat.

13. Middel til terapeutisk behandling, ken detegnet ved, at det foruden farmaceutisk indifferente bærestoffer indeholder en virksom mængde af et interferon ifølge et af kravene 8-10.

14. EqlFN-alpha, -beta eller -omega ifølge et af 25 kravene 8-10 til anvendelse som lægemiddel.