NL8920392A - 1alfa-hydroxyvitamine d-homologen met onverzadigde zijketen. - Google Patents

Description

Ια-Hvdroxvvitamine D-homoloaen met onverzadigde ziiketen.

Deze uitvinding werd gedaan in de loop van onderzoek, dat werd gesteund door subsidies of beloningen van het Department of Health and Human Services. De Regering heeft zekere rechten op deze uitvinding.

De uitvinding heeft betrekking op nieuwe vitamine D-verbindingen, die met name aktief zijn bij het opwekken van de differentiatie van kwaadaardige cellen tot normale cellen. Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op aan de zijketen onverzadigde en aan de zijketen verlengde analogen van lot, 25-dihydroxyvitamine D3, (1,25- (OH)2D3), die selectieve werking vertonen als antineoplas-tische middelen vanwege verhoogde werking op differentiatie van kwaadaardige cellen en sterk verminderde werking op calciummetabolisme.

Achtergrond.

De werking van de D-vitaminen (vitaminen D3 of D2) op de regulering van calciummetabolisme en normale beender-groei en -ontwikkeling vereist, naar bekend, metabolisme van het moedervitamine tot bepaalde gehydroxyleerde vormen. Met name is vastgesteld, dat la,25-dihydroxyvitamine D3, (l,25-(OH)2D3), de dihydroxymetaboliet, die normaliter in dier of mens uit vitamine D3 wordt gevormd, de aktieve speciës is, die verantwoordelijk is voor de stimulering van calciumtransport in de darm en calciumresorptie uit been-(beendermobilisatie) en daardoor de algehele bloedcalcium-spiegel van het organisme reguleert. (Deze op calcium betrekking hebbende werkingen van vitamine D-metabolieten of -analogen, zullen in de volgende beschrijving gezamelijk worden aangehaald als de "calcemische aktiviteit" of "calcemische werking" van de verbindingen.) Sommige struk-tuuranalogen van l,25-(OH)2D3, zoals bijvoorbeeld la-hydro- xyvitamine D3, Ια-hydroxyvitamine D2, la,25-dihydroxyvitami-ne D2, of fluorderivaten van l,25-(OH)2D3, zijn ook als sterk aktieve calcemische middelen bekend en als resultaat zijn 1,25-(0H)2D3 en zijn aktieve analogen gebruikt of voorgesteld als geneesmiddelen bij de profilaxis of behandeling van verschillende calciummetabolisme- en beenderstoringen, zoals renale of osteodystrofie, vitamine D-resis-tente rachitis of osteoporose en verwante ziekten.

Meer onlangs is ontdekt, dat 1,25-(OH) 2D3, naast zijn boven besproken, welbekende "calcemische werking” ook andere biologische funkties vervult. Zo werd bijvoorbeeld gevonden, dat 1,25-(0H)2D3 en nauwverwante analogen, (la-OH-D3, 1,25—(OH) 2D2, met fluor gesubstitueerde analogen, enzovoort) celdifferentiatie kunnen opwekken [Abe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 4990 (1981); Honma et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 80* 201 (1983)]. Met name is gebleken, dat l,25-(OH)2D3 en zijn analogen de voortplanting remmen van kwaadaardige cellen, die in cultuur zijn gegroeid (bijvoorbeeld menselijke leukemiecellen) en een differentiatie tot normale cellen van het makrofaagtype opwekken. (Deze werkingstypen zullen in het vervolg gezame-lijk worden aangeduid als dé "differentiatiewerking" van vitamine D-verbindingen.) Vanwege hun opmerkelijke potentie als differentiatie opwekkende middelen, zijn deze vitaminen D-derivaten potentieel geschikt voor antikankermiddelen en hun gebruik voor de behandeling voor menselijke leukemie is inderdaad voorgesteld (Suda et ül., US-A-4.391.802). Zelfs hoewel deze verbindingen zeer effectief zijn bij de differentiatie van kwaadaardige cellen in cultuur, beperkt echter hun even sterke calcemische werking in vivo hun gebruik in de praktijk als antikankermiddelen of sluit dit geheel uit. Aldus zijn l,25-(OH)2D3 en zijn fluorderivaten uitermate potente celdifferentiatiemiddelen, maar zijn ook de potentste verbindingen ten aanzien van calcemische werking en bij de in vivo vereiste spiegels voor effectief gebruik als antikankermiddelen (bijvoorbeeld antileukemi-sche middelen) kunnen deze zelfde verbindingen vanwege hun inherente calcemische werking gevaarlijk verhoogde bloed-calciumspiegels produceren. Andere bekende vitamine D-derivaten vertonen een soortgelijke overeenkomst tussen differentiatiewerking en calcemische werking en hun praktisch gebruik als potentiële antikankermiddelen is dan ook onderhevig aan dezelfde beperkingen en hetzelfde gevaar.

Deze waarnemingen wezen duidelijk op een behoefte aan en hebben een onderzoek bevorderd naar verbindingen met grotere specificiteit en selectiviteit van werking als antikankermiddelen, dat wil zeggen verbindingen met een verbeterde differentiatie/calcemische werkingsverhouding en recent onderzoek heeft dan ook daadwerkelijk geleid tot de bereiding van verschillende vitamine D-analogen met verhoogde differentiatiewerking. Er werd bijvoorbeeld gevonden, dat sommige l,25-(OH)2D3 homologen, waarin de zijketen is uitgebreid met één koolstof (hetzij binnen de keten, hetzij aan het einde) een opmerkelijk grotere differentiatiewerking (ongeveer 10 maal) op leukemiecellen in cultuur vertonen dan l,25-(OH)2D3 zelf [DeLuca et al·/ US-A-4.717.721; Ostrem and DeLuca, Steroids 49, 73-102 (1988); Ostrem et al., J. Biol, Chem. 262, 14864 (1987)]. Deze homologen zijn echter nog altijd uitermate potente calcemische middelen, die calcemische werkingen vertonen, die ongeveer gelijk zijn aan die van 1,25-(OH) 2D3. Deze verbindingen worden dan ook gekenmerkt door een verbeterde differentiatie/calcemische werkingsverhouding, maar zij overwinnen niet het boven besproken probleem van de ongewenste potente calcemische werking. Er zijn andere met vitamine D verwante verbindingen bereid, waarvan wordt vermeld, dat zij preferentiële differentiatiewerking hebben [zie Ostrem et al·/ supra; Kubodera et al. Chem. Pharm. Buil. 34/ 2286-89 (1986); Ikekawa et al. Chem. Pharm. Buil 35. 4362 (1987)], maar deze zijn struktureel onderscheidenlijk en verschillend van de verbindingen van de onderhavige uitvinding.

Samenvatting van de uitvinding.

Er werden nu met vitamine D verwante verbindingen gevonden, die een gewenst en zeer voordelig aktiviteitspa-troon vertonen ten aanzien van hun differentiatierespons versus calcemische respons. Deze nieuwe vitamineanalogen vertonen zeer uitgesproken werking ten aanzien van de remming van de voortplanting van kwaadaardige cellen en het opwekken van hun differentiatie tot normale cellen van het monocyte-type (gelijk aan of groter dan die van 1,25-(OH)2D3, voor zover het een calcemische werking betreft. Aldus vertonen deze nieuwe verbindingen een ingrijpend verbeterde differentiatie/calcemische werkingsverhouding en vanwege deze eigenschap vertegenwoordigen de verbindingen middelen, die de voorkeur verdienen voor de behandeling van neoplastische ziekten. Omdat zij sterk aktief zijn bij het opwekken van differentiatie en veel minder aktief zijn als calcemische middelen, kan men deze verbindingen toedienen zonder overmatig verhoogde bloedcalciumspiegels op te wekken, waardoor een groot praktisch probleem, dat met sterke calcemische werking verbonden is, wordt overwonnen.

De nieuwe verbindingen worden struktureel gekenmerkt als aan de zijketen onverzadigde homologen van 1,25-(OH)2D , waarin de zijketen is verlengd door invoeging van twee of drie methyleeneenheden in de koolstofketen. Zij kunnen dan ook worden voorgesteld met bijgaande algemene struktuurformule I, waarin X, Y en Z, die hetzelfde of verschillend kunnen zijn, zijn gekozen uit de groep, bestaande uit waterstof en een hydroxylbeschermende groep en waarin n de waarde 3 of 4 heeft.

Bepaalde en voorkeursvoorbeelden van deze verbindingen zijn 24-dihomo-l,25-dihydroxy-22-dehydrovitamine D3, dat wil zeggen de boven genoemde verbinding, waarin X, Y en Z waterstof zijn en n gelijk is aan 3 en 24-trihomo-l,25-dihydroxy-22-dehydr©vitamine D3, dat wil zeggen de verbinding met de formule I, waarin X, Y en Z waterstof zijn en n 4 is.

Het blijkt, dat deze nieuwe verbindingen verwant zijn aan de aan de zijketen onverzadigde 24-homo-vitamine D-verbinding, getoond in US-A-4.717.72l. De nieuwe verbindingen hebben echter onderscheidenlijke strukturele en biologische eigenschappen. Struktureel is het onderscheidende aspect een onverzadigde zijketen, die gehomologiseerd is door invoeging van twee of drie methyleeneenheden en biologisch zijn de verbindingen sterk potente celdifferen-tiatiemiddelen, zonder, of met sterk verminderde, calce-mische werking.

Bereiding nieuwe verbindingen.

De synthese van voorbeelden van de nieuwe verbindingen van de uitvinding is schematisch weergegeven in processchema's 1, 2 en 3. Schema 1 toont de bereiding van het vereiste la-hydroxyvitamine D-22-aldehydetussenprodukt, dat, wanneer gekoppeld aan de passende alkylfenylsulfon zijketeneenheid, als getoond in processchema 2, de gewenste vitamine D-homologen oplevert (bijvoorbeeld respectievelijk verbindingen (25) en (26)). Schema 3 licht de bereiding toe van de alkylfenylsulfoneenheden, die voor zijketenkoppeling nodig zijn. Experimentele details voor de chemische procestrappen, afgebeeld in de schema's, worden gegeven in de specifieke voorbeelden die volgen. Aanduidingen van verbindingen met arabische cijfers (bijvoorbeeld verbinding 1, 2, 3, enzovoort) als gebruikt in deze voorbeelden verwijzen naar de aldus genummerde strukturen in de schema's.

Algemene werkwijzen.

3)0-Acetoxy-22,23,-bisnor-5-choleenzuur (1) werd betrokken van Steraloids (Wilton, NH). Alle andere chemicaliën waren van de beste kwaliteit uit in de handel verkrijgbare bronnen. Oplosmiddelen werden volgens standaardmethoden gezuiverd.

Dunnelaagchromatografie (TLC) werd uitgevoerd onder gebruik van voorbeklede aluminiumsilicagelplaten met UV-indicator van EM Science (Gibbstown, NJ). Gebruikte oplosmiddelsystemen: A: chloroform-ethanol 85-15 (v/v), B: hexaan-ethylacetaat 1:1 en C: hexaan-ethylacetaat 3:1.

Hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC) werd uitgevoerd onder gebruik van een Waters Associates vloeistof chromatograaf, uitgerust met een Model 6000A oplosmiddel lever ingssysteem, een Model 6UK üniversal injector en een Model 450 variabele golflengte detector. Men gebruikte Zorbax-Sil (Phenomenex) kolommen (6,2 mm x 25 cm en 10 mm x 25 cm). Oplosmiddelsystemen: A: 3% 2-propanol in hexaan, B: 2% 2-propanol in hexaan, C: 6% 2-propanol in hexaan, D: 10% 2-propanol in hexaan, E: 20% 2-propanol in hexaan. Voor de voorfiltratie van HPLC-monsters werden silicagel Sep-Pak (Waters Associates) patronen gebruikt.

Elektroneninslag massaspectra (MS) werden bij 70 eV geregistreerd met Kratos MS-50 TC Mass Spectrometer uitgerust met Kratos DS-55 Data System.

Ultraviolet (UV) absorptiespectra werden geregistreerd met een Hitachi Model 60-100 UV-Vis spectrofotome-ter.

Infrarood spectra werden geregistreerd op een Nicolet MX-1 FT-IR spectrometer onder gebruik van films van olieachtige stoffen of tetrachloorkoolstofoplossingen.

Protonmagnetische resonantiespectra (1H-NMR) werden genomen met Bruker 270, 400 of 500 MHz spectrometers in CDCl3-oplossingen, die tetramethylsilan (TMS) als interne standaard bevatten.

Voorbeeld 1

Synthese van beschermd C-22-aldehyde. (Verbinding 18, schema 1).

Dit aldehyde wordt bereid volgens de algemene werkwijze van Kutner et al. (Tet. Letters 28, 6129-32, 1987). Verbinding (1) (10 g) werd opgelost in 420 ml 5% KOH in methanol en de oplossing werd 15 minuten bij heersende temperatuur geroerd, totdat er geen uitgangsstof meer werd waargenomen met TLC (oplosmiddelsysteem A) . Bij deze oplossing werd druppelsgewijze onder roeren 10% zwavelzuur in methanol gevoegd en de resulterende suspensie werd verdund met 400 ml 1% zwavelzuur in methanol. Het mengsel werd 48 uur onder terugvloeiing verwarmd ter volledige verestering (TLC, oplosmiddelsysteem A). Verbinding (2) (de ester) werd met ethylacetaat geëxtraheerd. De organische fase werd gewassen met 5% NaHC03 en verzadigd NaCl en op magnesiumsulfaat gedroogd. Het produkt, verbinding (2_) , (9,0 g, 88%) werd zonder verdere zuivering voor de volgende trap gebruikt.

Bij een oplossing van verbinding (2) (4,4 g, 12 mmol) in 135 ml droog dimethylformamide (DMF) werd imida-zool (3,6 g, 52,8 mmol) gevoegd, gevolgd door tert-butyldi-methylsilylchloride (4,0 g, 26,4 mmol). De oplossing werd 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd totdat er een volumineus precipitaat was gevormd en daarna werd het roeren nog 15 minuten voortgezet. Het reactiemengsel werd met hexaan (400 ml) geëxtraheerd, met water en verzadigde NaCl-oplos-sing gewassen en op magnesiumsulfaat gedroogd. Afdamping van het oplosmiddel gaf TLC-zuiver (oplosmiddelsysteem B) produkt, verbinding (3) (5,3 g, 91%), die zonder verdere zuivering voor de volgende trap werd gebruikt. Een analytisch monster werd verkregen door flitschromatografie onder gebruik van 2% ethylacetaat in hexaan.

Een mengsel van verbinding (3) (1,0 g, 2,1 mmol), dibromantine (0,42 g, 1,5 mmol) en watervrij natriumbicarbonaat (0,91 g, 10 mmol) in 20 ml hexaan werd 30 minuten in een stikstofatmosfeer onder terugvloeiing verwarmt totdat er geen uitgangsverbinding (3J meer werd waargenomen (TLC, systeem C). Het precipitaat werd afgefiltreerd en de oplossing werd onder verlaagde druk opgedroogd. Het residu werd heropgelost in 5 ml watervrij THF, er werd tetrabutyl-ammoniumbromide (0,06 g, 0,19 mmol) toegevoegd en het mengsel werd 30 minuten onder stikstof bij kamertemperatuur geroerd. Daarna werd een oplossing van tetrabutylammonium-fluoride (10 ml, 1M in THF) toegevoegd, gevolgd door 0,7 ml s-collidine en het mengsel werd 1 uur bij kamertemperatuur onder stikstof geroerd. Er werd nog 5 ml tetrabutylammo-niumfluorideoplossing toegevoegd en het roeren werd nog 3 uur voortgezet. Er werd ether (50 ml) toegevoegd en de organische fase werd gewasssen met water, koud IN HC1 en 10% NaHC03 en op watervrij magnesiumsulfaat gedroogd. Het produkt, verbinding (4), opgelost in benzeen, werd gechro-matografeerd over silicagel 70-230 mesh (30 g). Verbinding (£), (0,44 g, 58%) werd geëlueerd onder gebruik van ethyl-acetaat in hexaan. Er werd een analytisch monster verkregen door HPLC (systeem A), Ry 77 ml): IR (film) 1737, 1604, 1495, 1082, 1030 cm’1; UV (3% 2-propanol in hexaan) λ πβχ 262 nm (e 7.000), 272 nm (e 9.800), 282 nm (e 10.500), \,aX 293 (e 6.000); 1H NMR (CDClj) δ 0,54 (3H, s, I8-CH3), 0,94 (3H, s, 19-CH3), 1,22 (3H, d, J=6 Hz, 2-CH3) , 3,6 (1H, m, 3-H), 3,68 (3H, S, C02CH3), 5,42 (1H, m, 6-H), 5,58 (1H, m, 7-H); MS m/z (relatieve intensiteit) 358 (61), 340 (12), 325 (100), 299 (68), 271 (7), 253 (17), 237 (26), 211 (27), 143 (72) , 119 (35) .

Een oplossing van verbinding (4) (830 mg, 2,3 mmol) in 350 ml benzeen-ether, 1:4 (v/v) werd onder roeren 40 minuten (4 maal 10 minuten) onder stikstof in een met water gekoelde kwartsdompelput, uitgerust met een stikstof-borrelaar en een Vycorfilter bestraald onder gebruik van een Hanovia 608A36 middeldruk UV-lamp. De reactie werd met HPLC gevolgd onder gebruik van 2% 2-propanol in hexaan bij 265 nm. De oplossing werd onder verlaagde druk opgedroogd, heropgelost in 100 ml absolute ethanol en 3 uur in een stikstofatmosfeer onder terugvloeiing verwarmd. Daarna werd de oplossing geconcentreerd, heropgelost in 1 ml 10% ethylacetaat in hexaan en gechromatografeerd over silicagel 70-230 mesh (30 g). Vitamineester (5) (298 mg, 36%) werd geëlueerd onder gebruik van een mengsel van 15% ethylacetaat in hexaan. Een analytisch monster werd verkregen door HPLC (systeem B, Ry 94 ml): IR (film) 1738 cm'1; UV (EtOH) ^ 264 nrn, 228 nm; 1H NMR (CDCI3) 5, 0,56 (3H, s, 18- CH3), 1,20 (3H, d, J=7 Hz, 21-CH3) , 3,66 (3H, s, C02CH3) , 3,95 (1H, m, 3-H), 4,80 (1H, d, J=l,2 Hz, 19Z-H), 5,05 (1H, d, J=l,2 Hz, 19E-H) , 6,03 (1H, d, J=ll Hz, 7-H), 6,23 (1H, d, J=ll Hz, 6-H) ; MS m/Z (relatieve intensiteit) , M+ 358 (45), 340 (9), 325 (45), 299 (22), 253 (19), 237 (18), 136 (60), 118 (100).

Een oplossing van verbinding (5) (10 mg, 0,028 mmol) in 5 ml droge tolueen werd in een droogijs-acetonbad onder stikstof tot -70eC gekoeld. Bij deze oplossing werd druppelsgewijze onder roeren diisobutylaluminiumhydride (DIBAL-H, 50 μΐ, 25% oplossing in tolueen, 0,088 mmol) gevoegd. Het reactiemengsel werd 10 minuten bij -70 °C geroerd en daarna werd langzaam methanol (2 ml) toegevoegd. Men liet het mengsel tot kamertemperatuur opwarmen, waarna het werd verdund met ethylether en gewassen met 5% HC1, 5% NaHC03, water en verzadigd NaCl en op watervrij magnesium-sulfaat werd gedroogd. Silicagelchromatografie (15% ethyl-acetaat in hexaan) leverde verbinding (6) (4,9 mg, 54%) op met de volgende spectraalgegevens: MS: 328 (M+, 29), 310 (5), 295 (31), 269 (11), 253 (6), 136 (47), 118 (86), 29 (100); 1H-NMR (CDC13) Sl 0,59 (3H, S, 18-CH3) , 1,14 (3H, d, J=7 Hz, 21-CH3), 4,0 (1H, m, 3-H) , 4,81 (1H, d, J=l,2 Hz, 19E-H) , 5,05 (1H, d, J=l,2 Hz, 19Z-H) , 6,05 (1H, d, J=ll Hz, 7-H) , 6,23 (1H, d, J=ll Hz, 6-H) , 9,58 (1H, d, J=3,8 Hz, 22-H).

Verdere eluering van de silicagelkolom met 5% 2-propanol in hexaan leverde de C-22-alcohol op, verbinding (7), (2,7 mg, 29%),

Verbinding (5j werd in verbinding (8) omgezet door gebruik van p-tolueensulfonylchloride in pyridine bij 4°C gedurende 20 uur. Verbinding (8j (120 mg, 0,2 mmol) werd, opgelost in 2 ml watervrij dichloormethaan, onder roeren bij 55°C toegevoegd aan een methanoloplossing (15 ml) van watervrij kaliumbicarbonaat (250 mg). Het mengsel werd 24 uur bij 55°C onder stikstof geroerd. Daarna werden de oplosmiddelen onder verlaagde druk verwijderd en werd het residu met ether geëxtraheerd. De organische fase werd met water gewassen en op watervrij magnesiumsulfaat gedroogd. Het produkt, verbinding (9j, werd door silicagelchromatografie gezuiverd onder gebruik van 20% ethylacetaat in hexaan (50 mg. 68%).

Tert-butylhydroperoxyde (112 μΐ, 3,0 M oplossing in tolueen, 0,34 mmol) werd toegevoegd aan een suspensie van seleendioxyde (9 mg, 0,8 mmol) in 2 ml droog methyleen-chloride. Het mengsel werd onder stikstof bij kamertemperatuur geroerd totdat er een heldere oplossing was gevormd. Daarna werd watervrije pyridine (12 μΐ, 0,15 mmol) toegevoegd, gevolgd door verbinding (9) (50 mg), opgelost in 2 ml watervrij dichloormethaan. Het mengsel werd 30 minuten onder stikstof geroerd. Er werd koude 10% natriumbicarbonaat (2 ml) toegevoegd en het mengsel werd met ether geëxtraheerd. De organische fase werd gewassen met koud 10% natriumbicarbonaat en ijswater en op watervrij magnesium-sulfaat gedroogd. Silicagelchromatografie (10-20% ethylace-taat in hexaan) leverde 12,5 mg verbinding (10) op. Het produkt werd daarna onmiddellijk in 0,5 ml ijsazijn opgelost en de oplossing werd 15 minuten onder stikstof onder roeren op 55°C verhit. Het reactiemengsel werd over ijs uitgegoten, met ether geëxtraheerd en met ijskoude verzadigde natriumbicarbonaat gewassen. De gecombineerde ether-extracten werden met water gewassen en op watervrij magne-siumsulfaat gedroogd. Er werden analytische monsters van respectievelijk isomeer (5Z, 7E) en (5E, 7E), (11) en (12) in een verhouding van 2,5:1 verkregen door preparatieve HPLC.

Verbinding 11: HPLC, Ry 68 ml; UV (EtOH) 264 nm, Aroïn 227 nm, A264 = 2,07; 1H NMR (CDC13) 5, 0,56 (3H, s, A227 18-CH3), 1,20 (3H, d, J=6,5 Hz, 21-CH3) , 2,04 (3H, s, 3/J- acetyl), 3,66 (3H, s, 22-C02CH3), 4,4 (1H, m, 1-H), 5,2 (1H, m, 3-H), 5,01 (1H, br s, 19E-H) , 5,34 (1H, br S, 19Z-H), 6,01 (1H, d, J=10 Hz, 7-H), 6,33 (1H, d, J=10 Hz, 6-H) ; MS m/z (relatieve intensiteit), 416 (M+, 4), 356 (100), 338 (21), 251 (13), 134 (95).

Verbinding 12: HPLC, Ry 78 ml; UV (EtOH) Xmax 267 nm, 227 nm, A267 « 3,51; 1H NMR (CDC13) 5, 0,56 (3H, s, A227 18-CH3), 1,20 (3H, d, J=6,5 Hz, 21-CH3) , 2,04 (3H, s, 3/8- OAc), 3,66 (3H, S, 22-C02CH3) , 4,5 (1H, m# 1-H) , 5,3 (1H, m, 3-H) , 4,99 (1H, br s, 19E-H) , 5,13 (1H, br s, 19Z-H) , 5,81 (1H, d, J=10 Hz, 7-H), 6,56 (1H, d, J=10 Hz, 6-H) .

Voor bereidingen op grote schaal kunnen isomeren (11) en (12) ook effectief en voordelig worden gescheiden volgens de maleïnezuuranhydrideprocedure, beschreven in US-A-4.554.106.

Diisobutylaluminiumhydride (15 μΐ, 1,5 M oplossing tolueen) werd bij -70°C onder stikstof onder roeren toegevoegd aan een oplossing van verbinding (y) (2 mg) in 0,5 ml watervrije tolueen. Het mengsel werd 10 minuten bij -70°C geroerd en er werd langzaam 0,2 ml methanol toegevoegd ter ontleding van het organometaalcomplex. Het mengsel werd tot kamertemperatuur opgewarmd en met ethyl-ether geëxtraheerd. De organische fase werd met water gewassen en op watervrij magnesiumsulfaat gedroogd. Prepa-ratieve HPLC onder gebruik van oplosmiddelsysteem E leverde verbinding (13) en verbinding (14j op. Verbinding (13) gaf de volgende spectraalgegevens: 344 (M+, 22), 326 (13), 311 (2), 285 (4), 269 (4), 152 (29), 134 (100); 1H-NMR (CDC13) , S, 0,59 (3H, S, 18-CH3) , 1,15 (3H, d, J=7 Hz, 21-CH3) , 4,2 (1H, m, 3-H), 4,4 (1H, m, 1-H), 4,99 (1H, d, J=l,2 Hz, 19Z-H), 5,31 (1H, d, J=l,2 Hz, 19E-H), 6,02 (1H, d, J=ll Hz, 7-H), 6,36 (1H, d, J=ll Hz, 6-H), 9,56 (1H, d, J=4 Hz, 22-H).

Een 0,1 N oplossing van KOH in methanol (10 ml) werd aan een geroerde oplossing van verbinding (11) (100 mg, 0,24 mmol) in ethylether (10 ml) toegevoegd. De resulterende oplossing werd 90 minuten bij kamertemperatuur geroerd totdat er met TLC (oplosmiddelsysteem B) geen uitgangsstof meer werd waargenomen. Verbinding (15) werd gewonnen door standaardextractie (ethylacetaat, verzadigde NaCl, watervrij magnesiumsulfaat) onder verkrijging van kleurloze olie (86,2 mg, 96%).

Een mengsel van imidazool (250 mg, 3,6 mmol) en tert-butyldimethylsilylchloride (250 mg, 1,6 mmol) in DMF (2 ml) werd toegevoegd aan een geroerde oplossing van verbinding (15) (86,2 mg, 0,23 mmol) in 4 ml dimethylform-

amide. Het resulterende homogene mengsel werd 15 minuten bij 55°C geroerd totdat er met TLC (oplosmiddelsysteem B) geen uitgangsstof meer werd waargenomen. Het produkt werd door hexaanextractie van het reactiemengsel gewonnen. Organisch extract werd met pekel gewassen en op watervrij magnesiumsulfaat gedroogd. Hexaanoplossing van het ruwe produkt werd gefiltreerd door silicagel Sep-Pak patroon onder verkrijging van verbinding (16) (136 mg, 98%). IR (film) 2974, 2930, 1736, 1447, 1286, 1258, 1150, 1085 cm'1; UV (hexaan), 264 nm, 227 nm, A264 - 1,91; 1H NMR

A227 (CDC13), S, 0,07 [12H, s, Si(CH3)2], 0,55 (3H, s, 18-CH3) , 0,86 [18H, S, C(CH3)3], 1,20 (3H, d, J-6,8 Hz, 21-CH3) , 3,65 (3H, s, 0-CH3), 4,18 (1H, m, 3-H) , 4,36 (1H, m, 1-H) , 4,84 (1H, d, J-1,2 HZ, 19Z-H), 5,16 (1H, d, J=l,2 Hz, 19E-H), 5,96 (1H, d, J=ll,2 Hz, 7-H), 6,19 (1H, d, J=ll,2 Hz, 6-H); MS m/z (intensiteiten genormaliseerd tot m/e 248) 602 (M+, 10), 470 (59), 413 (7), 338 (10), 248 (100).

Lithiumaluminiumhydride (25 mg, 0,65 mmol) werd bij 0°C onder argon toegevoegd aan een geroerde oplossing van verbinding (16) (136,2 mg, 0,23 mmol) in watervrij THF (5 ml). De suspensie werd 15 minuten bij 0°C geroerd en de overmaat lithiumaluminiumhydride werd door druppelsgewijze toevoeging van 10% water in THF ontleed. De suspensie werd met 10 ml THF verdund en het roeren werd nog 15 minuten bij kamertemperatuur voortgezet. Het produkt werd door standaardextractie met ethylacetaat gewonnen. Verbinding (17) werd als een kleurloze olie (118,4 mg) met 91% opbrengst verkregen. IR (film) 3450, 2952, 2886, 1447, 1258, 1105, 1085, 834 cm'1; UV (EtOH) 264 nm, λ mfn 227 nm, A264 = A227 l, 57; 1H NMR (CDC13) δ 0,00 (12H, s, Si-CH3) , 0,53 (3H, s, 18-CH3), 0,85 [18H, s, Si-C(CH3)3], 1,04 (3H, d, J=6,4 Hz, 21-CH3), 3,37 en 3,63 (1H, en 1H, elk m, 22-GHz), 4,17 (1H, m, 3-H), 4,35 (1H, m, 1-H), 4,84 (1H, br S, 19Z-H), 5,16 (1H, br S, 19E-H) , 6,00 (1H, d, J=12,2 Hz, 7-H), 6,21 (1H, d, J=12,2 Hz, 6-H); MS M/z (intensiteiten genormaliseerd tot m/Z 248), 574 (M+, 17), 442 (67), 383 (11), 308 (17), 248 (100).

Een oplossing van oxalylchloride (30 μΐ, 0,34 nanol) in 0,5 ml dichloormethaan werd druppelsgewijze onder stikstof bij -60°C toegevoegd aan een geroerde oplossing van DMSO (50 μΐ, 0,7 mmol) in 3 ml dichloormethaan. De resulterende oplossing werd 10 minuten bij -60°C geroerd en een oplossing van verbinding (17) (27 mg, 0,05 mmol) in 1 ml dichloormethaan werd langzaam toegevoegd. Het mengsel werd 30 minuten bij -60 °C geroerd. Daarna werd 0,2 ml triethylamine toegevoegd en werd de oplossing nog 5 minuten geroerd. Het produkt, verbinding (1§) werd met ethylether geëxtraheerd en het organische extract werd gewassen met verzadigde NaCl en op watervrij magnesiumsulfaat gedroogd. Silicagel Sep-Pak filtratie leverde TLC-zuiver produkt op (17 mg, 62%). IR (film) 2954, 2929, 2884, 2857, 1727, 1472, 1375, 1256, 1085, 909, 880, 835 cm*1; NMR (CHC13) δ 0,00 (12H, S, Si-CH3) , 0,60 (3H, S, 18-CH3) , 0,88 [18H, s, Si- C(CH3)3], 1,11 (3H, d, J=6,9 Hz, 21-CH3) , 4,23 (1H, m, 3-H) , 4,43 (1H, m, 1-H) , 4,93 (1H, br S, 19Z-H) , 5,19 (1H, br S, 19E-H) , 6,07 (1H, d, J=10,0 Hz, 7-H) , 6,26 (1H, d, J=10,0 Hz, 6-H) , 9,54 (1H, d, J=3 Hz, 22-H) ; UV (hexaan) λ max 264 nm, λmi-n 227 nm, A264 = 1,9; MS m/z (intensiteiten ten op-A227

Zichte m/z 248) 572 (M+, 13), 440 (53), 383 (11), 308 (14), 248 (100); exacte massa, berekend voor C34H60O3Si2 572,4081, gevonden 572,4117.

Een verbeterde opbrengst aan aldehyde (18J werd verkregen toen de oxydatietrap werd uitgevoerd onder de volgende omstandigheden: een oplossing van 15 μΐ (0,17 mmol) oxalylchloride in 0,75 ml watervrij dichloormethaan werd druppelsgewijze bij -60°C onder een argonatmosfeer toegevoegd aan een geroerde oplossing van 25 μΐ (0,36 mmol) dimethylsulfoxyde in 0,25 ml watervrij dichloormethaan. Nadat het mengsel 10 minuten bij -60 °C was geroerd werd langzaam een oplossing van 20,3 mg (0,035 mmol) alcohol (17) in 0,5 ml watervrij dichloormethaan toegevoegd en flitsgespoeld met nog 0,2 ml watervrij dichloormethaan. Het mengsel werd 30 minuten bij -60°C geroerd en er werd bij -60 °C 0,3 ml (2,15 mmol) triethylamine toegevoegd. Het mengsel werd 5 minuten geroerd en tot 0°C opgewarmd en met ether geëxtraheerd. De etherfase werd met pekel gewassen en gedroogd (MgS04). Silicagel Sep-Pak filtratie leverde (18) op als een kleurloze olie, die werd gezuiverd door HPLC (Zorbax-Sil 9,4 x 25 cm, 10% EtOAc in hexaan) onder verkrijging van het zuivere aldehyde (18) (19 mg, 96%). Er werd slechts een spoor alcohol gewonnen (0,12 mg).

Voorbeeld 2

Zijketen aanhechting: synthese van 24-dihomo- 1 et. 25 -dihvdr oxv-2 2 -dehvdr ovitamine P3 (Verbinding 25, schema 2).

fa) Bereiding van hydroxysulfon f19).

Bij een geroerde oplossing van 31 mg (84 μπιοί) 2-methyl-6-(fenylsulfonyl)-2-(triethylsilyloxy)-hexaan (verbinding 31, schema 3) in 300 μΐ watervrij tetrahydrofu-ran (dat 1,10 fenantroline als indicator bevatte) werd bij -78°C onder argonatmosfeer 13 μΐ (90 μιηοΐ) diisopropylamine gevoegd, gevolgd door 70 ml n-BuLi (1,30 molair in hexaan) (91 μπιοί). De oplossing werd 30 minuten bij -78°c onder argonatmosfeer geroerd en daarna werd 6 mg C-22-aldehyde (verbinding 18) (10 μιηοΐ) in 300 μΐ watervrij tetrahydrofu-ran toegevoegd en werd 1 uur bij -78°C geroerd. Het mengsel werd ontleed door toevoeging van 1 ml verzadigde NH4C1-oplossing, tot 0°C opgewarmd en met ethylacetaat geëxtraheerd. Het ethylacetaat werd met water en pekel gewassen, op watervrij MgS04 gedroogd, gefiltreerd en ingedampt. Preparatieve HPLC (Zorbax-Sil kolom 9,6 x 25 cm, oplosmid-delsysteem: 10% ethylacetaat in hexaan) gaf 0,6 mg niet gereageerd hebbende aldehyde en 6,6 mg hydroxysulfon (19) als een mengsel van epimeren (77% opbrengst).

fb) 24-Dihomo-ltt.25-dihvdroxv-22-dehvdro-vitamine D: f25).

Een verzadigde oplossing van Na2HP04 in methanol (1,0 ml) werd toegevoegd aan een geroerde oplossing van hydroxysulfon (19) (3,3 mg) in 1,0 ml watervrij tetrahydro-furan, gevolgd door poedervormig, watervrij Na2HP04 (160 mg). Het mengsel werd 30 minuten onder argon geroerd en tot 0°C gekoeld. Daarna werd vers 5% natriumamalgaam (circa 400 mg) toegevoegd en werd het mengsel 16 uur bij 5°C geroerd. Het mengsel werd met 5 ml hexaan verdund en het roeren werd 15 minuten voortgezet. De oplosmiddelen werden gedecanteerd en de vaste stof werd gewassen met hexaan (3 maal 5 ml) . Aan de gecombineerde organische oplossing werd ijs en verzadigde NaCl-oplossing toegevoegd. De organische laag werd afgescheiden en door een Sep-Pak patroon in hexaan geleid. HPLC-zuivering gaf 2,0 mg (71%) beschermd Δ22- 24-dihomo-l,25-(OH)2D3 (21), en een kleine hoeveelheid 22-hydroxyprodukt (22) (Zorbax-Sil 9,4 x 25 kolom, 10% EtOAC in hexaan). Beschermde triol (21) (2 mg) werd in 1,0 ml watervrij THF opgelost en aan deze oplossing werd tetrabu-tylammoniumfluoride in THF (50 μΐ) , (1M oplossing) toege voegd. Het mengsel werd 1 uur onder argon bij 50°C geroerd. Daarna werd ether (8 ml) toegevoegd en werd de organische fase gewassen met verzadigd NaCl. Oplosmiddelen werden verwijderd en het residu werd opgelost in 10% 2-propanol in hexaan en gefiltreerd door silica Sep-Pak. HPLC (20% 2-propanol in hexaan Zorbax-sil 9,4 x 25 cm) gaf 0,6 mg gewenst produkt, de dihomoverbinding (25) . UV (EtOH) Xmax 264 nrn, xmin 228 nrn, A264 = 1,87; TH NMR (CDClj) , 0,55 (3H, A228 S, 18-CH3) , 1,00 (3H, d, J=6,6 Hz., 21-CH3) , 1,23 (6H, s, 26,27-CH3) 4,23 (1H, m, 3-H) , 4,43 (1H, m, 1-H) , 5,00 (1H, brs, 19Z-H) , 5,32 (1H, brs, 19E-H) , 5,29 (2H, m, 22H en 23H), 6,01 (1H, d, J=ll,3 Hz, 7-H); MS m/z (relatieve intensiteit) 442 (M+, 15), 424 (23), 406 (33), 391 (7), 287 (11), 285 (10), 269 (27), 251 (23), 152 (33), 134 (100), 116 (6), 59 (20); exacte massa berekend voor C29H46Q3 442,3446, gevonden 442,3441.

Voorbeeld 3

Ziiketenaanhechtincr: synthese van 24-trihomo- 1a.2 5-dihvdroxy—22-dihvdrovitamine D; (Verbinding 26, schema 2) fa) Bereiding van hydroxysulfon (201

Bij een geroerde oplossing van 58 mg (151 jumol) 2-methyl-7 (fenylsulfonyl) -2- (triethylsilyloxy) -heptaan (verbinding 35, schema 3) in 500 μΐ watervrij tetrahydrofu-ran (dat 1,10-fenantroline als indicator bevatte) werd onder argonatmosfeer bij -78°C 23 μΐ (160 μιηοΐ) diisopro-pylamine gevoegd, gevolgd door 106 μΐ n-Buli (1,5 molair in hexaan) (160 μιηοΐ). De oplossing werd 30 minuten bij -78°C onder argonatmosfeer geroerd en daarna werd 7 mg C-22-aldehyde (verbinding 18) (12 μιηοΐ) in 300 μΐ watervrij tetrahydrofuran toegevoegd en 1 uur geroerd. Het mengsel werd bij deze temperatuur ontleed door toevoeging van 1 ml verzadigde NH4Cl-oplossing, tot 0°C opgewarmd en met ethyl-acetaat geëxtraheerd. Het ethylacetaat werd met water en pekel gewassen, op watervrij MgS04 gedroogd, gefiltreerd en ingedampt. Preparatieve HPLC (Zorbax-Sil 9,4 x 25 cm, oplosmiddelsysteem 10% ethylacetaat in hexaan) gaf 0,4 mg niet gereageerd hebbend aldehyde en 7,5 mg hydroxysulfon (20) als een mengsel van epimeren (78%).

fb) 24-Trihomo-l.25-dihvdroxy-22-dehvdrovitamine D3_I261

Een verzadigde oplossing van Na2HP04 in ethanol (1,0 ml) werd toegevoegd aan een geroerde oplossing van het hydroxysulfon (20) (7,5 mg) in 1,0 ml watervrij tetrahydrofuran, gevolgd door poedervormig watervrij Na2HP04 (160 mg). Het mengsel werd 30 minuten onder argon geroerd en tot 0°C gekoeld. Daarna werd vers natriumamalgaam 5% (circa 400 mg) toegevoegd en werd het mengsel 16 uur bij 5°C geroerd. Het mengsel werd met 5 ml hexaan verdund en het roeren werd 15 minuten voortgezet. Oplosmiddelen werden gedecanteerd en de vaste stof werd gewassen met hexaan (3x5 ml). De gecombineerde organische fase werd met pekel gewassen, gescheiden, gedroogd en ingedampt. Het residu werd door een Sep-Pak patroon in 10% ethylacetaat in hexaan geleid. HPLC-zuive-ring gaf 2,12 mg beschermd Δ 22-24-trihomo-l, 25-(OH) 2 D3 (23) en 1,33 mg 22-hydroxy produkt (24) (Zorbax-Sil 9,4 x 25 kolom, 10% ethylacetaat in hexaan). Verbinding £3 (2,1 mg) werd in 1,0 ml watervrij tetrahydrofuran opgelost en bij deze oplossing werd 50 μΐ tetrabutylammoniumfluoride in tetrahydrofuran (1M oplossing) toegevoegd. Het mengsel werd 1 uur bij 50°C onder argon geroerd. Daarna werd ether toegevoegd en werd de organische fase met pekel gewassen. De etherfase werd op watervrij MgS04 gedroogd, gefiltreerd en ingedampt. Het residu werd opgelost in 30% 2-propanol in hexaan en door een Sep-Pak geleid. HPLC-zuivering (20%, 2-propanol in hexaan, Zorbax-Sil 9,4 x 25 cm kolom) gaf het gewenste trihomoprodukt, verbinding 2£ (0,8 mg). UV (EtOH) Xraax 264 nm 228, A264 = 1,81; 1H NMR: (CDCl3) 0,56 (3H, s, A228 18-CH3) , 1,00 (3H, d, J=6,6 Hz, 21-CH3) , 1,23 (6H, S, 26,27-CH3), 4,23 (1H, m, 3-H), 4,43 (1H, m, 1-H), 5,00 (1H, brs, 19Z-H) , 5,32 (1H, brs, 19E-H) , 5,29 (2H, m, 22H en 23 H) , 6,01 (1H, d, J=ll,3 Hz, 7-H); MS m/z (relatieve intensi teit) 456 (M+) (11) 438 (50), 420 (30), 402 (8), 287 (10), 269 (23), 251 (23), 152 (35), 134 (100).

Voorbeeld 4

Synthese van sulfonziiketeneenheden (Schema 3) fa) Bereiding van sulfonziiketenrest (32)

Een oplossing van 4-chloorvalerylchloride 27 (Aldrich; 3g, 19,2 mmol) in watervrij THF (25 ml) werd druppelsgewijze onder hevig roeren in 30 minuten onder argon bij -10°C toegevoegd aan een oplossing van methylmag-nesiumbromide (12,9 ml 3M oplossing in ether) in 25 ml droog THF. Daarna liet men het reactiemengsel in 2 uur tot kamertemperatuur opwarmen, waarna het met water werd afgeschrikt en met verdund zoutzuur werd geneutraliseerd. Het mengsel werd met ether geëxtraheerd en de gecombineerde organische lagen werden met water gewassen en met natrium- sulfaat gedroogd. Na verwijdering van het oplosmiddel werd het residu in vacuo gedestilleerd onder verkrijging van chlooralcohol 28 als een kleurloze vloeistof (2,1 g, 70%). Chlooralcohol 28_ (1,5 g, 10 mmol) in watervrij dimethyl-formamide (5 ml) werd daarna toegevoegd aan een geroerde oplossing van thiofenol (1,32 g, 12 mmol) en kalium t-butanolaat (1,32 g, 11,3 mmol) ih watervrij dimethylform-amide (25 ml). Het reactiemengsel werd een nacht bij kamertemperatuur geroerd en de oplossing werd verdeeld tussen dichloormethaan en water. De organische laag werd gewassen met waterig natriumcarbonaat en water en op watervrij magnesiumsulfaat gedroogd. Het oplosmiddel werd in vacuo afgedampt en de ruwe olie werd gezuiverd door silicagel flitschromatografie met hexaan-ethylacetaat. Sulfide 29 (2,2 g, 98%) werd als een kleurloze olie verkregen. Sulfide 29^ (1,01 g, 4,5 mmol) werd daarna opgelost in droog dichloormethaan (40 ml) en 3-chloorperbenzoëzuur (2,5 g, 11,6 mmol, Aldrich 80-85%) werd in porties onder roeren en van tijd tot tijd koelen toegevoegd. Het mengsel werd 2 uur geroerd en daarna met 10% natriumbicarbonaat afgeschrikt. De gecombineerde organische extracten werden met waterig natriumsulfiet en pekel gewassen en op magnesiumsulfaat gedroogd. Het oplosmiddel werd in vacuo verwijderd en de ruwe olie werd gezuiverd door silicagelflitschromato-grafie onder gebruik van hexaan-ethylacetaatmengsels onder verkrijging van sulfon _3£ (1,1 g, 97%) als een kleurloze olie. Bij een geroerde oplossing van sulfon (1,3 g, 5,1 mmol) en imidazool (1,5 g, 22,7 mmol) in droog dimethyl-formamide (50 ml) werd triethylsilylchloride (1,15 g, 7,7 mmol) gevoegd. Het reactiemengsel werd 2 uur op kamertemperatuur gehouden en daarna met dichloormethaan verdund. Het mengsel werd met waterige ammoniumchlorideoplossing en water gewassen. De organische lagen werden op natriumsul-faat gedroogd en het oplosmiddel werd in vacuo verwijderd. Het residu werd gezuiverd door silicagelflitschromatogra-fie. Eerst werd hexaethyldisiloxan geëlueerd met hexaan. Het met triethylsilyl beschermde sulfon 31 (1,8 g, 97%) werd geëlueerd met hexaan-ethylacetaat 9:1 als een kleurloze vloeistof: IR (netto): 3045, 2940, 1440, 1360, 1130, 1020 cm'1; 1H NMR (400 MHz, CDC13) δ 0,518 (6H, q, J=6,2 Hz, Si-CH2) , 0,899 (9H, t, J=6,2 HZ, Si-C-CH3) S 0,518 (6H, q, J=6,2 Hz, Si-CH2) , 0,899 (9H, t, J=6,2 Hz, Si-C-CH3) , 1,142 (6H, s, CH3), 1,307-1,462 (4H, m) , 1,655-1,738 (2H, m, H-4), 3,080-3,122 (2H, m, H-2) , 7,567 (2H, t, J=6,8 Hz, H-aryl meta) , 7,648 (1H, t, J-6,8 Hz, H-aryl para), 7,916 (2H, d, J=6,83 Hz, H-aryl ortho) ; MS (EI, 70 eV) : m/z (relatieve, intensiteit) 372 (M+, 2) , 341 (100) , 229 (2) , 227 (18), 173 (24), 103 (22), 75 (459, 55 (33).

(b) Bereiding van sulfonzinketeneenheid (35^

Een oplossing van 6-broomhexanoylchloride (32) (3,8 g, 2,8 ml, 18 mmol) in watervrij tetrahydrofuran (10 ml) werd druppelsgewijze onder hevig roeren in 15-20 minuten onder argonatmosfeer bij -10°C toegevoegd aan een oplossing van methylmagnesiumbromide (14 ml 3M oplossing in ether) in watervrij tetrahydrofuran (15 ml) . Het mengsel werd 2 uur bij kamertemperatuur geroerd, tot 0°C gekoeld en zorgvuldig ontleed met 1:1 verdund zoutzuur. Het mengsel werd met ether geëxtraheerd en de gecombineerde organische extracten werden met water gewassen, op watervrij magne-siumsulfaat gedroogd en ingedampt onder verkrijging van de broomalcohol (32) als een kleurloze olie (3,6 g) (94%).

De broomalcohol (3,4 g, 16 mmol) werd 4,5 uur bij 70°C behandeld met benzeensulfinezuurnatriumzout (3,3 g, 20 mmol) in watervrij dimethylformamide. Het mengsel werd op ijs uitgegoten, met dichloormethaan geëxtraheerd, gewassen met IN HCl, water en 10% NaHC03-oplossing, op watervrij MgS04 gedroogd, gefiltreerd en ingedampt onder verkrijging van het sulfon (34) dat werd gezuiverd door flitschromato-grafie over silicagel en werd geëlueerd met 40-50% ethyl-acetaat in hexaan onder verkrijging van het sulfon, dat iets van de overeenkomstige sulfinezuurester bevatte (4,18 g, 98%) MS, m/z 270 (M+) , 255 (M+-15) , 77, 59.

Bij een geroerde oplossing van het sulfon (34) (4 g, 14 mmol) en imidazool (3r8 g, 55 mmol) in watervrij dimethylformamide (13 ml) werd triethylsilylchloride (4,6 g, 5,1 ml, 30 mmol) gevoegd. Het reactiemengsel werd 2 uur bij kamertemperatuur geroerd, op ijswater uitgegoten, met ether geëxtraheerd, op watervrij MgS04 gedroogd, gefiltreerd en ingedampt. Het residu werd door flitschromatogra-fie gezuiverd. Eerst werd hexaethyldisiloxan met hexaan geëlueerd. 3% Ethylacetaat in hexaan elueerde de sulfine-zuurester met iets van het sulfon en 10% ethylacetaat in hexaan elueerde het beschermde, zuivere sulfon (35) (3,4 g, 60%). Analyse. Berekend voor CjgH^OjSSi C, 62,45%, H, 9,43%, S 38,34%. Gevonden C, 61,97%, H, 9,45%, S, 8,33% MS, m/z (relatieve intensiteit) 355 (100) (M+-29), 227 (15), 173 (35), 103 (43), 75 (95), 55 (23), NMR (400 MHz, CDC13) , 0,54 (6H, q, J=7 Hz, Si-CH2), 0,94 (9H, t, J=8 Hz, Si-C-CH3), 1,15 (6H, S, CH3), 1,31-1,36 (4H, m) , 3,08-3,12 (2H, m, H=2), 7,57 (2H, t, J=6,8 Hz, H-aryl-meta) , 7,66 (1H, t), H-aryl para), 7,92 (2H, d, J=6,8 Hz, H-aryl ortho).

Biologische werking.

Het nieuwe homoloog (25) werd zowel op differen-tiatiewerking als calcemische werking beproefd onder gebruik van in de techniek gevestigde proefmethoden. De proefmethoden en verkregen resultaten worden in meer detail beschreven in de volgende voorbeelden.

Voorbeeld 5

Meting van differentiatiewerking van dihomover-binding (25) in HL-60 cellen (Tabel 1).

Differentiatiegraad van HL-60 cellen (menselijke leukemiecellen) in respons op proefverbindingen werd vastgesteld met drie verschillende proeven: NTB-verminde-ring, fagocytose en esterasewerking. De eerste twee proeven werden uitgevoerd volgens de algemene werkwijze, gegeven door DeLuca et al. in US-A-4.717.721. De derde proef, het meten van niet specifieke esterasewerking als merker voor differentiatie, werd uitgevoerd volgens de methode, gegeven in Sigma Kit No. 90 verkrijgbaar bij Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO [zie ook Ostrem et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84/ 2610-2614 (1987); Ostrem et al., J. Biol. Chem. 262. 14164-13171 (1987)]. Resultaten worden getoond in onderstaande tabel 1. Gegevens worden vermeld als percentage gedifferentieerde cellen, verkregen na behandeling met verschillende concentraties l,25-(OH)2D3 (gebruikt als vergelijkingsstandaard) of vitamine D proefverbinding.

Tabel 1

Vergelijking van differentiatiewerking van 1,25-(OH)2D3 en dihomozijketenverbinding in HL-60 cellen in cultuur.

Voorbeeld 6

Calcemische werking van dihomoverbindincr f25) faV Werking op intestinaal calciumtransport (Tabel 2).

Mannelijke, pas gespeende ratten waren betrokken van de Harlan-Sprague Dawley Company of Madison, Wisconsin, en werden gevoederd met het rachitogene dieet (0,02% Ca, 0,3% P), beschreven door Suda et al. (J. Nutr. 100. 1049-1052, 1970). Zij werden in totaal ad libitum met dit dieet gevoederd. Aan het einde van de derde week werden de dieren verdeeld in groepen van elk zes ratten. Eén groep ontving 7 dagen lang interperitoneaal een dagelijkse injectie van drager (0,1 ml 95% propyleenglycol, 5% ethanol). De overige groepen ontvingen in dezelfde tijd dezelfde hoeveelheid drager, die echter één van de volgende doses bevatte: 12,5 ng of 25 ng of l,25-(OH)2D3 of 125 ng 24-dihomo-la,25-dihydroxy-22-dehydrovitamine D3 (verbinding 25) . 24 Uur na de laatste dosis werden de dieren afgemaakt, werden de darmen verwijderd en werden de duodenaalsegmenten gebruikt voor het meten van intestinaal calciumtransport als beschreven door Halloran en DeLuca (Arch. Biochem. Biophys. 208. 477-486, 1981). Resultaten worden gegeven in onder staande tabel 2.

Tabel 2

Werking op intestinaal calciumtransport van 1,25-(OH)2D3 en zijketen homoloog in ratten.

(b) Meting van calciumbeendermobilisatie (Tabel 3)

Mannelijke, pas gespeende ratten werden betrokken van de Harlan Sprague Dawley Company en vier weken gevoederd met het vitamine D-deficiënte dieet met laag calcium-gehalte (0,02% Ca, 0,3% P), beschreven door Suda et al. (J. Nutr. 100. 1049-1052, 1970). Aan het einde van de derde week werden de dieren verdeeld in groepen van elk zes dieren en ontvingen de aangegeven doses (zie tabel 3) opgelost in 0,1 ml 95% propyleenglycol en 5% ethanol. De controlegroep ontving slechts de oplosmiddeldrager. De andere groepen ontvingen 7 dagen lang elke dag de aangegeven dosis 1,25- (OH) 2D3 of dihomoverbinding (25). Aan het einde van de 7 dagen dosering werd seriumcalcium gemeten door atoomabsorptie. Resultaten van twee dergelijke experimenten worden gegeven in onderstaande tabel 3.

Tabel 3

Calciumbeendermobilisatiewerking (serumcalcium-spiegels) van l,25-(OH)2D3 en zijketenhomoloog in ratten.

De in tabel 1 gegeven resultaten wijzen er duidelijk op, dat dihomoanaloog _2J5 onderscheidenlijk potenter is dan l,25-(OH)2D3 bij het opwekken van de differentiatie van leukemiecellen tot normale monocytcellen. Zo produceert 1,25-(0H)2D3 bijvoorbeeld bij een concentratie 1 x 10*8 molair 55-61% gedifferentieerde cellen, terwijl verbinding (25) daarentegen bij dezelfde concentratie 78% differentiatie geeft. In aanmerking genomen, dat een concentratie van 1 x 10’7 molair van l,25-(OH)2D3 vereist is voor het verkrijgen van dezelfde differentiatiegraad (ongeveer 90%), als wordt geproduceerd door een concentratie van 5 x 10'8 molair van het dihomoanaloog (circa 92%), kan men de gevolgtrekking maken, dat analoog 25 als diffe-rentiatiemiddel in de orde van 5 x potenter is dan 1,25-(OH)2D3.

In scherp contrast vertoont de dihomoverbinding zeer geringe calcemische werking vergeleken bij 1,25-(OH)2D3. Deze gevolgtrekking wordt gesteund door de resultaten van tabellen 2 en 3. De proef op intestinaal calcium-transport, weergegeven door tabel 2, laat bijvoorbeeld zien, dat de bekende aktieve metaboliet, l,25-(OH)2D3, naar verwachting zeer uitgesproken respons (vergeleken bij de controle) uitlokt bij toediening in doses van 12,5 of 25 ng/dag gedurende 7 dagen. In het geval van de nieuwe dihomoverbinding (25) zijn echter doses van 125 ng/dag gedurende 7 dagen nodig voor het uitlokken van een respons en zelfs bij dergelijke hoge doseringen is de respons matig en wel slechts iets meer dan de helft als door l,25-(OH)2D3 wordt opgewekt bij een tienvoudig lagere dosis. Bij deze proef is het nieuwe dihomoanaloog dan ook tenminste 10 maal minder aktief dan 1,25-(OH)2D3.

Dezelfde gevolgtrekking kan worden gemaakt uit de resultaten van de beendercalciummobilisatieproef, getoond in tabel 3. Hier zijn doses van 125 en 250 ng/dag (toegediend gedurende 7 dagen) van het dihomoanaloog (25) nodig voor het verkrijgen van dezelfde mate van respons als wordt geproduceerd door respectievelijk 12,5 en 25 ng 1,25-(OH)2D3. Opmerkelijk is ook het feit, dat een verdere toeneming in de dosis van de dihomoverbinding (tot 500 ng/dag) de beendercalciummobilisatierespons niet verder opvoert, maar, ten hoogste onderdrukt (zie tabel 3). Bij een tweede experiment — ook getabelleerd in tabel 3 — waarbij l,25-(OH)2D3 weer een zeer betekenisvolle respons uitlokte (vergeleken bij controle) bij doses van 12,5 en 25 ng/dag, vertoonde het dihomoanaloog geen werking bij een dosis van 125 ng/dag. Bij een derde experiment, waarbij het dihomoanaloog (25) werd beproefd over een dosistraject tot 1000 ng/dag, lokte de verbinding bij geen enkel dosispeil calciummobilisatierespons uit, wat erop wees, dat de stof nagenoeg geen invloed heeft op het opvoeren van ceriumcal-cium ten koste van been. Deze beendermobilisatieproef is dan ook in volledige overeenstemming met de calciumtrans-portgegevens van tabel 2 en laat duidelijk zien, dat het nieuwe dihomoanaloog 25 in calcemische werking vele malen minder potent is dan l,25-(OH)2D3.

Hetzelfde aktiviteitspatroon wordt waargenomen voor de trihomoverbinding 26 van de uitvinding. Ook deze stof vertoont een zeer gunstige en ingrijpend verhoogde differentiatie/calcemische werkingsverhouding door uitgesproken aktiviteit te vertonen bij het opwekken van HL-60 celdifferentiatie zonder respons van betekenis uit te lokken (vergeleken bij de controle) op cerumcalciumspiegels bij ratten.

Dit type aktiviteitspatroon is natuurlijk juist wat gewenst is voor een verbinding, bedoeld voor gebruik als differentiatiemiddel bij de behandeling van neoplas-tische ziekten. De gewenste werking, de celdifferentiatie van kwaadaardige cellen, is sterk uitgesproken, terwijl de ongewenste werking, de calcemische werking, ingrijpend is verminderd, wat dus een zeer sterk opgevoerde differen-tiatie/calcemische werkingsverhouding geeft. Bekende la-hydroxyvitamine D-verbindingen zijn effectieve therapeutische middelen gebleken voor de behandeling van leukemi-sche ziekten (Suda et al., US-A-4.39l.802). Gebaseerd op de daarin gegeven bioproefgegevens, kan men de gevolgtrekking maken, dat de nieuwe zijketenhomoverbindingen van de uitvinding, bij toediening in hetzelfde dosispeil als de bekende verbindingen, geen of minder dan eentiende van de ongewenste calcemische werking van de bekende verbindingen zullen vertonen, waardoor het probleem van het opwekken van uitermate verhoogde bloedcalciumspiegels bij de behandelde patiënten grotendeels is verdwenen. Voorts kan men op basis van de in tabel l vermelde gegevens verwachten, dat de nieuwe homoverbindingen, een zeer sterke differentiatie-werking vertonen tegen kwaadaardige cellen, vooral leuke-miecellen, wat dus hun therapeutisch nut verder vergroot. Zodoende vertegenwoordigen de nieuwe verbindingen van de uitvinding een effectieve praktische toepassing van het concept van differentiatietherapie van kwaadaardige ziekten en hun aktiviteitspatronen doen duidelijk vermoeden, dat zij therapeutische middelen zijn, die bij dergelijke behandeling de voorkeur verdienen.

Ter behandeling kan men deze verbindingen verwerken als oplossingen in onschadelijke oplosmiddelen, of als emulsies, suspensies of dispersies in geschikte en onschadelijke oplosmiddelen of dragers, of als pillen, tabletten of capsules, volgens de in de techniek gebruikelijke methoden. Dergelijke samenstellingen kunnen ook andere farmaceutisch aanvaardbare en niet toxische excipiënten bevatten, zoals stabilisatoren, antioxydanten, bindmiddelen, kleurstoffen, of emulgatoren of smaakmodificatoren.

De verbindingen worden voordelig toegediend door injectie of door intraveneus infuus van geschikte steriele oplossingen, of in de vorm van orale doses via het spijsverteringskanaal. Ter behandeling van menselijke leukemie worden de homovitamine D-verbindingen van de uitvinding aan patiënten toegediend in doses, die voor het opwekken van de differentiatie van leukemische cellen tot macrofagen voldoende zijn. Geschikte doseerhoeveelheden zijn 0,5 μg tot 50 μg per dag, met dien verstande, dat de doses kunnen worden afgesteld (dat wil zeggen nog verder kunnen worden verhoogd) op de ernst van de ziekte of de respons of de toestand van de patiënt, zoals in de techniek welbekend is.

Claims (14)

1. Verbindingen met bijgaande struktuurformule I, waarin X, Y en Z, die hetzelfde of verschillend kunnen zijn, zijn gekozen uit de groep, bestaande uit waterstof en een hydroxylbeschermende groep en n 3 of 4 is.

2. Verbindingen volgens conclusie 1, waarin X, Y en Z elk waterstof zijn. 3. 24-Dihomo-la,25-dihydroxy-22-dehydrovitamine D3* 4. 24-Trihomo-la,25-dihydroxy-2 2-dehydrovitamine D3.

5. Verbindingen met de struktuurformule II, waarin X, Y en Z, die hetzelfde of verschillend kunnen zijn, zijn gekozen uit de groep, bestaande uit waterstof en een hydroxylbeschermende groep en n 3 of 4 is.

6. Farmaceutisch preparaat, dat tenminste één verbinding volgens conclusie 1 bevat naast farmaceutisch aanvaardbare excipiënten.

7. Farmaceutisch preparaat volgens conclusie 6, dat 24-dihomo-la,25-dihydroxy-22-dehydrovitamine D3 bevat.

8. Farmaceutisch preparaat volgens conclusie 6, dat 24-trihomo-la,25-dihydroxy-22-dehydrovitamine D3 bevat.

9. Farmaceutisch preparaat volgens conclusie 7, dat het vitaminehomoloog bevat in een hoeveelheid van ongeveer 0,5 vg tot ongeveer 50 pq*

10. Farmaceutisch preparaat volgens conclusie 8, dat het vitaminehomoloog bevat in een hoeveelheid van ongeveer 0,5 tot ongeveer 50 /xg.

11. Werkwijze voor het opwekken en opvoeren van celdifferentiatie in kwaadaardige cellen, waarbij men deze cellen blootstelt aan tenminste één la-hydroxyvitamine D-homoloog volgens conclusie 1.

12. Werkwijze volgens conclusie 11, waarbij het la-hydroxyvitamine D-homoloog 24-dihomo-la,25-dihydroxy-22-dehydrovitamine D3 is.

13. Werkwijze volgens conclusie 11, waarbij het la-hydroxyvitamine D-homoloog 24-trihomo-la,25-dihydroxy- 22-dehydrovitamine D3 is.

14. Werkwijze voor het behandelen van neoplas-tische ziekten, waarbij men aan een patiënt met een neo-plastische ziekten een effectieve dosis toedient van een Ια-hydroxyvitamine D-homoloog volgens conclusie 1.

15. Werkwijze volgens conclusie 14, waarbij het toegediende Ια-hydroxyvitamine D-homoloog 24-dihomo-la,25-dihydroxy-22-dehydrovitamine D3 is.

16. Werkwijze volgens conclusie 14, waarbij het toegediende Ια-hydroxyvitamine D-homoloog 24-trihomo-la,25-dihydroxy-22-dehydrovitamine D3 is.