HU206316B - Process for producing 1-alpha-hydroxy-d-vitamine homologues with unsaturated side-chain and pharmaceutical compositions containing them - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás új D-vitamin-származékok előállítására, amelyek specifikus hatása a rákos sejtek normális sejtekké történő differenciálódásának indukciójában nyilvánul meg. Közelebbről meghatározva, a találmány tárgya eljárás telítetlen és meghosszabbított oldalláncú la,25-dihidroxi-kolkalciferol-analógok előállítására, amelyek szelektív rákellenes hatása annak tulajdonítható, hogy fokozott aktivitást mutatnak a rákos sejtek differenciálódásának indukciója és serkentése tekintetében, viszont a kalcium metabolizmust illetően hatásuk nagymértékben csökkent.

A találmány révén elért műszaki eredmény az egészségügyi hatóságok (Department of Health and Humán Services) által támogatott kutatómunkán alapul, ezért bizonyos, a találmánnyal kapcsolatos jogok őket megilletik.

Ismereteink szerint ahhoz, hogy az ergokalciferol (D₂-vitamin) vagy a kolkalciferol (D₃-vitamin) hatásukat a kalcium métából izmusában és a normális csontképződésben, illetve -fejlődésben kifejtsék, szükséges, hogy az anyavegyületből annak metabolizmusa révén bizonyos hidroxilált fonnák keletkezzenek. Tulajdonképpen arról van szó, hogy - amint ez megállapítást nyert - a dihidroxilált metabolit, vagyis az la,25-dihidroxi-kolkalciferol, amely rendes körülmények között az állati vagy emberi szervezetben keletkezik, felelős a kalciumnak a bélből történő fokozott felszívódásáért, valamint a kalciumnak a csontokból történő felszabadulásáért (mobilizáció), és ezáltal az élő szervezetben szabályozza a vér kalciumszintjét.

A D-vitamin metabolitjainak és ezek analógjainak ezt a kalciumszint-szabályozó hatását a leírás további részében összefoglaló néven hiperkalcémiát okozó, vagy hiperkalcémiás hatásnak nevezzük.

Az 1,25-dihidroxi-kolkalciferol bizonyos szerkezeti analógjai, így például az Ια-hidroxí-kolkalciferol, az Ια-hidroxi-ergokalciferol, az 1,25-dihidroxi-ergokalciferol vagy az 1,25-dihidroxi-kolkalciferol fluoratommal szubsztituált származékai ugyancsak nagyon aktív hiperkalcémiás hatóanyagokként ismertek, és az 1,25dihidroxi-kolkalciferolt, valamint aktív analógjait már eddig is alkalmazták, illetve alkalmazását javasolták különböző, a kalcium metabolizmusával összefüggésbe hozható csontbetegségek, így a csontképződés vese eredetű zavarai, a D-vitaminra rezisztens angolkór, továbbá a csontritkulás megelőzésére vagy kezelésére.

Legújabban került nyilvánosságra az a felismerés, hogy az 1,25-dihidroxi-kolkalciferol a fent tárgyalt, jól ismert hiperkalcémiás hatásán kívül más biológiai hatásokat is mutat. Azt találták például, hogy az 1,25-dihidroxi-kolkalciferol, valamint a vele szoros rokonságot mutató származékok, így az la-hidroxi-kolkalciferol, az 1,25-dihidroxi-ergokalciferol, továbbá a fluoratommal szubsztituált analógok képesek kiváltani a sejtek differenciálódását [Abe és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 4990 (1981)]. Pontosabban meghatározva, az 1,25-dihidroxi-kolkalciferol és analógjai sejttenyészetben meggátolják a rákos sejtek, például az emberi leukémiasejtek burjánzását, és kiváltják azok normális makrofág típusú sejtekké történő diffe2 renciálódását. A leírás további részében erre a hatásra összefoglaló néven mint sejtdifferenciálódást indukáló hatásra hivatkozunk.

Tekintettel az említett D-vitamin-származékok figyelemre méltó sejtdifferenciálódást indukáló hatására, ezek a vegyületek rákellenes szerek hatóanyagaiként hasznosíthatók lehetnének, és valóban javasolták is alkalmazásukat az emberi leukémia kezelésére [Suda és munkatársai: 4 391 802 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás]. Mindazonáltal azt is figyelembe kell venni, hogy bár ezek az anyagok kétségtelenül hatásosnak bizonyultak sejttenyészetben a rákos sejtek differenciálódását illetően, in vivő körülmények között erős hiperkalcémiás hatást is mutatnak, ami eleve kizárja, hogy rákellenes gyógyszerként a gyakorlatban hasznosítsuk a vegyületeket. így például az 1,25dihidroxi-kolkalciferol vagy fluoratommal szubsztituált származékai rendkívül hatékony sejtdifferenciálódást indukáló hatóanyagok, ámde egyben a hiperkalcémiás aktivitás tekintetében is leghatékonyabbak, és ezért olyan dózisszinten, amely in vivő körülmények között megfelelő rákellenes effektust eredményez, a velejáró hiperkalcémiát okozó hatás miatt a vér kalciumszintje veszélyes mértékben megemelkedik. Más, ismert D-vitamin-származékok esetében a sejtdifferenciálódást indukáló és a hiperkalcémiás hatás hasonló összefüggést mutat, ezért ezek rákellenes szerként való alkalmazása, ugyanolyan korlátokba ütközik, illetve ugyanazokkal a veszélyekkel jár.

Ezek a megfigyelések világosan jelezték annak szükségességét - egyben ösztönözték is az erre irányuló kutatásokat -, hogy olyan rákellenes anyagokat találjunk, amelyek hatása specifikusabb és szelektívebb az eddigieknél, azaz amely vegyületeknél a sejtdifferenciálódást indukáló és hiperkalcémiás hatások viszonya kedvezőbben alakul. Az utóbbi évek kutatásainak eredményeképpen valóban előállítottak néhány D-vitamin-analógot, amelyek sejtdifferenciálódást indukáló hatása kiemelkedőnek bizonyult. Azt találták például, hogy az 1,25-dihidroxi-kolkalciferol bizonyos homológjai, amelyeknél az oldalláncot egy szénatommal meghosszabbították - ez a szénatom kerülhetett a láncon belülre vagy a lánc végére - sejttenyészetben vizsgálva, a leukémiasejtekkel szemben határozottan jobb, az 1,25-dihidroxi-kolkalciferolhoz viszonyítva mintegy tízszeres differenciálódást indukáló hatást mutattak [DeLuca és mások: 4 717 721 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Ostremés DeLuca: Steroids 49, 73-102 (1988); Ostrem és munkatársai: J. Bioi. Chem. 262, 14 864 (1987)]. Ezek a homológok azonban még mindig rendkívül hatékony hiperkalcémiás szereknek bizonyultak, hatáserősségük hozzávetőlegesen az 1,25-dihidroxi-kolkalciferoléval megegyező. Bár ezen vegyületek előnyére említhetjük a sejtdifferenciálódást indukáló és a hiperkalcémiás hatás erősségének kedvezőbb arányát, mindazonáltal a fent tárgyalt problémát, ami a nemkívánatos hiperkalcémiás hatékonyságból adódik, nem lehetett megoldottnak tekinteni.

Leírtak további D-vitaminszerű vegyületeket is,

HU 206 316 Β amelyeknél ugyancsak kiemelkedő sejtdifferenciálódást indukáló hatást találtak [lásd Ostrem és munkatársai fent idézett közleményét; Kubodera és munkatársai: Chem. Pharm. Bull. 34, 2286-89 (1986); Ikekawa és mások; Chem. Pharm. Bull. 35, 4362 (1987)], azonban ezek a vegyületek szerkezetileg különböznek a találmány tárgyát képező új vegyületektől.

Legújabban azt találtuk, hogy az (I) általános képletű, új, a D-vitaminokkal szerkezetileg rokon vegyületek - a képletben n értéke 3 vagy 4 - a sejtdifferenciálódást indukáló és hiperkalcémiás hatásukat tekintve megfelelnek az elvárásoknak, ezek erősségének aránya nagyon kedvező képet mutat. Az új vitaminanalógok kifejezetten gátolják a rosszindulatú sejtek burjánzását, és kiváltják azok differenciálódását normális monocita típusú sejtekké. Ez a hatásuk hasonló vagy erősebb, mint az 1,25-dihidroxi-kolkalciferolé, ugyanakkor hiperkalcémiás aktivitásukat tekintve messze elmaradnak attól. Ezeknél a vegyületeknél a sejtdifferenciálódást indukáló és a hiperkalcémiás hatás erősségének a viszonya hihetetlen mértékben megváltozik az előbbi javára, ennélfogva a rákos betegségek kezelésére előnyösen alkalmazható hatóanyagoknak tekinthetjük azokat. Az imént tárgyalt tulajdonságuk folytán, vagyis hogy nagyon aktív sejtdifferenciálódást indukáló hatásúak, és sokkal kevésbé aktívak a hiperkalcémiás hatást illetően, a vegyületek alkalmazása során nem alakul ki szélsőségesen magas kalciumszint a vérben, ezért azt mondhatjuk, hogy sikerült megoldanunk az ilyen típusú vegyületek nemkívánatos mellékhatásainak problémáját.

A fenti szempontok alapján különösen előnyösnek bizonyult az l,25-dihidroxi-22-dehidro-24-dihomokolkalciferol, amely egy olyan (I) általános képletű vegyület, ahol n értéke 3, továbbá az l,25-dihidroxi-22-dehidro-24-trihomokolkalciferol, amely egy olyan (I) általános képletű vegyület, n értéke pedig 4.

Látszólag a találmány szerinti új származékok rokonságot mutatnak a 4717 721 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban nyilvánosságra hozott, telítetlen oldalláncú 24-homo-D-vitaminnal, azonban mind szerkezetileg, mind biológiai sajátságaikat tekintve jól elkülöníthetők attól. A szerkezeti különbség nyilvánvaló, mivel a telítetlen oldalláncba beépített két, illetőleg három metilén-csoport révén az eredeti vegyület homológjaival állunk szemben, a biológiai sajátságokat tekintve pedig nagyon jelentős különbség, hogy ezek a vegyületek amellett, hogy erős sejtdifferenciálódást indukáló hatást mutatnak, hiperkalcémiás hatásuk elvész, vagy rendkívüli mértékben lecsökken.

A találmány szerinti új vegyületek szintézisét az 1.,

2. és 3. reakcióséma mutatja. Az 1. reakciósémán feltüntettük az la-hidroxi-D-vitamin-22-karbaldehid kulcsintermedier előállítását, amelyet a megfelelő alkil-fenil-szulfonnal kapcsolva - ezt láthatjuk a 2. reakciósémán - a kívánt D-vitamin-homológot, azaz a (25) vagy (26) képletű vegyületet kapjuk. A 3. reakcióséma az oldallánc kiépítéséhez szükséges alkil-fenil-szulfonok előállítását ábrázolja.

A reakciósémákon bemutatott eljárás kiviteli módját az alábbiakban példákkal szemléltetjük. A kísérletek leírása során a vegyületekkel kapcsolatban használt arab számok a reakciósémákon látható képletekre utalnak.

A 33-acetoxi-22,23-dinor-5-kolénsavat (7) a Steraloids (Wilton, NH) cég szállította. Minden más vegyszer az ismert forrásokból beszerezhető legjobb minőségű volt. Az oldószereket a szabványos eljárásokkal tisztítottuk.

A vékonyréteg-kromatogramokat előre gyártott, alumíniumlapokra felvitt, ultraibolya fényben fluoreszkáló szilikagél rétegen - az EM Science (Gibbstown, NJ) gyártmánya - fejlesztettük ki, amihez az alábbi térfogatarányú oldószerelegyek valamelyikét használtuk: A *= kloroform-etanol 85: 15; B = hexán-etil-acetát 1: 1; és C - hexán-etil-acetát 3 : 1. A nagynyomású folyadékkromatográfiához a Waters Associates Model 6000 A oldószerpumpával, Model 6 UK Universal injektorral és Model 450 változtatható hullámhosszú detektorral felszerelt készülékét használtuk. A Zorbax-Sil (Phenomenex) oszlopok mérete: 6,2 mm x 25 cm, illetve 10 mmx25 cm. Az alkalmazott oldószerelegyek összetétele a következő: A = 3% 2-propanolt tartalmazó hexán; B = 2% 2-propanolt tartalmazó hexán; C 6% 2-propanolt tartalmazó hexán; D -10% 2-propanolt tartalmazó hexán és E - 20% 2-propanolt tartalmazó hexán. A nagy nyomású folyadékkromatográfiához a minták előszűrését szilikagél Sep-Pak (Waters Associates) oszlopokon végeztük.

Az elektronbefogásos tömegspektrumokat 70 eV gyorsítófeszültség mellett, Kratos DS-55 adatfeldolgozóval felszerelt MS-50 tömegspektrométerrel készítettük.

Az ultraibolya spektrumokat Hitachi Model 60-100 UVrVis spektrofotométerrel vettük fel.

Az infravörös színképeket Nicolet MX-1 FT-IR spektrométerrel, filmtechnikát alkalmazva az olajok esetében, illetve szén-tetrakloridos oldatban vettük fel.

A magmágneses protonrezonancia-spektrumok (’HNMR) felvétele Bruker 270,400 vagy 500 MHz spektrométerrel, deuterokloroformos oldatban, tetrametilszilán belső standard alkalmazásával történt.

7. példa

A (18) képletű, védett C-22-karbaldehid előállítása

Az aldehidet Kutnerés munkatársai [Tetrahedron Letters 28,6129-32 (1987)] általános eljárását követve állítjuk elő. 10 g (7) képletű vegyületet feloldunk 420 ml 5%os metanolos kálium-hidroxid oldatban, és az oldatot szobahőmérsékleten keverjük 15 percig, amikor is a kiindulási vegyület rétegkromatográfiásan (A oldószerelegy) már nem mutatható ki az oldatban. 160 ml 10%-os metanolos kénsavoldatot adunk a reakcióelegyhez cseppenként, állandó keverés közben, majd a kapott szuszpenziót 400 ml 1%-os metanolos kénsavoldattal meghígítjuk. Ezután a reakcióelegyet az észterképződés teljessé tétele végett 48 óra hosszáig visszacsepegő hűtő alatt forraljuk. A reakció előrehaladását vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálattal, az A oldószerelegyet alkalmazva, követjük.

HU 206 316 Β

Az észtert etil-acetáttal extraháljuk, a szerves fázist mossuk 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát oldattal és telített nátrium-klorid oldattal, majd magnézium-szulfát felett szárítjuk. Az így kapott (2) képletű tennéket, amelynek tömege 9,0 g (88%), további tisztítás nélkül használjuk fel a következő reakciólépéshez.

4,4 g (12 mmól) (2) képletű vegyületet feloldunk 135 ml Ν,Ν-dimetil-formamidban, és előbb 3,6 g (52,8 mmól) imidazolt, majd 4,0 g (26,4 mmól) [(tercbutil)-dimetil-szilil]-klorídot adunk hozzá. Az oldatot szobahőmérsékleten keverjük, aminek következtében 5 perc múlva terjedelmes csapadék válik ki. További 15 percen át folytatjuk a keverést, majd a reakcióelegyet 400 ml hexánnal extraháljuk. Az extraktumot mossuk vízzel és telített nátrium-klorid oldattal, majd magnézium-szulfát felett szárítjuk és bepároljuk. Az így kapott termék vékonyréteg-kromatográfiásan (B oldószerelegy) tiszta (3) képletű vegyület, amelynek tömege 5,3 g (91%), és amelyet a következő reakciólépéshez további tisztítás nélkül használunk fel. Analitikai célokra egy kis mintát flash-kromatográfiás eljárással, eluensként 2% etil-acetátot tartalmazó hexánt alkalmazva tisztítunk.

1,0 g (2,1 mmól) (3) képletű vegyület, 0,42 g (1,5 mmól) dibromantin, 0,91 g (10 mmól) vízmentes nátrium-hidrogén-karbonát és 20 ml hexán elegyét nitrogéngáz atmoszférában, visszacsepegő hűtő alatt forraljuk 30 percen át, amikor is a C oldószereleggyel kifejlesztett vékonyréteg-kromatogramon a kiindulási vegyület már nem mutatható ki. A csapadékot szűrjük, és az oldatot vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot feloldjuk 5 ml vízmentes tetrahidrofuránban, hozzáadunk 0,06 g (0,19 mmól) tetrabutii-ammónium-bromidot, és az elegyet nitrogéngáz atmoszférában szobahőmérsékleten keverjük 30 percig. Ezután az elegyhez 10 ml 1 M tetrahidrofurános tetrabutil-ammónium-fluorid-oldatot és 0,7 ml szim-kollidint adunk, majd nitrogéngáz atmoszférában folytatjuk a keverést további 1 óra hosszat. Újabb 5 ml tetrabutil-ammónium-fluoridoldatot adunk az elegyhez, és még 3 órán át keverjük, majd 50 ml dietil-éterrel meghígítjuk. A szerves fázist vízzel, hideg 1 n sósavval és 10%-os nátrium-hidrogén-karbonát oldattal mossuk, majd magnézium-szulfát felett szárítjuk. A terméket benzolban feloldjuk, és 30 g 70-230 mesh szemcseméretű szilikagélen kromatográfiás eljárással tisztítjuk. Az oszlopot etil-acetát és hexán elegyével eluálva 0,44 g (58%) (4) képletű vegyületet kapunk, amelyből nagynyomású kromatográfiával (A oldószerrendszer, R_v - 77 ml) egy mintát analitikai célra tisztítunk. A vegyület infravörös színképének jellemző sávjai (film, cm^-1): 1737, 1604, 1495, 1082, 1030;

ultraibolya színkép (3% 3-propanolt tartalmazó hexánban); k_rra)i 262 nm (ε 7000), X,_nax 272 nm (ε 9800),

282 nm (ε 10 500), λ,_ηΜ 293 nm (ε 6000); 'HNMR-spektrum (CDClj, δ): 0,54 (3H, s, 18-CH₃),

0,94 (3H, s, 19-CH₃), 1,22 (3H, d, J = 6 Hz, 2CH₃), 3,6 (IH, m, 3-H), 3,68 (3H, s, CO₂CH₃), 5,42 (IH, m, 6-H), 5,58 (IH, m, 7-H); tömegspektrum m/z (relatív intenzitás): 358 (61), 340 (12), 325 (100), 299 (68) 271 (7), 253 (17), 237 (26),

211 (27), 143 (72), 119 (35).

830 mg (2,3 mmól) (4) képletű vegyületet feloldunk 350 ml benzol-dietil-éter 4: 1 térfogatarányú elegyben, és keverés közben, nitrogéngáz alatt, egy vízhűtéses, nitrogén buborékoltatóval és Vycor-szűrővel felszerelt csőben Hanovia 608A36 középnyomású UVlámpával 40 percig (négyszer 10 perc) besugározzuk az oldatot. A reakció előrehaladását nagynyomású folyadékkromatográfiával (2% 2-propanolt tartalmazó hexán, 265 nm) vizsgáljuk. Az oldatot azután vákuumban szárazra pároljuk, a maradékot feloldjuk 100 ml vízmentes etanolban, és nitrogéngáz atmoszférában, visszacsepegő hűtő alatt 3 óra hosszat forraljuk. Az oldatot ismét bepároljuk, újból feloldjuk a maradékot, ezúttal 1 ml 10% etil-acetátot tartalmazó hexánban, és 30 g 70-230 mesh szemcseméretű szilikagélen kromatografáljuk. Az oszlopot 15% etil-acetátot tartalmazó hexánnal eluálva 298 mg (36%) (5) képletű észtert kapunk. Analitikai célra egy mintát nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással (B oldószerrendszer, R_v = 94 ml) tisztítunk.

Az infravörös színkép jellemző sávja (film):

1738 cm'¹;

ultraibolya színkép (etanol); 264 nm, ?^,_in 228 nm; ‘H-NMR-spektrum (CDC1₃, δ): 0,56 (3H, s, 18-CH₃),

3,66 (3H, s, CO₂CH₃), 3,95 (IH, m, 3-H), 4,80 (IH, d, J= 1,2 Hz, 19Z-H)_r5,05 (lH,d,j = 1,2 Hz, 19EH), 6,03 (IH, d, J= 11 Hz, 7-H), 6,23 (IH, d, J = 11 Hz, 6-H);

tömegspektrum m/z (relatív intenzitás): M⁺ 358 (45),

340 (9), 325 (45), 299 (22), 253 (19), 237 (18), 136 (60), 118(100).

ml vízmentes toluolban feloldunk 10 mg (0,028 mmól) (5) képletű vegyületet, és nitrogéngáz alatt acetonos szárazjéggel -70 °C-ra hűtjük. Az oldathoz 50 μΐ (0,088 mmól) 25%-os toluolos diizobutil-alumínium-hidrid-oldatot adunk cseppenként, állandó keverés mellett, majd 10 percig -70 °Con keverjük az elegyet. Ezután lassú ütemben 2 ml metanolt adunk a reakcióelegyhez, hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni, meghígítjuk dietil-éterrel, majd mossuk 5%-os sósavval, 5%-os nátrium-hidrogénkarbonát oldattal, vízzel és telített nátrium-klorid oldattal, végül magnézium-szulfát felett szántjuk. Szilikagélen kromatografálva, amikor is az eluens 15% etil-acetátot tartalmazó hexán, 4,9 g (54%) (6) képletű vegyületet kapunk, amelynek spektrális adatai a következők:

tömegspektrum: 328 (M⁺, 29), 310 (5), 295 (31), 269 (11),253 (6), 136(47), 118 (86),29 (100): Ή-NMR-spektrum (CDC1₃, δ): 0,59 (3H, s, 18-CH₃),

1,14 (3H, d, J = 7 Hz, 21-CH₃), 4,0 (IH, m, 3-H),

4,81 (IH, d, J= 1,2 Hz, 19E-H), 5,05 (IH, d, J1,2 Hz, 19Z-H), 6,05 (IH, d, J = 11 Hz, 7-H), 6,23 (IH, d, J = 11 Hz, 6-H), 9,58 (IH, d, J = 3,8Hz,

22-H).

A szilikagél oszlop eluálását 5% 2-propanolt tartalmazó hexánnal folytatva 2,7 mg (29%) (7) képletű C22 alkoholt kapunk. .

HU 206 316 Β

Az (5) képletű vegyületet úgy alakítjuk át (8) képletű vegyületté, hogy piridinben, 4 °C-on, 20 órán át p-toluol-szulfonil-kloriddal reagáltatjuk.

102 mg (0,2 mmól) (8) képletű vegyületet feloldunk 2 ml vízmentes metilén-dikloridban, és keverés közben, 55 °C-on 250 mg vízmentes kálium-hidrogén-karbonát 15 ml metanollal készült oldatához adjuk. Az elegyet nitrogéngáz alatt 24 óra hosszat keverjük 55 °C-on, majd az oldószert vákuumben elpárologtatjuk, és a maradékot dietil-éterrel extraháljuk. A szerves fázist vízzel mossuk, és vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk. A terméket ezután kromatográfiás eljárással, szilikagélen, 20% etil-acetátot tartalmazó hexánnal eluálva tisztítjuk, aminek eredményeképpen 50 mg (68%) (9) képletű vegyületet kapunk.

mg (0,8 mmól) szelén-dioxid 2 ml vízmentes metilén-dikloriddal készült szuszpenziójához 112 μΐ (0,34 mmól) 3,0 M toluolos (terc-butil)-hidroperoxid oldatot adunk. Az elegyet nitrogéngáz alatt szobahőmérsékleten addig keverjük, amíg egy éles oldatot kapunk. Ezután hozzáadunk előbb 12 μΐ vízmentes piridint, majd 50 mg (9) képletű vegyületet 2 ml vízmentes. metilén-dikloridban oldva. A reakcióelegyet nitrogéngáz alatt 30 percig keverjük, majd 2 ml hideg, 10%os nátrium-hidrogén-karbonát oldatot adunk hozzá, és dietil-éterrel extraháljuk. A szerves fázist mossuk hideg, 10%-os nátrium-hidrogén-karbonát oldattal és jeges vízzel, majd vízmentes magnézium-szulfát felett szárítjuk. Szilikagélen kromatografálva, amikor is az eluens 10-20% etil-acetátot tartalmazó hexán, 12,5 mg (10) képletű vegyületet kapunk.

A terméket azonnal feloldjuk 0,5 ml tömény, vízmentes ecetsavban, és az oldatot nitrogéngáz alatt 55 °C-ra melegítjük, 15 percig ezen a hőmérsékleten tartjuk, majd jégre öntjük, és dietil-éterrel extraháljuk. Az extraktumot mossuk jéghideg, telített nátrium-hidrogén-karbonát oldattal és vízzel, majd vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk. Analitikai vizsgálatok céljára preparatív nagynyomású folyadékkromatográfiával választottuk el az (5Z, 7E)- és (5E, 7E)-izomereket, vagyis a (11) és (12) képletű vegyületeket, amelyek aránya 2,5: 1.

A (11) képletű vegyület (R_v - 68 ml) spektrális adatai: ultraibolya színkép (etanol): 264 nm, Amin 227 nm,

A264/A227 - 2,07;

‘H-NMR-spektrum (CDC1₃, δ): 0,56 (3H, s, 18-CH₃),

1,20 (3H, d, J = 6,5 Hz, 21-CH₃), 2,04 (3H, s, 3βacetil), 3,66 (3H, s, 22-CO₂CH₃), 4,4 (IH, m, 1-H),

5,2 (IH, m, 3-H), 5,01 (IH, széles s, 19E-H), 5,34 (IH, széles s, 19Z-H), 6,01 (IH, d, J = 10 Hz, 7-H), 6,33 (IH, d,J- 10 Hz, 6-H);

tömegspektrum m/z (relatív intenzitás): 416 (M⁺, 4),

356 (100), 338 (21), 251 (13), 134 (95).

A(12) képletű vegyület (R_v “ 78 ml) spektrális adatai: ultraibolya színkép (etanol): Á,_nax 267 nm, A,_nin 227 nm,

A267/A227 = 3,51, ‘H-NMR spektrum (CDCl₃, δ): 0,56 (3H, s, 18-CH₃),

1,20 (3H, d, J = 6,5 Hz, 21-CH₃), 2,04 (3H, s, 3βacetoxi), 3,66 (3H, s, 22-CO₂CH₃), 4,5 (IH, m, 1H), 5,3 (IH, m, 3-H), 4,99 (IH széles s, 19E-H),

5,13 (IH, széles s, 19Z/-H), 5,81 (IH, d, J = 10 Hz,

7-H), 6,56 (IH, d, J = 10 Hz, 6-H).

Nagyobb méretben a (11) és (12) képletű izomerek elválasztására előnyösen alkalmazhatjuk a 4554 106 számú amerikai egyesült államokbeli leírásban közölt, úgynevezett maleinsavanhidrides eljárást is.

mg (77) képletű vegyületet feloldunk 0,5 ml vízmentes toluolban, nitrogéngáz alatt -70 °C-ra hűtjük az oldatot, és állandó keverés közben hozzáadunk 15 μΐ 1,5 M toluolos diizobutil-alumínium-hidrid oldatot. Az elegyet -70 °C-on keverjük 10 percig, majd a szerves fémkomplex megbontása végett lassú ütemben 0,2 ml metanolt adunk hozzá. Szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni a reakcióelegyet, extraháljuk dietil-éterrel, majd a szerves fázist mossuk vízzel, és vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk. A keletkezett (13) és (14) képletű vegyületeket preparatív nagynyomású folyadékkromatográfiával választjuk szét, amikor is az eluálást az E oldószereleggyel végezzük.

A (13) képletű vegyület spektrális adatai a következők:

tömegspektrum: 344 (M⁺, 22), 326 (13), 311 (2), 285 (4),269(4), 152(29), 134(100);

‘H-NMR-spektrum (CDC1₃, δ): 0,59 (3H, s, 18-CH₃),

1,15 (3H, d, J = 7 Hz, 21-CH₃), 4,2 (IH, m, 1-H),

4,99 (IH, d, J= 1,2 Hz, 19Zr-H), 5,31 (IH, d, J =

1.2 Hz, 19E-H), 6,02 (IH, d, J = 11 Hz, 7-H), 6,36 (IH, d, J = 11 Hz, 6-H), 9,56 (IH, d, J = 4 Hz, 22H).

100 mg (0,24 mmól) (77) képletű vegyületet feloldunk 10 ml dietil-éterben, és keverés közben hozzáadunk 10 ml 0,1 n metanolos kálium-hidroxid oldatot. Az elegyet 90 percen át szobahőmérsékleten keverjük, amikor is kiindulási vegyület a β oldószereleggyel kifejlesztett vékonyréteg-kromatogramon már nem észlelhető. Az így keletkezett (75) képletű vegyületet a szokásos módon, etil-acetátos extrakcióval, amelyet telített nátrium-klorid oldattal történő mosás, és vízmentes magnézium-szulfáton végzett szárítás követ, izoláljuk. A kapott színtelen olaj tömege 86,2 mg (96%).

86.2 mg (0,23 mmól) (75) képletű vegyületet feloldunk 4 ml Ν,Ν-dimetil-formamidban, és keverés közben 250 mg (3,6 mmól) imidazol, 250 mg (1,6 mmól) [(terc-butil)-dimetil-szilil]-klorid, valamint 2 ml N,Ndimetil-formamid elegyét adjuk hozzá. A kapott homogén oldatot 15 percig 55 °C-on keverjük, amikor is a β oldószereleggyel kifejlesztett vékonyréteg-kromatogramon kiindulási vegyület már nem észlelhető. A terméket a reakcióelegyből hexános extrakcióval vonjuk ki. Az extraktumot sóoldattal mossuk, és vízmentes magnézium-szulfát felett szárítjuk, majd a nyerstermék hexános oldatát átengedjük egy Sep-Pak szilikagél oszlopon. Az így kapott (76) képletű vegyület tömege 136 mg (98%).

Infravörös színképe (film): 2974, 2930, 1736, 1447,

1286,1258,1150,1085 cm-'; ultraibolya színkép (hexán): 264 nm, ?^_;η 227 nm,

A264/A227 = 1,91;

HU 206 316 Β

Ή-NMR-spektrum (CDC1₃, δ): 0,07 [12H, s, Si(CH₃)₂], 0,55 (3H, s, 18-CHJ, 0,86 [18H, s, C(CH₃)₃], 1,20 (3H, d, J = 6,8 Hz, 21-CH₃), 3,65 (3H, s, O-CH₃), 4,18 (IH, m, 3-H), 4,36 (IH, m, IH), 4,84 (IH, d, J = 1,2 Hz, 19Z-H), 5,16 (IH, d, J = 1,2 Hz, 19E-H), 5,96 (IH, d, J - 11,2 Hz, 7-H),

6.19 (IH,d, J- 11,2 Hz, 6-H); tömegspektrum m/z (relatív intenzitás): 602 (M⁺, 10),

470 (59), 413 (7), 338 (10), 248 (100).

136,2 mg (0,23 mmól) (16) képletű vegyületet feloldunk 5 ml vízmentes tetrahidrofuránban, és 0 °C-on, argongáz alatt, keverés közben hozzáadunk 25 mg (0,65 mmól) lítium-[tetrahidro-aluminát]-ot. A szuszpenziót 15 percig keverjük 0 °C-on, majd a lítium-[tetrahidrido-aluminát] feleslegét 10% vizet tartalmazó tetrahidrofurán becsepegtetésével elbontjuk, és szobahőmérsékleten folytatjuk a keverést még 15 percen át. A terméket a szokásos etil-acetátos extrakcióval izoláljuk. Az ilyen módon, 91 %-os kitermeléssel kapott (17) képletű vegyület színtelen olaj, amelynek tömege 118,4 mg.

Infravörös színkép (film): 3450, 2952, 2886, 1447, 1258,1105, 1085,834 cm-¹;

ultraibolya színkép (etanol); 264 nm, 227 nm, A264/A227 - 1,57;

Ή-NMR-spektrum (CDC1₃, δ): 0,00 (12H, s, Si-CH₃), 0,53 (3H, s, I8-CH₃), 0,85 [18H, s, Si-C(CH₃)₃], 1,04 (3H, d, J = 6,4 Hz, 21-CH₃), 3,37 és 3,83 (IH és IH, m, 22-CHJ, 4,17 (IH, m, 3-H), 4,35 (IH, m, 1-H), 4,84 (IH, széles s, 19Z-H), 5,16 (IH, széles s, 19E-H), 6,00( lH,d,J= 12,2 Hz, 7-H), 6,21 (lH,d, J- 12,2 Hz, 6-H);

tömegspektrum m/z (relatív intenzitás): 574 (M⁺, 17), 442 (67), 383 (11), 308 (17), 248 (100).

μΐ (0,7 mmól) dimetil-szulfoxid és 3 ml metiléndiklorid elegyéhez keverés közben -60 °C-on, nitrogéngáz atmoszférában cseppenként hozzáadunk 30 μΐ (0,34 mmól) oxalil-dikloridot 0,5 ml metilén-dikloridban oldva. Az oldatot 10 percig -60 °C-on keverjük, majd lassú ütemben 27 mg (0,05 mmól) (17) képletű vegyület 1 ml metilén-dikloriddal készült oldatát adjuk hozzá. Az elegyet még 30 percen át keverjük -60 °Con, beadagolunk 0,2 ml trietil-amint, és további 5 percig folytatjuk a keverést. Az így keletkezett (18) képletű terméket dietil-éterrel extraháljuk, és az extraktumot telített nátrium-klorid oldattal mossuk, majd vízmentes magnézium-szulfát felett szárítjuk. Sep-Pak szilikagél oszlopon átengedve az oldatot. 17 mg (62%) vékonyréíeg-kromatográfiásan tiszta terméket kapunk. Infravörös színkép (film): 2954, 2929, 2884, 2857, 1727, 1472, 1375, 1256, 1085, 909, 880,835 cm-'; Ή-NMR-spektrum (CDC1₃, δ): 0,00 (12H, s, Si-CH,),

0,06 (3H, s, 18-CH₃), 0,88 [18H, s, Si-C(CH₃)₃], 1,11 (3H, d, J-6,9 Hz, 21-CH₃), 4,23 (IH, m, 3H), 4,43 (IH, m, 1-H), 4,93 (IH, széles s, 19Z-H),

5.19 (IH, széles s, 19E-H), 6,07 (lH,d,J- 10,0 Hz, 7-H), 6,26 (IH, d, J = 10,0 Hz, 6-H), 9,54 (IH, d, j = 3 Hz, 22-H);

ultraibolya színkép (hexán): 264 nm, X,_nin 227 nm,

A264/A227 = 1,9;

tömegspektrum m/z (relatív intenzitás): 572 (M⁺, 13),

440 (53), 383 (11), 308 (14), 248 (100); a C₃₄H₆₀O₃Si₂ összeképletre számított pontos relatív molekulatömeg = 572,4081, talált = 572,4117.

A (18) képletű aldehidet jobb kitermeléssel állíthatjuk elő, ha az oxidációt a következőképpen végezzük:

μΐ (0,36 mmól) dimetil-szulfoxid és 0,25 ml vízmentes metilén-diklorid elegyét argongáz alatt lehűtjük -60 °C-ra, és keverés közben, cseppenként beadagoljuk 15 μΐ (0,17 mmól) oxalil-diklorid 0,75 ml vízmentes metilén-dikloriddal készük oldatát. Az elegyet 10 percen át -60 °C-on keverjük, majd lassú ütemben hozzáadjuk 20,3 mg (0,035 mmól) (17) képletű alkohol 0,5 ml vízmentes metilén-dikloriddal készült oldatát, és 0,2 ml vízmentes metilén-dikloriddal beöblítjük. 30 percig keverjük a reakcióelegyet -60 °C-on, majd ugyanezen a hőmérsékleten beadagolunk 0,3 ml (2,15 mmól) trietil-amint. Még 5 percig folytatjuk a keverést, majd 0 °C-ra hagyjuk az elegyet melegedni, és extraháljuk dietil-éterrel. Az éteres fázist sóoldattal mossuk, magnézium-szulfáton szárítjuk, majd Sep-Pak szilikagél oszlopon átszűrjük. Az olaj formájában visszamaradó nyersterméket nagynyomású folyadékkromatográfiával (Zorbax-Sil 9,4 x 25 cm, 10% etilacetátot tartalmazó hexán) tisztítjuk, aminek eredményeképpen 19 mg (96%) tiszta (18) képletű aldehidet kapunk. Alkoholt csak nyomokban, 0,12 mg-ot kapunk vissza.

2. példa

Az la,25-dihidroxt-22-dehidro-24-dihomokolkalciferol (25) előállítása (oldallánc kapcsolás)

a) A (19) képletű hidroxi-szulfon előállítása mg (84 mmól) 2-[(trietil-szilil)-oxi]-6-(fenilszulfonil)-2-metil-hexán (31) 300 μΐ vízmentes tetrahidrofuránnal készült, indikátorként 1,10-fenantrolint tartalmazó, -78 °C-ra hűtött oldatához keverés közben, argongáz atmoszférában előbb 13 μΐ (90 μτηόΐ) diizopropil-amint, majd 70 μΐ (91 μζηόΐ) 1,3 M hexános butil-lítium oldatot adunk. Az elegyet -78 °C-on, argongáz alatt keverjük 30 percig, majd beadagoljuk 6 mg (ΙΟμτηόΙ) (18) képletű C-22-karbaldehid 300 μΐ vízmentes tetrahidrofuránnal készült oldatát, és további 1 órán át folytatjuk a keverést -78 °C-on. Az elegyet 1 ml telített ammónium-klorid oldat hozzáadásával megbontjuk, hagyjuk 0 °C-ra melegedni, majd etil-acetáttal extraháljuk. Az extraktumot vízzel és sóoldattal mossuk, vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, majd szűrjük és bepároljuk. Preparatív nagynyomású folyadékkromatográfiával (Zorbax-Sil oszlop, 9,6 x 25 cm, 10% etil-acetátot tartalmazó hexán) 0,6 mg reagálatlan aldehidet, és 6,6 mg (19) képletű hidroxi-szulfont kapunk epimerek keverékeként. A kitermelés 77%.

b) A (25) képletű la.,25-dihidroxi-22-dehidro-24-dihomokolkalciferol előállítása

3,3 mg (19) képletű hidroxi-szulfont feloldunk 1,0 ml vízmentes tetrahidrofuránban, és keverés közben előbb 1,0 ml telített, metanolos dinátrium-hidro1

HU 206 316 Β gén-foszfát oldatot, majd 160 mg vízmentes, porított dinátrium-hidrogén-foszfátot adunk hozzá. Az elegyet argongáz alatt 0 °C-on keverjük 30 percig, majd hozzáadunk mintegy 400 mg frissen készült, 5%-os nátriummalgámot, és folytatjuk a keverést 5 °C-on 16 órán át. Ezután az elegyet 5 ml hexánnal hígítjuk, még 15 percig keverjük, majd az oldószert dekantáljuk, és a szilárd részt mossuk háromszor 5 ml hexánnal. Az egyesített szerves oldószeres oldathoz jeget és telített nátrium-klorid oldatot adunk, elválasztjuk a szerves fázist, és átengedjük egy Sep-Pak szilikagél oszlopon. Nagynyomású folyadékkromatográfíával (Zorbax-Sil oszlop, 9,4x25 cm, 10% etil-acetátot tartalmazó hexán) tisztítva 2,0 mg (71%) védett A²²-l,25-dihidroxi-24-dihomokolkalciferolt (21), és csekély mennyiségű (22) képletű 22-hidroxi-származékot kapunk.

mg (21) képletű védett trióit feloldunk 1,0 ml vízmentes tetrahidrofuránban és hozzáadunk 50 μΐ 1 M tetrahidrofurános tetrabutil-ammónium-fluorid oldatot. Az elegyet argongáz alatt keverjük 50 °C-on 1 óra hosszat, majd 8 ml dietil-éterrel meghígítjuk, és a szerves fázist telített nátrium-klorid oldattal mossuk. Az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot feloldjuk 10%

2-propanolt tartalmazó hexánban, és átengedjük egy Sep-Pak szilikagél oszlopon. Nagynyomású folyadékkromatográfiával (Zorbax-Sil 9,4 x 25 cm, 20% 2-propanolt tartalmazó hexán) 0,6 mg kívánt, (25) képletű dihomoszármazékot kapunk.

Ultraibolya színkép (etanol): 264 nm, λ^-,,

228 nm, A264/A228 = 1,87;

'H-NMR-spektrum (CDC1₃, δ): 0,55 (3H, s, 18-CH₃),

I, 00 (3H, d, J«=6,6 Hz, 21-CH₃), 1,23 (6H, s,

26,27-CH₃), 4,23 (IH, m, 3-H), 4,43 (IH, m, 1-H),

5,00 (IH, széles s, 19Z-H), 5,32 (IH, széles s, 19EH), 5,29 (2H, m, 22-H és 23-H), 6,01 (IH, d,JII, 3 Hz, 7-H);

tömegspektrum m/z (relatív intenzitás): 442 (M⁺,

15), 424 (23), 406 (33), 391 (7), 287 (11), 285 (10),

269 (27), 251 (23), 152 (33), 134 (100), 116 (6), 59 (20);

a C₂₉ H4gO₃ összegképletre számított pontos relatív molekulatömeg = 442,3446, talált = 442,3441.

3. példa

Az la.,25-dihidroxi-22-dehidro-24-trihomokolkalci· ferol (26) előállítása (oldallánc kapcsolás) a) A (20) képletű hidroxi-szulfon előállítása 58 mg (151 μτηόΐ) 2-[(trietil-szilil)-oxi]-7-(fenilszulfonil)-2-metil-heptán (35) 500 μΐ vízmentes tetrahidrofuránnal készült indikátorként 1,10-fenantrolint tartalmazó, -78 °C-ra hűtött oldatához keverés közben, argongáz atmoszférában előbb 23 μΐ (160 μηιόΐ) diizopropil-amint, majd 106 μΐ (160 μτηόΐ) 1,5 M hexános butil-lítium oldatot adunk. Az elegyet argongáz alatt -78 °C-on keverjük 30 percig, majd beadagoljuk 7 mg (12μηιό1) (18) képletű C-22-karbaldehid 300 μΐ vízmentes tetrahidrofuránnal készült oldatát, és további 1 órán át folytatjuk a keverést. A reakcióelegyet 1 ml telített ammónium-klorid oldat hozzáadásával megbontjuk, hagyjuk felmelegedni 0 °C-ig, etil-acetáttal extraháljuk, majd a szerves fázist sóoldattal mossuk, vízmentes magnézium-szulfát felett szárítjuk, szűrjük és bepároljuk. Preparatív nagynyomású folyadékkromatográfiával (Zorbax-Sil 9,4 x 25 cm, 10% etil-acetátot tartalmazó hexán) 0,4 mg reagálatlan aldehidet és

7,5 mg (20) képletű hidroxi-szulfont kapunk epimerek keverékeként. A kitermelés 78%.

b)A (26) képletű 1,25-dihidroxi-22-dehidro-24-trihomokolkalciferol előállítása

IS mg (20) képletű hidroxi-szulfont feloldunk

1,0 ml vízmentes tetrahidrofuránban, és keverés közben előbb 1 ml telített, etanolos dinátrium-hidrogénfoszfát oldatot, majd 160 mg vízmentes, porított dinátrium-hidrogén-foszfátot adunk hozzá. Az elegyet argongáz alatt 0 °C-on keverjük 30 percig, majd mintegy 400 mg frissen készült, 5%-os nátriummalgámot adunk hozzá, és folytatjuk a keverést 5 °C-on még 16 óra hosszáig. Az elegyet ezután 5 ml hexánnal meghígítjuk, újabb 15 percig keverjük, majd az oldószert dekantáljuk, és a szilárd részt mossuk háromszor 5 ml hexánnal. Az egyesített hexános oldatot sóoldattal mossuk, elválasztjuk, szárítjuk és bepároljuk. A maradékot 10% etil-acetátot tartalmazó hexánban oldva átengedjük egy Sep-Pak szilikagél oszlopon. Nagynyomású folyadékkromatográfíával (Zorbax-Sil 9,4 x 25 cm, 10% etil-acetátot tartalmazó hexán) tisztítva 2,12 mg védett A²²-l,25-dihidroxi-24-dihomo-kolkalciferolt (23) és 1,33 mg (24) képletű 22-hidroxi-származékot kapunk, 2,1 mg (23) képletű vegyületet feloldunk 1,0 ml vízmentes tetrahidrofuránban, hozzáadunk 50 μΐ 1 M tetrahidrofurános tetrabutil-ammőnium-fluorid oldatot, és í óra hosszat argongáz alatt, 50 °C-on keverjük az elegyet, majd dietil-étenel meghígítjuk és sóoldattal mossuk. A szerves fázist vízmentes magnézium-szulfát felett szárítjuk, szűrjük és bepároljuk, majd a maradékot 30% 2-propanolt tartalmazó hexánban oldjuk, és átengedjük egy Sep-Pak oszlopon. Nagynyomású folyadékkromatográfíával (Zorbax-Sil 9,4 x 25 cm, 20% 2-propanolt tartalmazó hexán) végezve a tisztítást 0,8 mg kívánt, (26) képletű trihomovegyületet kapunk. Ultraibolya színkép (etanol): 264 nm, λ^η

228 nm, A264/A228 = 1,81;

Ή-NMR-spektrum (CDC1₃, δ): 0,56 (3H, s, 18-CH₃), 1,00 (3H, d, J = 6,6 Hz, 21-CH₃), 1,23 (6H, s, 26,27-CH₃), 4,23 (IH, m, 3-H), 4,43 (IH, m, 1-H), 5,00 (IH, széles s, 19Z-H), 5,32 (IH, széles sl, 19E-H), 5,29 (2H, m, 22-H és 23-H), 6,01 (IH, d, J = 11,3 Hz, 7-H);

tömegspektrum m/z (relatív intenzitás): 456 (M⁺, 11), 438 (50), 420 (30), 402 (8), 287 (10), 269 (23), 251 (23),152 (35), 134(100).

4. példa

Az oldallánc kialakításához szükséges szulfonok szintézise

a) A (31) képletű szulfon előállítása

12,9 ml 3 M dietil-éteres metil-magnézium-bromid oldatot 25 ml vízmentes tetrahidrofuránnal meghígítunk, és erélyes keverés közben, 30 perc alatt, -10 °C7

HU 206 316 Β on, argongáz atmoszférában, cseppenként beadagoljuk 3 g (19,2 mmól) (27) képletű (4-klór-valeril)-klorid (Alreich) 25 ml vízmentes tetrahidrofuránnal készült oldatát. A reakcióelegyet 2 óra alatt hagyjuk felmelegedni szobahőmérsékletre, majd vízzel megbontjuk, híg sósavval semlegesítjük, és dietil-éterrel extraháljuk. Az egyesített éteres extraktumot vízzel mossuk, és nátrium-szulfáton szárítjuk, majd elpárologtatjuk az oldószert, és a maradékot vákuumban desztilláljuk. Az így kapott (28) képletű klór-alkohol színtelen olaj, amelynek tömege 2,1 g (70%).

1,5 g (10 mmól) (28) képletű klór-alkoholt feloldunk ml vízmentes Ν,Ν-dimetil-formamidban, és az oldatot keverés közben 1,32 g (11,3 mmól) tiofenil, valamint

1,32 g (11,3 mmól) kálium-(terc-butilát) 25 ml vízmentes Ν,Ν-dimetil-formamiddal készült oldatához adjuk. A reakcióelegyet éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük, majd víz és metilén-diklorid keverékével összerázzuk. A szerves fázist vizes nátrium-karbonát oldattal és vízzel mossuk, vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, majd az oldószert vákuumben elpárologtatjuk. A nyerstermék olaj, amelyet flash-kromatográfiás eljárással szilikagélen tisztítunk, hexán és etil-acetát elegyével eluálva az oszlopot. A tiszta (29) képletű szulfid színtelen olaj, tömege

2,2 g, a kitermelés 98%.

1,01 g (4,6 mmól) (29) képletű szulfidot feloldunk ml vízmentes metilén-dikloridban, és keverés, valamint alkalmankénti hűtés közben, részletekben beadagolunk 2,5 g (11,6 mmól) 3-klór-perbenzoesavat (Aldrich, 80-85%-os). A reakcióelegyet 2 óra hosszat keverjük, majd 10%-os nátrium-hidrogén-karbonát oldatot adunk hozzá, a szerves fázist nátrium-szulfit oldattal mossuk, és magnézium-szulfáton szárítjuk. Az oldószert vákuumban elpárologtatjuk, és a nyersterméket flash-kromatográfiás eljárással szilikagélen tisztítjuk, hexán és etil-acetát elegyét alkalmazva elüensként. Az így kapott (30) képletű szulfon színtelen folyadék, tömege 1,1 g, a kitermelés 97%.

1,3 g (5,1 mmól) (30) képletű szulfont és 1,5 g (22,7 mmól) imidazolt feloldunk 50 ml vízmentes Ν,Νdimetil-formamidban, és keverés közben hozzáadunk

1,15 g (7,7 mmól) (trimeíil-szilil)-kloridot. Areakcióelegyet 2 órán át szobahőmérsékleten tartjuk, metilén-dikloriddal meghígítjuk, majd mossuk vizes ammónium-klorid oldattal és vízzel. A szerves fázist nátrium-szulfáton szárítjuk, és az oldószert vákuumban elpárologtatjuk, A maradékot szilikagélen flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk. Az oszlopról először hexánnal eluáljuk a hexaetildisziloxánt, majd hexán és etil-acetát 9: 1 arányú elegyével a trimetil-szilil-csoporttal védett, (31) képletű szulfont, amely színtelen folyadék. A kitermelés 1,8 g, 97%. Infravörös színkép (film): 3045, 2940, 1440, 1360,

1130, 1020 cm-', 'H-NMR-spektrum (400 MHz, CDC1₃, δ): 0,518 (6H, q, J = 6,2 Hz, Si-CH₂), 0,899 (9H, t, J = 6,2 Hz, Si-C-CH₃), 1,142 (6H, s, CH₃), 1,307-1,462 (4H,

m), 1,655-1,738 (2H, m, H-4), 3,080-3,122 (2H, m, H-2), 7,567 (2H, t, J = 6,8 Hz, aromás H, méta), 7,648 (IH, t, J - 6,8 Hz, aromás H, pára), 7,916 (2H, d,J = 6,83 H6, aromás H, orto);

tömegspektrum (elektrobefogásos, 70 eV) m/z (relatív intenzitás): 372 (M⁺, 2), 341 (100), 229 (2), 227 (18), 173 (24), 103 (22), 75 (45), 55 (33). b) A (35) képletű szulfon előállítása ml 3 M dietil-éteres metil-magnézium-bromid oldatot meghígítunk 15 ml vízmentes tetrahidrofuránnal, és -10 °C-on, argongáz atmoszférában, intenzív keverés közben, mintegy 15-20 perc alatt, cseppenként hozzáadjuk 3,8 g (2,8 ml, 18 mmól) (6-bróm-hexanol)klorid 10 ml vízmentes tetrahidrofuránnal készült oldatát. Az elegyet szobahőmérsékleten keverjük 2 óra hoszszat, majd lehűtjük 0 °C-ra, és óvatosan megbontjuk 1: 1 arányban hígított sósavval. A vizes részt dietil-éterrel extraháljuk, majd az egyesített szerves fázist mossuk vízzel, vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk és bepároljuk, aminek eredményeképpen színtelen olaj formájában 3,6 g (94%) (33) képletű bróm-alkoholt kapunk.

3,4 g (16 mmól) (33) képletű bróm-alkoholt és 3,3 g (20 mmól) nátrium-benzol-szulfinátot vízmentes Ν,Νdimetil-formamidban reagáltatunk 70 °C-on 4,5 órán át. A reakcióelegyet jégre öntjük, metilén-dikloriddal extraháljuk, és a szerves fázist mossuk 1 n sósavval, vízzel és 10%-os nátrium-hidrogén-karbonát oldattal, majd vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, szűrjük és bepároljuk. Az így kapott (34) képletű szulfont szilikagélen, flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk, melynek során 40-50% etil-acetátot tartalmazó hexáneleggyel végezzük az elúciót. A tisztított termék, amelynek tömege 4,18 g (98%), kevés szulfínsav-észtert is tartalmaz.

Tömegspektrum: m/z 270 (M⁺), 255 (M⁺-15), 77,59.

g (14 mmól) (34) képletű szulfont és 3,8 g (55 mmól) imidazolt feloldunk 13 ml vízmentes Ν,Νdimetil-formamidban, majd keverés közben hozzáadunk 4,5 g (5,1 ml, 30 mmól) (trietil-szilil)-kloridot. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten keverjük 2 óra hosszat, majd jégre öntjük, dietil-éterrel extraháljuk, és az éteres extraktumot vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, szűrjük, végül bepároljuk. A párlási maradékot flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk, melynek során először a hexaetil-disziloxiánt eluáljuk hexánnal, ezt követően 3% etil-acetátot tartalmazó hexánnal leoldjuk az oszlopról a szulfínsav-észtert és egy kevés szulfont, majd 10% etil-acetátot tartalmazó hexánnal eluáljuk a (35) képletű védett szulfont. A kapott termék tömege 3,4 g, a kitermelés 60%. Az elementáranalízis megfelel a számított értékeknek.

Tömegspektrum m/z (relatív intenzitás): 355 (M⁺-29, 100), 227 (15), 173 (35), 103 (43), 75 (95), 55 (23). NMR-spektrum (400 MHz, CDC1₃, Ö): 0,54 (6H, q, J 7 Hz, Si-CH₂), 0,94 (9H. t, J = 8 Hz, Si-C-CH₃),

1,15 (6H, s, CH₃), 1,31-1,36 (4H, m), 3,08-3,12 (2H, m, H-2), 7,57 (2H, t, J = 6,8 Hz, aromás H, méta), 7,66 (IH, t, aromás H, para), 7,92 (2H, d, J 6,8 Hz, aromás H, orto).

Biológiai aktivitás

A (25) képletű, új homológ sejtdifferenciálódást indukáló és hiperkalcémiás hatását tudományosan elfo1

HU 206 316 Β gadott, ismert módszerekkel határoztuk meg. A mérési eljárást, valamint az eredményeket az alábbi példákban adjuk meg részletesen:

5. példa

A (25) képletű dihomoszármazék differenciálódást indukáló hatásának meghatározása humán leukémiasejteken (HL-60)

A vizsgálandó hatóanyag humán leukémiasejtekre (HL-60) gyakorolt differenciálódást indukáló hatásának mértékét három különböző vizsgálati módszerei határoztuk meg: mértük az NBT-redukciót, valamint a fagocitózis és észteráz aktivitást. Az első két vizsgálatot DeLuca és munkatársai, a 4717 721 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban megadott általános módszerével végeztük. A harmadik vizsgálatot, miszerint a sejttranszformációs hatás mérésére a nem specifikus észteráz aktivitás szolgál, a Sigma Chemical Corp., (St. Louis, MO) cégtől beszerezhető Sigma Kit No. 90 előírásai szerint viteleztük ki [lásd még: Ostrem és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2160-2614 (1987); Ostrem és munkatársai: J. Bioi. Chem. 262, 14 164-14 171 (1987)]. Az eredményeket az 1. táblázatban foglaltuk össze. Az adatok az 1,25-dihidro-kolkalciferol mint összehasonlító vegyület és a találmány szerinti D-vitamin-származék különböző koncentrációinak hatására differenciálódott sejtek százalékos arányát mutatják.

1. táblázat

Az 1,25-dihidro-kolkalciferol és a meghosszabbított oldalláncú dihomovegyület HL-60 sejtekre gyakorolt differenciálódást indukáló hatásának összehasonlítása sejttenyészetben

Vizsgált vegyület	Koncentráció	A differenciálódott sejtek %-os aránya
Észteráz	Fagocitózis	NBT
1,25-dihidroxi-kolkalciferol	1 X ΙΟ’6 7 M	91 ±2	90±3	90±2
lxlO^M	61 ±4	56 + 2	55±4
1x10 9M	30 ± 3	31 ±2	34±4
l,25-dihidroxi-22-dehidro-24-dihomokolkalciferol (25)	5 x ΚΓ8 M	92 + 2	93+3	92±2
1 x 10-8 M	78 + 2	77 ±3	78 + 3
5 x ΙΟ’9 M	67±4	69 + 2	69±3
1x10 9M	49 + 2	50 + 3	48 + 3
5xlO loM	36±4	36 + 4	40±3

6. példa

A (25) képletű dihomoszármazék hiperkalcémiás hatásának vizsgálata

a) Kalcium transzport a bélfalon keresztül A Harlan-Sprague Dawley Company of Madison (Wisconsin) cég tenyészetéből származó, hím, éppen elválasztott patkányok 4 héten át Suda és munkatársai szerint [J. Nutr. 100, 1049-1052 (1970)] alacsony kalciumtartalmú, angolkórt okozó táplálékon (0,02% kalcium, 45 0,3% foszfor) tartottunk, amelyből az állatok tetszés szerint fogyaszthattak. A harmadik hét végén az állatokat hatos csoportokra osztottuk. Az egyik csoport egyedei 7 napon át naponta intraperitoneális injekció formájában vivőanyagot (95% propilénglikol és 5% etanol), míg a töb- 50 bi csoport egyedei ugyanabban az időben, azonos mennyiségű vivőanyaggal 12,5, illetve 25 ng 1,25-dihidroxi-kolkalciferolt, valamint 125 ng (25) képletű vegyületet, azaz la,25-dihidroxi-22-dehidro-2-dihomokolkalciferolt kaptak. Az utolsó kezelést követő 24. órában az ál- 55 latokat leöltük, a beleket kivettük, és a nyombélszelvényt használtuk fel arra, hogy a kalcium transzportot Halloran és DeLuca módszerével [Arch. Biochem. Biophys. 208, 477—486 (1981)] mérjük. Az eredményeket a 2. táblázatban adjuk meg. 60

2. táblázat

Az 1,25-dihidroxi-kolkalciferol és a meghosszabbított oldalláncú homológ hatása a bélfalon keresztül végbemenő kalcium transzportra

Vizsgált vegyület	Dózis ng/nap	Kalcium transzport átlag ± szórás
Kontroll	0	4,8 ±0,2
1,25-dihidroxi-koIkalcife-	12,5	11,2 + 0,6
rol	25,0	13,4± 1,2
l,25-dihidroxi-22-dehidro24-d ihomokolkalci ferol (25)	125,0	6,8 ±0,45

b) Kalcium felszabadulása a csontokból A Harlan Sprague Dawley Company of Madison cég tenyészetéből származó, hím, éppen elválasztott patkányokat 4 héten át Suda és munkatársai szerint [J. Nutr. 100, 1049-1052 (1970)] alacsony kalciumtartalmú (0,02% kalcium, 0,3% foszfor) és D-vitamin-hiányos táplálékon tartottunk. A harmadik hét végén az állatokat hatos csoportokra osztottuk, és minden csoport

HU 206 316 Β egyedeí a 3. táblázatban megadott vizsgálati anyagok ott feltüntetett dózisait kapták 0,1 ml vivőanyagban (95% propilénglikol és 5% etanol) oldva. A kontrollcsoportot csak vivőanyaggal kezeltük. A kezeléseket mind az 1,25-dihidroxi-kolkalciferollal, mind a (25) képletű dihomo-származékkal naponta végeztük 7 napon át. A szérum kalciumtartalmát a 7. nap végén atomabszorpciós módszerrel mértük. A 3. táblázat két azonos kísérlet adatait tartalmazza.

3. táblázat

Az 1,25-dihidroxi-kolkalciferol és a homológ oldalláncot viselő származék kalcium mobilizáló hatása patkányokon

Vizsgált vegyület	Dózis ng/nap	Kalciumszint a szérumban (mg%) átlag ± szórás
I. kísér lel	2, kísértei
Kontroll	0	3,4 ±0,07	4,1 ±0,05
1,25-dihidroxi-kolkal- ciferol	12,5	3,7 ±0,17	4,8 ± 0,08
25,0	4,1 ±0,07	4,8 ± 0,08
75,0	4,6 ±0,09	-
l,25-dihidroxi-22-dehidro-24-dihomokolkalciferol (25)	25,0	3,6 ±0,16	-
125,0	3,7 ±0,13	4,36 ±0,15
250,0	4,1+0,05	-
500,0	3,8 ±0,11	-

Az 1. táblázat adatai világosan mutatják, hogy a (25) képlett! dihomoszármazék felülmúlja az 1,25-dihidroxi-kolkalciferol sejtdifferenciálódást indukáló hatását, azaz kifejezetten hatékonyabbnak bizonyult a leukémiasejtek normális monocita típusú sejtekké történő differenciálódásának kiváltásában. Például az 1,25-dihidroxi-kolakciferol 1 x 10^-8 M koncentrációban a sejtek 55-61%-ának differenciálódását okozza, míg a (25) képletű vegyület esetén ez az érték 78%. Tekintettel arra, hogy az 1,25-dihidroxi-kolkalciferol 1 x 10~⁷ koncentrációja szükséges a differenciálódás adott mértékének (mintegy 90%) eléréséhez, ami a dihomoszármazék esetében már 5 x 10'^s M koncentrációval elérhető [hozzávetőlegesen 92%, azt mondhatjuk, hogy a (25) képletű vegyület sejtdifferenciálódást indukáló hatása ötszöröse az 1,25-dihidroxi-kolkalciferolénak].

Amint az a 2. és 3. táblázat adataiból kiolvasható, éles különbséget találtunk, ha a dihomovegyület alacsony hiperkalcémiás hatékonyságát hasonlítjuk az 1,25-dihidroxi-kolkalciferolélioz. A 2. táblázat adatai amelyek a bélfalon keresztül végbemenő kalcium transzportra vonatkoznak - azt mutatják például, hogy az ismert aktív metabolit, az 1,25-dihidroxi-kolkalciferol, amint az várható volt, a kontrolihoz képest igen erőteljes hatást vált ki napi 12,5 vagy 25 ng dózisban 7 napon át adva az állatoknak. A (25) képletű dihomovegyülettel azonban napi 125 ng dózisszinten kezeltük az állatokat 7 napon át, és még ilyen nagy dózisok is csak szerény hatást eredményeztek. A kapott értékek alig haladják meg a tízszer alacsonyabb dózisban alkalma10 zott 1,25-dihidroxi-kolkalciferol hatására mért érték felét. Ebben a vizsgálatban tehát az új dihomoszármazék legalább tízszer kevésbé aktívnak bizonyult, mint az 1,25-dihidroxi-kolkalciferol.

Ugyanezt a következtetést vonhatjuk le a 3. táblázatban szereplő, a csontokból felszabaduló kalciumra vonatkozó adatokból. Itt a 7 napon keresztül adott (25) képletű dihomovegyület napi 125 és 250 ng-os dózisai váltották ki ugyanazt a hatást, mint a 12,5 és 25 ng dózisban adott 1,25-dihidroxi-kolkalciferol. Figyelemre méltó továbbá, hogy a dihomovegyület dózisának további emelésével - napi 500 ng-ra - nem fokozódik a kalcium mobilizációja, sőt ha egyáltalán valamilyen változást tapasztalunk, inkább szupresszor hatás jelentkezik. A 2. kísérletben - az adatok szintén a 3. táblázatban találhatók - az 1,25-dihidroxi-kolkalciferol hatása a kontrolihoz viszonyítva napi 12,5 és 25 ng dózisszinten szignifikánsnak bizonyult, míg a dihomovegyület napi 125 ng dózisban hatástalannak mutatkozott. Egy harmadik kísérlet során, amikor a (25) képletű dihomovegyület dózisát egészen napi 1000 ng-ig növeltük, semmilyen kalcium mobilizáló hatást nem tapasztaltunk egyik dózisszinten sem, ami azt bizonyítja, hogy a vegyület alapvetően nem változtatja meg a szérum kalciumtartalmát a csontok rovására. A mobilizációs vizsgálatok eredményei teljes összhangban vannak a 2. táblázat adataival, amelyek a kalcium transzportra vonatkoznak, és világosan jelzik, hogy a (25) képletű dihomovegyület hiperkalcémiás aktivitása többszörösen alatta marad a 1,25-dihidroxi-kolkalciferolénak.

Hasonló képet kapunk a találmány szerinti (26) képletű vegyület hatáselemzése során is. Ez a vegyület szintén rendkívül előnyösnek bizonyult a sejtdifferenciálódást indukáló és a hiperkalcémiás hatás erősségének viszonyát tekintve, ami abban nyilvánult meg, hogy kifejezetten hatékonynak mutatkozott a HL-60 sejtek differenciálódásának tekintetében, míg a kontrolihoz képest nem okozott szignifikáns változást a patkányok szérumában mért kalciumszintet illetően.

Ez a típusú hatásegyüttes természetesen pontosan megfelel annak, amelyet egy, a daganatos betegségek kezelésére alkalmas sejtdifferenciálódást indukáló szertől megkívánunk. A kívánt hatás, vagyis a rákos sejtek differenciálódása igen kifejezett, míg a nemkívánatos hiperkalcémiás hatékonyság rendkívüli mértékben lecsökkent, és így a két hatás viszonya nagyon előnyös képet mutat. Az ismert lct-hidroxi-D-vitaminszármjzékok alkalmazhatósága a leukémiás betegségek kezelésében már bebizonyosodott (Suda és mások: 4 391 802 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). A fent részletezett biológiai vizsgálatok adatai alapján joggal következtethetünk arra, hogy az eddig ismert, a technika állását reprezentáló vegyületekkel azonos dózisszinten alkalmazva, a találmány szerinti, homológ oldalláncot viselő, új vegyületek hiperkalcémiás hatást egyáltalán nem mutatnak, vagy ez a hatásuk az ismert vegyületekéinek a tizedénél is kisebb lesz. Ha ez igaz, akkor megoldottnak tekinthetjük azt a problémát, amit az ilyen kezelésre szoruló betegeknél a vegyületek által okozott, szélsőségesen

HU 206 316 Β magas vér-kalciumszint jelentett. Az 1. táblázat adatai alapján mindazonáltal azt is remélhetjük, hogy az új homovegyületek differenciálódást indukáló hatása a rákos sejtek, különösen a leukémiasejtek esetében még kifejezettebb lesz, tovább növelve a vegyületek terápiás értékét. A találmány szerinti új vegyületek a rákos betegségek kezelésének egy sajátos, a sejtdifferenciálódás elvén alapuló gyógymódját valósíthatják meg a gyakorlatban. Amit a hatásukról eddig tudunk, azt sugallja, hogy a rákos betegségek kezelésére előnyösen alkalmazható terápiás szer birtokába jutottunk.

Gyógyászati célokra a vegyületekből különböző gyógyszerkészítményeket készíthetünk. Ilyenek például a megfelelő, ártalmatlan oldószerekkel vagy vivőanyagokkal készült oldatok, emulziók, szuszpenziók vagy diszperziók, valamint a pilulák, tabletták vagy kapszulák, amelyek előállítása a szakterület művelői előtt általánosan ismert, szokványos eljárásokkal történhet. Azonkívül a készítmények tartalmazhatnak más, gyógyszerészetileg elfogadható, nem toxikus alkotórészeket is, így például stabilizátorokat, antioxidánsokat, kötőanyagokat, színezőanyagokat, emulgátorokat vagy ízjavító szereket.

A hatóanyagokat megfelelő steril oldatban előnyösen alkalmazhatjuk injekció vagy intravénás infúzió formájában de az orális készítmények, amelyeket a tápcsatornán keresztül juttatunk be a szervezetbe, ugyancsak megfelelőek lehetnek. Az emberi leukémia kezelésére a találmány szerinti homo-D-vitamin-származékokat olyan dózisban kell a betegnek adnunk, amely elegendő ahhoz, hogy kiváltsa a leukémiasejtek differenciálódását makrofágokká. Ez a dózis lehet például napi 0,5 és 50 pg között, azonban tudnunk kell, hogy a dózist a betegség súlyosságától, a beteg állapotától, illetve reagálásától függően kell megállapítani esetleg még az említett szint fölé is emelni amint az a gyakorlatban általában szokásos.

Claims (4)

1. Eljárás az (I) általános képletű D-vitamin-homológok előállítására - a képletben n értéke 3 vagy 4-, azzal jellemezve, hogy egy (la) általános képletű fenil-szulfonil-származékot - a képletben X, Y és Z egymástól függetlenül hidrogénatom vagy hidroxi-védőcsoport, és n értéke 3 vagy 4 - reduktívan deszulfonálunk, és a jelen lévő védőcsoporto(ka)t eltávolítjuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás 24-dihomo-la,25dihidroxi-22-dehidrovitamin-D₃ előállítására, αζζα/ jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyületet alkalmazunk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás 24-trihomo-la,25dihidroxi-22-dehidrovitamin-D₃ előállítására, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyületet alkalmazunk.

4. Eljárás hatóanyagként (I) általános képletű D-vitamin-homológot - a képletben n értéke 3 vagy 4 tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított hatóanyagot a gyógyszerkészítésben szokásos segédanyagokkal együtt gyógyszerkészítménnyé dolgozzuk fel.