KR930011151B1

KR930011151B1 - 세포 분화의 유발에 유효한 화합물

Info

Publication number: KR930011151B1
Application number: KR1019890702481A
Authority: KR
Inventors: 헥터 에프. 드루카; 하인리히 케이. 쉬노에스; 캐토 엘. 펄먼; 안드르예즈 쿠트너
Original assignee: 위스콘신 알럼나이 리써취 파운데이션; 존 알. 파이크
Priority date: 1988-04-29
Filing date: 1989-04-18
Publication date: 1993-11-24
Also published as: HUT52475A; IE67868B1; JPH02504154A; KR900700449A; IL90066A0; NL8920414A; DK89091D0; HU206083B; WO1989010353A1; HU892989D0; AU3573089A; IN170659B; JPH0725730B2; DK666589D0; DK89091A; FR2630740A1; IL90066A; US4927815A; JPH0748343A; US5061699A

Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]

세포 분화의 유발에 유효한 화합물

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 미합중국 보건후생성(Department of Health and Human Service)의 승인 또는 재정하에 지원되는 연구를 행하는 중에 이루어졌다. 미합중국 정부는 본 발명에 일정 권리를 갖는다.

본 발명은 신규한 비타민 D 화합물 및 그의 일반적인 제조방법에 관한 것이다. 좀더 구체적으로 설명하면, 본 발명은 악성 종양 세포의 분화에 있어서 예기치 못했던 특이한 활성을 나타내는 1α-히드록시비타민 D 측쇄 동족체, 및 유백혈병성 질환을 포함하는 종양성 질환을 치료하기 위한 상기 신규 화합물의 용도에 관한 것이다.

[발명의 배경]

비타민 D 계열의 화합물은 동물 및 사람의 칼슘 향상성 조절시 필수적인 작용물로 공지되어 있다. 또한, 칼슘 대사의 조절에 유효한 것은 비타민 D 자체가 아니라, 동물 및 사람의 체내에서 비타민 D로부터 생성된 대사산물이라는것도 알려져 있다. 이와 관련하여, 가장 중요한 비타민 D 대사산물은 1α, 25-디히드록시 비타민 D₃(1, 25-(OH)₂D₃)이다. 이 화합물 및 1α-히드록시비타민 D₃(1α-OH-D₃), 1α-히드록시비타민 D₂(1α-OH-D₂) 또는 일부의 불소 치환된 1, 25-(OH)₂D₃유도제와 같은 그의 구조적 동족체 일부는 장의 칼슘 흡수 및 뼈(뼈관절)로부터 칼슘의 재흡수를 자극하는데 높은 효능을 나타낸다. 그 결과, 이들 화합물은 신성골이영양증, 상피소체기능감퇴증, 비타민 D-내성 구루병 또는 골다공증과 같은 다양한 칼슘 대사 장해를 치료하기 위한 약제로서 현재 사용되고 있거나 그의 사용이 권장되어 왔다.

보다 최근의 연구에 의하면, 1, 25-(OH)₂D₃는 생체내에서 칼슘 향상성을 조절하는 역할이외에 다른 생물학적 기능도 수행한다고 밝혀졌다. 좀더 구체적으로, 1, 25-(OH)₂D₃및 그의 관련 화합물(예:1α-OH-D₃또는 1, 25-(OH)₂D₃의 불소 동족체)는 세포 분화를 유발시키는데 있어서 높은 효능을 나타내는 것으로 나타났다. 가장 중요하게는, 1, 25-(OH)₂-D₃는 악성 종양 세포(좀더 구체적으로는 유백혈병성 세포)의 증식을 억제하며, 배양중인 악성 종양 세포를 정상 단핵세포로 분화시키는 것으로 밝혀졌다[아베(Abe)등, Proc. Natl, Acad. Sci. USA78, 4990(1981); 혼마(Honma)등, ibid, 80, 2O1(1983)]. 이와 같이 현저한 활성으로 인하여, 1, 25-(OH)₂D₃및 그의 관련 화합물은 항암제 특히, 유백혈병 치료제로서 권장 되었다[수다(Suda) 등, 미합중국 특허 제4,391,802호]. 이 화합물들이 배양중인 악성 종양 세포의 분화에 충분히 높은 효능이 있기는 하지만, 또한, 칼슘 대사에도 이와 동등하게 높은 효능을 나타내므로, 사실상 분화치료시 항암제로 사용함에는 극도의 제한이 따른다. 이 화합물들은 효과적인 유백혈병 치료제로 사용하기 위해 필요한 생체내 농도에서, 이 화합물들은 그의 고유한 칼세믹 활성(calcemic activity)으로 인하여 혈중칼슘 농도를 현저하게 상승시켜, 잠재적인 위험성을 유발시킬 수 있다. 이들 공지의 비타민 D 화합물은 이러한 칼세믹 활성 때문에 악성종양 치료시 사용이 금지되거나 극도로 제한되므로, 그 작용에 있어서 보다 큰 특이성 및 선택성을 갖는 화합물이 필요하다.

본 명세서에서, ＂칼세믹 활성＂ 또는 ＂칼세믹 작용＂이라는 용어는 비타민 D 화합물이 장의 칼슘 흡수(Ca 이동) 및 뼈(뼈관절)로부터의 칼슘 재흡수를 자극하여 혈중 칼슘 농도를 상승시킬수 있는 능력을 약칭하는 것이다. ＂분화 활성＂이라는 용어는 일부의 비타민 D 화합물이 악성종양 세포의 증식을 억제하여 정상 세포로의 분화를 유발시킬 수 있는 활성을 의미하여, 최근에 발견되었다.

선형 기술에서는 분화 활성이 증진된 수개의 화합물이 제조되었다. 즉, 미합중국 특허 제4,717,721호 및 다른 간행물[오스트렘 및 드루카(Ostrem ＆ DeLuca], Steroid, 49, 73-102(1988); 오스트렘 등, J. Biol. Chem., 262, 14164(1987)]은 측쇄가 탄소원자 1개 만큼 연장된 1, 25-(OH)₂D 동족체가 1, 25-(OH)₂D₃보다 약 10배나 더 큰 유백혈병성 세포의 분화 활성을 나타내는 것으로 기재하고 있다. 그러나, 이들 화합물은 1, 25-(OH)₂D₃와 거의 마찬가지로 칼슘흡수를 자극하여, 혈청 칼슘 농도를 상승시키는 효능이 있으므로, 상기 바람직하지 못한 강력한 칼세믹 활성이라는 문제를 극복하지 못했다. 따라서, 비록 이들 화합물이 개선된 분화/칼세믹 활성비를 나타내기는 하지만, 이들은 그의 모체 화합물(즉, 1, 25-(OH)₂D₃)만큼 높은 칼세믹 효능을 나타낸다는 점에서 선택적이지 못하다. 선택적 분화 활성을 나타낸다고 하는 다른 비타민 D-관련 화합물들이 다음의 참조문헌에 보고되어 있지만 [참조문헌 : 오스트렘 등, 상기 문헌과 동일 : 쿠보데라(Kubodera)등, Chem, Pharm, Bull., 34, 2286-2289(1986) : 이께까와(Ikekawa)등, Chem, Pharm, Bull., 35, 4362(1987)], 이들은 본 발명의 화합물과는 구조적으로 구별되고 또한 상이하다.

[발명의 요약]

본 발명은 바람직하고 매우 유리한 양상의 생물학적 활성을 나타내는 신규한 화합물군을 제공한다. 이들 화합물은 칼슘 대사에 대한 영향에 있어서 1, 25-(OH)₂D₃보다 훨씬 낮은 활성을 나타내면서도, 악성종양 세포의 분화를 유발시키는데 있어서는 1, 25-(OH)₂D₃에 비해 높은 효능을 가짐을 특징으로 한다. 따라서, 이들 화합물은 매우 특이적인 분화제이며, 이들의 활성 양상은 이들을 악성 종양의 분화치료에 사용할 수 있게 해 준다. 이들 화합물은 칼슘 대사에 대해 전혀 작용을 하지 않거나 그 작용이 현저하게 감소되며, 또한 매우 높은 분화 활성은 가지므로, 혈중 칼슘 농도를 과도하게 상승시키지 않으면서 악성종양 치료용으로 생체내 투여할 수 있다. 이러한 특성으로 인하여, 이들 화합물은 이러한 목적에 적합한 치료제일 것이다

위와 같이 바람직한 생물학적 특성을 갖는 화합물은 1, 25-(OH)₂D₃의 측쇄에 2 또는 3개의 메틸렌 단위가 삽입되어 측쇄가 연장된 1, 25-(OH)₂D₃의 측쇄 동족체라는 구조적 특징을 갖는다. 즉, 이러한 형태의 화합물은 하기의 일반식 구조를 특징으로 한다.

식중, X, Y 및 Z는 서로 동일 또는 상이한 것으로서 수소 또는 히드록시 보호기를 나타내며, n은 3 또는 4이다.

24-디호모-1, 25-(OH)₂D₃및 히드록시가 보호된 그의 유도체, 즉 상기 구조에서 n이 3인 화합물과 24-트리호모-1, 25-(OH)₂D₃및 히드록시기가 보호된 그의 유도체, 즉 상기 구조에서 n이 4인 화합물이 상기에서 구조적으로 정의된 화합물의 바람직한 예이다.

본 발명의 화합물은 미합중국 특허 제4,717,721호의 24-호모-비타민 D 화합물과 관련이 있지만, 이 화합물과 본 발명의 화합물은 구조적 특징 및 생물학적 특징에 의해 구별할 수 있다. 본 발명의 화합물은 구조적으로 2 또는 3개의 메틸렌 단위를 탄소쇄에 삽입함으로써 측쇄가 연장되어 있다는 주요한 특징을 갖는 신규한 비타민 D 동족체이며, 생물학적으로는 칼세믹 활성이 없거나 크게 감소되어 있으면서도 악성종양세포의 증식을 억제하여 분화를 유발시키는데 있어서 1, 25-(OH)₂D₃와 적어도 근사하거나 보다 큰 효능을 갖는 매우 선택적인 세포 분화제이다.

따라서, 본 발명은 악성종양 세포의 분화를 유발시켜, 종양성 질환의 치료에 특히 유용한 신규 화합물을 제공한다.

또한, 본 발명은 비타민 D 화합물의 신규한 제조방법을 제공한다. 이 방법은 상기한 신규 화합물의 합성뿐만 아니라 공지의 비타민 D 대사산물이나 다른 동족체 또는 다른 측쇄 변성 비타민 D₃유도체의 합성에도 사용할 수 있다.

이 제조 방법의 기본 개념은 제22위치의 탄소에 치환가능기를 갖는 미리 합성한 비타민 D 핵에 이와 별도로 합성한 적당한 측쇄 단위를 결합시켜 목적하는 비타민 D 화합물을 제조하는 것이다. 필요한 측쇄 단위는 페닐술폰 유도체로서 제조되며, 1α-히드록시비타민 D형 화합물이 합성의 목적물인 경우, 필요한 비타민 D핵은 하기 구조의 세코스테롤 유도체이다.

식중, X 및 Y는 수소 또는 히드록시 보호기를 나타내며, L은 할라이드와 같은 이탈기, 또는 토실옥시나 메실옥시 또는 유사한 치환성 관능기이다. 이 형태의 바람직한 유도체는 히드록시기가 보호된 비타민 D-22-토실옥시 화합물이다. 적합한 측쇄의 제조시 사용되는 필요한 페닐술폰 화합물은 하기의 구조를 갖는다.

식중, Ph는 페닐 또는 알킬 치환 페닐기를 나타내고, R은 알킬, 및 히드록시 및 플루오로 치환 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며, 히드록시기는 히드록시 보호기에 의해 유도되는 것이 바람직하다.

상술한 비타민 D-22-토실레이드와 적당한 페닐술폰 단위간의 결합은 확립된 술폰화학의 이론에 근거하고 있다 [예 : P.D.마그너스(Magnus), Tetrahedron, 33, 2019(1977) : 트로스트(Trost)등, Tetrahedron Letters, 3477(1976)]. 강염기가 개재된 반응은 하기 구조로 나타내는 부가물을 생성시킨다.

식중, R, X 및 Y는 상기 정의한 바와 같다.

이어서, 신규 화합물인 상기 형태의 중간 부가물은 금속 아말감(예 : 나트륨 아말감, 알루미늄 아말감)을 함유하는 매질 중에서 환원시켜 목적하는 하기 일반 구조의 비타민 D 화합물을 제조할 수 있다.

또한, 환원성 술폰제거반응은 예컨데 금속/알킬아민 또는 금속/NH, 혼합물을 사용하는 금속 환원물을 용해시키는 것과 같이 기타 다른 방법에 의하여 달성할 수도 있다. 이어서, 히드록시 보호기는 당 업계에 공지된 표준방법에 의해 제거하여 상응하는 유리 히드록시 화합물을 제조할 수 있다.

본 발명의 측쇄 결합 공정의 출발물질인 상기 비타민 D-22-토실레이트는 공지의 방법으로 제조할 수 있는 공지의 물질이다[예 : 앤드류(Andrews)등, J. Org. Chem. 51, 4819(1986)]. 또한, 이 출발물질은 하기 구조를 갖는 비타민 D-22-에스테르를 수소화물로 환원시킨 후, 토실화하여, 제조할 수도 있다[참조 : 쿳네르(Kutner)등, Tet.Letters 28, 6129-6132(1987)].

식중, X 및 Y는 수소 또는 히드록시 보호기이며, A는 알킬 또는 아릴기이다. 본 발명의 비타민 D 화합물 합성의 일부로서 이들 신규한 에스테르를 제조 및 사용하는 것은 본 발명의 또다른 일부분을 이룬다.

비타민 핵으로서 비타민 D-22-토실레이트를, 측쇄 잔기로서 적당한 페닐술폰을 사용하는 상기 방법은 R로서 선택되는 알킬 또는 히드록시-알킬기에 따라 좌우되어, 다수의 1α-히드록시비타민 D측쇄 동족체를 제조하는데 사용될 수 있음이 명백하다. 바람직한 페닐알킬 술폰 단위는 R이 하기 일반 구조의 알킬 또는 히드록시-알킬기인 화합물이다.

또는

식중, U는 수소, 히드록시, 보호된 히드록시 또는 탄소수 1-4의 탄화수소기로 이루어진 군으로부터 선택되고, P, m 및 n은 서로 독립적으로 1 내지 5의 정수이며, Z는 수소 또는 히드록시 보호기이다.

바람직한 생물학적 활성을 갖는(칼세믹 활성이 전혀 없거나 낮으며, 분화 활성이 높은) 신규 화합물의 제조에 특히 바람직한 것은 n이 3 또는 4인 상기한 술폰 단위이다.

본 명세서 및 특허청구의 범위에서, ＂히드록시 보호기＂라는 용어는 예를 들어 아실, 알킬실릴 및 알콕시 알킬기와 같이 히드록시 관능기를 일시적으로 보호하기 위해 통상적으로 사용되는 모든 기를 의미하며, 보호된 히드록시기는 이러한 보호기로부터 유도되는 히드록시 관능기이다. ＂아실＂이라는 용어는 모든 이성질체 형태를 포함한 탄소수 1-6의 알카노일기, 옥살릴, 말로릴, 숙시닐, 글루타릴기와 같은 탄소수 1-6의 카르복시 알카노일기, 벤조일과 같은 방향족 아실기 또는 할로, 나트로 또는 알킬 치환 벤조일기를 의미한다. ＂알킬＂이라는 용어는 모든 이성질체 형태를 포함한 탄소수 1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킥기를 의미한다. 알콕시알킬 보호기는 메톡시메틸, 에톡시메틸, 메톡시에톡시메틸 또는 테트라히드로푸라닐 및 테트라히드로피라닐 등과 같은 기이다. 바람직한 알킬실릴 보호기는 트리메틸실릴, 트리에틸실릴, t-부틸디메틸실릴 및 이와 유사한 알킬화된 실릴기이다.

본 발명은 후술하는 실시예에 의하여 보다 상세히 설명되는데, 이들 실시예는 단지 수득가능한 신규 화합물 및 그의 합성방법을 예시하고자 하는 것에 지나지 않는다. 이들 실시예에서, 아라비아 숫자로 나타낸 특정화합물(예 : 화합물 1,2,3등)은 반응식에서 동일한 번호의 구조를 갖는 화합물을 가리킨다. 또한, 이들 신규 화합물의 현저한 생물학적 특성을 나타내는 실시예도 제공되는데, 이러한 특성은 본 발명의 화합물을 세포분화제 및 항종양제로 사용하는 근거가 된다.

[화합물의 제조]

[일반적인 방법]

적외선 스펙트럼(IR)은 오일상물질만으로된 필름을 사용하는 Nicolet MX-1 FT-IR 분광계 상에서 얻었다. Hitachi Model 60-100 UV-VIS 분광계로 자외선(UV) 흡수 스펙트럼을 기록하였다. 특정 용매 중에서 Bruker WH-270 또는 AM-400FT 분광계로 270 또는 400MHz에서 핵자기 공명(NMR) 스펙트럼을 기록하였다. 화학적 이동(chemical shift, δ)은 내부 Me₄Si(δ 0.00) 또는 CHCl₃(δ 7.24)로부터 다운 피일드(downfield)로 보고한다. 저분해능 및 고분해능 질량 스펙트럼은 Kratos DS-55 Data System이 장치된 Kratos MS-50 TC 기기상에서 70 eV(달리 명시하지 않는 한)에서 기록하였다. 고분해능 데이터는 피이크 매칭법(peak matching)에 의해 얻었다. 시료는 직접삽입 탐침(probe)을 이용하여 120-250℃로 유지시킨 이온 공급원에 도입시켰다. 실리카겔 60(Merck, 70-230 또는 230-400메쉬)을 컬럼 크로마토그래피에 사용하였다. UV 지시약[이엠 사이언스(EM Science)사 제품, 뉴저지주 깁스타운 소재]으로 미리 피복된 알루미늄 실리카겔 시이트를 사용하여 박층 크로마토그래피(TLS)을 행하였다. 사용된용매 계는 다음과 같다.

A : 클로로포름-에탄올, 85 : 15(v/v), B : 헥산-아세트산에틸, 1 : 1, C : 헥산-아세트산 에틸, 3 : 1. 모델 6000A 용매 전달 시스템, 모델 6UK Universal 사출기 및 모델 450 가변파장 검출기가 장치된 Waters Associates 액체 크로마토그래피를 사용하여 고성능 액체 크로마토 그래피(HPLC)를 행하였다. Zorbax-Silica[페노메넥스(Phenomonex) 제품]컬럼(6.2mm×25cm 및 10mm×25cm)을 사용하였다. 용매계로는 A : 헥산중 2-프로판올 3％, B : 헥산중 2-프로판올 2％, C : 헥산중 2-프로판올 6％, D : 헥산중 2-프로판올 10％, E : 헥산중 2-프로판올 20％, F : 헥산중 아세트산에틸 2％을 사용하였다. 실리카겔 Sep-Pak[워트스 어소시에이츠(Waters Assciates)제품] 카트리지를 HPLC 시료의 예비여과에 사용하였다. 3β-아세톡시-22, 23-비스노르-5-콜렌산은 스트레랄로이드(Streraloids)사 (뉴햄프셔주 월튼 소재)로부터 구입 하였다. 테트라히드로푸란(THF)을 소듐 벤조페논 케틸로부터 증류시켰다. 다른 용매는 표준방법으로 정제하였다. 헥산중 n- 부틸리튬(알드리히)을 아르곤 기류하에서 THF중 1, 10-페난트롤린의 존재하에 n-프로판올로 적정하였다. 비타민 D 화합물과 관련된 반응은 질소 또는 아르곤 기류하에 자기교반을 하면서 행하였다. 용액 및 액체는 고무격막을 통해 주사기로 전달한다.

[실시예 1]

1α-히드록시비타민 C-22 에스테르(화합물 10) 및 히드록시기가 보호된 그의 유도체(화합물 8, 11)의 합성(제1도의 방법)

(a) 스테로이드 에스테르 1 및 2의 제조

3β-아세트-22, 23-비스노르-5-콜렌산(10g)을 메탄올 중의 5％ KOH 420ml에 용해시키고, 이 용액을 실온에서 15분 동안 교반하여 아세트산염을 가수분해하였다. 이 용액에 메탄올 중의 10％ H₂SO₄160ml를 교반하면서 적가하고, 이와 같이 하여 형성된 현탁액을 메탄올 중의 1％ H₂SO₄400ml로 희석시켰다. 이 혼합물을 환류 하에서 48시간 동안 가열하여 에스테르화 반응을 완결시켰다.(A 용매계로 TLC하여 검색). 생성물인 메틸 에스테르(1) (9.0g, 88％)를 표준법으로 단리 시키고, 이 화합물 4.4g(12mmole)을 무수 디메틸포름아미드(DMF) 135ml에 용해시키고, 여기에 이미다졸(3.6g, 52.8mmole), 염화 tert-부틸디메틸실릴(4.0g, 26.4mmole)의 순으로 첨가하였다. 이 용액을 다량의 침전물이 형성될 때까지 5분 동안 실온에서 교반한 후, 계속하여 15분 더 교반하였다. 반응 혼합물을 헥산(400ml)로 추출하고, 물, NaCl 포화용액 순으로 세척하고, MgSo₄상에서 거조시켰다. 용매를 증발시키고 TLC하여(B 용매계 사용), 무색 오일로서 실릴화 에스테르 2(5.3g)를 얻고, 이것을 더 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다. 이것을 헥산 중 2％ 아세트산에틸을 사용하여 불꽃 크로마토그래피하여 부석 시료를 얻었다. IR(필름) 1737.99, 1604.89cm^-1.

(b) 5, 7-디엔(3)의 제조

헥산 20ml 중에 화합물(2) (1.0g, 2.1mmole), 디브로만틴(0.42g, 1.5mmole) 및 무수 중탄산나트륨(0.91g, 10mmole)을 혼합시킨 혼합물을 출발 물질인 에스테르 2가 더 이상 검출되지 않을때까지(C 용매계로 TLC함) 30분 동안 질소 분위기에서 환류하에 가열하였다. 침전물을 여과하여, 용액을 감압 하에서 건조시켰다. 잔류물을 무수 THF 5ml에 재용해하고, 브롬화테트라부틸암모늄(0.06g, 0.19mmole)을 첨가한 후, 이 혼합물을 질소 분위기 하 실온에서 30분동안 교반하였다. 이어서, 여기에 불화테트라부틸 암모늄 용액(THF 중 1M용액, 10ml)을 첨가한 후, s-콜리딘 0.7ml를 첨가하고, 이 혼합물을 질소 분위기하 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 또다시 불포화테트라부틸암모늄 용액 5ml를 첨가하고 계속하여 3시간 동안 교반하였다. 여기에 에트르(50ml)를 첨가하고, 유기상을 물, 차가운 1N HCl, 10％ NaHCO₃로 세척하여, 무수 MgSO₄상에서 건조시켰다. 이와 같이 하여 얻은 생성물을 벤젠에 용해시켜, 이를 실리카 겔 70-230메쉬(30g)상에서 크로마토그래피 하였다. 에스테르 3(0.44g, 58％)을 헥산 중의 아세트산에틸을 사용하여 용출시켰다. 이것을 A 용매계를 이용하여 HPLC하여 분석 시료(Rv 77ml)를 얻었다 ;

UV(헥산 중 3％의 2-프로판올) λmax=262nm(ε 7,000), λmax=272nm(ε 9,800), λmax=282nm(ε 10,500), λmax=293(ε 6,000) ;

(c) 바티민 에스테르(4)의 제조

1 : 4 비(v/v)의 벤젠-에틸에테르 350ml중에 디엔 3(830mg, 2.3mmole)을 용해시킨 용액을 Vycor필터와 질소기포기가 장치된 수냉(水冷) 석영 액침웰(immersion well)에 담아, 질소 분위기 하에서 교반하면서 Hanovia 608A36 매질-가압 UV 램프를 사용하여 조사하였다(4×10분). 반응은 헥산 중의 2％ 2-프로판올을 사용하여 HPLC하고 265nm에서 검색하였다. 이 용액을 감압하에서 건조시키고, 무수 에탄올 100ml에 재용해시켜, 질소 분위기하에서 3시간 동안 환류하에 가열하였다. 이어서, 이 용액을 농축하고, 헥산 중 10％ 아세트산에틸 1ml에 재용해시켜 실리카겔 70-230메쉬(30g)상에서 크로마토그래피하였다. 비타민 에스테르 4(298mg, 36％)를 헥산 중 15％ 아세트산에틸 혼합물로 용출하였다. 이것을 B 용매계로 HPLC하여 분석 시료(Rv 94ml)를 얻었다 ;

1R(필름)1738.95cm^-1; UV, λmax=264nm ;

(d) 3, 5-시클로비타민 에스테르(6)의 제조

에스테르 4를 피리딘 중의 염화 p-톨루엔술포닐을 사용하여 4℃에서 2시간 동안 공지의 방법으로 토실레이트 5로 전환 시켰다. 무수 디클로로메탄 2ml에 용해시킨 조 토실레이트 5(102mg, 0.2mmole)을 55℃에서 무수 중탄산칼륨(250mg)을 함유한 메탄올 용액(15ml)에 교반하에 첨가하였다. 이 혼합물을 질소 분위기하 55℃에서 24시간 동안 교반하였다. 감압하에서 용매를 제거하고, 그 잔분을 에테르로 추출하였다. 유기상을 물로 세척하고, 무수 MgSO₄로 건조시켰다. 생성된 시클로비타민 에스테르 6을 헥산중 20％ 아세트산에틸을 사용한 실리카겔 크로마토그래프로 처리하여 정제 하였다(50mg, 68％) ;

(e) 5, 6-시스 1α-히드록시비타민 에스테르(8) 및 트랜스 이성질체(9)의 제조

tert-부틸 히드로퍼록시드(112μl, 톨루엔 중 3.0M 용액, 0.34mmole)를 무수 염화메틸렌 2ml중 이산화셀레늄(9mg, 0.8mmole)을 현탁시킨 현탁액에 첨가하였다. 이 혼합물을 맑은 용액이 형성될때까지 질소하 실온에서 교반하였다. 이어서, 무수 피리딘(12μl, 0.15mmole)을 상기 교반액에 첨가한 후, 무수 디클로로메탄 2ml에 용해시킨 에스테르 6(50mg)을 첨가했다. 이 혼합물을 질소 하에서 30분 동안 교반하였다. 차가운 10％ 중탄산나트륨(2ml)를 첨가하고, 이 혼합물을 에테르로 추출하였다. 유기상을 10％ 중탄산나트륨 빙수로 세척하고, 무수 MgSO₄상에서 건조시켰다. 이어서 실리카겔 크로마토그래피(헥산 중 10-20％ 아세트산에틸)하여 1α-히드록시 화합물(7) 12.5mg을 얻었다. 이어서 이 생성물을 즉시 빙초산 0.5ml에 용해시키고, 이 용액을 질소하에서 15분 동안 교반하면서 55℃에서 가열하였다. 반응 혼합물을 얼음에 붓고, 에테르로 추출한 후, 빙냉시킨 중탄산나트륨 포화용액으로 세척하였다. 한데 모은 에테르 추출물을 물로 세척하고 무수 MgSO₄상에서 건조시켰다. 에스테르 8을 드루카(DeLuca)등의 미합중국 특허 제4,554,106호에 기재된 방법으로 단리시켰다(6mg, 5 로부터 총수율 20％로 얻음). (5Z, 7E) 및 (5E, 7E) 이성질체인 8 및 9의 각 분석 시료를 2.5 : 1의 비율로 회수용(preparative) HPLC에 의해 얻었다.

(f) 1α-히드록시 에스테르(10) 및 디실릴 에스테르(11)의 제조

메탄올중 KOH 0.1N 용액(10ml)을 에틸 에스테르(10ml)중의 아세테이트 에스테르 8(100mg, 0.24mmole)의 교반용액에 첨가하였다. 생성된 용액을 출발물질이 TLC(B용매계)로 더 이상 검출되지 않을때까지 90분 동안 실온에서 교반하였다. 디히드록시에스테르(10)을 표준 추출법(아세트산에틸, 포화 NaCl, 무수 MgSO₄사용)으로 단리시켰다.

DMF(2ml)중에 호합한 이미다졸(250mg, 3.6mmole)과 염화 tert-부틸디메틸실릴(250mg, 1.6mmole)의 혼합물을 DMF 4ml중의 에스테르(10)(86.2mg, 0.23mmole)의 교반용액에 첨가하였다. 생성된 균질 혼합물을 출발물질이 TLC(B용매계)로 더 이상 검출되지 않을때까지 15분 동안 55℃에서 교반하였다. 생성물을 헥산으로 단리한 후, 유기 추출물을 염수로 세척하고, 무수 MgSO₄로 건조시켰다. 조 생성물의 헥산 용액을 실리카겔 Sep-Pak 카트리지를 통해 여과해서 디실릴화에스테르(11)(136mg, 98％)를 얻었다 ;

[실시예 2]

C-22-알코올(12) 및 C-22-토실 유도체(13)의 합성

(제2도의 방법)

(a) C-22-알코올(12)의 제조

수소화알루미늄리튬(25mg, 0.65mmole)을 아르곤 분위기하 0℃에서 무수 THF(5ml)중의 실릴 에스테르(11)(136.2mg, 0.23mmole)의 교반용액중에 첨가하였다. 현탁액을 15분 동안 0℃에서 교반한 후, THF중의 10％ H₂O를 적가하여 과량의 LiAlH₄)를 분해시켰다. 현탁액을 THF 10ml로 희석하고, 계속하여 실온에서 15분 더 교반시켰다. 생성물을 아세트산에틸을 사용하여 표준 추출법으로 단리하고, 헥산 중의 10％ 아세트산에틸에서 실리카겔 Sep-Pak로 여과하였다. 디실릴 알코올 12을 무색 오일(118.4mg)로서 91％ 수율로 얻었다.

(b) 22-알코올-토실레이트(13)의 제조

무수 피리딘(50μl)중에 용해시킨 염화 p-톨루엔술포닐(42.7mg, 0.22mmole)의 빙냉 용액을 알코올 12의 교반용액에 질소하 0℃에서 첨가했다. 출발물질이 C용매계로 TLC하여 더 이상 검색되지 않을때까지 상기 혼합물을 22시간 동안 5℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 NaHCO₃빙냉 포화 수용액에 붓고, 계속하여 30분 더 교반하였다. 생성물을 에틸 에테르-헥산 1 : 1(v/v)로 추출하였다. 유기상을 포화 NaCl로 세척하고, MgSO₄상에서 건조시켰다. 용매를 감압하에서 제거하고, 피리딘을 질소 기류중에서 제거하였다. 조 생성물은 실리카겔 Sep-Pak 여과(헥산중의 5％ 아세트산에틸)하여 정제하여, 순수한 토실레이트 13(54mg, 98％)을 얻었다.

[실시예 3]

페닐술폰 측쇄 단위의 합성(제3도의 방법)

(a) 페닐술폰 측쇄 잔기 18의 제조

무수 THF(25ml)에 용해시킨 염화 4-클로로발레릴 14(알드리히 : 3g, 19.2mmole)의 요액을 아르곤하에서 30분 동안 격렬히 교반하면서 -10℃의 무수 THF 25ml 중의 브롬화메틸마그네슘(에테르 중 3M용액 12.9ml) 용액에 적하였다. 이어서, 반응 혼합물을 2시간 내에 실온까지 가온한 후, 물로 급랭시키고, 묽은 염산으로 중화하였다. 혼합물을 에테르로 추출한 후, 모은 유기상을 물로 세척하고 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 제거한 후, 잔분을 진공에서 증류하여 무색 액체(2.1g, 70％)로서 클로로 알코올 15을 얻었다. 이어서 무수 디메틸포름아미드(5ml)중에 생성물 15(1.5g, 10mmole)을 첨가하고, 이것을 무수 디메틸포름아미드(25ml)중의 티오페놀(1.32g, 12mmole)과 포타슘 t-부톡시드(1.32g, 11.3mmole)의 교반용액에 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 실온에서 하룻밤 동안 교반한 후, 이 용액을 디클로로메탄과 물 층사이에서 분배시켰다. 유기층을 탄산나트륨 수용액 및 물로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 용매를 진공에서 증발시키고, 조 오일을 헥산-아세트산에틸을 사용하여 실리카겔 불꽃 크로마토그래피로 정제하였다. 황화물 16(2.2g, 98％)을 무색 액체로서 얻어서, 황화물 16(1.01g, 4.5mmole)을 무수 디클로메탄(40ml)에 용해시키고, 3-클로로과벤조산(2.5g, 11.6mmole, 알드리히 80-85％)을 교반하에 이따금씩 냉장시키면서 수 회로 나누어 상기 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 교반한 후, 10％ 중탄산나트륨으로 급랭시켰다. 유기 추출물을 한데 모아서 아황산나트륨 수용액과 염수로 세척하고, 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 진공에서 제거하고, 조 오일을 헥산-아스테산에틸 혼합물을 사용하는 실리카겔 불꽃 크로마토그래피에 의해 정제하여 무색 액체로서 술폰 17(1.1g, 97％)를 얻었다.

술폰 17(1.3g, 5.1mmole)과 이미다졸(1.5g, 22.7mmole)을 무수 디메틸포름아미드(50ml)중에서 교반한 용액중에 염화트리에틸실릴(1.15g, 7.7mmole)을 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 방치한 후, 디클로로메탄으로 희석시켰다. 이 혼합물을 염화암모늄 수용액과 물로 세척하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 용매를 진공에서 제거하였다. 잔분을 실리카겔 불꽃 크로마토그래피하여 정제하였다. 먼저, 헥산으로 헥사에틸디실록산을 용출시켰다. 헥산-아세트산에틸 9 : 1로 하기 특징을 갖는 무색 액체인 트리에틸실릴기를 보호시킨 술폰 18(1.8g, 97％)를 용출하였다.

제3도에 의한 실시예에서 설명된 바와 같이, 기타 다른 페닐술폰 다위를 상기의 일반적인 방법으로 제조하거나 또는 문헌에 기재된 것과 유사한 방법으로 제조할 수 있다. 예를들면 하기와 같다.

(b) 페닐술폰(19)의 제조

상기 실시예 3(a)에 기재된 방법으로 디클로로 화합물 14를 처리하되, 제1단계의 브롬화메틸마그네슘 대신 브롬화에틸마그네슘을 사용하여, 구조식 19(Z=Et₃Si)의 페닐술폰 동족체를 얻었다.

(c) 페닐술폰(23)의 제조

무수 테트라히드로푸란(10ml)중의 염화 6-브로모헥사노일(20, 3.8g, 2.8ml, 18mmole) 용액을 아르곤 분위기 하에서 15-20분 동안 격렬히 교반하면서 -10℃의 무수 테트라히드로푸란(15ml)중의 브롬화메틸마그네슘(에테르 중 3M 용액 14ml) 용액에 적가하였다. 이 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하면서, 0℃로 냉각시킨 후, 1 : 1의 묽은 염산으로 조심스럽게 분해시켰다. 이 혼합물을 에테르로 추출하고, 한데 모은 유기층을 물로 세척한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 증발시켜 무색 오일(3.6g, 94％)로서 브로모 알코올(21)을 얻었다.

브로모-알코올(3.4g, 16mmole)을 70℃의 무수 디메틸포름아미드중의 벤젠술핀산 나트륨염(3.3g, 20mmole)으로 4.5시간 동안 처리하였다. 이 혼합물을 얼음에 붓고, 디클로로메탄으로 추출하여, 1N HCl, 물, 10％ NaHCO₃용액으로 세척하고, 무수 MgSO₄로 건조시킨 후, 여과하고, 증발시켜 술폰(22)을 얻고, 이것을 실리카겔상에서 불꽃 크로마토그래피하여 정제하고 헥산중 40-50％ 아세트산에틸로 용출하여, 대응하는 술피네이트 에스테르(4.18g, 98％)를 약간 함유한 술폰을 얻었다. MS, m/z 270(M⁺), 255(M⁺-15), 77, 59.

무수 디메틸포름아미드(13ml)중에 용해시킨 술폰(22)(4g, 14mmole)과 이미다졸(3.8g, 55mmole)의 교반용액에 염화트리에틸실릴(4.6g, 5.1ml, 30mmole)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하여 빙수에 붓고, 에테르로 추출하여, 무수 MgSO₄로 건조시키고, 여과하여 증발시켰다. 잔분을 불꽃 크로마토그래피로 정제하였다. 헥사에틸디실록산이 헥산으로 먼저 용출되었고, 헥산중 3％ 아세트산에틸에 의해 술폰을 약간 함유한 보호된 술피네이트 에스테르가 용출되었으며, 헥산중 10％ 아세트산에틸에 의해 보호된 순수한 술폰(23)(3.4g, 60％)가 용출되었다.

(d) 페닐술폰(26)의 제조

입수가능한 시판용 3-페닐술포닐프로피온산(24)를 표준 에스테르화 조건하에서 산성 메탄올로 처리하여 대응하는 메틸 에스테를 얻고, 이것을 브롬화메틸마그네슘을 사용하여 그리나드(Grignard) 반응을 행하여 페닐술폰 유도체(25)를 얻었다. 이어서 실시예 3(a)의 조건을 사용하여 (25)와 염화트리에틸실릴을 반응시켜 히드록시기가 보호된 술폰(26)을 얻었다.

(e) 술폰 단위(28)의 제조

실시예 3(d)에 기재된 방법을 산(24)에 적용하되, 그리나드 반응단계에서 브롬화메틸마그네슘 대신에 브롬화에틸마그네슘을 사용하여 보호된 술폰 동족체(28)을 얻었다.

상기 실시예에서 설명된 바와 같이, 페닐술폰 단위가 바람직하게 제조되어, 이것을 히드록시기가 보호된 유도체로서 사용하였다. 트리에틸실릴 보호기 이외에, 다른 바람직한 히드록시 보호기로는 t-부틸디메틸실릴, 테트라히드로푸라닐 및 테트라히드로피라닐기가 있다.

[실시예 4]

측쇄 결합 반응(제4도의 방법)

(a) 비타민 술폰 29 및 30의 제조

무수 THF중의 1, 10-페날트롤린(지시약으로서 사용) 용액을 아르곤 하에서 헥산(48μl, 64μmole)중의 n-BuLi 1.35M 용액에 첨가하여 암적색의 혼합물을 얻었다. 이 용액을 아세톤-드라이아이스조에 놓고 디이소프로필아민(9μl, 64μmole)을 첨가했다. 생성된 용액을 아르곤 하 -77℃에서 30분 동안 교반하였다. 이어서 THF 100μl중의 술폰 18(29mg, 80μmole) 용액을 첨가하고, 세정단계에서 추가로 THF 100μl를 사용했다. 생성된 갈색 혼합물을 -75℃에서 아르곤 하에 30분 동안 교반하고, 냉각조를 CCl₄드라이아이스조로 대체했다. -21℃에서 15분동안 교반한 후, 토실레이트 13(11.6mg, 16μmole) 용액을 첨가하자 반응 혼합물의 색이 흑색에서 적색으로 변하였다. 용액을 -20℃ 내지 -10℃에서 3.5시간 동안 교반하고, 포화된 NH₄Cl 1ml를 -10℃에서 첨가했다. 이 혼합물을 헥산으로 추출하고, 유기상을 포화 NaCl로 세척하였다.

유기 추출물을 실리카겔 Sep-Pak 카트리지를 통해 여과하고 헥산중의 10％ 아세트산에틸 20ml로 용출하였다. 이것을 B 용매계를 이용하여 회수용 HPLC(컬럼 6.2m×25cm)에 의해 Rv 37ml에서 반응하지 않은 토실레이트 13(3.0mg)를 얻었다. 이어서 Rv 55ml에서 하기 특징을 갖는 술폰 29(2.1mg, 19％)가 용출되었다.

술폰 30(3.8mg, 35％)(화합물 29의 제23위치에 존재하는 탄소에서의 에피머)는 Rv 87ml에서 용출되었다 :

(b) 24-디호모-1, 25-디히드록시비타민 D₃(32)

메탄올(0.5ml)중 Na₂HPO₄의 포화 용액을 무수 THF 0.5ml중의 술폰 29(1.80mg) 교반 용액에 첨가하고, 이어서 무수 Na₂HPO₄분말(80mg)을 첨가했다. 이 혼합물을 아르곤 하에서 30분 동안 교반하고, 0℃로 냉각시켰다. 이어서 신선한 5％ 나트륨아말감(약 200mg)을 상기 냉각액에 첨가하고, 이 혼합물을 출발물질이 TLC(C 용매계 사용)로 검출되지 않을때까지 3시간 동안 5℃에서 교반하였다. 이 혼합물을 헥산(3ml)으로 희석시키고, 계속하여 15분 동안 교반하였다. 용매는 따라내고, 고체를 헥산(3×2ml)으로 세척하였다. 한데 모은 유기 용액에 얼음과 포화 NaCl(2ml)을 첨가하였다. 유기층을 포화 NaCl로 세척하고, 실리카 Sep-Pak 카트리지를 통해 여과하여 히드록시기가 보호된 24-디호모-1α, 25-디히드록시비타민 D₃화합물 31(1.19mg, 1.5μmole, 78％)을 무색 오일로서 얻었다. 또한, 화합물 31은 술폰 30을 나트륨아말감으로 환원시켜서 동일 방법으로 얻었다. 따라서, 상기 실시예 4(a)에서 얻은 술폰 29 및 30은 나트륨아말감으로 환원하기 전에 분리할 필요가 없다. 두 화합물의 혼합물을 효과적으로 환원시켜서 목적하는 비타민 D 유도체 31을 얻을 수 있다.

화합물 31(1.1mg)을 무수 THF 0.5ml에 용해시키고, 이 용액에 THF중의 불화테트라부틸암모늄용액(20μl, 1M 용액)을 첨가하였다. 이 혼합물을 아르곤 하 50℃에서 50분 동안 교반하였다. 에테르(3ml)를 상기 교반액에 첨가하고, 유기상을 포화 NaCl로 세척하였다. 용매를 제거하고, 잔분을 헥산 중의 10％ 2-프로판올에 용해시킨 후, 실리카 Sep-Pak을 통해 여과하였다. 이거을 회수용 HPLC(D 용매계, 컬럼 6.2mm×25cm, Rv 62ml)를 행하여 하기 특징을 갖는 목적하는 비타민 D 동족체 32(465㎍, 76％)를 얻었다.

(c) 페닐 술폰(23)을 사용한 측쇄 결합

비타민 토실레이트 13을 상기 실시예 4(a)에 기재한 조건하에서 페닐술폰 단위 23과 반응시켜, 대응하는 비타민 술폰 부가물을 얻었다. 이 부가물을 상기 실시예 4(b)의 일반적인 조건을 사용하여 Na/Hg을 이용하여 환원시킨 다음, 히드록시 보호기를 실시예 4(b)의 방법을 제거하여, 하기 구조를 갖는 목적 생성물인 24-트리호모-1, 25-디히드록시-비타민 D₃를 얻었다.

24-디호모-1, 25-디히드록시비타민 D₃(화합물 32)의 생물학적 활성

[실시예 5]

HL-60 세포에서 분화측정(표1)

HL-60 세포(사람의 백혈구)에서의 분화 측정은 드루카 등의 미합중국 특허 제4,717,721호에 기재된 일반적인 방법에 따라 행하였다. 상기 특허에 기재된 방법 이외에, 비특이적인 산에스테라제 활성은 미주리주 세이트 루이스 소재의 시그마 케미칼 코포레이션(Sigma Chemical Corporation)에서 시판하는 장치로 상기 방법에 의해 측정하였다. 표1에 나타낸 바와 같이, 분화도는 3종류의 상이한 분석법(NBT 환원, 식작용 및 에스테라제 활성)으로 측정하고, 그 결과는 여러 농도의 비타민 D 화합물 처리에 대한 반응으로 형성된 분화 세포의 백분율로서 표시하였다.

[표 1]

배양중의 HL-60 세포에서 24-디호모-1, 25-(OH)₂D₃의 분화 활성

^a3-4회 측정한 평균치의 표준오차

이러한 3종류의 상이한 분석법에 의한 분석 결과를 상기 표1에 나타냈다. 신규한 동족체인 24-디호모-1, 25-(OH)₂D₃(화합물 32)는 배양 중의 HL-60 세포의 분화를 유발시키는 작용에 있어서 1, 25-(OH)₂D₃보다 활성이 강함이 입증된다(표 1 참조). 그러므로, 천연 호르몬인 1, 25-(OH)₂D₃는 1×10^-8몰 농도에서 50-60％의 세포를 분화시키는 반면, 신규한 24-디호모 동족체(화합물 32)는 이보다 5배나 낮은 저농도(5×10^-9M)에서 60％ 이상 분화시킨다. 이와 유사하게, 약 80％의 분화 세포를 얻으려면 1, 25-(OH)₂D₃를 1×10^-7몰 농도로 필요하나, 디호모 동족체는 5×10^-8M(예, 5배 정도 낮은 농도)에서 90％ 이상의 분화도를 얻는다. 이러한 결과로부터 24-디호모-1, 25-(OH)₂D₃가 배양 중의 HL-60 세포의 분화를 유발시키는데 있어서, 1, 25-(OH)₂D₃보다 5-10배 강력하다는 결론을 내릴 수 있다.

[실시예 6]

쥐에서의 칼세믹 작용에 대한 분석

(a) 장의 칼슘 전달 작용 및 구루병이 있는 쥐 뼈에서의 광화 작용(표2)

젖을 땐 수컷쥐는 위스콘신주 메디슨 소재의 할랜-스프라그 다울리 캄파니(Harlan-Sprague Dawley Company)로부터 얻고, 수다(Suda)등의 J.Nutr.100, 1049-1052, 1970에 기재된 고칼슘 저인 구루병식을 공급했다. 이러한 먹이를 상기 피검 동물에게 총 4주동안 임의량으로 공급했다. 3주 마지막날, 동물을 한군에 각각 6마리씩으로 나누었다. 한 군에는 부형제(95％ 프로필렌 글리콜과 5％ 에탄올로 이루어진 0.1ml)를 복막내로 매일 주사하였다. 나머지군에는 각각 하기 물질의 투여량 중 하나의 양을 함유하는 부형제를 동량으로 주사 하였다. 즉 12.5ng의 1, 25-(OH)₂D₃, 25ng의 1, 25-(OH)₂D₃, 12.5ng의 24-디호모-1, 25-(OH)₂D₃, 또는 25ng의 24-디호모-1, 25-(OH)₂D₃, 동물에게 먹이를 최종적으로 투여한지 24시간 후에 동물을 치사시키고 장을 떼어낸 후, 십이지장절을 사용하여 헬로런(Halloran)과 드루카의 방법(Arch.Biochem.Biophys, 208, 477-486, 1981)에 따라 장의 칼슘 전달을 측정하였다. 칼슘 전달 활성은 I/O로 표시한 칼슘 전달비로서 표2에 나타냈다[I/O : 점막질중의 칼슘 농도(0)에 대한 장막질중의 칼슘 농도(I)]. 피검 화합물에 대한 반응으로 뼈의 광화작용을 분석하기 위해 모든 동물의 대퇴골을 떼어내어, Soxlet 추출기에서 95％ 에탄올로 24시간 동안, 그리고 Soxlet 추출기를 사용하여 클로로포름으로 24시간 동안 추출하였다. 이것을 함량(constant weight)으로 건조 시키고, 대퇴골을 약 315.6℃(600℉)에서 24시간 동안 태운 후에 회분 백분율 및 회분 총량을 측정하였다. 칼슘 전달비는 I/O[점막질 중의 칼슘 농도(0)에 대한 장막질의 칼슘 농도(I)]로 나타냈다. 회분 함량은 회분/대퇴골의 총 mg 또는 탈지한 대퇴골의 건조 중량에 대한 회분 백분율로 측정했다.

[표 2]

24-디호모-1, 25-디히드록시비타민 D₃에 대한 구루병쥐의 반응

^a6의 측정한 평균치의 표준 오차

(b) 장의 칼슘 전달 및 뼈의 칼슘 이동화 측정(표 3 및 표 4)

핼랜-스프라그 다울리 캄파니로부터 젖을 땐 수컷쥐를 구입하고, 수다 등의 발표한 저칼슘 비타민 D 결핍식(J.Nutr.100.1049-1052, 1970)을 4주 동안 공급했다. 3주의 마지막날에 동물에게 95％ 프로필렌 글리콜과 5％ 에탄올에 용해시킨 지시 투여량(표 3 및 표 4)을 투여하였다. 각 동물에게 일에 지시투여량을 함유한 용매 부형제 0.1ml씩 7일 동안 공급하고, 대조군에게는 용매만을 공급하였다. 장의 칼슘전달은 헬로란 및 드루카법(Arch.Biochem.Biophys.208, 477-486, 1981)으로 측정하고, 혈청 칼슘은 원자 흡수 분광기(미합중국 특허 제4,717,721호)를 사용하여 측정하였다.

[표 3]

저칼슘식을 공급한 쥐에서 24-디호모-1, 25-디히드록시비타민 D₃에 대한 반응

^a6의 측정한 평균치의 표준 오차

[표 4]

저칼슘식을 공급한 비타민 D 결핍 쥐의 혈청내 칼슘 24-디호모-1, 25-디히드록시비타민 D₃에 대한 반응

^a6의 측정한 평균치의 표준 오차

표 2 및 표 3에 나타낸 결과로부터 장의 칼슘 전달을 자극하는데 있어서 24-디호모-1, 25-(OH)₂D₃(화합물 32)가 1, 25-(OH)₂D₃보다 활성이 낮다는 것을 알 수 있다. 1, 25-(OH)₂D₃는 1일 12.5 내지 25ng에서 칼슘 전달 최대치를 얻을 수 있는 반면, 24-디호모-1, 25-(OH)₂D₃는 이 투여량에서는 전혀 활성을 나타내지는 않으며(표 2참조), 1일 125ng 투여량에서만 현저한 반응을 나타내었다(표 3). 그러나, 그 반응은 1, 25-(OH)₂D₃12.5ng/일에 의한 반응보다 더 낮았다. 이 결과는 장의 칼슘 전달을 자극하는데 있어서는 디호모 동족체가 1, 25-(OH)₂D₃의 활성보다 1/10 이하임을 나타낸다(표 2 및 표 3).

뼈의 광화작용의 경우(표 2), 상기와 유사하게 골격의 광화작용에 대한 24-디호모-1, 25-(OH)₂D₃의 효과가 결여됨이 관찰된다. 표 2의 대퇴골 회분 총량 및 대퇴골 회분의 백분율로부터 디호모 화합물(32) 12.5 및 25ng 투여량은 대조군과 비교해볼 때 현저한 변화가 없는 반면, 1, 25-(OH)₂D₃는 동일 투여량에서 현저한 광화반응을 나타냄을 알 수 있다.

뼈의 칼슘 이동(혈청내 칼슘 농도)을 측정했을 때는, 1, 25-(OH)₂D₃가 1일 12.5ng 및 25ng의 투여량에서 뼈로부터의 혈청내 칼슘이 현저히 증가하였다(표 3 및 표 4). 이와는 반대로, 24-디호모-1, 25-(OH)₂D₃는 한 실험(표 3)에서는 25ng/일의 투여량에서는 현저한 반응을 나타내지 않고 125ng/일의 투여량에서 전혀 반응을 나타내지 않으며, 2번째 실험(표4)에서는 125 및 250ng/일로 투여시에 혈청내 칼슘이 매우 적절히 증가한 것으로 나타났다. 마찬가지로, 125ng에서 250ng/일로 투여량을 증가시켜도 혈중 칼슘 농도를 더 이상 증가시키지 않음을 관찰할 수 있다(표 4). 이러한 결과는 24-디호모-1, 25-(OH)₂D₃가 뼈의 혈청 칼슘을 증가시키는 데에는 1, 25-(OH)₂D₃활성의 1/10 이하임을 나타낸다. 이 결과는 뼈의 칼슘 이동화를 측정하는 제3의 실험으로 확인되며, 이 실험에서 디호모 동족체는 최대 1000ng/일의 투여량으로 시험시 반응을 나타내지 않았다.

그러므로, 신규 비타민 D 동조체(화합물 32)는 칼슘 전달 및 이동화에 대한 작용이 거의 없는 반면, 세포 분화에 대해서는 의외로 바람직한 활성을 나타냄을 알 수 있다. 이것은 항암제로서 사용하려는 비타민 D 화합물에 대해 요구되는 바람직한 작용 양상이다. 신규한 디호모-1, 25-(OH)₂D₃동족체는 그 칼세믹 작용이 매우 낮기 때문에 (1, 25-(OH)₂D₃에 비하여), 이러한 디호모 동족체를 투여하여 환자에게서 바람직스럽지 못한 과칼세믹 반응을 유발시키지 않으면서도 악성종양 세포 증식을 억제하고 세포 분화를 증식시키는데 있어서 1, 25-(OH)₂D₃보다 강력하고 높은 작용을 나타낼 수 있다. 동일한 유형의 작용 양상(즉 칼세믹능이 매우 낮거나 또는 없으며, 분화 활성이 현저함)은 본 발명의 24-트리호모 동족체에서도 기대할 수 있으므로, 이 동족체도 매우 증강되고 유용한 분화/칼세믹 활성비를 나타낼 것이다. 선행 기술의 24-호모-비타민 D 동족체(미합중국 특허 제4,717,721호)가 본 발명의 화합물과 구조적을 관련있지만, 본 발명의 측쇄 호모비타민 D 화합물은 기능적으로 변형된 활성 양상, 즉 칼세믹능이 거의 없으며, 동시에 세포 분화에 있어서 고활성을 갖는다. 게다가, 분화 활성이 사람의 백혈구(HL-60 세포)의 경우에서 발현되므로, 이러한 신규 비타민 동족체를 인체의 악성 종양, 특히 백혈병의 치료에 사용할 수 있다.

치료용으로 사용하기 위해, 본 발명의 화합물은 무독성 용매에 용해된 용제, 또는 적절한 무독성 용매 또는 담체중의 유체, 현탁제 또는 분산제, 또는 당업계에 공지된 통상의 방법으로 제조한 환제, 정제 또는 캡슐제로 제제할 수 있다. 또한, 이러한 제제들은 예컨데 안정화제, 항산화제, 결합제, 착색제 또는 유화제 또는 풍미개선제 등과 같이 기타 다른 제약적으로 허용되는 무독성 부형제를 함유할 수 있다.

본 발명의 화합물은 주사하거나 또는 적절한 살균 용액을 정매내 주입하거나 또는 소화관을 통해 경구로 투여함이 바람직하다. 사람의 백혈병을 치료하기 위해서는, 백혈구가 대식세포로 분화되도록 유발시키기에 충분한 투여량으로 본 발명의 호모비타민 D 화합물을 투여하다. 바람직한 투여량은 1일 0.5㎍ 내지 50㎍이며, 이 투여량은 당업계에 공지된 바와 같이 환자의 질병의 심도, 반응 또는 증상에 따라 보다 높은 투여량으로 조절할 수 있다.

Claims

하기 일반식(II)의 비타민 D-22-토실레이트 유도체를 하기 일반식(III)의 알킬페닐술폰 유도체로 처리하여 하기 일반식(IV)의 측쇄 술폰 부가물을 얻고, 이 측쇄 술폰 부가물을 환원성 술폰 제거 반응에 의해 대응하는 비타민 D 화합물을 수득하고, 임의로 존재하는 히드록시 보호기를 제거하는 것으로 이루어진, 하기 일반식(I)의 비타민 D 화합물의 제조방법.

식중, X 및 Y는 서로 동일하거나 또는 상이한 것으로서 수소 및 히드록시 보호기로 이루어진 군 중에서 선택되고, R은 알킬, 플루오로 치환 알킬, 히드록시 치환 알킬, 히드록시 및 플루오로 치환 알킬, 히드록시기가 보호된 히드록시 치환 알킬, 히드록시기가 보호된 히드록시 및 플루오로 치환 알킬이고, Ts는 토실이다.
제1항에 있어서, X 및 Y가 히드록시기 보호기인 방법.
제2항에 있어서, R이 히드록시기가 보호된 4-메틸-4-히드록시 펜틸인 방법.
제2항에 있어서, R이 히드록시기가 보호된 5-메틸-5-히드록시 헥실인 방법.
하기 식의 화합물.

식중, X 및 Y는 서로 동일하거나 또는 상이한 것으로서, 수소 및 히드록시 보호기로 이루어진 군으로부터 선택되며, R은 알킬, 히드록시 치환 알킬, 플루오로 치환 알킬, 히드록시 및 플루오로 치환 알킬, 및 이들의 히드록시기가 보호된 기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제5항에 있어서, X 및 Y가 수소인 화합물.
제5항에 있어서, X 및 Y가 히드록시 보호기인 화합물.
제5항에 있어서, R이 4-메틸-4-히드록시펜틸인 화합물.
제5항에 있어서, R이 히드록시기가 보호된 4-메틸-4-히드록시펜틸인 화합물.
제5항에 있어서, R이 5-메틸-5-히드록시헥실인 화합물.
제5항에 있어서, R이 히드록시기가 보호된 5-메틸-5-히드록시헥실인 화합물.
하기 식의 화합물.

식중, X, Y 및 Z는 서로 동일하거나 또는 상이한 것으로서 수소 및 히드록시 보호기로 이루어진 군으로부터 선택되며, n은 3 또는 4이다.
제12항에 있어서, X, Y 및 Z가 히드록시 보호기인 화합물.
제12항에 있어서, X, Y 및 Z가 알킬실릴기인 화합물.
제12항에 있어서, X, Y 및 Z가 수소인 화합물.
24-디호모-1α, 25-디히드록시비타민 D₃.
24-트리호모-1α, 25-디히드록시비타민 D₃.
제약학적으로 허용되는 부형제와 함께 제12항의 화합물을 함유하는 제약 조성물.
제18항에 있어서, 상기 화합물이 24-디호모-1α, 25-디히드록시비타민 D₃인 제약 조성물.
제18항에 있어서, 상기 화합물이 24-트리호모-1α, 25-디히드록시비타민 D₃인 제약 조성물.
악성종양 세포를 세포 분화의 유발에 충분한 양의 제12항의 화합물 중 적어도 하나에 노출시킴을 특징으로 하여, 악성종양 세포의 분화를 유발 및 증진시키는 방법.
제21항에 있어서, 상기 화합물이 24-디호모-1α, 25-디히드록시비타민 D₃인 방법.
제21항에 있어서, 상기 화합물이 24-트리호모-1α, 25-디히드록시비타민 D₃인 방법.
종양성 질환 환자에게 제12항의 화합물 중 적어도 하나를 유효량으로 투여함을 특징으로 하는 종양성 질환의 치료 방법.
제24항에 있어서, 투여 화합물이 24-디호모-1α, 25-디히드록시비타민 D₃인 방법.
제24항에 있어서, 투여 화합물이 24-트리호모-1α, 25-디히드록시비타민 D₃인 방법.