DK162282B

DK162282B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af 26,26,26,27,27,27-hexafluor-1alfa,25-dihydroxycholecalciferoler samt 26,26,26-27,27,27-hexafluor-1alfa,3beta,25-trihydroxycholest-5,7-dien til anvendelse som udgangsmateriale ved fremgangsmaaden

Info

Publication number: DK162282B
Application number: DK137083A
Authority: DK
Inventors: Hector F Deluca; Yoko Tanaka; Nobuo Ikekawa; Yoshiro Kobayashi
Original assignee: Wisconsin Alumni Res Found
Priority date: 1981-07-27
Filing date: 1983-03-25
Publication date: 1991-10-07
Also published as: DK137083D0; AU6056086A; GB2118556B; IE891226L; DK137083A; AU586267B2; DE3248900T1; IT8222574A0; IL76091A; NL8220265A; DK165695B; IL76090A; IL66351A; JPH0348903B2; IL76091A0; DK554084D0; IL66351A0; GB2118556A; DK554084A; BE893943A

Description

i

DK 162282 B

Opfindelsen angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte 26,26,26,27,27,27-hexafluor-la, 25-dihydroxycholecalciferoler med den i krav l's indledning angivne formel, der er i besiddelse af vitamin 5 D-lignende virkning, hvilken fremgangsmåde er ejendom melig ved det i krav l's kendetegnende del angivne.

Opfindelsen angår desuden den hidtil ukendte forbindelse 26,26,26,27,27,27-hexafluor-la,30,25-trihydroxycholest- 5,7-dien til anvendelse som udgangsmateriale ved frem-10 gangsmåden.

Vitamin Dj er et velkendt middel til kontrol af calcium-og phosphorhomeostase. Hos normale dyr eller mennesker er det kendt, at denne forbindelse stimulerer tarmcal-ciumtransporten og knoglecalciummobiliseringen og er 15 i stand til at forhindre rakitis.

Det er også velkendt, at for at være virksom skal vitamin Dj omdannes in vivo til de hydro'xylerede former heraf. F.eks. hydroxyleres vitaminet først i leveren under dannelse af 25-hydroxy vitamin Dj og hydroxyleres 20 yderligere i nyren til frembringelse af la,25-dihydroxy vitamin Dj eller 24,25-dihydroxy vitamin Dj. Den Gi.-hydroxylerede form af vitaminet antages sædvanligvis for at være den fysiologisk aktive eller hormonale form af vitaminet og at være ansvarlig for, hvad der 25 betegnes som forbindelsernes vitamin D-lignende virkning, som f.eks. evnen til at forøge tarmabsorptionen af calcium og phosphat, mobilisere knoglemineral og tilbageholde calcium i nyrerne.

Efter at man har opdaget biologisk aktive nedbrydnings-30 produkter af vitamin D, har der været stor interesse for at fremstille strukturelt analoge af disse nedbrydningsprodukter, fordi sådanne forbindelser kan udgøre værdifulde terapeutiske midler til behandling af sygdomme, der stammer fra uregelmæssigheder inden for calcium- 2

DK 162282 B

stofskiftet. En hel række vitamin D-lignende forbindelser er blevet syntetiseret. Se f.eks. USA pate.ntskrif terne nr. 3 741 996, der omhandler l&i-hydroxycholecalciferol; nr. 3 907 843, der omhandler lot-hydroxyergocalciferol; 3 nr. 3 786 062, der omhandler 22-dehydro-25-hydroxychole- calciferol; nr. 3 906 014, der omhandler 3-deoxy-l&4-hydroxycholecalciferol og nr. 4 069 321, der omhandler fremstillingen af forskellige sidekæde fluorerede vitåmin D^-derivater og sidekædefluorerede dihydrotachysterolana-j.

10 loge.

Et fluorderivat af den anerkendte hormonale form af vitaminet 1,25-dihydroxycholecalciferol (1,25-(OH)) af særlig interesse er 24,24-difluor-1,25-(OH)> fordi forbindelsen er i besiddelse af mindst en lige så stor 15 for ikke at sige større virkning end 1(Se USA patentskrift nr. 4 201 881).

Af interesse er også 26,26,26,27,27,27-hexafluorderivatet af 25-hydroxycholecalciferol (se USA patentskrift nr.

4 248 791), der udviser større vitamin D-lignende virk-20 ning end 25-hydroxycholecalciferol.

Opfindelsen tilvejebringer en analogifremgangsmåde til fremstilling af de omhandlede derivater af vitamin D, der er i besiddelse af væsentligt større vitamin D-lignende virkning end den hormonale form af vitaminet, 25 1,25-(OH) 2D-j målt som forbindelsens evne til at stimu lere calciumtransporten i tarmen, til at mobilisere calcium fra knogler (forøgelse af serumcalciumindholdet) og målt som forbindelsens antirakitiske virkning målt ved hjælp af rottelinieforsøget.

30 Dette derivat er blevet identificeret som 26,26,26,27, 27.27- hexafluor-la,25-dihydroxych01ecålciferol (26,26 26.27.27.27- F6-lOd,25-(0H)2D3).

3

DK 162282 B

Forbindelsens ekseptionelt høje vitamin D-lignende virkning indicerer, at den let kan anvendes som en erstatning for vitamin D til forskellige allerede kendte formål og som et terapeutisk middel ved behandling af 5 sygdomme som f.eks. hypoparathyroidisme, pseudohypopara- thyroidisme, renal osteodystrophi, osteoporosis og andre typer af knoglesygdomme forbundet med calcium- og phos-phor-ubalance. Andre potentielle anvendelser kan være ved behandlingen af kælvningsfeber hos dyr, bensvaghed hos 10 kalkuner, kyllinger og andre fjerkræ og som profylaktisk middel over for bensvagheder hos andre husdyr.

De omhandlede forbindelser kan let syntetiseres således som angivet i følgende skema og i beskrivelsen, idet man går ud fra udgangsmaterialet 26,26,26,27,27,27-hexafluor-15 25-hydroxycholesterol-3-THP-ether (USA patentskrift nr.

4 248 791). I den skematiske gengivelse og i beskrivelsen er ens forbindelser identificeret med ens numre.

DK 162282 B

A

yyC

ΤΉΡ ° , HO , I - T^:F: χγ<ί 0J^U olYJ £ ,γ-γί γ~γ& __j. /y xYj ^ YfY] c'p3

Ho ^ 5- AfP' & JY<2 Y-Yo^ ,γνν«%

-^ Cf=3 pj^j tT3 lp°W

/c£ 7 /..λ \»\/V<5Ac. 1 1 Λ ^ (LjClv'Y/Vol-f £ 7 5

DK 162282 B

(1) hydrolyseredes med p-toluensulfonsyre til fremstilling af 3-olen (2), der oxideredes med dichlordicyano-benzoquinon (DDQ). 1,4,6-trien-3-onen (3) opnåedes i 55 % udbytte. Behandling af trien-onen (3) med alkalisk 5 hydrogenperoxid gav 1,2-epoxidet (4) (97 % udbytte), der reduceredes med metallisk lithium og ammoniumchlorid i flydende ammoniak-tetrahydrofuran til opnåelse af 1-hydroxyforbindelsen (5) (65 %). Efter acetylering behandledes triacetatet (6) med N-bromsuccinimid og 10 herefter med collidin, hvorved der opnåedes 5,7-dienen (7). 5,7-dienen bestråledes med en mellemtrykskviksølvslampe i benzen-EtOH efterfulgt af termisk isomerisering i benzen-EtOH, der kogte med tilbagesvaling, til opnåelse af 26,26,26,27,27,27-hexafluor-1,3,25-triacetoxy vi-15 tamin (8), der herefter hydrolyseredes til det tilsva rende 26,26,26,27,27,27-hexafluor-1,25-dihydroxy vitamin °3 (9)*

Syntese af 26,26,26,27,27,27-hexafluor-la,25-dihydroxy- cholecalciferol_ 20 26,26,26,27,27,27-hexafluor-25-hydroxycholesterol (2) THP-etheren (1) syntetiseredes som beskrevet af Y.

Kobayashi, T. Taguchi, N. Kanuma, N. Ikekawa og J. Oshida, J.C.S. Chem. Comm. 459 (1980). Efter behandling af (1) (354 mg) med p-toluensulfonsyre (10 mg) i en blanding 25 af CI^C^ (15 ml) og MeOH (8 ml) ved stuetemperatur i 2 timer, tilsattes NaHCO^-opløsning til reaktions-blandingen, der ekstraheredes med Cl^C^· Ekstrakten inddampedes, og inddampningsresten omkrystalliseredes af benzen-cyclohexan, hvorved der opnåedes 212 mg af 3Q (2) med et smeltepunkt 180-181 °C, MS m/e 510 (M+), 495, 492, 477, 255, 213; NMR (acetone-Dg^O 0,71 (s, 18-H3), 0,95 (d, J = 6 Hz, 21-H3), 1,02 (s, 19-Hj), 3,40 (IH, m, 3-H), 5,32 (IH, m, 6-H).

6

DK 162282 B

Analyse beregnet for ^27^40^6^2: C 63,51, H 7,90, F 22,33.

Fundet: C 63,72, H 7,84, F 22,54.

26.26.26.27.27.27- hexafluor-25-hydrqxycholest-l,4,6- 5 trien-3-on (3)_

En blanding af (2) (893 mg) og DDQ (2,2 g) i dioxan (50 ml) omrørtes 15 timer ved 80 - 90 °C og opvarmedes herefter raexL tilbagesvaling i 4 timer. Efter afkøling til stuetemperatur frafiltreredes bundfaldet, og fil-10 tratet fortyndedes med ether, der vaskedes først med 1 nor mal Κ0Η og derefter med saltopløsning. Ekstrakten ren-sedes ved hjælp af silicagelsøjlechromatografi (Ac0Et-n-hexan, 1:20) til opnåelse af 490 mg (55) af trienonen (3) med smeltepunkt 166 - 168 °C (fra AcEt-cyclohexan), 15 MS rn/e 504 (M+), 489, IR(KBr), 3180, 1650, 1595 cm-1, NMR(CDC13)£ 0,72 (s, 18-H3), 0,95 (d, J’= 6 Hz, 21-H3), 1,18 (s, 19-H3), 5,88 - 6,33 (4H, m, 2-,4-,6- og 7-H), 7,04 (IH, d, J = 10 Hz, 1-H).

Analyse beregnet for 6® 2l 20 C 64,27, H 6,79, F 22,59.

Fundet: C 64,17, H 6,81, F 22,34.

26.26.26.27.27.27- hexafluor-25-hydroxy-loi,2a!-epoxy- cholest-4,6-dien-3-on (4)_

Til en opløsning af 27 mg NaOH og 1 ml 30¾ ^2^2 * 25 afgasset MeOH (20 ml) sattes en THF-opløsning (10 ml) af 497 mg af trienonen (3), og herefter omrørtes reaktionsblandingen 20 timer ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen fortyndedes med saltopløsning og ekstra-heredes med ether. Etherekstrakten chromatograferedes 7

DK 162282 B

på silicagelsøjle (AcOEt-n-hexan, 1:4) til opnåelse af 499 mg (97%) af epoxidet (4) med smeltepunktet 181 -184 °C, (fra AcOEt-cyclohexan), MS m/e 520 (M+), 505, 503, NMR (CDClj) S 0,70 (s, 18-Hj), 0,95 (d, J = 6 5 Hz, 21-H3), 1,00 (s, 19-H3), 3,45 (IH, m, 2-H), 3,62 (IH, m, 2-H), 3,62 (IH, d, J = 6 Hz, 1-H), 4,10 (IH, s, OH), 5,62 (IH, bs, 4-H), 6,04 (2H, s, 6- og 7-H).

26.26.26.27.27.27- hexafluor-lo!,25-dihydroxycholestrol (5)

Til en opløsning af 1,2 g lithium i 80 ml flydende ammo-10 niak (destilleret over Na) sattes dråbevis i løbet af 1 time og under tøris-acetoneafkøling 443 mg af epoxidet (4) i THF (70 ml), og herefter omrørtes reaktions-blandingen med tilbagesvaling i 1 time. Reaktionsblandingen afkøledes atter i tøris-acetonebad, og til blan-15 dingen sattes fast NH^Cl (12 g) i små portioner i lø bet af 1 time, hvorefter der opvarmedes med tilbagesvaling i 3 timer. Efter gennembobling med argongas for at fjerne NH^ sattes vand til reaktionsblandingen, og denne ekstraheredes med AcOEt. Ekstrakten chromatogra-20 feredes på silicagelsøjle. Fraktionen, der eluerede med

n-hexan og AcOEt (1:2) gav 274 mg (65%) af triolen (5) med smeltepunktet 201 - 202 °C, (fra CHCl^) MS beregnet for C27H4oF6°3: 52é>2879· Fundet: 526,2878. NMR

(CDClj) og acetone-Dg ^0,69 (s, 18-Hj), 0,93 (d, J = 25 6 Hz, 21-H3), 1,03 (s, 19-Hj), 3,83 (IH, m, 1-H), 4,00 (IH, m, 3-H) , 5,53 (IH, m, 6-H).

26.26.26.27.27.27- hexafluor-la,25-dihydroxycholeste- roltriacetat (6)_

En opløsning af 216 mg af triolen (5) og katalytiske 30 mængder (ca. 20 mg) af 4-dimethylaminopyridin.i eddikesyre (1,5 ml) og pyridin (3 ml) omrørtes 20 timer ved stuetemperatur. Herefter koncentreredes reaktionsbian-

DK 162282B

8

dingen i vakuum, og remansen chromatograferedes på silicagel (n-hexan-AcOEt, 10:1), hvorved der opnåedes 263 mg (98%) af triacetatet (6), der tørredes ved 70 °C (5 mm Hg) i 20 timer. 6: glas, MS m/e 5 592 (M+-AcOH), 532 (M+-2AcOH), 517, 413, 253, NMR

(CDC13) (f 0,66 (s, 18-Hj), 0,94 (d, 3 = 6 Hz, 21-H), 1,10 (s, 19-H3), 2,03, 2,06 og 2,16 (9H, hvert s, acetyl), 4,98 (IH, m, 3-H), 5,06 (IH, m, 1-H), 5,53 (IH, m, 6-H).

10 26,26,26,27,27,27-hexafluor-la,3β,25 triacetoxycho- lest-5,7-dien (7)____ N-brewnsuccinimid·· (14 mg) sattes til en opløsning, der kogte med tilbagesvaling, bestående af 35 mg triace-tat (6) i 2 ml CCl^, og reaktionsblandingen opvarmedes 15 yderligere med tilbagesvaling under en argonatmosfære.

Efter afkøling i et is-vandbad frafiltreredes det udfældede bundfald. Filtratet inddampedes til tørhed under 40 °C. Remanensen opløst i xylen (1 ml) sattes dråbe-vis til en opløsning, der kogte med tilbagesvalihg, 20 bestående af xylen (1,5 ml) og s-collidin (0,5 ml), og tilbagesvalingen fortsattes 20 minutter under en argonatmosfære. Reaktionsblandingen ekstraheredes med AcOEt, vaskedes med 2 normal HC1, mættet NaHCOj, saltop- -løsning, og opløsningen tørredes over MgSO^. Efter opløs-25 ningsmidlet var fjernet,, behandledes remanensen med en katalytisk mængde pTsOH i acetone (10 ml) ved stuetemperatur i 16 timer under argon i mørke. Blandingen ekstraheredes med AcOEt, og ekstrakten vaskedes med mættet NaHCOj og saltopløsning og tørredes her-30 efter over MgSO^. Fjernelse af opløsningsmidlet gav en rå 5,7-dien, der rensedes ved præparativ TLC fremkaldt to gange med et opløsningsmiddel af n-hexan-AcOEt (10:1). Båndet med Rf-værdien 0,26 afskrabedes, og elu-eredes med AcOEt. Fjernelse af opløsningsmidlet gav 9

DK 162282 B

8,8 mg (25?ό) af forbindelsen (7); UV(EtOH)X , 294, ro s x 282, 272 nm.

26.26.26.27.27.27- hexafluor-la,25-dihydroxyvitamin triacetat (8)_ 5 En opløsning af 5,7-dienen (7) (8,8 mg) i benzen (90 ml) og EtOH (40 ml) bestråledes med en mellemtrykskviksølvslampe gennem et Vycor-filter i 2,5 minutter under argon og isafkøling. Herefter opvarmedes blandingen 1 time under argon med tilbagesvaling. Afdampning af op-10 løsningsmidlet gav et råt vitamin D-de.ri.vat, der under kastedes præparativ TLC (fremkaldt to gange med hexan AcOEt (10:1)). Båndet med Rf-værdien 0,36 fjernedes og elueredes med AcOEt. Fjernelse af opløsningsmidlet gav en ren forbindelse (8) (1,6 mg) (25?i), UV (Et0H)A max 264,5, 15 λ min 228 nm.

26.26.26.27.27.27- hexafluor-lg, 25-dihydroyyvitamin D-, (9)

En opløsning_af triacetat (8) (1,6 mg) i 5% K0H-Me0H (2 ml) og THF (2 ml) omrørtes under argon i mørke ved stuetemperatur i 14 timer. Reaktionsblandingen syrnedes 20 med 2 normal HC1 og ekstraheredes to gange med AcOEt.

Ekstrakten vaskedes med mættet NaHCO^ og saltopløsning og tørredes over MgSO^. Fjernelse af opløsningsmidlet gav den rene forbindelse (9) (1,13 mg, 90?o), der rensedes ved HPLC. Forbindelse (9), UV(Et0H)\ ’ max 25 264,5 nn,\ . 228 nm, MS m/e 524 (M+), 506, 488, 473, min 462, 383, 287, 269, 251, 152, 134.

26.26.26.27.27.27- Fg-l,25-(0H)2D^-forbindelsen kan eventuelt fås i krystallinsk form ved', opløsning i et passende opløsningsmiddel eller opløsningsmiddelsystem som f. eks. ether, ether-hexan, methanol-ether, ethyl- 30 acetat-alkan, hvorefter opløsningsmidlet/opløsnings- 10

DK 162282 B

midlerne fjernes ved afdampning eller på anden kendt måde.

Eventuelt kan 5,7-dienen (7) også hydrolyseres således som beskrevet foran eller ved andre milde ba-5 siske hydrolysemetoder, der er velkendt inden for fagområdet, inden bestrålingen for at omdanne acetoxy-substituenterne til hydroxyl.

Biologisk aktivitet

Den biologiske aktivitet af 26,26,26,27,27,27-Fg- 1,25 (OH^D^ undersøgtes ved hjælp af passende in vivo 10 forsøg hos rotter i sammenligning med den biologi ske aktivitet af 1,25—(OH)^D3.

Lige fravænnede hanrotter købt hos Holtzman Co., (Madison, WI) fodredes ad libitum med vand og enten en lav phosphor, høj calcium, vitamin D-manglende 15 diæt (rakitogen diæt) således som beskrevet af Tanaka og DeLuca (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1974) 71, 1040, eller en lav calcium, tilstrækkeligt phosphor, vitamin D-manglende diæt, som beskrevet af Suda et al., (J. Nutrition (1970) 100, 1049) i tre uger.

20 Rotterne, der var fodret med den rakitogene diæt i 3 uger, opdeltes i 5 grupper med 5-6 rotter i hver og indgaves enten 3,25 pmol eller 13 pmol af enten 26,26, 26,27,27,27-F6-l,25-(0H)2D3 eller 1,25-(0H)2D3 opløst i 0,1 ml af en blanding af prppylenglycol-ethanol (95: 25 5) subcutant dagligt i 7 dage. Rotterne i kontrolgrup pen fik 0,1 ml propylenglycol-ethanolbærestof på samme måde. 24 timer efter sidste dosis aflivedes rotterne ved decapitation, blodet opsamledes for at måle koncentrationen af uorganisk phosphor i serUm, 30 deres duodena fjernedes for at måle tarmcalciumtrans-

DK 162282B

11 portaktiviteten og deres spoleben og albueben fjernedes for at måle den antirakitiske virkning som beskrevet nedenfor.

Tarmcalciumtransportvirkning som respons på de to ind-5 givne forbindelser måltes således som beskrevet af Mar tin og DeLuca (Am. J. Physiol. (1969) 216, 1351). Resultaterne er angivet i tabel 1, første kolonne.

Blodet centrifugeredes umiddelbart til opnåelse af serum. 10/¾ trichloreddikesyre sattes til serummet, 10 og den supernatante væske fjernedes efter centrifu gering og analyseredes således som beskrevet af P.S.

Chen et al., (Anal. Chem. (1956) 28, 1756). Resultaterne er angivet i tabel 1, anden kolonne.

15 Spoleben og albueben fra rotterne fjernedes, spaltedes på langs og farvedes med 1,5¾ sølvnitratopløsning. Bedømmelsen af den antirakitiske virkning udførtes som beskrevet i forbindelse med rottelinieforsøget angivet i U.S. Pharmacopoeia (15. udgave, Mack Publishing 20 Co., Easton, PA). Resultaterne er angivet i tabel 1, tredje kolonne.

DK 162282B

12

DC I

CO ZJ

•H P

-P -H

•H > ^

JsC P rH

co c*: ø ·>

P CO X rH

•H -H CD

-P -P .C rH +i

C -H C

CO ZU CD I IA

CO ' ·>

CT p CD O ΙΛ O rH

o ·η cn pc Λ\

E c -H

3 <C C

P

CD

CO

Ή Pi—I

O E

P JZ

O CL O

JZ CO o

O. O rH

CO JZ "v.

O Q- CT CO JD O TD 0

JZ £ LA N Η -ί Η TD (D

Π ΓΟ ZJ. %—r λ r· r* r r ΙΑ <—I i—I

Ω CD O CD O O O .Q CM <D CD 0 CD

.Y CM -HE CD O O

ω r-v c 3 +i +i +i +i +i co ~ co «· co

•HX COP P CD p CD p O

C CD enør» O-OCAi-H d- y «I- v <P ..

CO ' PCOn '••'re* '

CT I O rH N <t N (O CO CL CO CL O CL

P ΙΑ X ·Η O CM M 3 i—)

_i Cl- rH

Ld CO P CO

CD CD H-> CO

< C rH P O

I— CD rH O ϋ

C CD CL 3 4-) -P

O CO E C C

•Η IA C CO CO

•P Ω CO OT 0 ZJ ZZ

CO CM p CJ °tS ·Η ·Η p r-'·. -P CO "O d— d- 4-> X £ r-H * JQ U TD 0 - ·Η ·Η

C CD 3 OT IA rHrHONrH O C C

0 v_>- *H 0 *· n r r r. I—I Q1 CT

ϋΙ O O CD rH rH O CM .CD CD TD ·Η 0 ·Η

C LA rH p O CD CO

O CM CO 0 +1 +1 +1 +1 +1 OT - CO CO

ZZ O CO PCDPØPØ

rH E lA GO VO rH vO d- P DC P DC

•Hl POT- ---- ^ ZZ Zi M3 OT CJ IA CO A A 0\ OTCLJD-HCJ-H H->

0 b_ I— ·—✓ -H

CD I C

rH Ar CO

0 CM E

CT 0

Q I r-. C

p CM CT C

O - CO 0

Cl_ r^· TD CT

CM 0 \ • r Ό H Cl- .

-p VO CT O LA LA CO

P CM C E CM CM

O - 83 Cl r- 0

CL VO 51 w fA ΙΑ ΙΑ IA CO

CO CM rH - rH rH

C - - 0

CO VO Ct_ CT

P CM CO -H

-P I ΓΑ ΓΑ > E d- 0 VOQQCO d-

3 CO CO Li_ CM CM C CO

•H rH II r-r» r-N 0 "O

0 CT 0 νΟΓ^Χ Χ ZZ P

rH C "CT rH CM CM O O ·Η rH CO

CO-H C 0 - - ^ '-r· U-0 XJ

ϋ C -H ZZ SO A- I I -H -DC C

S ZZ J1 ·Η CM CM LA lA C CO CD

pp p JZ — - CM CM CT P -P

co-h o ø vo f-~ - - ·η o tn l— > L·. DS CM CM IH rH UD d- * 13

DK 162282 B

Rotter, der var fodret med den lave calcium (0,02¾ Ca), tilstrækkeligt phosphor, vitamin D-manglende diæt i 3 uger opdeltes i 6 grupper med 5-6 rotter i hver, og indgaves henholdsvis 65 pmol af enten 26,26,26,27,27,27-F^-5 1,25-(QH) eller 1,25-(0Η)203 opløst i 0,05 ml 95¾ ethanol intrajugulart enten 24 eller 72 timer inden aflivning. Rotterne i kontrolgruppen indgaves ethanol-bærestoffet på samme måder. Rotterne aflivedes ved decapitation, og blodet opsamledes. Der centrifugeredes 10 for at få serummet. 0,1 ml serum blandedes med 1,9 ml 0,1¾ lanthanumchloridopløsning, og calciumkoncentrationen måltes med et atomabsorptionsspektrofotometer (Perkin-Elmer model 214). Da indtagelsen af calcium fra føden er uendelig ringe, afspejler forøgelsen af 15 serumcalciumkoncentrationen som respons på 26,26,26, 27,27,27-F6-l,25-(0H)2D3 eller 1,25-(0H)2D3 forbindelsens evne til at mobilisere knoglecalcium. Resultaterne er angivet i tabel 2.

DK 162282B

14 TABEL 2

Forøgelse i serumcalciumkoncentrationen som respons på en enkelt dosis på 65 pmol 26,26,26,27,27,27-F^-1,25-(OH^D^ eller 1,25-(OH)2D3 indgivet 24 eller 72 timer inden aflivningen af rotterne på en lø.vcalciumdiæt

Forbindelse serumcalciumkoncentration _(mq/100 ml) _____24 t_72 t ethanol 5,7 - 0,l*a 3,7 - 0,la 26,26,26,27,27,27- F6-1,25-(0H)2D3 5,3 - 0,3b 4,4 - 0,2b

1,25-(0H)2D3 4,4 - 0,2° 3,9 - 0,2C

Signifikans af forskel a fra b&c a fra c p <.0,001 ikke signi fikant b fra c a fra b p< 0,001 p <0,001 b fra c _ ' _p < 0,005 *Standardafgivelse på gennemsnittet

Af ovennævnte data kan konkluderes, at i de vitamin D responsive systemer hos vitamin D-manglende dyr udviser 26,26,26,27,27,27-Fg-l,25-(0.H)2D3 en virkning, der er mindst 10 gange større end virkningen af den 5 hormonale vitaminform 1,25-(0H)2D3 og må derfor betragtes som det hidtil mest biologisk aktive vitamin D-derivat.

Det omhandlede 26,26,26,27,27,27-F6-l,25-(0H)2D3 kan 15

DK 162282 B

let administreres i sterile parenterale opløsninger ved injektion eller intravenøst eller via fordøjelseskanalen i form af perorale doser eller ved suppositorier.

Doser fra ca. 0,1 ^,ug til ca. 2,5 ^ug pr. dag er ef-5 fektive til opnåelse af de fysiologiske calciumbalan-cerespons'er, der er beskrevet, og som er karakteristiske for den vitamin D-lignende virkning, idet vedligeholdelsesdoser er ca. 0,1 ^ug til 1,0 yug.pr. dag.

Doseringsformerne af forbindelsen kan fremstilles ved 10 kombination af ikke toxiske acceptable bærestoffer med forbindelsen på sædvanlig måde. Disse bærestoffer kan enten være faste eller flydende som f. eks. majsstivelse, lactose, sucrose, jordnøddeolie, olivenolie, sesamolie og vand. Dersom der anvendes et fast 15 .bærestof, kan doseringsformen af de omhandlede forbindelser være i form af kapsler, pulvere, drageer eller sugetabletter. Dersom der anvendes et flydende bærestof kan doseringsformen være bløde gelatinekap-' sier eller sirupper eller flydende suspensioner, emul-20 sioner eller opløsninger. Doseringsformen kan også indeholde hjælpestoffer som f. eks. konserveringsmidler, stabilisatorer, befugtningsmidler eller emulgerings-midler, opløsningsfremmere osv. De kan også indeholde terapeutisk værdifulde forbindelser.

25 Naturligvis afhænger den anvendte dosis af den på gældende patient og af den særlige sygdomstilstand, der skal behandles, og af de slutresultater, der ønskes opnået, s*å vel som af andre af fagmanden kendte faktorer.

Claims

1. A-nalogif remgangsmåde til fremstilling- af 26,26,26,27, .27,27-hexa fluor-Ιοί, 25-dihydroxycholecalcif er o ler med den almene formel 3 . i I OR cp3 r XX R-jO OR2 1 2 hvori R, R og R hver især uafhængigt betegner hydrogen 5 eller acyl med fra 1-4 carbonatomer, kendeteg net ved, at man bestråler en dien med formlen OR ζ N cf3 hvor R, R^ og R£ har de ovenfor anførte betydninger, hvorefter man underkaster det fremstillede prævitamin fchermisk isomerisering, og om nødvendigt hydrolyserer forbindelsen. 17 DK 162282 B

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 1 2 ved, at R, R og R alle betegner acyl med 1-4 carbonato-mer, og at bestrålings- og isomeriseringsproduktet hydrolyseres til opnåelse af 26,26,26,27,27,27-hexafluor-5 la,25-dihydroxy-cholecalciferol.

3. 26,26,26,27,27,27-hexafluor-la,3p,25-trihydroxycho-lest-5,7-dien til anvendelse som udgangsmateriale ved fremgangsmåden ifølge krav 1.