NL8920414A - Verbindingen met celdifferentiatieopwekkende werking. - Google Patents

Description

Verbindingen met celdifferentiatieopwekkende werking.

De uitvinding werd gedaan in de loop van onderzoek, dat werd gesteund door subsidies of beloningen van het Department of Health and Human Services. De Regering heeft zekere rechten op deze uitvinding.

De uitvinding heeft betrekking op nieuwe vitamine D-verbindingen en op een algemene werkwijze voor hun bereiding. Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op 1-a-hydroxyvitamine D zijketenhomologen die bijzonder en onverwacht actief zijn bij de differentiatie van kwaadaardige cellen en op werkwijzen voor het gebruik van de nieuwe verbindingen ter behandeling van neoplas-tische ziekten, waaronder in het bijzonder leukemoide ziekten.

Achtergrond

De verbindingen uit de vitamine D-reeks zijn welbekend als middelen, die essentieel zijn voor de calci-umhomeostaseregeling bij mens of dier. Ook is het bekend, dat niet vitamine D zelf, maar daaruit in het dierlijk of menselijk lichaam ontwikkelde metabolieten calcium-metabolisme daadwerkelijk reguleren. In dit verband is de belangrijkste vitamine D-metaboliet la,25-dihydroxyvitami-ne D3 (l,25-(OH)2D3). Deze verbinding, alsmede sommige structurele analogen, zoals la-hydroxyvitamine D3(la-OH-D3), la-hydroxyvitamine D2(laOH-D2), of sommige met fluor gesubstitueerde l,25-(OH)2D3-derivaten, zijn zeer potent bij de stimulering van intestinale calciumabsorptie, alsmede bij de calciumresorptie uit been (beendermobilisa-tie). Dientengevolge worden deze verbindingen nu gebruikt, of zijn voorgesteld voor gebruik, als farmaceutische middelen ter behandeling van een verscheidenheid van calciummetabolismestoringen, zoals renale osteodystrofie, hypoparathyrodisme, vitamine D-resistente rachitis of osteoporose.

Meer recent onderzoek heeft vastgesteld, dat l,25-(OH)2D3, naast zijn rol bij de calciumho- meostaseregulering in vivo ook andere biologische functies vervult. Met name is aangetoond, dat l,25-(OH)2D3 en daarmee nauw verwante verbindingen (bijv. la-OH-D3, of fluoranalogen van l,25-(OH)2D3) zeer potent zijn voor het opwekken van celdifferentiatie. Hoogst belangrijk is, dat werd gevonden, dat l,25-(OH)2D3 de voortplanting remt van kwaadaardige cellen (met name leukemiecellen) en in cultuur hun differentiatie veroorzaakt tot normale monocyten [Abe, et ali, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 78, 4990 (1981) ; Honma et. al.. ibid, 80, 201 (1983)]. Vanwege deze opmerkelijke werking zijn 1,25-(0H)2D3 en verwante verbindingen voorgesteld als antikankermiddelen, in het bijzonder an-tileukemiemiddelen (Suda et al.. US-A-4.391.802). Zelfs hoewel deze verbindingen echter inderdaad zeer effectief zijn bij het differentiëren van kwaadaardige cellen in cultuur, wordt hun praktisch gebruik bij de differen-tiatietherapie als antikankermiddelen ernstig beperkt, vanwege hun even hoge potentie als middelen, die calcium-metabolisme beinvloeden. Bij de in vivo vereiste spiegels voor effectief gebruik als antileukemiemiddelen, kunnen deze zelfde verbindingen aanmerkelijk verhoogde en potentieel gevaarlijke bloedcalciumspiegels opwekken vanwege hun inherente calcemische werking. Deze calcemische werking sluit het gebruik van deze bekende vitamine D-verbindingen bij de behandeling van kwaadaardige aandoeningen uit, of beperkt dit sterk en wijst op een behoefte aan verbindingen met meer specificiteit en werkingselectiviteit.

In deze beschrijving zijn de uitdrukkingen "calcemische activiteit" of "calcemische werking" bedoeld als een afkorting van het welbekende vermogen van vitamine D-verbindingen tot verhoging van bloedcalciumspiegels vanwege hun stimulering van intestinale calciumabsorptie (Ca-transport) en van calciumresorptie uit been (beendermo-bilisatie ). De uitdrukking "differentiatiewerking" heeft betrekking op de meer onlangs ontdekte werking van sommige vitamine D-verbindingen tot het stoppen van de voortplanting van kwaadaardige cellen en het opwekken van hun differentiatie tot normale cellen.

Eerder onderzoek heeft geleid tot de bereiding van verschillende verbindingen met verhoogde differentiatiewerking. Aldus beschrijven US-A-4.717.721, alsmede andere publicaties [Ostrem & DeLuca, Steroids, 49. 73-102(1988); Ostrem et al.. J. Biol. Chem. 262. 14164 (1987)], dat l,25-(OH)2D-analogen, waarin de zijketen met één koolstof is verlengd, een differentiatiewerking voor leukemiecellen vertonen, die ongeveer 10 maal groter is dan die van l,25-(OH)2D3 zelf. Dergelijke verbindingen zijn echter nog altijd ongeveer even potent als l,25-(OH)2D3 bij de stimulering van calciumabsorptie en de verhoging van serumcalciumspiegels en overwinnen dus niet het boven besproken probleem van de ongewenst potente "calcemische werking". Hoewel dus dergelijke verbindingen een verbeterde differentiatie/calcemische werkingverhouding vertonen, zijn zij niet zo selectief, omdat hun calcemische potentie even hoog is als die van de moederverbinding (1,25-(OH) 2D3) . Er zijn andere met vitamine D-verwante verbindingen vermeld, waarvan men zegt, dat zij preferentiele differentiatiewerking vertonen [Ostrem et al., supra; Kubodera et al. Chem. Pharm. Buil. 34/ 2286-89 (1986); Ikekawa et al. Chem. Pharm. Buil. 35, 4362 (1987)], maar deze verbindingen zijn structureel onderscheiden en verschillend van de verbindingen van de onderhvige uitvinding.

Samenvatting van de uitvinding

De onderhavige uitvinding geeft een nieuwe klasse van verbindingen, die een gewenst en zeer voordelig patroon van biologische werking vertonen. Deze verbindingen worden gekenmerkt door een hoge potentie (vergeleken bij die van l,25-(OH)2D3) bij het opwekken van de differentiatie van kwaadaardige cellen, maar vertonen veel minder activiteit dan l,25-(OH)2D3 in hun effect op calciummetabolisme. Zodoende zijn deze verbindingen zeer specifieke differen-tiatiemiddelen en zou hun werkingspatroon hun gebruik bij differentiatietherapieën van kwaadaardige aandoeningen toelaten. Hun zeer sterke differentiatiewerking laat, gecombineerd met hun opmerkelijk verminderde of verdwenen werking op calciummetabolisme toediening in vivo van deze verbindingen ter behandeling van kwaadaardige aandoeningen toe, zonder opwekking van uitermate verhoogde bloedcal-ciumspiegels. Vanwege dergelijke eigenschappen zouden zij voor dergelijke doeleinden als therapeutische middelen de voorkeur verdienen.

Structureel is het sleutelaspect van de verbindingen met deze gewenste biologische eigenschappen, dat zij zijketenhomologen zijn van l,25-(OH)2D3, waarin de zijketen is verlengd door inlas van twee of drie methyleeneenheden in de keten. Aldus worden de verbindingen van dit type gekenmerkt door de bijgaande structuurformule I, waarin X, Y en Z, die hetzelfde of verschillend kunnen zijn, waterstof of een waterstofbeschermende groep voorstellen en waarin n een geheel getal met een waarde van 3 of 4 is.

24-Dihomo-l,25-(OH)2D3 en zijn beschermde hydro-xylderivaten , d.w.z. de verbindingen met de bovengenoemde structuur, waarin n 3 is en 24-trihomo-l,25-(OH)2D3 en zijn beschermde hydroxylderivaten, d.w.z. verbindingen als bovengenoemd, waarin n = 4, zijn voorkeursvoorbeelden van de boven structureel gedefinieerde verbindingen.

De verbindingen van de uitvinding zijn verwant aan de 24-homo-vitamine D-verbinding van US-A-4.717.721. De verbindingen van de uitvinding kunnen echter door zowel structurele als biologische eigenschappen worden onderscheiden. Structureel zijn de verbindingen nieuwe vitamine D-homologen met als sleutelkenmerk, dat de zijketen is uitgebreid door inlas van twee of drie methyleeneenheden in de koolstofketen en biologisch, dat de verbindingen sterk selectieve celdifferentiatiemiddelen zijn met een potentie, die tenminste gelijk is aan of groter is dan die van 1,25-(OH)2D3 bij het remmen van de voortplanting en het opwekken van differentiatie van kwaadaardige cellen, maar geen of sterk verminderde calcemische werking vertonen.

De onderhavige uitvinding geeft dan ook nieuwe verbindingen, die met name geschikt zijn voor de bevordering van de differentiatie van kwaadaardige cellen en ter behandeling van neoplastische ziekten.

De uitvinding geeft ook een nieuwe werkwijze voor het bereiden van vitamine D-verbindingen. Deze werkwijze kan worden gebruikt voor de synthese van de bovengenoemde nieuwe verbindingen, alsmede voor de synthese van bekende vitamine D-metabolieten of andere homologen of andere aan de zijketen gemodificeerde vitamine D3-derivaten.

Het basisconcept van deze synthese is de bereiding van de gewenste vitamine D-verbinding door koppeling van de bijpassende en apart gesynthetiseerde zijketeneen-heid aan een vooraf gevormde vitamine D-kern die een afsplitsbare groep draagt aan koolstof-22. De vereiste zijketeneenheid wordt bereid als een fenylsulfonderivaat en de vereiste vitamine D-kern is , wanneer men verbindingen van het la-hydroxyvitamine D-type wenst te bereiden, een secosterolderivaat met bijgaande structuurformule II, waarin X en Y waterstof of hydroxyl beschermende groepen voorstellen en L een afsplitsbare groep is, zoals haloge-nide, of een tosyloxy of mesyloxy of soortgelijke afsplitsbare functie. Een voorkeursderivaat van dit type is de beschermde hydroxyvitamine D22-tosyloxyverbinding. De voor de constructie van de gewenste zijketen benodigde fenylsul-fonverbindingen hebben de volgende structuur:

PhS02-CH2 -R

waarin Ph een fenyl- of alkylfenylgroep voorstelt en waarin R is gekozen uit de groep, bestaande uit alkyl, en hydroxy-en fluoralkyl, waarbij de hydroxylgroepen bij voorkeur zijn gederivatiseerd met hydroxylbeschermende groepen.

De koppeling tussen het boven beschreven vitamine D-22-tosylaat en de passende fenylsulfoneenheid is geba seerd op gevestigde principes van sulfonchemie [zie bijv. P.D. Magnus, Tetrahedron 33, 2019 (1977); Trost et al., Tetrahedron Letters, 3477 (1976)]. De reactie,die door een sterke base wordt bemiddeld, levert een additieprodukt op, dat kan worden voorgesteld met bijgaande structuurformule III, waarin R, X en ï als boven gedefinieerd zijn. Tussentijdse additieprodukten van het boven getoonde type, die nieuwe verbindingen zijn, kunnen dan worden gereduceerd in een medium, dat een metaalamalgaam bevat (bijv. natrium-amalgaam, aluminiumamalgaam) ter produktie van de gewenste vitamine D-verbinding met bijgaande algemene structuurformule IV. Reduetieve desulfonering kan ook worden bereikt met andere middelen, zoals oplossende metaalreducties, onder gebruik van bijvoorbeeld metaal/alkylamine of metaal/NH3-mengsels. Hydroxylbeschermende groepen kunnen daarna zodanig volgens in de techniek bekende standaardmethoden worden verwijderd, dat de overeenkomstige vrije hydroxylverbindingen worden geproduceerd.

De boven beschreven vitamine D-22-tosylaat uitgangsstof voor het zijketenkoppelingsproces van de uitvinding is een bekende stof, die volgens bekende werkwijzen kan worden bereid [bijv. Andrews et al., J. Org. Chem. 51, 4819 (1986)]. Zij kan ook worden bereid door hydridereductie en daarop volgende tosylering van een vitamine D-22-ester [zie ook Kutner et al., Tet. Letters 28, 6129-6132 (1987)] met de bijgaande structuurformule V, waarin X en Y waterstof of hydroxylbeschermende groepen zijn en waarin A een alkyl- of arylgroep voorstelt. De bereiding en het gebruik van deze nieuwe esters als deel van de onderhavige synthese van vitamine D-verbindingen is een ander aspect van de uitvinding.

Het is evident, dat de bovenbeschreven werkwijze, onder gebruik van het vitamine D-22-tosylaat als vitamine-kern en een geschikte fenylsulfon als zijketenrest , kan worden gebruikt voor de bereiding van vele la-hydroxyvita-mine D-zijketenanalogen, afhankelijk van het gekozen alkyl- of hydroxyalkylradicaal R. Fenylalkylsulfoneenheden, die de voorkeur verdienen, zijn de verbindingen, waarin R een alkyl- of hydroxyalkylradicaal is met één der bijgaande algemene structuurformules VI en VII , waarin U is gekozen uit de groep, bestaande uit waterstof, hydroxyl, beschermde hydroxyl of een koolwaterstofradicaal met 1 tot 4 koolstof-atomen en waarin 1, m en n gehele getallen zijn met onafhankelijk de waarden 1 tot 5 en waarin Z waterstof of een hydroxylbeschermende groep is. Voor de bereiding van nieuwe verbindingen met de gewenste biologische werking (d.w.z. sterke differentiatiewerking en geen of weinig calcemische werking) verdienen bovengenoemde sulfoneenheden, waarin n de waarde 3 of 4 heeft, de voorkeur.

Als gebruikt in de beschrijving en in de conclusies betekent de uitdrukking hydroxylbeschermende groep elke groep, die gewoonlijk voor de tijdelijke bescherming van hydroxylfuncties wordt gebruikt, zoals bijvoorbeeld acyl-, alkylsilyl- en alkoxyalkylgroepen en een beschermde hydroxylgroep is een hydroxylfunctie, die met een der-gelijke beschermende groep is gederivatiseerd. De uitdrukking "acyl" betekent een alkanoylgroep met 1 tot 6 koolstof atomen in al haar isomere vormen, of een carboxyalkano-ylgroep met 1 tot 6 koolstofatomen, zoals een oxalyl-, malonyl-, succinyl-, glutarylgroep of een aromatische acylgroep, zoals benzoyl of een halogeen-nitro- of alkyl-benzoylgroep. Het woord "alkyl" als gebruikt in de beschrijving of de conclusies betekent een recht of vertakt alkylradicaal met 1 tot 10 kool stof at omen in al zijn isomere vormen. Beschermende alkoxyalkylgroepen zijn groepen als methoxymethyl, ethoxymethyl, methoxyethoxy-methyl of tetrahydrofuranyl en tetrahydropyranyl. Beschermende alkylsilylgroepen zijn bij voorkeur tetramethylsilyl, triethylsilyl, t-butyldimethylsilyl en analoge alkylsilyl-radicalen .

De uitvinding wordt nader beschreven met de volgende voorbeelden, die slechts ter toelichting van de wijze van synthese en de daarbij verkregen nieuwe verbindingen bedoeld zijn. In deze voorbeelden worden specifieke verbindingen aangeduid met arabische cijfers (bijv. verbindingen 1, 2, 3, enz.) die betrekking hebben op de aldus genummerde structuren in de processchema's. Bovendien worden voorbeelden gegeven, die de onderscheidenlijke biologische eigenschappen van de nieuwe verbindingen toelichten, welke eigenschappen dienen als basis voor de toepassing van deze verbindingen als celdifferentiatie en antineoplastische middelen.

Bereiding van verbindingen

Algemene procedures

Infraroodspectra (IR) werden verkregen op een Nicolet MX-1 FT-IR spectrometer onder gebruik van netto films van olieachtige stoffen. Ultraviolet (UV) absorptie-spectra werden geregistreerd met een Hitachi Model 60-100 UV-VIS spectrometer. Kernmagnetische resonantie (NMR) spectra werden geregistreerd bij 270 of 400 MHz met Bruker WH-270 of AM-400 FT spectrometers in de aangegeven oplosmiddelen. Chemische verschuivingen (5) worden veldafwaarts vermeld van inwendige Me4Si (50.000) of CHC13 (67,24). Lage- en hoge-splitsingsmassaspectra werden geregistreerd bij 70 eV (tenzij anders vermeld) op een Kratos MS-50 TC instrument uitgerust met een Kratos DS-55 Data System . Hoge splitsingsgegevens werden verkregen door piekvergelij-king. Monsters werden in de op 120-250°C gehouden ionenbron gebracht via een direkte insteeksonde. Silica gel 60 (Merck, 70-230 of 230-400 mesh) werd gebruikt voorkolom-chromatografie. Dunnelaagchromatografie (TLC) werd uitgevoerd onder gebruik van voorbeklede aluminiumsilicagel-platen met UV-indicator van EM Science (Gibsstown, NJ) . Gebruikte oplosmiddelsystemen: A: chloroform-ethanol (85:15(v/v), B: hexaan-ethylacetaat 1:1 en C: hexaan- ethylacetaat 3:1. Hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC) werd uitgevoerd met een Waters Associates Liquid chromatograph uitgerust met een model 6000 A oplosmid-delafgiftesysteem, een Model 6 UK Universal injector en een model 450 variabele golflengtedetector. Er werden Zorbax-

Silica (Phenomenex) kolommen (6,2 mm x 25 cm en 10 mm x 25 cm) gebruikt. Oplosmiddelsystemen: A: 3% 2-propanol in hexaan, B: 2% 2-propanol in hexaan, C: 6% 2-propanol in hexaan, D: 10% 2-propanol in hexaan, E: 20% 2-propanol in hexaan en F: 2% ethylacetaat in hexaan. Er werden Silica gel Sep-Pak (Waters Associates) patronen gebruikt voor de voorfiltratie van HPLC-monsters. 3B-Acetoxy-22,23-bisnor-5-choleenzuur werd betrokken van Steraloids (Wilton, NH) . Tetrahydrofuran (THF) werd afgedestilleerd van natriumben-zofenonketyl. Andere oplosmiddelen werden door standaardmethoden gezuiverd. n-Butyllithium in hexaan (Aldrich) werd met n-propanol getitreerd in aanwezigheid van 1,10-fenan-troline in THF onder argon. Reacties, waarbij vitamine D-verbindingen betrokken waren, werden onder magnetisch roeren uitgevoerd onder een stikstof- of argonatmosfeer. Oplossingen en vloeistoffen werden met injectiespuiten door rubber scheidingswanden afgegeven.

Voorbeeld 1

Synthese van Ια-hvdroxvvitamine C-22 ester (verbinding 10) en beschermde hvdroxvlderivaten (verbindingen 8, 11) (Processchema I) I) (a) Bereiding van steroideesters 1 en 2 3B-Acetoxy-22,23-bisnor-5-choleenzuur ( 10 g) werd opgelost in 420 ml 5% KOH in methanol en de oplossing werd 15 min bij heersende temperatuur geroerd ter hydrolyse van het acetaat. Bij deze oplossing werd druppelsgewijs onder roeren 160 ml 10% H2S04 in methanol gevoegd en de resulterende suspensie werd verdund met 400 ml 1% H2S04 in methanol. Het mengsel werd 48 uur onder terugvloeiing verwarmd ter voltooiing van de verestering (gecontroleerd met TLC, oplosmiddelsysteem A). Het produkt, de methylester (1) (9,0 g , 88%) werd volgens standaardwijze gewonnen en 4,4 g (12 mmol ) van dit materiaal werd opgelost in 135 ml droog dimethylformamide (DMF) en er werd imidazool (3,6 g, 52,8 mmol) toegevoegd, gevolgd door tert-butyldimethyl-silylchloride (4,0 g, 26,4 mmol). De oplossing werd 5 min bij kamertemperatuur geroerd totdat het volumineuze preci-pitaat was gevormd en daarna werd het roeren nog 15 min voortgezet. Het reactiemengsel werd geextraheerd met hexaan (400 ml), gewassen met water en verzadigde NaCl-oplossing en gedroogd op MgS04. Afdamping van het oplosmiddel leverde TLC zuivere (oplosmiddelsysteem b) ges ily leerde ester 2 (5,3 g) op als een kleurloze olie die zonder verdere zuivering voor de volgende trap werd gebruikt. Een analytisch monster werd verkregen door flitschromatografie onder gebruik van 2% ethylacetaat in hexaan: IR (film) 1737,99, 1604,89 cm’1.

(b) Bereiding van 5,7-dieen (1)

Een mengsel van verbinding (2) (1,0 g, 2,1 mmol), dibromantine (0,42 g, 1,5 mmol) en watervrij natriumbicarbonaat (0,91 g, 10 mmol) in 20 ml hexaan werd 30 min in een stikstofatmosfeer onder terugvloeiing verwarmd tot er geen uitgangsester 2 meer werd waargenomen (TLC, systeem C). Het precipitaat werd afgefiltreerd en de oplossing werd onder verlaagde druk opgedroogd. Het residu werd heropgelost in 5 ml watervrij THF, er werd tetrabutylammoniumbromide (0,06 g, 0,19 mmol) toegevoegd en het mengsel werd 30 min onder stikstof bij kamertemperatuur geroerd. Daarna werd een oplossing toegevoegd van tetrabutylammoniumfluoride (10 ml, 1M in THF), gevolgd door 0,7 ml s-collidine en het mengsel werd 1 uur bij kamertemperatuur onder stikstof geroerd. Er werd nog 5 ml tetrabutylammoniumfluorideoplossing toegevoegd en het roeren werd 3 uur voortgezet. Er werd ether (50 ml) toegevoegd en de organische fase werd gewassen met water, koud IN HC1 en 10% NaHC03 en op watervrij MgSO4 gedroogd. Het in benzeen opgeloste produkt werd gechromato-grafeerd over silicagel 70-230 mesh (30 g). Ester 3. (0,44 g, 58%) werd geelueerd onder gebruik van ethylacetaat in hexaan. Een analytisch monster werd verkregen met HPLC, oplosmiddelsysteem A, Ry 77 ml: UV (3% 2-propanol in hexaan), - 262 nm (£7.000), A^ = 272 nm (£9.800), Amax = 282 nm (£10.500, λ ^ = 293 (£6.000); 1H NMR (CDC13) δ, 0,54 (s,3H, 18-CH3) , 0,94 (s,3H, 19-CH3, 1,22 (d,2H, J=6 Hz; 21-CH3), 3,6 (m,lH, 3-H) , 3,68 (s,3H, C02CH3) , 5,42 (m,lH, 6-H), 5,58 (m,lH, 7-H); MS, m/z (relatieve intensiteit) M+ 358 (61), 340 (12), 325 (100), 299 (68), 271 (7), 253 (17), 237 (26), 211 (27), 143 (72), 119'(35).

(c) Bereiding van vitaminester (4.)

Een oplossing van dieen 3 (830 mg, 2,3 mmol) in 350 ml benzeen-ethylether, 1:4 (v/v) werd 40 min ( 4 x 10 min) onder roeren onder stikstof bestraald in een water-gekoelde kwartsdompelput; voorzien van een stikstofbor-relaar en een Vycorfilter onder gebruik van een Hanovia 608A36 middeldruk UV-lamp. De reactie werd met HPLC gevolgd bij 265 nm onder gebruik van 2% 2-propanol in hexaan. De oplossing werd onder verlaagde druk opgedroogd, heropgelost in 100 ml absolute ethanol en 3 uur onder terugvloeiing verwarmd in een stikstofatmosfeer. Daarna werd de oplos sing geconcentreerd, heropgelost in 1 ml 10% ethylacetaat in hexaan en gechromatografeerd over silicagel 70-230 mesh (30 g). Vitamineester 4 (298 mg, 36%) werd geelueerd onder gebruik van een mengsel van 15% ethylacetaat in hexaan. Een analytisch monster werd verkregen met HPLC, oplosmid-delsysteem B, Ry 94 ml: IR (film) 1738,95 cm'1; UV, ^max 264 nm; 1H NMR (CDC13) , δ 0,56 (3H,S, 18-CH3) , 1,20 (3H,d, J=7 HZ, 21-CH3, 3,66 (3H, S, C02CH3) , 3,95 (1H, m,3-H), 4,80 (1H,d, J=l,2 Hz, 19Z-H), 5,05 (1H, d, J=l,2 Hz, 19E-H), 6,03 (1H, d, J=ll Hz, 7-H), 6,23 (1H, d, J=ll Hz, 6-H), MS, m/z (relatieve intensiteit), M+ 358 (45), 340 (9), 325 (45), 299 (22), 253 (19), 237 (18), 136 (60), 118 (100).

(d) Bereiding van 3.5-cvclovitamineester (6)

Ester 4 werd volgens de bekende werkwijze omgezet in tosylaat 5 onder gebruik van p-tolueensulfonylchloride in pyridine bij 4°C gedurende 20 uur . Er werd ruw tosylaat 5 (102 mg, 0,2 mmol) , opgelost in 2 ml watervrij dichloor- methaan, bij 55eC onder roeren toegevoegd aan een methanol-oplossing (15 ml), die watervrij kaliumbicarbonaat (250 mg) bevatte. Het mengsel werd 24 uur onder stikstof geroerd bij 55 °C. De oplosmiddelen werden daarna onder verlaagde druk verwijderd en het residu werd met ether geextraheerd. De organische fase werd met water gewassen en op watervrij MgS04 gedroogd. Het produkt, cyclovitamineester 6_ , werd door silicagelchromatografie gezuiverd onder gebruik van 20% ethylacetaat in hexaan (50 mg, 68%): 1H NMR (CDC13), δ 0,54 (3H, S, 18-CH3), 0,74 (m, 3H) , 0,91 (m, 4-H) , 1,20 (3H, d, J=7 Hz, 2I-CH3), 3,25 (3H, s, 6R-OCH3), 3,65 (3H, s, 22-C02CH3), 4,15 (1H, d, J=9 Hz, 6-H) , 4,88 (1H, 19E-H) , 5,00 (1H, d, J=9 Hz, 7-H) , 5,02 (1H, 19E-H) ; MS, m/z (relatieve intensiteit) 372 (M+, 17), 340 (100), 253 (48), 221 (40), 135 (72).

(e) Bereiding van 5,6-cis la-hvdroxvvitamineester f8) en transisomeer f9)

Tert-butylhydroperoxyde (112 μΐ, 3,0 M oplossing in tolueen, 0,34 mmol) werd toegevoegd aan een suspensie van seleendioxyde (9 mg, 0,8 mmol) in 2 ml droog methyleen-chloride. Het mengsel werd onder stikstof bij kamertemperatuur geroerd totdat er een heldere oplossing was gevormd. Daarna werd watervrije pyridine (12 μΐ , 0,15 mmol) toegevoegd, gevolgd door ester 6 (50 mg), opgelost in 2 ml watervrij dichloormethaan. Het mengsel werd 30 min onder stikstof geroerd. Er werd koud 10% natriumbicarbonaat (2 ml) toegevoegd en het mengsel werd met ether geextraheerd. De organische fase werd met koud 10% natriumbicarbonaat ijswater gewassen en op watervrij MgS04 gedroogd.Silicagelchromatografie (10-20% ethylacetaat in hexaan ) leverde 12,5 mg la-hydroxyverbinding (7) op. Dit produkt werd daarna onmiddellijk opgelost in 0,5 ml ijsazijn en de oplossing werd onder roeren 15 min onder stikstof op 55°C verhit. Het reactiemengsel werd over ijs uitgegoten, met ether geextraheerd en met ijskoud verzadigd natriumbicarbonaat gewassen. De gecombineerde etherextracten werden met water gewassen en gedroogd op watervrij MgS04. Ester _8 werd gewonnen ( 6 mg, 20% algehele opbrengst uit 5) volgens de algemene werkwijze, beschreven door DeLuca et al., US-A-4.554.106. Analytische monsters van respectievelijk (5Z, 7E) en (5E,7E) isomeer, 8 en 9, werden door preparatieve HPLC verkregen in een verhouding van 2,5:1.

Verbinding (8): HPLC, oplosmiddelsysteem C, Rv 68 ml; UV (EtOH))^ 264 nm, λmin 227 nm, A264 -2,07: 1H NMR (CDC13) 5, 0,56 (3H,s, 18-CH3) , 1,20 (3H, A227 d, J=6,5 Hz, 21-CH3) , 2,04 (3H,s, 3/8-acetyl) , 3,66 (3H,s,22-C02CH3) , 4,4 (1H, m, 1-H),5,2 (lH,m 3-H) , 5,01 (19E-H),5,34 (19Z-H), 6,01 (1H, d, J=10Hz,, 7-H), 6,33 (1H, d, J=10 Hz, 6-H), MS, m/z (relatief intensiteit), 416 (M+, 4) 356 (100), 338 (21), 251 (13), 134 (95).

Verbinding (9) : HPLC oplosmiddelsysteem C, Ry 78ml; UV

(EtOH) , λ max 267 nm, >min 227 nm, A267- 3,51; 1H NMR (CDC13) 6, Q,56 (3H,s, 18 -CH3) , A227 1,20 (3H, d, J=6,5 HZ, 21-CH3) , 2,04 (3H, S,3/?-OAc), 3,66 (3H, s, 22-C02CH3) , 4,5 (lH,m, 1-H) , 5,3 (lH,m, 3-H) , 4,99 (19E-H), 5,13 (192-Η), 5,81 (lH,d,J=10 Hz,7-H), 6,56 (lH,d,J=10 Hz, 6-H).

ff)Bereiding van la-hvdroxvester f10 en di-silvlester fll)

Er werd een 0,1N oplossing van KOH in methanol (10 ml) toegevoegd aan een geroerde oplossing van azijn-zuurester 8 (100 mg, 0,24 mmol) in ethylether (10 ml). De resulterende oplossing werd 90 minuten bij kamertemperatuur geroerd totdat er geen uitgangsstof meer werd waargenomen door TLC (oplossmiddelsysteem B). Dihydroxyester (10) werd gewonnen door standaardextractie (ethylacetaat, verzadigd NaCl, watervrij MgS04).

Een mengsel van imidazool (250 mg, 3,6 mmol) en tert-butyldimethylsilylchloride (250 mg, 1,6 mmol) in DMF (2mm) werd toegevoegd aan een geroerde oplossing van ester (10) (86,2 mg, 0,23 mmol) in 4 ml DMF. Het resulterende homogene mengsel werd 15 minuten bij 55°C geroerd totdat er geen uitgangsstof meer werd waargenomen door TLC (oplos-middelsysteem B). Het produkt werd met hexaan gewonnen en het organische extract werd gewassen met pekel en gedroogd op watervrij MgS04. Een hexaanoplossing van het ruwe produkt werd gefiltreerd door een silicagel Sep-Pak patroon onder verkrijging van de disilylester (11) (136mg, 98%): UV (hexaan), \ 264 nm, Amin 227 nm, A264_ 1,91; 1H NMR (CDC13) , S 0,07 [12H, s, Si(CH3)2], 0,55 f227 (3H,s,18-CH3) , 0,86 [18H,s C(CH3)3], 1,20 (3H, d, J=6,8 Hz, 21-CHj) , 3,65 (3H, S, 0-CH3) , 4,18 (1H, m, 3-H) , 4,36 (lH,m, 1-H), 4,83 (1H, d, J—1,2 Hz, 19Z-H), 5,16 (lH,d, J=l,2 Hz, 19E-H), 5,96 (1H, d, J=ll,2 Hz, 7-H) , 6,19 (1H, d, J=ll,2 Hz, 6-H); MS, m/z (intensiteiten genormaliseerd tot m/e 248), 602, (M+,10), 470 (59), 413 (7) , 338(10), 248 (100).

Voorbeeld 2

Synthese van C-22-alcoholf12) en C-22-tosvlderi-vaat f 13) (processchema II) (a) Bereiding C-22-alcohol (12)

Er werd lithiumaluminiumhydride (25 mg, 0,65 mmol) onder argon bij 0°C toegevoegd aan een geroerde oplossing van silylester (ll) (136,2 mg, 0,23 mmol) in watervrij THF (5ml). De suspensie werd 15 minuten bij 0°C geroerd en de overmaat LiAlH4 werd ontleed door druppelsgewijze toevoeging van 10% H20 in THF. De suspensie werd met 10 ml THF verdund en het roeren werd nog 15 minuten bij kamertemperatuur voortgezet. Het produkt werd gewonnen door standaardextractie met ethylacetaat en silicagel Sep-Pak filtratie in 10% ethylacetaat in hexaan. Disilylalcohol 12 werd verkregen als een kleurloze olie (118,4 mg) met 91% opbrengst: UV (EtOH), λ mx 264 λmin 227, A264_ 1,57; 1H NMR (CDC13) S 0,00 (12H,s, Si-CH3) 0,53 A227 (3H,S, 18-CH3), 0,85 [18H, s, Si-C(CH3)3], 1,04 (3H, d, J=6,4 Hz, 21-CH3), 3,37 en 3,63 (1H en 1H, elk m, 22-CH2) , 4,17 (1H, m, 3-H), 4,35 (1H, m, 1-H) , 4,84 (1H, brs, 192- Η), 5,16 (lH,brs, 19Ε-Η), 6,0 (lff,d, J=12,2 Hz, 7-H), 6,21 (lH,d, J=12,2 Hz, 6-H); MS, m/z (intensiteiten genormaliseerd tot m/e 248, 574 (M+, 17), 442 (67), 383 (11), 308 (17), 248 (100).

(bïBereiding van 22-alcohol-tosvlaat(13)

Een ijskoude oplossing van p-tolueensul-fonylchloride (42,7 mg, 0,22 inmol) in droge pyridine (50 ml) werd bij 0°C onder stikstof toegevoegd aan een geroerde oplossing van alcohol ^2. Het mengsel werd 22 uur bij 5°C geroerd tot er geen uitgangsstof meer werd waargenomen met TLC onder gebruik van oplosmiddelsysteem C. Het reac-tiemengsel werd over ijskoude verzadigde waterige NaHC03 uitgegoten en het roeren werd nog 30 minuten voortgezet. Het produkt werd geextraheerd met ethylether-hexaan 1:1 (v/v). De organische fase werd gewassen met verzadigde NaCl en gedroogd op MgS04 De oplosmiddelen werden onder verlaagde druk verwijderd en pyridine werd in een stikstof-stroom verwijderd. Ruw produkt werd gezuiverd door silica-gel Sep-Pak filtratie (5% ethylacetaat in hexaan) onder verkrijging van zuiver tosylaat 13 (54 mg, 98% ): IR (film) 3500, 2950, 1580, 1367, 1267, 1189, 1178,1099,1085, 835 cm* 1; UV (hexaan) )imx 263 nm, ^m)-n 236 nm, 1H NMR (CDC13) δ 0,00 (12H, S, Si-CH3) , 0,43 (3H,S, 18-CH3) , 0,81 [18H, S, Si-C(CH3)3], 0,93 (3H, d, J=6,8 Hz, 21-CH3) , 2,40 (3H, S,Ar-CH3, 3,64 en 3,91 (1H en 1H, elk m, 22-CH2), 4,13 (1H, m, 3-H) , 4,31 (1H, m, 1-H), 4,79 (1H, brs, 10Z-H) , 5,13 (1H, brs, 19E-H), 5,94 (lH,d, J=12,8 Hz, 7-H), 6,17 (1H, d, J=12,8

Hz, 6-H), 7,43 en 7,84 (2H en 2H elk m, Ar-H); MS m/z (intensiteit t.o.v. m/z 248) 728 (6), 596 (30), 556 (7), 464 (7), 424 (44), 367 (19), 292 (23), 248 (100); exacte massa ber. voor C^H^O^igS 728, 4338 gev. 728,4326.

Voorbeeld 3

Synthese van fenvlsulfonziiketeneenheden (processchema III) (a)Bereiding van fenvlsulfonziiketenrest 18.

Een oplossing van 4-chloorvalerylchloride 14 (Aldrich; 3 g 19,2 mmol) in watervrij THF (25 ml) werd druppelsgewijs onder hevig roeren in 30 minuten onder argon toegevoegd aan een oplossing van methylmagnesiumbromide (12,9 ml van een 3M oplossing in ether) in 25 ml droog THF bij -10°C. Daarna liet men het reactiemengsel in 2 uur tot kamertemperatuur opwarmen, waarna het werd afgeschrikt met water en met verdund zoutzuur geneutraliseerd. Het mengsel werd met ether geextraheerd en de gecombineerde organische lagen werden gewassen met water en met natriumsulfaat gedroogd. Na verwijdering van het oplosmiddel werd het residu in vacuo gedestilleerd onder verkrijging van chloor-alcohol 15 als een kleurloze vloeistof (2,1 g, 70%). Produkt 15 (1,5 g, 10 mmol) werd daarna in watervrij dimethylformamide (5 ral) toegevoegd aan een geroerde oplossing van thiofenol (1,32 g, 12 mmol) en kalium t-butanolaat (1,32 g, 11,3 mmol) in watervrij dimethylformamide (25ml). Het reactiemengsel werd een nacht bij kamertemperatuur geroerd en de oplossing werd tussen dichloormethaan en water verdeeld. De organische laag werd gewassen met waterig natriumcarbonaat en water en op watervrij magnesiumsulfaat gedroogd. Het oplosmiddel werd in vacuo afgedampt en de ruwe olie werd gezuiverd door silicagel flitschromatografie met hexaan-ethylacetaat. Sulfide 16 (2,2g, 98%) werd verkregen als een kleurloze vloeistof. Sulfide 16 (1,01 g, 4,5 mmol) werd daarna opgelost in droog dichloormethaan (40 ml) en 3-chloorper-benzoëzuur (2,5 g, 11,6 mmol), Aldrich 80-85%) werd in porties onder roeren en van tijd tot tijd koelen toegevoegd. Het reactiemengsel werd 2 uur geroerd en daarna met 10% natriumbicarbonaat afgeschrikt. De gecombineerde organische extracten werden met waterig natriumsulfiet en pekel gewassen en op magnesiumsulfaat gedroogd. Het oplosmiddel werd in vacuo verwijderd en de ruwe olie werd gezuiverd door silicagelflitschromatografie onder gebruik van hexaan-ethylacetaatmengsels onder verkrijging van sulfon 17 (1,1 g, 97%) als een kleurloze vloeistof. Bij een geroerde oplossing van sulfon 17, 1,3 g, 5,1 mmol) en imidazool (1,5 g, 22,7 mmol) in droog dimethylformamide (50 ml) werd triethylsilylchloride (1,15 g, 7,7 mmol) gevoegd. Het reactiemengsel werd 2 uur op kamertemperatuur gehouden en daarna met dichloormethaan verdund. Het mengsel werd gewassen met waterige ammoniumchlorideoplossing en water. De organische lagen werden op natriumsulfaat gedroogd en het oplosmiddel werd in vacuo verwijderd. Het residu werd gezuiverd door silicagelflitscftromatografie. Hexaethyl-disiloxan werd eerst met hexaan geëlueerd. Het met tri-ethylsilyl beschermde sulfon 18 (1,8 g, 97%) werd met hexaan-ethylacetaat 9:1 geëlueerd als een kleurloze vloeistof: IR (netto): 3045, 2940, 1440, 1360, 1130, 1020 cm'1; 1H NMR (400 MHz, CDC13) δ 0,518 (6H, q, J=6,2 Hz, Si-CH2) , 0,899 (9H,t, J=6,2 Hz, Si-C-CH3) , 1,142 (6H,s,CH3), 1,307-1,462 (4H,m), 1,655-1,738 (2H, m, H-4), 3,080-3,122 (2H, m, H-2) , 7,567 (2H,t, J=6,8 Hz, H-aryl meta), 7,648 (1H, t, J=6,8 Hz, H-aryl para), 7,916 (2H, d, J=6,83 Hz, H-aryl ortho); MS (EI, 7 eV): m/z (relatief intensiteit) 372 (M+, 2), 341 (100), 229 (2), 227 (18), 173 (24), 103 (22), 75 (45), 55 (33).

Zoals uit de illustratieve voorbeelden van processchema III blijkt, kunnen andere fenylsulfoneenheden worden bereid volgens de boven beschreven algemene methode of volgens analoge methoden, beschreven in de literatuur. Bijvoorbeeld: (b) Bereiding van fenvlsulfon (19)

Door behandeling van dichloorverbinding 14 volgens de in voorbeeld 3 (a) bovenbeschreven werkwijze, waaronder gebruik van ethylmagnesiumbromide in plaats van mag-nesiumbromide bij de eerste reactietrap, wordt het fenyl-sulfonhomoloog verkregen met de structuur 19 (Z=Et3Si).

(c) Bereiding van fenvlsulfon (23)

Een oplossing van 6-broomhexanoylchloride (20. 3,8 g, 2,8 ml, 18 mmol) in watervrij tetrahydrofuran (10 ml) werd druppelsgewijze onder hevig roeren in 15-20 minuten onder argonatmosfeer toegevoegd aan een oplossing van methylmagnesiumbromide (14 ml 3M oplossing in ether) in watervrij tetrahydrofuran (15 ml) bij -10°C. Het mengsel werd 2 uur bij kamertemperatuur geroerd, tot G°C af gekoeld en zorgvuldig ontleed met 1:1 verdund zoutzuur. Het mengsel werd met ether geextraheerd, de gecombineerde organische lagen werden met water gewassen, op watervrij magnesiumsul-faat gedroogd en ingedampt onder verkrijging van de broom-alcohol (21) als een kleurloze olie (3,6 g, 94%).

De broomalcohol (3,4 g, 16 inmol) werd 4,5 uur bij 70°C behandeld met benzeensulfinezuur natriumzout (3,3g, 20 mmol) in watervrij dimethylformamide. Het mengsel werd op ijs uitgegoten, met dichloormethaan geextraheerd, gewassen met IN HC1, water en 10% NaHC03-oplossing, op watervrij MgS04 gedroogd, gefiltreerd en ingedampt onder verkrijging van sulfon (22), dat werd gezuiverd door flitschromatogra-fie over silicagel en geelueerd met 40-50% ethylacetaat in hexaan onder verkrijging van het sulfon, dat iets van de overeenkomstige sulfinezuurester bevatte (4,18 g, 98%), MS, m/z (270 (M+) , 255 (M+-15), 77, 59.

Bij een geroerde oplossing van het sulfon (22) (4 g, 14 mmol) en imidazool (3,8g, 55 mmol) in watervrij dimethylformamide (13 ml) werd triethylsilylchloride (4,6g, 5,1 ml, 30 mol) gevoegd. Het reactiemengsel werd 2 uur bij kamertemperatuur geroerd, op ijswater gegoten met ether geextraheerd, op watervrij MgS04 gedroogd, gefiltreerd en ingedampt. Het residu werd door flitschromatografie gezuiverd. Hexaethyldisiloxan werd eerst met hexaan geelueerd en 3% ethylacetaat in hexaan elueerde de beschermde sulfinezuurester met iets van het sulfon en 10% ethylacetaat in hexaan elueerde het beschermde zuivere sulfon (23) 3,4g 60%). Anal. ber. voor CjoH^OjSSi C, 62,45%, H, 9,43%, S 38,34%, gev. C, 61,97%, H, 9,45%, S, 8,33%, MS, m/z (relatieve intensiteit) 355 (100) (M+-29), 227 (15), 173 (35).

103 (43), 75 (95), 55 (23), NMR (400 MHz, GDCl3) , 0,54 (6,q, J—7 Hz, Si-CH2), 0,94 (9H, t, J=8 Hz), Si-C-CH3) , 1,15 (6H,S,CH3), 1,31-1,36 (4H,m), 3,08-3,12 (2H, m, H-2), 7,57 (2H, t, J—6,8 Hz, H-aryl-meta), 7,66 (lH,t), H-aryl para), 7,92 (2H, d, J=6,8 Hz, H-aryl ortho).

(d) Bereiding van fenvlsulfon (26)

Behandeling van het in de handel verkrijgbare 3- fenylsulfonylpropionzuur (,24) met zure methanol onder standaard veresteringsomstandigheden levert de overeenkomstige methylester op, die men daarna onderwerpt aan een Grignard-reactie onder gebruik van methylmagnesiumbromide onder verkrijging van het fenylsulfonderivaat (25). De reactie van (25) met triethylsilylchloride onder gebruik van de omstandigheden van voorbeeld 3 (a) boven geeft dan het beschermde hydroxysulfon (26).

(e) Bereiding van sulfoneenheid (28V

Door toepassing van de in voorbeeld 3 (d) gegeven werkwijze op zuur (24)/ maar onder gebruik van ethylmagnesiumbromide in plaats van methy lmagnesiumbromide bij de Grignardreactie, verkrijgt men het beschermde sulfonhomoloog (28) .

Zoals uit bovenstaande voorbeelden blijkt, worden de fenylsulfoneenheden bij voorkeur bereid en vervolgens gebruikt als beschermde hydroxylderivaten. Naast beschermende triethylsilylgroepen, zijn andere hydroxyl beschermende groepen t-butyldimethylsilyl, tetrahydrofuranyl en tetrahydropyranyl.

Voorbeeld 4

Ziiketenkoppelincrsreactie (processchema IV) (a) Bereiding van vitaminesulfonen 29 en 30.

Een oplossing van 1,10-fenanthroline (gebruikt als indicator) in watervrij THF werd onder argon toegevoegd aan een 1,35 M oplossing van n-BuLi in hexaan (48 μΐ, 64 μιηοΐ) ter verkrijging van een donkerrode kleur van het mengsel. De oplossing werd in een aceton-droogijsbad gezet en er werd diisopropylamine (9 μΐ, 64μιηο1) toegevoegd. De resulterende oplossing werd 30 minuten bij -77°C onder argon geroerd. Daarna werd een oplossing van sulfon 18 (29 mg, 80 μιηοΐ) in 100 μΐ THF toegevoegd, gevolgd door nog 10 μΐ THF, gebruikt als spoeling. Het resulterende bruine mengsel werd 30 minuten bij -75°C onder argon geroerd en het koelbad werd vervangen door een CCl4-droogijsbad. Na 15 minuten roeren bij -21°C voegde men een oplossing van tosy-laat 13 (11,6 mg, 16 /mol) toe en de kleur van het reac-tiemengsel sloeg van zwart om naar rood. De oplossing werd 3,5 uur bij -20 tot —10°C geroerd en er werd bij -10°C l ml verzadigd NH4C1 toegevoegd. Het mengsel werd met hexaan geextraheerd en de organische fase werd met verzadigd NaCl gewassen.

Het organische extract werd gefiltreerd door een silicagel Sep-Pak patroon, gevolgd door 20 ml 10% ethylace-taat in hexaan. Preparatieve HPLC (kolom 25 cm) met oplos-middelsysteem F gaf bij Ry 37 ml het niet gereageerd hebbende tosylaat 13 (3,0 mg). Sulfon 29 (2,1 mg, 19%, werd daarna geelueerd bij Ry 55 ml: IR (film) 3500, 2956, 1440, 1301, 1258, 1147, 1086, 1072, 1064, cm'1; UV (hexaan) 264 nm, λ230 nm, A264= 1,96; 1H NMR (CDC13) 6 0,41 (3H, S, I8-CH3) , 0,51 A230 (6H, q, J= 5,7Hz, Si-CH2_), 0,86 en Q,88[9H en 9H, elk, s, Si -C(CH3)33 , 0,90 (9H,t, J=8 Hz, SiCH2-CH3) , 1,13 (3H,d, J=5,8 Hz. 21-CH3) . 1,23 (6H,s, 26,27-CH3) , 4,17 (lH,m, 3-H, 4,37 (1H, m, 1-H) , 4,85 (1H, brs, 192-H), 5,17 (1H, brs, 19E-H), 5,99 (lH,d, J=11,0 Hz, 7-H), 6,21 (lH,d, J=10,8 Hz, 6-H), 7,54 (2H,t, J=7,3 Hz, Ar-H. meta), 7,61 (lH,t, J=7,3 Hz, Ar-H,para), 7,33 (2H,d, J=7,3 Hz. Ar-H. ortho); MS, m/z (relatieve intensiteit), 926 (M+,16), 794 (100), 737 (9), 530 (9), 521 (6), 389 (13), 301 (8).

Sulfon 30 (3,8 mg, 35%) (epimeer van 29 bij koolstof 23) werd geelueerd bij Ry 87 ml: IR (film) 3500,2955, 1440, 1304, 1257, 1148, 1086, 1072, 1064 cm*1; UV hexaan) Amax 264 nm, Xmin 229 nm, A264- 2,06; 1H NMR (CDC13) δ 0,49 (3H, s, 18-CH3) , 0,51 (6H, A229 q, J=5,7 Hz, Si-CH2-), 0,85 [18H, s, Si-C(CH3)3) ], 0,90 (9H, t, J—7,9 Hz, Si-CH2-CH3), 1,13 (3H, d, J=6,2 Hz, 21-CH3), 1,23 (6H, s, 26,27-CH3), 4,16 (1H, m, 3-H), 4,35 (1H, m, 1-H), 4,83 (1H, brs, 19Z-H), 5,16 (1H, brs, 19E-H), 5,98 (1H, d, J=Hz, 7-H), 6,20 (lH,d, J=ll,3 Hz, 6-H), 7,54 (2H, t, J=7 Hz, Ar-meta), 7,61 (1H, t, J=7 Hz, Ar-H, para), 7,86 (2H,d, J=7 Hz, Ar-H, ortho); MS m/z (relatieve intensiteit), 926 (19), 794 (100), 737, (11), 530 (28), 521 (14), 389 (33), 301 (14).

(b) 24-dihomo-1.25-dihvdroxvvitamine D;f32)

Een verzadigde oplossing van Na2HP04 in methanol (0,5 ml) werd toegevoegd aan een geroerde oplossing van sulfon 29 (1,80 mg) in 0,5 ml watervrij THF, gevolgd door poedervormig watervrij Na2HP04 (80 mg). Het mengsel werd 30 minuten onder argon geroerd en tot 0°C afgekoeld. Daarna werd vers 5% natriumamalgaan (ca. 200 mg) toegevoegd en werd het mengsel 3 uur bij 5°C geroerd totdat er geen uitgangsstof meer werd waargenomen met TLC (opiosmiddelsysteem C). Het mengsel werd verdund met hexaan (3ml) en het roeren werd 15 minuten voortgezet. De oplosmiddelen werden gedecanteerd en de vaste stoffen werden gewassen met hexaan (3 x 2 ml) er werd ijs en verzadigd NaCl (2 ml) aan de gecombineerde organische oplossingen toegevoegd. De organische laag werd gewassen met verzadigd NaCl en gefiltreerd door silica Sep-Pak patroon onder verkrijging van de beschermde hydroxy 24-dihomo-la,25-dihydroxyvitamine D3-verbinding 31 (1,19 mg, 1,5 jumol, 78%) als een kleurloze olie. Verbinding 31 werd ook op dezelfde wijze verkregen door natrium-amalgaamreductie van sulfon 30· Aldus behoeven sulfonen 29. en 30 als verkregen in bovenstaand voorbeeld 4(a) voor de natrium amalgaamreductie niet te worden gescheiden. Men kan een mengsel van beide ter verkrijging van het gewenste vi-tanime D-derivaat .31 effectief reduceren.

Verbinding 31 (1,1 mg) werd opgelost in 0,5 ml watervrij THF en bij deze oplossing werd tetrabutylam-moniumfluoride in THF(20jul, 1M oplossing) gevoegd . Het mengsel werd 50 minuten bij 50°C onder argon geroerd. Daarna werd ether (3ml) toegevoegd en werd de organische fase gewassen met verzadigd NaCl. Oplosmiddelen werden verwijderd en het residu werd opgelost in 10% 2-propanol in hexaan en gefiltreerd door silica Sep-Pak. Preparatieve HPLC (oplosmiddel D, kolom 6,2 mm x 25 cm, Ry 62 ml)leverde het gewenste vitamine D-homoloog 32. op (465 μg, 76%) ; IR

(film) 3360, 2927, 1602, 1447, 1376, 1297, 1146, 1106, 1086, 1064 cm'1; UV (10% 2-propanol in hexaan) 264 nm,

Kin 228 A264_ 1,91; 1H NMR (CDCl3) S 0,52 (3H, s, I8-CH3) , 0,90 A228 (3H,d, J=6,4 Hz, 21-0%), 1,19 (6H, s, 26,27-CH3), 4,22 (1H, m, 3-H), 4,42 (1H, m, 1-H), 4,99 (1H, brs , 19Z-H) , 5,31 (1H, brs, 19E-H, 6,00 (1H, d, J=ll,l Hz. 7-H), 6,36 (1H, d, J—11,2 Hz, 6-H); MS m/z (relatieve intensiteit 444 (M+, 1,4), 426 (41),393 (10), 251 (26), 209 (17), 197 (20), 157 (29), 155 (37), 134 (58), 105 (54), 59 (100); exacte massa ber. voor 444,3603 gev. 444,3609.

(c) Ziiketenkoppelino onder gebruik van fenvlsul- fon (23)

Men laat vitaminetosylaat 13 met de fenylsul-foneenheden 23 onder de omstandigheden, beschreven in voorbeeld (a) boven reageren ter verkrijging van het overeenkomstige vitaminesulfonadditieprodukt. Na Na/Hg-reductie van dit additieprodukt, onder gebruik van de algemene omstandigheden van voorbeeld 4 (b) boven en daaropvolgende verwijdering van de hydroxyl beschermende groepen als beschreven in voorbeeld 4(b), wordt het gewenste produkt 24-trihomo-1,25-dihydroxy-vitamine D3 verkregen, gekenmerkt door bijgaande structuurformule VIII.

Biologische werking van 24-dihomo-l,25-dihydroxy-vitamine Dz (verbinding 32)

Voorbeeld 5

Meting van differentiatie in HL-60 cellen (tabel 11

De meting van differentiatie in HL-60 cellen (menselijke leukemiecellen) werd uitgevoerd volgens de algemene werkwijzen, beschreven door DeLuca et. al.,. US-A-4.717.721. Naast de daarin beschreven werkwijzen werd niet specifieke zuuresterase activiteit als beschreven gemeten met de kit, op de markt gebracht door de Sigma Chemical Corporation of St. Louis, Missouri. Als getoond in tabel l wordt de differentiatiegraad vastgesteld met drie verschillende proeven (NBT-vermindering, fagocytose en esteraseac-tiviteit) en de resultaten worden uitgedrukt als het percentage geproduceerde gedifferentieerde cellen in respons op behandeling met verschillende concentraties vitamine D-verbindingen.

Tabel 1

Differentiatiewerking van 24-dihomo-l,25-(OH)2D3 in HL-60 cellen in cultuur.

% cellen, dat differentiatie vertoont

Verb. Con- NBT ver- Fagosytose Esterase centratie mindering (molair) 1.25- (OH)2D3 1x10’9 32±3a 28±3a 28±2a lXlO'8 51+3 56+3 60±4 lXlO'7 82±4 84±4 86±2 24-dihomo- 1.25- (OH)2 °3 1X10 28±3 36±3 35±4 (verb. 32) 5xl0"9 64±4 62±4 62±3 1x10-8 70+2 68+2 6 8 ±4 5xl0'8 93±5 94±2 94+2 a Standaardfout van het gemiddelde van 3-4 bepalingen.

De resultaten van deze drie proeven worden getoond in tabel 1. Het is evident, dat het nieuwe homoloog 24-dihomo-l,25-(OH)2D3 (verbinding 32) veel actiever is dan 1,25-(OH) 2D3 zelf bij het veroorzaken van differentiatie van HL-60 cellen in cultuur (tabel 1). Zo wekt 1,25-(QH)2D3, het natuurlijke hormoon, de differentiatie van ongeveer 50-60% van de cellen op bij concentratie van 1 x 10'8, terwijl het nieuwe 24-dihomoanaloog (verbinding 32) meer dan 60% differentiatie geeft bij een vijfvoudig lagere concentratie (5 x 10-9M). Insgelijks is voor l,25-(OH)2D3 een concentratie van 1 x 10'7 molair nodig voor het produceren van ongeveer 80% gedifferentieerde cellen, maar het dihomoana-loog geeft meer dan 90% differentiatie bij 5 x ίο’8 M (bijvoorbeeld 5 maal lager). Deze resultaten ondersteunen krachtig de gevolgtrekking, dat het 24-dihomo-l,25-(OH) 2D3 5-10 maal actiever is dan l,25-(OH)2D3 bij het veroorzaken van differentiatie van HL-60 cellen in cultuur.

Voorbeeld 6

Proef op calcemische werking bii de rat.

fa)Werking op intestinaal calciumtransport en mineralisatie van rachitisch rattebeen fTabel 2).

Pas gespeende mannelijke ratten werden betrokken van de Harlan-Sprague Dawley Company of Madison, Wisconsin en gevoerderd met het rachitogenedieet met hoog calcium-gehalte en laag fosforgehalte, beschreven door Suda et al. (J. NUtr. 100. 1049-1052, 1970). Zij werden in totaal vier weken ad libitum met dit dieet gevoederd. Aan het einde van de derde week werden de dieren verdeeld in groepen van elk 6 ratten. Eén groep ontving dagelijks intraperitoneaal een injectie van de drager (0,1 mm 95% propyleenglycol, 5% e-thanol). De overige groepen ontvingen dezelfde hoeveelheid drager, maar ontvingen één van de volgende doses: 12,5 ng l,25-(OH)2D3; 25 ng l,25-(OH)2D3; 12,5 ng 24-dihomo-l,25- (OH)2D3 of 25 ng 24-dihomo-l,25-(OH)2D3. 24 Uur na de laatste dosis werden de dieren afgemaakt, de darmen verwijderd en de duodenaalsegmenten werden gebruikt voor het meten van intestinaal calciumtransport als beschreven door Halloran en DeLuca fArch. Biochem. Biophvs. 208. 477-486, 1981).

Werking op calciumtransport wordt in tabel 2 gegeven als de calciumtransportverhouding, aangegeven met een aanduiding 1/0 [de concentratie van calcium in serosaalmedium (I) gedeeld door de calciumconcentratie in mucosaalmedium (0) ]. Ter bepaling van beendermineralisatie in respons op proef-verbindingen werden de femurs van alle dieren verwijderd, 24 uur geextraheerd met 95% ethanol in een Soxhlet extrac-tieinrichting en 24 uur geextraheerd met chloroform onder gebruik van een Soxhlet extractieinrichting. Zij werden tot constant gewicht gedroogd en zowel het totale als het percentage as in de femurs werd bepaald na 24 uur verassing bij 600°F. De calciumtransportverhouding wordt aangegeven met een aanduiding 1/0 [de calciumconcentratie in het sero-saalmedium (I) gedeeld door de calciumconcentratie in het mucosaalmedium (0)]. Het asgehalte wordt gemeten in totaal mg as/femur of het percentage as, gebaseerd op ontvet droog beendergewicht.

Tabel 2

Respons van rachitische ratten op 24-dihomo-l,25-dihydroxyvitamine D3

Groep Calciumtran- Femuras Femuras sportverhou- mg (gemidd.i ding 1/0 (gemidd.i S.E.M.) (gemidd. + S.E.M.) S.E.M.)

Controle 4,0±0,2a 17,71,0a 14,0±0,20a (drager) 1.25- (OH) 2¾ 12.5 ng/dag 10,4±0,8 26,3±1,6 18,9±0,52 25 ng/dag 13,2±1,0 26,4±1,7 19,9±1,3 24-dihomo- 1.25- (OH)2D3 (verb. 32) 12.5 ng/dag 3,0±0,3 21,0±1,0 14,75+1,4 25 ng/dag 3,0±0,4 18,7±1,5 14,8±0,69 a Standaardfout van het gemiddelde van 6 bepalingen.

(b) Meting van intestinaal calciumtransoort en beendercalciummobilisatie (tabellen 3 en 4).

Pas gespeende mannelijke ratten werden verkregen van de Harlan Sprague Dawley Company en werden gedurende een periode van 4 weken gevoederd met het vitamine D-defi-ciente dieet met laag calciumgehalte, beschreven door Suda et al. (i7_g_ Nutr. 100 1049-1052, 1970). Aan het einde van de derde week ontvingen de dieren de aangegeven doses (tabellen 3 en 4) opgelost in 95% propyleenglycol en 5% ethanol. Elk dier ontving 7 dagen lang elke dag 0,1 ml oplos-middeldrager, die de aangegeven dosis bevatte en de controlegroep ontving slechts oplosmiddel. Intestinaal cal-ciumtransport werd gemeten als beschreven door Halloran en DeLuca (Arch. Biochem. Biophvs. 208, 477-486, 1981) en se-rumcalcium werd gemeten onder gebruik van een atoomab-sorptiespectrofotometer (US-A-4.717.721).

Tabel 3

Respons van ratten met dieet met laag calciumgehalte op 24-dihomo-l,25-dihydroxyvitanine D3

Groep Calciumtransport Serumcalcium 1/0 mg% (gemidd. ± S.E.M) (gemidd.±S.E.M)

Controle 4,8±0,26a 4,l±0,05a 1,25-(OH) 2¾ 12,5 ng/dag 11,2/0,6 4,8±0,08 25 ng/dag 13,2±1,2 4,8±0,08 24-dihomo-l,25-(OH)2D3 (verbinding 32.) 125 ng/dag 9,4±0,8 4,2±0,06 8 Standaardfout van het gemiddelde van 6 bepalingen.

Tabel 4

Respons van serumcalcium van vitamine-deficiente ratten met dieet met laag calciumgehalte op 24-dihomo-l,25-dihydroxy-vitamine D3

Groep Serumcalcium mg% (gemidd. ± S.E.M)

Controle 3,4±0,07a l,25-(OH)2D3 12,5 ng/dag/7 dagen 3,7±0,17 25 ng/dag 4,1±0,07 75 ng/dag 4,6±0,09 24-dihomo-l,2 5-(OH)2D3 (verbinding 32) 25 ng/dag 3,6±0,16 125 ng/dag 3,95±0,13 250 ng/dag 3,80±0,05 a Standaardfout van het gemiddelde van 6 bepalingen.

De in tabellen 2 en 3 getoonde resultaten laten zien, dat 24-dihomo-l,25-(OH)2D3 (verbinding 32) veel minder actief is dan l,25-(OH)2D3 bij het stimuleren van intestinaal calciumtransport. l,25-(OH)2D3 bereikt maximaal cal-ciumtransport tussen 12,5 en 25 ng per dag, terwijl 24-di-homo-l,25-(OH)2D3 geen enkele werking vertoonde bij deze doses (tabel 2) en slechts een significante respons gaf bij het gehalte van 125 ng per dag (tabel 3). Zelfs dan was de respons lager dan werd geproduceerd door l,25-(OH)2D3 bij 12,5 ng/dag. Deze resultaten tonen aan, dat het dihomoana-loog slechts één-tiende of minder van de werking van 1,25-(OH)2D3 bij het stimuleren van intestinaal calciumtransport (tabellen 2 en 3).

In het geval van beendermineralisatie (tabel 2) wordt een soortgelijk gebrek aan effect van 24-dihomo- 1,25—(OH)2D3 op mineralisatie van het skelet waargenomen. De gegevens onder femuras en femuras % in tabel 2 laten zien, dat doses van 12,5 en 25 ng van de dihomoverbinding (32.) geen enkele verandering van betekenis geven ten opzichte van de controle, terwijl daarentegen l,25-(OH)2D3 bij dezelfde dosishoogten mineralisatie van betekenis uitlokte.

Toen beendercalciummobilisatie (serumcal-ciumspiegels) werd gemeten, bleek, dat l,25-(OH)2D3 een verhoging van betekenis van serumcalcium ten koste van been gaf bij dosis van 12,5 en 25 ng per dag (tabellen 3 en 4). Daarentegen lokte 24-dihomo-l,25-(OH)2D3 geen respons van ^6|ζβηι-3 uit bij een dosishoogte 25 ng/dag en geen bij 125 ng/dag bij één experiment (tabel 3) en een zeer gematigde stijging in serumcalcium bij toediening in hoeveelheden van 125 en 250 ng/dag bij een tweede experiment (tabel 4). Op te merken is ook de waarneming (tabel 4), dat opvoering van de dosis van 125 naar 250 ng/dag bloedcalciumspiegels niet verder opvoert. Deze resultaten wijzen erop, dat het 24,24-dihomo-l,25-(OH)2D3 minder dan één-tiende zo actief is als 1,25-(OH)2D3 bij het opvoeren van serumcalcium ten koste van been. Deze resultaten worden ook bevestigd door een derde experiment omtrent meting van beendercalciummobilisatie, waarbij het dihomoanaloog 32, bij beproeving over een dosistraject tot 1000 ng/dag geen respons uitlokte.

Aldus is het evident, dat het nieuwe vitamine D-homoloog (verbinding 32) onverwachte preferentieele werking in cellendifferentiatie vertoont en daarbij weinig effect heeft op calciumtransport en -mobilisatie. Dit is het type werkingspatroon, dat gewenst is voor een vitamine D-ver-binding, die bedoeld is voor gebruik als anti-kankermiddel. Vanwege zijn zeer geringe calcemische werking (vergeleken bij 1,25-(0H)2D3) kan het nieuwe dihomo-l,25-(OH)2D3 analoog worden toegediend zonder een ongewenste hypercalcemische respons op te wekken bij patiënten, terwijl het toch een zelfs hogere potentie vertoont dan 1,25-(011)203 bij het stoppen van kwaadaardige celvermenigvuldiging en het opwekken van celdifferentiatie. Hetzelfde type ac-tiviteitspatroon, namelijk uitgesproken differentiatiewer-king, gecombineerd met zeer geringe of verdwenen cal-cemische potentie, kan worden verwacht voor het 24-trihomo-analoog van de uitvinding, welke verbinding, dan ook een sterk verhoogde en voordelige differentiatie/calcemische werkingsverhouding zal vertonen. Hoewel structureel verwant met 24-homovitamine D-analogen van de stand der techniek (US-A-4.717.721) vertonen de homozijketenvitamine D-verbin-dingen van de uitvinding een radicaal veranderd wer-kingsprofiel: sterke werking op celdifferentiatie, gecombineerd met nagenoeg calcemische potentie. Aangezien de differentiatiewerking voorts uitgesproken is in het geval van menselijke leukêmiecellen (HL-60 cellen), is het duidelijk, dat deze nieuwe vitaminehomologen kunnen worden gebruikt voor de behandeling van kwaadaardige aandoeningen bij de mens, vooral leukemieën.

Voor behandelingsdoeleinden kan men deze verbindingen verwerken als oplossingen in onschadelijke oplosmiddelen, of als emulsies, suspensies of dispersies in geschikte en onschadelijke oplosmiddelen of dragers, of als pillen, tabletten of capsules volgens in de techniek gebruikelijke werkwijzen. Dergelijke samenstellingen kunnen ook andere farmaceutische aanvaardbare en niet toxische excipiënten bevatten, zoals stabilisatoren, anti-oxydanten, bindmiddelen, kleurstoffen of emulgatoren of smaak-modificerende middelen.

De verbindingen worden voordelig toegediend door injectie, of door intraveneus infuus van geschikte steriele oplossingen, of in de vorm van orale doses via het spijsverteringskanaal . Ter behandeling van menselijke leukemie worden de homovitamine D-verbindingen van de uitvinding aan patiënten toegediend in doses, die voldoende zijn voor het opwekken van de differentiatie van leukemiecellen tot ma-crofagen. Voorkeursdoses zijn 0,5 μg tot 50 μg per dag, maar de doses kunnen natuurlijk op nog veel lager peil worden ingesteld, afhankelijk van de ernst van de aandoening of de respons of de toestand van de patiënt, zoals in de techniek wel wordt onderkend.

Claims (26)

1. Werkwijze voor het bereiden van vitamine D-verbindingen met de algemene structuurformule IV, waarin X en Y, die hetzelfde of verschillend kunnen zijn, zijn gekozen uit de groep, bestaande uit waterstof en een hydroxyl beschermende groep en waarin R is gekozen uit de groep, bestaande uit alkyl, met fluor gesubstitueerde alkyl, met hydroxyl gesubstitueerde alkyl, met hydroxyl en fluor gesubstitueerde alkyl, met beschermde hydroxyl gesubstitueerde alkyl en met beschermde hydroxyl en fluor gesubstitueerde alkyl, waarbij men een vitamine D-22-tosylaat-derivaat met de algemene structuurformule IX, waarin X en Y zijn gekozen uit de groep, bestaande uit waterstof en hydroxyl beschermende groepen, behandelt met een alkylfenyl-sulfonderivaat met de algemene structuur Ph-S02-CH2-R waarin R is gekozen uit de groep, bestaande uit alkyl, met fluor gesubstitueerde alkyl, met hydroxyl gesubstitueerde alkyl en met hydroxyl en fluor gesubstitueerde alkyl, waarbij elke aanwezige hydroxylgroep bij voorkeur is gederiva-tiseerd met hydroxyl beschermende groepen, onder verkrijging van een zijketensulfonadditieprodukt met de algemene structuurformule III, waarin X, Y en R de boven gedefinieerde groepen voorstellen en dit zijketensulfonadditieprodukt zodanig reduceert, dat de overeenkomstige vitamine D-verbinding wordt verkregen en eventueel de aanwezige hydroxyl beschermende groepen verwijdert.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij X en Y hydroxyl beschermende groepen zijn.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, waarbij R 4-methyl-4-hydroxypentyl in beschermde hydroxylvorm is.

4. Werkwijze volgens conclusie 2, waarbij R 5-methyl-5-hydroxyhexyl in beschermde hydroxylvorm is.

5. Verbindingen met de structuurformule III, zijn gekozen uit de groep, bestaande uit waterstof en een hydroxyl beschermende groep en waarin R is gekozen uit de groep, bestaande uit alkyl, met hydroxyl gesubstitueerde alkyl, met fluor gesubstitueerde alkyl, met hydroxyl en fluor gesubstitueerde alkyl en hun overeenkomstige beschermde hydroxylvormen.

6. Verbindingen volgens conclusie 5, waarin X en Y waterstof zijn.

7. Verbindingen volgens conclusie 5, waarin X en Y hydroxyl beschermende groepen zijn.

8. Verbindingen volgens conclusie 5, waarin R 4-methyl-4-hydroxypentyl is.

9. Verbindingen volgens conclusie 5, waarin R 4-methyl-4-hydroxypenty1 in beschermde hydroxylvorm is.

10. Verbindingen volgens conclusie 5, waarin R 5-methyl-5-hydroxyhexyl is.

11. Verbindingen volgens conclusie 5, waarin R 5-methyl-5-hydroxyhexyl in beschermde hydroxylvorm is.

12. Verbindingen met de structuurformule I, waarin X, Y en Z, die hetzelfde of verschillend kunnen zijn, zijn gekozen uit de groep, bestaande uit waterstof en een hydroxyl beschermende groep en waarin n 3 of 4 is.

13. Verbindingen volgens conclusie 12, waarin X, Y en Z hydroxyl beschermende groepen zijn.

14. Verbindingen volgens conclusie 13, waarin X, Y en Z alkylsilylgroepen zijn.

15. Verbindingen volgens conclusie 12, waarin X, Y en Z waterstof zijn.

16. 24-Dihomo-la,25-dihydroxyvitamine D3.

17. 24-Trihomo-la,25-dihydroxyvitamine D3.

18. Farmaceutisch preparaat, dat een verbinding volgens conclusie 12 naast een farmaceutisch aanvaardbare drager bevat.

19. Farmaceutisch preparaat volgens conclusie 18, waarin de verbinding 24-dihomo-la,25-dihydroxyvitamine D3 is.

20. Farmaceutisch preparaat volgens conclusie 18, waarin de verbinding 24-trihomo-la,25-dihydroxyvitamine D3 is.

21. Werkwijze voor het opwekken en opvoeren van celdifferentiatie in kwaadaardige cellen, waarbij men deze cellen blootstelt aan tenminste één van de verbindingen volgens conclusie 12 in een voor het opwekken van celdifferentiatie voldoende hoeveelheid.

22. Werkwijze volgens conclusie 21, waarbij de verbinding 24-dihomo-la,25-dihydroxyvitamine D3 is.

23. Werkwijze volgens conclusie 21, waarbij de verbinding 24-trihomo-la,25-dihydroxyvitamine D3 is.

24. Werkwijze voor het behandelen van neoplas-tische ziekten, waarbij men aan een patiënt met een neo-plastische ziekte een effectieve hoeveelheid toedient van tenminste één van de verbindingen van conclusie 12.

25. Werkwijze volgens conclusie 24, waarbij de toegediende verbinding 24-dihomo-la, 2 5-dihydroxy vitamine D3 is.

26. Werkwijze volgens conclusie 24, waarbij de toegediende verbinding 24-trihomo-la,25-dihydroxyvitamine D3 is.