KR940010864B1 - 말 및 개의 인터페론의 제조방법 - Google Patents

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Description

말 및 개의 인터페론의 제조방법

제 1 도는 사람의 인터페론과 하이브리드화하는 말의 인터페론 유전자를 검출하는 방사선 사진.

제 2 도는 λEq-α1 및 pAH50의 제한지도.

제 3 도는 λEq-β6 및 pAH60의 제한지도.

제 4 도는 Eq IFNα1(pAH50 HindⅢ단편)의 서열.

제 5 도는 각종 α-인터페론의 아미노산 서열의 비교.

제 6 도는 각종 β-인터페론의 아미노산 서열의 비교.

제 7 도는 몇몇 동물의 α-인터페론의 아미노산 서열의 비교.

제 8 도는 Eq IFNβ(pAH60 HindⅢ단편)의 서열.

제 9 도는 pRH61 및 pRH63의 제한지도.

제 10 도는 Eq IFN-α2(pRH63)의 서열.

제 11 도는 Eq IFN-α1 및 Eq IFN-α2의 DNA서열의 비교.

제 12 도는 Eq IFN-ω(pRH61 EcoRI단편)의 서열.

제 13 도는 플라스미드 parpATER103의 작제 공정도.

제 14 도는 플라스미드 pAH52, pAH52/2 및 pAH53의 작제 공정도.

제 15 도는 플라스미드 pAH55의 작제 공정도.

제 16 도는 플라스미드 pAH62의 작제 공정도.

제 17 도는 맥시세포에서 단백질을 표지시켜 발현된 말의 인터페론을 검출하는 방사선 사진.

제 18 도는 말의 DNA에서 EqIFN-α, EqIFN-β 및 EqIFN-ω의 하이브리드화하는 서열을 검출하는 방사선 사진.

제 19 도는 각종 인터페론의 아미노산 서열.

제 20 도는 각종 인터페론의 아미노산 서열의 비교.

제 21 도는 사람의 인터페론과 하이브리드화하는 개의 인터페론 유전자를 검출하는 방사선 사진.

제 22 도는 λCa α11-2의 제한지도.

제 23 도는 pAH4 및 pAH2의 제한지도.

제 24 도는 CaIFN α2(pAH2 HindⅢ단편)의 서열.

제 25 도는 CaIFN α1(pAH4 HindⅡ단편)의 서열.

제 26 도는 각종 α-인터페론의 아미노산 서열.

제 27 도는 각종 α-인터페론 아미노산 서열의 비교.

제 28 도는 플라스미드 pAH 4/2의 작제 공정도.

제 29 도는 개의 DNA에서 CaIFN-α 및 EqIFN-ω와 하이브리드화하는 서열을 검출하는 방사선 사진.

제 30 도는λEq-α1,λEq-α16,λEq-α20 및 λEq-β6제한지도.

제 31 도는 EqIFN-ω2(pRH62)의 아미노산 및 DNA서열.

제 32 도는 EqIFN-ω1 및 EqIFN-ω2의 아미노산 및 DNA서열의 비교.

제 33 도는 각종 인터페론의 아미노산 서열의 비교.

제 34 도는 EqIFN-α3(pRH83)의 아미노산 및 DNA서열.

제 35 도는 EqIFN-α4(pRH82)의 아미노산 및 DNA서열.

제 36 도는 각종 인터페론의 아미노산 서열.

제 37 도는 EqIFN-ω2의 아미노산 및 DNA서열.

제 38 도는 EqIFN-α3의 아미노산 및 DNA서열.

제 39 도는 EqIFN-α4의 아미노산 및 DNA서열.

제 40 도는 플라스미드 pRH100의 작제 공정도이다.

본 발명은 말 및 개의 재조합 인터페론의 제조방법에 관한 것이다.

인터페론은 바이러스 감염 또는 다른 자극후에 진핵세포에 의해 분비되어 바이러스 감염으로부터 세포를 보호할 수 있는 단백질이다. 현재, 4종류의 인터페론이 공지되어 있는데, 이들은 α-인터페론, β-인터페론, ω-인터페론 및 γ-인터페론으로 언급된다(이하에서는 IFN-α, IFN-β, IFN-ω, 및 -γ로 약칭함). 이들은 구조 및 효과에 있어서 차이가 있다. 따라서, 인터페론은 면역계의 세포에 대한 조절효과를 가질 수 있거나, 세포분화 및 종양증식에 영향을 미칠 수 있다.

오랫동안 인터페론은 종-특이활성을 가지고 있는 것으로 추정되어 왔다. 그러나, 시험관내 시험에서 소로부터의 IFN제제가 원숭이 및 사람에서 항바이러스 활성을 가질 수 있는 것으로 나타났다(참조 : 문헌32). 이러한 종간의 활성은 유전자 또는 유단백질의 다소간의 동종성(homology)과 관련이 있을 수 있으며, 동물 인터페론이 소량이기 때문에 이러한 가설은 조사할 수 없었다.

종-간의 활성이 밝혀졌음에도 불구하고, 다른 종으로부터의 인터페론을 사용하는 경우에, 치료용으로 허용되지 않는, 항원성과 같은 부작용이 예측될 수 있었다.

그러나, 한편으로는 농업용 동물 및 가축의 사육이 주된 경제적 요인을 구성하기 때문에, 수의사가 사용할 수 있는 다른 종에 대한 인터페론이 필요하다.

또한, 여러 종들로부터의 고도로 정제된 동물 인터페론은 사람에게 적용될 수 있는 모델에 달할 수 있도록 인터페론 활성의 기전을 연구하는 좋은 기회를 제공한다.

동물 인터페론을 사용한 최초의 연구는 천연 세포 물질로부터의 제제를 사용하여 수행되었으며, 이러한 방법으로 제조한 인터페론의 수율 및 순도는 약제학적 조성물의 제조에 부적절하다.

재조합 DNA기술이 개발된 결과, 이종 단백질을 생성하는 미생물을 유도할 수 있다. 사람 인터페론(HU-IFN)도 또한 이 방법으로 제조되며 : 가장 최근에, 소의 α-인터페론 및 소의 β-인터페론 또한 제조되었다.

본 발명은 말 및 개의 인터페론(EqIFN 및 CaIFN) 및 이들의 임의로 N-글리코실화된 유도체에 관한 것이다.

본 발명은 또한 이들 인터페론을 암호화하는 유전자 서열 및 이들 서열을 함유하는 재조합 분자, 즉 서열들을 삽입체로 함유하는 플라스미드와 같은 발현 벡터 및 각종 숙주 유기체 또는 말의 인터페론의 제조를 가능하게 하는 각종 숙주 유기체 또는 배양물에 관한 것이다.

본 발명은 특히, 말의 인터페론 및 이들을 암호화 하는 구조식(I)(Ⅱ)(Ⅲ) 및 (Ⅳ)의 서열, 및 개의 인터페론 및 이를 암호화 하는 구조식(V)의 서열에 관한 것이다 :

[구조식 I]

[구조식 II]

[구조식 III]

[구조식 IV]

[구조식 V]

본 발명의 목적은, 상기 언급한 동물의 조직, 바람직하게는 간으로부터 블라인 및 스태포드(Blin and Stafford)에 의해 기술된 변형 방법(참조 : 문헌 18)으로 고분자 DNA를 분리하고, 이를 특이 엔도뉴클레아제에 의해 통계적으로 단편화시킴으로써 성취될 수 있다. 생성된 다른 크기의 단편들은 그들이 크기에 따라 분별하여 벡터(예 : 람다(λ)-벡터)에 클로닝시키기 위해서 10 내지 23kb단편을 생성하는 것이 바람직하다. 다음, 이들 벡터를 세균, 바람직하게는 이. 콜라이내에서 복제시킨다.

말의 DNA를 엄격하지 않은 조건하에서 성인 인터페론-α2 Arg의 암호화 DNA 및 사람 β-인터페론의 암호화 cDNAV로 선별한다.

개의 DNA를 엄격하지 않은 조건하에 성인 인터페론-α2 ARG의 암호화 DNA를 사용하여 선별한다.

엄격성이 부족하기 때문에, HuIFN-α2 Arg 및 HuIFN-β와는 서열이 실질적으로 다른 클론도 또한 수득된다.

말의 DNA를 사람 α-유전자로 탐침하는 경우에, 소, 돼지 및 사람의 경우에서처럼 서던 분석(Southernanalysis)에 의해 몇개의 밴드가 발견되므로, 말에도 일부류의 α-인터페론 유전자가 존재하는 것이 틀림없는 것으로 추측할 수 있다.

파지 DNA는 하이브리드화 재조합체로부터 제조되며 생성된 클론 Eq-α1, Eq-β6으로부터 제한지도(참조 : 제 2 도 및 제 3 도)가 작성된다. 또한, 사람의 IFN탐침과 하이브리드화하는, 2개의 λ클론, Eq-α16및 Eq-α20이 수득된다. 클론 Eq-α1의 3.2kb HindⅢ단편, 클론 Eq-β6의 4.5kb PvuⅡ단편, 클론Eq-α6의 3.3kb EcoRI단편 또는 클론 Eq-α20의 2.2kb EcoRI단편을 벡터(예 : pUC9)에 아클론화(sub-cloned)시킨 다음 숙주 유기체(예 : 이. 콜라이 JM101)에 형질전환시킨다. 정확한 표현형을 분리하면, 말의 인터페론을 암호화하는 서열을 삽입체로 함유하는 플라스미드 pAH50, pAH60, pRH63 및 pRH61이 수득된다. pRH61 및 pRH63에 대한 제한지도는 제 9 도에 도시하였다.

플라스미드의 삽입체를 "숏건법(shotgun method)"을 사용하여 생거(Sanger)에 의해 기술된 디데옥시 방법(참조 : 문헌 23)으로 서열분석한다. 변형된 컴퓨터 프로그램으로 이들 삽입체의 부분서열을 합하여 전체서열을 형성한다(참조 : 제 4,8,10 및 12도).

클론 Eq-α1로부터의 Eq-IFN-αr유전자에 대한 최장의 개방 판독 프레임은 184개의 아미노산을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한다. 다른 종의 공지 α-인터페론과 상당한 동종성을 갖는다는 것이 주목할만하다. 사람, 소 및 쥐의 α-인터페론의 경우에서처럼, 이러한 말의 α-인터페론은 놀라웁게도 단지 161개의 아미노산만을 갖는 성숙한 단백질의 앞에 존재하는 23개의 아미노산을 함유하는 소수성 시그날 펩타이드를 함유한다(Eq-IFN-α1).1, 29, 99 및 139의 위치에 존재하는 4개의 시스테인 그룹은 말, 소, 마우스, 래트 및 사람의 종들 사이에서 정확히 보전된다(참조 : 제 7 도). 제 166번의 아미노산까지 계속해서 전사시키지 않고 제 159번 아미노산 이후부터 정지 코든 TGA까지 염기를 삭제함으로써 이 말의 α-인터페론을 161개의 아미노산으로 단축시킬 수 있었다. 이러한 발견은 성숙한 말의 인터페론 α1에 대한 폴리 펩타이드쇄가 161개의 아미노산의 길이를 가질 수 있으나, 166개 이하의 아미노산을 갖는 다른 형태가 존재할 수도 있음을 보여준다. 이들 펩타이드도 물론 본 발명의 또 다른 목적대상이다.

놀라웁게도, 아미노산 서열을 한쌍씩 비교함으로써, 말의 인터페론 α1이 소 α-인터페론(57 내지 67%), 래트 α-인터페론(61%) 또는 마우스 α-인더페론(54 내지 59%)에 대해서 보다, 사람 α-인터페론(71 내지 77%)에 대해 더 큰 동종성을 나타냄을 알 수 있었다(참조 : 제 5 도). 다른 속의 α-인터페론간의 동종성은 다른 종간의 동종성 보다 상당히 크다(예 : 사람 : 77 내지 100%, 소 91 내지 99%).

클론 Eq-α16으로부터 Eq-IFN-α 유전자에 대한 최장의 개방 판독 프레임도 또한 184개의 아미노산(시그날 펩타이드 : 23개의 아미노산, 성숙한 단백질 : 161개의 아미노산)을 갖는 폴리펩타이드로를 암호화한다.

클론 pRH63의 DNA서열이 단백질-암호화 영역에서 클론 pAH50의 DNA서열과 매우 유사하다는 사실은 유전자의 발현에 이용될 수 있음을 의미한다(참조 : 실시예 M : 제 11 및 15도). 클론 pRH63으로부터의 인터페론은 Eq-IFN-α1(클론 pAH50으로부터의)과의 동종성이 크기때문에, Eq-IFN-α2라고 칭한다. Eq-IFN-α1과 비교되는, 성숙한 Eq-IFN-α2는 C-말단에 단지 2개의 다른 아미노산 그룹을 함유하는한편, Eq-lFN-α2에서 151위치에 존재하는 Ser-Cys의 상호 교환으로, 어떠한 다른 인터페론에서도 관찰되지 않았던 위치에 제 5의 시스테인 그룹이 존재한다(참조 : 제 19 도).

달리, Eq-IFN-α1에 관하여 언급한 것은 또한 Eq-IFN-α2에 대해서도 적용된다.

Eq-α20의 DNA단편은 172개의 아미노산을 갖는 단백질 및 23개의 아미노산을 갖는 소수성 시그날 펩타이드를 암호화하는 서열을 함유한다. 성숙한 단백질의 78 내지 80번 위치에 N-글리코실화 가능 부위Asn-Thr-Thr이 존재하는데, 이는 Eq-IFN-β, Hu-IFN-β, Mu-IFN-β, Mu-IFN-α1, 2, 4, 5, 6의 위치와 정확히 상응한다(참조 : 제 19 도).

이 도면의 단백질 서열은 개개의 인터페론간에 최대의 동종성을 갖도록 배열되었다. IFN-α 및 IFN-β서열을 비교하기 위해서, IFN-β를 3개의 아미노산으로 대치시키고 갭(gab)을 도입시켰다. 제 20 도에서의 아미노산 서열의 쌍과 쌍의 비교는 이러한 배열로부터 시작하여 단백질의 공통되는 최장 길이에 걸쳐 수행되었다.

제 19 및 20 도는 클론 pRH61의 DNA서열에 의해 암호화하는 단백질이 타입 I 인터페론(α- 및 β-IFN)과 관련된다는 것을 나타낸다. 172개의 아미노산의 특성, 78번 위치의 글리코실화 위치의 특성, 다른종(사람, 소, 말)들 사이 및 이들의 더 긴 인터페론과 특정속에 포함되는 α-인터페론 사이에서 이러한 부류의 인터페론의 대략 똑같은 동종성, 및 클론 pRH61로부터의 α-인터페론 및 탐침과 하이브리드화하는 DNA단편의 다른 세트(참조 : 제 18도)로 인하여, 클론 pRH61의 삽입체가 ω-인터페론(참조 : 문헌 33)을 칭하는 새로운 부류의 타입 I 인터페론에 속한다는 것을 추정할 수 있다. 이러한 명칭은 카프론 등(Capron)(참조 : 문헌 34)등에 의해 사용된 것보다 덜 혼동스럽다 : 타입 I, 클레스 Ⅱ 인터페론은 타입 Ⅱ 인터페론(IFN-γ)와 혼동을 일으킬 수 있다.

말의 β-인터페론의 서열은 α-인터페론의 서열과 유사하게 결정된다. β-IFN유전자에 대한 최장 개방판독 프레임은 186개의 아미노산을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 한편, 다른 종의 공지된 β-인터페론과의 동종성은 또한 주목할 만한다. 사람의 β-인터페론, 소의 세가지 β-인터페론 및 쥐의 β-인터페론에서와 같이, 말의 β-인터페론은 21개의 아미노산을 갖는 소수성의 시그날 펩타이드를 갖는다.

놀랍게도, β-인터페론에서의 아미노산 서열의 쌍과 쌍의 비교는, 말의 β-인터페론이 소(50 내지 55%) 또는 마우스의 β-인터페론(44%)에서 보다 사람 β-인터페론(59%)에 훨씬 더 동종성이 있음을 보여준다(참조 : 제 6 도).

다른 한편, 말과 사람의 β-인터페론 사이의 놀랍도록 높은 동종성에도 불구하고, 소의 세가지 β-인터페론에서와 같이, 사람의 β-인터페론에서 119번 위치에 존재하는 아미노산이 말의 β-인터페론에는 존재하지 않는다.

말의 β-인터페론은 2개의 N-글리코실화 기능 부위를 수반한다 : 즉 성숙한 단백질의 80번 위치(사람 및마우스의 β-인터페론에서와 같은, Asn-Gln-Thr) 및 115번 위치(Asn-Thr-Thr), 소의 β-인터페론에서 2개의 가능한 N-글리코실화 부위는 110번 위치(Asn-Phe-Thr 또는 Asn-Ser-Phe) 및 152번 위치(Asn-Val-Ser 또는 Asn-Phe-Ser)에 존재한다.

소 및 사람에서와 같이 세개의 시스테인 그룹은 정확히 동일하게 위치한다(사람의 경우, 17, 31 및 140 또는 141번 위치).

개의 DNA를 사람의 α유전자로 조사할 경우에, 여러 밴드가 소, 돼지 및 사람에서와 똑같이 발견되는데, 이는 개에 일부류의 α-인터페론 유전자가 있음을 의미한다.

파지 DNA는 하이브리드화 재조합체로부터 제조되고, 제한지도는 수득되는 클론 Ca α 11-2로부터 작성된다(참조 : 제 22 도). 이 클론의 3.7kb SmaI단편 및 2.4kb Smal단편을 벡터(예 : pUC9)내에 이콜론화시킨후, 미생물(예 : 이. 콜라이 JM101)을 형질전환시킨다. 정확한 표현형을 분리하여, 삽입물로서 개의 인터페론을 암호화하는 서열을 함유하는 두개의 플라스미드 pAH2 및 pAH4를 수득한다.

이들 플라스미드내의 삽입물을 "숏건법"를 사용하여 생거(참조 : 문헌 23)에 의하여 기술된 디데옥시 방법에 따라 서열분석한다. 이들 삽입물의 부분서열을 변형된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결합시켜 전체 서열을 만든다(참조 : 제 24 도 및 제 25 도).

놀랍게도, 양 플라스미드 서열의 최장 개방 판독 프레임은 187개의 아미노산을 갖는 전체적으로 동일한 폴리펩타이드를 암호화한다. 다른 종의 공지된 α-인터페론과의 상당한 동종성이 주목할 만하다. 단백질-암호화 서열은 정확하게 동일하다 : 5'-비-해독 영역의 170개의 염기중 단지 3개의 뉴클레오타이드(1.8%)만이 다르다(참조 : 문헌 28). 사람, 소 및 쥐의 α-인터페론에서와 같이, 개의 α-인터페론은, 놀랍게도 단지 164개의 아미노산을 갖는 성숙한 단백질의 앞에 있는 23개의 아미노산을 갖는 소수성 시그날 펩타이드를 함유한다. 다른 α-인터페론 유전자의 단백질 서열과 비교하여, 개의 α-인터페론은 성숙한 단백질의 119 및 120번 위치에 있는 2개의 아미노산이 결여되어 있다(참조 : 제 26 도).

놀랍게도, 성숙한 개의 α-인터페론은 6개의 시스테인 그룹을 갖는 이미 공지된 α-인터페론이므로 세개의 분자내 디설파이드 결합이 가능하다.

이들 시스테인 그룹중 1번, 29번, 99번 및 139번 위치에 존재하는 4개는 개, 소, 마우스, 래트 및 사람에서와 정확히 동일하다. 86번 위치의 시스테인은 CaIFN-α1, CaIFN-α2, MuIFN-α1, MuIFN-α2, RaIFN-α 및 HuIFN-αD사이에서 보존된다.

놀랍게도, 개의 α-인터페론은 78번 위치(Asn-Met-Thr) 및 133(Asn-His-Ser)번 위치에 2개의 N-글리코실화 가능 부위를 갖는다. 78번 위치의 글리코실화 부위는 MuIFN-α1 및 2(Asn-Ala-Thr)에서의 부위와 일치하고 : 이는 또한 사람 및 마우스에서 80번 위치(Asn-Glu-Thr)의 β-인터페론의 글리코실화 부위와 일치한다.

아미노산 서열의 쌍 비교로부터 개의 α-인터페론은 각기 사람의 α-인터페론과 52 내지 57%, 소의α-인터페론과 54 내지 55%, 래트와 α-인터페론과 50% 및 마우스의 α-인터페론과 48 내지 51%의 동종성을 갖고 있음을 알 수 있다(참조 : 제 27 도).

이러한 견지에서, 본 발명에 따른 인터페론은 상세히 기술된 성숙한 인터페론 뿐만아니라 말/개의 IFN활성을 본질적으로 변경시키지는 않는 이들 폴리펩타이드의 변형물임이 언급되어야 한다. 이러한 변형에는, 예를 들어 N- 또는 C-말단에서 분자의 단축, 아미노산의 다른 그룹에 의해 치환, 분자의 불활성 또는 활성인 다른 분자에의 화학적 또는 생화학적 결합이 포함된다. 후자의 변형은 예를 들어 본 발명에 따른 하나 이상의 인터페론 및/ 또는 공지의 α- 또는 β-인터페론으로부터의 하이브리드 분자에 관한 것일 수 있다.

따라서 본 발명은 본 발명에 따른 인터페론을 특히 암호화하는 유전자 서열뿐만 아니라, 돌연변이, 분해, 전위 또는 부가에 의해서 쉽게 통상적으로 수득될 수 있는 변형물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 인터페론을 암호화하며(즉 본문에 기술한 생물학적 활성 스팩트럼을 갖는) 이와 비교시 축퇴된(degenerate) 모든 서열도 포함되며 : 본 분야의 전문가는 암호화 영역의 DNA서열을 축퇴시킬 수 있다. 마찬가지로 본 발명에 따른 인터페론의 활성 스펙트럼을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하고 엄격한 조건(예를 들어 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상의 동종성을 선택하는 조건)하에 나타낸 서열( 또는 이의 일부)과 하이브리드화 하는 모든 서열도 포함된다.

하이브리드화는 65℃에서 6×SSC/5× 덴하르트의 용액(Denhardt's Solntion)/0.1% SDS중에서 수행한다. 엄격한 정도는 세척단계에서 결정한다. 따라서 대략 85%이상의 동종성을 갖는 DNA서열의 선택하기 위한 적합한 조건은 0.2×SSC/0.01%, SDS/65℃이고, 대략 90%이상의 동종성을 갖는 DNA서열을 선택하기 위한 적합단 조건은 0.1×SSC/0.01% SDS/65℃이다.

본 발명에 따른 인터페론 유전자는 고수율을 초래하는 조건하에 어떤 유기체에도 도입시킬 수 있다. 적합한 숙주 및 벡터는 본 분야의 전문가에게 공지되어 있다[참조 : 유럽 특허원 제0,093,619호].

원핵 세포가 발현을 위해서 특히 바람직하다[예 : 이. 콜라이 K12, 균주 294(ATCC No. 31,446) 또는 이.콜라이 X1776(ATCC No.31,537)]. 상기한 균주 이외에 이.콜라이 W3110(F, Lambda-기본 유기 영양, ATCC No.27325), 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스, 살모넬라 타이피뮤륨(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens)와 같은 엔테로 박테리아과 및 다양한 슈도모나드(Pseudomonads)를 사용할 수도 있다.

일반적으로 숙주세포와 부합하는 종으로부터 유래하는 레플리콘(replicon) 및 조절서열을 함유하는 플라스미드 벡터를 이들 숙주와 함께 관련시켜 사용할 수 있다. 이 벡터는 보통 복제 부위 외에도, 형질전환된 세포를 표현형에 의해 선택할 수 있게하는 인자 서열을 수반한다. 예를 들어 이.콜라이는 보통 이.콜라이 종으로부터 유래하는 플라스미드인 pBR322로 형질전환시킨다[참조 : Bolivar, et al., Gene 2, 95(1977)]. pBR322는 암피실린 및 테트라사이클린 내성 유전자를 함유하고, 따라서 형질전환된 세포를 확인하는 간단한 수단을 제공한다. pBR322 플라스미드 또는 다른 플라스미드는 또한 그 자체의 프로모터를 함유하거나, 이들이 그 자신의 단백질을 발현시키기 위해 미생물 유기체에 의해서 사용될 수 있는 프로모터를 함유하도록 변형되어야 한다. 재조합 DNA의 제조에 가장 빈번하게 사용되는 프로모터는 β-락타마제(페니실리나제) 및 락토즈 프로모터 시스템[참조 : Chang et al., Nature. 275, 615(1978) : Itakura et al., Science 198, 1056(1977) : Goeddel et al., Nature, 281, 544(1979)] 및 트립토판(trp) 프로모터 시스템[참조 : Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057(1980) : EP-A-0,036,776]이다. 이들이 가장 통상적인 프로모터이며, 다른 미생물의 프로모터도 개발사용되어 왔다. 본 발명에 따른 인터페론의 유전자 서열은 예를 들어 박테리고다시 람다의 좌측 프로모터(P₁)의 제어하에 사용할 수 있다. 이 프로모터는 특히 강력하고 또한 조절 가능한 것으로 알려진 프로모터의 일종이다. 조절은 인접 제한 절단 부위가 알려져 있는λ억제인자(repressor)에 의해서 이루어질 수 있다.

상기한 억제 유전자의 온도-민감성 대립인자를 완전한 IFN-ω서열을 함유하는 벡터내에 삽입시킬 수 있다. 온도가 42℃로 증가하면 억제인자는 탈활성화 되고 프로모터는 이의 최대 농도까지 발현된다. 이러한 조건하에 생성된 총 mRNA는 이의 새로운 합성 리보헥산중 P₁프로모터로부터 유래하는 약 10%를 함유하는 세포를 수득하는데 충분해야 한다. 이렇게하여 작용성 IFN서열의 λP₁프로모터로부터 다양한 거리에 있는 리보솜 결합 부위 부근에 위치하는 클론 뱅크를 수립할 수 있다. 이어서 이들 클론을 체크하고 최고수율을 갖는 클론을 선택할 수 있다.

본 발명에 따른 단백질을 암호화하는 서열의 발현 및 해독은 또한 형질전환되지 않은 형태의 유기체에 대해 "동종인(homologous)"것으로 간주될 수 있는 다른 조절 시스템의 조절하에도 수행할 수 있다. 따라서 예를 들어 락트즈-의존성 이.콜라이로부터의 염색체 DNA는 효소인 β-갈락토시다제를 분비시킴으로써 락토즈 분해를 가능케하는 락토오스 또는 1ac-오페론을 함유한다.

lac-조절 성분은 이.콜라이에 감염성인 박테리오파지 λ-plac5로부터 수득할 수 있다. 이 파지의 1ac-오페론은 동일한 세균종을 형질도입(transduction)시켜 얻을 수 있다. 본 발명에 따르는 방법에서 사용될 수 있는 조절 시스템은 유기체에 대해 고유한 플라스미드 DNA로부터 유래될 수 있다. lac-프로모터-오퍼레이터(operator)시스템은 IPTG에 의해 유도될 수 있다.

기타의 프로모터-오퍼레이터 시스템 또는 이의 부분을 동일하게 우수한 효과로 사용할 수 있다 : 예를 들면, 아라비노즈 오퍼레이터, 콜리신 E₁-오퍼레이터, 갈락토즈오퍼레이터, 알카리 포스파타제 오퍼레이터, trp오퍼레이터, 크실로즈-A-오퍼레이터, tac -프로모터 등.

원핵세포외에, 효모배양물과 같은 진핵세포 미생물을 사용할 수도 있다. 사카로마이세스 세리비지애(Saccharomyces cervisiae)가 가장 흔히 사용되는 진핵 세포 미생들이며, 기타의 여러 종도 일반적으로 가능하다. 사카로마이세스에서의 발현에는 통상적으로 플라스드 YTp₇이 사용되며(참조 : Stinchcomb et al., Nature 282, 39(1979) ; Kingsman et al., Gene 7, 141(1979) ; Tschumper et al., Gene 10, 157(1980)), 플라스미드 YEp1/참조 ; Bwach et al., Gene 8, 121-133(1979)) 또한 통상적으로 사용된다. 플라스미드 YRp₇은 트립토판-유리 배지에서 성장할 수 없는 효모 변이주에 대해 선택적 표지물을 부여하는 TRP1유전자를 함유한다(ATCC No.44076). 효모 숙주 게놈의 특정인 TRP1결손의 존재는, 형질전환을 검정(트립토판이 없이 배양할 수 있다)하는데 기여한다. 이러한 상황은 LEU-2-마이너스 돌연변이체를 보조하기에 사용될 수 있는 효모 유전자 LEU2를 함유하는 플라스미드 YEp₁₃에서도 매우 유사하다. 효모 벡터에 적합한 프로모터 서열은 ADH1[참조 : Ammerer G., Methods of Enzymology 101, 192-201(1983)], 3-포스포글리세레이트-키나제 [참조 : Hitzeman et al., J.Biol.Chem.255, 2073(1980)] 또는 에놀라제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트-데하이드로게나제, 헥소키나제, 피루메이트 데카복실라제,포스포프럭토키나제, 글루코즈-6-포스페이트 아이소메라제, 포스포글루코즈-아이소메라제 및 -글루코키나제와 같은 다른 당분해 효소[참조 : Kawasaki and Fraenkel, BBRC 108, 1107-1112(1982)]의 유전자의 5'-플랭킹(flanking)영역을 함유한다. 적합한 발현 플라스미드를 작제함으로써, 이들 유전자와 결합된 종결 서열도 또한 m-RNA의 폴리아데닐화 및 종결을 예상하기 위해, 발현될 서열의 3'-말단 부위에서 발현벡터내에 삽입시킬 수도 있다.

또한 성장조건에 의해 조절되는 전사의 이점을 갖는 다른 프로모터는 알콜 데하이드로게나제-2, 이소시토크롬 C, 질소대사와 결합된 산포스파타제 분해효소, 상기 언급된 글리세르알데하이드-3-포스페이트-데하이드로게나제 및, 말토즈와 갈락토즈의 대사과정에 관여하는 효소들에 대한 유전자의 프로모터 부위이다. 효모교배형 유전자좌(yeast Mating Type Locus)에 의해 조절된 프로모터, 예를들면 유전자 BARl,. MFα1, STE2, STE3 및 STE5의 프로모터는 온도 의존성 sir돌연변이의 사용에 의한 온도조절 시스템에 사용될 수 있다[참조 : Rhine Ph.D.in Thesis, University of Oregon. Eugene, Oregon(1979),Herskowitz and Oshima, the Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, part I, 181-209(1981), Cold Spring Harbour Laboratory]. 이러한 돌연변이는 효모의 휴지 교배형 카세트의 발현에 영향을 미치며, 따라서 간접적으로 교배형 의존성 프로모터에 대해서도 영향을 미친다. 그러나 일반적으로는 효모-화합성(compatible)프로모터, 복제기원 및 말단 서열을 함유하는 어떤 플라스미드 벡터라도 적합하다.

미생물 이외에 다세포 유기체의 배양물도 또한 숙주 유기체로 적합하다. 이론적으로는 이들 배양물은 이들을 척추동물 배양물 또는 무척추동물 배양물중 어느것으로 부터 수득했더라도 사용될 수 있다. 그러나 최대의 관심사는 척추동물의 세포인데, 이는 최근에 배양물(조직 배양물)중에서 척추동물세포의 증식이 통상적 방법이 되었기 때문이다[참조 : Tissue Culture, Academic Press, Editors Kruse and Patterson,(1973)]. 이러한 종류의 유용한 숙주세포주의 예로는 VERO 및 HeLa세포, 챠이니즈 햄스터 난자(CHO)세포 및 W138, BHK, COS-7 및 MDCK세포주가 포함된다. 이들 세포를 위한 발현 벡터는 일반적으로 특정한 필수적인 리보좀 결합부위, RNA스플라이싱(Splicing), 폴리아데닐화 부위 및 전사 말단 서열과 함께,(필요한 경우에)복제부위 및 발현될 유전자의 전방에 위치하는 프로모터를 함유한다.

포유동물 세포에서 사용하는 경우, 발현 벡터내의 조절 기능은 주로 바이러스 물질로부터 수득된다. 예를 들어, 일반적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마아데노바이러스 2, 특히 주로는 시미안(simian)바이러스 40(SV40)으로부터 유래한다. SV40의 초기 및 후기 프로모터가 특히 유용한데, 이는 이들 프로모터가 모두 SV40의 바이러스 복제부위를 또한 함유하는 단편으로써 바이러스로부터 용이하게 수득될 수 있기 때문이다[참조 : Fiers et al., Nature 273,113(1978)]. 또한, 바이러스 복제부위내에서 HindⅢ 절단부위로부터 Bgl 1절단부위까지의 약 250bp길이의 서열을 함유하는 경우, SV40의 더 작은 단편이나 더 큰 단편도 사용할 수 있다. 또한 프로모터 또는 조절서열이 숙주세포계와 화합성이 있는 경우, 통상적으로 목적하는 유전서열에 결합된 프로모터 또는 조절서열을 사용할 수 있으며 이것이 종종 바람직하다.

복제부위는, 예를 들어 SV40 또는 다른 바이러스성 공급원(예 : 폴리오마, 이데노, VSV, PBV 등)으로부터의 외인성 부위를 삽입시키기 위해 상응하는 벡터 구조에 의해 제공되거나, 숙주세포의 염색체 복제 메카니즘에 의해 제공될 수 있다. 벡터가 숙주세포 염색체내에 통합되는 경우, 숙주세포의 염색체 복제 메카니즘에 의해 제공된 복제부위가 일반적으로 만족스럽다.

그러나 유전자를 바람직하게는 발현 플라스미드 pBR103[참조 : E, Rastle-Dworkin et al., Gene21,237-248(1983) 및 EP-A-O 0,115,613-1983년 12월 20일자로 DSM에 기탁번호 DSM2773으로 기탁됨] 또는 플라스미드 parpER33(EP-A-O 0,115,613)내에서 발현시킬 수 있는데, 이는 이들 벡터가 클론화된 유전자에 대한 높은 발현율을 나타내는 조절인자를 모두 함유하기 때문이다.

발현 플라스미드 parpER33으로부터 출발하여, 이.콜라이내에서 증가된 플라스미드 안정성을 제공하는 "par"서열 및 트립토판 프로모터-오퍼레이터 서열을 인공적 리보좀 결합부위와 함께 플라스미드 벡터pAT153내에 삽입시킨다. pAT153은 플라스미드 pBR322의 단축된 유도체로, DNA의 유동성에 필요한 단편이 없는 것이다(참조 : 문헌 36).

플라스미드 parPATER103의 제조방법이 제 13 도에 도시되어 있다. 플라스미드 parPER33을 HindⅢ로 완전히 절단하고, EcoRI로 부분적으로 절단한후, 생성된 0.47kb길이의 DNA단편을 아가로즈겔로부터 분리하여 정제하고, EcoRI 및 HIndIII로 2회 절단한 pAT153과 결합시킨다. 이.콜라이 HB101를 형질전환시킨후 수득된 여러가지 제한효소로 분해하여 확인된 목적하는 구조의 플라스미드를 parpATER103으로 칭한다. 이 플라스미드는 플라스미드 pAT153의 복제 기원 부위 및 임피실린 내성 유전자, 및 이.콜라이 내에서의 안정화에 유효한 par서열 및 유전자의 효율적인 발현에 사용될 수 있는 트립토판 프로모터-오퍼레이터 영역 및 리보좀 결합부위를 함유한다.

발현 플라스미드 pAH52, pAH52/2 및 pAH53의 제조 및 그의 예비단계가 제 14 도에 도시되어있다. 발현 플라스미드의 제조를 위해서, 플라스미드 pAH50을 HindⅢ로 분해하고, 완전한 EqIFN-α1유전자를 함유하는 4.2kb 길이의 DNA단편을 분리하여 정제한다. HIndⅢ단편의 말단은 SphI링커를 가지고 있다. 그후 DNA를 SphI으로 분해하고, 페놀 및 클로로포름으로 추출한후, 에탄올로 침전시킨다. DNA를 리가제로 환형으로 만들어, 이.콜라이 HB101를 형질전환시킨다. 목적하는 구조의 플라스미드를 pAH51이라 칭한다. 이 플라스미드는 단축된 3'-비해독 영역 및 추가의 SphI절단부위와 함께 EqIFN-α1유전자를 함유한다.

성숙한 말의 α-인터페론에 대한 DNA서열을 정확한 거리에서 최종 구조물의 프로모터 서열에 결합시키기 위해서, 플라스미드 pAH50을 PvuⅡ로 절단하여 분리한 0.4kb 길이의 DNA단편을 사용한다. 서열 5'-TGTGACCTGCCTCAC를 갖는 합성 15-머(mer) 올리고뉴클레오타이드를 폴리뉴클레오타이드 키나제로 처리한다. 이것은 클론 pAH50으로부터 성숙한 EqIFN-α1의 제 1의 5개의 아미노산을 암호화하는 서열을 함유한다. 15-머를 0.5kb PvuⅡ단편과 혼합하고, DNA이본쇄를 변성시킨다. 일본쇄에 결합된 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 클레노우(klenow) 단편으로 연장시킨다. 3'-돌출기가 안전하게 제거되는 것을 확실히 하기 위해, DNA를 T4 DNA폴리머라제와 함께 배양한다. 평활말단을 갖는 생성된 DNA를 페놀 및 클로로포름으로 추출하여 침전시킨다. 이 DNA단편에, 서로에 대해 상보적인 2개의 포스포릴화된 올리고뉴클레오타이드, 즉 12머 5'-TGCTTAAAGATG 및 8머 5'-CATCTTTA(유럽 특허 원 제 83112812.9호)의 혼합물을 연결시킨다(이 혼합물은 HindⅢ 절단부위와 해독 개시 코돈 ATG를 제공한다). 두 올리고뉴클레오타이드를 리가제를 사용하여 DNA단편에 연결시킨다. 효소를 불활성시킨후, 수득된 DNA를 HindⅢ 및 BglⅡ로 절단하고 약 190bp 길이의 DNA단편을 분리하여 정제한다. 생성된 DNA단편을 HindⅢ 및 BglⅡ로 이중 절단한 pAH51벡터와 연결시킨후, 이.콜라이 HB101를 형질전환시킨다. 수득된 65개의 콜로니중에서, 목적하는 제한 패턴을 갖는 4개의 플라스미드로부터 HindⅢ/BamHI DNA단편을 분리하고, 이 DNA단편을 생거 방법에 의해 서열분석하여 정확하게 필요한 서열을 갖는 2개의 클론을 찾아낸다. 이 플라스미드를 pAH51/2라 칭한다. 이는 선행하는 해독 개시 코돈 ATG 및 HindⅢ 절단부위와 함께 성숙한 EqIFN-α1에 대한 서열을 함유한다.

발현 플라스미드 pAH52 및 pAH52/2를 제조하기 위하여, 플라스미드 pAH51/2를 SphI 및 HindⅢ로 2회 절단하고, 생성된 1.0kb길이의 DNA단편을 아가로오스겔로부터 분리시킨후, HindⅢ 및 SphI으로 2회 절단한 플라스미드 parpATER103과 연결시킨다. 이.콜라이 HB101을 형질전환시킨후 수득한 목적하는구조의 플라스미드를 pAH52로 칭한다. 이것은 성숙한 EqIFN-α1의 발현을 유도할 수 있는데 필요한 모든 정보를 함유한다. 이와 유사하게, 플라스미드 pAH52/2는 HindⅢ 및 BamHI로 이중절단한 pAH51/2로부터 및 HindⅢ/BamHI로 절단한 parpATER103으로부터 제조한다. 이 발현 플라스미드는 pAH52보다 약 0.2kb가 길며 부가적으로 하나의 BamHI절단부위를 갖는다.

이.콜라이에서 성숙한 EqIFN-α1을 생성하기 위한 사실상 가장 작은 발현 플라스미드(여기에서, 트립토판 프로모터, 인터페론 유전자, 암피실린 내성 유전자 및 복제 기원은 한 방향으로 배향한다)를 플라스미드pAH52 및 pBR322로부터 제조한다 : 즉 pAH53, pAH52를 SphI 및 EcoRI로 절단하고, 효소를 70℃에서 불활성화시키고, 이어서 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP를 클레노우(Klenow) 단편과 함께 가한후 DNA말단을 평활말단으로 만든다. DNA단편을 아가로오스 겔상에서 크기에 따라 분별시키고, 프로모터 및 인터페론 유전자를 함유하는 길이 1.1kb의 단편을 분리시킨다. pBR322를 EcoRI 및 PvuⅡ로 이중분해시키고, 말단을 상기 기술된 바와 같이 클레노우 단편으로 평활말단으로 만든 다음, 송아지 장내 포스파타제로 탈인산화시킨다. 2.4kb길이의 DNA단편을 아가로오스 겔로부터 분리시킨다. 이렇게하여 수득된 2개의DNA단편을 T₄DNA리가제로 연결시키고 이.콜라이 HB101로 형질전환시킨다. 이렇게하여 수득된, 2개의 EcoRI인지 부위를 수득한 플라스미드를 pAH53으로 표기한다.

EqIFN-α1(pAH50) 및 EqIFN-α2(pRH63, 참조 : 제 11 도)에 대한 유전자의 동종성이 크다는 관점에서, 발현 플라스미드 pAH52/2 및 λ아클론 pRH63(참조 : 제 15 도)으로부터 EqIFN-α2에 대한 발현 플라스미드를 제조할 수 있다. 성숙한 인터페론을 암호화하는 영역에서 통상적인 BglII부위까지 단지 2개의 염기에서 차이가 있지만 아미노산 코드가 축퇴되어 있기 때문에 이 차이는 아미노산에서 차이를 일으키지 않음으로, 발현 플라스미드 pAH52/2에서 EqIFN-α1에 대한 유전자의 첫번째 부분을 또한 EqIFN-α2의 발현을 위해 사용할 수 있다. pRH63을 BglⅡ 및 BamHI으로 2회 절단하고, 64번 아미노산으로부터 EqIFN-α2에 대한 암호화 서열을 함유하는 1.0kb길이의 DNA단편을 아가로즈 겔로부터 분리시킨다. pAH52/2를 또한 BglⅡ 및 BamHI으로 절단하고, 말단을 송아지 장내 포스파타제로 탈인산화시킨후, 생성된 2개의 DNA단편의 큰것을 아가로오스 겔로부터 수득한다. 이 DNA단편은 플라스미드 벡터 부분, 프로모터 및 성숙한 인터페론의 제 1의 63개의 아미노산에 대한 암호화 서열을 함유한다. 기술된 2개의 DNA단편을 리가제로 연결시키고, 이.콜라이 HB101에 형질전환시킨다. 이렇게 하여 수득한, 정배향으로 삽입물을 함유하는 플라스미드(BamH1 및 BglⅡ로 절단할 수도 있다)를 pAH55로 칭한다. 이 플라스미드는 이.클라이에서 성숙한 EqIFN-α2를 발현시킬 수 있다.

EqIFN-β에 대한 발현 플라스미드를 제조하기 위하여, 먼저 플라스미드 pAH60으로부터의 말의 DNA삽입물을 3'말단에서 단축시키고, 이어서 이것을 세균의 프로모터에 의해 성숙한 EqIFN-β단백질이 발현되도록 처리한다. 그 공정이 제 16 도에 도식적으로 나타나있다. pAH60을 HgiAI로 절단시킨다. 효소를 불활성화시킨후, 3'-돌출한 DNA말단을 T₄DNA폴리머라제 (dATP, dGTP, dCTP, dTTP를 가하여 ) 로 평활말단으로 만든다. SphI 링커(linker)를 평활말단에 연결시키고, 생성된 DNA를 SphI로 및 HindⅢ로 절단한다. 생성된 1.85kb 길이의 DNA단편을 아가로오스겔로부터 분리시키고, HindⅢ 및 SphI으로 이중절단한 플라스미드 parpATER103과 연결시킨다. 이.콜라이 HB101을 형질전환시킨후 수득한 목적하는 플라스미드를 갖는 클론을 pAH61로 칭한다. 이 플라스미드는 추가로 발현 플라스미드의 작제를 위한 중간단계를 구성한다. pAH61을 BamHI 및 Sal I으로 이중 절단하고, 생성된 1.3kb길이의 DNA단펀을 아가로즈 겔로부터 분리시키고, 정제하여 BamHI/Sal I로 이중 분해시킨 M13mp9파지 DNA와 연결한다. 이.콜라이 JM101을 형질전환시킨후, 일본쇄의 파지 DNA를 재조합 M13파지(Ml3pAH61)로부터 수득할 수 있다. 이 일본쇄 DNA를 인산화된 15머 올리고뉴클레오타이드 5'-GTGAACTATGACTTG와 혼합하고, 95℃로 가열한 다음, 서서히 주변온도로 냉각시킨다. 올리고뉴클레오타이드는 β-인터페론 서열의 제 1염기에 정확하게 결합한다. 15머-프라이머(primier)로부터 출발시킨 각각의 본쇄를 기초로하여 제 2본쇄의 합성을 dATP, dGTP, dCTP, dTTP 및 클레노우 단편을 가한후 수행한다. DNA를 추출하고, 침전시킨다. 어떠한 잔류하는 일본쇄 DNA도 S1-뉴콜레아제로 분해시킨다.

12머 및 8머 올리고뉴클레오타이드 5'-AGCTTAAAGATG 및 5'-CATCTTTA의 혼합물을 이 처리에 의해 평활말단으로 만든 DNA상에 연결시키고 생성된 DNA를 HindⅢ 및 SphI으로 절단한다. 목적하는1.1kb길이의 DNA단편을 아가로오스 겔로부터 분리시키고, HindⅢ/SphI 으로 이중절단한 플라스미드 parpATER103과 결합시킨다. 이.콜라이 HB101을 형질전환시킨후, 54개의 콜로니를 수득한다. 이로부터 분리된 9개의 플라스미드 DNA로부터, 1.3kb길이의 EcoRI/SalI단편을 분리시키고, 생거 방법에 의해 서열분석한다. 이로부터 수득한 목적하는 서열을 갖는 플라스미드를 pAH62로 칭한다. 이 플라스미드는 이.콜라이에서 성숙한 EqIFN-β단백질을 효과적으로 발현시킨다. 성숙한 β-IFN유전자의 제 1염기(G)를 결실시킨 플라스미드를 pAH62deltaG1으로 칭한다. 이 플라스미드는 다음의 ATG(성숙한 β-IFN에서 아미노산 19에 상응한다)에서 해독을 시작하여 아미노 말단에서 단축된 β-IFN의 발현을 허용하는데, 이것은 비록 생략되지 않은 단백질보다는 항바이러스 활성이 매우 적지만 놀랍게도 항바이러스 활성을 갖는다.

플라스미드 pAH52, pAH52/2, pAH53, pAH55 또는 pAH62를 함유하는 이.콜라이 HB101에 의한 인터페론 활성의 발현을 설명하기 위하여, 세균을 적합한 배양 배지에서 배양한후, 분해시키고, 상등액을 먼저 여과하여 멸균한후 VSV 또는 EMCV의 세포변성 효과(CPE)를 측정하는 검정으로 인터페론 활성을 시험한다. 소낭 구내염 바이러스(VSV)로 감염된 NBL-6세포(ATCC CCL57, 말의 가죽으로부터의 표피세포)및/ 또는 뇌막심근염 바이러스(EMCV)로 감염된 A549(ATCC CCL185, 사람의 페암 세포주)를 이에 사용한다. 이 결과는 실시예 0에 기재되어 있다.

발현된 말의 인터페론의 검정을 맥시세포(maxicell)에서 단백질을 표지시켜 수행한다. 플라스미드-암호화된 단백질을 맥시세포 기술(참조 : 문헌 37)을 사용하여 생체내에서 선택적으로 표지시킬 수 있다. 이.콜라이균 CSR603(CGCC 5830)(F-, thr-,leu36, proA2, phr-1, recAl, argE3, thi-1, uvrA6, ara-14, lacY1, galk2, xyl-5, mtl-1, gyrA98(nalA98), rpsL31, tsx-33,λ°-, SupE44)은 UV방사선에의해 야기된 DNA에 대한 손상을 회복시키는 메카니즘을 가지고 있지 않다. UV선의 적절한 용량으로 조사하면 세균의 염색체가 파괴되는 반면, 세포당 몇개의 복제수로 존재하는 실질적으로 작은 플라스미드 DNA의 일부는 작용성이 남아있다. 손상되지 않은 모든 증식성 세포를 항생물질 D-사이클로세린에 의해 사멸시키고, 내생(endogenous) mRNA를 소비한 다음, 플라스미드 상에서 암호화된 유전자만을 남아있는 세포에서 전사시키고 해독시킨후, 형성된 단백질을³⁵S-메티오닌을 도입시켜 방사능적으로 표지시켜 검정한다. 이.콜라이 CSR603을 통상의 방법에 의해 발현 플라스미드로 형질전환시키고, 형질전환된 세균을 암피실린을 함유하는 한천 평판상에서 선별한다. 맥시세포의 제조 및 단백질의 표지는 에이.산카(A.Sancar)(참조 : 문헌 37)에 의해 기술된 바대로 수행한다. 제 17 도는 건조된 겔의 방사선 사진을 나타낸다.¹⁴C-메틸화된 단백질 혼합물(Amersham)을 분자량 표준치로 사용한다. 사용된 대조용은 인터페론 유전자는 없고 프로모터만을 함유하는 플라스미드 pER103 및 사람의 IFN-α2 Arg유전자의 2개의 복제물을 갖는 플라스미드 pER21/1이다. 약 18kd의 단백질 밴드는 플라스미드에 의해 발현된 인터페론이다.

IFN-α, IFN-β 및 IFN-ω 인터페론 유전자와 동종성이 큰 발의 게놈에서 서열의 총 수를 검정하기 위하여, 고분자량의 말의 DNA를 적절한 제한효소로 전체적으로 분해시키고, 이 절단 DNA를 크기에 따라분리시킨다. 니트로셀룰로즈 필터상에 서던 전위시킨 후, DNA를 변성시켜 고정시키고, 각 필터를 닉(nick)-해독된 탐침과 하이브리드화한다. EqIFN-α에 대해 사용되는 탐침은 플라스미드 pAH52로부터의 1.0kb길이의 HindⅢ/SphI단편인 반면, EqIFN-β에 대해 사용되는 탐침은 플라스미드 pAH62의 1.1kb길이의 HindⅢ/SphI단편인데, 이들은 전체의 성숙한 인터페론에 대한 암호화 서열을 함유한다. 플라스미드 pRH61으로부터 2.1kb EcoRI삽입물은 EqIFN-ω에 대한 탐침으로 사용된다. 이어서 필터를 엄격한 조건하에서 세척하여 이들 세개의 인터페론 서열사이에서 교차-하이브리드화가 일어나지 않도록 한다. 방사선 사진법을 Kodark Lanex-Reguler 증감필름을 사용하여 DuPont Cronex X-선 필름상에서 -80℃에서 7일동안 수행한다. 그 결과를 제 18 도에 나타내었다. 놀랍게도 말의 게놈은 적어도 7개의 IFN-αr의, 유전자 적어도 2개의 IFN-β의 유전자 및 적어도 8개의 IFN-ω의 유진자를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 발현 플라스미드 pRH100을 제조하기 위하여, 플라스미드 pER103(Eva Dworkin-Rastl et al., Gene21(1983)237-248, EP-A-O 115-613)을 제한 엔도뉴클레아제 HindⅢ로 선형화시키고, 5'말단 포스페이트 진기를 제거한다.

이 플라스미드 DNA를 혼합하고, 인산화된 올리고뉴클레오타이드 d(AGCTTAAAGATGAGCT) 및 d(CATCTTTA)와 연결시킨다. 리가제 반응을 제한 엔도뉴클레아제 SacI으로 분해시키고, T₄-PNK를 가하여 연결시킨다. 올리고뉴클레오다이드를 EP-A-O 115-613에 기술된 방법과 유사하게 제조한다.

컴피턴트(competent) 이.콜라이 HB101을 이 리가제 반응에 가하여 배양한다.

생성된 세균의 콜로니들 중에서, 12개를 무작위로 선택하여 플라스미드를 현미경적 규모로 분리한다(참조 : Birnboin and Doly, Nucl.Acids Res.7(1979) 1513-1523). 생성된 DNA를 제한 엔도뉴클레아제 SacI으로 절단하고 DNA를 아가로즈겔(1%,1% TBE완충액)상에서 분리시킨다. 약 4,400bp의 선형 분자와 같은 DNA의 이동은 SacI-인식 부위가 플라스미드내로 도입되었음을 확인시킨다. 이들 플라스미드중의하나를 임의로 선택한다. 이.콜라이 HB101을 관련된 미니 제제로부터의 DNA로 다시 형질전환시킨다. 생성된 형질전환된 세균으로부터 콜로니를 선별하여 보다 큰 규모로 성장시킨다. 이것으로부터 분리된플라스미드를 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI 및 BamH I로 절단하고, DNA를 1% 아가로즈겔 상에서 분리시키고, 보다 작은 단편을 전기용출에 의해 겔로부터 분리시킨다. 약 460bp길이의 이 EcoRI-BamHI DNA단편을생거 방법(참조 : F.Sanger at al., Proc.Natl.Acad.Sci(1977) 5463-5467)에 따라 서열분석한다. 이러한 방식으로 분석한 플라스미드를 pRH100으로 칭한다.

발현 플라스미드 pAH4/2를 제조하기 위하여, 플라스미드 pRH100을 제한 엔도뉴클레아제 BamHI으로 완전히 절단한 다음, 5'말단 포스페이트 잔기를 송아지 장내 포스파타아제(CIP)로 제거시킨다.

플라스미드 pAH4를 BamHI으로 절단하고, CaIFN-1에 대한 전체 암호화 서열을 함유하는 0.6kb길이의 DNA단편을 분리시킨 다음, 정제한다.

이 0.6kb DNA단편을 BamHI으로 선형화시킨 pRH100벡터 DNA와 연결한 후, 컴피턴트 이.콜라이HB101을 형질전환시키고, 이를 LB한천상에 도말한다.

생성된 세균 콜로니로부터, 플라스미드를 현미경적 규모로 분리하고, 각종 효소를 사용한 제한분석으로 특징분석한다. 인터페론 유전자 및 트립토판 프로모터가 동일한 배향으로 배열된 플라스미드를 pAH104로 칭한다(참조 : 제 28 도). 이 플라스미드는 성숙한 CaIFN-α1을 생성시키는 최종 발현 플라스미드를 제조하기 위한 중간 단계이다.

플라스미드 pAH4로부터 수득한 0.6kb길이의 BamHI단편을 EP-A-O 0,115-613호와 유사한 방법으로 제조한 합성 올리고뉴클로레오타이드(5' TGCCACCTGCCCGAC)와 혼합한다. 15머 올리고뉴클레오타이드는 개의 성숙한 α-인터페론의 N-말단의 5개 아미노산에 대한 암호화 서열을 함유한다. DNA용액을 가열한 다음, 냉각시키는데, 이동안, 과량으로 존재하는 올리고뉴클레오타이드는 DNA일본쇄의 상보적 위치에 결합한다. 결합된 올리고뉴클레오타이드 프라이머로부터 시작하여 제 2본쇄를 합성한다. S1 뉴클레아제를 사용하여 잔류하는 일본쇄 DNA부분을 제거한다. 수득한 DNA를 분해한 다음, 전기영동시킨다. 약 300bp 길이의 DNA단편을 분리한 다음, 정제한다.

플라스미드 pAH104를 SacI으로 분해한 다음, 클레노우 폴리머라아제와 함께 배양하여 DNA말단을 평활하게 한다. 수득한 DNA를 PstI으로 부분적으로 절단하고, 이어서 DNA를 전기영동시킨 다음, 4.3kb길이의 단편을 분리 및 정제한다.

생성된 DNA를 전술한 0.3kb길이의 DNA단편과 연결시킨다. 이와 같이 연결반응시킨 다음, 이.콜라이 HB101을 형질전환시키고, 이어서, 암피실린이 함유된 LB한천상에 도말한다.

생성된 세균 콜로니를 신선한 한천 평판에 옮기고, 미리 한천 평판에 놓아둔 니트로셀루로즈 필터에 이중으로 옮긴다. 배양한 후, 문헌[참조 : M. Grunstein D.Hogness, Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1975) 72,3961]에 기술된 방법으로 세균을 용해시키고, DNA를 변성시킨 다음, 니트로셀룰로즈에 결합시킨다. 세포파편을 제거시킨다. 이어서,³²p로 표지된 올리고데옥시뉴클레오타이드 d(TGCCACCTGCCCGAC)와 필터를 하이브리드화시킨다.

-80℃의 온도에서 Kodak X-Omet규격 증감필름을 사용한 Kodak X-Omet S X-선 필름상에 필터를 노출시킨다. 방사선 사진에서 양성 하이브리드화 신호를 나타내는 세균 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 분리시킨다. HindⅢ 및 BaHI을 사용하여 플라스미드를 완전히 절단시킨다. 아가로즈 겔에서 전기영동시킨후, 0.5kb길이의 제한 단편을 분리시키고, 이어서 생거의 방법에 따라 DNA를 서열 분석한다.

목적하는 구조를 갖는 플라스미드를 pAH4/2라 칭한다. 이는 이.콜라이에서 성숙한 GalFN-α를 발현할 수 있다.

CaIFN-α의 세균성 발현을 위하여 조작된 유전자를 플라스미드 pAH4/2로부터 세포당 복사 수가 큰 변형된 플라스미드 벡터 parpATER103으로 아클론화하고, 플라스미드의 안정성을 증가시켜 플라스미드 pAH4/3을 제조한다.

0.5kb길이의 pAH4/2의 HindⅢ/BamHI단편을 HindⅢ 및 BamHI으로 절단한 다음, 겔 정제시킨 플라스미드 벡터 parpATER103과 연결한다. 컴피던트 이.콜라이 HB101을 리가제 반응물로 형질전환시키고,이어서 도말시킨다.

생성된 세균 콜로니로부터 6개의 콜로니를 무작위로 선택한 다음, 그들로부터 플라스미드를 현미경적 규모로 분리시킨다. 각종 제한 엔도뉴클레아제로 제한 분석한 후, 목적하는 구조를 갖는 플라스미드를pAH4/3으로 칭한다.

플라스미드 pAH4/2 또는 pAH4/3을 함유하는 이.콜라이 HB101에 의한 인터페론 활성의 발현정도를 검정하기 위하여, 적합한 배양 매질 중에서 배양한 후, 세균을 분쇄하고, 상등액을 여과하여 멸균한 다음, VSV의 세포변성효과(CPE) 측정시험으로 인터페론 활성을 시험한다. 소낭 구내염 바이러스(VSV)로 감염된 A-72세포(ATCC CRL1542, 개의 종양)를 사용한다. 그 결과는 실시예 K에 기재되어 있다.

IFN-α 및 IFN-ω류의 인터페론 유전자와 고도의 동종성을 갖는 개의 게놈에서의 서열의 총 수를 조사하기 위하여, 고 분자량의 개 DNA를 상응하는 제한 효소를 완전히 분해한 다음, 절단된 DNA를 크기별로 분리시킨다. DNA를 니트로셀룰로즈 필터에 서던 전위시킨 후, 변성시키고, 이어서 고정시킨 후, 각 필터를 닉-해독된 DNA탐침과 하이브리드화시킨다.

CaIFN-알파에 대한 탐침으로는 인터페론에 대한 아모화 서열 전체를 함유하는, 플라스미드 pAH4로부터 수득한 0.6kb길이의 BamHI단편을 사용한다. EqIFN-ω에 대한 탐침으로는 플라스미드 pRH61의 2.lkb의 EcoRI삽입물을 사용한다.

이어서, 하이브리드화된 필터를 엄중한 조건하에서 세척한다. -80℃의 온도에서 Kodak Lanex규격 증감 필름을 사용한 DuPont Cronex X-선 필름상에서 7일 동안 방사선 사진을 촬영한다.

방사선 사진(참조 : 제 9 도)은, 동일한 알파-인터페론을 양호화하는 두개의 유전자와는 달리, 개의 게놈에서는, 인터페론 부류에 속하는 다른 종에서 생성되는 CaIFN-α1과 고도의 동종성을 나타내는 어떠한 다른 서열도 전혀 검출할 수 없는 것으로 나타났다 : EgIFN-ω에 대한 DNA를 사용하여, 다소 덜 엄중한 조건하에서 전술한 개의 α-인터페론과는 상이한 유전자를 하나 이상 검출할 수 있다.

벡터를 사용한 세포의 형질전환은 다수의 방법으로 수행할 수 있다. 예를 들어, 칼슘을 사용하여 수행할 수 있는데, 이는 세포를 마그네슘으로 세척한 다음, 칼슘에 현탁된 세포에 DNA를 가하여 수행하거나, DNA와 인산 칼슘의 공동 침전물에 세포를 가하여 수행할 수 있다. 유전자의 발현을 위한 후속단계에서, 형질전환된 세포를 선별하기 위한 배지에 세포를 옮긴다.

숙주세포를 형질전환시킨 후, 본 발명에 따른 단백질이 발현되는 조건하에서 유전자의 발현 및 발효 또는 세포배양을 수행하고, 이어서 리더 및 트레일링(leader and trailing) 서열을 갖거나 갖지않는 단백질을 함유하는 물질을 수득하기 위하여 공지의 크로마토그라피법으로 생성물을 추출할 수 있다. 본 발명에 따른 인터페론은 N-말단(pre-IFN)에서 리더 서열과 함께 발현할 수 있는데, 이 리더 서열은 몇몇 숙주세포로부터 제거할 수 있다. 만약 그렇지 않다면, 성숙한 IFN을 수득하기 위하여 리더 폴리펩타이드(존재한다면)를 분리시켜야 한다. 이와 달리, pre-IFN대신에 미생물에서 직접 성숙한 단백질을 제조할 수 있도록 IFN클론을 변형시킬 수 있다. 이 경우에는, 효모 교배 페로몬(pheromon)인 MF-α-1의 전구체 서열을 사용하여, 융합 단백질을 정확하게 성숙시킬 수 있고, 생성물을 생장배지 또는 페리플라스믹(periplasmic) 공간으로 침전시킬 수 있다. 작용성을 갖는 성숙한 IFN을 암호화하는 DNA서열을 MF-α-1을 사용하여 개시코든인 ATG로부터 256번 위치의 카텝신형의 절단 부위(Lys-Arg의 뒤)에 연결시킬 수 있다[참조 : Kurjan, Herskowitz, Cell 30, 933-943(1982)].

본 발명에 따른 신규의 인터페론은 그들의 생물학적 활성을 기초로 하여, 공지의 인터페론이 사용되는 모든 타입의 치료에 사용할 수 있다. 이들 치료에는 예를 들어, 포진, 리노바이러스(rhinovirus), 말/개(eqnine/canine) 유산 바이러스, 각종 형태의 암 등이 포함된다. 이 신규의 인터페론은 단독으로 사용하거나, 다른 공지의 인터페론 또는 생물학적 활성 생성물(예 : IFN-α, IL-2, 기타의 면역 조절제 등)과 함께 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 인터페론은 항종양 또는 항바이러스성 치료가 필요한 경우 및 면역 억압 특성이 존재하는 경우에 비경구적으로 투여할 수 있다. 용량 및 용량 비율은 임상 시험에서 IFN-α물질에 대하여 현재 적용되고 있는 용량 및 용량 비율[예를 들어,1일 약(1 내지 10)×10⁶단위]과 유사할 수 있고, 순도가 1% 이상인 제제의 경우에는 1일 5×10⁷단위까지 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따라 세균으로 제조한 실질적으로 균일한 IFN을 함유하는 편리한 제형에 있어서, 비경구적으로 사용하기 위하여 3mg의 IFN-ω를 25ml의 5% 동물 혈청 알부민, 바람직하기로는 말/개 혈청 알부민에 용해시킨다. 이 용액을 세균학적 필터에 통과시킨 다음, 여과된 용액을 100개의 바이알에 무균상태로 분배한다. 이때, 각각의 바이얼은 비경구투여하기에 적합한 순수한 IFN을 6×10⁶단위씩 함유한다. 바이알은 사용하기 전에는 저온(-20℃)에서 보관하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 물질은 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합함으로써 공지의 방법으로 제형화하여 약제학적으로 유용한 조성물을 제조할 수 있다. 통상적인 부형제 및 그들의 제형은 문헌[참조 : E.W.Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences]에 기술되어있다. 본 발명에 따른 인터페론은 계산된 양의 부형제와 혼합하여, 환자에게 효과적으로 투여하기에 적합한 약제학적 조성물을 제조할 수 있다. 이들 조성물은 비경구적으로 투여하는 것이 바람직하다.

따라서 본 발명에 따라 우선 말 및 개의 인터페론 및 이들을 암호화하는 유전자 서열을 수득할 수 있다. 본 발명은 특히 다음에 관한 것이다:

[단백질]

말의 α-인더페론 : 동물 기원의 다른 단백질이 거의 없음

-실질적으로 순수한 형태

-천연 글리코실화가 없음

-리더 단백질을 함유

-구조식(I) 또는 (Ⅱ)에 따른 아미노산 서열 또는 이들 서열의 생물학적 활성 변이체를 함유

-본 발명의 방법에 의해 제조될 수 있음.

말의 ω-인터페론 : 동물 기원의 다른 단백질이 거의 없음

-거의 순수형

-천연 글리코실화가 없음

-리더 단백질 함유

-구조식(Ⅳ)에 따른 아미노산 서열 또는 이들 서열의 생물학적 활성 변이체를 함유

-본 발명에 따른 방법으로 제조될 수 있음.

말의 β-인터페론 : 동물 기원의 다른 단백질이 거의 없음

-거의 순수형

-천연 글리코실화가 없음

-리더 팝타이드 함유

-구조식(Ⅲ)에 따른 아미노산 서열 또는 이들 서열의 생물학적 활성 변이체를 함유

-본 발명의 방법에 의해 제조될 수 있음.

개의 α-인터페론 : 동물 기원의 다른 단백질이 거의 없음

-거의 순수형

-천연 글리코실화가 없음

-리더 펩타이드 함유

-구조식(V)에 따른 아미노산 서열 또는 이들 서열의 생물학적 활성 변이체를 함유

-본 발명에 따른 방법에 의해 제조될 수 있음

[DNA서열]

-EgIFN-α를 암호화하는 서열

-플라스미드 pUC9의 HindⅢ 절단 부위내에 삽입되는 EgIFN-α를 암호화하는 서열 또는 이들 서열의 축퇴변이체

-플라스미드 pAH50

-플라스미드 pRH63

-엄중한 조건하에서 플라스미드 pAH50 또는 pRH63의 삽입물과 하이브리드화하는 EgIFN-α를 암호화하는 서열, 또는 85%이상, 바람직하게는 95%이상의 동종성을 나타내는 이들 서열의 축퇴 변이체

-미생물, 바람직하게는 원핵 세포 또는 진핵 세포 및 포유동물 세포에서 복제될 수 있는 발현 벡터 중에 함유된 EgIFN-α 또는 이들 서열의 축퇴 변이체

-구조식(I) 및 (Ⅱ)의 DNA서열 또는 이들 서열의 축퇴 변이체

-EgIFN-ω를 암호화하는 서열

-플라스미드 pUC9의 EcoRI절단 부위내에 삽입된 EgIFN-ω를 암호화하는 서열 또는 이들 서열의 축퇴 변이체

-플라스미드 pRH61

-엄밀한 조건하에 플라스미드 pRH61의 삽입체와 하이브리드화하는 EgIFN-ω를 암호화하는 서열, 또는 85%이상, 바람직하게는 95%이상의 동종성을 나타내는 이들 서열의 축퇴 변이체

-미생물, 바람직하게는 원핵 세포 또는 진핵 세포 및 포유동물 세포 중에서 복제될 수 있는 발현 벡터내에 함유된 EgIFN-ω를 암호화하는 서열, 또는 이들 서열의 축퇴 변이체

-구조식(Ⅳ)의 DNA서열 또는 이 서열의 축퇴 변이체

-EgIFN-β를 암호화하는 서열

-플라스미드 pAH60의 HindⅢ 절단 부위내에 삽입된 EgIFN-β를 암호화하는 서열 또는 이들 서열의 축퇴 변이체

-플라스미드 pAH60

-엄밀한 조건하에 플라스미드 pAH60의 삽입물과 하이브리드화하는 EgIFN-β를 암호화하는 서열, 또는 85%이상, 바람직하게는 95%이상의 동종성을 나타내는 이들 서열의 축퇴 변이체

-미생물, 바람직하게는 원핵 세포 또는 진핵 세포 및 포유동물 세포 중에서 복제될 수 있는 발현 벡터내에 함유된 EgIFN-β를 암호화하는 서열, 또는 이들 서열의 축퇴 변이체

-구조식(Ⅲ)의 DNA서열 또는 이 서열의 축퇴 변이체

-CaIFN-α를 암호화하는 서열

-플라스미드 pAH2 또는 pAH4의 HindⅢ절단 부위내에 삽입된 CaIFN-α를 암호화하는 서열 또는 이들 서열의 축퇴 변이체

-플라스미드 pAH2

-플라스미드 pAH4

-엄밀한 조건하에 플라스미드 pAH2 또는 pAH4의 삽입물과 하이브리드화하는 CaIFN-α를 암호화하는 서열, 또는 85%이상, 바람직하게는 95%이상의 동종성을 나타내는 이들 서열의 축퇴 변이체

-미생물, 바람직하게는 원핵 세포 또는 진핵 세포 및 포유동물 세포 중에서 복제될 수 있는 발현 벡터내에 함유된 CaIFN-α를 암호화하는 서열, 또는 이들 서열의 축퇴 변이체

-구조식(V)의 DNA서열 또는 이 서열의 축퇴 변이체 형질전환된 숙주 유기체

-EgIFN-α,-ω 또는 -β를 암호화하는 유전정보 또는 CaIFN-α를 암호화하는 유전정보를 갖는 유기체, 바람직하게는 원핵 세포, 진핵 세포 또는 포유동물 세포, 특히 이. 콜라이 또는 이. 콜라이 JM101

-숙주 유기체내에서 복제될 수 있는 벡터 중에 본 발명의 단백질에 대한 유전자 서열을 함유하는 유기체 플라스미드

-플라스미드 pAH51(HindⅢ로 절단된 4.2kb길이의 플라스미드 pAH50의 DNA단편에 SphI링커를 마련하고 SphI로 절단 후 고리화시킴을 특징으로 함)

-플라스미드 pAH51/2(플라스미드 pAH51의 HindⅢ/BglⅡ절단 부위내에, 플라스미드에 고유한 긴 단편 대신에, 15머 올리고뉴클레오타이드 프라이머 5' TGTGACCTGCCTCAC의 존재하에 변성시킨 후, 클레노우단편으로 연장시키고 올리고뉴클레오타이드 컴플렉스 5' AGCTTAAAGATG(3' ATTTCTAC를 연결시키며 HindⅢ 및 BglⅡ로 절단시킨 후, 플라스미드 pAH50의 0.4kb길이 pAHⅡ단편으로부터 수득된 단편을 함유함을 특징으로 함)

-발현 플라스미드 parpATER103(부분적으로는 EcoRI으로 절단되고 부분적으로는 HindⅢ으로 절단된 플라스미드 parpER33의 0.47kb길이의 DNA단편을 플라스미드 pAT153의 EcoRI/HindⅢ 절단 부위내에 삽입시킴을 특징으로 함)

-발현 플라스미드 pAH52/2(플라스미드에 고유한 짧은 단편 대신에, 플라스미드 pAH51/2의 1.0kb길이의 긴 HindⅢ/BamHI단편을 플라스미드 parpATER103의 HindⅢ/BamHI절단 부위내에 삽입시킴을 특징으로 함)

-발현 플라스미드 pAH52(플라스미드에 고유한 짧은 단편 대신에, 플라스미드 pAH51/2의 HindⅢ/SchI단편을 플라스미드 parpATER103의 HindⅢ/SphI절단 부위내에 삽입시킴을 특징으로 함)

-발현 플라스미드 pAH53(클레노우 단편으로 선형화되고 탈인산화된 pBR322의 2.4kb길이의 EcoRI/PvuⅡ 단편이, 클레노우 단편으로 평활화된 플라스미드 pAH52의 1.1kb길이의 EcoRI/SphI단편에 연결됨을 특징으로 함)

-발현 플라스미드 pAH55(플라스미드 pAH52/2는 플라스미드에 고유한 짧은 BglⅡ/BamHI단편 대신에, 플라스미드 pRH63의 1.0kb길이의 BglⅡ/BamHI단편을 함유함을 특징으로 함)

-플라스미드 pAH61(플라스미드에 고유한 짧은 단편 대신에, HgiAI으로 절단되고 T4-DNA 폴리머라제로 선형화되고 SphI링커가 마련되고 이어서 HindⅢ 및 SphI으로 절단된 플라스미드 pAH60의 1.85kb길이 DNA단편을, 플라스미드 parpATER103의 HindII/SphⅡ절단 부위내에 삽입시킴을 특징으로 함)

-M13 pAH61(1.3kb길이인 플라스미드 pAH61의 BamHI/SalI 단편을, BamHI/SalI 로 이중으로 분해된 M13 mp9-파지 DNA와 연결시킴을 특징으로 함)

-발현 플라스미드 pAH62(S1 뉴클레아제로 처리된 15-머 5' GTGAACTATGACTTG를 사용하여 이본쇄화 되고, 올리고뉴클레오타이드 컴플렉스5'AGCTTAAAGATG(3'ATTTCTAC와 연결되며, HindⅢ 및 SphI로 절단된 pAH61의 단편을, 플라스미드에 고유한 짧은 단편 대신에 플라스미드 parpATER103의 HindⅢ/SphI절단 부위내에 삽입시킴을 특징으로 함)

-발현 플라스미드 pRH100(올리고뉴클레오타이드 컴플렉스 5' AGCTTAAAGATGAGCTCATCTTTA-(3'ATTTCTACTCGAGTAGAAATTCGA를 플라스미드 pER103의 HindⅢ 절단 부위내에 삽입시킴을 특징으로 함)

-플라스미드 pAH104(플라스미드 pRH100의 BamHI절단 부위내에 CaIFN-α를 암호화하는 서열을 함유함을 특징으로 함)

-발현 플라스미드 pAH4/2(성숙한 CAIFN-α1을 암호화하는 서열을 플라스미드 pAH104의 평활 말단된 SacI절단 부위내에 삽입시킴을 특징으로 함)

-발현 플라스미드 pAH4/3(0.5kb길이의, 플라스미드 pAH4/2의 HindⅢ/BamHI단편을, 플라스미드 parpATER103의 HindⅢ/BamHI절단 부위내에 삽입시킴을 특징으로 함)

이들 플라스미드의 제조방법은 다음과 같이 기술된다 :

-플라스미드 pAH51의 제조방법 : 플라스미드 pAH50을 HindⅢ로 절단하고, 4.2kb길이 단편 SphI링커를 제공한 다음, SphI로 절단하고 DNA 리가아제로 환형화하며, 수득된 플라스미드를 이.콜라이HB101에서 복제하기 위해 형질전환시켜 배양함을 특징으로 함.

-플라스미드 pAH51/2의 제조방법 : 플라스미드 pAH50을 PvuⅡ로 절단하고,0.4kb길이의 단편을 하기의 15-머 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 존재하에 변성시키고, 5' TGTGACCTGCCTCAC 일본쇄에 결합된 프라이머를 클레노우 단편으로 연장한 후, 어떠한 가능한 3' 돌출부도 제거시키고, 이어서 하기의 올리고뉴클레오타이드 컴플렉스를 연결시키며 5' AGCTTAAAGATG 3' ATTTCTAC 및 BglⅡ로 제한 엔도뉴클레아제 분해시켜 수득된 DNA단편을 플라스미드에 고유한 긴 분획 대신에 플라스미드 pAH51의 HindIlI/BalⅡ절단 부위내에 삽입시키고, 생성된 플라스미드를 이.콜라이 HB101에서 복제하기 위해 형질전환시켜 배양함을 특징으로 함.

-발현 플라스미드 parpATER103의 제조방법 : 대부분은 HindⅢ로 절단하고 부분적으로는 EcoRI로 절단된 플라스미드 parpER33의 0.47kb길이의 단편을 리가아제 반응에 의해, EcoRI 및 HindⅢ를 사용한 제한 엔도뉴클레아제 분해에 의해 선형화된 플라스미드 pAT153내에 삽입하고, 수득된 플라스미드를 이.콜라이HB101에서 복제하기 위해 형질전환시켜 배양함을 특징으로 함.

-발현 플라스미드 pAH53/2의 제조방법 : 1.0kb길이의 플라스미드 pAH51/2의 HindⅢ/BamHI 단편을 플라스미드에 고유한 짧은 단편 대신에 플라스미드 parpTER103의 HindⅢ/BamHI절단 부위내에 삽입하고, 수득된 플라스미드를 이.콜라이 HB101에서 복제하기 위해 형질전환시켜 배양함을 특징으로 함.

-발현 플라스미드 pAH52의 제조방법 : 플라스미드 pAH51/2의 HindⅢ/SphI 단편을 플라스미드에 고유한 짧은 단편 대신에 플라스미드 parpATER103의 HindⅢ/SphI절단 부위내에 삽입하고, 수득된 플라스미드를 이.클라이 HB101에서 복제하기 위해 형질전환시켜 배양함을 특징으로 함.

-발현 플라스미드 pAH53의 제조방법 : 클레노우 단편으로 평활하게 되고 탈인산화된 2.4kb길이의 EcoRI/PvuⅡ단편을, 클레노우 단편으로 평활하게 된 플라스미드 pAH52의 1.1kb길이의 EcoRI/AphI단편에 연결하고, 수득된 플라스미드를 이.콜라이 HB101에서 복제하기 위해 형질전환시켜 배양함을 특징으로함.

-발현 플라스미드 pAH55의 제조방법 : 플라스미드 pRH63의 1.0kb길이의 BglⅡ/BamHI단편을 플라스미드에 고유한 짧은 BglⅡ/BamHI단편 대신에 플라스미드 pAH52/2내에 삽입하고, 수득된 플라스미드를 이.콜라이 HB101에서 복제하기 위해 형질전환시켜 배양함을 특징으로 함.

-발현 플라스미드 pAH61의 제조방법 : 플라스미드에 고유한 짧은 단편 대신에 HgiAI로 절단하고, T₄-DNA 폴리머라제로 선형화시킨 후 SphI링커를 제공하고 HindⅢ 및 SphI으로 절단된 플라스미드 pAH60의 1.85kb길이의 DNA단편을 플라스미드 parpATER103의 HindⅢ/SphI절단 부위내로 삽입하고, 수득된 플라스미드를 이.콜라이 HB101에서 복제하기 위해 형질전환시켜 배양함을 특징으로 함.

-M13 pAH61의 제조방법 : 플라스미드 pAH61의 1.3kb길이의 BamHI/SalI 단편을 BamHI/SalI으로 이중 분해된 M13 mp9-파이지 DNA와 연결하고 이.콜라이 JM101에서 복제하기 위해 형질전환시켜 배양함을 특징으로 함.

-발현 플라스미드 pAH62의 제조방법 플라스미드15-머를 사용하여 이본쇄로 만들고 5' GTGAACTAT GACTTG S1뉴클레아제로 처리하고, 다음 올리고뉴클레오타이드 컴플렉스와 연결시킨 후, 5' AGCTTAAAGATG 3' ATTTCTAC HindⅢ 및 SphI으로 절단한 M13 pAH61의 단편을 플라스미드에 고유한 짧은 단편 대신에 플라스미드 parpATER103의 HindⅢ/SphI 절단 부위내에 삽입하고, 수득된 플라스미드를 이.콜라이 HB101에서 복제하기 위해 형질전환시켜 배양함을 특징으로 함.

-플라스미드 pAH4/2의 제조방법 : 성숙한 CaIFN-α1을 암호화하는 서열을 플라스미드 pAH104의 평활-말단화된 SacI내에 삽입하고, 수득된 플라스미드를 이. 콜라이 HB101에서 복제하기 위해 형질전환시켜 배양함을 특징으로 함.

-플라스미드 pAH4/2의 제조방법 : 플라스미드 pAH4의 0.6kb길이의 BamHI단편을 다음 올리고뉴클레오타이드 프라이머에 결합시키고, 5' TGCCACCTGCCCGAC 클레노우 단편을 사용하여 제 2본쇄를 합성한후, 나머지 일본쇄를 S1뉴클레아제로 제거하고, DNA를 PstI으로 절단한 후, DNA리가제를 사용하여 클레노우 폴리머라제로 평활 말단화한 SacI단편의 부분적 PstI분해후 수득된 플라스미드 pAH104의 4.3kb길이 단편에 연결시킨다.

-발현 플라스미드 pRH100의 제조방법 : 플라스미드 pER103을 HindⅢ을 사용하여 선형화하고, 다음 올리고뉴클레오타이드 컴플렉스와 연결시킨 후, 5' AGCTTAAAGATGAGCTCATCTTTA 3 ATTTCTACTCGAGTAGAAATTCGA 리가제 반응물은 SacI로 분해시키고 환형화시킨 후, 생성된 플라스미드를 이.콜라이 HB101에서 복제하기 위해 형질전환시켜 배양함을 특징으로 함.

-발현 플라스미드 pAH4/3의 제조방법 : 플라스미드 pAH4/2의 0.5kb길이의 HindⅢ/BamHI단편을 플라스미드 parpATER103의 HindⅢ/BamHI절단 부위내에 삽입하고, 수득된 플라스미드를 이.콜라이 HB101에서 복제하기 위해 형질전환시켜 배양함을 특징으로 함.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 단백질의 제조방법에 관한 것이다 :

-EqIFN-α,-β,-ω 또는 CaIFN-α의 제조방법

a) 숙주 유기체, 바람직하게는 원핵, 진핵 또는 포유동물 세포, 특히 이.콜라이 또는 사카로마이세스 세리비지애를 EgIFN-α,-β,-ω 또는 CaIFN-α를 암호화하는 유전정보, 바람직하게는 본 발명에 따른 단백질을 암호화하는 플라스미드 pAH50, pAH62, pRH63, pRH61, pAH60, pAH2 또는 pAH4의 서열 또는 엄격한 조건하에서 85%이상, 더욱 바람직하게는 90%이상의 동종성을 보이는 이들 플라스미드와 하이브리드화하는 서열, 더욱 바람직하게는 구조식(I) 내지 (V)중 하나에 따르는 서열 또는 이들 서열의 축퇴 변이체를 암호화하는 서열로 형질전환시키고 : b) 암호화 서열을 발현 벡터, 바람직하게는 벡터 pAH52, pAH52/2, pAH53, pAH55, pAH63, pAH4/2 또는 pAH4/3중의 하나에 함유시키고, 이 정보를 EgIFN-α,-β,-ω 또는 CaIFN-α를 생성하도록 숙주 유기체에서 발현시키고, c) 인터페론 EgIFN-α,-β,-ω 또는 CAIFN-α, 바람직하게는 구조식(I) 내지 (V)중의 하나에 따른 인터페론을 분리시켜 정제함을 특징으로 함.

또한 본 발명은 의학적 치료를 위한 본 발명에 따른 단백질의 용도 및 약제학적 부형제와 함께 이들 단백질의 유효량을 함유하는 의학적 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.

하기 실시예는 본 발명을 상세히 기술하는 것으로서, 본 발명을 제한하지 않는다.

[물질]

몇몇 출발물질은 시판되며, 몇몇은 하이델베르그(Heidelberg)에 있는 EMBL로부터 수득된다. 이.콜라이 JM101, pUC8, pUC9, M13 mp8 및 M13 mp9는 베데스다 리서치 래보러토리즈(Bethesda Research Laboratories)로부터 수득되고, 억제인자 SupF를 갖는 이.콜라이 균주, 예를 들면, 이.콜라이 NM526,538 및 539 및 벡터 λ-EMBL3 또는 3A는 EMBL로부터 수득되며, 몇몇의 경우에는 스위스 연방 바슬의 스테헬린(Stehelin) 회사로부터 수득된다.

[A) 말 DNA의 분리]

냉동된 조직, 예를 들면 말의 간을 액체 질소하에 미세한 분말로 분쇄하고 0.5M EDTA, 10mM Tris.HCl pH 8.0, 0.5% SDS, 0.1mg/ml의 프로테아제 K(20ml/g조직) 중에서 55℃에서 3시간 배양한다. 수득된 점성용액을 페놀 추출 및 페놀/클로로포름/이소아밀알콜(25/24/1 용적)로 3회 추출하여 단백질을 제거시키고, 50mM Tris-HCl, pH 8.0, 10mM EDTA, 10mM NaCl로 투석시킨 후, DNA를 2용적의 에탄올로 침전시킨다. 진공하에 건조시킨 후, DNA는 TE완충액(10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA) 중에서 4℃의 용액 중에 넣고 1.273g CsCl/ml용액으로 20℃에서 40,000rpm으로 62시간 동안 원심분리시킨다(Sorval 50 Ti-Roctor). CsCl구배를 적하하고 DNA함유 분획을 TE완충액으로 투석시킨 후 DNA를 2용적의 에탄올로 침전시키고, 70% 에탄올로 세척하고, 건조시킨 다음 다시 TE완충액(4℃) 중에 용해시킨다.

최종 DNA제제는 RNA 및 50kb길이 이상의 DNA를 제거한다(0.45% 아가로오스 겔상에서 전기영동법으로 측정함).

[B) 말의 DNA의 부분적 엔도뉴클레아제 분해 및 크기 분별화]

말의 DNA 50mcg를 2회에 걸쳐 반응 배지(10mM Tris-HCl, pH 7.5, 10mM MgCl₂, 1mM디티오트레이톨) 450mcl중에서 Sau 3A의 1.6단위와 함께 37℃에서 배양한다. 15, 25 및 40분 후, 150mcl분취량을 취하여 15mM EDTA와 혼합하고, 반응을 70℃로 10분간 가열하여 중지시킨다. pH 6.0의 0.3M Na아세테이트를 가한 후, 에탄올 2.5용적을 사용하여 DNA를 침전시킨다. TE완충액에 재용해시킨 후, DNA를 약 1V/cm의 TBE완충액(10.8g/l Tris, 5.5g/l 붕산, 0.93g/l Na₂EDTA)에서 0.45% 이가로오스 겔상에서 밤새 전기영동시켜 크기에 따라 분리한다. 크기 표지물(EcoRI 및 HindⅢ로 이중 분해되고 HindⅢ로 분해된λ-DNA)을 사용하여 10 내지 23kb길이의 DNA를 갖는 겔 단편을 절단하고, DNA를 300V(완충액 0.1×TBE)에서 3시간 동안 투석 튜브 중에서 겔로부터 용출시키고, 제조자의 교시에 따라 일류팀(elutip)-D컬럼(Schleicher and Sch

ll)상에서 정제한 후, 에탄올로 침전시킨다.

한편으로는 말의 DNA를 인위적 하이브리드로 유도하고, 다른 한편으로는 λ파지에서 더이상 패키징 될 수 없다. 과도하게 큰 DNA단편을 유도할 수 있는, 말의 DNA 단편의 자체 연결을 방지하기 위하여, 크기분류된 말의 DNA단편을 탈-인산화한다.

이를 위해, DNA를 소의 장내 포스파타제 5단위를 사용하여 반응 배지(50mM Tris-HCl, pH 9.5, 1.0mM의 MgCl₂,0.1mM의 Zn아세테이트, 1mM의 스페르미딘) 140mcl중에서 37℃에서 30분간 배양하며, 효소 5단위를 추가하고, 30분 동안 배양한다.

EDTA를 가하여 최종 농도 25mM을 수득한 후, DNA를 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜(25/24/1용적)으로 1회, 클로로포름/이소아밀알콜(24/1 용적)로 2회, 그리고 디에틸에테르로 3회 추출한 후, 에탄올로 침전시키고, 건조한 다음 0.1×TE완충액 중에 용해시킨다.

[C) 말의 게놈-DNA 라이브러리의 작제]

10 내지 23kb길이의 탈인산화된 말의 DNA단편을 파지 DNA의 내부 BamHI단편을 제거하여 수득된 G-A-T-C 점성 말단을 사용하여 λ벡터, 예를 들면 λ-EMBL 3 또는 3A(참조 : 문헌 3)중에서 클로닝한다.

벡터를 억압인자 SupF를 갖는 이.콜라이 균주, 예를 들면, 이.콜라이 NM526,538 또는 539(참조 : 문헌3)를 MgSO₄5mM을 갖는 LB욕중(참조 : 문헌 20)중에서 성장시키고, 폴리에틸렌글리콜로 침전시킨 다음, CsCl-밀도 구배에 의해 2회 원심분리(용액의 0.71g CsCl/ml용액, 45000rpm, 20℃에서 40시간)시켜 정제한다. TE완충액을 사용하에 투석시킨 후, 파지 DNA를 페놀/클로로포름/이소아밀알콜(25/24/1 용적)을 사용하여 2회 추출하고, 클로로프름/이소아밀알콜(24/1 용적)로 2회 추출하여 단백질로부터 유리시키고 에탄올 침전에 의해 농축시킨다.

EMBL3A의 말단 단편을 수득하기 위해, 파지 DNA 50mcg, 반응배지(10mM Tris-HCl, pH 7.5, 10mM MgCl₂, 1mM 디티오트레이톨) 450mcl중에서 24시간 동안 37℃에서 BamHI를 사용하여 전체적으로 분해시킨 후, 15mM EDTA를 사용하여 10분간 분해시킨 다음, 70℃에서 반응을 중지시키고, DNA를 에탄올을 사용하여 침전시킨다.

재-연결을 방지하기 위하여, 중간 단편을 EcoRI를 사용하여 재절단하고, 떨어진 올리고뉴클레오타이드를 이소프로판올 침전에 의해 제거시킨다.

BamHI-분해된 λ -DNA를 10mM Tris-HCl, pH 7.5, 100mM NacL, 10mM MgCl₂450mcl중에서 EcoRI를 사용하여 37℃에서 2시간 동안 전체적으로 분해시킨다. Na-아세테이트를 가하여 최종 농축액 0.3M을 수득한 후, 3개의 큰 DNA단편을 0℃에서 15분간 이소프로판을 0.6용적을 사용하여 침전시키고, 0.45M Na-아세테이트/0.6용적의 이소프로판올로 2회, 0.3M Na-아세테이트/2.5용적의 에탄올로 1회 세척한 후, 0.1×TE완충액 15mcl중에서 용해시킨다. BamHI/EcoRI링커가 공정 중에 용액에 잔류한다.

EMBL 3A단편 (8mcg)을 약 5mcg의 10 내지 23kb의 발의 DNA 및 10단위의 T₄-DNA 리가제(NEN)을 사용하여 조합시키고, 연결 배지(66mM Tris-HCl, pH 7.2,0.1M NaCl, 10mM MgCl₂,lmMEDTA,5mM 디티오트레이톨,0.5mM ATP) 50mcl중에서 14℃에서 밤새, 및 4℃에서 1일간 배양한다. 연결된 DNA 혼합물을 시험관내 λ패킹 시스템(참조 : 문헌 27)을 사용하여 성숙한 λ-파지 입자로 패킹한다.

이 시스템의 성분, 예를 들면 초음파 추출(SE), 동결-해동 용해질(FTL), 완충액 MI. 및 A는 문헌(참조 : 문헌 27)에 따라 제조한다. 연결된 DNA혼합물 10mcl 분취량을 FTL과 같이 얼음으로부터 30분간 해동된 SE 25mcl을 사용하여 주위온도에서 2분간 배양한 후, FTL 100mcl을 가하고, 혼합물을 주위온도에서 60분간 재배양한다. 팩키징 혼합물을 λ희석액(100mM의 Tris-HCl, pH 7.5, 10mM MgSO₄, lmM EDTA) 150mcl로 희석하고 4℃에서 저장한다.

팩키징된 λ파지 소량을 이.콜라이 균주 NM528 SupF상에서 분쇄한다. 이 방법으로 약 1×10⁶인디펜던트 말의 DNA재조합체를 수득한다. 팩키징된 물질의 잔류물을 13.5cm의 LB/MgSO₄한천평판당 30000 플라크-형성 단위(pfu)의 밀도로 NM528상에서 도말하여 증식시킨다.

[D) 인터페론 유전자에 대한 말의 유전자 라이브러리의 스크리닝]

말의 인터페론 유전자를 함유하는 재조합 파지를 확인하기 위하여, 방사선으로 표지된 사람의 IFN-α유전자로 사용하여 서던-블롯(17)에 의해 나타나는 뉴클레오타이드 동종성을 이용한다.

말의 고분자량 DNA 10mcg를 EcoRI 또는 HindⅢ으로 전체적으로 분해시키고, 0.8% 아가로제 겔상에서 전기영동시켜 재용해시키며, 니트로셀룰로오즈 필터로 전이시킨다. p-32-표지된 DNA 단편을 발현 플라스미드 pER33(참조 : 문헌 14)로부터 기원하고 성인 인터페론 α 2ARG에 대한 전체 단백질-암호화 영역을 함유하는 845bp HindⅢ단편으로부터 통상의 방법(참조 : 문헌 25)으로 제조한다.

말의 β-인터페론 유전자를 스크리닝하기 위해, 방사선 표지된 DNA 탐침을 상기한 바와 같이 사람의β-인터페론을 암호화하는 cDNA 클론 P1F12(참조 : 문헌 15)의 363bp Pst-BglⅡ단편으로부터 제조한다. 이 탐침은 성숙한 β-인터페론의 아미노산 48 내지 166을 암호화한다.

니트로셀룰로즈 필터를 5×SSPE(0.9M NaCl, 50mM NaH₂PO₄, 5mM EDTA, pH 7.4), 5×덴하르트(Denhart)용액(0.1% 피콜, 0.1% 폴리비닐피롤리돈, 0.1% 소의 혈청 알부민), 0.1% SDS, 20mg/ml의 연어 정자 DNA중에서 7시간 동안 65℃에서 예비 하이브리드화 한 다음, 연어 정자 DNA가 빠진 동일한 용액 중에서 표지된 탐침 13×10⁶cpm을 사용하여 하이브리드화한다. 65℃에서 밤새 배양한 후, 필터를 3×SSC(0.45M NaCl, 45mM Na 시트레이트), 0.1% SDS중에서 1 내지 1.5시간 동안 65℃에서 4회 세척하고, Kodak 레귤러 증강제 필름(참조 : 제 1 도)을 사용하여 Kodak X-omat S-X-선 필름상에서 7일간 노출시킨다. 몇몇 밴드의 외관은 소, 돼지 및 사람에서 이미 검출된 바와 같이 말해서 α-인터페론 유전자 계열을 나타낸다.

따라서, 동일한 하이브리드화 조건을 말의 DNA 라이브러리에서 인터페론 유전자를 스크리닝하는데 사용한다.

600,000개의 재조합 λ파지를 30000pfu/13.5cm의 판의 밀도로 이.콜라이 NM528상에 도말한다. 4겹의 니트로셀룰로오스 레폴리카스(replicas)를 Benton과 Davis(참조 : 문헌 19)의 방법에 의해 기술된 방법을 사용하여 각 판으로부터 제조한다.

80℃에서 2시간 동안 베이킹한 후, 필터를 1N NaCl, 10mM Tris-Hcl, pH 8.0, 0.1% SDS에서 1.5시간 동안 65℃에서 세척하고, 상기한 바와 같이 밤새 예비 하이브리드화시키며, 각 판으로부터 2개의 필터 리폴리카스를 필터당 1.5×10⁶cpm의 방사선 α-인터페론 탐침을 또는 1×10⁶cpm의 β-인터페론 탐침을 사용하여 24시간 동안 하이브리드화한다. 스크리닝을 3회 반복한 후, 포지티브 하이브리드화 시그날을 수득하는 8개의 말의 α-인터페론 클론 및 6개의 말의 β-인터페론 클론을 수득한다.

[E) 재조합 파지의 특성화]

파지 DNA를 사람의 α-IFN과 하이브리드화한 7개의 재조합체 및 사람의 β-IFN과 하이브리드화한 3개의 재조합체로부터 제조한다. DNA는 EcoRI, BamHI, HindⅢ, PstI, BglⅡ, SalI 및 SmaI으로 분해하고, 0.8% 아가로제겔상에서 전기영동에 의해 분리시킨다. 하이브리드화 단편의 크기는 서던법에 의해 측정한다.λ삽입물내의 제한 부위의 위치를, λDNA의 부분적 제한 분해하고, 합성 P-32-표지된 올리고뉴클레오타이드로 λ아암의 좌우측 점성 말단을 표지화하며, 이어서 0.45% 아가로오스겔 중에서 전기영동시킨 후, Rackwitz등에 의해 기술된 방법(참조 : 문헌 4)을 사용하여 측정한다. 클론 Eq-α1, Eq-α16, Eq-α20 및 Eq-β6의 제한지도는 제 2,3 및 30도에 나타나있다.

[F) 말의 인터페론 α유전자의 아클론화]

사람 α-인터페론 표지물과 하이브리드화된 클론 Eq-α1의 제한 단편을 pBR322유도체 pUC9의 다수의 제한효소 클로닝 부위에 아클론화시킨다. 외인성 DNA 단편의 삽입은 β-갈락토시다제의 LacZ유전자에서 방해를 야기시켜서 플라스미드로 형질전환시킨 이.콜라이 균주 JM101의 표현형을 lac+로부터 lac-로 변화시킨다. 비 -작용성 β- 갈락토시다제 때문에, 이 소프로필 티오갈락토사이드(1PTG)로 유발된 JM101은 무색 기질 유사체 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드(BCIG)를 청색 염료를 생성하도록 절단시킬 수 없다. lac-표현형을 갖는 세균 콜로니는 흰색에 의해 인식할 수 있다.

클론 Eq-α1의 3.2kb길이의 HindⅡ 단편을 아가로스겔로부터 용출시키고 일루팁-디 컬럼상에서 정제하며, 약 10배의 몰과량 중에 SmaI으로 절단한 pUC9 벡터의 40mg과 연결시키고, 탈포스포릴화시킨 다음, 이.콜라이 JM101에 형질전환시키며, 0.2mg/ml의 BCIG, 0.17mg/ml의 IPIG 및 0.1mg/ml의 암피실린이 함유된 LB톱 한전에 붓는다. 백색 콜로니를 37℃에서 철야 0.1mg/ml의 암피실린을 함유한 LB육즙 5ml중에 성장시키고, 삽입한 단편에 대해 플라스미드 미나프라퍼레이션(minipreparation)방법(참조 : 문헌 25)에 의해 스크리닝 한다. 이렇게 수득된 플라스미드를 pAH50으로 칭한다.

[G) 클론 Eq-α1으로부터 말의 α-인터페론 유전자의 DNA서열]

pAH50의 3.2kb길이의 HindⅡ삽입물(Eq-α1의 3.2kb길이의 HindⅡ단편, 제 3 도)을 숏건(Shotgun)방법을 사용하여 생거(참조 : 문헌 23)에 의해 기술된 디데옥시 방법에 의해 서열분석한다.

pAH50 플라스미드 DNA 60mcg를 HindⅢ로 완전히 분해시키고, 3.2kb단편을 1% 아가로스겔로부터 분리시키고 상술한 바와 같이 정제한다.

이 단편 15mcg를 14유니트의 T₄-DNA 리가제를 함유한 100mcl의 연결 배지 중에 14℃에서 밤새 그 자체와 연결시키고 4℃에서 추가로 4일 동안 연결시킨다. 이 연결된 DNA를 총 100 내지 140초 중에 20초 펄스(pulse)의 초음파로 빙욕 중에 작은 조각으로 분할시킨다. DNA말단을 250mcl의 반응배지(50mM Tris-HCl, pH 7.5,10mM MgCl₂, 1mM디티오트레이톨, 0.5mg/ml의 소혈청 알부민/0.1mM dATP, dGTP,dCTP, dTTP)중에서 14℃에서 2시간 동안 15유니트의 이.콜라이 폴리머라제 I(크레노우단편)의 대단편으로 보수한다. 에탄올 침전에 의한 농축 후, 이러한 방법으로 예비처리한 DNA를 1% 아가로스 겔상에서 분리시키고, 0.35 내지 1.0kb의 크기 범위의 DNA 단편을 분리하여 정제시킨다. 단편을 약 10배의 몰과량으로 SmaI으로 절단하고 탈인산화시킨 박테리오파지 M13 mp8(참조 : 문헌 22)과 연결시키고, 이.콜라이 JM101로 형질전환시킨다. 이렇게 수득한 재조합 파지의 일본쇄 DNA를 분리시키고 합성 올리고뉴클레오타이드의 결합 후, 제 2분쇄의 합성을 이.클라이 DNA-폴리머라제 1의 클레노우 단편으로 4개의 개개 반응에서 수행한다.

여러가지 재조합 파지의 삽입물의 서열을 C.Pieler가 변형시킨 STaden(참조 : 문헌 24)의 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결합시켜 제 4 도에 도시된 전체 서열을 형성시킨다.

[H) 말의 β-인터페론 유전자의 아클론화]

λ클론 Eq-β6에서 확인된 말의 β-인터페론 유전자의 아클론화를 수행하기 위해, F)에서와 동일한 방법을 사용한다. 사람 β-인터페론 탐침과 하이브리드화한 4.5kb PvuⅡ단편을 분리시키고 정제하여 평활말단을 갖는 플라스미드 pUC9의 SmaI 제한 부위내에 연결시키며, 이어서 이.콜라이 JM101에 형질전환시킨다. 바람직한 삽입물을 갖는 형질전환체(pAH60)를 성장시키고, 플라스미드를 상세히 서던 분석으로 보다 정확히 특정화한다. 수득된 제한 지도는 제 3 도에 나타나 있다. 2.5kb HindⅡ 단편을 생거의 디데옥시 방법을 사용하여 G)와 유사하게 서열분석한다. 제 8 도에 도시된 2.5kb단편의 전체 서열은 52개의 서열로 이루어진다.

[I) 클론 Eq-α16으로부터 말의 인터페론 유전자의 아클로화 및 서열분석]

사람 α-IFN표지물(참조 : 실시예 D, E)와 하이브리드화한 λ클론 Eq-α16으로부터 33kb길이의 EcoRI제한 단편을 플라스미드 pUC8의 EcoRI부위내에 아클론화시킨다. 수득된 플라스미드는 pRH63으로 칭한다. (제 9 도)에 도시된 제한 지도를 사용하여 정의된 제한 단편을 조절시킨 방법으로 M13 파지중에 아클론화 시키고 DNA서열을 생거방법에 따라 측정한다(참조 : 제 10 도).

[J) 클론 Eq-α20으로부터 말의 인터페론 유전자의 아클론화 및 서열분석]

사람 α-IFN탐침과 약하게 하이브리드화한 클론 Eq-α20의 2.2kb길이의 EcoRI단편을 플라스미드pUC9의 EcoRI부위내에 아클론화시킨다. 수득된 클론을 pRH61로 칭한다(참조 : 제 9 도). 전체 2.2kb길이의 EcoRI삽입물을 분리시키고 DNA서열을 생거법에 의해 숏건 방법을 사용하여 측정한다(참조 : 실시예G) (참조 : 제 12 도).

[K) 발현 플라스미드 parpATER103의 제조]

발현 플라스미드 parpER33으로부터 출발해서, 인공 리보조솜 결합부위와 함께 이.콜라이에서 플라스미드 안정성을 증가시키는 "par"서열 및 트립토판 프로모우터-오퍼레어터 서열을 플라스미드 벡터 pAT153(Amersham)중에 삽입시킨다. pAT153은 DNA(참조 : 문헌 36)의 유동화를 위해 필요한 부분이 부족한, 플라스미드 pBR322를 짧게 만든 유도체이다.

플라스미드 parpATER103의 제조방법은 제 13 도에 도시되어 있다. 플라스미드 parpER33을 HindⅢ로 완전히 절단하고 EcoRI으로 부분적으로 절단하여, 생성된 0.47kb길이의 DNA단편을 아가로스 겔로부터 분리시키고, 정제하며, EcoRI 및 HindⅢ로 이중 절단시킨 pAT153으로 연결시키다. 이.콜라이 HB101의 형질전환후 수득되고 여러가지 제한효소로 분해시켜 측정한 바람직한 구조의 플라스미드를 parpATER103으로 칭한다.

[L) 이.콜라이에서 성숙한 Eq-IFN-α1의 직접발현]

발현 플라스미드 pAH52, pAH52/2 및 pAH53의 제조 및 이의 예비단계는 제 14 도에 나타나 있다. 20mcg의 플라스미드 pAH50(참조 : 실시예 F)를 30유니트의 HindⅢ(Boehringer Mannheim)으로 분해시키고, 전체 Eq-IFN-α1유전자를 함유하는 4.2kb길이의 DNA단편을 DE81페이퍼(Whatman)로 아가로스겔로부터 분리시키고 정제시킨다. 이렇게 하기 위해, 아가로스 겔 중의 DNA단편을 분리시킨 후, 분리시킬DNA 밴드 앞뒤에서 슬롯(slot)을 절단하고 DE81페이퍼의 스트립을 슬롯 중에 삽입시킨다. 전기영동을 바람직한 DNA단편이 프론트 DE81스트림에 완전히 결합할 때까지 계속한다. 백 DE81 스트립은 커다란 DNA단편에 의해 오염을 방지한다 : 결합된 DNA 단편을 갖는 DE81 페이퍼를 5분 동안 400mcl의 저 염완충액(0.2M NaCl, 25mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA)으로 두번 세척한 다음, DNA를 10분에 걸쳐 200mcl의 고 염완충액(1M NaCl, 25mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA)으로 DE81페이퍼로부터 두번 용출시키고, 1ml의 에탄올로 침전시킨다. HindⅢ단편의 말단에 SphI 링커(linker)를 제공한다.

이를 위해, 0.2mcg의 SphI링커(Worthington)를 37℃에서 45분 동안 10mcl의 반응배지 중에서 2유니트의 폴리뉴클레오타이드 키나제와 함께 배양한다(70mM Tris-HCl, pH 7.6, 10mM MgCl₂, 1mM ATP, 5mM 디티오트레이트). 키나제 처리된 SphI링커 및 HindⅢ 단편을 4℃에서 20시간 동안 8유니트의 T₄-DNA 리가제로 연결시킨다. 이어서 효소를 70℃에서 탈활성화시키고, DNA를 100mcl의 총용적 중에서 30유니트의 SphI으로 분해시키고, 페놀 및 클로로포름으로 추출시키며, 에탄올로 침전시킨다. DNA를 리가제로 환형화하고, 이.콜라이 HB101로 형질전환시킨다. 바람직한 구조의 플라스미드를 pAH51로 칭한다. 이는 짧게 만든 3'-비-해독 영역 및 추가의 절단부위를 갖는 Eq-EFN-α1 유전자를 함유한다.

성숙한 말의 알파-인터페론의 DNA서열을 최종 구조물에서 장확한 거리에서 프로모터 서열에 연결시키기 위해, PvuⅡ로 절단된 20mcg의 플라스미드 pAH50으로부터 분리한 0.4kb길이의 DNA단편을 출발물질로 사용한다. 서열 5'-TGTGACCTGCCTCAC를 갖는 1n mol합성 15머 올리고뉴클레오타이드를 폴리뉴클레오타이드키나제로 인산화시킨다. 이것은 클론 pAH50으로부터 성숙한 Eq-IFN-알자 1의 제 1의 5개 아미노산을 암호화하는 서열을 함유한다. 15머를 약 7p mol의 0.4kb PvuⅡ 단편과 혼합하고, 총용적 34mcl중에서 5분동안 비등시켜 DNA 이본쇄를 변성시킨다. 냉각시킨 후, 일본쇄에 결합된 올리고뉴클레오타이드프라이머를 반응배지(50mH Tris-HCl, pH 7.2, 10mM MgSO₄, 0.1mM 디티오트레이톨, 50mcg/ml 소혈청 알부민, 각각 1mM의 dATP, dGPT, dCTP 및 dTTP) 70mcl중 3시간 동안 37℃에서 클레노우 단편 30단위로 연장시킨다. 그후 DNA를 반응배지(33mM Tris-아세테이트, pH 7.9, 66mM KAC, 10mM Mg(AC)₂0.5mM 디티오트레이톨, 0.1mg/ml 소혈청 알부민, 각각 1mM의 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP) 120mcl 중 20분 동안 37℃에서 T4 DNA폴리머라제 16단위와 함께 배양하여 어떠한 잔류하는 3'돌출부를 확실히 제거한다.

평활 말단을 갖는 생성된 DNA를 페놀 및 클로란포름으로 추출하고, 15분 동안 0℃에서 0.45M의 Na-아세테이트 및 0.6용적부의 2-프로판올로 침전시킨다. 서로 상보적인 2개의 인산화된 올리고뉴클레오타이드의 혼합물, 즉 12머 5'-AGCTTAAAGATG 및 8머 5'-CATCTTTA를 이 DNA단편에 연결시키고, 이 혼합물은 HindⅢ절단부위 및 해독출발 코돈 ATG를 생성한다. 70℃에서 효소를 불활성화시킨 후, 1n mol이배치의 두 -올리고뉴클레오타이드를 40시간 동안 4℃에서 14단위 리가제와 20mcl중에서 DNA단편에 연결시키고, 수득된 DNA를 80단위의 HindⅢ 및 20단위의 BglⅡ와 100mcl중에서 절단하고, 약 190bp길이의 DNA단편을 DE81페이퍼를 사용한 2% 아카로오스겔로부터 분리시키고, 정제한다. 생성된 DNA단편을, HindⅢ 및 BglⅡ로 이중 절단된 pAH51벡터 약 50ng와 연결시키고, 이.콜라이 HB101로 형질전환시킨다.

수득된 65콜로니중에서, HindⅢ/BamHI DNA단편을 목적하는 제한패턴을 갖는 4개의 플라스미드로부터 분리시키고, 이 단편을 생거방법에 의해 서열분석하고, 이에 의해 바람직한 서열을 갖는 두 클론을 수득한다. 이러한 플라스미드를 pAH51/2로 칭한다. 이 플라스미드는 해독 출발 코돈 ATG 및 HindⅢ절단 부위와 성숙한 EqIFNα1의 서열을 함유한다.

[발현 플라스미드 pAH52 및 pAH52/2의 제조]

20mcg 플라스미드 pAH51/2를 SphI 및 HindⅢ으로 이중 절단하고, 생성된 1.0kb길이의 DNA단편을 아가로오스겔로부터 분리시키고, 40ng HindⅢ 및 SphI로 이중절단된 panpATER103와 연결시킨다(참조 : 실시예 K). 이.콜라이 HB101을 형질전환시킨 후 수득된 바람칙한 구조의 플라스미드를 pAH52로 칭한다. 이것은 성숙한 EqIFN-α1의 유도성 발현에 필요한 모든 정보를 함유한다. 마찬가지로, HindⅢ 및 BamHI로 이중 절단된 pAH51/2 및, HindⅢ/BomHI으로 절단된 parpATER103으로 부터 플라스미드 pAH52/2를 제조한다. 이 발현 플라스미드는 pAH52보다 약 0.2kb 더 크고, 부가적으로 만일 BamHI절단 부위를 갖는다.

[플라스미드 pAH53의 제조]

트립토판 프로모터, 인터페론 유전자, 암피실린 내성 유전자 및 복제 기원이 한 방향으로 배향된, 이.콜라이에서 성숙한 Eq IFN-α1을 제조하는 실질적으로 작은 발현 플라스미드를 플라스미드 pAH52 및 pBR322로부터 제조한다. 10mcg pAH52를 SphI 및 EcoRI로 절단하고, 효소를 70℃에서 불활성화시키고, 1시간 이상 22℃에서 0.15mM dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP를 가한 후, DNA말단을 클레노우 단편으로 평활하게 만든다. DNA단편을 아가로오스 겔상에서 크기에 따라 분별하고, 프로모터 및 인터페론 유전자를 함유하는 1.1kb길이의 단편을 분리시킨다. 10mcg pBR322 플라스미드를 EcoRI 및 PvuⅡ로 이중 분해시키고, 말단을 상술한 바와 같이 클레노우 단편으로 평활하게 만든 후, 송아지 장내 포스페이타제로 탈인산화시킨다. 2.4kb길이의 DNA 단편을 아가로오스 겔로부터 분리시킨다. 이렇게 수득된 두개의 DNA단편을 T₄DNA리가제로 연결시키고, 이.콜라이 HB101를 형질전환시킨다. 이렇게 수득된 두개의 EcoRI인지부위를 갖는 플라스미드를 pAH53으로 표칭한다.

[M) EqIFN-2의 발현 플라스미드의 제조(pAH55)]

EqIFN-α1(pAH50) 및 EqⅡFN-α2(pRH63, 제 11 도) 유전자와 높은 동종성을 가지므로, 발현 플라스미드 pAH52/2(참조 : 실시예 L) 및 λ아클론 pRH63(참조 : 실시예 L)으로부터 EqIFN 2(참조 : 제 15 도)의 발현 플라스미드를 제조할 수 있다. 20mcg pRH63 플라스미드를 BglⅡ 및 BamHI로 2회 절단하고, 64아미노산 이후부터 EqIFN-α2의 암호화 서열을 함유하는 1.0kb길이의 생성된 DNA단편을 아가로오스 겔로부터 분리시킨다. 또한 10mcg의 플라스미드 pAH52/Ⅱ도 BglⅡ 및 BamHI로 절단하고, 말단을 송아지 장내 포스페이타제로 탈인산화시키고, 생성된 두 DNA단편중 더 큰것을 아가로오스겔로부터 수득한다. 이 DNA단편은 플라스미드벡터 성분, 프로모터, 성숙한 인터페론의 제 1의 63개의 아미노산에 대한 암호화 서열을 함유한다. 기술된 두 DNA단편을 리가제로 연결시키고, 이.콜라이 HB101을 형질전환시킨다. 이렇게수득된, 정확한 배향으로 삽입물(BamHI 및 BglⅡ로 절단할 수 있는)을 함유하는 플라스미드를 pAH55로 표시한다. 이 플라스미드에 의해 이.콜라이 내에서 성숙한 EqIFN-α2를 발현시킬 수 있다.

[N) 성숙한 EqIFN-β에 대한 발현 플라스미드 제조(pAH62)]

이 공정은 제 16 도에 도식적으로 나타나있다. 30mcg, pAH60 플라스미드를 150mcl용적중의 30단위HgiAI로 절단시킨다. 70℃에서 효소를 불활성화시킨 후, 3개의 프라임 돌출 DNA말단을 30분 동안 37℃에서 7단위의 T₄DNA 폴리머라제(각각 1mM의 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP첨가)로 선형화한다. SphI링커를 평활 말단에 연결시키고(참조 : 실시예 L), 생성된 1.85kb길이의 DNA단편을 아가로오스겔로부터분리시키고, HindⅢ 및 SphI로 이중 절단된 50ng 플라스미드 parpATER103과 연결시킨다. 이.콜라이 HB101을 형질전환시킨 후 수득된 플라스미드를 갖는 클론을 pAH61로 칭한다. 이 플라스미드는 발현 플라스미드를 작제하기 위한 중간단계를 구성한다. 20mcg 플라스미드 pAH61을 BamHI 및 SalI로 2회 절단시키고, 1.3kb길이의 생성된 DNA단편을 아가로오스겔로 분리시키고, 정제하고, BamHI/SalI 로 이중 분해된 M13 mp p파지 DNA와 연결시킨다. 이.콜라이 JM101을 형질전환시킨 후, 일본쇄 파지 DNA를 재결합 M13-파지(M13 pAH61)로부터 수득할 수 있다. 3p mol의 일본쇄 DNA를 50mcl 의 20mM TrisHCl, pH 8.0, 10mM MgCl₂중의 38p mol의 인산화된 15머 올리고뉴클레오타이드 5' GTGAACTATGACTTG와 혼합시킨 후, 95℃로 가열하고 주위온도로 천천히 냉각시킨다.

올리고뉴클레오타이드는 성숙한 β-인터페론 서열의 제 1염기로부터 정확하게 결합시킨다. 1시간이상 22℃에서 각각 3mM의 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP 및 15단위의 클레노우 단편을 가한 후, 15머 프라이머로부터 출발한 일본쇄에 의거하여 제 2본쇄의 합성을 100mcl 용적중에서 수행한다. 20mM의 EDTA를 가한 후, DNA를 페놀 및 클로로프름으로 추출하고, 에탄올로 침전시킨다.

잔류하는 일본쇄 DNA단편을 2시간 동안 14℃에서 400mcl반응 혼합물(4mM Zm(Ac)₂30mM NaAc, 250mM NaCl, 5% 글리세린, pH 4.6) 중 150단위의 S1 뉴클레아제(Sigma)로 분해시킨다. EDTA를 가하여 반응을 중단시키고, 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, DNA를 에탄올로 침전시킨다. 12머 및 8머 올리고뉴클레오타이드 5'-AGCTTAAAGATG 및 5'-CATCTTTA의 혼합물을 이 처리에 의해 평활하게 만들어진 DNA에 연결시키고(참조 : 실시예 H), 생성된 DNA를 HindⅢ 및 SphI로 절단한다. 목적하는 1.1kb길이의 DNA단편을 아가로오스 겔로 분리시키고 HindⅢ/SphI로 이중 절단된 플라스미드 parpATER103과 연결시킨다. 이. 콜라이 HB101을 형질전환시킨후, 54콜로니를 수득한다. 이로부터 분리시킨 9플라스미드 DNA중에서, 1.3kb길이의 EcoRI/Sal I단편을 분리시키고 생거방법으로 서열분석한다. 목적하는 서열을갖는 플라스미드를 pAH62로 칭한다. 이 플라스미드는 이.콜라이내에서 성숙한 EqIFN-β 단백질이 효과적으로 발현한다. 성숙한 β-IFN유전자의 제 1염기 (G)가 결실된 플라스미드를 pAH62 δG1로 칭한다. 이 플라스미드는 다음 ATG(성숙한 β-TFN에서 아미노산 19에 상응)에서 해독시작에 의해 아미노 말단에서 단축된 β-IFN이 발현되는데, 이것은 비 단축된 단백질보다 상당히 작긴 하지만(참조 : 실시예 0) 놀랍게도 항바이러스 활성을 지닌다.

[O) 플라스미드 pAH52, pAH52/2, pAH53, pAH55, 또는 pAH62를 함유하는 이.콜라이 HB101에 의한 인터폐론 활성의 발현]

트립토판 유리 배지(양은 배지 ℓ당이다)[10g(NH₄)₂PO₄, 3.5g, KH₂PO₄, NaOH로 pH 7.3, 0.5g NaCl, 21g 카사미노산(산 가수분해된), 11g 글루코즈, 1mH MgSO₄, 0.1mM CaCl₂, 1mg 티아민-HCl, 20mg L-시스테인, 20mg 3-β-인돌아크릴산(IAA트립토판 오페론의 유도물질), 임의로 50 내지 100mg의 암피실린]중 600nm에서 하기에 명시된 흡광도가 될때까지, 세균 배양액 100ml를 37℃에서 격렬히 진탕시키면서 배양시킨다. 그후 세균을 5분 동안 4000rpm에서 원심분리에 의해 펠렛화시키고, 배양액 용적 1/10의 빙냉시킨 50mM Tris HCl, pH 8.0, 30mM NaCl로 현탁시키고, 빙냉시키면서 초음파 탐침(20KHz, 100watt)를 사용하여 30초 동안 2회 분쇄한다. 세로 파편을 4℃, 10,000rpm에서 10분 동안 제거하고, 잔사를 멸균 여과시킨후, 소포성 구내염 바이러스(VSV) 또는 뇌막심근염 바이러스(EMCV)의 세포변성 효과(CPE)를 측정하는 분석에서 인터페론 활성에 대해 시험한다.

[시험계]

NBL-6세포(ATCC CCL57, 말피부의 포피세포) /VSV

A549(ATCC CCL185, 사람 폐암 세포주)/EMCV

A549세포에 대한 역가를 사람인터페론 표준을 사용하여 국제단위로 표준화한다.

[P) 맥시세포의 단백질을 표지시켜 발현된 말 인터페론의 검출]

플라스미드-암호화된 단백질은 맥시 세포 기술(참조 : 문헌 37)을 사용하여 생체내에서 선별적으로 표지할 수 있다. 이.콜라이 CSR603을 통상적인 방법에 의해 발현 플라스미드로 형질전환시키고, 형질전환된 세균을 에탄올을 함유하는 전기영동 탐침 완충액으로 분해시키고, 15% 폴리아크릴아미드 겔중에서 단백질을 분리한다.

허쉐이 염용액(리터당) 허쉐이 배지(허쉐이 염용액 100ml당)

5.4g NaCl 2ml 20% 글루코즈

3.0g KCl 0.5ml 2%트레오닌

1.1g NH₄Cl 1.0ml 1% 로이신

15mg CoCl₂·2H₂O 1.0ml 2%프롤린

0.2mg MgCl₂·6H₂O 1.0ml 2%아르기닌

0.2mg FeCl₃·6H₂O 0.1lml 0.1% 티아민

87mg KH₂PO₄

12.1g Trs+HCl pH 7.4

제 17 도는 -80℃에서 Kodak Lancx-Regular 증감 필름을 사용하여 DuPont Cronex X-선 필름상에서 2일간 노출시킨 후 건조된 겔의 방사선 사진을 나타내는 암피실린 함유 한천 평판 상에서 선별한다. 맥시세포의 제조 및 단백질의 표지는 A.Sancar(참조 : 문헌 37)에 의해 기술된 바와 같이 수행한다. 세포를 OD 600nm=0.5될때까지 37℃에서 인돌아크릴산이 없는 배지(참조 : 실시예 O) 15ml중에서 배양시키고, 이 배양물 10ml을 페트리 접시내에서 UV살균 램프(15와트)를 사용하여 50cm거리에서 5초 동안 조사하고, 37℃에서 1시간 동안 계속 배양한다. 배양액을 D-사이클로 세린 100mcg/ml와 혼합하고 37℃에서 14시간 동안 배양한후, 원심분리하여 세균을 수거한다. 세포를 허쉐이(Hersheg) 염용액 5ml로 2회 세척하고, 인돌아크릴산 20mcg/ml를 함유한 허쉐이 배지 5ml에 현탁시키고, 37℃에서 2시간 동안 배양한다. 35S-메티오닌 5μCi/ml(1000Ci/mMol)을 각 배양액에 가한 다음, 37℃에서 1시간 동안 진탕한다. 세포를 수득하고, SDS 및 2-머캅토도이다.¹⁴C-메틸화된 단백질 혼합물(Amersham)을 분자량 표준으로 사용한다. 대조용으로 인터페론 유전자가 없는 프로모터만을 함유하는 플라스미드 pER103 및 2개의 사람 IFN-α2 arg유전자의 복사물을 함유하는 플라스미드 pER21/1을 사용한다. 약 18kd에서의 단백질 앤드는 플라스미드에 의해 발현된 인터페론이다.

[Q) 게놈성말 DNA에서 EqIFN-α, EqIFN-β 및 EqIFN-ω의 하이브리드화하는 서열의 검출]

IFN-α, IFN-β 및 IFN-ω의 인터페론 유전자와 높은 동종성을 갖는 말 게놈에서의 서열의 총 수를 검출하기 위해 다음 방법을 사용한다. 고분자량의 말 DNA(참조 : 실시예 A) 30mcg를 반응 용적 300mcl중의 상용하는 제한 효소 100유니트로 완전히 분해시키고, 트레이스마다 이 절단된 DNA 10mcg을 0.8% 아가로오스겔 상에서 크기에 따라 재용해시킨다.

DNA를 니트로셀룰로즈 필터상에 서던 이동시킨 후, 변성 및 고정시키고, 각 필터를 닉-해독된 탐침(65℃에서 17시간, 5×SSPE, 5×Denhardt용액, 0.1% SDS, 변성된 연어 혈청 20mcg/ml 약 6×10⁶cpm과 하이브리드화시킨다. EqIFN-α에 대한 탐침은 플라스미드 pAH52로부터의 1.0kb길이의 HindⅢ/SphI단편이고, EqIFN-β에 대한 탐침은 플라스미드 pAH62로부터의 1.1kb길이의 HindⅢ/SphI단편이며, 이들은 각각 완전히 성숙한 인터페론에 대한 암호화 서열을 함유한다. EqIFN-ω에 사용된 탐침은 플라스미드 pRH61로부터의 2.1kb EcoRI삽입물이다. 필터를 엄격한 조건하에 세척하여 세 인터페론 서열사이에 교차-하이브리드화가 일어날 수 없게한다 : 0.3×SSC(45mM NaCl, 4.5mM Na₃시트레이트), 0.1% SDS를 사용하여 65℃에서 45분간 4회 세척한다. 방사선사진은 -80℃에서 7일에 걸쳐 Kodak Lanex Regular증감 필름을 사용하여 DuPont Cronex X-선 필름상에서 수행한다.

제 18 도의 부호 설명 : 칼럼표제 : M=크기 표지물(람다×EcoRI/HindⅢ) E=EcoRI, H=HindⅢ, Ba=BamHI, P = Pst1, B = BglⅡ

[1) 개 DNA의 분리]

냉동 조직, 예를 들어, 개의 간을 액체 질소중에서 미세한 분말로 분쇄하고, 0.5M EDTA, 10mM Tris-HCl, pH 8.0,0.5% SDS, 0.lmg/ml프로테아제 K(20ml/g조직)중에 55℃에서 3시간 동안 배양한다. 수득된 점성 용액을 페놀 추출 및 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜(25/24/1 Vol)로 3회 추출시켜 단백질로부터 유리시키고, 50mM Tris-HCl 8.0,10mM EDTA,10mM NaCl로 투석하고, DNA를 에탄올 2용적을 사용하여 침전시킨다. DNA를 진공 중에서 완전히 건조시킨후, 이를 4℃에서 TE완충액(10mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA)중의 용액에 넣고, CsCl 1.273g/ml용액으로 20℃에서 40,000rpm으로 62시간 동안 원심분리 시킨다(Sorvall 50Ti rotor). CsCl구배를 적하시키고, DNA함유 분획을 TE완충액으로 투석한 다음, 에탄올 2용적으로 침전시키고, 70% 에탄올로 세척한 후 건조시키고, TE완충액(4℃)에 재용해시킨다.

완성된 DNA제제는 RNA를 함유하지 않으며 길이는 50kb이상이다(0.45% 아가로즈겔 상에서 전기영동으로 측정).

[2) 개 DNA의 크기 분별화 및 부분적인 엔도뉴클레아제 분해]

2개의 개 DNA 50mcg를 반응 배지(10mM Tris-HCl pH 7.5, 10mM MgCl₂, 1mM디티오트레이톨)450mcl중, 37℃에서 Sau 3A 2.0유니트로 배양한다. 40분 및 60분 후에 225mcl분취량을 취해 15mM EDTA와 혼합하고 70℃로 10분간 가열하여 반응을 정지시킨다. 0.3M Na아세테이트, pH 6.0을 가한 후, 에탄올 2.5용적을 사용하여 DNA를 침전시킨다. TE완충액에 재용시킨후, 약 1V/cm에서 밤새 TBE완충액(10.8g/ℓ, Tris, 5.5g/ℓ 붕산 0.93g/ℓ(Na₂EDTA)중의 0.45% 아가로즈겔 상에서 전기영동시켜 크기에따라 분리한다. 크기 표지물(EcoRI 및 HindⅢ로 이중 분해시키고 HindⅢ로 분해시킨 λDNA)를 사용하여, 10 내지 23kb길이의 DNA를 갖는 겔 단편을 절단하고, DNA를 300V에서 3시간 동안 투석 튜브중에서 겔로부터 전기 영동적으로 용출시키고(완충액 0.1×TBE), 사용 교시에 따라 일루팁-D칼럼(Schleicher 및 Sch

ll)상에서 정제한 다음, 에탄올을 사용하여 침전시킨다.

한편으로는 개 DNA 서열의 인위적인 하이브리드를 생성하고 다른 한편으로는 너무커서 더이상 λ파지로 패킹될 수 없는 DNA단편이 생성될 수 있는 개 DNA단편의 자체-연결을 방지하기 위해, 크기-분별된 개 DNA단편을 탈인산화시킨다.

이를 수행하기 위하여, DNA를 소의 장내 포스파타제 5유니트를 함유한 반응 배지(50mM Tris-HCl, pH 9.5, 1.0mM MgCl₂, 0.1mM Zn아세테이트, 1mM스페르미던) 140mcl중에서 30분간 37℃로 배양하고, 효소 5유니트를 더 가하고, 30분간 배양한다. 최종 농도가 25mM이 되도록 EDTA를 가한후, DNA를 페놀/클로로프름/이소아밀 알콜(25/24/ℓ 용적)로 1회, 클로로포름/이소아밀 알콜(24/ ℓ 용적)로 2회, 디에틸에테르로 3회 추출한 다음, 건조시키고 0.1×TE완충액에 용해시킨다.

[3) 개의 게놈 DNA라이브러리의 작제]

10 내지 23kb길이의 탈인산화된 개 DNA 단편을 λ벡터, 예를 들어, 파지 DNA의 BamHI단편을 제거하여 수득된 G-A-T-C점착 말단을 가진 λ-EMBL 3 또는 3A(참조 : 문헌 3)에 클론화한다.

벡터를 5mM의 MgSO₄가 함유된 LB육즙(참조 : 문헌 20)중의, 억제인자 supE를 가진 이.콜라이 균주, 예를 들어 이.콜라이 NM526, 538 또는 539(참조 : 문헌 3)에서 배양하고, 폴리에틸렌글리콜을 사용하여 침전시키고, CsCl-밀도 구배 원심분리로써 2회 정제한다(CsC1 0.71g/용액 ml, 45,000rpm에서 40시간, 20℃). TE완충액으로 투석한 후, 파지 DNA를 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜(25/24/1용적)로 2회 추출하고, 클로로포름/이소아밀 알콜(24/1용적)로 2회 추출하여 단백질로부터 유리시키고, 에탄올 침전시켜 농축시킨다.

최종 단편 EMBL 3A를 수득하기 위해, 파지 DNA 50mcg를 반응 배지(10mM Tris-HCl, pH 7.5, 10mM MgCl₂, 1mM디티오트레이톨) 450ml중, 37℃에서 2시간 동안 BamHI로 분해시킨 다음, 70℃에서 10분간 15mM EDTA를 사용하여 반응을 중지시키고, 에탄올을 사용하여 DNA를 침전시킨다.

재-연결을 피하기 위하여, 중간단편을 EcoRI으로 다시 절단하고, 절단된 올리고뉴클레오타이드를 이소프로판을 침전에 의해 제거한다.

BamHI-분해된 λ-DNA를 2시간 동안 37℃하에 450mcl의 10mM Tris-HCI, pH 7.5,100mM NaCl, 10mM MgCl₂중에서 EcoRI에 의해 완전히 분해시키고, 15mM EDTA를 가하고 70℃로 10분 동안 가열하여 반응을 중단시킨다. Na-아세테이트를 가하여 최종농도를 0.3M로 되게한 후, 3개의 큰 DNA단편을 0℃에서 15분 동안, 0.6용적의 이소프로판올로 침전시키고, 0.45M Na-아세테이트/0.6용적의 이소프로판올로 2회 세척하고, 0.3M Na-아세테이트/2.5용적 에탄올로 1회 세척하고, 15mcl의 0.1A TE완충액중에 용해시킨다. BamHI/EcoRI링커는 이 과정중 용액중에 잔류한다.

EMB1 3A단편(8mcg)을 약 5mcg의 10 내지 23kb길이의 개 DNA 및 10단위의 T₄-DNA리가제(NEN)와 배합하고, 50mcl의 연결배지(66mM Tris-HCl, PH 7.2,0.1M NaCl,10mM MgCl₂, 1mM EDTA, 5mM 디티오트레이톨, 0.5mM ATP) 중에서 14℃하에 밤새 배양하고 4℃하에서 1일동안 배양한다. 연결된 DNA 혼합물을 생체내 람다 패킹시스템을 사용하여 성숙한 람다-파지입자중에 패킹시킨다(참조 : 문헌27).

이 시스템의 성분, 즉 초음가 추출물(SE), 냉동-해동 용해질(FTL), 완충액 M1 및 A를 문헌(참조 : 문헌 27)에 따라 제조한다. 연결된 DNA 혼합물의 10mcl의 분취량을 25mcl의 FTL과 같이 30분 동안 얼음으로부터 해동시킨 SE와 함께 주위온도에서 2분 동안 배양하고, 100ml의 FTL을 가하고, 혼합물을 주위온도에서 60분동안 재배양한다. 패킹 혼합물을 150mcl의 λ희석액(100mM의 Trsi-HCl, pH 7.5, 10mM MgSO₄, 1mM EDTA)으로 희석하고, 4℃에서 저장한다.

소량의 패킹된 λ파지를 이.콜라이 균주 NM528 SupF상에서 분쇄한다. 전 과정을 수행하면 약 1×10⁶개의 독립적인 개 DNA제조합체가 생성된다. 패킹된 물질중 나머지를 NM 528상에 도말시켜 13.5cm의 LB/MgSO₄한천 평판당 30,000플라크-형성 단위 (pfu) 의 밀도로 증식시킨다.

[4) 인터페론 유전자에 대한 개의 유전자의 라이브러리의 스크리닝]

개 인터페론 유전자를 함유하는 재조합 파지를 동정하기 위하여, 방사선 표지된 사람 IFN-α유전자를 사용하여 서던-블롯(참조 : 문헌 17)에 의해 입증된 뉴클레오타이드 동족성을 이용한다.

10mcg의 고분자의 말 DNA를 EcoRI 또는 HindⅢ로 완전히 분해하고, 0.8% 아가로스 겔상에서 전기영동에 의해 용해시킨후, 니트로셀룰로오스 필터로 전위시킨다. P-32-표지된 DNA 단편을 통상적인 방법(참조 : 문헌 25)으로 발현 플라스미드 pER33(참조 : 문헌 14)로부터 기원하며 성숙한 사람 인터페론-α 2ARG에 대한 전체의 단백질-암호화 영역을 함유하는 845bp길이의 HindⅢ단편으로부터 제조한다. 니트로셀룰로오스 필터를 5 × SSPE(0.9M NaCl, 50mM NaH₂PO₄, 5mM EDTA, pH 7.4), 5 × Dephart용액 (0.1% 피콜, 0.1% 폴리비닐 피롤리돈, 0.1% 소혈청 알부민),0.1% SDS, 20mg/ml의 연어 정자 DNA 중에서 65℃하에 7시간 동안 예비하이브리드화시킨후, 연어 정자 DNA가 빠진 동일한 용액중에서 13×10⁶cpm 표지된 탐침과 하이브리드화시킨다. 65℃에서 밤새 배양한 후, 필터를 3×SSC(0.45M NaCl, 45mM Na시트레이트), 0.1% SDS로 65℃하에 1 내지 1.5시간 동안 4회 세척하고, Kodak Regular증감 필름을 사용하여 Kodak X-omat S-X-선 필름(참조 : 제 21 도)상에 7일 동안 노출시킨다. 수개의 밴드의 출현은 이미 소, 돼지 및 사람에서 검출된 바와 같이, 개에서 일부류의 α-인터페론 유전자를 나타낸다.

그러므로 동일한 하이브리드화 조건이 개의 DNA 라이브러리에서 인터페론 유전자를 스크리닝하는데 사용된다.

1,000,000개의 재조합 λ파지를 이.콜라이 NM528상에 30,000pfu/13.5cm의 평판의 밀도로 도말한다. 2층의 니트로셀룰로오스 복사물을 Benton 및 Davis에 의해 기술된 방법(참조 : 문헌 19)을 사용하여 각각의 평판으로부터 제조한다.

80℃에서 2시간 동안 베이킹시킨 후, 필터를 1M NaCl, 10mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.1% SDS 중에서 65℃하에 1.5시간 동안 세척하고, 전술한 바와 같이 밤새 예비 하이브리드화시키고, 24시간 동안 필터당 1.5×10⁶cpm의 방사선 표지된 α-인터페론 탐침과 하이브리드화시킨다. 스크리닝을 3회 반복한 후, 양성 하이브리드화 시그날을 제공하는 9개의 개의 α-인터페론 클론을 수득한다.

[5) 재조합 파지의 특성화]

파지 DNA는 사람 α-IFN과 하이브리드화하는 9개의 재조합체로부터 제조한다. DNA를 EcoRI, BamHI, HindⅢ, PstI, BgⅢ, Sa1I 및 SmaI로 분해시키고, 0.8% 한천 겔상에서 전기영동적으로 분리시킨다. 하이브리드화 단편의 크기를 서던 방법에 의해 측정한다. λ삽입물 내의 제한 부위의 위치는 Rackwitz 등에 의해 기술된 방법을 이용하여, λ DNA의 부분적인 제한 분해후, 람다 아암의 우 또는 좌측 점성 말단을 합성 P-32-표지된 올리고뉴클레오타이드로 표지하고, 0.45% 한천 겔상에서 전기영동시킨 후에 측정한다. 생성된 클론 Ca-α-H-2의 제한지도를 제 22 도에 나타내었다.

[6) 개의 인터페론 α 유전자의 아클론화]

사람 α 인터페론 표지물과 하이브리드화하는 클론 Ca-알파 H-2의 2개의 제한단편을 pBR322유도체 pUC9의 다수의 제한 효소클론화 부위내에 아클론화시킨다. 외인성 DNA단편을 삽입하면 β-갈락토시다제의 lacz유전자에 방해가 일어나므로, 플라스미드에 의해 형질전환된 이.콜라이 균주 JM101의 표현형을 lac⁺로부터 1ac^-로 변형시킨다. 비-작용성 β-갈락토시다제 때문에, 이소프로필티오갈락토사이드(IPTG)에 의해 유도된 JM101은 무색의 기질 유사체 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토사이드(BDIG)를 분해시켜 푸른색 염료를 생성시킬 수 없다. 그러므로 lac^-표현형을 갖는 세균 클로니는 그들의 백색에 의해 인식될 수 있다.

클론 Eq-α1의 3.7kb길이의 HindⅡ단편을 아가로즈겔로부터 용출시키고, 일루팁 -D칼럼상에서 정제하고, 약 10배 몰 과량으로 SmaI으로 절단된 40mg의 pUC 9벡터와 연결시킨 후, 탈인산화 반응시키고, 이.콜라이 JM101을 형질전환시키고, 톱 0.2mg/ml의 BCIG, 0.17mg/ml의 IPTG 및 0.1mg/ml의 암피실린을 갖는 LB톱 한천에 붓는다. 백색 콜로니를 0.1mg/ml의 암피실린을 함유하는 5ml의 LB육즙중에서 37℃하에 밤새 성장시키고, 플라스미드 소형 제조법(참조 : 문헌 25)에 의해 삽입된 단편을 스크리닝한다. 이와 같이 수득된 플라스미드를 pAH2로 칭한다. 유사하게 동일한 λ클론으로부터의 2.4kb SmaI단편을 pUC9에 아클론화시킨다. 생성된 플라스미드를 pAH4로 칭한다.

[7) 클론 Ca·α11-2로부터의 개의 α 인터페론 유전자의 DNA 서열]

pAH50의 1.7kb길이의 HindⅢ삽입을(Ca-α11-2의 3.2kb HindⅢ단편 아클론, 제 23 도)을 생거에 의해 기술된 디데옥시방법(참조 : 문헌 23)에 의해 솟건방법을 사용하여 서열분석한다. 60mcg의 pAH2 플라스미드 DNA를 HindⅢ으로 완전히 분해시키고, 1.7kb단편을 1%아가로즈 겔로부터 분리시키고, 전술한 바와 같이 정제한다.

15mcg의 이 단편을 100mcl의 연결배지중에서 14단위의 T₄-DNA 리가제로 14℃에서 밤새 이어서 4℃에서 추가의 4일 동안 그 자체와 연결시키고, 이 연결된 DNA를 빙욕중에서 20초 펄스의 초음파로 총 100 내지 140초 동안 소편으로 분해시킨다. DNA말단을 250mcl의 반응배지(50mM Tris-HCl, pH 7.5, 10mM MgCl₂, 1mM 디티오트레이롤, 각각 0.1mM의 dATP, dGTP, dCTP, dTTP,0.5mg/ml의 소혈청 알부민)중에서 14℃하에 2시간 동안 15단위의 이.콜라이 폴리머라제 I의 큰 단편(클레노우단편)으로 재생시킨다. 에탄올 침전에 의해 농축시킨 후, 이 방법으로 전처리된 DNA를 1% 아가로즈 겔상에서 분리시키고, 0.35 내지 1.0kb크기 범위의 DNA단편을 분리시켜 정제한다. 단편을 약 10배 몰 과량으로 SmaI로 절단된 박테리오파지 M13 mp8(참조 : 문헌 22)의 복제형태와 연결시키고, 탈인산화시킨 후 이.콜라이 JM101를 형질전환시킨다. 이와 같이 수득된 재조합 파지의 일본쇄 DNA를 분리시키고 합성 올리고뉴클레오타이드를 결합시킨 후, 제 2본쇄의 합성을 4개의 개별반응으로 이.콜라이 DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편을 사용하여 수행한다.

여러가지의 재조합 파지의 삽입물의 서열을 C.Pieler에 의해 변형된 Staden의 컴퓨터 프로그램(참조 : 문헌 24)을 사용하여 조합하여 제 24 도에 표시된 전체 서열을 형성한다.

이와 같은 방법으로 플라스미드 pAH4로부터 수득한 1.9kb길이의 HindⅢ단편(Ca-α11-2로부터 수득한 2.4kb길이의 SmaI 아클론, 제 23 도)을 서열분석한다(참조 : 제 25 도).

[8) 발현 플라스미드 pRH 100의 제조]

모든 효소 반응은 제조자에 의해 규정된 조건하에서 수행한다.

7mcg의 플라스미드 pER103[참조 : Eva Dworkin-Rastl et al., Gene 21(1983) 237-248, EP-A-0.115-613]을 제한 엔도뉴클레아제 HindⅢ으로 50mcl의 반응 배지내에서 선형화한다. 37℃에서 1시간 동안 배양한후, 50mcl의 2×CIP완충액을 가한다(2×CIP완충액=20mM Tris, pH=9.2, 0.2mM EDTA). 송아지 장에서 수득한 알칼리포스파타제 2유니트를 가한후, 5' 말단 포스페이트 잔기를 제거하고, 45℃에서 30분 동안 배양한다. 이 반응을 4mcl의 0.5EDTA용액과 10mcl의 1M Tris, pH=8.0용액을 첨가시켜 정지시킨다. 페놀로 2희 추출하고 페놀/클로로포름으로 1회 추출하여 단백질을 제거한다. 0.1용적 3M Na아세테이트 용액 pH=5.5과 250mcl에탄올을 첨가한 후 수성상으로부터 DNA를 침전시킨 다음, 원심분리한 후, DNA 침전물을 70% 에탄올 용액으로 1회 세척한다. 이 DNA를 건조시킨 후, 펠렛을 20mcl의 TE완충액(10mM Tris pH=8.0, lmM EDTA)중에 용해시킨다.

합성적으로 제조한 1mcg배취의 올리고데옥시 뉴클레오타이드 d(AGCTTAAAGATGAGCT) 및 d(CATCTTTA)를 10mcl의 반응용액중에서 10유니트의 T₄-PNK(폴리뉴클레오타이드 키나제) 및 1mM의 rATP를 첨가하여 인산화시킨다. 이 반응을 37℃에서 45분간 수행한다. 반응을 10분간 70℃로 가열하여 중지시킨다.

5mcl의 플라스미드 용액 및 인산화된 올리고뉴클레오타이드를 함께 혼합한 후,5분간 70℃로 가열한다. 그런후, 이 용액을 0℃로 냉각시킨 다음, 2mcl의 10×리가제 완충액(500mM Tris, pH=7.5), 100mM의 MgCl₂, 200mM의 DDT(디티오트레이톨), 1mM의 rATP, 500mcg/ml의 BAS(소 혈청 알부민), 2mol의 물 및 10유니트의 T₄-DNA 리가제를 가한다. 이 반응을 40시간 동안 4℃에서 수행한다. 그런후, 10분간70℃로 가열시켜 중지시킨다.

이 리가제 반응을 2mcl을 10유니트의 제한 엔도뉴클레아제 SacI(New England Biolabs)을 사용하여 37℃에서 3시간 동안 총 30mcl의 용액중에서 분해시킨다. 이 반응을 10분간 70℃로 가열하여 중지시킨다. 5mcl의 반응 혼합물을 10유니트의 T₄-PNK를 첨가하여 14℃에서 16시간 동안 종 30mcl중에서 연결시킨다.

200mcl의 컴피턴트 이.콜라이 Hb101을 10mcl의 상기 리가제 반응물과 혼합한다. 이 세균을 빙욕상에서 45분간 방치시킨 다음 2분간 42℃로 가열하여 DNA가 흡수되도록 한다. 그런다음, 세균 현탁액을 0℃에서 10분동안 재배양한다. 최종적으로 형질전환된 세균을 50mcg/ml의 암피실린을 함유하고 있는 LB한천상에 도말한다.

생성된 세균 콜로니로부터 12개의 콜로니를 무작위로 선별하여 이들로부터 플라스미드를 현미경적 규모로 분리한다[참조 : Birnboim and Doly, NucI. Acids. Res, 7(1979) 1513-1523)]. 수득한 DNA를 제한 엔도뉴클레아제 SacI 으로 절단하고 DNA를 아가로스 겔(1%, 1×TBE완충액)상에서 분리한다. 약 4,400bp로 측정되는 선형분차로서의 DNA의 이동은 SacI인지 부위가 플라스미드에 삽입된 것을 입증한다. 이.콜라이 HB101를 연관된 소형 제제로부터의 DNA로 형질전환시킨다. 수득된 형질전환 세균으로부터 하나의 콜로니를 선별하여 큰 규모로 성장시킨다. 이로부터 분리된 플라스미드를 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI와 BamHI으로 절단시키고, DNA는 1% 아가로스 겔상에서 분리시켜 작은 단편은 전기 용출법에 의해 겔로부터 분리시킨다. 약 460bp길이의 EcoRI-BamHI DNA단편을 생거에 의한 방법으로 서열분석한다[참조 : F.Sanger et al., Proc.Natl.Acad.Sci.(1977)5463-5467]. 이러한 방식으로 분석되는 플라스미드를 pRH100으로 칭한다.

[9) 이.콜라이내에서 성숙한 CaIFN-α1의 직접 발현]

성숙한 CaIFN-α1에 대한 발현 플라스미드 pAH4/2의 작제공정을 제 28 도에서 도식적으로 나타내었다. 5mcg의 플라스미드 pRH100을 제한 엔도뉴클레아제 BamHI으로 완전히 절단시킨 후, 5' 말단 포스페이트 잔기를 소의 장내 포스파타제(CIP)로 제거한다.

30mcg의 플라스미드 pAH(참조 : 실시예 6)를 BamHI으로 분해시킨다. 아가로스 겔내에서 DNA를 전기영동법으로 분리시킨 후, CaIFN-α1에 대한 전체 암호화 서열을 함유하는 0.6kb길이의 DNA 단편을 겔로부터 분리한 다음 정제한다.

상기 0.6kb길이의 DNA단편 약 1mcg을 10유니트의 T₄DNA리가제를 사용하여 14℃에서 24시간 동안 10mcl의 연결배지(66mM Tris-HCl, pH 7.2, 0.1M NaCl, 10mM의 MgCl₂, 1mM의 EDTA, 5mM의 디티오트레이톨, 0.5mM의 ATP)중에서 25ng의 절단 pRH100 벡터 DNA와 연결시킨다. 컴피턴트 이.콜라이 HB101를 상기 연결 반응물 5mcl로 형질전환시킨 후, 50mcg/ml의 암피실린을 함유하는 LB한천상에 도말한다.

수득된 세균 콜로니로부터, 플라스미드를 현미경적규모로 분리하고, 여러가지 효소를 사용한 제한 분석법으로 특징화한다. 동일 배향으로 인터페론 유전자 및 트립토판 프로모터를 함유하는 플라스미드를 pAH104(참조 : 제 28 도)로 칭한다. 이 플라스미드는 성숙한 CaIFN-α1에 대한 최종 발현 플라스미드를 제조하기 위한 중간 단계를 구성한다.

[발현 플라스미드 pAH4/2의 제조]

0.6kb길이의 플라스미드 pAH4의 단편 약 7p mol을 먼저 T₄뉴클레오타이드 키나제에 의해 5'말단에 프스페이트 그룹이 제공된 1n mol의 합성 올리고데옥시뉴클레오타이드(d TGCCACCTGCCCGAC)와 혼합한 후, 물을 이용하여 총용적이 34mcl이 되도록 한다. 15머 올리고뉴클레오타이드는 성숙한 개의 α 인터페론의 N-말단 5개의 아미노산을 암호화하는 서열을 함유한다. 이 DNA용액을 5분간 100℃로 가열한 후, 냉각시키며, 이때 초과량으로 존재하는 올리고뉴클레오타이드는 DNA 일본쇄의 상보적 부위에 결합된다.

제 2본쇄는 이.콜라이 인터페론 폴리머라제 I의 클레노우 단편 35유니트를 사용하여 70mcl의 반응배지(50mM의 Trsi-HCl pH 7.5, 10mM의 MgCl₂, lmM의 디티오트레이톨, 0.5mg/ml의 소 혈청, 알부민, 각각 1mM의 dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 중에서 결합 올리고뉴클레오타이드 프라이머로부터 출발하여 22℃에서 90분 동안 합성한다. 이 반응을 20mM의 EDTA를 첨가하여 정지시키고, 단백질을 페놀/클로로포름 추출에 의해 제거시킨다. DNA를 pH6의 0.1용적 3M나트륨 아세테이트 용액을 첨가한 후 에탄올로 침전시킨 다음, 70% 에탄올로 세척시킨다.

잔류하는 일본쇄 DNA단편을 S1 뉴클레아제로 제거시킨다. 이것은 건조된 DNA 펠렛을 300mcl의 SI반응 완충액(4mM의 ZnCAC)₂, 30mM의 NaAc, 250mM의 NaCl, 5% 글리세린, pH 4.6)중에 용해시킨 후, 150유니트의 S1뉴클레아제(Sigma)로 14℃에서 2시간 동안 배양하여 수행한다. 이 반응을 20mM의 EDTA를 첨가하여 정지시킨다. 단백질을 페놀 및 클로로포름으로 추출함으로써 제거시킨다. 0.15용적의 3M Na아세테이트 용액 및 0.6용적의 이소프로판올을 첨가한 후, DNA를 0℃에서 수성상으로부터 침전시킨 다음 70% 에탄올로 세척한다.

수득된 DNA를 60유니트 PstI을 사용하여 37℃에서 2.5시간 동안 분해한 다음,2% 아가로스 겔내에서 전기영동으로 분리한다. 약 300bp길이의 DNA단편들을 분리하고 정제한다. 30mcg의 플라스미드 pAH104를 37℃에서 2시간 동안 50유니트, SacI로 분해한 후, 70℃에서 10분간 효소를 불활성화시킨다. 0.5mM의 모든 네개의 데옥시뉴클레오타이드와 30유니트의 클레노우 폴리머라제를 첨가한 후, 이 혼합물을 주위 온도에서 60분간 배양하여 DNA말단을 평활말단으로 되게한다. 단백질들을 페놀과 클로로포름으로 추출시켜 제거시킨 다음, DNA를 에탄올로 침전시킨다. 이렇게 하여 수득한 DNA를 40분간 37℃에서 20유니트 PstI로 부분적으로 절단시킨 후, 20mM의 EDTA를 첨가시켜 반응을 중지시킨다. 이 DNA를 아가로스 겔 내에서 전기영동법으로 분리시킨 후, 4.3kb길이의 단편들을 분리하여 정제한다.

이렇게 하여 수득한 DNA를, 10유니트 T₄-DNA 리가제를 사용하여 10mcl의 연결배지내에서 상술한 0.3kb길이의 DNA단편과 14℃에서 20시간 동안 연결시킨다. 이.콜라이 HB101을 상기 연결반응물로 형질전환시키고 암피실린을 함유하는 LB-한전상에 도말한다.

생성된 세균 콜로니를 신선한 한천 평판에 전위시키고, 한전 평판상에 위치한 니트로셀룰로즈 필터로 복제시킨다. 37℃에서 배양한 후, 하기 문헌에 기술된 방법으로 세균을 용해시키고(참조 : M. Grunstein ＆ D. Hognes, Proc. Natl. Acal. Sci. USA(1975) 72 3961∼), DNA를 변성시킨 후, 니트로셀룰로즈에 결합시킨다. 세포 파편을 예비-세척용액(1M NaCl, 50mM Tris HCll pH 8.0, 1mM EDTA, 0.1% SDS)중에서 16시간 동안 65℃로 배양하여 제거시킨다. 다음, 필터를 10ml의 하이브리드화 용액(0.9M NaCl, 90mM Tris-HCl pH 7.5, 6mM EDTA, 0.1% SDS, 이.콜라이로부터의 tRNA(Singma) 0.1mcg/ml)중에서, 2×10⁷cpm의³²p-표지된 올리고데옥시 뉴클레오타이드 d(TGCCACCTGCCCGAE)와 47℃에서 3시간 동안 하이브리드화시킨다.

18p mol의 올리고뉴클오타이드를, 10유니트의 T₄-폴리뉴클레오타이드 키나제(BRL)를 사용하여 20mcl의 인산화 완충액(70mM Tris-HCl, pH 7.6,10mM MgCl₂, 5mM 디티오트레이톨)중에서 180p mol의[γ³²P] ATP(300Ci/mmol, Amershan)와 함께 37℃에서 45분간 배양한다. 25mM의 EDTA를 가하여 반응을 궁지시키고, 1ml의 Biogel P6-DG(Biorad) 컬럼상에서 배타(exclusion) 크로마토그라피하여 삽입되지 않은 방사능을 제거시킨다.

필터를 47℃에서 30분간 4회 세척한다. 세척액은 하이브리드화 용액과 동일하나 tRNA가 함유되어 있지 않다. 필터를 -80℃에서 Kodak α-Omat Regular증감 필름을 사용하여 Kodak α-Omat S α-선 X-선 필름상에 노출시킨다. 플라스미드 DNA를 소형 제조법으로 방사선 사진에서 양성 하이브리드화 시그날을 갖는 세균 콜로니로부터 분리시킨다. 플라스미드를 HindⅢ 및 BamHI로 완전히 절단시킨다. 아가로즈겔내에서 전기영동적 분리후 0.5kb길이의 제한 단편을 분리시키고 DNA 서열 분석을 생거 방법에 따라 수행한다.

목적한 구조를 갖는 플라스미드를 pAH4/2로 칭한다. 이는 이.콜라이 내에서 성숙한 CaIFN-α1을 발현시킬 수 있게 한다.

[10) 플라스미드 pAH4/3의 제조]

CaIFN-α1의 세균성 발현을 위해 작제된 플라스미드 pAH4/2(참조 : 실시예 9)로부터 얻은 유전자를, 세포당 더 많은 복제수 및 증가된 플라스미드 안정성을 갖는 변형된 플라스미드 벡터 parpATER103(참조 : 실시예 K)내에 아클론화한다.

0.5kb길이의 pAH4/2의 HindⅢ/BamHI분획 약 0.5mcg(참조 : 실시예 9)를 5유니트의 T₄-DNA 리가아제가 함유된 10mcl의 연결 배지내에서 22℃에서 3시간 동안, HindⅢ 및 BamHI로 절단시켜 겔-정제시킨 플라스미드 벡터 parpATER103 25ng과 함께 배양한다. 이 리가제 반응액 5mcl을 사용하여 이.콜라이 HB101을 형질전환시키고, 50mcg/ml의 암피실린이 함유된 LB한천상에 놓는다.

수득된 세균 콜로니로부터 무작위로 6개를 선택하고, 이들로부터 현미경적 규모로 플라스미드를 분리한다. 여러가지 제한 엔도뉴클레아제로 제한 분석한 후 목적하는 구조를 갖는 플라스미드를 pAH4/3으로 칭한다.

[11) 플라스미드 pAH4/2 또는 pAH4/3를 함유하는 이.콜라이 HB101에 의한 인터페론 활성의 발현]

100ml의 세균 배양액을 격렬히 진탕시키면서 60nm에서 하기 명시된 흡광도가 도달할 때까지 하기와 같은 성분으로 이루어진 트립토판-유리 배지(주어진 양은 배지 ℓ당 이다)중에서, 37℃에서 배양한다 : 10g의 (NH₄)₂PO₄, 3.5g의 KH₂PO₄, NaOH로 pH 7.3, 0.5g의 NaCl, 21g의 카사미노산(산성가수분해된것),11g의 글루코즈, 1mM의 MgSO₄, 0.1mM의 CACl₂, 1mg의 티아민-HCl, 20mg의 L-시스테인, 20mg의 3-β-인돌아크릴산 IAA, 트립토판 오페론의 유도인자, 임의 성분의 50 내지 100ng의 암피실린.

이어서 세균을 5분간 4000rpm으로 원심분리시켜 펠렛화시키고, 빙냉각된 50mM Tris-HCl, pH 8.0, 30mM NaCl의 배양용적

로 현탁시킨 후, 빙냉시키면서 초음파(20KHz, 100watt)로 30초 동안 2회 분쇄한다. 세포 파편을 10,000rpm(4℃)에서 10분간 제거하고 멸균 여과한후, 상등액을 소포성 구내염 바이러스(VSV)의 세포변성효과(CPE)의 감소를 측정하는 분석으로 인터페론의 활성을 체크한다.

시험 시스템 : A-72(ATCC CRL1542)개 종양/소포성 구내염 바이러스

플라스미드 OD 600nm IFN유니트/ℓ 세균 배양액

pAH4/2 4.2 3.2×10⁵

pAH4/3 3.2 3.0×10⁵

[12) 게놈성 개 DNA내에서 CaIFN-α1 및 EqIFN-ω와 하이브리드화하는 서열의 탐지]

IFN-α 또는 IFN-ω의 인터페론 유전자와 높은 동종성을 갖는 개 게놈내의 서열의 총수를 검출하기 위하여, 하기 방법을 사용한다 :

20mcg의 고분자 개 DNA(참조 : 실시예 1)을 200mcl의 반응용액중의 60유니트의 상용하는 제한 효소로 완전히 분해시키고, 트레이스당 절단된 DNA 10mcg을 0.8아가로즈 겔상에서 크기에 따라 분리시킨다. 니트로셀룰로즈 필터로 서던 전위시킨후, DNA를 변성 및 고정시키고, 각 필터를 닉-해독된 DNA 탐침 약 6×10⁶cpm과 하이브리드화시킨다(65℃에서 17시간, 5×SSPE, 5×Denhardt용액, 0.1% SDS,20mcg/ml의 변성된 연어 정자 DNA, 실시예 4).

CaIFN-α에 대해 사용된 탐침은 인터페론에 대한 전체 암호화 서열을 함유하는 플라스미드 pAH4의 0.6kb길이의 BamHI단편이다. EqIFN-ω에 대해 사용된 탐침은 플라스미드 pRH61로부터의 2.1kb길이의 EcoRI삽입물이다.

이어서, CaIFN-α1과 하이브리드화된 필터를 엄격한 조건하에 65℃에서 45분간 0.3×SSC(45mM NaCl, 4.5mM Na₃시트레이트), 0.1% SDS로 4회 세척한다. EqIFN-ω와 하이브리드화된 필터를 65℃에서 2×SSC(0.3M NaCl, 30mM Na₃시트레이트), 0.1% SDS로 세척한 후, 65℃에서 45분 동안 0.3×SSC(45mM NaCl, 4.5mM Na₃시트레이트), 0.1% SDS로 4회 세척한다. EqIFN-ω와 하이브리드화된필터를 65℃에서 2×SSC(0.3M NaCl, 30mM Na₃시트레이트), 0.1DNA SDS로 세척한다.

Kodak-Lanex Regular증감 필름을 사용하여 Dupont Cronex X-선 필름상에서 7일간 -80℃에서 방사선 사진을 찍는다.

방사선 사진(참조 : 제 29 도)으로부터, 동일 α-인터페론을 암호화하는 두개의 쇄 이외에는, 개 게놈에서는 다른 종류의 인터페론내에서 발생하는 것과 같은 CaIFN-α1과 유사하게 높은 정도의 동종성을 갖는 다른 서열을 탐지할 수 없다는 것을 알 수 있다. 말의 ω-인터페론 유전자의 DNA 경우, 보다 덜 엄격한 조건하에서 상술한 개의 α-인터페론과는 다른 유전자 하나 이상을 검출할 수 있다.

[13) λ-클론 Eq-α16의 제 2의 말의 인터페론 유전자(EqIFN-ω2)의 아-클론화 및 서열분석]

사람 α-IFN탐침(참조 : 실시예 D, E)과 약하게 하이브리드화하는 λ-클론 Eq-α16(참조 : 제 30 도)의 5.5kb EcoRI제한 단편을 플라스미드 pUC8의 EcoRI부위로 아클론화시킨다. 이.콜라이 JM101을 연결 혼합물로 형질전환시킨다. 정확한 삽입물을 함유하는 플라스미드를 pRH62로 칭한다. 플라스미드 pRH62의 EcoRI삽입물을 아가로즈 겔로부터 분리시키고, 실시예 6에 기술된 숏건법을 사용하여 M13 mp8로 아클론화시킨다. 이.콜라이 JM101을 형질전환시킨후 얻어진 파지 플라크를 Benton 및 Davis(참조 : 문헌 19)의 방법에 따라 니트로셀룰로즈막으로 옮긴다(참조 : 실시예 D). EqIFN-ω1의 전체 암호화 영역을 함유하는 플라스미드 pRH61의 0.1kb HindⅢ 단편을 하이브리드화 탐침으로 사용한다. 일본쇄 DNA의 분리 및 생거법에 의한 서열분석을 위해, 하이브리드 시그날을 생성하는 재조합 M13파지를 선택한다. 측정된 DNA서열(참조 : 제 31 도)은 작용성 말 인터페론 유전자에 대한 완전한 암호화 영역을 함유한다. 이는, 플라스미드 pRH61의 말 인터페론(참조 : 실시예 J, 제 32 도)과 HuIFN-ω1[172개의 아미노산을 가진 성숙 인터페론암의 23개의 아미노산의 리더 펩타이드 의 동종성 때문에, EqIFN-ω2로 칭한다. EqIFN-ω2는 놀랍게도 성숙한 단백질의 86번 위치에서 5번째 시스테인 잔기를 함유한다. 두개의 말의 ω-인터페론 사이의 동종성은 성숙한 단백질의 아미노산 29에서 시작하여 매우 높다. 78 내지 80위치의 N-글리코실화 부위(Asn-Thr-Thr)뿐만 아니라 4개의 시스테인 잔기가 완전히 유지된다(참조 : 제 31 도, 제 32 도). 소 및 사람의 ω-류의 인터페론에 대한 아미노산 동종성은 말 α-인터페론(57 내지 60%, 제 33 도)보다 높다(61 내지70%).

[14) 두개 이상의 말 α-인터페론 유전자(EqIFN-α3, EqlFN-α4)의 아클론화 및 서열분석]

사람 α-IFN탐침(참조 : 실시예 D, E)와 하이브리드화하는 λ-클론 Eq-α24의 3.2kb HindⅢ 제한 단편을 플라스미드 pUC8의 HindⅢ부위에 아클론화시킨다. 이.콜라이 JM101을 형질전환시켜 수득된, 정확한 삽입물을 함유하는 플라스미드를 pRH83으로 칭한다. 동일한 방법으로, λ-클론 Eq-α9의 2.8kb HindⅢ제한 단편을 pUC8에 클론화시키고 수득된 재조합 플라스미드를 pRH82로 칭한다. 이 플라스미드의 HindⅢ삽입물을 상술한 숏건법에 따라 M13 mp8로 아클론화시킨다. 이.콜라이 JM101을 형질전환시킨 후 수득된 파지를 Benton 및 Davis의 방법에 따라 하이브리드화시킨다. 일본쇄 DNA의 분리 및 생거법에 의한 서열 분석을 위해, 성숙 EqIFN-α1의 암호화 서열을 함유한, 플라스미드 pAH52/2(참조 : 실시예 G)의 1.0kb HindⅢ-BamHI단편에 하이브리드화하는 파지를 사용한다. 제 34 도 및 제 35 도에 나타나 있는 DNA 서열로부터, 이들 단편이 EqIFN-α3(pRH83으로부터 수득) 및 EqIFN-α4(pRH82로부터 수득)으로 명명된작용성 말 α-인터페론 유전자를 함유한다는 것을 알 수 있다. 유전자는 23개 아미노산의 시그날 펩타이드 및 161개 아미노산의 성숙한 단백질로 이루어진 폴리펩다이드를 암호화한다. EqIFN-α1(pAH50)의 DNA서열과 EqIFN-α3의 DNA서열 사이 및 EqIFN-α2(pRH62)의 DNA 서열과 EqIFN-α4(pRH82)의 DNA서열 사이에는 각각 현저하게 높은 동종성이 있다. EqIFN-α1 및 EqIFN-α3의 성숙한 단백질의 아미노산 서열은 동일하다. 이 경우, 뉴클레오타이드 서열의 변화는, 유전자 코드의 축퇴로 인해, 아미노산 서열의 변화를 야기시키지 않는다. EqIFN-α3는 EqIFN-α1의 대립변이체일 것이다.

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Claims (9)

1. (a) EqIFN-α,-β, 또는 -ω 또는 CaIFN-α를 암호화하는 유전 서열을 발현 벡타내에 함유시키고 : (b) (a)에서 제조된 벡타로 숙주 유기체를 형질 전환시키고 : (c) 유전 정보를 발현시켜 숙주 유기체내에서 EqIFN-α,-β, 또는 -ω, 또는 CaIFN-α를 생성하고 : (d) 생성된 인터페론 EqIFN-α,-β, 또는 -ω, 또는 CaIFN-α를 분리시키고 정제시킴을 특징으로 하여, EqIFN-α,-β, 또는 -ω, 또는 CaIFN-α를 제조하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 숙주 유기체가 원핵 세포, 진핵 세포, 또는 포유동물 세포인 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 유전 서열이 단백질을 발현시킬 수 있으며 숙주 유기체내에서 복제 가능한 벡터내에 함유되는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 암호화 서열이 구조식(Ib) 내지 (Vb)의 서열 또는 이들 서열의 축퇴(degenerate) 변이체인 방법.

   

   [구조식 (Ib)]

   

   [구조식 (Ⅱb)]

   

   [구조식(Ⅲb)]

   

   

   [구조식(Ⅳb)]

   

   [구조식(Ⅴb)]
5. 제 1 항에 있어서, 암호화 서열이 85%이상의 동종성을 나타내는 엄격한 조건하에서 플라스미드 pAH50, pAH62, pRH63, pRH61, pAH160, pAH2, 또는 pAH4의 삽입물과 하이브리드화되는 방법.
6. 제 1 항에 있어서, 인터페론이 구조식(Ia) 내지 (Va)의 아미노산 서열 또는 이들 서열의 생리학적으로 활성인 변이체를 함유하는 방법.

   

   

   [구조식(Ⅰa)]

   

   [구조식(Ⅱa)]

   

   

   [구조식(Ⅲa)]

   

   

   [구조식(Ⅳa)]

   

   [구조식(Ⅴa)]
7. 제 2 항에 있어서, 숙주 유기체가 에스훼레키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 사카로마이세스 세레비지 애 (Saccharomyces cerevisiae) 인 방법.
8. 제 3 항에 있어서, 벡터가 플라스미드 pAH52, pAH52/2, pAH53, pAH55, pAH62, pAH4/2 및pAH4/3으로 이루어진 그룹중에서 선택된 발현 벡터인 방법.
9. 제 5 항에 있어서, 코드화 서열이 90%이상의 동종성을 나타내는 엄격한 조건하에서 하이브리드화되는 방법.

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