NO176057B - Fremgangsmåte for fremstilling av hunde- og hesteinterferoner og ekspresjonsvektor som koder for disse - Google Patents
Fremgangsmåte for fremstilling av hunde- og hesteinterferoner og ekspresjonsvektor som koder for disse Download PDFInfo
- Publication number
- NO176057B NO176057B NO855078A NO855078A NO176057B NO 176057 B NO176057 B NO 176057B NO 855078 A NO855078 A NO 855078A NO 855078 A NO855078 A NO 855078A NO 176057 B NO176057 B NO 176057B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- dna
- plasmid
- fragment
- interferon
- alpha
- Prior art date
Links
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 title claims abstract description 122
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 title claims abstract description 99
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims description 16
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 title abstract description 70
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 title abstract description 65
- 241000282465 Canis Species 0.000 title description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 270
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 261
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 67
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims description 44
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 12
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 12
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 181
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 103
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 81
- 238000000034 method Methods 0.000 description 59
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 59
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 57
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 55
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 50
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 46
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 42
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 41
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 41
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 40
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 40
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 39
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 38
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 38
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 38
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 35
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 31
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 30
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 28
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 28
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 27
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 27
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 27
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 24
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 23
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 23
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 22
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 21
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 20
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 20
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 19
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 19
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 17
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 17
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 15
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 15
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 14
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 14
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 14
- FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-trinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-3,5-dinitrooxy-6-(nitrooxymethyl)oxan-4-yl] nitrate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O1)O[N+]([O-])=O)CO[N+](=O)[O-])[C@@H]1[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O[C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N 0.000 description 14
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 14
- 229940079938 nitrocellulose Drugs 0.000 description 14
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 13
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 13
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 13
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 13
- 241000894007 species Species 0.000 description 13
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 13
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 12
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 12
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 12
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 11
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 11
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 11
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 11
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 11
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 10
- 102100040019 Interferon alpha-1/13 Human genes 0.000 description 10
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 10
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 10
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 10
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 10
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 9
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 9
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 9
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 9
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 9
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 8
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 8
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 8
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 8
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 8
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 8
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 7
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 7
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 244000309466 calf Species 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 7
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 7
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 7
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 7
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 6
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 6
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 6
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 6
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 5
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 5
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 5
- RZILCCPWPBTYDO-UHFFFAOYSA-N fluometuron Chemical compound CN(C)C(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 RZILCCPWPBTYDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 5
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 5
- 101150116497 sacm1l gene Proteins 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 4
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 4
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 4
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 4
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- -1 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- Chemical group 0.000 description 3
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 3
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- PLVPPLCLBIEYEA-UHFFFAOYSA-N indoleacrylic acid Natural products C1=CC=C2C(C=CC(=O)O)=CNC2=C1 PLVPPLCLBIEYEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000002512 suppressor factor Substances 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PLVPPLCLBIEYEA-AATRIKPKSA-N (E)-3-(indol-3-yl)acrylic acid Chemical compound C1=CC=C2C(/C=C/C(=O)O)=CNC2=C1 PLVPPLCLBIEYEA-AATRIKPKSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 2-acetamido-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound CC(=O)NC(CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- GFFRWIJAFFMQGM-NUMRIWBASA-N Asn-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GFFRWIJAFFMQGM-NUMRIWBASA-N 0.000 description 2
- UXHYOWXTJLBEPG-GSSVUCPTSA-N Asn-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O UXHYOWXTJLBEPG-GSSVUCPTSA-N 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- DYDCUQKUCUHJBH-UWTATZPHSA-N D-Cycloserine Chemical compound N[C@@H]1CONC1=O DYDCUQKUCUHJBH-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- DYDCUQKUCUHJBH-UHFFFAOYSA-N D-Cycloserine Natural products NC1CONC1=O DYDCUQKUCUHJBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 102000002227 Interferon Type I Human genes 0.000 description 2
- 108010014726 Interferon Type I Proteins 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000724220 Phage M13mp8 Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000005275 alloying Methods 0.000 description 2
- 101150087698 alpha gene Proteins 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 2
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 108010045648 interferon omega 1 Proteins 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 2
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- IARGXWMWRFOQPG-GCJQMDKQSA-N Asn-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O IARGXWMWRFOQPG-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 1
- AITGTTNYKAWKDR-CIUDSAMLSA-N Asn-His-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O AITGTTNYKAWKDR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- VITDJIPIJZAVGC-VEVYYDQMSA-N Asn-Met-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O VITDJIPIJZAVGC-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- YXVAESUIQFDBHN-SRVKXCTJSA-N Asn-Phe-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YXVAESUIQFDBHN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- BKFXFUPYETWGGA-XVSYOHENSA-N Asn-Phe-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O BKFXFUPYETWGGA-XVSYOHENSA-N 0.000 description 1
- VLDRQOHCMKCXLY-SRVKXCTJSA-N Asn-Ser-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O VLDRQOHCMKCXLY-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- PQKSVQSMTHPRIB-ZKWXMUAHSA-N Asn-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PQKSVQSMTHPRIB-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 241000701083 Bovine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 101100402795 Caenorhabditis elegans mtl-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010073254 Colicins Proteins 0.000 description 1
- 108050009160 DNA polymerase 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- 101001054334 Homo sapiens Interferon beta Proteins 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical group NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108050005735 Maltoporin Proteins 0.000 description 1
- 101001054328 Mus musculus Interferon beta Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- FFOKMZOAVHEWET-IMJSIDKUSA-N Ser-Cys Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O FFOKMZOAVHEWET-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 210000001132 alveolar macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002070 germicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004046 hyporesponsiveness Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000004922 lacquer Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000009304 pastoral farming Methods 0.000 description 1
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000003016 pheromone Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 101150059159 proA2 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører en ekspresjonsvektor som koder for, og er istand til å uttrykke EqIFN-a, - f3, -6 og CaIFN-a og en fremgangsmåte for fremstilling av EqIFN-a,
-6 eller CaIFN-a.
Interferoner er proteiner som utskilles av høy-kariotiske celler etter virusinfeksjon eller andre stimuleringer, og som på sin side kan beskytte cellene mot virusinfeksjoner. For tiden er fire av klasser av interferoner kjent, og de betegnes med interferon-alfa, interferon-beta, interferon-omega og interferon-gamma (forkortet: I FN-a, IFN-/3, IFN-O og IFN-å) .
De adskiller seg i sin oppbygning og i sine virkninger. Således kan interferoner påvirke immunsystemets celler regu-lerende eller også differensieringen av celler og veksten av tumorer.
I lang tid har man antatt at interferonene virker arts-spesifikt. In vitro forsøk har imidlertid vist at IFN-preparater fra kveg kan utløse en antivirus-virkning hos aper og hos mennesker (32). Denne artsinteraktiviteten henger muligens sammen med genenes henholdsvis proteinenes mer eller mindre store homologi, men på grunn av de små mengder animalske interferoner kunne denne antagelse ikke bevises.
Tross den fastslåtte artsinteraktivitet er bivirkninger såsom antigenvirkninger å vente ved anvendelse av artsfremmede interferoner, hvilke ikke kan tolereres for en terapi.
Da nytte- og husdyrhold imidlertid utgjør en betydelig økonomisk verdi, består et behov for interferoner for de forskjellige arter som kan anvendes av veterinærer.
Meget rene dyreinterferoner fra forskjellige arter vil dertil gi den velkomne anledning til å undersøke virknings-mekanismene for interferoner for å komme til modellfore-stillinger som kan overføres til menneskene.
De første undersøkelser med animalske interferoner ble utført med preparater fra naturlig cellemateriale, men utbytte og renhet av interferoner fremstilt ifølge denne fremgangsmåten gjør at de synes uegnet for fremstilling av legemidler.
Ved utviklingen av denne rekombinant-DNA-teknikk er det mulig å produsere heterologe proteiner fra mikroorganismer. Således ble for eksempel også human-interferoner (Hu-IFN) fremstilt, og nylig også et kveg-alfa- og et kveg-beta-interferon.
Den innledningsvis nevnte ekspresjonsvektor er særpreget ved at den omfatter et DNA-molekyl som koder for EqIFN-a, - p,
-co eller CaIFN-a, med en sekvens ifølge formlene I-V som inne-holder tryptofanpromotoren; og særlig foretrukket er at den er plasmidet pAH52 (Fig. 14), pAH52/2 (Fig. 15), pAH53 (Fig. 14), pAH55 (Fig. 15), pAH62 (Fig. 16), pAH4/2 (Fig. 28), pAH4/3 som er replikerbar i E. Coli;
Spesielt foretrukne DNA-sekvenser i ekspresjonsvektoren er
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er særpreget ved at
a) E. coli transformeres med en ekspresjonsvektor som koder for, og er istand til å uttrykke EqIFN-a, -/3, -co eller CaIFN-a
ifølge krav 3,
b) interferonet EqIFN-a, -/3, -co eller CaIFN-a, fortrinnsvis et interferon med én av sekvensene ifølge krav 3, fremstilles,
isoleres og renses.
Ekspresjonsvektoren i følge oppfinnelsen koder for heste-interferonene med den angitte aminosyresammensetning over, og har DNA-sekvensene med de tilsvarende kodoner:
Oppfinnelsens oppgave løses ved at man isolerer høymole-kylart DNA fra vevet til de nevnte dyr, fortrinnsvis fra leveren etter en modifisert fremgangsmåte ifølge Blind und Stafford (18) og fragmenteres statistisk ved hjelp av spesi-elle endonukleaser. De således erholdte forskjellige store fragmenter fraksjoneres etter størrelsen, fortrinnsvis for dannelse av 10-23 kb-fragmenter, for å klones i en vektor, for eksempel i en lambda-vektor. Deretter formeres disse vektorer i en bakterie, fortrinnsvis E. coli.
Heste-DNA ble utprøvet ved hjelp av DNA som koder for ferdig humane interferon-alfa2ARG og cDNA som koder for humant /3-interferon under ikke stringente betingelser.
Hunde-DNA ble utprøvet ved hjelp av DNA som koder for ferdig humane interferon-alfa2ARG under ikke stringente betingelser.
Ved den lave stringens fikk man også med kloner som i sine sekvenser har betydelige forskjeller fra HuIFN-alfa2ARG henholdsvis HuIFN-/?.
Ved undersøkelsen av heste-DNA med humant alfa-genet ble det ved kveg, svin og mennesker med Southern-analyse fastslått flere bånd, slik at man kan gå ut fra at det også hos hesten må finnes en klasse av alfa-interferon-gener.
Fra de hybridiserte rekombinanter ble fag-DNA fremstilt og fra de resulterende kloner Eq-alfal, Eq-beta6 ble det oppstilt restriksjonskart (figur 2 og 3). Videre fikk man to lambda-kloner, Eq-alfal6 og Eq-alfa20 som hybridiserte med den humane IFN-probe. Et 3,2 kb HindIII-fragment fra klone Eq-alfal, et 4,5 kb PvuII-fragment av klonet Eq-beta6, et 3,3 kb EcoRI-fragment av klonet Eq-alfal6, henholdsvis et 2,2 kb EcoRI-fragment av klonet Eq-alfa2 0 ble subklonet i en vektor, for eksempel pUC 9 og deretter transformert til en verts-organisme, for eksempel E. coli JM101. Isoleringen av de korrekte fenotyper ga plasmidene pAH50, pAH60, pRH63 henholdsvis pRH61 hvilke som innskudd inneholdt sekvensene som koder for heste-interferonene.
Restriksjonskartene for pRH61, pRH63 er avbildet i figur 9.
Innskuddene av plasmidene ble sekvensbestemt etter dideoksy-metoden til Sanger (23) ifølge "Shotgun-metoden". Delsekvensen av disse innskudd ble forenet ved hjelp av et modifisert computerprogram til en totalsekvens (figur 4, 8, 10 og 12).
Den lengste åpne leserammen for Eq-IFN-alfa-genet fra klonet Eq-alfal kodet polypeptid med 184 aminosyrer. Bemerkelsesverdig er den signifikante homologien med kjente alfa-interferoner fra andre arter. Likesom ved de humane, kveg og murine alfa-interferner består dette heste-alfa-interferon av et hydrofobt signalpeptid med 23 aminosyrer, som går forut for et ferdig protein med overraskende bare 161 aminosyrer (Eq-IFN-alfal). Fire cysteinrester i posisjonene 1, 29, 99 og 139 fåes mellom artene hest, kveg, mus, rotte og menneske nøyaktig (figur 7). Forkortningen av dette heste-alfa-interferonet til 161 aminosyrer bør være bevirket av delesjonen av en base etter den 159de aminosyre, uten hvilken transkripsjonen frem til den 166de aminosyre frem til Stopcodon TGA ville være skrevet videre.
Dette resultatet tyder på at polypeptidkjeden. for et ferdig hesteinterferon-alfal kan ha en lengde på 161 aminosyrer, men at også andre former med opp til 166 aminosyrer kan eksistere. Også disse peptider er selvfølgelig gjenstand for foreliggende oppfinnelse.
Overraskende viste det seg ved parvis sammenligning av aminosyre-sekvensene at hesteinterferon-alfal har en større homologi (71-77 %) til de humane alfa-interferoner enn til kveg- (57-67 %), rotte- (61 %) eller mus-alfa-interferoner (54-59 %) (figur 5). Homologien mellom de forskjellige alfa-interferoner av en slekt er tydeligvis større enn mellom deres forskjellige arter (for eksempel mennesker 77-100 %, kveg 91-99 %).
Den lengste åpne leseramme for Eq-IFN-alfa-genet fra klonet Eq-alfal6 koder likeledes for et polypeptid med 184 aminosyrer (signalpeptid 23 aminosyrer, ferdig protein 161 aminosyrer).
DNA-sekvensen fra klonet pRH63 er i det proteinkodende område meget likt det fra klonet pAH50, hvilket kan utnyttes for ekspresjonen av genet (se eksempel M; figur 11 og 15). Interferonet fra klonet pRH63 ble på grunn av den høye homologi med Eq-IFN-alfal (fra klon pAH50) kalt Eq-IFN-alfa2. Ferdig Eq-IFN-alfa2 har likeledes i forhold til Eq-IFN-alfal bare to forskjellige aminosyre-rester på den C-terminale ende, hvorunder en femte cysteinrest ved utskiftning på posisjon 151 Ser — Cys i Eq-IFN-alfa2 befinner seg på en posisjon som hittil ikke er observert ved noe annet interferon (se figur 19) .
Ellers gjelder det som er nevnt for Eq-IFN-alfal også for Eq-IFN-alfa2.
DNA-fragmentet av Eq-alfa20 inneholder den kodende sekvens for et protein med 172 aminosyrer og et hydrofobt signalpeptid med 23 aminosyrer. På posisjon 78-80 i det ferdige protein befinner det seg et potensielt N-glykosiler-ingssted som nøyaktig tilsvarer det for Eq-IFN-/3, Hu-IFN-/3, MU-IFN-/3, Mu-IFN-alfal,2,4,5,6 (figur 19).
Proteinsekvensene i denne avbildning ble anordnet slik at det ble oppnådd en størst mulig homologi mellom de. enkelte interferoner. Til sammenligning av IFN-alfa og IFN-/3-sekvenser ble sistnevnte forskjøvet med 3 aminosyrer og et tomrom innført. Den parvise sammenligning av aminosyre-sekvensene i figur 2 0 fant sted ut fra denne anordning over den lengste felles mengde av proteinene.
Fra avbildningene 19 og 2 0 fremgår at det fra DNA-sekvensen til klonet pRH61 kodede protein er beslektet med type I interferoner (alfa- og /3-IFN) . Karakteristika for 172 aminosyrer, glykosyleringssted på posisjon 78 og den omtrent like store homologi av interferonene til denne klasse mellom forskjellige arter (menneske, kveg, hest) liksom mellom disse lengre interferoner og alfa-interferonene innenfor en slekt, samt de forskjellige setninger av hybridiserte DNA-fragmenter med alfa-interferon og prober fra klonet pRH61 (figur 18), tillater den antagelse at innskuddet av klonet pRH61 tilhører en ny klasse av type I interferoner, som betegnes interferon-omega (33). Denne betegnelse er mindre forvirrende enn den Capon et al (34) anvendte: Type I, klasse II interferon, som kunne føre til forveksling med type II interferon (IFN-gamma).
Heste-beta-interferonets sekvens ble bestemt analogt med alfa'et. Den lengste åpne leseramme for beta-IFN-genet koder for et polypeptid med 186 aminosyrer, hvorunder homologi også i dette tilfelle med kjente beta-interferoner fra andre arter kan observeres. Som hos de humane, de 3 kveg og de murine beta-interferoner har heste-beta-interferonet et hydrofobt signalpeptid med 21 aminosyrer.
Overraskende viste det seg også ved beta-interferonet ved parvis sammenligning av aminosyresekvensene at heste-beta-interferonet har en større homologi (59 %) med det menne-skelige beta-interferon enn med kveg (50-55 %) eller mus-beta-interferonene (44 %) (figur 6).
På den annen side mangler man til tross for overraskende høy homologi av heste/menneske-beta-interferon, liksom ved de tre storfe-beta-interferoner aminosyren som står i posisjon 119 i det humane beta-interferon også i heste-beta-interferon!
Heste-beta-interferonene har to potensielle N-glykosyler-ingssteder: på posisjon 80 i det ferdige protein .
(ASN-GLU-THR, nøyaktig som hos humant og mus-beta-interferon)
og på posisjon 115 (ASN-THR-THR). Ved kveg-beta-interferonene med to mulige N-glykosileringssteder lokalisert på posisjon 110 (ASN-PHE-THR henholdsvis ASN-SER-PHE) og 152 (ASN-VAL-SER henholdsvis ASN-PHE-SER).
Liksom hos kveg og mennesker er de 3 cysteinrester blitt opprettholdt nøyaktig (posisjon 17, 31 og 140 henholdsvis 141 hos mennesker).
Ved undersøkelsen av hunde-DNA med det humane-alfa-gen kunne man likeledes som hos kveg, svin og mennesker fastslå flere bånd, slik at man kan gå ut fra at det også hos hund må finnes en klasse alfa-interferongener.
Fra de hybridiserende rekombinanter ble fag DNA fremstilt og fra det resulterende klon Ca alfall-2 ble det oppstilt et restriksjonskart (figur 22). Et 3,7 kg Smal fragment og et 2,4 kb Smal fragment av dette klon ble subklonet i en vektor, for eksempel pUC 9 og transformeres deretter til en mikro-organisme, for eksempel E. coli JM101. Isoleringen av de riktige fenotyper ga to plasmider pAH2 og pAH4, hvilke som innskudder inneholder sekvensene som kode for hunde-interferonene.
Innskuddene til disse plasmider ble sekvensbestemt etter dideoksy-metoden til Sanger (23) ifølge "Shotgun-metoden". Delsekvensene til disse innskudder ble forenet ved hjelp av et modifisert computerprogram til en totalsekvens (figur 24 og 25) .
Overraskende koder den lengste åpne leseramme av de to plasmidsekvenser for fullstendig identiske polypeptider med 187 aminosyrer. Bemerkelsesverdig er den signifikante homologi med kjente alfa-interferoner fra andre arter. De proteinkodede sekvenser er nøyaktig like; 170 baser av den 5'-ikke-translaterte region adskiller seg bare ved 3 nukleotider (1,8 %) (sammenlign 28). Liksom ved human, storfé og murin-alfa-interferonene består hunde-alfa-interferon av et hydrofobt signalpeptid med 23 aminosyrer, som går forut for et ferdig protein med overraskende bare 164 aminosyrer. Sammenlignet med proteinsekvensene til andre beskrevne alfa-interferoner mangler hunde-alfa-interferonet to aminosyrer på posisjon 119 og 120 i det ferdige protein (figur 26).
Overraskende har ferdig hunde-alfa-interferon som eneste hittil kjente alfa-interferon 6 cysteinrester, og altså er tre intramolekylære disulfidbroer mulige.
Fire av disse cysteinrester på posisjonene 1, 29, 99 og 139 erholdes nøyaktig mellom artene hund, kveg, mus, rotte og menneske. Cysteinet på posisjon 86 er bevart mellom CalFN-alfal, CaIFN-alfa2, MuIFN-alfal, MuIFN-alfa2, RalFN-alfa og HuIFN-alfaD.
Overraskende har hunde-alfa-interferonet to potensielle N-glykosileringssteder, nemlig på posisjon 78 (ASN-MET-THR) og 133 (ASN-HIS-SER). Glykosileringsstedet på posisjon 78 tilsvarer det i MuIFN-alfal og 2 (ASN-ALA-THR); det tilsvarer også glykosileringsstedet til beta-interferonet fra menneske og mus på posisjon 80 (ASN-GLU-THR).
En parvis sammenligning av aminosyresekvensene viste at hunde-alfa-interferonet har en homologi på 52-57 % med humant alfa-interferon, på 54-55 % med kveg-alfa-interferonene og på 50 % med rotte-alfa-interferonene og på 48-51 % med mus-alfa-interferonene (figur 27).
Det skal her nevnes at det ved interferonene ifølge oppfinnelsen ikke bare dreier seg om de ferdige interferoner som er beskrevet i detalj, men likeledes som enhver modifikasjon av disse polypeptider som ikke vesentlig forandrer heste/hunde-IFN-aktiviteten. Disse modifikasjoner omfatter for eksempel forkortelse av molekylet for eksempel på den N-eller C-terminale ende, utskifting av aminosyrer med andre rester, kjemiske eller biokjemiske bindinger av molekylet til andre molekyler som er inerte eller aktive. Ved de sistnevnte modifikasjoner kan det for eksempel dreie seg om hybride molekyler av ett eller flere interferoner ifølge oppfinnelsen og/eller kjente a- eller /3-interferoner.
Gjenstand for oppfinnelsen er derfor ikke bare gen-sekvenser, som spesifikt koder for interferonene ifølge oppfinnelsen, men likeledes modifikasjoner som lett og rutinemessig kan erholdes ved mutasjon, nedbygning, trans-posisjon eller addisjon. Enhver sekvens som koder for interferoner ifølge oppfinnelsen (dvs. som har det biologiske aktivitetsspektrum som her er beskrevet) og er degenerert i sammenligning med det viste, er likeledes innbefattet, og en fagmann på dette område er istand til å degenerere DNA-sekvensene til de kodede områder. Likeledes er enhver sekvens som koder for et polypeptid med aktivitetsspektre til interferoner i oppfinnelsen, og som hybridiserer med de nevnte sekvenser (eller deler derav) under stringente betingelser (for eksempel betingelser som selekterer for mer enn 85 %, fortrinnsvis mer enn 90 % homologi) omfattet.
Hybridiseringen utføres i 6 x SSC/5 x Denhardt<1>s løs-ning/0,1 % SDS ved 65°C. Stringensgraden bestemmes i vaske-trinnet. Således er for en seleksjonering på DNA-sekvensen med ca. 85 % eller mer homologi betingelsene 0,2 x SSC/0,01 %, SDS/65°C og for en seleksjonering på DNA-sekvenser med ca. 90 % eller mer homologi betingelsene 0,1 x SSC/0,01 % SDS/65°C
egnet.
Interferon-gener ifølge oppfinnelsen kan under betingelser innføres i enhver organisme som førte til høye utbytter. Egnede verter og vektorer er velkjente for fagmannen, og som eksempel vises til europeisk patentsøknad 0 093 619.
Ekspresjon utføres i E. coli, for eksempel E. coli K 12, Stamme 294 (ATCC Nr. 31 446) eller E. coli X1776 (ATCC Nr. 31.537). I likhet med de forannevnte stammer kan også E. coli W 3110 (F", LAmbda", Prototroph, ATCC Nr. 27325).
Generelt kan plasmid-vektorene inneholde replikon, og kontrollsekvenser som stammer fra arter som er kompatible med vertscellene, anvendes i forbindelse med disse verter. Vektoren bærer normalt ved siden av et replikasjonssted gjen-kj ennelsessekvenser, som gjør det mulig å selektere for de transformerte celler fenotypisk. For eksempel transformeres E. coli normalt med pBR322, et plasmid som stammer fra E. coli arter (Bolivar, et al., Gene 2, 95 (1977)). pBR322 inneholder gener for ampicillin- og tetracyklin-resistens og gir dermed et enkelt middel til å identifisere transformerte celler. pBR322-plasmid eller også andre plasmider må dertil dessuten i seg selv inneholde promotorer eller må være såvidt modifiserte at de inneholder promotorer som av den mikrobielle organisme kan anvendes for ekspresjon av dens egne proteiner. Promo-torene som oftest anvendes med fremstilling av rekombinant DNA inneholder beta-laktamase (penicillinase) og laktose-promotor-systemer (Chang et al., Nature 275. 615 (1978); Itakura et al., Science 198. 1056 (1977); Goeddel et al., Nature 281, 544
(1979)) og tryptofan(trp) promotor-systemer (Goeddel et al.,
Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); EP-A-0 036 776). Skjønt de nevnte er de vanligste promotorer, er det dertil også utviklet og anvendt andre mikrobielle promotorer. Gen-sekvensen for interferonene i oppfinnelsen kan for eksempel anvendes under kontroll av Leftward-promotoren til bakteriofagen lambda (PL) . Denne promotor er en av de promotorer som er kjent som spesielt sterke, som er styrbar. Styringen muliggjøres av lambda-reseptoren, fra hvilken nabostående restriksjons-delesteder er kjente.
Et temperaturømfintlig allel av dette repressor-gen kan innføres i en vektor som inneholder en fullstendig IFN-omega-sekvens. Økes temperaturen til 42°C, inaktiveres repressoren og promotoren eksprimeres til sin maksimale konsentrasjon. Summen av mRNA, som produseres under disse betingelser, skulle være tilstrekkelig til å oppnå en celle som blant sine nye syntetiske ribonukleinsyrer inneholder ca. 10 %, som stammer fra PL-promotoren. På denne måten er det mulig å etablere en klone-bank, hvori en funksjonell IFN-sekvens plasseres i naboskap til et ribosom-bindingssted i varierende avstander fra lambda-PL-promotoren. Disse kloner kan så prøves og det med det viste utbytte utvelges.
Ekspresjonen og translasjonen av en sekvens som koder for proteinet i oppfinnelsen kan også forløpe under kontroll av andre reguleringssystemer som kan gjelde som "homologe" med organismen i sin ikke-transformerte form. Således inneholder for eksempel kromosomalt DNA fra en laktose-avhengig E. coli et laktose- eller lac-operon som ved utskillelse av enzymet beta-galaktosidase muliggjør laktose-nedbrytningen.
Lac-kontrollelementene kan også erholdes fra bakteriofagen lambda-plac5, som kan infisere E. coli. Lac-operonene til fagen kan ved transduksjon stamme fra den samme bakterie-art. Reguleringssystemer som ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan finne anvendelse, kan stamme fra plasmidisk DNA, som er organismens eget. Lac-promotor-operatorsystemet kan induseres med IPTG.
Andre promotor-operatorsystemer eller -deler derav kan likså godt anvendes: for eksempel arabinose-operator, kolicin Ei-operator, galaktose-operator, alkalisk fosfatase-operator, trp-operator, xylose-A-operator, låc-promotor og lignende.
Genene kan imidlertid fortrinnsvis uttrykkes .i et ekspresjonsplasmid pER103 (E. Rastl-Dworkin et al., Gene 21, 237-248 (1983) og EP-A-0.115-613 - deponert hos DSM under nummeret DSM 2773 den 20. desember 1983) eller også i plasmidet parpER33 (EP-A-0.115-613), da disse vektorer inneholder alle reguleringselementer som fører til en høy ekspresjons-grad hos de klonede gener.
Ut fra ekspresjonsplasmidet parpER33 ble "par"-sekvensen som er ansvarlig for den økede plasmid-stabilitet i E. coli og tryptofan-promotor-operatorsekvensen samt det kunstige ribosomale bindingssted satt inn i plasmid-vektoren pAT153. pAT153 er et forkortet derivat av plasmid pBR322 som mangler et avsnitt som er nødvendig for mobilisering av DNA (36).
Denne fremstilling av plasmidet parpATER103 er vist i figur 13. Plasmidet parpER33 ble delt fullstendig med Hindlll og delvis med EcoRI, det dannede 0,47kb lange DNA-fragment isolert fra en agarosegel og renset og ligert med pAT153 delt to ganger med EcoRI og Hindlll. Et plasmid med den ønskede struktur oppnådd etter transformasjon av E. coli HB101, som man bestemte ved nedbygning med forskjellige restriksjonsenzymer, ble kalt parpATER103. Dette plasmid inneholder replikasjonsopprinnelsen og ampicillin-resistensgenet for plasmid pAT153, samt den virksomme par-sekvens for stabili-seringen i E. coli og tryptofan-promotor-operatorområdet som er anvendelige for virkningsfull ekspresjon av gener og det ribosomale bindingssted.
Fremstillingen av ekspresjonsplasmidene pAH527 pAH52/2 og pAH53 samt deres fortrinn er vist i figur 14. For fremstilling av ekspresjonsplasmidene ble plasmidet pAH50 delt med Hindll og det 4,2 kb lange DNA-fragment, som inne-holder det fullstendige EqIFN-al-gen isolert og renset. Endene av HindII-fragmentet ble utstyrt med Sphl-bindere. Deretter ble DNA'et spaltet med SphI, ekstrahert med fenol og kloroform og utfelt med etanol. DNA'et ble ringsluttet med ligase og E. coli HB101 transformert. Et plasmid med en ønskede struktur fikk betegnelsen pAH51. Det inneholdt EqIFN-al-genet med et forkortet 3'-ikke-translatert område og et ytterligere Sphl-delingssted.
For å forbinde DNA-sekvensen for det ferdige heste-a-interferon i den riktige avstand med promotorsekvensen i sluttkonstruksjonen, gikk man ut fra et 0,4 kb langt DNA-fragment, som ble isolert fra plasmid pAH50 delt med PvuII. Syntetisk. 15mer oligonukleotid med sekvensen
5'-TGTGACCTGCCTCAC ble behandlet med polynukleotid-kinase.
Det inneholder sekvensen som koder for de første 5 aminosyrene til det ferdige EqIFN-al fra klon pAH50. 15meren ble blandet med 0,4 kb PvuII-fragmentet som denaturerer DNA-dobbeltkjeden.
Oligonukleotid-primer som er bundet til enkeltkjeden ble forlenget med Klenow-fragmentet. For sikkert å fjerne et eventuelt tilbakeblitt 3'-overheng, ble DNA'et så inkubert med T4 DNA-polymerase. Det dannede DNA med rette ender ble ekstrahert og utfelt med fenol og kloroform. På dette DNA-stykke ble en blanding av to kinasebehandlede innbyrdes komplementære oligonukloetider: 12mer 5'-AGCTTAAAGATG, 8mer 5'-CATCTTTA (europeisk patentsøknad nr. 83 112 812.9) ligert, som gir et Hindlll-delingssted og translasjonsstartkodonet ATG. Begge oligonukleotider ble ligert med ligase til DNA-fragmentet. Etter inaktivering av enzymet ble det erholdte DNA delt med Hindlll og Bglll og DNA-fragmentene isolert og renset med ca. 190 bp lengde. Det erholdte DNA-fragment ble ligert med pAH51-vektor dobbeltdelt med Hindlll og Bglll og E. coli HB101 transformert. Av 65 oppnådde kolonier ble det fra 4 plasmider som hadde det ønskede restriksjonsmønster isolert et HindiII/BamHI DNA-fragment og sekvensbestemt med Sanger-metoden, hvorunder to kloner inneholdt nøyaktig den ønskede sekvens. Et slikt plasmid ble kalt pAH51/2. Dette inneholdt sekvensen for ferdig EqIFN-al med forhåndstilt translasjonsstart-kodon ATG og Hindlll-delingssted.
For å fremstille ekspresjonplasmidene pAH52 og pAH52/2 ble plasmid pAH51/2 delt to ganger med SphI og Hindlll, det dannede 1,0 kb lange DNA-fragment isolert fra en agarosegel og ligert med Hindlll og SphI dobbeltkappet plasmid parpATER103. Et plasmid erholdt etter transformasjon av E. coli HB101 med den ønskede struktur ble kalt pAH52. Det inneholder alle de nødvendige informasjoner for en induserbar ekspresjon av ferdig EqIFN-al. På analog måte ble det fra pAH51/2 kappet med Hindlll og BamHI dobbelt og parpATER103 kappet med Hindlll/BamHI fremstilt plasmidet pAH52/2. Dette ekspresjonsplasmid er ca. 0,2 kb større enn pAH52 og har et tillegg et singulært BamHI-delingssted.
Et vesentlig redusert ekspresjonsplasmid for fremstilling av ferdig EqIFN-al i E. coli, hvori tryptofan-promotoren, interferon-genet, ampicillin-resistens-genet og replikasjonsopprinnelsen er orientert i en retning, ble fremstilt ut fra plasmidene pAH52 og pBR322: pAH53. pAH52 ble kappet med SphI og EcoRI, enzymene inaktivert ved 7 0°C og DNA-endene gjort jevne med Klenow-fragment etter tilsetning av dATP, dGTP, dCTP, dTTP. DNA-fragmentene ble fraksjonert etter størrelse på en agarosegel og et 1,1 kb langt stykke isolert som inneholder promotor og interferon-gen. pBR322 ble dobbeltdelt med EcoRI oog PvuII, endene behandlet som ovenfor beskrevet med Klenow-fragment og deretter defosforylert med kalvetarmsfosfatase. Et DNA-fragment med 2,4 kb lengde ble isolert fra en agarosedel. De to således erholdte DNA-stykker ble knyttet sammen med T4 DNA-ligase og E. coli HB101 transformert. Et således erholdt plasmid, hvori det forelå to EcoRI-gjenkjennelsessteder, fikk betegnelsen pAH53.
På grunn av den høye homologien til genene for EqIFN-al (pAH50) og EqIFN-a2 (pRH63, fig. 11) er det mulig ut fra ekspresjonsplasmidet pAH52/2 og lambda-subklonet pRH63 å fremstille et ekspresjonsplasmid for EqIFN-a2 (fig. 15)... Da det bare består to base-forskjeller frem til det felles Bglll-sted i området som koder for ferdig interferon, som likevel på grunn av den degenererte aminosyre-koden ikke kan bevirke noen aminosyreforskjell, kan den første del av genet for EqIFN-al i ekspresjonsplasmidet pAH52/2 også anvendes for ekspresjonen av EqIFN-a2. pRH63 ble kappet to ganger med Bglll og BamHI og det dannede DNA-fragment med 1,0 kb lengde, som inneholder sekvensen som koder for EqIFN-a2 fra den 64. aminosyre isolert fra en agarosegel. pAH52/2 ble likeledes kuttet med Bglll og BamHI, endene defosforylert med kalvetarm-fosfatase og det største av de to dannede DNA-fragmenter utvunnet fra en agarosedel. Dette DNA-stykke inneholder plasmidvektordelen, promotoren og den kodende sekvens for de første 63 aminosyrer av det ferdige interferon. De to beskrevne DNA-fragmenter ble sammenknyttet med ligase og E. coli HB101 transformert. Et således erholdt plasmid, som inneholder innskuddet i den riktige orientering (kappbar med BamHI og Bglll) ble kalt pAH55. Dette plasmid muliggjør ekspresjonen av ferdig EqIFN-a2 i E. coli.
For fremstilling av et ekspresjonsplasmid for EqIFN-/3 ble først heste-DNA-innskuddet fra plasmid pAH60 på 3'-ende forkortet og dette manipulert således i videre rekkefølge at et ferdig EqIFN-£-protein utløses fra en bakteriell promotor. Fremgangsmåten er vist skjematisk i figur 16. pAH60 ble kappet med HgiAI. Etter inaktivering av enzymet ble de 3'-overhengende DNA-ender behandlet med T4 DNA-polymerase (tilsetning av dATP, dGTP, dCTP, dTTP). På de stumpe ender ble Sphl-bindere ligert, og de erholdte DNA'er kappet med SphI og Hindlll. Et annet DNA-fragment med 1,85 kg lengde ble isolert fra en agarosegel og ligert med Hindlll dobbeltkappet plasmid parpATER103. Et klon erholdt etter transformasjon av E. coli HB101 med det ønskede plasmid ble kalt pAH61. Dette plasmid er et mellomtrinn for en videre konstruksjon av ekspresjonsplasmidet. pAH61 ble kappet to ganger med BamHI og Sali og et dannet 1,3 kb langt DNA-fragment bir isolert fra en agarosegel, renset og ligert med BamHI/Sali dobbelt-spaltet M13mp9 fag-DNA. Etter transformasjon av E. coli JM101 kunne det fra en rekombinant M13-fag (M13pAH61) utvinnes enkeltkjedet fag-DNA. Dette enkeltkjedede DNA ble blandet med kinatisert 15mer oligonukleotid 5'GTGAACTATGACTTG, oppvarmet til 95°C og langsomt avkjølt til romtemperatur. Oligonukleotidet binder nøyaktig den første basen av sekvensen til det ferdige /?-interferon. Tokjede-syntesen på den enkelt-kjedede templat 15mer-primeren ble utført etter tilsetning av dATP, dGTP, dCTP, dTTP og Klenow-fragment. DNA'ene ble ekstrahert og utfelt. Gjenværende enkeltkjedede DNA-avsnitt ble spaltet med Sl-nuklease. På de DNA'er som var blitt gjort stumpendede med denne behandling ble det ligert blandingen av 12mer og 8mer oligonukleotidene 5'-AGCTTAAAGATG og 5'CATCTTTA og de dannede DNA'er kappet med Hindlll og SphI. Et DNA-fragment med den ønskede lengde på 1,1 kb ble isolert fra en agarosegel og ligert med Hindlll/SphI dobbeltkappet plasmid parpATER103. Etter transformasjon av E. coli HB101 fikk man 54 kolonier. Fra 9 derav isolerte plasmid-DNA'er ble 1,3 kb langt EcoRI/Sa11-fragment isolert og sekvensbestemt med Sanger-metoden. Et derav funnet plasmid med den ønskede sekvens ble kalt pAH62. Dette plasmid muliggjør effektiv ekspresjon av ferdig EqIFN-/3-protein i E. coli. Et plasmid som har en delesjon av den første base (G) av det ferdige /3-IFN-gen ble kalt pAH62deltaGl. Dette plasmid muliggjør ekspresjonen av et på amino-enden forkortet /3-IFN ved translasjonsstart på neste følgende ATG (tilsvarende aminosyre 19 i det ferdige /3-IFN) , som overraskende har antivirus-aktivitet, om en tydelig mindre sammenlignet med det uforkortede protein.
For å påvise ekspresjon av interferon-aktivitet med
E. coli HB101 som inneholder plasmidene pAH52/2, pAH53, pAH55 eller pAH62, ble bakteriene etter inkubasjonen i et egnet kulturmedium brukket opp og supernatanten etter sterilisering undersøkt med hensyn til interferon-aktivitet i en måling som måler den cytopatiske virkning (CPE) av VSV eller EMCV. For dette anvendté man NBL-6-celler (ATCC CCL 57, hestehud-epider-misk celler) som var infisert med vesikulær-stomatitt-virus (VSV) og/eller A549 (ATCC CCL185, human lungekarcinom-celle-linje) som var blitt infisert med encefalomyokarditt-virus (EMC). Resultatene er oppført i eksempel 0.
Påvisningen av de uttrykte heste-interferoner ble foretatt med markering av proteinene i maksi-celler. Plasmid-kodede proteiner kunne markeres selektivt in vivo ved anvendelse av maksicelle-teknikken (37). E. coli stamme CSR603 (CGSC 5830) (F", thr-1, leuB6, proA2, phr-1, recAl, argE3, thi-1, uvrA6, ara-14, lacYl, galK2, xyl-5, mtl-1, gyrA98 (nalA98), rpsL31, tsx-33, ", supE44), har ingen mekanismer for reparasjon av skader på DNA'et oppstått ved UV-bestråling. Ved bestråling med en egnet UV-stråledose forstyrres det bakterielle kromosom, men noen av de vesentlige mindre plasmid-DNA'er som foreligger i flere kopier pr. celle forblir funksjonelle. Etter å ha drept alle ikke-skadede celler som formerer seg med antibiotikummet D-cykloserin og oppbruk av det endogene mRNA transkriberes i de gjenværende celler nå bare gener som er kodet på plasmidet og translateres og de dannede proteiner kan markeres radioaktivt ved inn-bygning av <35>S-metionin og påvises. E. coli CSR603 ble transformert ved vanlige metoder med ekspresjonsplasmidene og seleksjonert på ampicillin-holdige agarplater med hensyntil tansformerte bakterier. Prepareringen av maksicellene og markeringen av proteinene foregikk etter en forskrift fra A. Sancar (37). På figur 17 er det vist autoradiogrammet til den tørkede gel. Som molekylvektsstandard ble det anvendt en "c-metylert proteinblanding (Amersham). Som kontroller ble det anvendt plasmidet pER103, som bare inneholder promotoren uten interferon-gen og plasmidet pER21/l, som inneholder to kopier av det humane IFN-a2arg-gen. Proteinbåndene ved ca. 18 kd er interferonene som er uttrykt fra plasmidene.
For å påvise totalantallet av sekvenser i hestegenomet som har høy-homologi med interferongenene av klassen IFN-a, IFN-0 henholdsvis IFN-omega ble høymolekylært heste-DNA fullstendig spaltet med det tilsvarende restriksjonsenzym, og de kappede DNA'er adskilt etter størrelsen. Etter Southern-overføring til nitrocellulosefilter, denaturering og fiksering av DNA ble hvert filter hybridisert med ikke-translatert probe. Som probe anvendtes for EqIFN-a et 1,0 kb langt Hindlll/Sphl-fragment fra plasmidet pAH52, for EqIFN-/8 1,1 kb langt HindIII/SphI-fragment fra plasmid pAH62, som inneholdt den kodende sekvens for hele det ferdige interferon. Som probe for EqIFN-omega anvendtes den 2,1 kb lange EcoRI-innskudd fra plasmid pRH61. Filtrene ble så vasket under strigente betingelser slik at ingen krysshybridisering mellom disse 3 interferonsekvenser inntrådte: autoradiografien fant sted på DuPont Cronex røntgenfilm under anvendelse av Kodak Lanex-regulær forsterkerfolie 7 dager ved -80°C. Resultatet er vist på figur 18. Det viste overraskende at det hestegenomet foreligger minst 7 gener av IFN-/3-klassen, minst 2. gener av IFN-/3-klassen og minst 8 gener av IFN-omega-klassen.
For å fremstille ekspresjonsplasmider pRH 100 ble plasmidet pER 103 (Eva Dworkin-Rastl et al., Gene 21 (1983) 237-248, EP-A-0.115-613) linearisiert med restriksjonsendonukleasen Hindlll og de 5'terminale fosfatrester fjernet. Dette plasmid-DNA ble blandet med de fosforylerte oligonukleotider d(AGCTTAAAGATGAGCT) og d(CATCTTTA) og ligert. Ligasereaksjonen ble behandlet med restriksjonsendonuklease SacI og ligert ved tilsetning av T4-PNK. Oligonukleotidene ble fremstilt analogt med metoden som er beskrevet i EP-A-0.115-613.
Kompetente E. coli HB101 ble blandet med denne ligerings-blanding og inkubert.
Fra de oppståtte bakteriekolonier ble 12 vilkårlig utplukket og plasmidene isolert fra disse i mikromålestokk (Birnboim und Doly, Nucl. Acids Res. 7 (1979) 1513-1523). De resulterende DNA'er ble kappet med restriksjonsendonuklease SacI og DNA'ene adskilt på agarosegel (1 %, lx TBE-buffer). Vandringen av DNA som lineært molekyl med størrelse på ca. 4.400 bp bekreftet innføringen av et Sacl-gjenkjennelsessted i plasmidet. Et av disse plasmidene ble utplukket vilkårlig. Med DNA'et fra det tilhørende minipreparat ble E. coli HB101 gjentransformert. Fra de resulterende transformerte bakterier ble en koloni valgt ut og dyrket i større målestokk. Plasmidet som ble isolert fra dette ble kappet med restriksjonsendonukleasene EcoRI og BamHI, DNA'ene adskilt på en 1 %ig agarosedel, og det mindre fragmentet isolert fra gelen ved elektroeluering. Dette ca. 460 bp lange EcoRI-BamHI-DNA-fragment ble sekvensbestemt ifølge Sanger. (F. Sanger et al., Proe. NAtl. Acad. Sei. (1977) 5463-5467). Det således analyserte plasmid ble kalt pRH 100.
For å fremstille ekspresjonsplasmidet pAH4/2 ble plasmidet pRHIOO fullstendig kappet med restriksjonsendonukleasen BamHI og deretter ble de 5'terminale fosfatrester fjernet med kalvetarm-fosfatase (CIP).
Plasmidet pAH4 ble kappet med BamHI og et 0,6 kb langt DNA-fragment, som inneholdt hele den kodende sekvens for CalFN-alfal, isolert og renset.
Dette 0,6 kb DNA-fragment ble ligert med det med BamHI linearisierte pRHIOO Vektor-DNA; kompetente E. coli HB101 ble transformert og strøket på LB-agar.
Fra de dannede bakteriekolonier ble plasmider isolert i mikromålestokk og karakterisert ved restriksjonsanalyse med forskjellige enzymer. Et plasmid som inneholdt interferon-genet og tryptofanpromotoren i samme orientering, ble kalt pAH104 (figur 28). Dette plasmid er et mellomtrinn for fremstillingen av det endelige ekspresjonsplasmid for ferdig CalFN-alfal.
Den 0,6 kb lange BamHI-fragment fra plasmid pAH4 ble blandet med syntetisk oligonukleotid (5'TGCCACCTGCCCGAC), fremstilt analogt med EP-A-0.115-613. Det 15mere oligonukleotid inneholder den kodende sekvens for de N-terminale 5-aminosyrer til ferdig hunde-alfa-interferon. DNA-løsningen ble oppvarmet og deretter avkjølt, hvorved oligonukleotidene som var til stede i stort overskudd bindes til det komplementære sted av DNA-enkeltkjeden.
Deretter fant tokjedede syntesen sted ut fra bundet oligonukleotid-primer. De gjenværende enkeltkjedede DNA-avsnitt ble fjernet med Sl-nuklease. Det erholdte DNA ble spaltet og deretter oppdelt elektroforetisk. DNA-fragmenter med lengde på ca. 300 bp ble isolert og renset.
Plasmidet pAH104 ble spaltet med SacI og inkubert med Klenow-polymerase for å gjøre DNA-endene stumpe. -De erholdte DNA'er ble kappet parallet med Pstl, DNA'ene skilt elektroforetisk og fragmenter med en lengde på 4,3 kb isolert og renset.
De erholdte DNA'er ble ligert med det forutbeskrevne
0,3 kb lange DNA-fragment. Med denne ligasereaksjon ble E. coli HB101 transformert og plettert på ampicillin-holdig LB-agar.
De dannede bakteriekolonier ble overført på nye agarplater og overført i duplikat på nitrocellulosefiltre som var lagt på agarplatene. Etter inkubering ble bakteriene lyset etter en forskrift av Grunstein und Hofgness (M. Grunstein & D. Hogness, Proe. NAtl. Acad. Sei. USA (1975) 72., 3961 - og DNA'ene bundet til nitrocellulosene etter denaturering. Cellebruddstykkene ble fjernet. Filtrene ble så hybridisert med <32>P markert oligodeoksynukleotid d(TGCCACCTGCCCGAC).
Filtrene ble eksponert på Kodak X-omat S-røntgen-film under anvendelse av Kodak X-omat regulære forsterkerfolier ved -8 0°C. Fra bakteriekolonier som ga et positivt hybridiseringssignal i autoradiogrammet ble det isolert plasmid-DNA med en minipreparatmetode. Plasmidene ble fullstendig kappet med Hindlll og BamHI. Etter elektroforetisk adskillelse i en agarosegel ble 0,5 kb lange restriksjonsfragmenter isolert og tilført DNA-sekvens-analysen ifølge Sanger.
Et plasmid som hadde den ønskede struktur ble kalt pAH4/2. De muliggjorde ekspresjon av ferdig CalFN-alfa i E. coli.
For fremstilling av plasmidet pAH4/3 ble genet fra plasmidet pAH4/2 manipulert for den bakterielle ekspresjon av CalFN-alfal subklonet i en modifisert plasmidvektor parpATER103, som har et høyere kopitall pr. celle og øket plasmidstabilitet.
Den 0,5 kb lange Hindlll/BamHI-fragment fra pAH4/2 ble kappet med Hindlll og BamHI og ligert med gelrenset plasmidvektor parpATER103. Kompetente E. coli HB101 ble transformert med ligasereasjonen og plettert.
Fra de dannede bakteriekolonier ble 6 vilkårlig utplukket, og fra disse ble plasmidene isolert i mikromålestokk. Et plasmid som etter restriksjonsanalyse med forskjellige restriksjonsendonukleaser hadde den ønskede struktur ble kalt pAH4/3.
For å påvise ekspresjonen av interferon-aktiviteten gjennom E. coli HB101 som inneholdt plasmidet pAH4/2 eller pAH4/3, ble bakteriene brutt opp etter inkubering i et egnet dyrkningsmedium og submatanten etter steril filtrering under-søkt med hensyn til interferonaktivitet i en måling hvor den cytofatiske effekt (CPE) av VSV måles. Dertil anvendte man A-72-celler (ATCC CRL 1542, hunde-tumor), som var infisert med vesikulær stomatitt-virus (VSV). Resultatet er oppført i eksempel K.
For å påvise totaltallet av sekvenser i hundegenomet som har høy homologi med interferongenene til klassen IFN-alfa og IFN-omega, ble høymolekylære hunde-DNA'er fullstendig spaltet med de tilsvarende restriksjonsenzymer og kappede DNA'er adskilt etter størrelsen. Etter Southern TRansfer til nitrocellulosefiltre, denaturering og fiksering av DNA'et ble hvert filter hybridiset med ikketranslatert DNA-probe.
Som probe for CalFN-alfa anvendtes et 0,6 kb langt BamHI-fragment fra plasmid pAH4, som inneholdt hele den kodende sekvens for interferonet. Som probe for EqIFNq-omega anvendtes den 2,1 kb EcoRI-innskuddet til plasmidet pRH61.
De hybridiserte filtre ble så vasket under strigente betingelser. Autoradiografien fant sted på DuPont Cronex røntgenfilm under anvendelse av Kodak Lanex-regulær forsterkerfolie 7 dager ved -8 0°C.
Autoradiogrammet (figur 9) viser at i hundegenomet er ingen ytterligere sekvenser påvisbare foruten om de to gener som koder for identiske alfa-interferoner, hvilke har en lignende høy homologi-grad med CalFN-alfal, slik den fore-kommer ved andre arter innenfor en interferon-klasse. Med DNA'et for EqIFN-omega er minst et gen påviselig under mindre strigente betingelser som er forskjellig fra de beskrevne alfa-interferonene til hunden.
Transformasjonen av celler med bærerne kan oppnåes ved en rekke fremgangsmåter. For eksempel kan den skje med kalsium, hvorunder enten cellene vaskes i magnesium og DNA'ene settes til cellene oppslemmet i kalsium eller cellene utsettes for en kopresipitering av DNA og kalsiumfosfat. Ved etterfølgende genekspresjon overføres cellene til medier som selekterer for transformerte celler.
Etter ferdig transformasjon av verten, ekspresjon av genet og fermentering eller celledyrkning under betingelser ved hvilke proteinene i oppfinnelsen dannes, kan produktet ekstraheres med kjente kromatografiske .adskillelsesmetoder, slik at man får et material som inneholder proteinene med eller uten leder- og hale-sekvenser. Interferonene i oppfinnelsen kan fremstilles med en leder-sekvens på N-enden (Pre-IFN), som kan fjernes av noen vertsceller. Hvis ikke er en avspaltning av lederpolypeptidet (når dette foreligger) nødvendig for å oppnå ferdig IFN. Alternativt kan IFN-klonet modifiseres slik at det ferdige protein produseres direkte i mikroorganismen i stedet for Pre-IFN. I dette tilfelle kan forstadiesekvensen av gjærmodningsferomonet MF-alfa-1 anvendes for å oppnå en korrekt "modning" av det fusjonerte protein og utskillelsen av produktene i vekstmediet eller det peri-plasmiske rom. DNA-sekvensen for funksjonelt eller ferdig IFN kan være forbundet med MF-alfa-1 på det antatte katepsi-lignende delingssted (etter Lys-Arg) på stilling 256 fra begynnelseskodonet ATG (Kurjan, Herskowitz, Cell 30, 933-943
(1982) ) .
På grunn av sine biologiske virkningsspektre er de nye interferoner anvendelig for enhver behandlingsart hvor også de kjente interferoner anvendes. Disse omfatter for eksempel herpes, rhinovirus, equin-/kanin-abortvirus, forskjellige krefttyper og lignende. De nye interferoner kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre kjente interferoner eller biologiske aktive produkter, for eksempel IFN-alfa, IL-2, andre immun-modulatorer og lignende.
Interferoner fremstilt ifølge oppfinnelsen kan gis parenteralt i tilfeller hvor antitumor- eller antivirus-behandling er nødvendig og i tilfeller hvor immununder-trykkende egenskaper viser seg. Dosering og doserings-hyppighet kan være lignende sådanne som for tiden gjelder ved klinisk undersøkelser for IFN-a-materialer, for eksempel ca.
(1-10) x 10<6> enheter daglig og" ved preparater som er mer enn
1 % rene, inntil for eksempel 5 x 10<7> enheter daglig. For eksempel kan det for en hensiktsmessig doseringsform ved ett i det vesentlige homogent, bakterielt produsert IFN innenfor oppfinnelsen ved parenteral anvendelse oppløses 3 mg IFN-omega i 25 ml 5 %ig animalsk serum albumin, fortrinnsvis heste/hunde-serum albumin. Denne løsning føres så gjennom et bakteriologisk filter, og den filtrerte løsning fordeles aseptisk på 100 flasker, hvorav hver inneholder 6 x 10<6> enheter rent IFN egnet for parenteral applikasjon. Glassene opp-bevares før anvendelse fortrinnsvis kaldt (-2 0°C) . Substansene ifølge oppfinnelsen kan formuleres på kjent måte for å oppnå farmasøytisk anvendelige midler, hvorunder polypeptidet i oppfinnelsen blandes med en farmasøytisk akseptabel bærer-substans. Anvendelige bærestoffer og deres formulering er beskrevet av E.W. Martin i Remingtom's Pharmaceutical Sciences som der henvises til. De fremstilte interferoner blandes med en passende mengde av bærerstoffet for å frembringe egnede farmasøytiske midler, som er egnet for en effektiv anvendelse på mottageren (pasienten). Fortrinnsvis foretaes en parenteral applikasjon.
Ved hjelp av foreliggende oppfinnelse er det også for første gang mulig å oppnå de innledningsvis nevnte heste- og hunde-interferoner og gensekvensene som koder for dem.
Detaljer ved de fremstilte interferoner.
Heste-alfa-interferoner fremstilt ifølge oppfinnelsen foreligger i det vesentlig fri for andre proteiner av animalsk opprinnelse.
- i det vesentlige ren form,
- fri for opprinnelig glykosylering,
- inneholdende et leder-peptid,
- har en aminosyresekvens med formel I, II, VI eller VII eller inneholdende biologisk aktive varianter av disse sekvenser.
Heste-omega-interferoner fremstilt ifølge oppfinnelser foreligger i det vesentlig fri for andre proteiner av animalsk opprinnelse,
- i idet vesentlige ren form,
- fri for opprinnelig glykosylering,
- inneholder et lederpeptid,
- inneholder en aminosyresekvens med formel IV eller VIII eller biologiske aktive varianter av disse sekvenser.
Heste-beta-interferoner fremstilt ifølge oppfinnelsen foreligger idet vesentlige fri for andre proteiner, av animalsk opprinnelse.
- i i det vesentlige ren form,
- fri for opprinnelig glykosylering,
- inneholder et lederpeptid,
- inneholder en aminosyresekvens med formel III eller biologisk aktive varianter og disse sekvenser.
Hunde-alfa-interferoner fremstilt ifølge oppfinnelsen foreligger i det vesentlige fri for andre proteiner av animalsk opprinnelse.
- i idet vesentlige ren form,
- fri for opprinnelig glykosylering,
- inneholder et lederpeptid,
- inneholder en aminosyresekvens med formel V eller biologisk aktive varianter av disse sekvenser.
DNA-sekvenser:
- sekvenser som koder for EqIFN-alfa,
- sekvenser eller degenererte varianter av disse sekvenser som koder for EqIFN-alfa, som er satt inn i Eco RI henholdsvis Hindlll skjæringsstedet til plasmider pUC9 henholdsvis pUC8,
- plasmidet pAH50,
- plasmidet pRH63,
- plasmidet pRH82,
- plasmidet pRH83
- sekvenser som koder for EqIFN-alfa eller degenererte varianter av disse sekvenser, som under stringente betingelser, som viser en større homologi enn 85 % fortrinnsvis større enn 95 % hybridiserer med innskuddene av plasmidene pRH82, pRH83, pAH50 eller pRH63, - sekvenser som koder for EqIFN-alfa eller degenererte varianter av disse sekvenser, som sitter i en ekspresjonsvektor, som er replikerbar i E. Coli. - DNA-sekvensene med formel I, II, VI eller VII, eller degenererte varianter av disse sekvenser,
- sekvenser som koder for EqIFN-omega,
- sekvenser som koder for EqIFN-omega eller degenererte varianter av disse sekvenser, som er satt inn i Eco RI skjæringsstedet til plasmidet pUC9 eller pUC8,
- plasmidet pRH61,
- plasmidet pRH62,
- sekvenser som koder for EqIFN-omega eller degenererte varianter av disse sekvenser, som under stringente beting-eiser, som viser en homologi større enn 85 %, fortrinnsvis større enn 95 %, hybridiserer med innskuddene til plasmidet pRH61 eller pRH62, - sekvenser som koder for EqIFN-omega eller degenererte varianter av disse sekvenser, som sitter i en ekspresjonsvektor, som er replikerbar i E. Coli. - DNA-sekvensen med formel IV eller VIII eller degenererte varianter av denne sekvens,
- sekvenser som koder for EqIFN-beta,
- sekvenser som koder for EqIFN-beta eller degenerte varianter av disse sekvenser, som er innskuddet i Hindlll skjæringsstedet til plasmidet pAH60,
- plasmidet pAH60,
- sekvenser som koder for EqIFN-beta eller degenererte varianter av disse sekvenser, som under stringente betingelser, som viser en homologi større enn 85 %, fortrinnsvis større enn 95 %, hybridiserer med innskuddene til plasmidet pAH60, - sekvenser som koder for EqIFN-beta eller degenererte varianter av disse substanser, som sitter i en ekspresjonsvektor, som er replikerbar i E Coli. - DNA-sekvensene for formel III eller degenererte varianter av denne sekvens,
- sekvenser som koder for CalFN-alfa,
- sekvenser som koder for CalFN-alfa eller degenererte varianter av disse sekvenser, som er satt inn i Hindlll skjæringsstedet til plasmidet pAH2 eller pAH4,
- plasmidet pAH2,
- plasmidet pAH4,
- sekvenser som koder for CalFN-alfa eller degenererte varianter av disse sekvenser, som under stringente betingelser, som viser en homologi større enn 85 % fortrinnsvis større enn 95 %, hybridiserer med innskuddene av plasmidene pAH2 eller pAH4, - sekvenser som koder for CalFN-alfa eller degenererte varianter av disse sekvenser, som sitter i en ekspresjonsvektor, som er replikerbar i E. Coli, - DNA-sekvensene for formel V eller degenererte varianter av denne sekvens.
Transformerte E. Coli:
- hvilke inneholder de genetiske informasjoner som koder for EqIFN-alfa, -omega eller -beta eller for CalFN-alfa, i en replikerbar vektor.
Plasmidet:
- plasmid pAH51, med et 4,2 kb langt DNA-fragment av det med Hindll kappede plasmid pAH50 er utstyrt med Sphl-binder og er sirkulærisert etter skjæring med SphI, - plasmid pAH51/2, karakterisert ved at det i Hindlll/Bglll-skjæringsstedet til plasmidet pAH51 i stedet for det plasmid egne, lengre fragment inneholder et fragment, som erholdtes fra det 0,4 kb lange PvuII-fragment av plasmidet pAH50, etter at i nærvær av 15-mer oligonukelotid-primeren
<5> TGTGACCTGCCTCAC
var denaturert, forlenget med Klenow-fragment, legert til oligonukleotidkomplekset
og kappet med Hindlll og Bglll.
- Ekspresjonsplasmid parpATER103, hvori det i EcoRI/Hindlll-skjæringsstedet til plasmidet pAT153 er innsatt et 0,47 kb langt DNA-fragment av det med EcoRI delvis og med Hindlll fullstendig kappede plasmid parpER33. - Ekspresjonsplasmid pAH52/2, hvori det i
Hindlll/BamHI-skjæringsstedet til plasmidet parpATER103 i stedet for det plasmid-egne, kortere fragment er satt inn 1,0 kg lange HindIII/BamHI-fragment av plasmidet pAH51/2.
- Ekspresjonsplasmid pAH52, hvori det i
Hindlll/Sphl-skjæringsstedet til plasmidet parpATER103 i stedet for det plasmid-egne, kortere fragment er satt inn HindIII/SpH-fragmentet av plasmidet pAH51/2.
- Ekspresjonsplasmid pAH53, hvori det med Klenow-fragment behandlede og defosforylerte 2,4 kb lange
EcoRI/P vull-fragment fra pBR322 er knyttet sammen med et med KLenow-fragment behandlet, 1,1 kb langt EcoRI/Sphl-fragment av
plasmidet pAH52.
- Ekspresjonsplasmid pAH55, hvori plasmidet pAH52/2 i stedet for det plasmid-egne, kortere BglII/BamHI-fragment har det 1,0 kb lange BglII/BamHI-fragment av plasmidet pRH63. - Plasmid pAH61, hvori det i Hindlll/Sphl-skjæringsstedet av plasmidet parpATER103 i stedet for det plasmid-egne, korte fragment er satt inn et 1,85 kg langt DNA-fragment av det med HgiAI kappede plasmid pAH60, som er behandlet med T4-DNA polymerase, utstyrt med Sphl-bindere og til slutt ble kappet med Hindlll og SphI. - M13pAH61, hvori det 1,3 kb lange BamHI/Sall-fragment av plasmidet pAH61 er sammenknyttet med BamHI/Sall dobbelt-spaltet M13mp9-fag-DNA. - Ekspresjonsplasmid pAH62, karakterisert ved at et med hjelp av 15-meren
dobbelt-kjedet fremstilt, med Sl nukleasebehandlet, med oligonukleotidkomplekset
legert og med Hindlll og SphI kappet fragment av M13pAH61 er satt inn i Hindlll/Sphl-skjæringsstedet av plasmidet parpATER103 i stedet for det plasmid-egne, kortere fragment. - Ekspresjonsplasmid pRHIOO, hvori det i Hindui-sk j ær ingsstedet til plasmidet pER103 er satt inn oligonukleotidkomplekset - Plasmid pAH104, hvor det i BamHI-skjæringsstedet til plasmidet pRHIOO inneholder den kodende sekvens for CalFN-alfal. - Ekspresjonsplasmid pAH4/2, hvor Sacl-skjæringsstedet av plasmidet pAH104 som har fått stump ende har fått tilført sekvensen som koder for det ferdige CalFN-alfal. - Ekspresjonsplasmid pAH4/3, hvor det 0,5 kb lange HindIII/BamHI-fragment av plasmidet pAH4/2 er satt inn i HIndlll/BamHI-skjæringsstedet av plasmidet parpATER103.
Dessuten beskrives fremgangsmåter ved fremstilling av disse plasmider: - Fremgangsmåte for fremstilling av plasmidet pAH51, hvor plasmidet pAH50 kappes ved hjelp av Hindll, det 4,2 kb lange fragment forsynes med Sphl-bindere, så kappes med SphI og sirkulæriseres med DNA-ligase og det således erholdte plasmid transformeres for replikasjon i E. coli HB101 og dyrkes. - Fremgangsmåte for fremstilling av plasmidet pAH51/2, hvori plasmidet pAH50 kappes med PvuII, det 0,4 kb lange fragment denatureres i fravær av 15-mer oligonukleotidprimeren
primeren som er bundet til enkeltkjeden forlenges med Klenow-fragment, et eventuelt 3'-overheng fjernes, oligonukleotidkomplekset
legeres til, det erholdte DNA-fragment innsettes etter restriksjonsendonuklease-spaltning med Hindlll og Bglll i Hindlll/Bglll-skjæringsstedet av plasmidet pAH51 i- stedet for det plasmidegne, lengre fragment, og det således erholdte plasmid transformeres for replikasjon i E. coli HB101 og dyrkes. - Fremgangsmåte for fremstilling av plasmidet parpATER103, hvori det i det restriksjonsendo-nuklease-spaltning med EcoRI og Hindlll lineariserte plasmid pAT153 innsettes et 0,47 kb langt fragment av det med Hindlll fullstendig, med EcoRI delvis kappede plasmid parpER3 3 ved hjelp av ligasereaksjon, og det således fremstilte plasmid transformeres for replikasjon i E. coli HB101 og dyrkes. - Fremgangsmåte for fremstilling av ekspresjonsplasmidet pAH52/2, hvor det i Hindlll/BamHI-skjæringsstédet av plasmidet parpATER103 innsettes i stedet for det plasmid-egne, korte fragment, det 1,0 kb lange HindIII/BamHI-fragment av plasmidet pAH51/2 og det således erholdte plasmid transformeres for replikasjon i E. coli HB101 og dyrkes. - Fremgangsmåte for fremstilling av ekspresjonsplasmidet
pAH52, hvor det i Hindlll/Sphl-skjæringsstedet av plasmidet parpATER103 innsettes i stedet for det plasmid-egne, korte fragment, Hindlll/Sphl-fragmentet av plasmidet pAH51/2, og det således erholdte plasmid transformeres for replikasjon i E. coli HB101 og dyrkes. - Fremgangsmåte for fremstilling av ekspresjonsplasmidet pAH53, hvor det med Klenow-fragment behandlede og defosforylerte 2,4 kg lange EcoRI/PvulI-fragment fra pBR322 sammen-knyttes med et 1,1 kb langt EcoRI/Sphl-fragment av plasmidet pAH52 behandlet med Klenow-fragment, og det således erholdte plasmid transformeres for replikasjon i E. coli HB101 og dyrkes. - Fremgangsmåte for fremstilling av ekspresjonsplasmidet pAH55, hvori det i plasmidet pAH52/2 innsettes i stedet for det plasmid-egne, kortere Bglll/BamHI-fragment det 1,0 kb lange Bglll/BamHI-fragment av plasmidet pRH63, og det således erholdte plasmid transformeres for replikasjon i E. coli HB101 og dyrkes. - Fremgangsmåte for fremstilling av plasmidet pAH61, hvori det i Hindlll/Sphl-skjæringsstedet av plasmidet parpATERl03 insettes i stedet for det plasmid-egne, kortere fragment, et 1,85 kb langt DNA-fragment av plasmidet pAH60kappet med HgiAI, som er behandlet med T4-DNA-polymerase, utstyrt med Sphl-bindere og til slutt kappet med Hindlll og SphI, og det således erholdte plasmid transformeres for replikasjon i E. coli HB101 og dyrkes. - Fremgangsmåte for fremstilling av M13pAH61, hvori det 1,3 kb lange BamHI/Sall-fragmentet av plasmidet pAH61 sammen-knyttes med BamHI/Sali dobbeltspaltet Ml3mp9-fag-DNA og for replikasjon transformeres i E. coli JM101 og dyrkes. - Fremgangsmåte for fremstilling av ekspresjonsplasmidet pAH62, karakterisert ved at et ved hjelp av 15-meren
5' GTGAACTATGACTTG
dobbeltkjedet fremstillet, med Sl nuklease-behandlet, med oligonukleotidkomplekset
ligert og med Hindlll og SphI kappet fragment av M13pAH61 innsettes i Hindlll/Sphl-skjæringsstedet av plasmidet parpATER103 i stedet for det plasmid-egne, kortere fragment, og det således erholdte plasmid transformeres for replikasjon i E. coli HB101 og dyrkes. - Fremgangsmåte for fremstilling av plasmidet pAH4/2, hvori deti Sacl-skjæringsstedet til plasmidet pAH104 som er gjort jevnendet, innsettes sekvensen som koder for det ferdige CalFN-alfal, og det således erholdte plasmid transformeres for replikasjon i E. coli HB101 og dyrkes. - Fremgangsmåte for fremstilling av plasmidet pAH4/2, hvori det 0,6 kb lange BamHI-fragment av plasmidet pAH4 forbindes med oligonukleotidprimeren
tokjede-syntesen utføres ved hjelp av Klenow-fragmentet, de gjenværende enkeltkjeder fjernes med Sl-nuklease, DNA-ene kappes med Pstl og ligeres med det 4,3 kb lange fragment av plasmidet pAH104, som erholdes etter partiell Pstl-spaltning av det med Klenow-polymerase stumpendéde fremstilte Sacl-fragment, ved hjelp av DNA-ligase. - Fremgangsmåte for fremstilling av ekspresjonsplasmidet pRHIOO, hvori plasmidet pER103 linealiseres ved hjelp av Hindlll, legeres med oligonukleotidkomplekset
ligasereaksjonen spaltes med SacI og til slutt sirkulæriseres, og det således erholdte plasmid transformeres for replikasjon i E. coli HB101 og dyrkes. - Fremgangsmåte for fremstilling av ekspresjonsplasmidet pAH4/3, hvori i Hindlll/BamHI-skjæringsstedet av plasmidet parpATER103 innsettes det 0,5 kb lange HindIII/BamHI-fragment av plasmidet pAH4/2, og det således erholdte plasmid transformeres for replikasjon i E. coli HB101 og dyrkes.
Gjenstand for oppfinnelsen er likeledes som tidligere nevnt, fremgangsmåter for fremstilling av proteinene: - Fremgangsmåte for fremstilling av EqIFN-alfa, -beta,
-omega eller CalFN-alfa, hvori
a) E. coli transformeres med genetiske informasjoner som koder for EqIFN-alfa, -beta, -omega eller CalFN-alfa, fortrinnsvis med sekvensene som koder for proteinene innenfor oppfinnelsen ved plasmidene pAH50, pRH63, pRH82, pRH83, pRH61, pAH60, pRH62, pAH2 eller pAH4 eller sekvensene som hybridiserer med disse plasmider under stringente betingelser, som viser en større homologi enn 85 %, fortrinnsvis større enn 90 %, spesielt sekvenser med en av formlene I til VIII eller degenererte varianter av disse sekvenser, b) den kodende sekvens sitter i en ekspresjonsvektor, fortrinnsvis i en av ekspresjonsvektorene pAH52, pAH52/2,
pAH53, pAH55, pAH62, pAH4/2 eller pAH4/3 og denne informasjon for produksjon av EqIFN-alfa, -beta, -omega eller CalFN-alfa uttrykkes i vertsorganismen, og
c) interferonet EqIFN-alfa, -beta, -omega eller CalFN-alfa, fortrinnvsis et interferon ifølge en av formlene I til
VIII isoleres og renses.
Proteinene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan formuleres som midler som ved siden av'farmasøytisk inerte bærestoffer inneholder en virksom mengde av disse proteiner for terapeutisk behandling.
De følgende eksempler beskriver oppfinnelsen i detalj.
MATERIALER
Utgangsmaterialene ble delvis kjøpt, delvis stammet fra EMBL i Heidelberg, E. coli JM101, pUC8, pUC9, M13mp8 og M13mp9 stammet fra Bethesda Research Laboratories, E. coli stammende med suppressorfaktor sup F, for eksempel E. coli NM526, 538 og 53 9 og vektoren lambda-EMBL3 eller 3A stammet fra EMBL, men kan likevel delvis også skaffes fra Firma Stehelin/Basel (Sveits).
A) Isolering av heste- DNA
Frossent vev, for eksempel hestelever ble malt til fint pulver i flytende nitrogen og inkubert i 0,5M EDTA, 10 mM tris-HCl pH 8,0, 0,5 % SDS, 0,1 mg/ml proteinase K (20 ml/g vev) 3 timer ved 55°C. Den erholdte viskøse løsning ble ved en fenolekstraksjon og 3 ganger ekstraksjon med fenol/kloroform/ isoamylalkohol (25/24/1 vol) befridd for proteiner, dialysert mot 50 mM tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA, 20 mM NaCl og DNA-et utfelt med 2 volumdeler etanol. Etter fullstendig tørking i vakuum ble DNA-et brakt til løsning i TE-buffer
(10 mM tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA ved 4°C og sentrifugert med 1,273 g CsCl/ml løsning 62 timer ved 40 000 opm ved 20°C (Sorvall 50 Ti-rotor). CsCl-gradienten ble dryppet ut, DNA-holdige fraksjoner dialysert mot TE-buffer og DNA-et så felt med 2 volumdeler etanol, vasket med 70 %ig etanol, tørket og løst igjen i TE-buffer (4°C).
Det ferdige DNA-preparat var fritt for RNA og ler.ger enn 50 kb (ved elektroforese på en 0,45 %ig agarosegel).
B) Partiell endonuklease- spaltning og størrelses-fraksjonering av heste- DNA
To ganger 50 ug heste-DNA ble inkubert med 1,6 enheter Sau3A i 45 /il reaks jonsmedium (10 mM tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2 1 mM ditiotreitol ved 37°C. Etter 15, 25 og 40 minutter ble 150 /il alikvoter tatt ut og blandet med 15 mM EDTA og reaksjonsstoppet ved 10 minutters oppvarmning til 70°C. Etter tilsetning av 0,3 M Na-acetat pH 6,0 ble DNA-et utfelt med 2,5 volumdeler etanol. Etter gjenoppløsning i TE-buffer ble DNA-et adskilt etter størrelse på en 0,45 %ig agarosegel i TBE-buffer (10,8 g/l tris, 5,5 g/l borsyre, 0,93 g/l (Na2EDTA) ved ca. 1 volt/cm natten over elektroforetisk. Ved hjelp av størrelsesmarkører (lambda-DNA dobbeltspaltet med EcoRI og Hindlll og spaltet med Hindlll) ble gelstykket med DNA med lengde på 10-2 3 kb skåret ut, DNA'et elektroeluert fra gelen i en dialyseslange 3 timer ved 3 00 V (buffer 0,1 x TBE), renset på en elutip-D-søyle (Schleicher og Schull) ifølge anvendelsesforskriften og til slutt felt med etanol.
For å forhindre selvlegering av heste-DNA-fragmenter, hvilket på den ene side kan føre til kunstige hybrider av heste-DNA-sekvenser, på den annen side til for store og dermed ikke lenger i lambda-fager forpakkbare DNA-stykker, ble de størrelsesfraksjonerte heste-DNA-stykke defosforylert.
For dette ble DNA'et inkubert i 14 0 /xl reaksjonsmedium (50 mM tris-HCl pH 9,5, 1,0 mM MgCl2, 0,1 mM Zn-acetat, 1 mM spermidin) med 5 enheter kvegtarm-fosfatase i 30 minutter ved 37°C, ytterligere 5 enheter enzym tilsatt og inkubert 30 minutter. Etter tilsetning av EDTA til 25 mM sluttkonsentrasjon ble DNA'et en gang ekstrahert med fenol/kloroform/isoamylalkohol (25/24/1 vol), 2 ganger med kloroform/ isoamylalkohol (24/1 vol) og 3 ganger med dietyleter, fylt med etanol, tørket og oppløst i 0,1 x<s>TE-buffer.
C) Oppbygning av hesteqenom- DNA- bibliotek
De defosforylerte 10-2 3 kb heste-DNA-fragmenter ble klonet i en lambda-vektor, for eksempel lambda-EMBL3 eller -3A (3) med G-A-T-C klebende ender oppnådd ved fjerning av det invendige BamHI-fragment fra fag-DNA.
Vektoren ble dyrket en E. coli stamme med suppressorfaktor sup F, for eksempel E. coli NM526. 538 eller 539 (3) i LB-medium (20) med 5 mM MgSO,,, felt med polyetylenglykol og renset ved 2 gangers CsCl-densitetsgradient-sentrifugering (0,71 g CsCl/ml løsning, 40 timer 45.000 opm 20°C) . Etter dialyse mot TE-buffer ble fag-DNA'et befridd for protein ved 2 gangers ekstraksjon med fenol/kloroform/isoamylalkohol (25/24/1 vol) og 2 gangers ekstraksjon med kloroform/iso-amylalkohol (24/1 vol) og oppkonsentrert ved etanolfelling.
For å oppnå endefragmenter av EMBL3A ble 50 /ig fag-DNA fullstendig spaltet 2 timer ved 37°C i 450 /il reaksjonsmedium (10 mM tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, ImM ditiotreitol) med BamHI, reaksjonsstoppet med 15 mM EDTA 10 minutter ved 70°C og DNA'et felt med etanol.
For å unngå religering ble midtfragmentet etterkappet med EcoRI og det vekkfallende oligonukleotid fjernet ved hjelp av i sopropanolfel1ing.
Det BamHI-spaltede lambda-DNA ble for dette fullstendig spaltet 2 timer ved 37°C i 450 /il 10 mM tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaVl, 10 mM MgCl2 med EcoRI og reaksjonen stoppet ved tilsetning av 15 mM EDTA og 10 minutters oppvarmning til 70°C. Etter tilsetning av Na-acetat til en sluttkonsentrasjon på
0,3 M ble de 3 store DNA-fragmenter felt med 0,6 volumdeler isopropanol 15 minutter ved 0°C, vasket 2 ganger med 0,45 M Na-acetat/0,6 volumdeler isopropanol og 1 gang med 0,3 M Na-acetat/2,5 volumdeler etanol og oppløst i 15 /il
0,1 x TE-buffer. BamHI/EcoRI-bindrene forblir i løsning ved denne fremgangsmåten.
EMBL3A-fragmentene (8 /ig) ble slått sammen med ca. 5 /ig 10-23 kb heste-DNA og 10 enheter T4-DNA-ligase (NEN) og inkubert natten over ved 14°C og en dag ved 4°C i 50 /il legereringsmedium (66 mM tris-HCl pH 7,2, 0,1 M NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 5 mM ditiotreitol, 0,5 mM ATP). Den ligerte DNA-blanding ble pakket ved hjelp av et in vitro-lambda-forpakningssystem (27) i modne lambda-fagpartikler.
Dette systemets bestanddeler, dvs. ultralydekstrakt (SE), frosset-opptint-lysat (FTL), buffer Ml og A ble fremstilt ifølge (27) . 10 /il alikvoter av den ligerte DNA-blanding ble inkubert 2 minutter ved romtemperatur med 25 /il SE, som liksom FTL var opptint 30 minutter på is, blandet med 100 /il FTL og inkubert videre 60 minutter ved romtemperatur. Pakningsblandingen ble fortynnet med 150 /il lambda-fortynningsmiddel (100 mM tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgSOA 1 mM EDTA) og lagret ved 4°C.
En liten andel av de pakkede lambda-fager ble titrert på
E. coli stamme NM 528 SupF. Tilsammen ga fremgangsmåten ca.
1 x IO<6> uavhengige heste-DNA-rekombinanter. Resten av det forpakkede materiale ble formert ved plettering på NM528 i en tetthet på 3 0.000 plakkdannende enheter (pfu) pr. 13,5 cm LB/MgSOA-agar-plate.
D) Undersøkelse av heste- gen- biblioteket for interferongener
For å identifisere de rekombinante fager som inneholder hunde-interferongener, ble nukleotidhomologien som var påvist ved Southern-Blots (17) utnyttet med radioaktivt markerte human-IFN-alfa-gener.
For dette ble 10 /xg høymolekylært heste-DNA fullstendig spaltet med EcoRI henh. Hindlll, adskilt på 0,8 %ig agarosegel elektroforetisk og overført på nitrocellulosefiltre. Et 845 bp HindIII-fragment som stammet fra ekspresjonsplasmidet pER33 (14), som inneholdt hele det proteinkodende område for ferdig humaninterferon-alfa2ARG ble det fremstilt et P-32-markert DNA-stykke ved vanlig fremgangsmåte (25).
For søking etter ekine beta-interferongener ble det som ovenfor ut fra et 363 bp Pstl-BglII-fragment av et-cDNA-klon P1F12 (15) som koder for human /3-interferon fremstilt en radioaktivt markert DNA-probe. Denne probe koder for aminosyrene 48-166 i ferdig /3-interferon.
Nitrocellulosefiltrene ble forhybridisert 7 timer ved 65°C i 5xSSPE (0,95 M NaCl, 50 mM NaH2P04, 5 mM EDTA, pH 7,4), 5 x Denhardt-løsning (0,1 % Ficoll, 0,1 % polyvinylpyrrolidon,
0,1 % Rinderserumalbumin), 0,1 % SDS, 20 mg/ml laksesperm-DNA og deretter hybridisert med 13 x 10<6> cpm av den markerte probe i den samme løsning, men uten laksesperm-DNA. Etter inkubering ved 65°C natten over ble filtrene vasket fire ganger 1 til 1,5 timer i 3 x SSC (0,45 M NaCl, 45 mM Na-citrat), 0,1 % SDS ved 65°C og eksponert 7 dager på Kodak X-omat S-røntgenfilm med Kodak regulære forsterkerfolie (fig. 1). Forekomst av flere bånd beviser en familie av alfa-interferongener hos hester som tidligere påvist hos kveg, svin og mennesker.
For utplukking av interferongener i heste-DNA-biblioteket ble derfor de samme hybridiseringsbetingelser anvendt.
600.000 rekombinante lambda-fager ble på E. coli NM528 plettert i en tetthet på 30.000 pfu/13,5 cm plate. Fire gangers nitrocellulose-replikar ble fremstilt av hver plate etter fremgangsmåten til Benton og Davis (19).
Etter 2 timers oppvarmning ved 80°C ble filtrene vasket 1,5 timer ved 65°C i 1 M NaCl, 10 mM tris-HCl pH 8,0, 0,1 % SDS, fdrhybdridisert natten over som ovenfor beskrevet og 2 filterreplikar av hver plate hybridisert 24 timer med 1,5 x 10<6 >cpm radioaktive alfa-interferon-probe henh. 1 x 10<6> cpm-/3-interferon-probe pr. filter. Etter 3 gangers gjentatt undersøkelse erholdtes 8 heste-alfa-interferon-kloner og 6 heste-beta-interferon-kloner som ga positive hybridiserings-signaler.
E) Karakterisering av rekombinante fager
Fra 7 rekombinanter som hybridiserer med humant alfa-IFN og 3 med humant /3-IFN fremstiltes fag-DNA. DNA'ene ble spaltet med EcoRI, BamHI, Hindlll, Pstl, Bglll, Sali, Smal og adskilt elektroforetisk i en 0,8 %ig agarosegel. Størrelsen av de hybridiserende fragmenter ble bestemt etter Southern-metoden. Restriksjonsstedenes posisjon innenfor lambda-innskuddet ble bestemt ved hjelp av metoden til Rackwitz et al. (4) etter delvis restriksjonsspalting av lambda-DNA, markering av de høyre henh. venstre klebende ender av lambda-armene med syntetisk, P-32-markerte oligonukleotider og elektroforese i 0,45 %ige agarosegeler. Restriksjons-kartene av klonene Eq-alfal, Eq-alfal6, Eq-alfa20 og Eq-beta6 man derved fikk er vist i fig. 2, 3 og 30.
F) Subkloning av hesteinterferon- alfa- genet
Et restriksjonsfra<g>ment av klonet Eq-alfal, s.om hadde hybridisert med den humane alfa-interferon-markør, ble subklonet i multirestriksjonsenzyms-kloningsstedet til pBR322-derivatet pUC9. Innskuddet av et fremmed DNA-fragment fører til et avbrudd av lac Z-genet til /?-galaktosidasen og forandrer dermed fenotypen til den med plasmidet transformerte E. coli-stamme JM101 fra lac+ til lac-. På grunn av den ikke-fungerende /3-galaktosidase kan man med isopropyl-tiogalaktosid (IPTG) indusert JM101 ikke spalte det fargeløse substrat-analog 5-brom-4-klor-3-indolyl-)9-D-galaktosid (BCIG) til blått farvestoff. Bakteriekolonier med lakk-fenotype kan derfor erkjennes ved den hvite farge.
Et 3,2 kb HindIII-fragment fra klonet Eq-alfal ble eluert fra en agarosegel, renset på en elutip-D-søyle og ligert i et ca. 10 gangers molart overskudd med 40 ng defosforylert pUC9-vektor kappet med Smal, transformert i E. coli JM101 og helt ut med LB topp-agar med 0,2 mg/ml BCIG, 0,17 mg/ml IPTG og 0,1 mg/ml ampicillin. Hvite kolonier ble dyrket sterkt i 5 ml LB-medium 0,1 mg/ml ampicillin natten over ved 37°C og søkt etter det innsatte fragment med en plasmid-miniprepa-reringsmetode (25). Et således erholdt plasmid ble kalt pAH50.
G) DNA- sekvens fra heste- alfa- interferon- qener fra klon Eq-alfal
3,2 kb Hindlll-innskuddet fra pAH50 (3,2'kb Hindlll-fragment sublon fra Eq-alfal, fig. 3) ble sekvensbestemt etter dideoksymetoden til Sanger (23) etter Shotgun-fremgangsmåten.
60 txq pAH50 plasmid-DNA ble fullstendig spaltet med Hindlll, 3,2 kb fragmentet isolert fra en 1 %ig agarosegel og renset som ovenfor beskrevet. 15 /xg av dette fragmentet ble ligert i 100 /il ligeringsmedium med 14 enheter T4-DNA-ligase natten over ved 14°C og ytterligere 4 dager ved 4°C med seg selv. Dette ligerte DNA ble i et isbad oppdelt med ultralyd i 20 sekunders pulser, til sammen 100-140 sekunder, i små stykker. DNA-endene ble reparert 2 timer ved 14°C i 250 /il reaksjonsmedium (50 mM tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol, 0,5 mg/ml kvegserumalbumin 0,1 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP) med 15 enheter av det store fragment fra E. coli polymerase I (Klenow-fragment) . Etter konsentrering ved etanol-felling ble det således forbehandlede DNA adskilt på en 1 %ig agarosegel og DNA-fragmentene isolert i et størrelsesområde fra 0,35-1,0 kb og renset. Fragmentene ble ligert i ca. 10 gangers molart overskudd med den med Smal kappede og defosforylerte replikative form av bakteriofag M13mp8 (22) og E. coli JM101 transformert. Det enkeltkjedede DNA til de således erholdte rekombinante fager ble isolert og etter binding av et syntetisk oligonukleotid ble tokjedesyntesen utført i 4 enkelt-reaksjoner med Klenow-fragmentet fra E. coli DNA-polymerase I.
Sekvensene til innskuddet fra forskjellige rekombinante fager ble forenet ved hjelp av et av C. Pieler modifisert computerprogram fra Staden (24) til en totalsekvens som er vist i fig. 4.
H) Subkloninq av heste-/ 3- interferon- genet
For subkloningen av det i lambda-klon Eq-beta6 identi-fiserte heste-jø-interferongen gikk man frem som ved F) . Et 4,5 kb PvulI-fragment, som hybridiserte med den humane /3-interferonprobe ble isolert, renset og Smal restriksjons-stedet til plasmidet pUC9 ligert med glatte ender og E. coli JM101 transformert. En transformant med ønsket innskudd (pAH60) ble dyrket sterkt og karakterisert nøyaktig ved hjelp av Southern-analyse. Det erholdte restriksjonskart er vist i fig. 3. Det 2,5 kb HindIII-fragment ble sekvensbestemt analogt G) etter dideoksymetoden til Sanger. Totalsekvensen som er vist i fig. 8 av 2,5 kb fragmentet ble satt sammen av 52 enkeltsekvenser.
I) Subkloninq og sekvensbestemmelse av heste- interferon-genet av klon Eq- al6
Et 3,3 kb langt EcoRI restriksjonsfragment fra lambda-klonet Eq-al6, som hadde hybridisert med en human a-IFN-markør (se eksempel D, E) ble subklonet i EcoRI-stedet til plasmidet pUC8. Et erholdt plasmid ble kalt pRH63. Ved hjelp av et oppstilt restriksjonskart (fig. 9) ble definerte restriksjonsfragmenter innrettet i M13-fager subklonet og DNA-sekvensen bestemt etter Sanger-metoden (fig. 10).
J) Subkloninq og sekvensbesteitmtelse av heste- interferon-genet fra klon Eq- a2 0
Et 2,2 kb langt EcoRI-fragment av lambda-klonet Eq-a20, som hadde hybridisert svakt med den humane a-IFN-probe, ble subklonet i EcoRI-stedet til plasmidet pUC9. Et erholdt klon ble kalt pRH61 (fig. 9). Hele 2,2 kb EcoRI-innskuddet ble isolert og DNA-sekvensen bestemt etter Shotgun-metoden med Sanger-metoden (eksempel G) (fig. 12).
K) Fremstilling av ekspresjonsplasmidet parpATER103
Ut fra ekspresjonsplasmidet parpER3 3 ble "par"-sekvensen og tryptofan-promotor-operator-sekvensen som var ansvarlig for den økede plasmid-stabiliteten i E. coli samt det kunstige ribosomale bindingssted innsatt i plasmid-vektoren pAT153 (Amersham). pAT153 er et forkortet derivat av plasmidet pBR3 22 som mangler et avsnitt som er nødvendig for mobili-seringen av DNA (36) .
Fremgangsmåten ved fremstillingen av plasmid parpATER103 er vist i fig. 13. Plasmidet parpER33 ble fullstendig kappet med Hindlll og delvis med EcoRI, det dannede 0,47 kb lange DNA-fragment isolert fra en agarosegel og renset og ligert med pAT153 skåret to ganger med EcoRI og Hindlll. Et plasmid erholdt etter transformasjon av E. coli HB101 med den ønskede struktur, som man bestemte ved spaltning med forskjellig restriksjonsenzymer, ble kalt parpATER103.
L) Direkte ekspresjon av fullstendig EqIFN- g- 1 i E. coli
Fremstillingen av ekspresjonsplasmidene pAH52/2 og pAH53 samt deres fortrinn er vist i fig. 14. 20 /xg av plasmidet pAH50 (eksempel F) ble spaltet med 3 0 enheter HindiI (Boehringer Mannheim) og det 4,2 kb lange DNA-fragment, som inneholdt hele EqIFN-al genet ble isolert og renset fra en agarosegel med DE81-papir (Whatman). For dette skjæres et snitt etter adskillelse av DNA-fragmentene i agarosegelen foran og bak DNA-båndene som skal isoleres hvori DE81-papir-stripen plasseres. Elektroforesen videreføres, inntil det ønskede DNA-fragment er fullstendig bundet på det fremre DE81-filteret. Det bakre De81-filteret forhindrer en forurensning av større DNA-fragmenter. DE81-papiret med det bundne DNA-fragment vaskes to ganger 5 minutter i 4 00 /il lavsalt-buffer (0,2 M NaCl, 25 mM tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) og deretter elueres DNA'et to ganger 10 minutter med 200 /il høysalt-buffer (1 M NaCl, 25 mM tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) fra DE81-papiret og utfelles med 1 ml etanol. Endene til HindII-fragmentet ble utstyrt med Sphl-bindere. For dette ble 0,2 /xg Sphl-bindere (Worthington) inkubert med 2 enheter polynukleotid-kinase i 10 /il reaksjonsmedium i 45 minutter ved 37°C (70 mM tris-HCl pH 7,6, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 5 mM ditiotreit). De kinase-behandlede Sphl-bindere og HindII-fragmentet ble ligert med 8 enheter T4-DNA-ligase i 2 0 timer ved 4°C. Så ble enzymet inaktivert ved 70°C og DNA'et spaltet med 30 enheter SphI i et totalvolum på 100 /il, ekstrahert med fenol og kloroform og utfelt med etanol. DNA'et ble sirkularisert med ligase og E. coli HB101 transformert. Et plasmid med den ønskede struktur fikk betegnelsen pAH51. Det inneholdt EqIFN-al-genet med et forkortet 3'-ikke-translatert område og et ytterligere Sphl-skjæringssted. For i sluttkonstruksjonen å forbinde DNA-sekvensen for det fullstendige heste-a-interferon i den riktige avstand med promotorsekvensene, gikk man ut fra et 0,4 kb langt DNA-f ragment, som ble isolert fra 20 /ig plasmid pAH50 kappet med PvuII. 1 nmol syntetisk 15mer oligonukleotid med sekvensen 5'-TGTGACCTGCCTCAC ble behandlet med poly-nukleatid-kinase. Det inneholdt sekvensen som koder for de første 5 aminosyrene i det fullstendig EqIFN-al fra klon pAH50. 15meren ble blandet med ca. 7 pmol av 0,4 kb PvuII-fragmentet og kokt 5 minutter i et total-volum på 34 jul for å denaturere DNA-dobbeltkjeden. Etter avkjøling ble. oligo-nukloetid-primeren som er bundet til enkeltkjeden forlenget i 7 0 /il reaks jonsmedium (50 mM tris-HCl pH 7,2, 10 mM MgSOA,
0,1 mM ditiotreit, 50 /ig/ml Rinder-serum-albumin, 1 mM dATP, dGPT, dCTP, dTTP) med 3 0 enheter Klenow-fragment 3 timer ved 37°C. For sikkert å fjerne et eventuelt gjenværende 3'-overheng, ble DNA'et så inkubert med 16 enheter T4 DNA-polymerase 1 20 minutter ved 37°C i 120 / il reaks jonsmedium (33 mM tris-acetat pH 7,9, 66 mM KAc, 10 mM (Mg(Ac)2, 0,5 mM ditiotreit, 0,1 mg/ml kvegserumalbumin, 1 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Det dannede DNA med rette ender ble ekstrahert med fenol og kloroform og utfelt med 0,45 M Na-acetat og 0,6 volumdeler 2-propanol i 15 minutter ved 0°C. Til dette DNA-stykke ligerte man en blanding av to kinasebehandlede oligonukleotider som var komplementære med hverandre: 12mer 5'-AGCTTAAAGATG, 8mer 5'-CATCTTTA, som gir et Hindlll-skjæringssted og translasjonsstart-kodonet ATG. Et mol av hver av disse to oligonukleotider ble ligert i 2 0 jul med 14 enheter ligase i 40 timer ved 4°C til DNA-fragmentet. Etter inaktivering av enzymet ved 70°C ble det erholdte DNA kappet i 100 fil med 80 enheter Hindlll og 20 enheter Bglll og DNA-fragmentene med ca. 190 bp lengde isolert og renset fra en 2 %ig agarosedel med DE81-papir. Det erholdte DNA-fragment ble ligert med ca. 50 ng pAH51-vektor kappet dobbelt med Hindlll og Bglll og E. coli HB101 ble transformert.
Fra 65 erholdte kolonier isolerte man fra 4 plasmider som har det ønskede restriksjonsmønster et Hindlll/BamHI DNA-fragment og sekvensbestemt med Sanger-metoden, hvorunder to kloner inneholdt nøyaktig den ønskede sekvens. Et slikt plasmid kalles pAH51/2. Dette inneholder sekvensen for ferdig EqIFN-al med forutstilt translasjonsstart-kodon ATG og HindiII-skjæringssted.
Fremstilling av eks<p>resjonsplasmider pAH52 og pAH52/ 2
20 fig plamis pAH51/2 ble kappet to ganger med SphI og Hindlll, det dannede 1,0 kb lange DNA-fragment isolert fra en agarosegel og ligert med plasmid parpATER103 (eksempel K) dobbelt-kappet med 40 ng Hindlll og SphI. Et plasmid erholdt etter transformasjon av E. coli HB101 med den ønskede struktur ble kalt pAH52. De inneholder alle nødvendige informasjoner for en induserbar ekspresjon av ferdig EqIFN-al. På analog måte fremstilte man plasmid pAH52/2 ut fra parpATER103 dobbelt-kappet med Hindlll og BamHI. Dette ekspresjonsplasmid er ca. 0,2 kb større enn pAH52 og har i tillegg et
enkelt BamHI-skjæringssted.
Fremstilling av plasmidet pAH53
Et vesentlig redusert ekspresjonsplasmid for fremstilling av ferdig EqIFN-al i E. coli hvori tryptofanpromotoren, interferon-genet, ampicillin-resistensgenet og replikasjonsopprinnelsen er orientert i en retning, ble fremstilt fra plasmidene pAH52 og pBR322. 10 /ig pAH52 ble kappet med SphI og EcoRI, enzymene inaktivert ved 70°C og DNA-endene gjort stumpe med Klenow-fragment etter tilsetning av 0,15 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP 1 time ved 22°C.
DNA-fragmentene ble fraksjonert etter størrelsen på en agarosegel og et 1,1 kb langt stykke isolert som inneholdt promotoren og interferongenet. 10 /ig pBR322 plasmid ble dobbeltspaltet med EcoRI og PvuII, endene behandlet med Klenow-fragment som ovenfor beskrevet og deretter defosforylert med kalvetarmfosfatase. Et DNA-fragment med 2,4 kb lengde ble isolert fra en agarosegel. Dei to derved erholdte DNA-stykker ble sammenknyttet med T4 DNA-ligase og E. coli HB101 transformert. Et således erholdt plasmid hvori det er frembrakt to EcoRI-gjenkjennelsessteder, fikk betegnelsen pAH53.
M) Fremstilling av et ekspresjonsplasmid for EqIFN- a2
( PAH55)
På grunn av den høye homologien til genene for EqIFN-al (pAH50) og EqlIFN-a2 (pRH63, fig. 11) er det mulig ut fra ekspresjonsplasmidet pAH52/2 (eksempel L) og lambda-subklonet pRH63 å fremstille et ekspresjonsplasmid for EqIFN-a2 (fig. 15). 20 /ig pRH63 plasmid ble kappet to ganger med Bglll og BamHI og det dannede DNA-fragment med 1,0 kb lengde, som inneholder den kodende sekvens for EqIFN-a2 fra den 64. aminosyre isolert fra en agarosegel. 10 /ig av plasmidet pAH52/2 ble likeledes kappet med Bglll og BamHI, endene defosforylert med kalvetarmfosfatase og det større av de to dannede DNA-fragmenter utvunnet fra en agarosegel. Dette DNA-stykke inneholder plasmid-vektorandel, promotoren og sekvensen som koder for de første 63 aminosyrer av det ferdige interferon. De to beskrevne DNA-fragmenter ble sammenknyttet med ligase og E. coli HB101 transformert. Et således erholdt plasmid, som inneholder innskuddet i den riktige orientering
(skjærbar med BamHI og Bglll) ble kalt pAH55. Dette plasmid muliggjør ekspresjonen av fullstendig EqIFN-a2 i E. coli.
N) Fremstilling av et ekspresjonsplasmid for fullstendig EqIFN- fl ( PAH62)
Fremgangsmåten er vist skjematisk i fig. 16. 30 /tg pAH60 plasmid ble kappet med 30 enheter HgiAI i 150 /il volumer. Etter inaktivering av enzymer ved 70°C ble de 3'overhengende DNA-ender behandlet med 7 enheter T4 DNA-polymerase (tilsetning av 1 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 30 minutter ved 37°C. På de stumpe ender ble Sphl-bindere ligert (se eksempel L) og det erholdte DNA kappet med SphI og Hindlll. Et annet DNA-fragment med 1,85 kb lengde ble isolert fra en agarosegel og ligert med 50 ng plasmid parpATER103 (eksempel K) kappet dobbelt med Hindlll og SphI. En klon erholdt etter transformasjon av E. coli HB101 med det ønskede plasmid- ble kalt pAH61. Dette plasmid er et mellomtrinn for den videre konstruksjon av ekspresjonsplasmidet. 20 /tg plasmid pAH61 ble kappet to ganger med BamHI og Sali og et dannet 1,3 kb langt DNA-fragment isolert fra en agarosegel, renset og ligert med M13mp9 fag-DNA dobbelt-spaltet med BamHI/Sall. Etter transformasjon av E. coli JM101 kunne et enkeltkjedet fag-DNA utvinnes fra en rekombinant M13-fag (M13pAH61). 3 pmol av dette enkelt-kjedede DNA ble blandet med 38 pmol kinase-behandlet 15mer oligonukleotid 5'GTGAACTATGACTTG i 50 /il 20 mM tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, oppvarmet til 95°C og langsomt avkjølt til romtemperatur. Oligonukleotidet avbindet nøyaktig den første basen i sekvensen til det ferdige /?-interferon. Tokjede-syntesen på enkeltkjedemalen ut fra 15mer-primeren ble utført i 100 /ti volumer etter tilsetning av 3 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP og 15 enheter Klenow-fragment 1 time ved 22°C . Etter tilsetning av 20 mM EDTA ble DNA'et ekstrahert med fenol og kloroform og utfelt med etanol.
Igjenværende enkeltkjedede DNA-avsnitt ble skåret av med 150 enheter Sl-nuklease (Sigma) i 400 ul reaksjonsblanding i 2 timer ved 14°C (4 mM Zn(Ac)2, 30 mM NaAC, ,250 mM NaCl, 5 % glycerl, pH 4,6). Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av EDTA og ekstraksjon med fenol og kloroform, og DNA'et utfelt med etanol. Til DNA'et som var gjort jevnendet ved denne behandlingen ligertes liksom i eksempel H blandingen av de 12mer og 8mer oligonukleotider 5'-AGCTTAAAGATG og 5'-CATCTTTA og det dannede DNA ble kappet med Hindlll og SphI. Et DNA-fragment med den ønskede lengde på 1,1 kb ble isolert fra en agarosegel og ligert med plasmid parpATERl03 dobbeltkappet med HIndlll/Sphl. Etter transformasjon av E. coli HB101 erholdtes 54 kolonier. Fra 9 derav isolerte plasmid-DNA'er isolerte man et 1,3 kb langt EcoRI/Sall fragment og sekvens-bestemte med Sanger-metoden. Et således bestemt plasmid med den ønskede sekvens ble kalt pAH62. Dette plasmid muliggjorde effektiv ekspresjon av ferdig EqIFN-/3 protein i E. coli. Et plasmid som har en delesjon i første base (G) av ferdig /3-IFN-gen, ble kalt pAH62deltaGl. Dette plasmid tillater ekspresjonen av et /3-IFN forkortet på amino-enden ved translasjonsstart på neste følgende ATG (tilsvarer aminosyre 19 i ferdig /3-IFN) , som overraskende viser antivirus-aktivitet, selvom tydelig mindre sammenlignet med det uforkortede protein (se eksempel 0).
0) Ekspresjon av interferonaktiviteten med E. coli HB101
som inneholder plasmidet <p>AH52. pAH52/ 2, <p>AH53, pAH55 eller PAH62
100 ml bakteriekultur inkuberes ved 37°C under kraftig rysting inntil nedenfor angitte optiske densitet ved 600 nm i følgende tryptofanfri medium (angitt pr. liter medium): 10 g (NHA)2P0<,, 3,5 g KH2P04 pH 7,3 med NaOH, 0,5 g NaCl, 21 g casaminosyre (syrehydrolysert), 11 g glukose, 1 mM MgSOA,
0,1 mM CaCl2, 1 mg tiamin-HCl, 2 0 mg L-cystein, 2 0 mg 3-/3-indolakrylsyre (IAA, induktor for tryptofan-operon) , om ønsket med 50-100 mg ampicillin. Så klumpes bakteriene ved sentrifugering i 5 minutter ved 4000 opm, oppslemmes med 1/10
av kulturvolumet iskald 50 mM tris-HCl pH 8,0, 3 0 mM NaCl og brekkes opp under iskjøling to ganger i 30 sekunder ved hjelp av ultralydsonde (20 kHz, 100 watt). Celleavfallet fjernes 10 minutter ved 10.000 omp (4°C) og supernatantene undersøkes etter steril-filtrering med hensyn til interferon-aktivitet i en bestemmelse som måler den cytopatiske effekt (CPE) av vesikulær stomatitt-virus (VSV) eller encefalomyokarditt-virus
(EMCV).
Prøvesystem: NBL-6 celler (ATCC CCL 57, hestehud-epiderm-celler)/VSV
A549 (ATCC CCL 185, human lungekarcinom-celle linje)/EMCV
Konsentrasjonen av A 549-celler ble normert med human interferon-standard til internasjonale enheter.
P) Påvisning av uttrykte heste- interferoner ved markering av proteinene i maksiceller
Plasmid-kodede proteiner kan markeres selektivt in vivo ved anvendelse av maksicelle-teknikken (37). E. coli CSR603 ble transformert med vanlige fremgangsmåter med ekspresjonsplasmider og seleksjonert for transformerte bakterier på ampicillin-holdige agarplater. Prepareringen av maksiceller og markeringen av proteinene foregikk etter en forskrift fra A. Sancar (37). Cellene ble dyrket i 15 ml medium (se eksempel O) i puten indolakrylsyre ved 37°C frem til en OD600lim=0,5 og 10 ml av denne kultur bestrålt i en petriskål 5 sekunder fra 50 cm avstand med en UV-germicid-lampe (15 watt) under dreining og inkubert videre 1 time ved 3 7°C. Kulturene ble blandet med 100 Atg/1 D-cykloserin og inkubert 14 timer ved 37°C og bakteriene så høstet ved sentrifugering. Cellene ble vasket to ganger med 5 ml Hershey saltløsning, oppslemmet i 5 ml Hershey Medium med 20 jug/ml indokrylsyre og inkubert 2 timer ved 37°C. Hver kultur ble tilsatt 5 ^Ci/ml <35>S-metionin (1000 Ci/mMol) og rystet i 1 time ved 37°C. Cellene ble høstet i SDS- og 2-merkaptoetanol-holdig elektroforese-probe, lyset og proteinene adskilt på en 15 %ig polyakrylamid-gel.
På fig. 17 vises autoradiogrammet av den tørkede gel
etter 2 dagers eksponering på DuPont Cronex rø.ntgen-film under anvendelse av et Kodak Lanex-regulær forsterkerfolie ved -80°C. Som molekylvekts-standard anvendte man en "C-metylert proteinblanding (Amersham). Som kontroller anvendtes plasmidet
pER103, som bare inneholdt promotoren uten interferongen og plasmidet pER21/l, som inneholdt to kopier av det humane IFN-a2arg-genet. Som markert proteinbåndene ved ca. 18 kd er interferonene som uttrykkes av plasmidene.
Q) Påvisning av sekvenser som hybridiserer med• EqIFN- a.
EglFN- fl og EqIFN- omega i genomisk heste- DNA
For å påvise totalantallet av sekvenser i hestegenomet, som har høy homologi med interferongenene fra klassene IFN-a, IFN-/3 henh. IFN-omega gikk man frem som følger. 30 jxg høy-molekylært heste-DNA (eksempel A) ble fullstendig spaltet med 100 enheter av det tilsvarende restriksjonsenzym i 3 00 ul reaksjonsvolum og 10 /tg av dette kappede DNA adskilt etter størrelsen pr. spr på en 0,8 %ig agarosegel.
Etter Southern-Transfer til nitrocellulosefilter, denaturering og fiksering av DNA ble hvert filter hybridisert med ca. 6xl0<6> cpm ikke-translatert probe (17 timer ved 65°C, 5x SSPE, 5x Denhardt-løsning, 0,1 % SDS, 20 /xg/ml denaturert laksesperm-DNA). Som probe for EqIFN-a anvendtes et 1,0 kb langt HindIII/SphI-fragment fra plasmid pAH52, for EqIFN-/3 i et 1,1 kb langt Hindlll/Sphl-fragment fra plasmid pAH62, som inneholdt sekvensen som koder for hele det ferdige interferon. Som probe for EqIFN-omega anvendtes 2,1 kb EcoRI-innskuddet fra plasmid pRH61. Filtrene ble så vasket under stringente betingelser slik at ingen krysshybridisering inntraff mellom disse 3 interferonsekvenser: 4 ganger 45 minutter ved 65°C med 0,3x SSC (45 mM NaCl, 4,5 mM Na3Ci-trat) , 0,1 % SDS. Autoradiografi ble utført på DuPont Cronex røntgen-film under anvendelse av Kodak Lanex-regulær forsterkerfolie i 7 dager ved -80°C.
Bemerkning til fig. 18:
Spaltebetegnelse: M = størrelsesmarkør (Lambda x EcoRI/Hindlll)
E=EcoRI, H=HindIII, Ba=BamHI, P=Pstl, B=BglII
1) Isolering av hunde- DNA
Frossent vev, for eksempel hundelever, ble finmalt i flytende nitrogen til pulver og inkubert i 0,5 M EDTA, 10 mM tris-HCl pH 8,0, 0,5 % SDS, 0,1 mg/ml proteinase K (20 ml/g vev) 3 timer ved 55°C. Den erholdte viskøse løsning ble gjennom en fenolekstraksjon og 3 gangers ekstraksjon med fenol/kloroform/isoamylalkohol (25/24/1 vol) befridd for protein, dialysert mot 50 mM tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA, 10 mM NaCl og DNA'et utfelt med 2 volumdeler etanol. Etter fullstendig tørking i vakuum ble DNA'et brakt til løsning i TE-buffer (10 mM tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) ved 4°C og sentrifugert med 1,273 g CsCl/ml løsning 62 timer med 40.000 opm ved 20°C (Sorvall 50Ti-rotor). CsCl-gradienten ble dryppet ut, de DNA-holdige fraksjoner dialysert mot TE-buffer og DNA'et så utfelt med 2 volumdeler etanol, vasket med 70 %ig etanol, tørket og igjen oppløst i TE-buffer (4°C) .
Det ferdige DNA-preparat var fritt for RNA og lenger enn 50 kb (bestemt ved elektroforese fra en 0,45 %ig agarosegel).
2) Partiell endonuklease- nedbrytning og størrelsesfrak-sjonerinq av hunde- DNA
To ganger 50 fig hunde-DNA ble inkubert med 2,0 enheter Sau3A i 450 fil reaksjonsmedium (10 mM tris-Hcl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol) ved 37°C. Etter 40 og 60 minutter ble 225 jul alikvoter tatt ut og blandet med 15 mM EDTA og reaksjonen stoppet ved 10 minutters oppvarmning til 70°C. Etter tilsetning av 0,3 M Na-acetat pH 6,0 ble DNA'et utfelt med 2,5 volumdeler etanol. Etter gjenoppløsning i TE-buffer ble DNA'et skilt etter størrelse på en 0,45 %ig agarosegel i TBE-buffer (210,8 g/l tris, 5,5 g/l borsyre, 0,93 g/l (Na2EDTA) ved ca. 1 volt/cm elektroforetisk natten over. Ved hjelp av størrelsesmarkører (lambda-DNA dobbelt nedbrutt med EcoRI og Hindlll og nedbrutt med Hindlll) ble gelstykket med DNA av en lengde på 10-23 kb skåret ut, DNA'et elektroeluert (buffer 0,1 x TBE) fra gelen i en dialyse-slange 3 timer ved 300 volt, renset på en elutip-D-søyle (Schleicher og Schiill) ifølge anvendelsesforskriften og deretter felt med etanol.
For å forhindre religering av hunde-DNA-fragmenter, hvilket på den ene side kan føre til kunstige hybrider av hunde-DNA-sekvenser, og på den annen side til for store og dermed ikke lenger pakkbare DNA-stykker i lmbda-faget, ble de størrelsesfraksjonerte hunde-DNA-stykker defosforylert.
For dette ble DNA'et inkubert i 140 fil reaks jonsmedium
(50 mM tris-HCl pH 9,5, 1 mM MgCl2, 0,1 mM Zn-acetat, 1 mM spermidin) med 5 enheter bovin-tarmfosfatase i 30 minutter ved 37°C, videre ble 5 enheter enzym tilsatt og inkubert 30 minutter. Etter tilsetning av EDTA til 25 mM sluttkonsentrasjon ble DNA'et en gang ekstrahert med fenol/kloroform/ isoamylalkohol (25/24/1 vol), 2 ganger med kloroform/- isoamylalkohol (24/1 vol) og 3 ganger med dietyleter, felt med etanol, tørket og oppløst i 0,1 x TE-buffer.
3) Oppbygning av hundegenom- DNA- bibliotek
De defosforylerte 10-23 kb hunde-DNA-fragmenter ble klonet i en lambda-vektor, for eksempel lambda-EMBL3 eller -3A (3) med G-A-T-C kohesive ender, fremstilt ved fjerning av det interne BamHI-fragment av fag-DNA.
Vektoren ble dyrket i en E. coli-stamme med suppressor-faktoren sup F, for eksempel E. coli NM526. 538 eller 539 (3). I LB-medium (20) med 5 mM MgS04, utfelt med polyetylenglykol og renset ved 2 gangers CsCl-densitetsgradient-sentrifugering (0,71 g CsCl/ml løsning, 40 timer 45.000 opm, 20°C)-. Etter dialyse mot TE-buffer ble fag-DNA'et befridd for protein ved 2 gangers ekstraksjon med fenol/kloroform/isoamylalkohol (25/24/1 vol) og 2 gangers ekstraksjon med kloroform/iso-amylalkohol (24/1 vol) og oppkonsentrert ved etanolfelling.
For å oppnå slutt-fragmentene av EMBL3A ble 50 fig fag-DNA fullstendig nedbrutt med BamHI 2 timer ved 37°C i 450 fil reaks jonsmedium (10 mM tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol), reaksjonen stoppet med 15 mM EDTA i 10 minutter ved 7 0°C og DNA'et utfelt med etanol.
For å unngå religeringen ble midtfragmentet etterkappet med EcoRI og det vekkfallende oligonukleotid fjernet ved hjelp av isopropanolfelling.
Det BamHI-nedbrutte lambda-DNA ble i denne hensikt fullstendig nedbygget 2 timer ved 37°C i 450 fil 10 mM tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 med EcoRI og reaksjonen stopopet ved tilsetning av 15 mM EDTA og 10 minutters oppvarmning til 70°C. Etter tilsetning av Na-acetat til en sluttkonsentrasjon på 0,3 M ble de 3 store DNA-fragmenter felt med 0,6 volumdeler isopropanol 15 minutter ved 0°C, 2 ganger med 0,4 5 M Na-acetat/0,6 volumdeler isopropanol og vasket 1 gang med
0,3 M Na-acetat/2,5 volumdeler etanol og oppløst i 15 /ul 0,1 x TE-buffer. BamHI/EcoRI-binderen forblir i løsning ved denne fremgangsmåten.
EMBL3A-fragmentene (8 /ig) ble forenet med ca. 5 /ug
10-23 kb hunde-DNA og 10 enheter T4-DNA-ligase (NEN) og inkubert natten over ved 14°C og 1 dag ved 4°C i 50 jul ligeringsmedium (66 mM tris-HCl pH 7,2, 0,1 M NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 5 mM ditiotreitol, 0,5 mM ATP). Den ligerte DNA-blanding ble pakket ved hjelp av et in vitro-lambda-forpakningssystem (27) i ferdig lambda-fag-partikkel.
Komponentene i dette systemet, dvs. ultralydekstrakt (SE), frosset-opptint-lysat (FTL), buffer Ml og A ble fremstilt ifølge (27) . 10 /ul alikvoter av den ligerte DNA-blanding ble inkubert 2 minutter ved romtemperatur med 25 jul SE, som i likhet med FTL var opptint 3 0 minutter fra is, blandet med 100 /il FTL og inkubert videre 60 minutter ved romtemperatur. Pakningsblandingen ble fortynnet med 150 /il lambda-fortynningsmiddel (100 mM tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgS04 1 mM EDTA) og lagret ved 4°C.
En liten andel av de pakkede lambda-fager ble titrert på E. coli-stamme NM 528 SupF. Til sammen ga metoden ca. lxlO<6 >uavhengige hunde-DNA-rekombinanter. Resten av det forpakkede materiale ble multiplisert ved plettering på NM528 i en tetthet på 30.000 plakkdannende enheter (pfu) pr. 13,5 cm LB/MgSC^-agar-plate.
4) Undersøkelse av hunde- genbiblioteket med hensyn til interferongener
For å identifisere de rekombinante fager som inneholdt hundeinterferon-gener, utnyttet man nukleotidhomologien som var påvist ved Southern-Blots (17) med radioaktivt markerte human-IFN-alfa-gener.
For dette formål ble 10 /xg høymolekylært hunde-DNA fullstendig spaltet med EcoRI henh. Hindlll, adskilt elektroforetisk på 0,8 %ig agarosegel og overført på nitrocellulosefiltre. Fra et 845 bp HindIII-fragment som stammer fra ekspresjonsplasmidet pER3 3 (14), som inneholder hele det proteinkodende område for ferdig human-interferon-alfa2ARG, ble P-3 2 markert DNA-stykke fremstilt etter vanlige metoder (25) .
Nitrocellulosefiltrene ble forhybridisert 7 timer ved 65°C i 5xSSPE (0,9 M NaCl, 50 mM NaH2POA, 5 mM EDTA, pH 7,4), 5 x Denhardt-løsning (0,1 % Ficoll, 0,1 % polyvinylpyrrolidon, 0,1 % kvegserum-albumin), 0,1 % SDS, 20 mg/ml laksesperm-DNA og deretter hybridisert med 13 x 10<6> cpm av den markerte probe i den samme løsning, men uten laksesperm-DNA. Etter inkubering ved 65°C natten over ble filtrene vasket fire ganger 1 til 1,5 timer i 3 x SSC (0,45 NaCl, 45 mM Na-citrat), 0,1 % SDS ved 65°C og eksponert 7 dager på røntgen X-omat S-røntgen-film med Kodak regulære forsterkerfolier (fig. 21). Forekomst av flere bånd beviser en familie av alfa-interferongener hos hunder liksom man tidligere har påvist hos kveg, svin og mennesker.
For undersøkelsene av interferongenene i hunde-DNA-biblioteket anvendte man derfor de samme hybridiseringsbetingelser.
1.000.000 rekombinante DNA-fager ble sådd ut på E. coli NM528 i en tetthet på 30.000 pfu/13,5 cm plate. Togangers nitrocellulose-replikaer ble fremstilt av hver plate etter fremgangsmåten til Benton og Davis (19).
Etter 2 timers oppvarmning ved 80°C ble filtre vasket
1,5 timer ved 65°C i 1 M NaCl, 10 mM tris-HCl pH 8,0, 0,1 % SDS, forhybridisert som beskrevet natten over og hybridisert 24 timer med 1,5 x 10<6> cpm radioaktiv alf a-interf eron-probe pr. filter. Etter tre gangers gjentatt undersøkelse erholdtes 9 hunde-alfa-interferon-kloner som ga positive hybridiserings-signaler.
5) Karakterisering av rekombinantfager
Fra 9 humane alfa-IFN-hybridiserende rekombinanter fremstiltes fag-DNA. DNA'ene ble spaltet med EcoRI, BamHI, Hindlll, Pstl, Bglll, Sali, Smal og adskilt elektroforese i en 0,8 %ig agarosegel. Størrelsen av de hybridiserende fragmenter ble bestemt ved Southern-metoden. Restriksjonsstedenes posisjon innenfor lambda-innskuddet ble bestemt ved hjelp av metoden til Rackwitz et al. (4) ved partiell restriksjons-spaltning av lambda-DNA, markering av høyre henholdsvis venstre kohesive ender av lambda-armer med syntetisk, P-32-markert oligonukleotid og elektroforese i 0,45 %ige agarosegeler. Restriksjonskartene av klonet Ca-alfa-11-2 man derved fikk er vist i fig. 22.
6) Subkloning av hundeinterferon- alfa- qener
To restriksjonsfragmenter av klonet Ca-alfall-2, som hadde hybridisert med den humane alfa-interferon-markør, ble subklonet i multirestriksjonenzyms-kloningsstedet til pBR322-derivatet pUC9. Innskuddet av et fremmed DNA-fragment fører til et avbrudd av lac Z-genet til /3-galaktosidase og forandrer dermed fenotypen til den med plasmidet transformerte E. coli stamme JM101 fra lac+ til lac-. På grunn av den ikke-fungerende /3-galaktosidase kan man ikke med isopropyltio-galaktosid (IPTG)-indusert JM101 spalte den fargeløse sub-stratanalog 5-brom-4-klor-3-indolyl-/?-D-galaktosid (BCIG) til blått fargestoff. Bakteriekolonier med lac-fenotype kan derfor gjenkjennes på den hvite fargen.
Et 3,7 kb Smal-fragment fra klonet Ca-alfall-2 ble eluert fra en agarosegel, renset på en elutip-D-søyle og ligert i ca. 10 ganger molart overskudd med 40 ng pUC9-vektor kappet med 40 ng Smal og defosforylert, transformert til E. coli JM101 og helt ut med LB topp-agar med 0,2 mg/ml BCIG, 0,17 mg/ml IPTG og 0,1 mg/ml ampicillin. Hvite kolonier ble dyrket natten over ved 37°C i 5 ml LB-medium med 0,1 mg/ml ampicillin og undersøkt etter det anvendte fragment med en plasmid-mini-preparasjonsmetode (25). Et således oppnådd plasmid ble kalt pAH2. På samme måte ble et 2,4 kb Smal-fragment fra det samme lambda-klon subklonet i pUC9. Det erholdte plasmid ble kalt pAH4 . 7) DNA- sekvens for hunde- alfa- interferon- genet fra klon Ca-alfall- 2 1,7 kb Hindlll-innskuddet fra pAH2 (3,7 kb Smal-fragment subklon av Ca-alfall-2, fig. 23) ble sekvensbestemt etter dideoksymetoden til Sanger (23) etter Shotgun-metoden. 60 fig pAH2 plasmid-DNA ble spaltet fullstendig med Hindlll, 1,7 kb fragmentet isolert fra en 1 %ig agarosegel og renset som ovenfor beskrevet. 15 fig av dette fragmentet ble ligert i 100 fil ligeringsmedium med 14 enheter TA-DNA-ligase natten over ved 14°C og 4 dager til ved 4°C med seg selv. Dette ligerte DNA ble oppdelt i små stykker et isbad med ultralyd i 20 sekunders pulser, til sammen 100-140 sekunder. DNA-endene ble reparert 2 timer ved 14°C i 250 fil reaks jonsmedium (50 mM tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol, 0,5 mg/ml kvegserumalbumin hver 0,1 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP) med 15 enheter av det store fragment fra E. coli polymerase I (Klenow-fragment). Etter konsentrering ved etanolfelling ble det således forbehandlede DNA adskilt på en 1 %ig agarosegel og DNA-fragmentene isolert og renset i et størrelsesområde fra 0,35-1,0 kb. Fragmentene ble ligert i ca. 10 gangers molart overskudd med den replikative form av bakteriofag M13mp8 kappet med Smal og fosforylert (22) og transformert til E. coli JM101. Det enkeltkjedede DNA av de således erholdte rekombinante fager ble isolert og etter binding av et syntetisk oligonukleotid ble tokjedesyntesen utført i 4 enkelte reaksjoner med Klenow-fragmentet fra E. coli DNA-polymerase I.
Sekvensene til innskuddet i de forskjellige rekombinante fager ble forenet ved hjelp av et computerprogram av Staden (24) modifisert av C. Pieler til en total sekvens som er vist i fig. 24.
Fullstendig analogt sekvensbestemtes et 1,9 kb Hindlll-fragment fra plasmid pAH4 (2,4 kb Smal-subklon fra Ca-alfall-2, fig. 23) (fig. 25).
8) Konstruks- jon av ekspresjonsplasmid pRH 100
Alle enzym-reaksjoner ble utført innen de betingelser som
er angitt av produsentene.
7 /tg plasmid pER103 (Eva Dworkin-Rastl et al., Gene 21
(1983) 237-248, EP-A-0.115-613) ble linearisert i 50 /il reak-sjons-medium med restriksjonsendonukleasen Hindlll. Etter en en-times inkubasjon ved 37°C ble 50 /ul 2x CIP-buffer tilsatt (2x CIP-buffer = 20 mM tris, pH=9,2, 0,2 mM EDTA). Ved tilsetning av 2 enheter av alkalisk fosfatase fra kalvetarm (CIP) ble de 5'terminale fosfatrester fjernet og man inkuberte 3 0 minutter ved 45°C. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av
4 /il 0,5 EDTA-løsning samt tilsetning av 10 /il. 1 M tris, pH=8,0-løsning. Proteinene ble fjernet ved toganger fenol og engang fenol-/kloroform-ekstraksjon. DNA'et ble felt ut fra den vandige fase etter tilsetning av 0,1 vol 3 M natrium-acetat-løsning pH=5,5 og 250 /il etanol, DNA-fellingen ble vasket etter sentrifugering engang med 70 %ig etanol-løsning. DNA'et ble tørket og klumpen så oppløst i 20 /il TE-buffer
(10 mM tris pH=8,0, 1 mM EDTA).
1 /tg av hver av de syntetiske fremstilte oligodesoksy-nukleotider d(AGCTTAAAGATGAGCT) og d(CATCTTTA) ble fosforylert i 10 /il reaksjonsløsning under tilsetning av 10 enheter T4-PNK (polynukleotidkinase) samt 1 mM rATP. Reaksjon fant sted ved 37°C og varte 45 minutter. Reaksjonen ble avbrutt ved 10 minutters oppvarmningn til 70°C. 5 /il av plasmid-løsningen og av det fosforylerte oligonukleotidet ble blandet og oppvarmet 5 minutter ved 70°C. Deretter ble løsningen avkjølt til 0°C, 2 /il 10 x ligasebuffer
(500 mM tris, pH=7,5), 100 mM MgCl2 200 mM DTT (ditio-
treit), 1 mM rATP, 500 /tG/ml BSA (kve<g>serumalbumin) , samt 2 /il vann og 10 enheter T4-DNA-ligase tilsatt. Reaksjonen varte 40 timer og ble utført ved 4°C. Den ble avbrutt ved 10 minutters oppvarmning til 7 0°C.
2 /il av denne ligase-reaksjonen ble spaltet i tilsammen
3 0 /il løsning med 10 enheter av restriksj onsendonukleasen SacI (New England Biolabs) i 3 timer ved 37°C. Reaksjonen ble avbrutt ved 10 minutters oppvarmning til 70°C. 5 /il av denne
reaksjonsblanding ble ligert i tilsammen 30 fil ved tilsetning av 10 enheter T4-PNK ved 14°C i 16 timer.
200 fil kompetenter E. coli HB101 ble blandet med 10 fj. 1 av denne ligasereaksjonen. Bakteriene ble holdt 45 minutter på is og deretter oppvarmet 2 minutter til 42°C for å muliggjøre DNA-opptaket. Så ble bakteriesuspensjonen igjen inkubert 10 minutter ved 0°C. Til slutt ble de transformerte bakterier strøket ut på en LB-agar som inneholdt 50 fxg/ml ampicillin.
Fra de dannede bakteriekolonier ble 12 plukket ut vilkårlig og plasmidene isolert fra disse i mikromålestokk (Birnboim und Doly, Nucl. Acids Res. 7 (1979) 1513-1523). Det resulterende DNA ble kappet med restriksjonsendonukleasen SacI og DNA'et adskilt på en agarosegel (1 %, lx TBE-buffer). DNA'ets vandring som lineært molekyl med størrelse på ca. 4.400 bp bekreftet innføring av et Sacl-gjenkjennelsessted i plasmidet. Et av disse plasmider ble plukket ut vilkårlig.
E. coli HB101 ble igjen transformert med DNA'et fra det tilhørende minipreparat. En koloni ble vart ut fra de resulterende transformerte bakterier og dyrket i større målestokk. Plasmidet som ble isolert derfra ble kappet med restriksjonsendonukleasene EcoRI og BamHI, DNA'et skit på en 1 %ig agarosegel, og det mindre fragment isolert fra gelen ved elektroeluering. Dette ca. 4 60 bp lange EcoRI-BamHI DNA-fragment ble sekvensbestemt etter Sanger. (F. Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (1977) 5463-5467). Det således analyserte plasmid ble kalt pRH 100.
9) Direkte ekspresjon av ferdig CalFN- alfal i E. coli
Fremgangsmåten for konstruksjonen av ekspresjonsplasmidet pAH4/2 for ferdig CalFN-alfal er vist skjematisk i fig. 28. 5 jug plasmid pRHIOO ble kappet fullstendig med restriksj onsendonukleasen BamHI og de 5-terminale fosfatrester så fjernet med kalvetarm-fosfatase (CIP)-. 3 0 fig plasmid pAH4 (se eksempel 6) ble spaltet med BamHI. Etter elektroforetisk separasjon av DNA i en agarosegel ble DNA-fragmentene med en lengde på 0,6 kb, som inneholder hele den sekvens som koder for CalFN-alfal, isolert og renset fra gelen.
Ca. 1 ug av dette 0,6 kb DNA-fragment ble ligert med
25 ng kappet pRHIOO vektor-DNA i 10 /il ligeringsmedium (66 mM tris-HCl pH 7,2, 0,1 M NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 5 mM ditiotreit, 0,5 mM ATP) med 10 enheter T4-DNA-ligase ved 14°C i 24 timer. Kompetente E. coli HB101 ble transformert med 5 /il av denne ligasereaksjon og strøket ut på LB-agar som inneholdt
50 /ig/ml ampicillin.
Fra de dannede bakteriekolonier ble plasmidet isolert i mikromålestokk og karakterisert ved restriksjonsanalyse med forskjellige enzymer. Et plasmid som inneholdt interferon-genet og tryptofanpromotor i samme orientering, ble kalt pAH104 (fig. 28). Dette plasmid er et mellomtrinn for fremstilling av det endelige ekspresjonsplasmid for ferdig CalFN-alfal.
Fremstilling av ekspresjonsplasmid PAH4/ 2
Ca. 7 pmol av det 0,6 kb lange BamHI-fragment fra plasmidet pAH4 ble blandet med 1 nmol syntetisk oligodeoksynukleotid (d(TGCCACCTGCCCGAC), som først på 5'enden ved hjelp av T4 polynukleotid-kinase var utstyrt med en fosfat-gruppe, og brakt til 34 /il totalvolum med vann. 15-mer oligonukleotidet inneholdt den kodende sekvens for de N-terminale 5-aminosyrer av det ferdige hunde-alfa-interferon. DNA-løsningen ble oppvarmet 5 minutter til 100°C og deretter avkjølt, hvorved oligonukleotidet som foreligger i stort overskudd bindes til det komplementære stedet av DNA-enkelt-kj eden.
Tokjede-syntesen ut fra den bundede oligonukleotidprimer fant sted i 70 /il reaksjonsmedium (50 mM tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM ditiotrit, 0,5 mg/ml kvegserumalbumin, 1 mM av hver av dATP, dGTP, dCTP, dTTP) med 35 enheter Klenow-fragment fra E. coli DNA-polymerase I i 90 minutter ved 22°C. Reaksjonen ble avbrutt ved tilsetning av 20 mM EDTA og proteinet fjernet ved fenol/kloroform-ekstraksjon. DNA'et ble utfelt etter tilsetning av 0,1 vol 3 M natriumacetatløsning pH
6 med etanol og vasket med 70 %ig etanol.
De gjenværende enkeltkjedede DNA-avsnitt ble fjernet med Sl nuklease. Dertil ble den tørkede DNA-klumpen oppløst i
300 /xl Sl-reaksjonsbuffer (4 mM Zn(Ac)2, 30 mM NaAc, 250 mM NaCl, 5 % glycerol, pH 4,6) og inkubert med 150 enheter Sl nuklease (Sigma) i 2 timer ved 14°C. Reaksjonen ble avbrutt ved tilsetning av 20 mM EDTA. Proteinene ble fjernet ved ekstraksjon med fenol og kloroform. Etter tilsetning av 0,15 vol 3 M natriumacetatløsning og 0,6 vol isopropanol ble DNA'et utfelt ved 0°C fra den vandige fase og vasket med 7 0 % etanol.
Det erholdte DNA ble spaltet med 60 enheter Pstl 2,5 timer ved 37°C og så separert ved elektroforese i en 2 %ig agarosegel. DNA-fragmenter med en lengde på ca. 300 bp ble isolert og renset. 30 /ig plasmid pAH104 ble spaltet 2 timer ved 37°C med 50 enheter SacI og enzymet inaktivert 10 minutter ved 70°C. Etter tilsetning av 0,5 mM av hver av alle fire desoksynukleotider og 3 0 enheter Klenow-polymerase inkuberte man 60 minutter ved romtemperatur for å gjøre DNA-endene jevne. Proteinene ble fjernet ved ekstraksjon med fenol og kloroform og DNA'et utfelt med etanol. Det erholdte DNA ble kappet partielt med 20 enheter Pstl i 4 0 minutter ved 37°C og reaksjonen avbrutt ved tilsetning av 2 0 mM EDTA. DNA'et ble separert ved elektroforese i en agarosegel og fragmentene med en lengde på 4,3 kb isolert og renset.
Det erholdte DNA ble ligert med det forutbeskrevne 0,3 kb lange DNA-f ragment i 10 fil liger ingsmedium med 10 enheter T4 DNA-ligase i 20 timer ved 14°C. E. coli HB101 ble transformert med denne ligase-reaksjon og plettert på ampicillin-holdig LB-agar.
De dannede bakteriekolonier ble overført på friske agarplater og i duplikat på nitrocellulosefiltre som var lagt på agar-platen. Etter inkubering ved 37°C ble bakteriene lyset etter en forskrift av Grunstein und Hogness (M. Grunstein &
D. Hogness, Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1975) 72, 3961- ) og DNA'et bundet til nitrocellulosen etter denaturering. Cellebruddstykkene ble fjernet ved 16 timers inkubering ved 65°C i en forvaskløsning (1 M NaCl, 50 mM tris-HCl 1 pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,1 % SDS). Filtrene ble så hybridisert i 10 ml hybridiseringsløsning (0,9 M NaCl, 90 mM tris-HCl pH 7,5, 6 mm EDTA, 0,1 % SDS, 0,1 fig/ ml tRNA fra E. coli (Sigma) med 2xl0<7 >cpm med <32>P markert oligodesoksynukleotid d(TGCCACCTGCCCGAC) i 3 timer ved 47°C. 18 pmol oligonukleotid ble inkubert med 18 pmol [å ~<32>P]ATP (3000 Ci/mmol, Amersham) i 20 fil kinaseringsbuffer (70 mM tris-HCl pH 7,6, 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreit) med 10 enheeter T4-polynukleotidkinase (BRL) i 45 minutter ved 37°C. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 2 5 mM EDTA og den ikke innbygde radioaktivitet skilt fra ved utelukkelseskromatografi over en 1 ml biogel P6-DG (Biorad)-søyle.
Filtrene ble vasket fire ganger i 30 minutter ved 47°C. Vaskeløsningen tilsvarte hybridiseringsløsningen uten tilsetning av tRNA. Filtrene ble eksponert på Kodak X-omat S røntgenfilm under anvendelse av Kodak X-omat regulære forsterkerfolier ved -80°C. Fra bakteriekolonier som i autoradiogrammet ga et positivt hybridiseringssignål isolerte man plasmid-DNA med en mikroprepareringsmetode. Plasmidene ble kappet fullstendig med Hindlll og BamHI. Etter separasjon ved elektroforese i en agarosegel isolertes 0,5 kb lange restriksjonsfragmenter og ble DNA-sekvensanalysert ifølge Sanger.
Et plasmid som hadde den ønskede struktur, ble kalt pAH4/2. Det muliggjorde ekspresjonen av ferdig CalFN-alfal i E. coli.
10) Fremstilling av plasmidet pAH4/ 3
En fra plasmidet pAH4/2 (eksempel 9) som er manipulert for den bakterielle ekspresjon av CalFN-alfal ble subklonet i en modifisert plasmidvektor parpATER103 (eksempel K) som har et høyere kopitall pr. celle og øket plasmidstabilitet.
Ca. 0,5 fig av den 0,5 kb lange HindIII/BamHI-fragment fra pAH4/2 (eksempel 9) ble inkubert med 2 5 ng plasmidvektor parpATER103 kappet med Hindlll og BamHI og gelrenset i 10 /il legeringsmedium ved 5 enheter T4-DNA-ligase i 3 timer ved 22°C. Kompetente E. coli HB101 ble transformert med 5 jul av denne ligasereaksjon og plettert på LB-agar med 50 /itg/ml ampicillin.
Fra de oppvokste bakteriekolonier ble seks plukket ut ved vilkårlig og plasmidene fra disse isolert i mikromålestokk.
Et plasmid som etter restriksjonsanalyse med forskjellige restriksjonsendonukleaser hadde den riktige struktur, ble kalt pAH4/3.
11) Ekspresjon av interferonaktivitet med E. coli HB101 som inneholder plasmidet PAH4/ 2 eller PAH4/ 3
100 ml bakteriekultur ble inkubert ved 37°C under kraftig rysting inntil den nedenfor angittte optiske densitet ved 600 nm i følgende tryptofanfri medium ble oppnådd (angivelser pr. liter medium): 10 g (NH4)2POA, 3,5 g KH2PO<, pH 7,3 med NaOH, 0,5 g NaCl, 21 g kasaminosyrer (surt hydrolysert). 11 g glukose, 1 mM MgSOA, 0,1 mM CaCl2, 1 mg tiamin-HCl, 20 mg L-cystein, 20 mg 3 -/3-indol akryl syre IAA, induktor for tryptofan-operonet), om ønsket 50-100 mg ampicillin.
Så ble bakteriene sammenklumpet ved sentrifugering i 5 minutter ved 4 000 opm, oppslemmet med 1/10 av kulturvolumet iskald 50 mM tris-HCl pH 8,0, 30 mM NaCl og brukket opp undet iskjøling toganger 3 0 sekunder ved hjelp av ultralydsonde (20 kHz, 100 watt). Celleavfallet ble fjernet 10 minutter ved 10.000 opm (4°C) og supernantanten undersøkt etter sterilfil-trering med hensyn til interferonaktivitet i en måling hvor reduksjonen av den cytofatiske effekt (CPE) fra vesikulær virus (VSV) måles.
Prøvesystem: A-72 (ATCC CRL 1542) hundetumor/vesikulær stomatitt virus
Plasmid OD500 ^ IFN-enheter/1 bakteriekultur
pAH4/2 4,2 3,2xl0<5>
pAH4/3 3,2 3,0xl0<5>
12) Påvisning av sekvenser i genomisk hunde- DNA hybridisert med CalFN- alfal og EqIFN- omega
For å påvise totalantallet av sekvenser i hundegenom som har høy homologi med interferongener av klassen IFN-alfa, henholdsvis IFN-omega, gikk man frem på følgende måte: 20 /xg høymolekylært hunde-DNA (eksempel 1) ble fullstendig spaltet med 60 enheter av det tilsvarende restriksjonsenzym i 200 jul reaksjonsvolum og 10 / ig av dette kappede DNA pr. spor separert etter størrelse på en 0,8 %ig agarosegel. Etter Southern-overføring til nitrocellulosefilter, denaturering og filtrering av DNA'et ble hvert filter hybridisert med ca. 6xl0<6> cpm nicktranslatert DNA-probe (17 timer ved 65°C, 5x SSPE, 5x Denhardt-løsning, 0,1 % SDS,
2 0 /ug/ml denaturert laksesperm-DNA, se eksempel 4) .
Som probe for CalFN-alfa anvendtes en 0,6 kb langt BamHI-fragment fra plasmid pAH4, som inneholdt hele sekvensen som koder for interferonet. Som probe for EqIFN-omega anvendtes en 2,1 kb EcoRI-innskudd fra plasmid pRH61.
Filter som hybridisert med CalFN-alfal ble så vasket under stringente betingelser, 4 ganger 45 minutter-ved 65°C med 0,3 x SSC (45 mM NaCl, 4,5 mM Na3-citrat) , 0,1 % SDS. Filtre som var hybridisert med EqIFN-omega ble vasket ved 65°C med 2x SSC (0,3 M NaCl, 30 mM Na3-citrat), 0,1 % SDS, 4 ganger 45 minutter ved 65°C med 0,3 x SSC (45 mM NaCl, 4,5 mM Na3-citrat) , 0,1 % SDS. Filtre som hybridiserte med EqIFN-omega ble vasket ved 65°C med 2x SSC (0,3 M NaCl, 30 mM Na3-citrat), 0,1 % SDS. Autoradiografien fant sted på DuPont Cronex røntgenfilm under anvendelse av Kodak Lanex-regulær forsterkerfolie 7 dager ved -80°C.
Autoradiogram (fig. 29) viser at i hundegenomet er foruten de to gener som koder for identiske alfa-interferoner
ingen ytterligere sekvenser påviselige som har en lignende høy homologigrad med CalFN-alfal, slik det opptrer ved andre arter innenfor en interferonklasse. Med DNA'et fra et ekvint omega-interferongen er minst et gen påviselig under noe mindre stringente betingelser som er forskjellig fra hundens beskrevne alfa-interferoner.
13) Subkloning og sekvensbestemmelse av et andre heste- interferon- gen ( EgIFN- omega2) fra lambda- klon- Eq- al6
Et 5,5 kb langt EcoRI restriksjonsfragment fra lambda-klonet Eq-al6 (se fig. 30), som hadde hybridisert svakt med en human a-IFN-markør (se eksempel D, E) ble underklonet i EcoRI-stedet til plasmidet pUC8 og E. coli JM101 transformert med ligeringsblandingen. Et erholdt plasmid med den ønskede DNA-innskudd ble kalt pRH62. EcoRI-innskuddet til plasmidet pRH62 ble isolert fra en agarosegel og subklonet som beskrevet i eksempel G etter Shotgun-metoden i M13mp8. M13-fag-plakkene man fikk etter transformasjon av E. coli JM101 ble overført etter fremgangsmåten til Benton und Davis (19) på nitro-cellulosef iltre (eksempel D) og hybridisert. Som hybridi-seringsprobe anvendtes det 1,0 kb lange HindIII-fragment fra plasmidet pRH61, som inneholdt hele sekvensen som koder for EqIFN-omegal. Fra rekombinante M13-fager som gir et positivt hybridiseringssignal isolertes enkeltkjedet DNA og ble sekvensbestemt etter Sanger-metoden. Den målte DNA-sekvens (fig. 31) inneholdt hele det kodende område for et funksjonelt hesteinterferongen, som på grunn av homologi med interferonet fra plasmid pRH61 (eksempel J, fig. 32) og HuIFN-omegal (23 aminosyrer signalpeptid etterfulgt av ferdig protein med 172 aminosyrer) ble kalt EqIFN-omega2. EqIFN-omega2 inneholdt overraskende i posisjon 86 av det ferdige protein en femte cysteinrest. Homologien mellom de to ekvine omega-interferoner er meget høy fra den 29. aminosyre i det ferdige protein, og de fire cysteinrestene samt det potensielle N-glykosyleringssted på posisjon 78-80 (Asn-Thr-Thr) er fullstendig bevart (fig. 31, 32). Aminosyre-homologien med proteinene fra klasse omega hos kveg og menneske er høyere (61-70 %) enn til de ekvine alfa-interferoner (57-60 %, fig. 33) . 14) Subkloning og sekvensbestemmelse av to videre heste- alfa-interferon- gener ( EgIFN- a3, EqIFN- a4)
Et 3,2 kb langt Hindlll restriksjonsfragment fra lambda-klonet Eq-a24, som hadde hybridisert med en human a-IFN-markør
(se eksempel D, E) ble subklonet i Hindlll-stedet til plasmidet pUC8 og transformert i E. coli JM101. Et erholdt plasmid med den ønskede innskudd ble kalt pRH83. På samme måte ble 2,8 kb langt Hindlll restriksjonsfragment fra lambda-klon Eq-a9 klonet i pUC8, og det erholdte plasmid kalt pRH82. Hindlll-innskuddene i plasmidene pRH82 og pRH83 ble subklonet etter Shotgun-metoden (eksempel G) i M13mp8 og transformert i E. coli JM101. De erholdte fag-plakker ble hybridisert som forut beskrevet etter Benton und Davis-metoden. Fra fager som hybridiserte med det 1,0 kb lange HindiII-BamHI-fragment fra plasmidet pAH52/2 (eksempel L), som inneholder sekvensen som koder for ferdig EqIFN-al, ble enkeltkjede-DNA isolert og sekvensbestemt etter Sanger-metoden. De bestemte DNA-sekvenser (fig. 34, 35) viste at det dreide seg om to funksjonelle alfa-interferongener fra hesten, som ble kalt EqIFN-a3 (fra pRH83) henholdsvis EqIFN-a4 (fra pRH82). De koder for polypeptider bestående av et 23 aminosyrer langt signalpeptid etterfulgt av et fullstendig protein med 161 aminosyrers lengde. Homologi-graden av DNA-sekvensene mellom EqIFN-al (pAH50) og EqIFN-a3 (pRH83) henholdsvis mellom EqIFN-a2 (pRH62) og EqIFN-a4 (pRH82) er overordentlig høy. Aminosyresekvensene til de fullstendige proteiner av EqIFN-al og EqIFN-a3 er fullkomment like. Ved degenereringen av den genetiske kode fører ikke forskjellene i nukleotid-sekvensene i dette tilfelle til noen utskiftning i aminosyresekvensene. Muligens dreier det seg ved EqIFN-a3 om en allel-form av EqIFN-al.
LITTERATURHENVISNINGER:
1) D.W. Leung, D.J. Capon, D.V. Goeddel
The structure and bacterial expression of three distinct bovine interferon-beta genes. Gene cloning transmission and expression in Escherichia coli.
Bio/Technology, (1984) 2,5,458-464.
2) D.J. Capon, D.V. Goeddel, GENENTECH
Tierische Interferone
Offenlegungsschrift DE 33 08 030 Al, 7.3.83
3) A.M. Frischauf, H. Lehrach, A. Poustka, N. Murray
Lambda replacement vectors carrying polylinker sequences J. Mol. Biol., (1983), 170, 827-842
4) H.R. Rackwitz, G. Zehetner, A.M. Frischauf, H. Lehrach
A protocoll for rapid restriction mapping of sequences cloned into lambda vectors.
Gene (1984) 30, 195-200.
5) D. Skup et al.
Molecular cloning of partial cDNA copies of two distinct mouse IFN beta-mRNA's
Nucl. Acids Res. (1982), 10, 10,3069-3084.
6) Y. Higashi et al.
Structure and expresssion of a cloned cDNA for Mouse Interferon-beta.
J.Biol. Chem. (1983), 258, 9522-9529. 7) V. Wilson, A.J. Jeffreys, P.A. Barrie, P.G. Boseley, P.M.
Slocombe, A. Easton, D.C. Burke
A comparison of vertebrate interferon gene families detected by hybridization with human interferon DNA. J.Moi. Bio. (1983) 166, 457-475.
8) S.C. Tsai, M.J. Appel
Hyporesponsiveness to dog interferon induction in vitro J. Gen. Virol. (1983) 64,2007-2012. 9) R.Dijkema, P. Pouwels, A.de Reus, H. Schellekens Structure and expression in Escherichia coli of a rat interferon alpha gene.
Nucl. Acids Res. (1984), 12,2,1227-1242.
10) G.D. Shaw, W. Boll, H. Taira, N.Mantei, P. Lengyel,
C. Weissmann
Structure and expresssion of cloned murine IFN-alpha genes
Nucl. Acid Res. (1983) 11,3,555-573.
11) H. Bielefeldt Ohmann, L.A. Babiuk
Effect of bovine recombinant alpha-1 interferon on inflammatory responses of bovine phagocytes.
J. Interferon Res., (1984), 4,2,249-263.
12) H. Bielefeldt Ohmann, J.E. Gilchrist, L.A. Babiuk Effect of recombinant DNA-produced bovine interferon alpha (BoIFN-1) on the interaction between bovine alveolar macrophages and bovine Herpesvirus type 1.
J. Gen. Virol., (1984), 65, 1487-1495.
13) Y. Higashi, Y.Sokawa, Y. Watanabe, Y. Kawade, S. Ohno,
C. Takaoka, T. Taniguchi.
Structure and expression of a cloned cDNA for.mouse interferon-beta.
J. Biol. Chem., (1983), 258,15, 9522-9529.
14) E. Dworkin-Rastl, P. Swetly, M.B. Dworkin
Construction of expression plasmids producing high levels of human leukocyte-type interferon in Escherichia coli. Gene, (1983), 237-248.
15) E. Dworkin-Rastl, M.B. Dworkin, P. Swetly.
Molecular cloning of human alpha and beta interferon genes from Namalwa cells.
J. Interferon Res., (1982) 2,4, 575-585.
16) D.V. Goeddel, D.W. Leung, T.J. Dull, M. Gross, R.M. Lawn, R.McCandliss, P.H. Seeburg, A. Ullrich, E. Yelverton, P.W. Gray.
The structure of eight distinct cloned human leukocyte
interferon cDNA's.
Nature, (1981), 290,20-16.
17) E.M. Southern
Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoreses.
J. Mol. Biol., (1975) 98, 503-
18) Blin, N. and Stafford, D.W.
A general method for isolation of high molecular weight DNA from eukaryotes.
Nucl. Acids Res. (1976), 3, 2303-2308.
19) W.D. Benton, R.W. Davies
Screening lambda gt re combinant clones by hybridization to single plaques in situ.
Science, (1977), 196, 180-182.
20) Miller (1972)
Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
21) W.E. Stewart II (1979)
The Interferon System, Springer Verlag, New York.
22) J. Messing et al.
Gene, (1982), 19, 269-276.
23) F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulson
DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proe. Nati. Acad. Sei., USA, (1977), 74, 5463-5467.
24) R. Staden
Automation of the computer handling of gel reading data produced by the shotgun method of DNA sequencing. Nucl. Acids Res., (1982), 10, 4731-4751.
25) T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook
Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York.
26) Birnholm and Doly
Nucl. Acids Res., (1979), 7, 1513.
27) Scalenghe, F., Turco, E., Edstrom, J.E. Pirotta, V.
and Melli, M.
Microdissection and cloning of DNA from a specific region of Drosophila melanogaster polytene chromosomes. Chromosoma (1981) , 82, 205-216.
28) K. Todokoro, D. Kioussis, C. Weissmann
Two non-allelic human interferon alpha genes with identi-cal coding regions.
EMBOJ., (1984) 3,8, 1809-1812.
29) B. Hohn, K. Murray
Packaging recombinant DNA molecules into bacteriophage particles in vitro.
Proe. Nati. Acad. Sei. USA, (1977), 74, 3259-3263.
30) Hohn, B.
In vitro packaging of lambda and cosmic DNA.
Meth. Enzymology (1979), 68, 299-309.
31) J.M. Messing, R. Crea, P.H. Seeburg
A system for shotgun sequencing.
Nucl. Acids Res., (1981) 9, 309-321.
32) Tovey, M.G., Bandu, M.T., Begon-Lours, J., Brouty-Boye, D. and Gresser, I.
Antiviral activity of bovine interferons on primate cells
J. Gen. Virol. (1977), 36, 341-344.
33) Hauptmann, T. and Swetly, P.
A novel class of human type I interferons.
Nucl. Acids Res. (1985), 13, 4739-4749, in press.
34) Capon, D.J., Shepard, H.M. and Goeddel, D.V.
Two distinct families of human and bovine interferon-alpha genes are coordinately expressed and encode functional polypeptides.
Mol. Cell. Biol. (1985), 5, 768-779.
35) Feinstein, S.I., Mory, Y., Chernajovsky, Y, Maroteaux, L. , Nir, U. , Lavie, V. and Revel,, M. Family of human alpha-interferon-like sequences. Mol. Cell. Biol. (1985), 5, 510-517. 36) Twigg, A.J. and Sherratt, D.J.
Trans-complementable copy-number mutants of plasmid ColEl
Nature (1980), 283, 216-218.
37) Sancar, A., Hack, A.M. and Rupp, W.D.
Simple method for identification of plasmid-coded proteins
J. Bacteriol. (1979), 137, 692-693. 38) Velan, B., Cohen, S., Grosfeld, H., Leitner, M. and Shafferman, A.
Bovine interferon alpha genes. Structure and expression J. Biol. Chem. (1985), 260, 5498-5504. 39) Zwarthoff, E.C., Mooren, T.A, and Trapman, J. Organization, structure and expression of murine interferon alpha genes.
Nucl. Acids Res. (1985), 13, 791-803.
Claims (4)
1. Ekspresjonsvektor som koder for, og er istand til å uttrykke EqIFN-a, -/?, -o og CaIFN-a, karakterisert ved at den omfatter et DNA-molekyl som koder for EqIFN-a, -0, -6 eller CaIFN-a, med en sekvens ifølge figurene I-v som inneholder tryptofanpromotoren.
2. Ekspresjonsvektor ifølge krav 1, karakterisert ved at den er plasmidet PAH52 (Fig. 14), pAH52/2 (Fig. 15), pAH53 (Fig. 14), pAH55 (Fig. 15), pAH62 (Fig. 16), pAH4/2 (Fig. 28), pAH4/3 som er replikerbar i E. Coli.
3. Ekspresjonsvektor ifølge krav 1, karakterisert ved at den inneholder sekvensene
4. Fremgangsmåte for fremstilling av EqIFN-a, -/3, -6 eller CaIFN-a,
karakterisert ved ved at a) E. Coli transformeres med en ekspresjonsvektor som koder for, og er istand til å uttrykke EqIFN-a, -6 eller CaIFN-a ifølge krav 3, b) interf eronet EqIFN-a, -/3, -6 eller CaIFN-a, fortrinnsvis et interferon med én av sekvensene ifølge krav 3, fremstilles, isoleres og renses.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3446122 | 1984-12-18 | ||
| DE3446124 | 1984-12-18 | ||
| DE3529262 | 1985-08-16 | ||
| DE3535115 | 1985-10-02 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO855078L NO855078L (no) | 1986-06-19 |
| NO176057B true NO176057B (no) | 1994-10-17 |
| NO176057C NO176057C (no) | 1995-01-25 |
Family
ID=27433247
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO855078A NO176057C (no) | 1984-12-18 | 1985-12-17 | Fremgangsmåte for fremstilling av hunde- og hesteinterferoner og ekspresjonsvektor som koder for disse |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5605688A (no) |
| EP (1) | EP0186098B1 (no) |
| JP (1) | JPH0753596A (no) |
| KR (1) | KR940010864B1 (no) |
| AT (1) | ATE77410T1 (no) |
| AU (1) | AU604634B2 (no) |
| CA (1) | CA1339954C (no) |
| DE (1) | DE3544520C2 (no) |
| DK (1) | DK167929B1 (no) |
| ES (1) | ES8704515A1 (no) |
| FI (1) | FI90990C (no) |
| GR (1) | GR853062B (no) |
| HU (1) | HU212836B (no) |
| IE (1) | IE58685B1 (no) |
| IL (1) | IL77369A (no) |
| NO (1) | NO176057C (no) |
| NZ (1) | NZ214602A (no) |
| PT (1) | PT81691B (no) |
| WO (1) | WO1986003775A1 (no) |
Families Citing this family (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI90990C (fi) * | 1984-12-18 | 1994-04-25 | Boehringer Ingelheim Int | Rekombinantti-DNA-molekyyli, transformoitu isäntäorganismi ja menetelmä interferonin valmistamiseksi |
| DE3642096A1 (de) * | 1986-12-10 | 1988-06-16 | Boehringer Ingelheim Int | Pferde-(gamma)-interferon |
| DE3932311A1 (de) * | 1989-09-28 | 1991-04-11 | Boehringer Ingelheim Int | Verfahren zur reinigung von beta-interferon |
| US6482403B1 (en) | 1998-05-29 | 2002-11-19 | Heska Corporation | Caniney IL-13 immunoregulatory proteins and uses thereof |
| US20020127200A1 (en) | 1998-05-29 | 2002-09-12 | Shumin Yang | Canine and feline immunoregulatory proteins, nucleic acid molecules, and uses thereof |
| USRE40374E1 (en) | 1998-05-29 | 2008-06-10 | Heska Corporation | Canine IL-13 immunoregulatory proteins and uses thereof |
| US6471957B1 (en) | 1998-05-29 | 2002-10-29 | Heska Corporation | Canine IL-4 immunoregulatory proteins and uses thereof |
| LT2599503T (lt) | 1998-10-16 | 2017-06-26 | Biogen Ma Inc. | Interferono beta-1a polimero konjugatai ir jų panaudojimas |
| US20020197235A1 (en) | 2000-11-03 | 2002-12-26 | Moran Stanford Mark | Method for short-term and long-term drug dosimetry |
| DE60237721D1 (de) * | 2001-11-09 | 2010-10-28 | Intarcia Therapeutics Inc | Kombinationstherapie mit omega-interferon zur behandlung von hepatitis c virus oder gelbfieber virus infektionen |
| US20040072236A1 (en) * | 2002-09-27 | 2004-04-15 | Neil Cashman | PrPSc -interacting molecules and uses thereof |
| US7731947B2 (en) | 2003-11-17 | 2010-06-08 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Composition and dosage form comprising an interferon particle formulation and suspending vehicle |
| WO2006083761A2 (en) | 2005-02-03 | 2006-08-10 | Alza Corporation | Solvent/polymer solutions as suspension vehicles |
| US11246913B2 (en) | 2005-02-03 | 2022-02-15 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Suspension formulation comprising an insulinotropic peptide |
| ES2351527T3 (es) | 2006-05-30 | 2011-02-07 | Intarcia Therapeutics, Inc | Modulador de flujo en dos piezas con conducto interno para un sistema osmótico de administración. |
| EP2359808B1 (en) | 2006-08-09 | 2013-05-22 | Intarcia Therapeutics, Inc | Osmotic delivery systems and piston assemblies |
| EP2157967B1 (en) | 2007-04-23 | 2013-01-16 | Intarcia Therapeutics, Inc | Suspension formulations of insulinotropic peptides and uses thereof |
| CA2726861C (en) | 2008-02-13 | 2014-05-27 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Devices, formulations, and methods for delivery of multiple beneficial agents |
| EP3323423B1 (en) | 2009-09-28 | 2020-06-17 | Intarcia Therapeutics, Inc | Rapid establishment and/or termination of substantial steady-state drug delivery |
| US20120208755A1 (en) | 2011-02-16 | 2012-08-16 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Compositions, Devices and Methods of Use Thereof for the Treatment of Cancers |
| PL2686002T3 (pl) | 2011-03-15 | 2018-10-31 | Biogen Ma Inc. | Sposób łagodzenia symptomów grypopodobnych związanych z domięśniowym podawaniem interferonu przy wykorzystaniu schematu zwiększania dawki z szybkim miareczkowaniem |
| CN102321169A (zh) * | 2011-09-30 | 2012-01-18 | 长春工业大学 | 一种犬重组干扰素α及制备方法 |
| US9889085B1 (en) | 2014-09-30 | 2018-02-13 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Therapeutic methods for the treatment of diabetes and related conditions for patients with high baseline HbA1c |
| MA44390A (fr) | 2015-06-03 | 2019-01-23 | Intarcia Therapeutics Inc | Systèmes de mise en place et de retrait d'implant |
| SG11201810102SA (en) | 2016-05-16 | 2018-12-28 | Intarcia Therapeutics Inc | Glucagon-receptor selective polypeptides and methods of use thereof |
| USD840030S1 (en) | 2016-06-02 | 2019-02-05 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Implant placement guide |
| USD860451S1 (en) | 2016-06-02 | 2019-09-17 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Implant removal tool |
| CN110225762A (zh) | 2017-01-03 | 2019-09-10 | 因塔西亚制药公司 | 包括glp-1受体激动剂的连续施用和药物的共同施用的方法 |
| CN108486127A (zh) * | 2018-01-12 | 2018-09-04 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 犬干扰素-α6α7重组蛋白及其制备方法与应用 |
| CN108424915A (zh) * | 2018-01-12 | 2018-08-21 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 犬干扰素-α2重组蛋白的制备方法 |
| CN111233997B (zh) * | 2018-08-02 | 2022-04-12 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种重组犬干扰素CaIFN-λ突变体及其应用 |
| GB202011945D0 (en) * | 2020-07-31 | 2020-09-16 | Ilc Therapeutics Ltd | Compositions and methods relating to the treatment of diseases |
| CN112079912B (zh) * | 2020-09-25 | 2022-05-06 | 广州源博医药科技有限公司 | 一种高活性的犬α干扰素重组蛋白及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1980002375A1 (en) * | 1977-09-23 | 1980-11-13 | Hem Res Inc | High purity animal interferons |
| US4262090A (en) * | 1979-06-04 | 1981-04-14 | Cetus Corporation | Interferon production |
| ZA811368B (en) * | 1980-03-24 | 1982-04-28 | Genentech Inc | Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator |
| ATE25985T1 (de) * | 1980-06-12 | 1987-04-15 | Japan Found Cancer | Plasmid. |
| US4436815A (en) * | 1981-11-27 | 1984-03-13 | Eli Lilly And Company | Method for stabilizing and selecting recombinant DNA containing host cells |
| IE54592B1 (en) * | 1982-03-08 | 1989-12-06 | Genentech Inc | Anumal interferons, processes involved in their production, compositions containing them, dna sequences coding therefor and espression vehicles containing such sequences and cells transformed thereby |
| IL68561A (en) * | 1982-05-05 | 1991-01-31 | Genentech Inc | Preparation of polypeptide with human tissue plasminogen activator function,processes for making it,and dna and transformed cell intermediates thereof |
| DE3247922A1 (de) * | 1982-12-24 | 1984-06-28 | Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim | Dna-sequenzen, deren herstellung, diese sequenzen enthaltende plasmide und deren verwendung zur synthese eukaryotischer genprodukte in prokaryoten |
| JPS60118196A (ja) * | 1983-11-30 | 1985-06-25 | Takeda Chem Ind Ltd | インタ−フェロンの製造法 |
| US4606917A (en) * | 1984-10-03 | 1986-08-19 | Syntex (U.S.A) Inc. | Synergistic antiviral composition |
| FI90990C (fi) * | 1984-12-18 | 1994-04-25 | Boehringer Ingelheim Int | Rekombinantti-DNA-molekyyli, transformoitu isäntäorganismi ja menetelmä interferonin valmistamiseksi |
| US4689224A (en) * | 1985-10-07 | 1987-08-25 | Neogen Corporation | Method for administering vaccines containing equine leukokines and compositions therefor |
-
1985
- 1985-12-16 FI FI854994A patent/FI90990C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-12-17 DK DK586585A patent/DK167929B1/da not_active IP Right Cessation
- 1985-12-17 IL IL77369A patent/IL77369A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-12-17 WO PCT/EP1985/000716 patent/WO1986003775A1/de unknown
- 1985-12-17 EP EP85116083A patent/EP0186098B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-17 IE IE319485A patent/IE58685B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-12-17 PT PT81691A patent/PT81691B/pt not_active IP Right Cessation
- 1985-12-17 HU HU854811A patent/HU212836B/hu not_active IP Right Cessation
- 1985-12-17 NO NO855078A patent/NO176057C/no unknown
- 1985-12-17 AT AT85116083T patent/ATE77410T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-12-17 ES ES550043A patent/ES8704515A1/es not_active Expired
- 1985-12-17 AU AU51320/85A patent/AU604634B2/en not_active Ceased
- 1985-12-17 DE DE3544520A patent/DE3544520C2/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-12-17 NZ NZ214602A patent/NZ214602A/en unknown
- 1985-12-18 GR GR853062A patent/GR853062B/el unknown
- 1985-12-18 CA CA000497972A patent/CA1339954C/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-12-18 KR KR1019850009607A patent/KR940010864B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-03-28 JP JP6057871A patent/JPH0753596A/ja active Pending
- 1994-09-08 US US08/302,391 patent/US5605688A/en not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-02-24 US US08/805,165 patent/US5798228A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU604634B2 (en) | 1991-01-03 |
| US5798228A (en) | 1998-08-25 |
| GR853062B (no) | 1986-04-21 |
| EP0186098A1 (de) | 1986-07-02 |
| FI854994A0 (fi) | 1985-12-16 |
| FI90990C (fi) | 1994-04-25 |
| DK167929B1 (da) | 1994-01-03 |
| CA1339954C (en) | 1998-07-14 |
| ES8704515A1 (es) | 1987-04-01 |
| IE58685B1 (en) | 1994-02-09 |
| PT81691B (pt) | 1988-04-21 |
| ATE77410T1 (de) | 1992-07-15 |
| DK586585A (da) | 1986-06-19 |
| US5605688A (en) | 1997-02-25 |
| FI90990B (fi) | 1994-01-14 |
| KR940010864B1 (ko) | 1994-11-18 |
| DE3544520A1 (de) | 1986-12-18 |
| WO1986003775A1 (en) | 1986-07-03 |
| DK586585D0 (da) | 1985-12-17 |
| NO855078L (no) | 1986-06-19 |
| EP0186098B1 (de) | 1992-06-17 |
| PT81691A (de) | 1986-01-01 |
| KR860005020A (ko) | 1986-07-16 |
| NO176057C (no) | 1995-01-25 |
| NZ214602A (en) | 1991-06-25 |
| ES550043A0 (es) | 1987-04-01 |
| JPH0753596A (ja) | 1995-02-28 |
| AU5132085A (en) | 1986-06-26 |
| HU212836B (en) | 1996-12-30 |
| FI854994A (fi) | 1986-06-19 |
| DE3544520C2 (de) | 1995-07-20 |
| HUT40165A (en) | 1986-11-28 |
| IL77369A (en) | 1993-07-08 |
| IE853194L (en) | 1986-06-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO176057B (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av hunde- og hesteinterferoner og ekspresjonsvektor som koder for disse | |
| FI86559B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av humant immuninterferon, daervid anvaendbara medel och dessas framstaellning. | |
| DK170054B1 (da) | DNA-sekvenser, transformerede værtsorganismer, polypeptid med biologisk aktivitet som gamma-hesteinteferon, fremgangsmåde til fremstilling heraf og farmaceutisk præparat indeholdende polypeptidet | |
| EP0088540A2 (en) | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human immune interferon-like polypeptides | |
| US5004689A (en) | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human gamma interferon-like polypeptides in high yields | |
| CA1340184C (en) | Cloning and characterizing omega-interferon and related genes | |
| US20030065148A1 (en) | Method for expression of human interferon alpha 1 in Pichia pastoris | |
| HRP950157A2 (en) | Polypeptide with human interferon (ifn-gamma) characteristics | |
| DD251789A5 (de) | Verfahren zur Herstellung von Rekombinanten Pferde- und Hunde-Interferonen |