FR2630739A1 - Homologues a chaine laterale insaturee de vitamine d, compositions pharmaceutiques contenant ces composes, et leur utilisation - Google Patents

Abstract

Cette invention fournit de nouveaux dérivés de vitamine D qui présentent des structures à chaîne latérale insaturée allongée. Ces composés présentent une activité accrue dans l'arrêt de la prolifération de cellules malignes et dans la différentiation de celles-ci, tout en ne présentant qu'une activité calcémique minimale, et ce sont donc de nouveaux agents thérapeutiques applicables et utiles de façon unique dans la thérapie par différentiation de maladies malignes. Les caractéristiques d'activité de ces composés fournissent la base d'un traitement des maladies néoplasiques, et en particulier des maladies leucémiques.

Description

HOMOLOGUES A.CHAINE LATERALE INSATUREE DE VITAMINE D,

COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES CONTENANT CES COMPOSES,

ET LEUR UTILISATION

Cette invention concerne de nouveaux dérivés de vitamine D, qui présentent une activité spécifique pour provoquer la différentiation de cellules malignes en cellules normales. Plus précisément, l'invention concerne des analogues à chaine latérale insaturée et à chaine

latérale allongée de la la,25-dihydroxyvitamine D3 (1,25-

(OH)2D3), qui présente une grande sélectivité d'action en tant qu'agents antinéoplasiques, en vertu de leur activité augmentée de différentiation des cellules malignes et de leur activité très réduite.sur le

métabolisme du calcium.

On sait que l'activité des vitamines D (vitamine D3 ou D2) dans la régulation du métabolisme du calcium et de la croissance et du développement normal des os exige le métabolisme de la vitamine parente en certaines formes

hydroxylées. Précisément, on a établi que la la,25-

dihydroxyvitamine D3 (1,25-(OH)2D3), métabolite dihydroxylé normalement formé à partir de la vitamine D3 chez les animaux ou l'homme, est l'espèce active responsable de la stimulation du transport du calcium dans les intestins et de la résorption du calcium à partir des os (mobilisation des os), régulant ainsi le taux global de calcium sanguin dans l'organisme. (Ces activités liées au calcium des métabolites ou des

analogues de vitamine D seront, dans la description qui

va suivre, désignées collectivement comme "l'activité

calcémique" ou "l'action calcémique"l de ces composés).

Certains analogues de structure de la 1,25-(OH)2D3 comme

par exemple la la-hydroxyvitamine D3, la la-

hydroxyvitamine D2, la la,25-dihydroxyvitamine D2, ou des dérivés fluorosubstitués de la 1,25-(OH)2D3, sont également connus comme des agents calcémiques hautement actifs, et on a donc utilisé ou proposé la 1, 25-(OH)2D3 et ses analogues actifs en tant qu'agents pharmaceutiques dans la prophylaxie ou le traitement de divers désordres des os et du métabolisme du calcium, comme l'ostéodystrophie rénale, le rachitisme résistant à la

vitamine D, ou l'ostéoporose et les maladies apparentées.

Plus récemment, on a découvert que la 1,25-(OH)2D3,

en plus de son action calcémique bien connue rappelée ci-

dessus, possède également d'autres fonctions biologiques.

Par exemple, on a trouvé que la 1,25-(OH)2D3 et ses analogues étroitement apparentés (la-OH-D3), 1,25-(OH)2Dz, analogues fluorosubstitués, etc.) sont capables de provoquer une différentiation cellulaire (Abe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 4990 (1981); Honma et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 201 (1983)). Précisément, on a montré que la 1,25-(OH) 2D3 et ses analogues inhibent la prolifération de cellules malignes grandissant en culture (par exemple des cellules de Ieucémie humaine) et provoquent leur différentiation en cellules normales de type macrophage. (Les activités de ce type seront désormais désignées ici collectivement comme "l'activité de différentiation"' des dérivés de vitamine D.) En raison de leur remarquable efficacité comme agents provoquant la différentiation, ces dérivés de vitamine D sont potentiellement utiles en tant qu'agents anticancéreux, et on a effectivement proposé leur utilisation pour le

traitement de leucémies humaines (Suda et al., brevet US-

4.391.802). Cependant, même si ces composés présentent une efficacité élevée pour la différentiation de cellules malignes en culture, leur action calcémique in vivo, également élevée, limite ou empêche leur utilisation

pratique en tant qu'agents anticancéreux. Ainsi, la 1,25-

(OH)2D3 et ses dérivés flucrés sont des agents très efficaces de différentiation cellulaire, mais ce sont également ces composés qui ont l'activité calcémique la plus efficace, et aux doses requises in vivo pour un usage efficace comme agents anticancéreux (par exemple antileucémiques), ces mêmes composés peuvent entraîner des taux de calcium sanguin dangereusement élevés, en vertu de leur activité calcémique inhérente. D'autres dérivés connus de vitamine D présentent une correspondance similaire entre activité de différentiation et activité calcémique, et leur utilisation pratique en tant qu'agents anticancéreux potentiels est donc sujette aux mêmes limitations et aux

mêmes risques.

Ces observations indiquaient clairement un besoin, et ont stimulé une recherche, de composés présentant une plus grande spécificité et une plus grande sélectivité

dans leur action en tant qu'agents anticancéreux, c'est-à-

dire de composés présentant un rapport différentiation/ activité calcémique amélioré, et des travaux récents ont effectivement mené à la préparation de plusieurs analogues de vitamine D présentant une activité de différentiation exaltée. On a par exemple trouvé que certains homologues de 1,25-(OH)2D3 dans lesquels la chaîne latérale est allongée d'un atome de carbone (à l'intérieur de la chaîne ou en bout de chaîne) présentent une activité de différentiation nettement plus élevée (environ 10 fois plus), vis-à-vis de cellules de leucémie en culture, que la 1,25(OH)2D3 elle-même (DeLuca et al., brevet US N' 4.717.721; Ostrem et DeLuca, Steroids 49, 73-102 (1988); Ostrem et al., J. Biol. Chem. 262, 14864 263073g (1987)). Cependant, ces homologues sont encore des agents calcémiques extrêmement efficaces, qui présentent des activités calcémiques approximativement égales à celle de la 1,25-(OH)zD3. Ces composés sont par conséquent caractérisés par un rapport différentiation/activité calcémique amélioré, mais ils ne résolvent pas le problème de l'action calcémique efficace non souhaitée, discuté cidessus. On a préparé d'autres composés apparentés aux vitamines D, dont on a dit qu'ils présentent une activité de différentiation préférentielle (voir Ostrem et al., supra; Kubodera et al., Chem. Pharm. Bull. 34, 228689 (1986); Ikekawa et al., Chem. Pharm. Bull. 35, 4362 (1987)), mais du point de vue de leur structure, ils se distinguent et diffèrent des composés

de la présente invention.

On a maintenant découvert des composés apparentés aux vitamines D, qui présentent un schéma d'activité désiré et très avantageux, en ce qui concerne leur activité de différentiation par rapport à leur activité calcémique. Ces nouveaux analogues de vitamine D présentent une activité très prononcée d'inhibition de la prolifération de cellules malignes et d'induction de leur différentiation en cellules normales de type monocyte

(activité semblable ou supérieure à celle de la 1,25-

(OH)2D3), mais ils sont beaucoup moins actifs que la 1,25-

(OH)2D3 pour ce qui est de leur action calcémique. Ces nouveaux composés présentent donc un rapport différentiation/activité calcémique très nettement amélioré, et en vertu de cette caractéristique, les composés représentent des agents préférés pour le traitement de maladies néoplasiques. Parce qu'ils sont très actifs pour provoquer la différentiation et beaucoup moins actifs comme agents calcémiques, ces composés

peuvent être administrés sans provoquer des taux.

excessivement élevés de calcium sanguin, et permettent ainsi de résoudre un problème pratique majeur, associé à

l'activité calcémique élevée.

Les nouveaux composés sont caractérisés, du point de vue de la structure, comme étant des homologues à chaîne latérale insaturée de la 1,25-(OH)2D3, dans lesquels la chaîne latérale est allongée par insertion de 2 ou 3 groupes méthylène à l'intérieur de la chaîne carbonée. Ils peuvent donc être représentés par la formule générale suivante: *"(c<)Y OZ xo. o> dans laquelle X, Y et Z, qui peuvent être identiques ou différents, sont choisis parmi des atomes d'hydrogène et des groupes hydroxy-protecteurs, et dans lesquels n vaut

3 ou 4.

Des exemples particuliers et préférés de ces

composés sont la 24-dihomo-1,25-dihydroxy-22-déhydro-

vitamine D3, c'est-à-dire le composé représenté ci-dessus, dans lequel X, Y et Z représentent des atomes d'hydrogène

et n vaut 3, et la 24-trihomo-1,25-dihydroxy-22-

déhydrovitamine D3, c'est-à-dire le composé ayant la structure représentée ci-dessus, dans laquelle X, Y et Z

sont des atomes d'hydrogène et n vaut 4.

Il est évident que ces nouveaux composés sont apparentés au- composé 24homo-vitamine D à chaîne

latérale insaturée, présenté dans le brevet US-4.717.721.

Cependant, les nouveaux composés présentent des

caractéristiques structurales et biologiques distinctives.

Du point de vue de la structure, le trait distinctif est une chaîne latérale insaturée, allongée en un homologue par insertion de 2 ou 3 groupes méthylène, et du point de vue biologique, ces composés sont des agents très efficaces de différentiation cellulaire, mais une

activité calcémique nulle ou très réduite.

Préparation des nouveaux composés La synthèse d'exemples des nouveaux composés de cette invention est représentée de façon schématique dans les schémas de procédé 1, 2 et 3. Le schéma 1 montre la

préparation de l'intermédiaire requis, le la-

hydroxyvitamine D-22-aldéhyde, qui, couplé avec l'alkylphénylsulfone apportant le groupé de chaîne latérale approprié, comme l'indique le schéma de procédé 2, fournit les homologues désirés de vitamine D (par exemple les composés 25 et 26, respectivement).-Le schéma de procédé 3 illustre la préparation des alkylphénylsulfones nécessaires pour le couplage de la chaîne latérale. Les détails expérimentaux des étapes de procédé chimique décrites dans les schémas de procédé sont donnés dans les exemples particuliers suivants. Les désignations de composés par des chiffres arabes (par exemple composé 1, 2, 3, etc..) utilisées dans ces exemples se rapportent aux structures numérotées ainsi

dans les schémas de procédé.

Modes opératoires généraux L'acide 3e-acétoxy-22,23-bisnor-5-cholénique (1) a été fourni par Steraloids (Wilton, NH). Tous les autres composés chimiques étaient de la meilleure qualité disponible sur le marché. Les solvants étaient purifiés

selon des procédés habituels.

On a effectué la chromatographie sur couche mince (CCM) à l'aide de couches de gel de silice préétalées sur aluminium, avec indicateur UV, venant de EM Science (Gibbstown, NJ). Systèmes solvants utilisés: A: chloroforme/éthanol 85:15 (v/v); B: hexane/acétate

d'éthyle 1:1; C: hexane/acétate d'éthyle 3:1.

On a effectué la chromatographie en phase liquide haute performance (HPLC) à l'aide d'un chromatographe en phase liquide Waters Associates muni d'un système d'alimentation de solvant modèle 6000A, d'un injecteur Universal modèle 6 UK, et d'un détecteur à longueur d'onde variable modèle 450. On a utilisé des colonnes de

Zorbax-Sil (Phenomenex) (6,2 mm x 25 cm et l0 mm x 25 cm).

Systèmes solvants: A: 3% de 2-propanol dans de l'hexane;

B: 2% de 2-propanol dans de l'hexane; C: 6% de 2-

propanol dans de l'hexane; D: 10% de 2-propanol dans de l'hexane; E: 20% de 2-propanol dans de l'hexane. On a utilisé des cartouches de gel de silice Sep-Pak (Waters Associates) pour la filtration préalable des échantillons

de HPLC.

Les spectres de masse par choc électronique (SM) ont été enregistrés à 70 eV avec un spectromètre de masse Kratos MS-50 TC muni d'un système d'acquisition de

données Kratos DS-55.

Les spectres d'absorption dans l'ultraviolet (UV)

ont été -enregistrés à l'aide d'un spectrophotomètre UV-

visible Hitachi Modèle 60-100.

On a enregistré les spectres infrarouges sur un spectromètre Nicolet MX-1 FT-IR, en utilisant des films des substances huileuses ou de solutions dans le

tétrachlorure de carbone.

On a enregistré les spectres de résonance magnétique du proton (RMN'H) avec des spectromètres Bruker 270, 400 ou 500 MHz dans des solutions dans CDCl3, contenant du tétraméthylsilane (TMS) en guise de

référence interne.

Exemple 1

Synthèse du 22-aldéhyde Drotégé (Composé 18, schéma 1) On prépare cet aldéhyde selon le mode opératoire

général de Kutner et al. (Tet. Letters 28, 6129-32, 1987).

On dissout 10 g de composé (1) dans 420 ml de KOH à 5% dans le méthanol, et on agite la solution à température ambiante pendant 15 minutes, jusqu'à ce qu'on ne détecte plus de produit de départ par CCM (système solvant A). A cette solution, on ajoute goutte à goutte, sous agitation, 160 ml d'acide sulfurique à 10% dans le méthanol, et la suspension résultante est diluée avec 400 ml d'acide sulfurique à 1% dans le méthanol. On chauffe le mélange au reflux pendant 48 heures pour achever l'estérification (CCM, système solvant A). On extrait le composé (2), l'ester, avec de l'acétate d'éthyle. On lave la phase organique avec une solution de NaHCO3 à 5%, une solution' saturée de NaCl, et on la sèche sur du sulfate de magnésium. Le produit, le composé (2) (9,0 g, 88%) est

utilisé pour l'étape suivante sans autre purification.

A une solution du composé (2) (4,4 g, 12 mmoles) dans 135 ml de diméthylformamide (DMF) anhydre, on ajoute de l'imidazole (3,6 g, 52,8 mmoles), puis du chlorure de tert-butyldiméthylsilyle (4,0 g, 26,4 mmoles) . On agite la solution à la température ambiante pendant 5 minutes, jusqu'à ce qu'il se forme un précipité volumineux, puis on poursuit l'agitation pendant 15 minutes supplémentaires. On extrait le mélange réactionnel à l'hexane. (400 ml), on le lave à l'eau, puis avec une solution saturée de NaCl, et on le sèche sur du sulfate de magnésium. L'évaporation du solvant fournit un produit pur en CCM (système solvant B) , le composé (3) (5,3 g, 91%), que l'on utilise pour l'étape suivante sans autre purification. Un échantillon analytique est obtenu par chromatographie éclair, avec 2% d'acétate d'éthyle dans

de l'hexane.

Un mélange de composé (3) (1,0 g, 2,1 mmoles), de dibromantine (0,42 g, 1, 5 mmole) et de bicarbonate de sodium anhydre (0,91 g, 10 Lmmoles) dans 20 ml d'hexane est chauffé au reflux dans une atmosphère d'azote, pendant 30 minutes, jusqu'à ce qu'on ne détecte plus de produit de départ (3) (CCM, système C). On élimine le précipité par filtration, et on évapore la solution à sec sous pression réduite. On redissout le résidu dans 5 ml de THF anhydre, on ajoute du bromure de tétrabutylammonium (0,06 g, 0,19 mmole), et on agite le mélange à la température ambiante pendant 30 minutes, sous azote. On ajoute ensuite une solution de fluorure de tétrabutylammonium (10 ml, 1 M dans THF), puis 0,7 ml de s-collidine, et le mélange est agité sous azote à la température ambiante pendant 1 heure. Une autre portion de 5 ml de solution de fluorure de tétrabutylammonium est

ajoutée, et l'agitation est poursuivie pendant 3 heures.

On ajoute 50 ml d'éther, et on lave la phase organique à l'eau, avec HCl 1N froid, avec une solution à 10% de NaHCO3, puis on la sèche sur du sulfate de magnésium anhydre. Le produit, le composé (4), dissous dans du benzène, est chromatographié sur du gel de silice, 70-230 mesh (30 g). Le composé (4) (0,44 g, 58%) est élué avec de l'acétate d'éthyle dans de l'hexane. Un échantillon analytique est obtenu par HPLC (système A, Rv 77 ml): IR

(film) 1737, 1604, 1495, 1082, 1030 cm-'; UV (3% de 2-

propanol dans l'hexane) X.ax 262 nm (e7000), max 272 nm (E 9800), t max 282 nm (E 10500), À max 293 (e 6000);

RMNIH (CDC13) 8 0,54 (3H, s, 18-CH3), 0,94 (3H, s, 19-

CH3), 1,22 (3H, d, J=6 Hz, 2-CH3), 3,6 (1H, m., 3-H), 3,68 (3H, s, CO2CH3) , 5,42 (1H, m, 6-H), 5,58 (1H, m, 7-H) SM m/z (intensité relative) 358 (61), 340 (12), 325 (100),

299 (68), 271 (7), 253 (17), 237 (26), 211 (27), 143 (72),

119 (35).

Une solution du composé (4) (830 mg, 2,3 mmoles) dans 350 ml d'un mélange benzène/éther éthylique 1:4 (v/v) est irradiée, sous agitation, sous azote et dans une cellule d'immersion en quartz, refroidie à l'eau et munie d'un barboteur d'azote et d'un filtre Vycor, à l'aide d'une lampe UV à moyenne pression Hanovia 608A38, pendant 40 minutes (4 fois 10 minutes). On surveille la réaction par HPLC, en utilisant du 2-propanol à 2% dans de l'hexane, à 265 nm. On évapore la solution sou_ pression réduite, on redissout le résidu dans 100 ml d'éthanol absolu, et on chauffe au reflux sous atmosphère d'azote pendant 3 heures. Puis on concentre la solution, -on redissout dans 1 ml de mélange d'acétate d'éthyle (10%) et d'hexane, et on opère une chromatographie sur un gel de silice 70-230 mesh (30 g). Le vitamine-ester (5) (298 mg), 36%). est élué à l'aide d'un mélange de 15% d'acétate d'éthyle dans de l'hexane. Un échantillon analytique est obtenu par HPLC (système B, Rv 74 ml): IR (film) 1738 cm-1; UV (EtOH) Xsax 264 nm, Xain 228 nm; RMN'H (CDC13) S: 0, 56 (3H, s, 18-CH3), 1,20 (3H, d, J=7 Hz, 21-CH3), 3,66 (3H, s, CO2CH3), 3, 95 (1H, m, 3-H), 4,80(1H, d, J=1,2 Hz,19Z-H), 5,05 (1H, d, J=1,2 Hz, 19E- H), 6,03 (1H, d,- J=11 Hz, 7-H), 6,23 (1H, d, J=11 Hz, 6-H); SM m/z (intensité relative),M+ 358 (45),340 (9), 325 (45),

299 (22), 253 (19), 237 (18), 136 (60),118 (100).

Une solution de composé (5) (10 mg, 0,028 mmole) dans 5 ml de toluène anhydre est refroidie sous azote à -70 C dans un bain d'acétone et de carboglace. On ajoute à cette solution, goutte à goutte et tout en agitant, de l'hydrure de diisobutylaluminium (DIBAL-H), 50 pl, solution à 25% dans le toluène, 0,088 mmole). On agite le mélange réactionnel à -70C pendant 10 minutes, puis on ajoute lentement 2 ml de méthanol. On laisse le mélange se réchauffer jusqu'à la température ambiante, on le dilue avec de l'éther éthylique et on le lave avec HCL à %, une solution de NaHCO3 à 5%, de l'eau et une solution saturée de NaCl, puis on le sèche sur sulfate de magnésium anhydre. Une chromatographie sur gel de silice (15% d'acétate d'éthyle dans de l'hexane) donne le composé (6) (4,9 mg, 54%), qui présente les données spectroscopiques suivantes: SM: 328 (M+, 29), 310 (5),

295 (31), 269 (11), 253 (6), 136 (47), 118 (86),.29 (100);

RMN1H (CDC13) 8: 0,59 (3H, s, 18-CH3), 1,14 (3H, d, J=7 Hz, 21-CH3), 4,0 (1H, m, 3-H), 4,81 (1H, d, J=1,2 Hz, 19-E-H), 5,05 (1H, d, J=1,2 Hz, 19ZH), 6,05 (1H, d, J=11 Hz,7-H), 6,23 (1H, d, J=11 Hz, 6-H), 9,58 (1H, d, J=3,8 Hz, 22-H). Une élution ultérieure de la colonne de gel de

silice avec 5% de 2-propanol dans de l'hexane donne le 22-

alcool, le composé (7) (2,7 mg, 29%).

On convertit le composé (5) en le composé (8), en utilisant du chlorure de p-toluènesulfonyle, dans de la pyridine, à 4'C, pendant 20 heures. Le composé (8) (102 mg, 0,2 mmole), dissous dans 2 ml de dichlorométhane anhydre, est ajouté à une solution de 250 mg de bicarbonate de potassium anhydre dans 15 ml de méthanol, sous agitation et à 55'C. Le mélange est agité sous azote à 55C pendant 24 heures. Les solvants sont ensuite chassés sous pression réduite, et le résidu est extrait à l'éther. La phase organique est lavée à l'eau, puis séchée sur du sulfate de magnésium anhydre. Le produit, le composé (.9), est purifié par chromatographie sur gel de silice, avec 20% d'acétate d'éthyle dans de l'hexane

(50 ing, 68%).

On ajoute de l'hydroperoxyde de tert-butyle (112 pl, solution 3,0 M dans le toluène, 0,34 mmole) à une suspension de dioxyde de sélénium (9 mg, 0, 8 mmole) dans 2 ml de chlorure de méthylène anhydre. On agite le mélange à la température ambiante sous azote, jusqu'à ce qu'il se forme une solution limpide. On ajoute alors de -la pyridine anhydre (12 pl, 0,15 mmole), puis le composé (9) (50 mg), dissous dans 2 ml de dichlorométhane anhydre. On agite le mélange sous azote pendant 30 minutes. On ajoute 2 ml d'une solution froide à 10% de bicarbonate de sodium, et on extrait le mélange à l'éther. On lave la phase organique avec une solution' froide à 10% de bicarbonate de sodium, puis avec de l'eau glacée, et on la sèche sur du sulfate de magnésium anhydre. Une chromatographie sur gel de silice (10-20% d'acétate d'éthyle dans l'hexane) donne 12,5 mg du composé (10). Le produit est alors immédiatement dissous dans 0,5 ml d'acide acétique cristallisable, et on chauffe la solution à 55'C, tout en agitant, sous azote, pendant 15 minutes. On verse le mélange réactionnel sur de la glace, on extrait à l'éther et on lave avec une solution saturée de bicarbonate de sodium, refroidie par de la glace. Les extraits éthérés réunis sont lavés à l'eau et séchés sur sulfate de magnésium anhydre. Des. échantillons analytiques des isomères (5Z, 7E) et (5E, 7E), les composés (11) et (12), respectivement, sont obtenus par

HPLC préparative en un rapport de 2,5:1.

Composé 11: HPLC, Rv 68 ml, UV (EtOH) omax 264 nm, X.i. 227 nm, A264 = 2, 07; RMN1H (CDC13) 8, 0,56 (3H, s, A227

18-CH3), 1,20 (3H, d, J=6,5 Hz, 21-CH3), 2,04 (3H, s,.3e-

acétyle), 3,66 (3H, s, 22-CO2CH3), 4,4 (1H, m, 1-H), 5,2 (1H, m, 3-H), 5, 01 (1H, s large, 19E-H), 5,34 (1H, s large, 19Z-H), 6,01 (1H, d, J=10 Hz, 7-H), 6,33 (1H, d, J=10 Hz, 6-H); SM m/z (intensité relative), 416 (M+l, 4),

356 (100), 338 (21), 251 (13), 134 (95).

Composé 12: HPLC, Rv 78 ml; UV (EtOH) X.ax 267 nm, X min 227 nm, A267 = 3, 51; RMNIH (CDC13) 8, 0,56 (3H, s, A227

18-CH3), 1,20 (3H, d, J=6,5 Hz, 21-CH3), 2,04 (3H, s, 30-

OAc), 3,66 (3H, s, 22-CO2CH3), 4,5 (1H, m, 1-H), 5,3 (1H, m, 3-H), 4,99 (1H, s large, 19E-H), 5,13 (1H, s large, 19Z-H), 5,81 (1H, d, J=10 Hz, 7H), 6,56 (1H, d, J=10 Hz, 6-H). Pour des préparations à grande échelle, les isomères (11l) et (12) peuvent aussi être efficacement et avantageusement séparés par le mode opératoire à

l'anhydride maléique, décrit dans le brevet US-4.554.106.

On ajoute de l'hydrure de diisobutylaluminium (15 Pl, solution 1,5 M dans du toluène) sous agitation à une solution de 2 mg de composé (11) dans 0, 5 ml de toluène anhydre, à -70'C, sous azote. On agite le mélange à -70C pendant 10 minutes, puis on ajoute lentement 0,2 ml de

méthanol afin de décomposer le complexe organométallique.

On réchauffe le mélange jusqu'à la température ambiante, puis on l'extrait avec de l'éther éthylique. On lave la phase organique avec de l'eau, puis on la sèche sur du sulfate de magnésium anhydre. Une HPLC préparative, à l'aide du système solvant E, donne le composé (13) et le composé (14). Le composé (13) présente les données spectrales suivantes: 344 (M+, 22), 326 (.13), 311 (.2), 285 (4), 269 (4), 152 (29), 134 (100); RMNIH (CDCl3) 8, 0,59 (3H, s, 18-CH3), 1,15 (3H, d, J=7 Hz, 21-CH3), 4,2 (1H,m, 3-H), 4,4 (1H, m, 1-H), 4,99 (1H, d, J=1,2 Hz, 19Z- H), 5,31 (1H, d, J=1,2 Hz, 19E-H), 6,02 (1H, d, J=11 Hz, 7-H), 6,36 (1H, d, J=11 Hz, 6- H), 9,56 (1H, d, J=4 Hz,

22-H).

On ajoute une solution 0,1 N de KOH dans du méthanol (10 ml) à une solution agitée de composé (11) %

(100 mg, 0,24 mmole) dans de l'éther éthylique (10 ml).

La solution obtenue est agitée à température ambiante

pendant 90 minutes, jusqu'à ce que l'on ne détecte plus-

de produit de départ par CCM (système solvant B). On isole le composé (15) par des- procédés courants d'extraction (acétate d'éthyle, solution saturée de NaCli sulfate de magnésium anhydre), pour obtenir une huile

incolore (86,2 mg, 96%).

Un mélange d'imidazole (250 mg, 3,6 mmoles) et de chlorure de tertbutyldiméthylsilyle (250 mg, 1,6 mmole) dans du DMF (2 ml) est ajouté à une solution agitée de composé (15) (86,2 mg, 0,23 mmole) dans 4 ml de diméthylformamide. Le mélange homogène obtenu est agité pendant 15 minutes à 55'C, jusqu'à ce que l'on n.e détecte plus de produit de départ par CCM (système solvant B). On isole le produit par extraction à l'hexane du mélange réactionnel. L'extrait organique est lavé avec de la saumure, puis séché sur sulfate de magnésium anhydre. La solution de produit brut dans l'hexane est filtrée sur une cartouche de gel de silice Sep-Pak, ce qui donne le composé (16) (136 mg, 98%). IR (film) 2974, 2930, 1736, 1447, 1286, 1258, 1150, 1085 cm-'; UV (hexane),X max 264 nm, >Xin 227, A264 = 1,91; RMN1H (CDC13), 8 0,07 (12H, s, A227 Si(CH3)2), 0,55 (3H, s, 18-CH3), 0,86 (18H, s, C(CH3)3), 1,20 (3H, d, J=6,8 Hz, 21-CH3), 3,65 (3H, s, O-CH3), 4,18 (1H, m, 3-H), 4,36 (1H, m, 1-H), 4,84 (1H, d, J=1,2 Hz, 19Z-H), 5,16 (1H, d, J=1,2 Hz, 19E-H), 5,96 (1H, d, J= 11,2 Hz, 7-H), 6,19 (1H, d, J=11,2 Hz, 6-H); SM m/z (intensités rapportées à m/e 248) 602 (M+, 10), 470 (59),

413 (7), 338 (10), 248 (100).

On ajoute de l'hydrure de lithium-aluminium (25 mg, 0,65 mmole) à une solution agitée de composé (16) (136,2 mg, 0,23 mmole) dans 5 ml de THF anhydre, sous argon, à 0'C. La suspension est agitée pendant 15 minutes à 0 C, et on décompose l'excès d'hydrure de lithium-aluminium par addition goutte à goutte d'une solution à 10% d'eau dans THF. On dilue la suspension avec 10 ml de THF, et on poursuit l'agitation pendant 15 minutes supplémentaires à température ambiante. On isole le produit par extraction usuelle à l'acétate d'éthyle. On obtient le composé (17) sous forme d'une huile incolore (118,4 mg) avec un rendement de 91%. IR (film) 3450, 2952, 2886, 1447, 1258, 1105, 1085, 834 cm-; UV (EtOH)X.x 264 nm,X. in 227 nm, A264 = 1,57; RMN1H (CDCl3) 8 0,00 (12H, s, Si-CH3), 0,53 A227 (3H, s, 18-CH3), 0,85 (18H, s, Si-C(CH3)3), 1,04 (3H, d,

J=6,4 fz, 21-CH3), 3,37 et 3,63 (1H et 1H, chacun m, 22-

CH2), 4,17 (1H, m, 3-H), 4,35 (1H, m, 1-H), 4,84 (1H, s large, 19Z-H), 5, 16 (1H, s large, 19E-H), 6,00 (1H, d, J=12,2 Hz, 7-H), 6,21 (1H, d, J=12, 2 Hz, 6-H); SM m/z (intensités rapportées à m/z 248), 574 (M+, 17), 442 (67),

383 (11), 308 (17), 248 (100).

On ajoute goutte à goutte une solution de chlorure d'oxalyle (30 Pil, 0, 34 mmole) dans 0,5 ml de dichlorométhane, à une solution agitée de DMSO (50 pl, 0,7 mmole) dans 3 ml de dichlorométhane, à -60'C et sous azote. On agite la solution obtenue à -60'C pendant 10 minutes, et on ajoute lentement une solution de composé (17) (27 mg, 0,05 mmole) dans 1 ml de dichlorométhane. Le mélange est agité pendant 30 minutes à -60'C. Puis on ajoute 0,2 ml de triéthylamine, et la solution est agitée pendant 5 minutes supplémentaires. On extrait le produit, le composé (18), avec de l'éther éthylique et on lave l'extrait organique avec une solution saturée de NaCl, puis on le sèche sur sulfate de magnésium anhydre. La filtration sur gel de silicoe Sep-Pak donne un produit pur en CCM (17 mg, 62%). IR (film) 2954, 2929, 2884, 2857, 1727, 1472, 1375, 1256, 1085, 909, 880, 835 cm--; RMN (CHCj.3) 8 0,00 (12H, s, Si-CH3), 0,60 (3H, s, 18-CH3) , 0,88 (18H, s, Si-C(CH3)3), 1,11 (3H, d, J=6,9 Hz, 21-CH3), 4,23 (1H, m, 3-H), 4,43 (1H, m, 1-H), 4,93 (1H, s large, 19Z-H), 5,19 (1H, s large, 19E-H), 6,07 (1H, d, J=10,0 Hz,7-H), 6,26 (1H, d, J=10,0 Hz, 6-H),- 9,54 (lH,d, J=3 Hz, 22-H); UV (hexane) X.ax 264 nm, XAin 227 nm, A264 = 1,9; SM m/z (intensités rapportées à. m/z 248) A227

572 (M+, 13), 440 (53), 383 (11), 308 (14), 248 (100);

masse exacte calculée pour C34H6003Si2: 572,4081,

trouvée: 572,4117.

On obtient un rendement amélioré en aldéhyde (18) quand l'étape. d'oxydation est effectuée dans les conditions suivantes. On ajoute goutte à goutte une solution de 15 pl (0,17 mmole) de chlorure d'oxalyle dans 0, 75 ml de dichlorométhane anhydre, à une solution agitée de 25 pl (0,36 mmole) de diméthylsulfoxyde dans 0,25 ml de dichlorométhane anhydre, à 60 C et sous une atmosphère d'argon. Après avoir agité le mélange pendant 10 minutes à -60 C, on ajoute lentement une solution de ,3 mg (0,035mmole) de l'alcool (17) dans 0,5 ml de dichlorométhane anhydre, et on rince le flacon avec une quantité supplémentaire de 0,2 ml de dichlorométhane anhydre. On agite le-mélange pendant 30 minutes à -60'C, et on ajoute 0,3 ml (2,15 mmoles) de triêthylamine à -60*C. On agite le mélange pendant 5 minutes, on le réchauffe jusqu'à 0'C, et on l'extrait à l'éther. On lave la phase éthérée avec de la saumure, puis on la sèche sur MgSO4. La filtration sur gel de silice Sep-Pak donne le composé (18) sous forme d'une huile incolore que l'on purifie par HPLC (Zorbax-Sil 9,4 x 25 cm, 10% EtOAC dans l'hexane) pour obtenir l'aldéhyde pur (18) (19 mg, 96%);

on ne récupère qu'une trace d'alcool (0,12 mg).

Exemple 2

Fixation de chaîne latérale: synthèse de la 24-

dihomo-la,25-dihvdroxy-22-déhydrovitamine D3 (Composé 25, Schéma 2) (a) Préparation de l'hydroxysulfone (19)

A une solution agitée de 31 mg (84 pmoles) de 2-

méthyl-6-(phénylsulfonyle)-2-(triéthylsilyloxy)-hexane (composé 31, Schéma 3) dans 300 pil de tétrahydrofuranne anhydre (contenant de la 1,10phénantroline comme indicateur), dans une atmosphère d'argon, à -78 C, on ajoute 13 pl (90 pmoles) de diisopropylamine, puis 70 pl de n-BuLi (1,30 M dans l'hexane) (91 Mmoles). La solution est agitée sous atmosphère d'argon à -78'C pendant 30 minutes, puis on ajoute 6 mg du 22-aldéhyde (composé 18) (10 pmoles) dans 300 pl de tétrahydrofuranne anhydre, puis on agite à -78'C pendant 1 heure. On décompose le mélange par addition de 1 ml d'une solution saturée de NH4Cl, on réchauffe à 0'C, et on extrait & l'acétate d'éthyle. L'extrait d'acétate d'éthyle est lavé à l'eau et avec de la saumure, puis séché sur MgSO4 anhydre,

filtré et évaporé. Une HPLCpréparative (colonne Zorbax-

Sil 9,6 x 25 cm, système solvant: 10% d'acétate d'éthyle dans l'hexane) donne 0,6 mg d'aldéhyde n'ayant pas réagi et 6,6 mg de l'hydroxysulfone (19), sous forme d'un mélange d'épimères (77% de rendement).' (b) 24dihomo-la,25-dihydroxy-22-déhydrovitamine D3 (25) Une solution saturée de Na2HPO4 dans du méthanol (1,0 ml) est ajoutée à une solution agitée d'hydroxysulfone (19) (3,3 mg) dans 1,0 ml de tétrahydrofuranne anhydre, puis on ajoute 160 mg de Na2HPO4 anhydre en poudre. On agite le mélange sous argon pendant 30 minutes et on le refroidit à 0'C. On ajoute alors environ 400 mg d'un amalgame de sodium à 5% fraîchement préparé, et on agite le mélange pendant 16 heures à 5 C. On dilue le mélange avec 5 ml d'hexane, et on poursuit l'agitation pendant 15 minutes. On laisse les solvants décanter, et on lave le produit solide à l'hexane (3 fois 5 ml). On ajoute de la glace et une solution saturée de NaCl, aux solutions organiques réunies. On sépare la phase organique, et on la fait' passer sur une cartouche de Sep-Pak, dans de l'hexane. La

purification par HPLC donne 2,0 mg (71%) de L22-24-dihomo-

1,25-(OH)2D3 protégée (21), et une petite quantité du produit 22hydroxylé (22) (Zorbax-Sil, colonne de 9,4 x cm, 10% de EtOAc dans l'hexane). On dissout 2 mg du triol protégé (21) dans 1,0 ml de THF anhydre, et on ajoute à cette solution du fluorure de tétrabutylammonium en solution dans THF (50 pl., solution 1 M). On agite le mélange sous argon pendant 1 heure à 50'C. On ajoute ensuite 8 ml d'éther, et on lave la phase organique avec une solution saturée de NaCl. Les solvants sont chassés, et le résidu est dissous dans 10% de 2-propanol dans l'hexane, puis on filtre la solution sur du gel de silice

Sep-Pak. La HPLC (20% de 2-propanol dans l'hexane, Zorbax-

Sil 9,4 x 25 cm) donne 0,6 mg du produit souhaité, le composé dihomo (25). UV (EtOH Bxax 264 nm, Xain 228 nm, A264 = 1,87; RMN'H (CDC13), 0,55 (3H, s, 18-CHa), 1,00 A228 (3H, d, J=6,6 Hz, 21-CH3), 1,23 (6H, s, 26,27-CH3) 4,23

(1H, m, 3-H), 4,43 (1H, m, 1-H), 5,00 (1H, s large, 19Z-

H), 5,32 (1H, s large, 19E-H), 5,29 (2H, m, 22H et 23H), 6,01 (1H, d, J=11,3 Hz, 7-H); SM m/z (intensité relative) 442 (M+, 15), 424 (23), 406 (33), 391 (7), 287

(11), 285 (10), 269 (27), 251 (23), 152 (33), 134 (100),

116 (6), 59 (20); masse exacte calculée pour C29H4603:

442,3446, trouvée: 442,3441.

Exemple 3

Fixation de chaîne latérale: synthèse de là 24-trihomo-la,25-dihYdroxv-22déhvdrovitamine D3 (Composé 26,Schéma 2) (a) Préparation de l'hydroxysulfone (20)

A une solution agitée de 58 mg (151 pmoles) de 2-

méthyl-7-(phénylsulfonyl)-2-(triéthylsilyloxy)-heptane (composé 35, Schéma 3) dans 500 pl de tétrahydrofuranne anhydre (contenant de la 1,10phénantroline comme indicateur), on ajout=, sous atmosphère d'argon et à 78'C, 23 pl (160 pmoles) de diisopropylamine, puis 106 pl de n-BuLi(1,5 M dans l'hexane, 160 pmoles). On agite la solution sous atmosphère d'argon à -78*C pendant 30 minutes, puis on ajoute 7 mg de 22-aldéhyde (composé 18, 12 pmoles) dans 300 pl de tétrahydrofuranne anhydre, et on agite pendant 1 heure. On décompose le mélange à cette température par addition de 1 ml d'une solution saturée de NH4Cl, on réchauffe à 0'C et on extrait à l'acétate d'éthyle. On lave l'extrait d'acétate d'éthyle à l'eau et avec de la saumure, on le sèche sur MgSO4 anhydre, on le filtre et on l'évapore. Une HPLC préparative (Zorbax-Sil 9,4 x 25 cm, système solvant: 10% d'acétate d'éthyle dans l'hexane) donne 0,4 mg d'aldéhyde n'ayant pas réagi et 7,5 mg de l'hydroxysulfone (20) sous- forme d'un

mélange d'épimères (78%).

(b) 24-trihomo-1,25-dihydroxy-22-déhydrovitamine D3 (26) Une solution saturée de Na2HPO4 dans de l'éthanol (1,0 ml) est ajoutée à une solution agitée de l'hydroxysulfone (20) (7,5 mg) dans 1,0 ml de tétrahydrofuranne anhydre, puis on ajoute 160 mg de Na2HP04 anhydre en poudre. Le mélange est agité sous argon pendant 30 minutes et refroidi à 0'C. On ajoute alors environ 400 mg d'un amalgame de sodium à 5% fraîchement prépare, et on agite le mélange pendant 16 heures à 5'C. On dilue le mélange avec 5 ml d'hexane, et on poursuit l'agitation pendant 15 minutes. On laisse les solvants décanter, et on lave le produit solide à l'hexane (3 fois 5 ml). Les phases organiques réunies sont lavées avec de la saumure, séparées, séchées et évaporées. On fait passer le résidu sur une cartouche de SepPak dans 10% d'acétate d'éthyle dans l'hexane. La

purification par HPLC donne 2,12. mg de A22-24-trihomo-

1,25-(OH)2D3 protégée (23) et 1,33 mg de produit 22-

hydroxylé (24) (colonne Zorbax-Sil 9,4 x 25 cm, 10% d'acétate d'éthyle dans de l'hexane). On dissout 2,1 mg du composé 23 dans 1,0 ml de tétrahydrofuranne anhydre, et on ajoute à cette solution 50 1pl d'une solution 1 M de

fluorure de tétrabutylammonium dans du tétrahydrofuranne.

On agite le mélange sous argon pendant 1 heure à 50'C. On ajoute ensuite de l'éther, et on lave la phase organique avec de la saumure. La phase éthérée est séchée sur MgSO4 anhydre, filtrée et évaporée. Le résidu est dissous dans % de 2-propanol dans l'hexane, et on fait passer cette solution sur un gel de silice Sep-Pak. La purification par HPLC (20% de 2propanol dans de l'hexane, colonne Zorbax-Sil 9,4 x 25 cm) donne 0,8 mg du produit trihomo désiré, le composé 26. UV (EtOH) Xmax 264 nm, Xain 228, A264 = 1,81; RMN1H: (CDCl3) 0,56 (3H, s, 18-CH3), 1,00 A228 (3H, d, J=6, 6 Hz, 21-CH3), 1,23 (6H, s, 26,27-CH3), 4,23

(1H, m, 3-H), 4,43 (1H, m, 1-H), 5,00 (1H, s large, 19Z-

H), 5,32 (1H, s large, 19E-H), 5,29 (2H, m, 22H et 23H), 6,01 (1H, d, J=11,3 Hz, 7-H); SM m/z (intensité relative) 456 (M+) (11) 438 (50), 420 (30), 402 (8), 287

(10), 269 (23), 251 (23), 152 (35), 134 (100).

Exemple 4

Synthèse des sulfones pour chaînes latérales (Schéma 3) (a) Préparation de la sulfone__ __pour chaîne latérales (31)) Une solution de chlorure de 4-chlorovaléryle 27 (Aldrich; 3 g, 19,2 mmoles) dans du THF anhydre (25 ml) est ajoutée goutte à goutte, sous vigoureuse agitation, en 30 minutes et sous argon, à une solution de bromure de méthylmagnésium (12,9 ml d'une solution 3 M dans l'éther) dans 25 ml de THF anhydre, à -10'C. On laisse ensuite le mélange réactionnel se réchauffer jusqu'à la température ambiante en l'espace de 2 heures, puis on arrête la réaction avec de l'eau, et on neutralise avec de l'acide chlorhydrique dilué. On extrait le mélange à l'éther, on lave les phases organiques réunies avec de l'eau et on les sèche avec du sulfate de sodium. Après avoir chassé le solvant, on distille le résidu sous vide pour obtenir le chloro-alcool 28, qui se présente comme un liquide incolore (2,1 g, 70%). Le chloro-alcool 28 (1,5 g, 10 mmoles) en solution dans du diméthylformamide anhydre (5 ml) est ensuite ajouté à une solution agitée de thiophénol (1,32 g, 12 mmoles) et de t-butylate de potassium (1,32 g, 11,3 mmoles) dans du diméthyl.ormamide anhydre (25 ml). On agite le mélange réactionnel à la température ambiante pendant une nuit, et on partage la solution entre du dichlorométhane et de l'eau. On lave la phase organique avec une solution aqueuse de carbonate de sodium, puis à l'eau, et on la sèche sur du sulfate de magnésium anhydre. On évapore le solvant sous vide, et on purifie l'huile brute par chromatographie éclair sur gel de silice, à l'aide d'un mélange d'hexane et d'acétate d'éthyle. On obtient le sulfure 29 (2,2 g, 98%) sous forme d'un liquide incolore. On dissout ensuite le sulfure 29 (1,01 g, 4,5 mmoles) dans 40 ml de dichlorométhane anhydre, et on ajouté par portions 2,5 g

d'acide 3-chloroperbenzoique (11,6 mmoles; Aldrich 80-

%), tout en agitant et en refroidissant éventuellement.

On agite le mélange réactionnel pendant 2 heures, puis on arrête la réaction avec du bicarbonate de sodium en solution à 10%. Les extraits organiques réunis sont lavés avec du sulfite de sodium en solution aqueuse et avec de la saumure, puis séchés sur du sulfate de magnésium. Le solvant est chassé sous vide, et l'huile brute est purifiée par chromatographie éclair sur gel de silice, avec des mélanges d'hexane et d'acétate d'éthyle, ce qui donne la sulfone 30 (1,1g, 97%) sous forme d'un liquide incolore. A une solution agitée de sulfone 30 (1,3 g, 5,1 mmoles) et d'imidazole (1,5 g, 22,7 mmoles) dans du diméthylformamide anhydre (50 ml), on ajoute du chlorure de triéthylsilyle (1,15 g, 7,7 mmoles). On maintient le mélange réactionnel à la température ambiante pendant 2 heures, puis on le dilue avec du dichlorométhane. On lave le mélange avec une solution aqueuse de chlorure d'ammonium, puis à l'eau. La phase organique est séchée

sur sulfate de sodium, et le solvant est chassé sous vide.

Le résidu est purifié par chromatographie éclair sur gel de silice. On élue d'abord, avec de l'hexane, l'hexaéthyldisiloxane. On élue la sulfone protégée par un groupe triéthylsilyle (composé 31, 1,8 g, 97%) avec un mélange 9:1 d'hexane/acétate d'éthyle, sous forme d'un liquide incolore: IR (pur): 3045, 2940, 1440, 1360, 1130, 1020 cm-1; RMNIH (400 MHz, CDC13) 8 0,518 (6H, q, J=6,2 Hz, Si-CHz), 0,899 (9H, t, J=6,2 Hz, Si-C-CH3), 1, 142 (6H, s, CH3), 1,307-1,462 (4H, m), 1,655-1,738 (2H, m,

H-4), 3,080-3,122 (2H, m, H-2), 7,567 (2H, t, J=6,8 Hz, H-

aryle méta), 7,648 (1H, t, J=6,8 Hz, H-aryle para), 7,916 (2H, d, J=6,83 Hz, H-aryle ortho); SM (EI, 70 eV):m/z (intensité relative) 372 (M+, 2), 341 (100), 229.(2), 227

(18), 173 (24), 103 (22), 75 (45), 55 (33).

(b) Préparation de la sulfone pour chaîne latérale (35) Une solution de chlorure de 6-bromohexanoyle (32) (3,8 g, 2,8 ml, 18 mmoles) dans du tétrahydrofuranne anhydre (10 ml) est ajoutée goutte à goutte, sous vigoureuse agitation, en 15-20 minutes et sous atmosphère d'argon, à une solution de bromure de méthylmagnésium (14 ml d'une solution 3 M dans l'éther) dans du tétrahydrofuranne anhydre (15 ml), à -10'C. Le mélange est agité à la température ambiante pendant 2 heures, refroidi à 0'C, et soigneusement décomposé avec de l'acide chlorhydrique dilué 1:1. Le mélange est extrait à l'éther, et les phases organiques réunies sont lavées à l'eau, séchées sur sulfate de magnésium anhydre, et évaporées pour donner le bromo-alcool 33 sous forme d'une huile incolore (3,6 g, 94%). Le bromo-alcool (3,4 g, 16 mmoles) est traité avec du benzènesulfinate de sodium (3,3 g, 20 mmoles) dans du diméthylformamide anhydre à 70'C pendant 4 heures 1/2. On verse le mélange sur de la glace, on extrait avec du dichlorométhane, on lave avec du HCl 1 N, avec de l'eau, avec une solution à 10% de NaHCO3, on sèche sur MgSO4 anhydre, on filtre et on évapore pour obtenir la sulfone 34 qui est purifiée par chromatographie éclair sur gel de silice et éluée avec un mélange & 40- 50% d'acétate d'éthyle dans de l'hexane, ce qui donne de la sulfone contenant un peu de l'ester sulfinate correspondant (4,18

g, 98%) SM, m/z 270 (M+), 255 (M±15), 77, 59.

A une solution agitée de la sulfone (34) (4 g, 14 mmoles) et d'imidazole (3,8 g, 55 mmoles) dans du diméthylformamide anhydre (13 ml), on ajoute du chlorure de triéthylsilyle (4,6 g, 5,1 ml, 30 mmoles). On agite le mélange réactionnel à la température ambiante pendant 2 heures, puis on le verse sur de l'eau glacée, on extrait à l'éther, on sèche sur MgSO4 anhydre, on filtre et on

évapore. On purifie le résidu par chromatographie éclair.

On élue d'abord l'hexaéthyldisiloxane avec l'hexane; avec 3% d'acétate d'éthyle dans de l'hexane, on élue l'ester sulfinate avec un peu de la sulfone, et avec 10% d'acétate d'éthyle dans de l'hexane, on élue la sulfone protégée (35) pure (3,4 g, 60%). Analyse calculée pour C2o0H3603SSi: C, 62,45%; H, 9,43%; S, 38,34%; trouvé: C,61,97%; H, 9,45%; S, 8,33%. SM, m/z (intensité relative) 355 (100) (M±29), 227 (15), 173 (35), 103 (43), (95), 55 (23), RMN (400 MHz, CDC13), 0,54 (6H, q, J=7 Hz, Si-CH2), 0,94 (9H, t, J=8 Hz, Si-C-CH3), 1,15 (6H, s, CH3), 1,31-1,36 (4H, m), 3,08-3,12 (2H, m, H=2), 7,57 (2H, t, J=6,8 Hz, H-aryle méta), 7,66 (1H, t), H-aryle para),

7,92 (2H, d, J=6,8 Hz, H-aryle ortho).

Activité biologique On teste l'activité de différentiation et l'activité calcémique du nouvel homologue (25) en utilisant des procédés d'essais établis, connus dans la technique. Les modes opératoires d'essai et les résultats obtenus sont décrits de façon plus détaillée dans les

exemples suivants.

Exemple 5

Mesure de l'activité de différentiation du composé dihomo (25) dans les cellules HL-60 (Tableau 1) On évalue le degré de différentiation de cellules HL-60 (cellules de leucémie humaine) en réponse à des composés d'essai, selon trois modes différents d'évaluation: diminution des NBT, phagocytose et activité d'estérase. On réalise les deux premiers modes d'évaluation selon les procédés généraux donnés par DeLuca et al.dans le brevet US-4.717.721. Le troisième mode d'évaluation, qui consiste en la mesure de l'activité non spécifique d'acide-estérase en qualité de marqueur de la différentiation, est réalisé selon le - procédé donné dans la trousse Sigma n' 90, disponible chez Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO (voir aussi Ostrem et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2160-2614 (1987); Ostrem et al.J. Biol. Chem. 262, 14164-14171

(1987)). Les résultats sont donnés dans le tableau 1 ci-

dessous. Les données sont présentées en pourcentages de cellules différenciées à la suite d'un traitement avec diverses concentrations de 1,25-(OH)2D3 (utilisé comme référence de comparaison) ou du dérivé de vitamine D d'essai.

Tableau 1

Comparaison de l'activité de différentiation de la 1,25-

(OH)2D3 et du dérivé dihomo dans la chaîne latérale, chez des cellules HL60 en culture % de cellules différenciées Composé Concentration Estérase Phagocytose NBT administré (molaire)___ __ 1,25-(OH)2D3 1 x 10-7 M 91 2 90 3 90 2 i x 10-8 M -61 4 56 2 55 4 i x 10-9 M 30 3 31 2 34 4 24-dihomo- 5 x 10-8 M 92 2 93 3 92 2 1,25-(OH)2- i x 10-8 M 78 4 77 3 78 3 22-déhydro- 5 x 10-9 M 67 4 69 2 69 3 vitamine D3 1 x*10-9 M 49 2 50 3 48 3 (composé 25) 5 x 10-1 M 36 4 36 4 40 3

Exemple 6

Activité calcémiqcue du composé dihomo (25) (a) Activité de transport du calcium intestinal

(Tableau 2)

Des rats males juste sevrés sont fournis par la Harlan-Sprague Dawley Company de Madison, Wisconsin, et nourris avec le régime rachitogène à faible teneur en calcium (0,02% de Ca, 0,3% de P) décrit par Suda et al. (J. Nutr. 100, 1049-1052, 1970). On les nourrit avec ce régime pendant 4 semaines au total, à volonté. A la fin de la troisième semaine, les animaux sont divisés en groupes de 6 rats chacun. Un groupe reçoit une injection quotidienne d'un véhicule (0,1 ml d'un mélange de 95% de propylène-glycol et de 5% d'éthanol), par voie intrapéritonéale pendant 7 jours. Pendant la même période, les autres groupes reçoivent la même quantité de véhicule, mais qui contient l'une des doses suivantes: 12,5 ng ou

ng de 1,25-(OH)2D3, ou 125 ng de 24-dihomo-la,25-

dihydroxy-22-déhydrovitamine D3 (composé 25). On sacrifie les animaux 24 heures après la dernière dose, on prélève les intestins, et on utilise les segments duodénaux pour mesurer le transport de calcium intestinal, comme décrit

par Halloran et DeLuca (Arch. Biochem. Biophys. 208, 477-

486, 1981). Les résultats sont indiqués dans le tableau 2 ci-dessous.

Tableau 2

Activité de transport du calcium intestinal de la 1,25-

(OH)2D3 et de son homologue de chaîne latérale chez le rat

_

Composé Quantité Transport de Ca administré__._Lng/i/7iours) (moyenne S. E.M.*) Déficltaire en vitamine D (témoin) 0 4,8 0,2

1,25-(OH)2D3 12,5 11,2 0,6

,0 13,4 1,2

24-dihomo-1,25-(OH)2-

22-déhydrovitamine D3 125,0 6,8 0,45 (composé 25) * S.E.M.: écart quadratique moyen (b) Mesure de la mobilisation du calcium des os

(Tableau 3)

Des rats mâles juste sevrés sont fournis par la Harlan Sprague Dawley Company et nourris avec le régime déficitaire en vitamine D et à faible teneur en calcium

(0,02% de Ca, 0,3% de P) décrit par Suda et al. (J. Nutr.

, 1049-1052, 1970), pendant une période de 4 semaines.

A la fin de la troisième semaine, les animaux sont divisés en groupes de 6 animaux chacun, et reçoivent les doses indiquées sur le tableau 3, dissoutes dans 0,1 ml d'un mélange de 95% de propylène-glycol et de 5% d'éthanol. Le groupe témoin ne reçoit que le solvant véhicule. Les autres groupes recoivent quotidiennement les doses indiquées de 1,25-(OH)2D3 ou du composé dihomo (25), pendant 7 jours. A la fin des 7 jours, on mesure le taux de calcium dans le sérum par absorption atomique. Dans le tableau 3 ci-dessous, on donne les résultats de

deux expériences de ce type.

Tableau 3

Activité de mobilisation du calcium des os (taux de calcium dans le sérum) de la 1,25-(OH)2D3 et de son homologue de chaîne latérale chez le rat Composé Quantité Calcium dans le sérum administré (ng/i/7 jours) (moyenne S.E.M.)mg% Expérience 1 Expérience 2 Déficitaire en vitamine D (témoin) 0 3,4 0,07 4,1 0,05

1,25-(OH)2D3 12,5 3,7 0,17 4,8 0,08

- 25,0 4,1 0,07 4,8 0,08

75,0 4,6 0,09 --

24-dihomo-1,25-(OH)2- 25,0 3,6 0,16 --

22-déhydrovitamine D3 125,0 3,7 0,3 4,36 0,15

(composé 25) 500,0 3,8 0,11 --

Les résultats présentés sur le tableau 1 indiquent clairement que l'analogue dihomo 25 est nettement plus efficace que la 1,25-(OH)2D3 pour provoquer la différentiation de cellules leucémiques en monocytes normaux. Par exemple, à une concentration de 1.10-8 M, la 1,25-(OH)2D3 donne 55 à 61% de cellules différenciées, alors que le composé 25 à la même concentration donne 78% de différentiation. Si l'on considère qu'une concentration de 1.10-7 M de 1,25-(OH)2D3 est nécessaire pour obtenir le même degré de différentiation (environ À90%) que celui produit par une concentration de 5.10-8 M de l'analogue dihomo (environ 92%), on peut conclure que l'analogue 25 est environ 2 fois plus efficace que la

1,25-(OH)2D3 comme agent de différentiation.

En un contraste saisissant, le composé dihomo présente une très faible activité calcémique, en comparaison de celle de la 1,25-(OH)2D3. Cette conclusion est corroborée par les résultats indiqués dans les tableaux 2 et 3. Le test de transport de calcium intestinal, représenté sur le tableau 2, montre par exemple que le métabolite actif connu, la 1,25-(OH) 2D3, provoque, comme on s'y attend, des réponses très prononcées (en comparaison de celle du témoin), lorsqu'elle est administrée à des doses de 12,5 ou 25 ng/jour pendant 7 jours. Cependant, dans le cas du nouveau composé dihomo 25, des doses de 125 ng/jour pendant 7 jours sont nécessaires pouz provoquer une réponse, et même pour des doses aussi élevées, la réponse est modeste, faiblement supérieure & la moitié de celle provoquée par la 1,25-(OH)2D3 à une dose 10 fois plus faible. Par conséquent, dans cet essai, le nouvel analogue dihomo est au moins 10 fois moins actif que la

1,25-(OH)2D3.

On peut tirer la même conclusion des résultats du test de mobilisation du calcium des os, indiqués dans le tableau 3. Ici, des doses de 125 et 250 ng/jour, administrées pendant 7 jours, de l'analogue dihomo 25 sont nécessaires pour obtenir le même degré de réponse que celui produit par des doses de 12,5 et 25 ng, respectivement, de 1,25-(OH)2D3. Il est également notable qu'une augmentation supplémentaire de la dose du composé dihomo (jusqu'à 500 ng/jour) ne provoque pas une augmentation supplémentaire de la réponse de mobilisation du calcium des os, mais semble plutôt la diminuer (voir tableau 3). Dans une seconde expérience, également indiquée dans le tableau 3, dans laquelle la 1,25-(OH)2D3 manifeste à nouveau une réponse très significative (comparée au témoin) & des doses de 12,5 et de 25 ng/jour, l'analogue dihomo ne présente pas d'activité à une dose de 125 ng/jour. Dans une troisième expérience, dans laquelle l'analogue dihomo 25 est testé sur un intervalle de doses allant jusqu'à 1000 ng/jour, le composé ne provoque pas de réponse de mobilisation de calcium, à n'importe quelle valeur de la dose, ce qui montre que cette substance ne présente pratiquement aucune activité dans l'élévation du taux de calcium dans le sérum aux dépens des os. Ces tests de mobilisation du calcium des os sont par conséquent en plein accord avec- les données de transport du calcium du tableau 2, et indiquent clairement que le nouvel analogue dihomo 25 est-plusieurs fois moins efficace que la 1,25-(OH)2D3 en ce qui concerne l'action calcémique. On observe le même type de schéma d'activité pour le composé trihomo 26 de cette invention. Cette substance présente également un rapport différentiation/activité calcémique hautement favorable et nettement augmenté, en raison du fait qu'il présente une activité prononcée dans la différentiation des cellules HL-60, tout en ne donnant pas de réponse significative (comparé au témoin) en ce qui concerne les taux de calcium dans le sérum chez le rat. Il est évident que ce type de schéma d'activité est exactement ce que l'on désire pour un composé destiné à être utilisé comme agent de différentiation dans le traitement de maladies néoplasiques. L'activité souhaitée, la différentiation cellulaire de cellules malignes, est très prononcée, tandis que l'activité non souhaitée, l'activité calcémique, est nettement réduite, ce qui donne un rapport différentiation/activité calcémique très

nettement augmenté. Les dérivés connus de la-

hydroxyvitamine D se sont révélés comme étant des agents thérapeutiques efficaces dans le traitement de maladies leucémiques (Suda et coll., brevet US-4.391.802). Sur la base des données d'essais biologiques citées ici, on peut conclure que les nouveaux dérivés homologues de chaîne latérale de cette invention, lorsqu'ils sont administrés aux mêmes doses que les composés de l'art antérieur, ne manifestent aucune activité calcémique ou manifestent moins du dixième de l'activité calcémique indésirable des composés de l'art antérieur, ce qui élimine dans une grande mesure le problème de la production de taux de calcium sanguin excessivement élevés chez les sujets traités. En outre, sur la base des résultats présentés dans le tableau 1, on peut s'attendre à ce que les nouveaux dérivés homologues présentent une activité très élevée de différentiation contre des cellules malignes, en particulier des cellules leucémiques, ce qui augmente encore les bénéfices thérapeutiques que l'on peut en tirer. Par conséquent, les nouveaux composés de cette invention représentent un mode de réalisation pratique efficace du concept de la thérapie par différentiation des maladies malignes, et leurs schémas d'activité suggèrent clairement qu'ils constituent des agents

thérapeutiques préférés pour un tel traitement.

Pour les besoins d'un traitement, ces composés peuvent être- formulés sous la forme de solutions dans des solvants inoffensifs ou sous la forme d'émulsions, de suspensions ou de dispersions dans des solvants ou véhicules convenables et inoffensifs, ou sous la forme de pilules, de comprimés ou de capsules, par des méthodes conventionnelles connues dans la technique.- De telles formulations peuvent également contenir d'autres excipients non toxiques, pharmaceutiquement acceptables, tels que stabilisants, anti-oxydants, liants, colorants,

* émulsifiants ou agents modificateurs du goût.

Les composés sont avantageusement administrés par injection, ou par perfusion intraveineuse de solutions stériles convenables, ou sous la forme de présentations orales, par le canal alimentaire. Pour le traitement de la leucémie humaine, les dérivés homologues de vitamine D de cette invention sont administrés aux sujets à des doses suffisantes pour provoquer la différentiation de cellules leucémiques en macrophages. Des doses convenables vont de 0,5 pg à 50 pg par jour, étant entendu que ces doses peuvent être ajustées (c'est-à-dire i5 encore augmentées) en fonction de la sévérité de la maladie ou de la réponse ou de l'état du sujet, comme

cela est bien compris dans la technique.

SCHEMADE PROCEDE 1

//yr-COOH "r' COOH c COOCH 3"OOO

AcC - XO HO.-

1 2 X"H 4

3 X-t-BuMe2Si + ON0 ",r CO:^H 3eg CHO 1"t!ll/ C.':20H

6 - 7

COCM,3 o COOC3 XC L HoCYF OAc I1 X-Ac, Y. H 12 1l X-_-i X-Y-t-BuM*21 I, W 1 f0 ,,/000CHt5uaaI:W'CH xo "O

13 X-Y-H, W..CHO

14 XuYmH; W.CHO20H 17 X-Y-t-BauM2St; W-C20H 18 Xiy-t-BNMe$] W.-CH: i-.u) tl,)m t)s D"U a C'u g S 1. +SOiv^sOlt, +Oi8ois+

MO II

u '3ISO,sOis j.su Or

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13!S=Z I.1

ZO-O ú(l:ttO)':FlgOgtd. H_ O-3 (;Cll)4:HOSqd O3(13 1DI -..HO- li IqOIt WI NRIIDB

Claims (11)

REVENDICATIONS

1. Composé caractérisé en ce qu'il présente la structure: i t0x dans laquelle chacun de X, Y et Z, qui peuvent être identiques ou différents, représente un atome d'hydrogène

ou un groupe hydroxy-protecteur, et n vaut 3 ou 4.

2. Composé conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que chacun des X, Y et Z représente un

atome d'hydrogène.

3. 24-dihomo-la,25-dihydroxy-22-déhydrovitamine D3.

4. 24-trihomo-la,25-dihydroxy-22-déhydrovitamine D3.

5. Composé caractérisé en ce qu'il présente la structure i;"/(É In\ dans laquelle chacun des X, Y et Z, qui peuvent être identiques ou différents, représente un atome d'hydrogène

ou un groupe hydroxy-protecteur, et n vaut 3 ou 4.

6. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé conforme à l'une

quelconque des revendications.1 à 4, conjointement avec

un excipient pharmaceutiquement acceptable.

7. Composition conforme à la revendication 6,

caractérisée en ce qu'elle comprend de la 24-dihomo-1a,25-

dihydroxy-22-déhydrovitamine D3.

8. Composition conforme à la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle comprend de la 24-trihomo-la,

-dihydroxy-22-déhydrovitamine D3.

9. Composition conforme à l'une quelconque des

-15 revendications 1 à 8, caractérisée en ce que le composé

s'y trouve en une quantité de 0,5 pg à 50 pg.

10. Composé selon l'une quelconque des

revendications 1 à 4 utilisé pour provoquer et exalter

la différenciation cellulaire des cellules malignes.

11. Composé selon l'une quelconque des

revendications 1 à 4 appliqué au traitement de maladies

néoplasiques.